JPH0276598A - 抗ｅｄ−ｂ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、フィブロネタチン（ｆｉｂｒ’ｏｎｅｃｔｉ
ｎ　：ＦＮ）、殊に癌組織に含まれるタイプの上記ＦＮ
に対する新規な抗体に関する。

従来の技術 「Ｎは、種々の組織や体液中に広く分布する一群の多機
能糖蛋白質であり、細胞の接着因子として、細胞の移動
、分化、増殖、癌化といった多彩な生物現象に関与する
ことが知られている（関口清俊、細胞工学、Ｖｏｌ、４
．　Ｎｏ、　６．　Ｄ４８５−４９７　（１９８５））
。

また従来より上記ＦＮには、細胞外マトリックスに存在
するもの（細胞型ＦＮ　：　ＣＦＮ）と血漿中のＦＮ（
血漿型ＦＮ　：　ｐＦＮ）との２つの分子種があること
が知られていたが、之等ＦＮの分子多様性は、遺伝子初
期転写産物の可変的スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔ
ｉｖｅ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）により生ジルコとが明らか
にされている。かかる可変的スプライシングを受ける領
域には、ＥＤ−Ａ、ＥＤ−Ｂ及びｌｌ１ｃｓと呼ばれる
３個所があり、２等領域の発現の組合せによって、多数
の分子種が生じるものと考えられている。

一方、癌組織に含まれるタイプのＦＮ（以下「癌性ＦＮ
Ｊと略記する）は、上記ＥＤ−Ｂの発現が異常に高いＦ
Ｎであって、９１アミノ酸からなるＥＤ−８を有するＦ
Ｎとして知られている（Ｌｕｃｉａｎｏ　Ｚａｒｄｉ、
ｅｔ　ａｔ、、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、Ｖ
ｏｌ。

６．Ｎｏ、８．ｐ２３３７−２３４２　（１９８７））
。

発明が解決しようとする課題 かかる坦状において、上記癌性ＦＮについて分子レベル
での研究を進めるために、またその分子種に特異的な測
定（検出）乃至は精製を可能とし、ひいては癌の診断を
可能とするための手段が、斯界で要望されている。

本発明の目的は上記要望に合致する手段を提供すること
におる。即ち、本発明は前記ＦＤ−Ｂを特異的に認識し
、従って癌性ＦＮに特異反応性を有する抗体を提供する
こと、上記ＥＤ−Ｂに関連するペプチド、殊に上記抗体
の製造のためのハプテン及び癌性「Ｎの測定のためのト
レーサーとなり得る特定のペプチドを提供すること、更
に之等を利用して所望の癌性ＦＮもしくはＥＤ−８を測
定する技術を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段 本発明によれば、下記式（１）、（２）又は（３）のア
ミノ酸配列中に抗原決定基を有することを特徴とする抗
ＦＤ−Ｂ抗体が提供される。

（１）：ＥＧＩＰＩＦＥＤＦＶＤＳＳＶＧＹ（２）：Ｙ
ＴＶ丁ＧＬＥＰＧＩＤＹＤＩＳ（３）：ＮＧＧＥＳＡＰ
ＴＴＬ丁ＱＱＴまた本発明によれば、上記式（１）、（
２）又は（３）のアミノ酸配列で表わされるＦＤ−８ペ
プチドが提供される。

上記及び以下の本明細書において、アミノ酸、ペプチド
、保護基、活性基、その他に関して略号で表示する場合
は、ＩＵＰＡＣの規定或いは当該分野における慣用記号
に従うものとする。それらの例は次に挙げる通りである
。またアミノ酸等に関して光学異性体があり得る場合は
、特に明記しなければ１体を示すものとする。

Ａ；アラニン　　　　Ｄ；アスパラキン酸Ｎ；アスパラ
キン　　Ｉ；イソロイシンＬ；ロイシン　　　　Ｇ；グ
リシン Ｐ；プロリン　　　Ｓ；セリン ［；グルタミンＭ　　Ｑ；グルタミン 丁；スレオニン　　　Ｆ；フェニルアラニン■；バリン
　　　　　Ｃ；システィン Ｙ；チロシン ’ｒｏｓ；ｐ−トルエンスルホニル基 ＢＯＣ；第３級ブトキシカルボニル基 ＢＺＩ　　：ペンジル基 ）ＩＢＺＩ　；　ｐ−メ１〜キシベンジル暴０Ｂｚｌ　
；ベンジルオキシ基 Ｃｌ２Ｂｚｌ　　；　２．６−ジクロルベンジル基ＣＩ
−Ｚ：２−タロルベンジルオキシカルホニル基Ｂｒ−Ｚ
；２−ブロモベンジルオキシカル小ニル基本発明によっ
て、提供される上記特定の抗ＦＤ−Ｂ抗体は、ＥＤ−Ｂ
に特異的な抗原部位を認識する抗体であって、ＦＤ−８
もしくは該領域を有するＦＮ、即ち癌性「Ｎに特異反応
性を有し、前記ＣＦＮ、１ｍ）ＦＮ等の他の分子種のＦ
Ｎとは交叉反応性を示さないことにより特徴イ］けられ
る。

従って、本発明抗体は、ＥＤ−Ｂもしくは癌性ＦＮの免
疫測定法における特異抗体として利用することかでき、
これによって之等の高感度、高精度且つ簡便な測定法を
確立できる。また、上記測定法が確立できれば、癌のス
クリーニング並びに診断技術か提供できると共に、これ
は発癌機構の研究、解明等の基礎研究に極めて有用であ
る。

更に、上記本発明抗体は、例えばアフィニティークロマ
１〜グラフイー等による上記ＥＤ−Ｂもしくは癌性［Ｎ
の免疫学的精製に有用である。

また、本発明により提供される上記特定のペプチド（Ｅ
Ｄ−８ペプチド）は、ＥＤ−Ｂに特異的な抗原部位から
なり、従って、これは上記抗ＦＤ−Ｂ抗体の製造のため
のハプテンとして有用であり、また上記測定法における
１〜レーサー（標識体）等としても有効に利用できる。

