KR102614063B1

KR102614063B1 - 엑스트라도메인 b 피브로넥틴에 특이적으로 결합하는 신규한 항체

Info

Publication number: KR102614063B1
Application number: KR1020200182769A
Authority: KR
Inventors: 고건; 김백경; 최영준; 이인현; 장준희
Original assignee: 대화제약 주식회사
Priority date: 2020-12-24
Filing date: 2020-12-24
Publication date: 2023-12-19
Also published as: KR20220092666A

Abstract

본 발명은 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B에 결합하는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 EDB-FN에 특이적으로 결합하여 신생혈관 형성을 억제함으로써 암을 예방 또는 치료하는 우수한 효과를 갖는다.

Description

엑스트라도메인 B 피브로넥틴에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 {Novel antibodies specifically binding to Extradomain-B Fibronectin}

본 발명은 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 신규한 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 EDB-FN에 특이적으로 결합하여 신생혈관 형성을 억제함으로써 암을 예방 또는 치료하는 우수한 효과를 갖는다.

항체 (antibody)는 신체 내에서 외부유입 항원 (antibody)과 결합하여 항원의 작용을 방해하고, 항원을 제거하기 위하여 생성되는 면역단백질로 타겟 물질에 특이적으로 결합할 수 있어 다양한 질병에 대한 치료제로서 많은 연구가 이루어지고 있다. 항체는 중쇄 (Heavy chain)와 경쇄 (Light chain)의 두 가지 면역글로불린으로 이루어지며, 이들은 다시 불변영역 (Constant region)과 가변영역 (Variable region)으로 이루어진다.

피브로넥틴 (FN; Fibronectin)은 고분자량의 점착성 당단백질로, 혈장 등 체액 내에서 가용성이고 세포 외 기질 (ECM : Extra Cellular Matrix)에서 불용성인 형태로 존재하며, 다양한 단백질 동형으로 발현된다. 피브로넥틴은 암세포화되면 현저하게 소실되는 세포막 표면 단백질로 큰 주목을 받고 있다.

엑스트라도메인 B (EDB; Extra Domain B)는 조직 재형성이 발생할 때 선택적 스플라이싱에 의해 피브로넥틴 분자 내로 삽입되는 91개의 아미노산 유형 III 상동성 도메인으로, 종양세포에서 많이 생성되며, 혈관신생에 관여하는 것으로 알려져 있다.

엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (EDB-FN; Extradomain-B Fibronectin)은 스플라이스 변이체로서, 악성 형질 전환 중에 발현되는 것으로 알려져 있으며 일반적으로 건강한 조직내에서는 발견되지 않는다. Petrini et al., Sun et al., 등 다수의 연구자들의 관련된 연구결과는 EDB-FN의 과발현이 구강암종 환자의 낮은 생존율 및 유방종양과 관련이 있는 것을 보여주고 있다.

EDB-FN에 특이적으로 결합하는 항체로 L19 항체가 제시되고 있다. L19 항체는 다양한 실험모델에서 인간 종양 및 기타 혈관형성 질환의 절편 상에서 종양 혈관을 착색시키는 것으로 알려졌다. [Carnemolla et al., "J. Cell Biol. 108(3): 1139-48 (1989)"; Kaczmarek et al., "Int. J. Cancer 59(1): 11-6 (1994)"; Berndt et al., "Histochem. Cell Biol. 109(3): 249-55 (1998)"]. 다양한 L19 항체 기반의 치료법이 제안되어 있지만, 아직까지 우수한 효과를 나타내면서 동시에 낮은 부작용을 갖는 항체 치료제가 요구되어 지고 있다.

따라서, 본 발명자들은 EDB-FN에 특이적으로 결합하면서 낮은 용량에도 우수한 효과를 갖는 EDB-FN 특이적 항체를 연구 및 개발하여 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 제10-0741452호 한국공개특허 제10-2010-0113572호 한국공개특허 제10-2019-0069493호

본 발명은 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (EDB-FN; Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 2의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 3의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 4의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 EDB-FN에 특이적으로 결합하는 EDB-FN 특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고자 한다. 구체적으로 본 발명은 암을 표적화하여 우수한 항암 효과를 가지면서 동시에 부작용이 적은 암 치료용 항체를 제공하고자 한다.

