CZ295531B6

CZ295531B6 - Izolovaná protilátka, způsob její výroby a použití

Info

Publication number: CZ295531B6
Application number: CZ19983815A
Authority: CZ
Inventors: Dario Neri; Barbara Carnemolla; Annalisa Siri; Enrica Balza; Patrizia Castellani; Alessandro Pini; Luciano Zardi; Gregory Paul Winter; Giovanni Neri; Laura Borsi
Original assignee: Philogen S. R. L.
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-23
Publication date: 2005-08-17
Also published as: HK1020990A1; JP4750912B2; ATE361364T1; KR20050010081A; DK0906426T3; BG102950A; SK161298A3; CA2256308C; GB9610967D0; PL188557B1; US8703143B2; US20140134182A1; EP0906426B1; IL127216A; WO1997045544A1; AU2910197A; KR20060035812A; BR9709350A; DE69737683D1; JP2000511416A

Abstract

Popisuje se specificky se vázající člen, který je specifický k ED-B onkofetální doméně fibronektinu (FN) a přímo se na ni váže. Rovněž jsou popsány materiály a způsoby produkce takových vazebných členů.ŕ

Description

Vynález se vztahuje na členy, konkrétně protilátky nebo jejich fragmenty, vázající se specificky na zárodečnou izoformu fíbronektinu označovanou ED-B, kterou také exprimují vyvíjející se nevaskulární nádory, jak bylo prokázáno cestou imunocytochemie a při cíleném zavádění do nádorů in vivo. Vynález se dále týká materiálů a metod, které se vztahují k těmto specificky se vázajícím členům.

Dosavadní stav techniky

Primárním cílem většiny existujících forem terapie nádorů je usmrtit co nejvíce konstitutivních buněk nádoru, jak jen je možné. Omezený úspěch, kterého se dosáhlo metodami chemoterapie a radioterapie, souvisí s relativním nedostatkem specificity léčby a s tendencí k toxickým vedlejším účinkům na normální tkáně. Jednou z cest, jak lze dosáhnout zlepšení selektivity léčby nádorů, je zavedení činidla přímo do nádoru pomocí vazebného proteinu, který obvykle obsahuje vazebnou doménu protilátky se specificitou pro markerový antigen, jenž se exprimuje na povrchu nádoru, ale nenachází se na normálních buňkách. Tato forma cílové terapie, která se volně nazývá „magie bullets“, je dosud demonstrována hlavně pomocí monoklonálních protilátek (mAbs), které pochází z hlodavců a které jsou specifické pro tak zvané antigeny spojené s nádory. Tyto antigeny se exprimují na povrchu buněk. Takové monoklonální protilátky se spojují s cytotoxickou látkou chemickou cestou (např. toxin nebo lék) nebo se mohou produkovat jako rekombinantní fúzní protein, kde geny kódující mAb a toxin jsou spojeny a exprimují se v tandemu.

Přístup označovaný „magie bullet“ má omezený, ačkoli podstatný, účinek při léčbě lidské rakoviny, zvláště při zavádění do nádorů lymfatického původu, kde maligní buňky jsou nejpřístupnější terapeutické dávce během cirkulace. Léčba pevných nádorů však zůstává vážným klinickým problémem. Tento problém spočívá v tom, že pouze malá část celkové buněčné masy, převládající nejperifemější buňky nádoru, je vystavena cirkulujícím terapeutickým imunokonjugátům; tyto periferní cíle tvoří tak zvanou „bariéru vazebných míst“ vnitřní části nádoru (Juweid et atl., 1992, Cancer Res. 52, 5144-5153). V nádoru je tkáň obecně velmi hustá, tvoří ho vláknitá podpůrná tkáň a nádorové buňky, které jsou umístěné velmi blízko sebe, což umožňuje penetraci molekul v rozmezí velikostí odpovídající protilátkám. Nádory jsou však známy, že mají zvýšený intersticiální tlak, za který odpovídá nedostatek lymfatických cév, což ohrožuje přístup exogenních molekul. V publikaci Jain, R (1994), Sci. Am. 271 58-65 se popisují faktory, které ovlivňují vstup terapeutických činidel do nádorů.