以下、本発明抗体の製造方法につき詳述する。

本発明抗体は、前記式（１）、（２）及び（３）で表わ
されるアミノ酸配列を少なくとも有しているペプチドも
しくは蛋白を免疫原として用いて、常法により製造でき
る。例えば、上記免疫原を哺乳動物に投与（免疫）して
生体内に所望抗体を産生きせる方法、上記免疫原で免疫
された哺乳動物の形質細胞（免疫細胞）とｌ…乳動物の
形質細胞腫細胞とのハイブリドーマを作成し、これより
所望抗体（モノクローナル抗体〉を産生するクローンを
選択、培養する方法等により得ることができる。

本発明抗体の製造に当たり、免疫原として用いられる上
記ペプチドもしくは蛋白は前記式（１）、（２）及び（
３）で表わされるアミノ酸配列を少なくとも有している
限り、特に限定はなく、例えば癌組織から調製した癌性
ＦＮ、遺伝子転子え技術に従い製造された癌性ＦＮ、そ
れら癌性ＦＮのＦＤ−Ｂ領域乃至はそれらの７ラグメン
ト、上記特定のアミノ酸配列を有する合成ペプチド等の
いずれでもよい。之等の内で特に好ましいものとしては
、本発明ＥＤ−８ペプチドをハプテンとして利用して得
られるものを例示できる。

上記方法において、免疫に供せられる哺乳動物としては
、特に制限はないが、本発明抗体をハイブリドーマを利
用して製造する場合には、細胞融合に使用する形質細胞
腫細胞との適合性を考慮して選択されるのが望ましく、
一般にはマウス、ラット等が有利に用いられる。

上記抗体の製造法において免疫は一般的方法により、例
えば免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔的注
射等により投与することにより実施できる。より具体的
には、免疫原を所望により通常のアジュバン１へと併用
して、供試動物に２〜１４日毎に数回投与し、総投与量
が、例えばマウスでは約１０〜１００μｑ程度、家兎で
は約０．２〜２．０ｍｇ程度になるようにすることによ
り行ない得る。抗体の採取は、上記最終投与の１〜２週
間経過後、免疫化された動物から採血し、これを遠心分
離後、血清を分離することにより行なわれる。また上記
モノクローナル抗体の製造において用いられる免疫細胞
としては、上記最終投与の約３日後に摘出した牌臓細胞
を使用するのが好ましい。

上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動
物の形質細胞腫細胞としては、既に公知の種々のもの、
例えばｐ３　（ｐ３／ｘ６３−Ａｇ８）（Ｎａｔｕｒｅ
　、２５６，４９５−４９７（１９７５）　）、ｐ３−
Ｕ］（Ｃｕｒｒｅｎｔ丁ｏｐｉｃｓ　ｉｎ　　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　
。

８′ｌ、１−７　（１９７８））、ＮＳ−１（Ｅｕｒ。

Ｊ、　　Ｉ＋ｎｍｕｎｏ１．．６．５１１−５１９　（
１９７６）　）、ＭＰＣ−１１（Ｃｅｌｌ　、　８．４
０５−４１５（１９７６））、５Ｐ２１０　（Ｎａｔｕ
ｒｅ　、２７６゜２６９−２７０　（１９７８））、Ｆ
Ｏ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｌ、３５．１−２１　　（
１９８０））、Ｘ６３．６．５．３．　　（Ｊ、　　Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ、、１２３゜１５４．８−１５５０　（１
９７９））、３１９４〔Ｊ、　　ＥＸＩ）、　　Ｍｅｄ
、、　１４８．　３１３−３２３（１９７８））等や、
ラットにあ【プるＲ２１０〔Ｎａｔｕｒｅ、２７７．１
３１−１３３　（１９７９））等の骨髄腫細胞等を使用
できる。

上記免疫細胞と形質細胞腫細胞との融合反応は、公知の
方法、例えばマイルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）ら
の方法（Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、
　Ｖｏｌ、　７３　、　Ｉ）ｌ）３（１９８１））等に
準じて行なうことかできる。

より具体的には、上記融合反応は通常の融合促進剤、例
えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウィ
ルス（ＨＶ　、Ｊ　）等の存在下に、通常の培地中で゛
実施され、培地には更に融合効率を高めるためにジメチ
ルスルホキシド等の補助剤を必要に応じて添加すること
もてきる。免疫細胞と形質細胞腫細胞との使用比は、通
常の方法と変りはなく、例えば形質細胞腫細胞に対して
免疫細胞を約１〜１０倍程度用いるのが普通でめる。融
合反応時の培地としては、上記形質細胞腫細胞の増殖に
通常使用される各種のもの、例えばＲＰＭＩ−１６４０
培地、ＭＥＭ培地、その他この種細胞培養に一般に利用
されるものを例示でき、通常２等培地は牛胎児血清（Ｆ
ｅ２）等の血清補液を扱いておくのがよい。融合は上記
免疫細胞と形質細胞腫細胞との所定量を上記培地内でよ
く混合し、予め３７°Ｃ程度に加温したＰＥＧ溶液、例
えば平均分子量１０００〜６０００程度のものを、通常
培地に約３０〜６０Ｗ／Ｖ％の濃度で加えて混ぜ合せる
ことにより行なわれる。以後、適当な培地を逐次添加し
て遠心し、上清を除去する操作を繰返すことにより所望
のハイブリドーマが形成される。

得られる所望のハイブリドーマの分離は、通常の選別用
培地、例えばＨＡ丁培地（ヒポキサンチン、アミノプテ
リン及びチミジンを含む培地）で培養することにより行
なわれる。該ＨＡ下培地での培養は、目的とするハイブ
リドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充
分な時間、通常数日〜数週間性なえばよい。かくして得
られるハイブリドーマは、通常の限界希釈法により目的
とする抗体の検索及び単一クローン化に供される。