본 발명은, 하기 표 1의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 1 또는 항체 2, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

항체	가변영역	서열번호	서열
항체 1 (2G11)	중쇄가변영역	서열번호 1	cagatccagttggtgcagtctggacctgacctgaagaagcctggagagacggtcaagatctcctgcaaggcttctggatataccttcacagactctggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacaccttcactggaaagccaacatatgctgataacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccaacactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagaggccctcattactacgcctacggatacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca
항체 1 (2G11)	경쇄가변영역	서열번호 2	gacattgtgatgacccagtctccatcctccctggctatgtcagtgggacagaaggtcactatgagctgcaagtccagtcagagccttttaaatagtagcaatcaaaagaactatttggcctggtaccagcagaaaccaggacagtctcctaaacttctggtatactttgcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcataggcagtggatctgggacagatttcactcttaccatcaacagtgtgcaggctgaagacctggcagattacttctgtcagcaacattatatcactccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa
항체 2 (5G5)	중쇄가변영역	서열번호 3	cagatccaactgcagcagtctggacctgagccgaagaagcctggagagacagtcaagatctcctgcaaggcttctggatatgccttcacagactacggaatgaactgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacacctccactgggaagccaacatatgctgatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacatggctacatatttctgtgcaagagggcctcattactacggctacgggtacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtctcctca
항체 2 (5G5)	경쇄가변영역	서열번호 4	gacattgtgatgacccagtctccatcctccctggctgtgtcagcaggagagaaggtcactatgagctgcaaatccagtcagagtctgctcaacagtagaacccgaaagaactacttggcttggtaccagcagaaaccagggcagtctcctaaactactgatcttctgggcatccactagggaatctggggtccctgatcgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtgtgcaggctgaagacctggcagtttattactgcaagcaatcttatattctactcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa

본 발명은, 하기 표 2의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 1 또는 항체 2, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다. 상기 항체 및 항원 결합 단편은 표 1의 염기 서열에 의해 각각 암호화되는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 1 및 항체 2, 또는 이의 항원 결합 단편일 수 있다.

항체	가변영역	서열번호	서열
항체 1 (2G11)	중쇄가변영역	서열번호 5	QIQLVQSGPDLKKPGETVKISCKASGYTFTDSGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTFTGKPTYADNFKGRFAFSLETSANTAYLQINNLKNEDMATYFCARGPHYYAYGYFDVWGAGTTVTVSS
항체 1 (2G11)	경쇄가변영역	서열번호 6	DIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTINSVQAEDLADYFCQQHYITPLTFGAGTKLELK
항체 2 (5G5)	중쇄가변영역	서열번호 7	QIQLQQSGPEPKKPGETVKISCKASGYAFTDYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTSTGKPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDMATYFCARGPHYYGYGYFDVWGAGTTVTVSS
항체 2 (5G5)	경쇄가변영역	서열번호 8	DIVMTQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQKPGQSPKLLIFWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCKQSYILLTFGAGTKLELK

본 발명에서 “항체(Antibody)”는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)과 같은 항원에 특이적으로 결합하고 인식하는 폴리펩티드를 의미한다. 본 발명은 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 결합하는 완전한 항체 형태뿐만 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함한다.

본 발명에서 "항체"는 단클론항체, 다클론항체, 및 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체)를 모두 포함할 수 있다. 항체는 2개의 중쇄 (heavy chain)와 2개의 경쇄 (light chain)로 구성되며, 대상 항원의 종류에 따라 아미노산 서열이 달라지는 가변 영역 (variable region)과 서열이 달라지지 않는 불변 영역 (constant region)을 갖는다.