Ačkoli existuje zřejmé omezení při léčbě nádorů pomocí cíleného zavádění antigenů do nádorů, tyto nádory mají běžný rys, který poskytuje alternativní antigenní cíl pro protilátkovou terapii. Jestliže nádory dorostou do určité velikosti, jsou univerzálně závislé, aby si udržely přívod kyslíku a nutrientů pro svůj růst, na nezávislém, přísunu krve. V případě, že tato dodávka krve je zablokována nebo uzavřena, existuje realistický potenciál vyhladovět tisíce nádorových buněk. Jak se nádor vyvíjí, přechází na angiogenní fenotyp, přičemž produkuje odlišný soubor angiogenních faktorů, které působí na okolní endoteliální buňky kapilár, přičemž se indukuje jejich množení a migrace. Struktura těchto nově vytvořených krevních cév, na rozdíl od uspořádané struktury kapilár v normální tkáni, je vysoce neorganizovaná se slepými konci a s perforacemi, které vedou k únikům. Indukce angiogeneze je doprovázena neregulovanou expresí jistých buněčných povrchových antigenů, kdy řada z nich jsou běžné při vaskularizaci normální tkáně. Identifikované antigeny, které se vyskytují pouze při neovaskularizaci nádorů, jsou hlavním limitujícím faktorem při vývoji generické léčby pevných nádorů prostřednictvím vaskulárního cíleného zavádění. Antigen, který je předmět tohoto vynálezu přímo souvisí s tímto problémem.

-1 CZ 295531 B6

Během vývoje nádoru se extracelulámí matrice okolní tkáně remodeluje dvěma hlavními postupy: (1) proteolytická degradace komponentů extracelulámí matrice normální tkáně a (2) de novo syntéza komponentů extracelulámí matrice nádorovými buňkami a buňkami podpůrné tkáně, která se aktivuje nádorem indukovanými cytokíny. Tyto dva postupy generují „nádorovou extracelulámí matrici“, která poskytuje vhodnější prostředí pro vývoj nádoru a kvantitativně a kvalitativně se liší od prostředí normálních tkání. Mezi komponenty uvedené matricejsou velké izoformy tenaskinu a fíbronektinu (FN); popis těchto proteinů, jako izoforem uvádí jejich rozsáhlou strukturální heterogenitu, která se získá na stupni transkripce, post-transkripčního a post-translaěního zpracování (uvedeno dále v textu). Předmětem vynálezu je jedna izoforem fíbronektinu, která se nazývá izoforma B+ (B-FN).

Fibronektiny (FN) mají více funkcí. Glykoproteiny s vysokou molekulovou hmotností tvoří extracelulámí matrice a tělní kapaliny. Podílejí se na řadě různých biologických postupů, jako je zajištění a udržení normální buněčné morfologie, migrace buněk, haemostáze a trombózy, hojení ran a onkogenní transformace (popisuje se v publikacích Alitalo et al., Adv. Cancer Res. 37, 111-158 (1982); Yamada, 1983; Hyneš Ann., Rev. Cell Biol. 1, 67-90 (1985); Owens et al., Oxf. Surv. Eucaryot. Genes 3, 141-160(1986);). Strukturální diverzita FN se získá alternativním sestřihem tří oblastí (ED-A, ED-B a IIICS) primárního transkriptu FN (Hyneš Ann., Rev. Cell Biol. 1, 67-70(1985); Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342(1987), aby vzniklo nejméně 20 různých izoforem, přičemž některé z nich se odlišně exprimují v nádoru nebo v normální tkáni. Stejně jako regulace tkáňově a vývojově specifickým způsobem je známo, že patem sestřihu FN-pre-mRNA je v transformovaných a maligních buňkách deregulován (Castellani et al., J. Cell. Biol. 103, 1671-1677 (1986); Borsi et al., J. Cell. Biol. 104, 595-600 (1987); Vartio et al., J. Cell Science 88, 419-430 (1987), Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987); Barone et al., EMBO J. 8, 1079-1085 (1989); Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989); Oyama et al., J. Biol. Chem. 10331-10334(1989); Oyama et al., Cancer Res. 50, 1075-1078 (1990); Borsi et al., Exp. Cell Res. 199, 98-105 (1992b)). Izoformy FN obsahující sekvence ED-A, ED-B a IIICS se exprimují ve větším rozsahu v transformovaných buňkách a v buňkách maligních nádůrů. Zvláště izoforma FN obsahující sekvenci ED-B (B+ izoforma) se silně exprimuje v zárodečné a nádorové tkáni, stejně jako během hojení ran, ale exprese je omezena v normálních dospělých tkáních (Norton a Hyneš, Mol. Cell. Biol. 7, 4297-4307 (1987); Gutman aKomblihtt, Proč. Nati. Acad. Sci USA 90 7179-7182, 1987;); Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989); Ffrench-Constant et al., J. Cell Biol. 109, 903-914(1989); Ffřench-Constant et al., Development 106, 375-388 (1989); Laitinen et al., Lab. Invest. 64, 375-388 (1991)). Molekuly B+ FN nejsou v dospělých cévách detekovatelné, ale při normálním (např. vývoj endometria), patologickém (např. při diabetické retinopatii) a nádorovém vývoji (Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994) angiogenních krevních cév je jejich množství vysoké.