目的抗体産生株の検索は、例えばＥＬＩＳＡ法（Ｅｎｇ
ｖａｌｌ、Ｅ、、　）Ｉｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　
７０．４１９−４３９　（１９８０））、プラーク法、
スポット法、凝集反応法、オクテロニ−（Ｏｕｃｈｔｅ
ｒｌｏｎｙ）法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ＞法等
の一般に抗体の検出に用いられている種々の方法〔「ハ
イブリドーマ法とモノクローナル抗体」、株式会社Ｒ＆
Ｄプラニング発行、第３０−５３頁、昭和５７年３月５
日〕に従い実施でき、この検索には前記本発明ＦＤ−Ｂ
ペプチドの利用が好適である。

かくして得られる本発明の所望のモノクローナル抗体を
産生ずるハイブリドーマは、通常の培地で継代培養する
ことができ、また液体窒素中で長期間保存することがで
きる。

上記ハイブリドーマからの本発明抗体の採取１よ、該ハ
イブリドーマを、常法に従って培養してその培養上清と
して得る方法やハイブリドーマをこれと適合性のめる哺
乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法等
が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに
適しており、後者の方法は、抗体の大量生産に適してい
る。

また上記のごとくして得られる抗体は、更に塩析、ゲル
濾過法、アフイニテイクロマトグラフイー等の通常の手
段により精製することができる。

かくして、本発明抗ＥＤ−８抗体を製造できる。

以下、本発明ＥＤ−８ペプチド及びその利用につき詳述
する。

本発明ＥＤ−Ｂペプチドは、例えば通常の化学合成法に
従い、入手容易な市販のアミノ酸等を利用して、簡単な
操作で容易に製造できる。該化学合成法は、より詳しく
は、通常のペプチド合成法、ｉ体内Ｇ、：　ハｒ　ｆ　
　ペプチド（Ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ）Ｊ第１巻（１
９６６年）　　（Ｓｃｈｒ６ｄｅｒ　ａｎｄ　Ｌｕｈｋ
ｅ著、八ｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏ
ｒｋ、　ｔＪｓＡ　）或いは「ペプチド合成」　〔東屋
ら著、丸善株式会社（１９７５年）〕に記載される如き
方法に従い、例えばアジド法、クロライド法、酸無水物
法、混酸無水物法、Ｄ　ＣＣＬ活性エステル法（ｐ−ニ
トロフェニルエステル法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ドエステル法、シアンメチルエステル法等）、ウッドワ
ード試薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸
化還元法、ＤＣＣ／アディティブ（ＨＯＮＢ。

ＨＯ２丁、ＨＯ３Ｕ　）法等により実施できる。上記方
法においては同相合成法及び液相合成法のいずれをも適
用できる。通常本発明ペプチドは、上記した一般のポリ
ペプチドの合成法に従い、例えば末端アミノ酸に順次１
個づつアミノ酸を縮合させる所謂ステップワイズ法によ
り、又は数個のフラグメントに分けてカップリングさせ
ていく方法により製造される。

より詳細には例えば同相合成法を採用する場合、Ｃ末端
アミノ酸（アミノ基を保護したもの）をそのカルボキシ
ル基によって、まず不溶性担体に結合させる。不溶性担
体としては、反応性カルボキシル基と結合性を有するも
のであれば特に限定はなく、例えばクロロメチル樹脂、
ブロモメチル樹脂等のハロゲノメチル樹脂やヒドロキシ
メチル樹脂、フェノール樹脂、ｔｅｒｔ−アルキルオキ
シカルボニルヒドラシト化樹脂等を使用できる。次いで
アミン保護基を除去した後、目的とするペプチドのアミ
ノ酸配列に従い順次アミノ基保護アミノ酸を、その反応
性アミノ基及び反応性カルボキシル基との縮合反応によ
り結合させ、−段階ずつ合成し、全配列を合成後、ペプ
チドを不溶性担体からはずすことにより本発明ペプチド
を収得できる。

上記各種方法において側鎖官能基を有する各アミノ酸、
例えばＹ、Ｅ、Ｔ、Ｃ，Ｓ等は、その側鎖官能基を保護
してあくのが好ましく、これは通常の保護基により保護
され、反応終了後該保護基は脱離される。また反応に関
与する官能基は、通常活性化される。これら各反応方法
は公知であり、それらに用いられる試薬等も公知のもの
から適宜選択される。

アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカル
ボニル、ＢＯＣ、ｔｅｒｔ−アミルオキシカルボニル、
イソボルニルオキシカルボニル、ρ−メトキシベンジル
オキシカル ンチルオキシ力ルホニル、トリフルオロアセチル、フタ
リル、ホルミル、０−ニトロフェニルスルフェニル、ジ
フェニル小スフイノチオイル基等が挙げられる。

カルボキシル基の保ＩＩとしては、例えばアルキルエス
テル（メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−
ブチル等のアルキルエステル）　、ＢＺＩエステル、ρ
ーニトロベンジルエステル、ＭＢＺＩエステル、ｐ−ク
ロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル ｔｅｒｔ〜ブチルオキシカル小ニルヒドラジド、トリチ
ルヒドラジド等を形成し得る基を例示できる。

Ｓ及び丁の水酸基は、例えばエステル化又【ｊ、エーテ
ル化によって保護することができるが、必ずしも保護す
る必要はない。このエステル化に適する基としては、ア
セチル等の低級アルカノイル基、ベンゾイル等のアロイ
ル基、ベンゾイルオキシカルボニル、エチルオキシカル
小ニル等の炭酸から誘導される基等が挙げられる。また
エーテル化に適する基としては、ベンジル、テトラヒド
ロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル基等を例示できる。