바람직하게는, 본 발명에서 상기 항체는 단클론항체일 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 항체는 본원에서 2G11, 또는 5G5로 지칭되는 단클론항체일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "단클론항체(monoclonal antibody)"는 상기 항체 분자가 단일 분자로 구성되도록 제조된 것을 의미한다. 단클론항체는 동일한 에피토프를 갖는 항원에 대해서만 반응하는 특이성을 가지며, 또한 특정 에피토프에 대해서만 친화성을 나타낸다. 본 발명의 단클론항체는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 단클론항체는 하이브리도마 세포주에서 생산되는 것일 수 있다. 상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 실시예에서 사용된 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.

이에 따라 본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄는 IgG, IgM, IgA, IgD, IgA의 타입을 가지고, 경쇄는 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

경쇄 및 중쇄의 가변 영역들은 "상보성 결정 부위 (complementarity-determining region, CDR)"라고 하는 매우 가변적인 3개의 영역을 포함한다. CDR은 항원의 에피토프 (epitope)에 결합하며, 각 체인의 CDR은 전형적으로 3개의 영역(CDR1, CDR2, 및 CDR3)을 갖는다. 본원에서는 중쇄의 CDR을 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3로, 경쇄의 CDR을 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3로 표기하기도 한다. 이러한 CDR은 각 항체에 있어 항원 특이성에서 매우 중요한 부위이며, 따라서 항체를 특정하는데 있어 가장 중요한 부분이다.

본원에서 사용된 용어 "(항체의) 항원 결합 단편"은 항체 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab (fragment antigen binding)는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chin variable fragment, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있음), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10^-6 M이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.

본 발명의 상기 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "인간 항체 (human antibody)" 또는 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리 (repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다.

본원에서 사용된 용어 "키메라(chimeric) 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.

본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

본 발명의 항체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다. 상기 암은 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 또는 이의 전이암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산을 제공한다.

본 발명의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 본 발명의 핵산은 상기한 뉴클레오타이드 염기 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 염기 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 염기 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 염기 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl.Math. 2:482(1981)]; [Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970)]; [Pearson and Lipman, Methods inMol. Biol. 24: 307-31(1988)]; [Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988)]; [Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989)]; [Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988)]; [Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992)] 및 [Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)] 등에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오타이드 염기 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자 (cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스, 레트로 바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 일례에서, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 연결 (operatively linked)되어 있다. 본원에서 사용된 용어 "작동적으로 연결"은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)] 등에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본원에서 사용된 용어 "클로닝(cloning)"은 동일한 유전자를 대량 생산하는 유전 공학기술로, 유전자 또는 DNA 절편을 대량 생산하기 위하여 벡터 (vector)로 작용하는 플라스미드 또는 바이러스에 도입하여 세포분열을 통하여 유전적으로 동일한 클론을 복제하는 기술을 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "cDNA"는 mRNA와 상보적인 DNA를 의미한다.

본원에서 사용된 용어 "클론 (clone)”은 동일한 복제물을 의미하는 것으로, 동일한 세포집단 또는 특정 유전자 절편의 동일한 복제물을 뜻한다.

본원에서 사용된 용어 "형질전환 (transformation)"은 외래 유전자를 숙주 세포로 도입하여 숙주 세포의 유전적인 성질이 변하는 것을 의미하고, 숙주가 진핵세포인 경우에는 “형질주입 (transfection)”이라는 용어를 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 형질전환은 외래 유전자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 모든 방법을 포함할 수 있고, 바람직하게는 외래 유전자를 대장균에 도입하는 것을 의미하는 것일 수 있다. 형질전환하는 방법으로는 전기천공법, 리포좀을 이용한 방법, Ca++을 이용한 DNA 운반 방법 등 일반적으로 쓰이는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 엑스트라도메인 B 피브로넥틴의 검출용 키트를 제공한다. 엑스트라도메인 B 피브로넥틴는 종양 세포에서 주로 발현되기 때문에, 본 발명의 키트는 암의 진단에 사용될 수 있다. 상기 암은 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 또는 이의 전이암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 키트에는 검사대상시료를 채취 또는 검출 시약을 적용하기 위한 도구, 항원-항체 결합을 확인하기 위한 시약 또는 장치 등 항체를 사용하여 생물학적 시료로부터 항원 단백질의 존재유무를 확인하는 통상의 검출 또는 진단 키트에 포함될 수 있는 도구, 장치 또는 시약이 더 포함될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 키트는 샌드위치 효소결합면역측정법 (Sandwich ELISA)에 사용하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 포획 항체 (capturing antibody)로서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 부위; 및 검출 항체 (detection antibody)로서 엑스트라도메인 B 피브로넥틴에 대한 다클론항체를 포함하는, 엑스트라도메인 B 피브로넥틴의 검출용 키트일 수 있다. 상기 포획 항체로서의 항체 또는 이의 항원 결합 부위는 바람직하게는 단클론항체일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 단클론항체 2G11 또는 5G5일 수 있다.