Sekvence ED-B je celá homologní repetice typu III, která je kódovaná jediným exonem a obsahuje 91 aminokyselin. Na rozdíl od alternativně sestřihované izoformy IIICS, která obsahuje vazebné místo specifické k buněčnému typu, biologická funkce izoforem A+ a B+ je stále předmětem spekulace (Humphries et al., J. Cell Biol. 103, 2637-2647 (1986).

Samotná přítomnost izoformy B+ tvoří nádorem indukovaný neoantigen, ale navíc exprese ED-B vyjadřuje normálně kryptický antigen v repetici 7 typu III (předcházející ED-B); protože tento epitop není v molekulách FN, kterým chybí ED-B, vyjádřen, což umožňuje, že exprese ED-B indukuje přímou a nepřímou expresi neoantigenů. Toto kryptické antigenní místo tvoří cíl monoklonálních protilátek (mAb), které se nazývají BC-1 (Camemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992). Specifíta a biologické vlastnosti těchto mAb se popisují v EP 0 344 134 B1 a je možné získat z hybridomu uloženého v instituci European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, Salisbury, UK s přístupovým číslem 88042101. Monoklonální protilátky se úspěšně používají při lokalizaci angiogenních krevních cév nádorů, aniž zkříženě reagují

-2CZ 295531 B6 s dospělým vaskulárním endoteliem, což ukazuje potenciál izoforem FN při vaskulárním cílovém zavádění za použití protilátek.

Stále však existují jisté námitky ke specifícitě monoklonálních protilátek BC-1. Na základě skutečnosti, že BC-1 přímo nerozeznává izoformu B+, vyvstala otázka, zda v některých tkáních je možné odmaskovat epitop, který je rozpoznáván protilátkami BC-1, aniž je přítomna ED-B, což vede nepřímo k nechtěné zkřížené reaktivitě BC-1. BC-1 je mimoto přísně specifická pro lidskou izoformu B+, což znamená, že studie biodistribuce BC-1 a její lokalizace v nádoru na zvířatech není možná. Ačkoli byly produkovány polyklonální protilátky proti rekombinantním fúzním proteinům, které obsahují izoformu B+ (Peters et al., Cell. Adhes. Commun. 3, 6789 (1995), tyto reagují pouze s FN, na které se aplikovala N-glykanáza za účelem odkrytí epitopu.

Další obecný problém s použitím myších monoklonálních protilátek je odezva na anti-myší protilátky u lidí (HAMA) (Schroff et al., 1985, Cancer Res. 45: 879-885; Dejager et al., (1988), Proč. Am. Assoc. Cancer Res. 29:377). HAMA odezva má rozmezí účinků od neutralizace aplikované protilátky vedoucí ke snížení terapeutické dávky, přes alergické reakce, sérové onemocnění po renální poškození.

Ačkoli byla identifikována polyklonální antiséra reagující s rekombinantní ED-B (viz výše), izolace mAb se stejnou specificitou jako BC-1 po imunizaci myší se obecně ukázala obtížnou, protože lidské a myší proteiny ED-B vykazují prakticky 100% sekvenční homologii. Lidský protein může proto pro myši vypadat jako autoantigen a myš si pak proti němu nevytvoří imunitní odezvu. Ve skutečnosti byla po několika letech usilovného bádání v této oblasti identifikována pouze jediná mAb s nepřímou reaktivitou kFN izoformě B+ (BC-1), přičemž žádná přímo nerozeznává ED-B. Je téměř jistě významné, že specificita BC-1 se pro kiyptický epitop odkrývá v důsledku ED-B, spíše než pro část samotného ED-B, který pravděpodobně v myším FN chybí, a není proto myším imunitním systémem nahlížen jako „vlastní“.