Ｙの水酸基の保護基としては、例えばＢＺＩ、Ｃ１２Ｂ
ｚｌ　、Ｂｒ−Ｚ，ベンジルオキシカルボニル、アセチ
ル、ＴＯＳ基等が挙げられる。

Ｃのチオール基の保護基としては、）ＩＢｚ　ｌ、ＢＺ
Ｉ、ｐ−メチルベンジル基等が挙げられる。

Ｅのカルボキシル基の保護は、ベンジルアルコール、メ
タノール、エタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等とのエ
ステル化により行なわれる。

カルホキシル基の活性化されたものとしては、例えば対
応する酸クロライド、酸無水物又は混合酸無水物、アジ
ド、活性エステル（ペンタクロロフェノール、ｐ−二１
〜ロフェノール、Ｎ−ｅドロキシザクシンイミド、Ｎ−
ヒドロキシベンズトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシ−５−
ノルボルネン−２、３−ジカルホキシイミト等とのエス
テル）等が挙げられる。

上記方法において反応性アミノ基と反応陣カルボキシル
基との縮合反応（ペプチド結合形成反応）は溶媒の存在
下に行ない得る。溶媒としてはペプチド結合形成に使用
し得ることの公知の各種のもの、例えば無水又は含水の
ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ＞　、ジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）、ピリジン、クロロホルム、ジオキサ
ン、ジクロルメタン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ＞　
、酢酸エチル、Ｎ−メチルピロリドン、ヘキザメチルリ
ン酸トリアミド（ＨＭＰＡ）或いはこれらの混合溶媒等
を用い得る。同原料化合物の使用割合は、特に限定はな
いが、通常一方に対して他方を等モル量〜５倍モル量、
好ましくは等モル量〜１．５倍モル量とするのがよい。

反応温度はペプチド結合形成反応に使用される通常の範
囲、一般には約−４０°Ｃ〜約６０’Ｃ１好ましくは約
−２０’Ｃ〜約４０’Ｃの範囲から適宜選択される。反
応時間は一般に数分〜３０時間程度である。

混合酸無水物法は、適当な溶媒中、塩基性化合物の存在
下、クロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸
エチル、ブロモ＠酸エヂル、クロロ蟻酸イソブヂル等の
アルキルハロカルボン酸を用いて行なわれる。塩基性化
合物としては、例えばトリエチルアミン、トリメチルア
ミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホ
リン、１．５−ジアザビシクロＣ４，３，○〕ノネンー
５　（ＤＢＮ＞、１．５−ジアザじシクロ（５，４，。

Ｏ〕ラウンセン−５（ＤＢＵ）、１．４−ジアザビシク
ロ［２，２，２）ｔ−フラン（ＤＡＢＣＯ）等の有ａ塩
基や炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム
、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基を使用できる。溶媒
としては混合酸無水物法に慣用の各種溶媒、具体的には
塩化メチレン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロ
ゲン化炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の
芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ＴＨＦ、ジメト
キシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等
（Ｄエステル類、ＤＭＦ、ＤＭＳＯＳＨＭＰＡ等の非プ
ロトン性極性溶ｔｓ等を使用できる。

反応は通常−２０〜１００℃、好ましくは一２０〜５０
’Ｃにおいて行なわれ、反応時間は一般に５分〜１０時
間、好ましくは５分〜２時間でおる。

またアジド化法は、まず活性化されたカルボキシル基、
例えばメチルアルコール、エチルアルコール、ベンジル
アルコール等のアルコールで活性化されたカルボキシル
基に、ヒドラジン水和物を適当な溶媒中にて反応させる
ことにより行なわれる。溶媒としては例えばジオキサン
、ＤＭＦ。

ＤＭＳＯ又はこれらの混合溶媒等を使用できる。

ヒドラジン水和物の使用量は、活性化されたカルボキシ
ル基に対して通常５〜２０倍モル量、好ましくは５〜１
０倍モル量とするのがよい。反応は通常５０’Ｃ以下、
好ましくは一２０〜３０’Ｃにて行なわれる。かくして
カルボキシル基部分がヒドラジンで置換された化合物（
ヒドラジン誘導体）を製造し得る。

カルボキシル基部分がアジドで置換された化合物は、酸
の存在下、適当な溶媒中、上記で得られるヒドラジン誘
導体と亜硝酸化合物を反応させることにより製造される
。酸としては通常塩酸を、溶媒としてはジオキサン、Ｄ
ＭＦ、ＤＭＳＯ又はこれらの混合溶媒等を、また亜硝酸
化合物としては亜硝酸ナトリウム、亜硝酸イソアミル、
塩化ニトロシル等を各々使用することができる。斯かる
亜硝酸化合物は、ヒドラジン誘導体に対して通常等モル
〜２倍モル量、好ましくは等モル−１，５倍モル量用い
られる。反応は通常−２０−０’Ｃ１好ましくは−２０
〜−１０’Ｃにて行なわれ、一般に５〜１０分程度で反
応は終了する。

尚、ペプチド結合形成反応は、縮合剤例えばジシクロヘ
キシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、カルホジイミダゾー
ル等のカルボジイミド試薬ヤテトラエチルピロホスフィ
ン等の存在下に実施することもできる。

上記の各反応行程及び最終行程において、保護基の脱離
を要する場合、これは通常の脱離反応に従って行なわれ
る。該方法としては例えばパラジウム、パラジウム黒等
の触媒を用いる水素添加、液体アンモニア中金属ナトリ
ウムによる還元等の還元的方法、トリフルオロ酢酸、塩
化水素酸、弗化水素、メタンスルホン酸、臭化水素酸等
の強酸によるアシドリシス等を例示することかできる。