상기 검출 항체는 검출 표지와 연결될 수 있다. 검출 표지의 구체적인 예로는 화학물질 (예를 들어, 비오틴), 효소 (알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스래디쉬 퍼옥시다아제 (Horseradish peroxidase, HRP) 및 사이토크롬 P450), 방사능물질 (예를 들어, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질 (예를 들어, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질 (chemiluminescent) 및 FRET (fluorescence resonance energy transfer)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출 표지는 비오틴이다.

상기 검사대상시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 개체는 척추동물일 수 있다. 상기 척추동물은 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다. 상기 시료는 개체로부터 채취되거나 분리된 것, 예를 들어, 혈액 또는 혈액 구성성분 (blood constituent), 체액 (bodily fluid), 타액, 가래, 또는 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 EDB 특이적 항체는, EDB-FN 단백질에 특이적으로 결합하여, 종양부위 또는 혈관신생부위를 표적하며, 시판 제제인 루센티스와 비교하여 더 우수한 신생혈관형성 억제 효과를 가지므로, 우수한 항암 효과를 나타낸다.

도 1 MBP-EDB가 코팅된 플레이트와 각 클론의 항체 2G11, 3E7, 및 5G5를 이용하여 진행한 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Biacore T200 (GE Healthcare) 시스템을 이용하여 분리 정제된 항체 2G11의 Recombinant Human Fibronectin type III EDB protein (Abcam, ab209886)에 대한 결합력을 측정한 것이다.
도 3은 Biacore T200 (GE Healthcare) 시스템을 이용하여 분리 정제된 항체 3E7의 Recombinant Human Fibronectin type III EDB protein (Abcam, ab209886)에 대한 결합력을 측정한 것이다.
도 4는 Biacore T200 (GE Healthcare) 시스템을 이용하여 분리 정제된 항체 5G5의 Recombinant Human Fibronectin type III EDB protein (Abcam, ab209886)에 대한 결합력을 측정한 것이다.
도 5는 2G11 및 5G5 항체를 이용해 생산한 융합항체의 EDB 결합력을 ELISA를 이용해 확인한 것이다.
도 6은 HUVEC 세포주에 포도당 농도에 따른 EDB-FN/FN를 측정한 것이다.
도 7은 포도당 농도에 따른 관형성 정도를 촬영한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본원발명의 항체인 2G11 및 5G5, 및 루센티스 처리시, 관형성 정도를 촬영한 결과를 나타낸 것이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1]

항원 제작

EDB-FN 특이적 항체 제작을 위해 EDB 서열 (서열번호 9)을 pET41a와 pMAL-P2X에 각각 클로닝하여 pET41a-EDB와 pMAL-P2X-EDB를 제작하였다. 상기 제작된 pET41a-EDB와 pMAL-P2X-EDB를 BL21(DE3) 대장균 균주에 transformation시키고 IPTG induction을 통해 단백질 발현을 유도하였다.

pET41a-EDB가 transformation된 균주에서 발현된 GST-EDB 단백질은 Glutathione agarose resin을 이용하여 정제하였으며, pMAL-P2X-EDB가 transformation된 균주에서 발현된 MBP-EDB 단백질은 Amylose resin을 이용하여 정제하였다.