上記触媒を用いる水素添加は、例えば水素圧１気圧、０
−４０℃にて行ない得る。触媒の使用量は通常１００ｍ
Ｑ〜１ｇ程度とするのがよく、一般に１〜４８時間程度
で反応は終了する。また上記アシドリシスは、無溶媒下
、通常Ｏ〜３０’Ｃ程度、好ましくはＯ〜２０’Ｃ程度
で約１５分〜１時間程度を要して行なわれる。酸の使用
量は原料化合物に対し通常５〜］Ｏ（８量程度とするの
かよい。該アシドリシスにおいてアミノ基の保護基のみ
を脱離する場合は、酸としてトリフルオロ酢酸又は塩化
水素酸を使用するのが好ましい。更に上記液体アンモニ
ア中金属ナトリウムによる還元は、反応液かパーマネン
トブルーに３０秒〜１０分間程度呈色しているような量
の金属す１〜リウムを用い、通常−４０’Ｃ〜−７０’
Ｃ程度にて行ない得る。

上記のようにして製造された本発明ペプチドは反応混合
物からペプチドの分離手段例えば抽出、分配、逆相高速
液体クロマトグラフィー等により単離精製される。

かくして得られる本発明ペプチドは、前記した抗ＥＤ−
８抗体の製造にお【ブる免疫原の製造に有用である。

かかる免疫原は、上記本発明ペプチドをハプテンとして
、これを直接又は適当なスペーサーを介して、通常の担
体蛋白に結合させることにより収得でき、この結合反応
は、通常のハプテン−担体結合試薬を用いる一般的方法
により実施できる。

上記においてスペーサーとしては、１分子中に上記結合
のための少なくとも２以上の官能基を有する各種化合物
をいずれも利用でき、これにはハプテン−担体結合試薬
の一部が包含される。好適な上記スペーサーとしては、
システィン、リジン、グリシン等の通常のアミノ酸、殊
にシスナインを挙げることができる。２等スペーサーは
本発明ペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に任意に結合
できるものであり、従って、本発明はかかるアミノ酸を
更に有するペプチドをも提供するものである。

上記スペーサーとしてのアミノ酸とハプテンとの反応は
、前記した本発明ペプチドの製造に準じることができる
。

また、上記免疫原の製造方法において、用いられる担体
蛋白としては、通常抗原の作成に当り慣用される高分子
の天然もしくは合成の蛋白質を広く使用できる。該担体
としては例えば馬血清アルブミン、牛血清アルブミン、
ウサギ血清アルブミン、人血清アルブミン、ヒツジ血清
アルブミン等の動物の血清アルブミン類；馬血清グロブ
リン、牛血清グロブリン、ウサギ血清グロブリン、人血
清グロブリン、ヒツジ血清グロブリン等の動物の血清グ
ロブリン類；馬チログロブリン、生チログロブリン、ウ
サギチログロブリン、人チログロブリン、ヒツジチログ
ロブリン等の動物のチログロブリン類；馬ヘモグロビン
、牛ヘモグロビン、ウサギヘモグロビン、人ヘモグロビ
ン、ヒツジヘモグロビン等の動物のヘモグロビン類；キ
ーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の動物の
ヘモシアニン類；回虫より抽出された蛋白質（アスカ−
リス抽出物、特開昭５６−１６４１４＠公報、Ｊ、Ｉｍ
ｍｔＪｎ６，１１１，２６０〜２６８　（１９７３）、
Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、　　１２２．３０２〜３０８　（１
９７９）、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ、、　９８．８９３〜９００
　（１９６７）及びＡｍ、Ｊ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　１
９９．５７５〜５７８（１９６０）に記載のもの又はこ
れらを更に精製したもの〉；ポリリジン、ポリグルタミ
ン酸、リジン−グルタミン酸共重合体、リジン又はオル
ニチンを含む共重合体等を挙げることができる。

ハプテン−担体結合試薬としては、通常抗原の作成に当
り慣用されているものを広く使用できる。

具体的にはチロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架
橋結合させる、例えばビスジアゾタイズドベンジジン（
ＢＤＢ）　、ビスジアゾタイズド−３゜３′−ジアニシ
ジン（ＢＤＤ）等のジアゾニウム化合物；アミノ基とア
ミノ基とを架橋結合させる、例えばグリオキサール、マ
ロンジアルデヒド、ゲルタールアルデヒド、スクシンア
ルデヒド、アジポアルデヒド等の脂肪族ジアルデじド類
；ヂオール基とチオール基とを架橋結合させる、例えば
Ｎ。

Ｎ′−〇−フェニレンジマレイミド、Ｎ　、Ｎ’　−ｍ
−フェニレンジマレイミド等のシマレイミド化合物；ア
ミノ基とチオール基とを架橋結合させる、例えばメタマ
レイミドベンゾイル−Ｎ−じドロキシスクシンイミドエ
ステル、４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサン−
１−カルボキシル−Ｎ′−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジシ
クロ）プロピオネ−１〜（ＳＰＤＰ）等のマレイミドカ
ルホキシル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類
；アミノ基とカルボキシル基とをアミド結合させる通常
のペプチド結合形成反応に用いられる試薬、例えばＮ、
Ｎ−ジシクロヘキシルカル示ジイミド（ＤＣＣ＞　、Ｎ
−エチル−Ｎ′−ジメチルアミノカルボジイミド、１−
エチル−３−ジイソプロピルアミノカルポジイミド、１
−シクロヘキシル−３−（２−モルポリニル−４−エチ
ル）カルボジイミド等のカルボジイミド類等の脱水縮合
剤等を挙げることができる。また上記ハプテン−担体結
合試薬としては、ｐ−ジアゾニウムフェニル酢酸等のジ
アゾニウムアリールカルボン酸類と通常のペプチド結合
形成反応試薬、例えば上記脱水縮合剤とを組合せたもの
も使用可能である。

上記ハプテン、担体蛋白、ハプテン−担体結合試薬、ス
ペーサー等を用いる免疫原の製造反応は、常法に従うこ
とができ、一般には水溶液もしくはｐｌ」５〜１０程度
の通常の緩衝液中、好ましくは−２８＝ １）Ｈ６〜９程度の緩衝液中、Ｏ〜４０’Ｃ１好ましく
は至温付近で行なわれる。該反応は通常的２〜５時間程
度で完結する。

上記においてハプテン、ハプテン−担体結合試薬及び担
体の使用割合は、適宜に決定できるが、通常ハプテンに
対して担体を０．５〜５倍重量程度、好ましくは１〜２
倍重量程度、及びハプテン−担体結合試薬を１〜３０倍
モル程度用いるのがよい。上記によりスペーサーを仲介
してもしくは直接に担体とハプテンとが結合したハプテ
ン−担体複合体からなる所望の免疫抗原か収得される。

反応終了後骨られる抗原は常法に従い、例えば透析法、
ゲル濾過法、分別沈澱法等により容易に単離精製できる
。

更に、本発明のＥＤ−８ペプチドは、これに１２５１．
１３１丁等の放射性物質、パーオキシダーゼ（ＰＯＸ）
　、キモトリプシノーゲン、プロカルホキジペプチダー
ゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、アミ
ラーゼ、ホスホリラーゼ、Ｄ−Ｎａｓｅ　、　Ｐ−Ｎａ
ｓｅ　、β−ガラクトシダーセ、グルコース−６−フＡ
スフエートデハイドログナーゼ、オルニチンデカル小キ
シラーゼ等の各種酵素試薬等を導入することにより、ラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法又はエンザイムイムノ
アッセイ（Ｆ　ＩＡ）法において用いられるトレーサー
として利用できる。上記放射性物質の導入は、通常の方
法により実施できる。例えば放射性ヨードは、クロラミ
ン下を用いる酸化的ヨード化法（Ｗ、Ｍ、ＨＩＪｎｔｅ
ｒａｎｄ　Ｆ、Ｃ，ＧｒｅｅｎＷＯＯｄ　；　１ａｔｕ
ｒｅ、　　１９４　。

４９５　（１９６２）　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、、　８
９．　’Ｉ　４４゜（１９６３）参照〕等により行なわ
れ、酵素試薬の導入は、通常のカップリング法、例えば
エルランガー（Ｂ、Ｆ、Ｅｒｌａｎｇｅｒ）らの方法（
Ａｃｔａ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、５ｕｐｐ１．、１６８．２０６
　（１９７２）　）及び力ロール（１４，１１，にａｒ
ｏｌ　）らの方法（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、、５７　．７
　１３　　（１９６７）　　）等の公知の方法によって
行なうことができる。

上記において、本発明ペプチド中、そのアミノ酸配列内
にチロシンを含まないペプチドは、例えば上記ヨード化
に有利なように、そのＮ末端及び／又はＣ末端に、任意
にチロシンを結合させることができ、本発明はかかるチ
ロシンを結合させた前記ビＤ−Ｂペプチドをも提供する
ものでおる。

実　　　施　　　例 以下、本発明を更に詳しく説明するため、本発明ペプチ
ドの製造例、該ペプチドからの免疫原の製造例及び該抗
原からの抗体の製造例を挙げるか、本発明はこれらに限
定されない。

〈ペプチドの製造〉 製造例　１ 式（１）で表わされる本発明ペプチドの製造ペプチド合
成は、アプライドバイオシステムズ社製ペプチド　シン
セサイザーモデル４３０Ａを用いて行なった。

ＢＯ叶クシスティンｐａｍ樹脂（１％ジビニルベンゼン
架橋ポリスチレン、０．５５９ｍ　ｍｏｌ　／Ｑ＞を出
発原料樹脂として、Ｃ末端側より順次以下の３ｏｃ−ア
ミノ酸誘導体を導入し、下記第１表に示すアクチベータ
ー　ベッセル、コンセントレータ−ベッセル及びリアク
ション　ベッセルから構成されるプログラムに従い、ペ
プチド合成反応を行なった。尚、縮合反応は対称酸無水
物法によつ１こ　。

Ｂｏｃ−Ｌ−Ｅ　（ＯＢｚｌ） Ｂｏｃ−Ｌ−Ｇ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉ・１／２Ｈ２０ １３ｏｃ−Ｌ−Ｐ ３ｏｃ−Ｌ−Ｆ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｄ　（ＯＢｚｌ） ３ｏｃ−Ｌ−Ｖ ［３ｏｃ−Ｌ−３ Ｂｏｃ−Ｌ−Ｙ　（Ｂｒ−Ｚ） 上記プログラムに従い順次ペプチド鎖を延長させた。最
終縮合反応後、保護ペプチド樹脂を、アニソール及びエ
チルメチルスルワイドの存在下にＯ′Ｃで１時間ＨＦ処
理して脱保護基及び脱樹脂反応を行ない、次いで酢酸エ
チルとクロロホルムで交互に洗浄後、乾燥し、２Ｍ酢酸
で抽出し、凍結乾燥して目的ペプチドを収得した。

収　率：保護ペプチド樹脂　１．７ｇ 粗ペプチド　　　　約４００ｍｇ 次に、粗ペプチドを以下の条件でＨＰＬＣにより精製し
た。

カラム：　ＹＭＣパックＤ−ＯＤＳ−５（２，１ｘ２５
ｃｍ） 溶出液：０．１％ＴＦＡ１０．０７５％ＴＦＡ。

９９．９％ＣＨ３ＣＮ ７０／３０→４０／６０　（１時間） 検　出：２０６ｎｍ 流　速：５＋ｎＱ／分 かくして精製ペプチド（以下「ペプチドＢ−１」という
）の２５０ｍＱを得た（収率６３％、粗ペプチドより）
。