이후 GST-EDB 단백질은 마우스에서 EDB 항체 생산을 위한 항원으로 사용되었으며, MBP-EDB는 생산된 항체를 검증하기 위한 결합력 측정 (ELISA)에 사용되었다.

[실시예 2]

항체 제작 및 클론 선별

마우스에 항원(GST-EDB) 주사 이후 2주 간격으로 항원을 추가 주사 (boosting)하였고, 마지막 boosting 이후 immunized mice를 희생시켜 비장을 분리하였다. 분리된 비장의 혈구세포와 불멸화된 myeloma cell을 융합시켜 hybridoma를 만들고, 이들 중 EDB와 결합력이 높은 항체를 생산하는 하이브리도마 (hybridoma)를 선별하였다.

하이브리도마 선별은 MBP-EDB가 코팅된 plate에 하이브리도마 배양액을 이용한 ELISA를 통하여 진행하였고, 상기 과정을 통하여, 3가지 클론 (2G11, 3E7, 5G5) 이 선별되었다. 이후 선별된 각 클론을 마우스 복강에 주사하여 항체를 생산 및 정제하였다. 정제된 항체를 이용한 ELISA를 진행하여 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상기 과정을 통하여 각 클론의 결합력을 확인하였다.

[실시예 3]

항체결합력 테스트(SPR, Surface Plasmon Resonance)

선별된 클론의 EDB 항체가 어느 정도의 결합력을 갖는지 여부를 확인하기 위해 SPR을 통해 결합력을 측정하였다.

Biacore T200 (GE Healthcare) 시스템을 이용하여, 실시예 1에서 생산 및 정제된 항체의 Recombinant Human Fibronectin type III EDB protein (Abcam, ab209886)에 대한 결합력을 측정하여 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

상기 도 2 내지 도 4에 나타난 바와 같이, 2G11 및 5G5는 nanomolar range (10E-9) 이하의 high affinity antibody 범주에 속하는 것을 확인하였다. 분석에 사용한 항체는 Protein A/G 컬럼을 통해 분리된 마우스 복강의 전체 항체이므로, EDB 특이적인 항체를 대상으로 정제된 항체를 사용하였다면 결합력은 더 높게 측정될 것으로 예상된다.

[실시예 4]

항체서열 분석

항체서열 분석을 위해, 2G11 및 5G5 하이브리도마 세포에서 RNA을 분리하고, 항체의 중쇄과 경쇄의 가변부위에 대해 RT-PCR을 통해 DNA fragment을 얻은 후 이를 plasmid에 클로닝하여 서열분석을 진행하였고, 이를 통해 2G11 및 5G5의 중쇄 및 경쇄 가변부위 서열을 확보하였다. 확보된 서열이 실제 EDB에 결합하는 항체의 서열인지 여부를 확인하기 위해, 분석된 2G11 및 5G5 서열을 기반으로 생산된 항체의 EDB와의 결합정도를 확인하였다.

분석된 가변부위 서열을 인간항체 IgG의 불변부위에 융합시켜 2G11 및 5G5에 해당되는 융합항체를 제작하였고, 융합항체의 EDB 결합력을 ELISA를 통해 확인하였다. ELISA 진행시 항원은 MBP-EDB를 사용하였으며, 마우스 복강에서 생산한 항체도 함께 비교실험을 진행하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 실험결과 융합항체가 효과적으로 EDB에 결합하는 것을 알 수 있고, 분석된 서열이 항체의 서열임을 확인하였다.

[실험예 1]

혈관형성억제 실험

HUVEC 세포주에 Serum starvation 후 포도당 농도에 따른 EDB-FN/FN를 측정하였다 (- Invest Ophthalmol Vis Sci. 2012 Dec 17;53(13):8333-43. Regulation of vascular endothelial growth factor expression by extra domain B segment of fibronectin in endothelial cells 참조).