得られたペプチドＢ−１の物性は次の通りでおった。

ＨＰＬＣによる解析： ５ｙｎｃｈｒｏｐａｃｋＲＰ　８　（４、１ｘ　２５０
ｍｍ＞を用いたＨＰＬＣ（溶出液：０．１％丁ＦＡ１０
．０７５％ＴＦＡ−９９．９％ＣＨ３０Ｎ＝１００１０
→４０／６０．３５分間、検出２０６ｎｍ、流速２．０
ｍＱ／分）の結果を第１図に示す。

図において縦軸は２０６ｎｍでの吸光度（ＯＤ＞（実線
で示す）及びＣＨ３ＯＮのグラジェント（Ｏ→６０％）
（破線で示ず〉を、横軸は溶出時間（分〉を示す。

アミノ酸分析値： 日立Ｌ−８５００型にて分析したアミノ酸分析結果を第
２表に示す。

第２表 上記表は丁ｙ「の値を１．００モルとして表示した。ま
た分析値の（）内数値は整数比を示す。

尚、上記アミノ酸分析値は、６Ｎ−塩酸による加水分解
（１１０°Ｃ１２４時間）後に測定した結果である。

製造例　２ 製造例１と同様にして、前記式（２）で表わされる本発
明ペプチド（以下「ペプチドＢ−２」という）を製造し
た。

そのＨＰＬＣによる解析パターンを、第１図と同様にし
て第２図に示す。

またそのアミノ酸分析値を下記第３表に示す。

アミノ酸分析値：　（日立１−８５００型にて分析）尚
、上記表（ユｉｌｅの値を２モルとして表示したもので
必り、（）内数値（ユ前記と同様でおる。

〈抗原（免疫原）の製造〉 製造例　１ ペプチドの合成製造例１て得たペプチドＢ−１の５ｍ（
Ｉｔを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５
＞１．０ｍ２に溶解し、こ（Ｄ溶液ニ１０１１１ｑのＫ
ＬＨを含む上記リン酸す（・リウム緩衝液１　ｍＱを加
えて混和した。次に、これに１　ｍＱの２０ｍＭグルタ
ルアルデヒド溶液をゆっくり滴下しながら加え、至温で
３０分間撹拌して反応させた。

得られた反応産物を４°Ｃ下に２日間リン酸緩衝生理食
塩水（ＰＢＳ）に対して透析して、所望の抗原（抗原−
１〉を得た。

製造例　２ ペプチドの合成製造例２で得たペプチドＢ−２を用いて
、上記製造例］と同様にして所望の抗原（抗原−２）を
得た。

〈本発明抗体の製造〉 製造例　１ ポリクローナル抗体の製造 抗原の製造例で得た抗原（抗原−１と抗原−２との１：
１混合物＞０．５ｍＱを”１．ＯｍＱのＰＢＳで希釈し
た後、１．５ｍ１２のアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ
　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合乳化さ
せ、これを１．０１１Ｑずつ、２羽の家兎の背中に３０
〜４０１１Ｎ所に別けて皮内投与した。更に２週間間隔
で３回、同様にして追加免疫を行なった。かくして、試
験動物２羽共に目的の抗体を産生じていることが、免疫
プロット法により確認された。

最終免疫から１週間後に、試験動物から全採血を行ない
、これを４°Ｃで一晩放置した後、遠心分離して、所望
の本発明抗体（抗血清）を得た。

製造例　２ モノクローナル抗体の製造 抗原の製造例で得た抗原（抗原−１と抗原−２との１：
１混合物）の０．０５ｍＱを０．５ｍＱのＰＢＳで希釈
した後、０．５ｍ２のアジュバント（ｃｏｍｐｌｅｔｅ
　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）と混合乳化さ
せ、これを０．２ｍ（２ずつ、５匹のＢＡＬＢ／ｃ系マ
ウス（８週齢）の背中に５〜１０個所に別けて皮下投与
した。更に２週間間隔で４回、同様にして追加免疫を行
なった。最終投与の３日後に、各マウスの牌臓より牌細
胞を取出し、該細胞中に存在する赤血球を０．８３％塩
化アンモニウム液で４°Ｃ下に１〜２分間処理して融解
除去した。上記で得られた細胞を感作リンパ球として、
数回ＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。

一方、ＨＧＰＲＴ欠損ＢＡＬＢ／ｃ由来Ｐ３Ｕ１細胞を
、１５％ＦＣ８を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地に、
８−アザグアニン１００μＭを加えた培地中で、継代培
養し、これをミエローマ細胞として用いた。

上記ミエローマ細胞５Ｘ１０７個を、上記で調製した感
作細胞５Ｘ１０８個と混合し、得られた細胞混合物を５
００Ｘｇで遠心後、これに３５％ポリエチレングリ］−
ル１５００（和光紬薬社製）４ｍＱを加えて細胞融合を
行なわせた。

ＨＡ丁培地で増殖してくるハイブリドーマを、ＢＡＬＢ
／ｃ系マウス胸腺細胞をフィーダーセルとして使用して
、限界希釈法（１’１ｅｔｈＯｄ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｑｙ、　　７３．３　（１９８１）　）によりクロー
ニングした。

ＥＬＩＳＡ法による目的抗体産生クローンの検索は、ヒ
ト正常線維芽細胞ＷＩ−３８を腫瘍ウィルスＳＶ４０で
悪化させた細胞ＷＩ−３８ＶＡ１３の培養上清から精製
した細胞型ＦＮとの反応性を指標として、血漿型ＦＮと
の反応性がないことを確認しながら、上記クローニング
を４回行ない、所望のモノクローナル抗体を得た。

得られた所望モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの
内の一つを、ｌ０ＡＩ−ＣＦ５２５Ｊとする。このもの
は通産省工業技術院微生物工業研究所（機工研）にｒＯ
ＡＬ−ＣＦ５２５ｊなる表示で寄託されてあり、その寄
託番号は［機工研菌奇第１００５２号（ＦＦＲＭ　　Ｐ
−１００５２）」でおる。

上記ハイブリドーマの産生する本発明抗体１０ＡＬ−Ｃ
Ｆ５２５ｊのザブクラスをオフタロニー法により決定し
た。

その結果上記抗体のサブクラスは、■ｃ＋Ｇ２ａであっ
た。

〈本発明抗体の各種［Ｎに対する反応性〉■　上記抗体
の製造例１で得た本発明抗体（抗血清）の種々のＦＮに
対する反応性を以下の通り調ぺた。

ＦＮ標品として（１）ヒト血漿より精製した血漿型ＦＮ
　（Ｐ）　、（２）ヒト正常線維芽細胞ＷＩ−３８の培
養上清から精製した細胞型ＦＮ　（ｎＣ）、（３）同Ｗ
Ｉ−３８を腫瘍ウィルスＳＶ４０で悪性化させた細胞Ｗ
Ｉ−３８ＶＡ１３の培養上清から精製した細胞型ＦＮ　
（ｔｃ）及び（４）ヒト胎盤より精製した胎児組織型Ｆ
Ｎ　（ｆ）の４種を用いた。

之等のＦＮを６％ポリアクリルアミドゲルを用いて５Ｄ
Ｓ−ゲル電気泳動を行ない、更に分離された蛋白質をニ
トロセルロース膜上ヘエレクトロブロツテイングにより
転写した。

まず、これを７７ストグリーン（Ｆａｓｔ　Ｇｒｅｅｎ
）を用いた蛋白染色を行なって写真撮影した。

また別に、上記ニトロセルロース膜を、２％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳ△）を含むＰＢＳで１０００倍希釈した
本発明抗体と、室温で２時間反応させた後、０．１％Ｂ
ＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄し、次いで１２５■で標識
したプロティンΔ（約２Ｘ１０６Ｃ１）ｍ　）を含む２
％ＢＳ△含有ＰＢＳ中で３０分間反応させた。これを０
．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで３回洗浄後、風乾し、Ｘ線
フィルムに密着させてオートラジオグラムを得た。

上記の各結果を第３図に示す。第３図の左のパネルは、
上記ファストグリーン染色後の結果を示すものであり、
第３図の右のパネルは上記オートラジオグラムの結果を
示している。また図の各レーンは、前記各ＦＮ標品を示
している。

該図かパネルより、各ＦＮはほぼ等量ずつニトロセルロ
ース膜に転写されでいることが判る。また該図右パネル
より、本発明抗体は血漿型「Ｎ（ｐ）とは反応せす、細
胞型ＦＮ　（ｎｃ；及び↑Ｃ）並びに胎児組織型ＦＮ（
ｆ）とのみ反応することが明らかである。更に、本発明
抗体は、正常腺維芽細胞が産生するＦＮ　（ｎｃ＞や胎
児組織型ＦＮ（ｆ）に比べて、ウィルスで悪化させた細
胞が産生するＦＮ（↑Ｃ）とより強く結合することが判
る。このことから本発明抗体の利用によれば、癌性ＦＮ
と他のＦＮとを識別できることが支持される。

■　また、前記抗体の製造例２で得た本発明抗体（モノ
クローナル抗体ｒＯＡＬ−ＣＦ５２５Ｊ　）の種々のＦ
Ｎに対する反応性を以下の通り調べた。

即ち、ヒト血漿より精製したＦＮと、ＷＩ−３８ＶＡ１
３の培養上清から精製した細胞型ＦＮとをそれぞれ同相
化させた９６穴プラスチツクプレートを用いて、ＥＬＩ
ＳＡ法により、本発明抗体の之等各ＦＮに対する反応性
を調べた。尚、抗体は、ｒＯＡＬ−ＣＦ５２５Ｊの培養
上清を１５％ＦＣ３を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にて
希釈して利用した。

上記結果を第４図に示す。

図において縦軸は４９２ｎｍでのＯＤを、横軸は抗体の
希釈倍数を示し、（１）が細胞型ＦＮの結果、（２）が
血漿型ＦＮの結果である。

該図より、本発明抗体は血漿型ＦＮとは反応せず、細胞
型ＦＮ　（ｔｃ）と用量依存的に反応することが明らか
でおる。

次いで、前記■と同様にして、４種のＦＮを、４〜１５
％グラジェントポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳
動を行ない、ニトロセルロース膜へエレクトロブロッテ
ィングにより転写し、之等と本発明抗体０ＡＬ−ＣＦ５
２５との反応性を調べた。尚、本発明抗体は、培養上清
を２％ＢＳＡを含むＰＢＳで５０倍に希釈して用いた。

その他の条件は前記■と同じとした。

上記試験の結果は、第３図と同様であり、このことより
、本発明抗体ＯＡＬ、−ＣＦ５２５は前記■に示した家
兎から得られた本発明ポリクローナル抗体と同様の反応
性を有していることが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明ペプチドの製造例１で得たペプチドＥＤ
ＢｉのＨＰＬＣ解析結果を示すグラフ、第２図は本発明
ペプチドの製造例２で得たペプチドＥＤＢ−２のＨＰＬ
Ｃ解析結果を示すグラフ、第３図は本発明抗体の製造例
１で得られた抗体の種々のＦＮに対する反応性を、ＰＡ
ＧＥ−８ＤＳゲル電気泳動及びオートラジオグラムによ
り調べた結果を示す図面に代る写真、並びに第４図は抗
体の製造例２で得た本発明抗体と各種ＦＮとの反応性を
調べた結果を示すグラフである。 （以　上）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　下記式（１）、（２）又は（３）のアミノ酸配列中
   に抗原決定基を有することを特徴とする抗ＥＤ−Ｂ抗体
   。 （１）：ＥＧＩＰＩＦＥＤＦＶＤＳＳＶＧＹ（２）：Ｙ
   ＴＶＴＧＬＥＰＧＩＤＹＤＩＳ （３）：ＮＧＧＥＳＡＰＴＴＬＴＱＱＴ