도 6에 나타낸 바와 같이, 높은 포도당 농도로 유지하는 경우 EDB-FN/FN의 비율도 높아지는 것을 확인하였다. 또한, 도 7에 나타낸 바와 같이, EDB-FN의 과발현에 따라, 튜브 (tube) 형성도 같이 유도되는 것을 확인하였다.

[실험예 2]

혈관형성억제 실험

실험예 2의 조건에서, 본 발명의 항체 (2G11 및 5G5) 및 대조군으로 루센티스를 각각 처리시, 관형성이 억제되는 효과를 확인하였다. 특히, 본 발명의 항체 2G11 및 5G5가 동일 농도에서 루센티스와 비교하여 더 높은 관형성 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

결국, 본 발명의 EDB 항체는 혈관신생을 억제하는 효과를 가지는 것을 알 수 있고, EDB 항체로 암의 예방 또는 치료에 활용될 수 있다.

<110> Dae Hwa Pharma. Co., Ltd. <120> Novel antibodies specifically binding to Extradomain-B Fibronectin <130> DHP20P-0002-KR <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G11-VH, DNA seq. <400> 1 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgac ctgaagaagc ctggagagac ggtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggata taccttcaca gactctggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct tcactggaaa gccaacatat 180 gctgataact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccaa cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggctacat atttctgtgc aagaggccct 300 cattactacg cctacggata cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 2 <211> 339 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G11-VL, DNA seq. <400> 2 gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctggctatgt cagtgggaca gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtagca atcaaaagaa ctatttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tatactttgc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactcttacc 240 atcaacagtg tgcaggctga agacctggca gattacttct gtcagcaaca ttatatcact 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaa 339 <210> 3 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5G5-VH, DNA seq. <400> 3 cagatccaac tgcagcagtc tggacctgag ccgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggata tgccttcaca gactacggaa tgaactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacacct ccactgggaa gccaacatat 180 gctgatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac atggctacat atttctgtgc aagagggcct 300 cattactacg gctacgggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 4 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5G5-VL, DNA seq. <400> 4 gacattgtga tgacccagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactactga tcttctgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttatattcta 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G11-VH, AA seq. <400> 5 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Asp Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Phe Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro His Tyr Tyr Ala Tyr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2G11-VL, AA seq. <400> 6 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln 85 90 95 His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5G5-VH, AA seq. <400> 7 Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Pro Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Ser Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Pro His Tyr Tyr Gly Tyr Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5G5-VL, AA seq. <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln 85 90 95 Ser Tyr Ile Leu Leu *** Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 9 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EDB, AA seq. <400> 9 Glu Val Pro Gln Leu Thr Asp Leu Ser Phe Val Asp Ile Thr Asp Ser 1 5 10 15 Ser Ile Gly Leu Arg Trp Thr Pro Leu Asn Ser Ser Thr Ile Ile Gly 20 25 30 Tyr Arg Ile Thr Val Val Ala Ala Gly Glu Gly Ile Pro Ile Phe Glu 35 40 45 Asp Phe Val Asp Ser Ser Val Gly Tyr Tyr Thr Val Thr Gly Leu Glu 50 55 60 Pro Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Ser Val Ile Thr Leu Ile Asn Gly Gly 65 70 75 80 Glu Ser Ala Pro Thr Thr Leu Thr Gln Gln Thr 85 90

Claims

서열번호 1의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 2의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
서열번호 3의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 4의 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단클론항체인 것을특징으로 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin)에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 또는 이의 전이암으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암치료 또는 예방용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin) 검출용 키트.
제8항에 있어서, 암 진단에 사용되는 것을 특징으로 하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin) 검출용 키트.
제8항에 있어서, 상기 암은 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 두경부암, 갑상선암, 연부조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종, 비만세포종, 백혈병, 림프종, 간암, 폐암, 췌장암, 위암, 신장암, 대장암, 조혈 종양 또는 이의 전이암인 것을 특징으로 하는 엑스트라도메인 B 피브로넥틴 (Extradomain-B Fibronectin) 검출용 키트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산.
제11항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 하이브리도마 세포주.