Realizace vynálezu se dosáhlo použitím strategie alternativní k dříve používaným strategiím, kde předchozí imunizace s fibronektinem nebo ED-B není nutná: získaly se protilátky se specificitou pro izoformu ED-B jako jeden řetězec Fvs (scFvs) z knihoven lidských protilátek variabilních oblastí vyjádřených na povrchu vláknitého bakteriofága (Nissim et al., EMBOJ. 13, 692698(1994), dále také WO 92/01407, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172).

S použitím protilátkové fágové knihovny jsme zjistili, že se mohou izolovat specifické csFv jak přímou selekcí rekombinantních fragmentů FN obsahujících doménu ED-B, tak samotné rekombinantní ED-B, kdy tyto antigeny potahují pevný povrch („panning“). Stejné zdroje antigenu se s úspěchem použily také při produkci „druhé generace“ scFv s vylepšenými vlastnostmi příbuznými s rodičovskými klony v procesu „afinitní maturace“. Zjistili jsme, že izolované scFv silně a specificky reagují s izoformou B+ lidského FN bez předchozí aplikace N-glykanázy.

Při anti-nádorových aplikacích mají lidské vazebné domény protilátkového antigenu podle vynálezu výhodu, že nejsou subjektem odezvy HAMA. Navíc, jak vyplývá z dále uvedených příkladů, jsou použitelné při imunohistochemické analýze nádorové tkáně jak in vivo, tak in vitro. Tato a další použití jsou odborníkům zřejmá.

Terminologie

Specificky se vázající člen.

Termín popisuje člena páru molekul, které mají vzájemnou vazebnou specifícitu. Členové specifického vazebného páru se mohou získat přirozenou cestou nebo se mohou zcela nebo zčásti syntetizovat. Jeden člen páru molekul má na svém povrchu oblast nebo dutinu, prostřednictvím

-3CZ 295531 B6 které se váže na určitou prostorovou a polární organizaci dalšího člena pásu molekul. Pak členové páru molekul se vzájemně specificky vážou jeden k druhému. Příklady typů specificky se vázajících párů jsou dvojice antigen-protilátka, biotin-avidin, receptor hormon-hormon, receptor-ligand, enzym-substrát.

Protilátky

Termín „protilátky“ popisuje imunoglobulin produkovaný přirozeným způsobem nebo částečně nebo zcela syntetický. Termín také zahrnuje polypeptid nebo protein, který m,á vazebnou doménu, která je protilátkovou vazebnou doménou nebo je s ni homologní. Protilátky se dají získat z přirozených zdrojů nebo se mohou částečně nebo zcela syntetizovat. Příklady protilátek jsou imunoglobulinové izotypy a jejich izotypické podtřídy; fragmenty, které obsahují doménu vázající antigen, jako je Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; a diabody.

Je možné vzít monoklonální a jiné protilátky a za použití metod genového inženýrství vytvořit jiné protilátky nebo chimérické molekuly, které si ponechávají specifítu původních protilátek. Takové metody například mohou zahrnovat zavedení DNA kódující variabilní oblast imunoglobulinu nebo oblasti určující komplementaritu (CDR) protilátek proti konstantním oblastem nebo konstantním oblastem plus rámcovým oblastem odlišného imunoglobulinu, což se popisuje například v EP-A-184187, GB 2188638A nebo EP-A-239400. Hybridom nebo jiné buňky, které produkují protilátky se mohou stát předmětem genových mutací nebo jiných změn, které mohou nebo nemusí pozměnit vazebnou specificitu produkovaných protilátek.

Protilátky se mohou modifikovat řadou způsobů. Termín „protilátky“ zahrnuje specificky se vázající členy nebo látky, které mají vazebnou doménu s požadovanou specificitou. Dále zahrnují fragmenty protilátek, deriváty, funkční ekvivalenty a homology protilátek, libovolný polypeptid obsahující vazebnou doménu imunoglobulinu, ať už jsou připraveny přirozenou cestou, nebo zčásti nebo zcela syntetizovány. Dále zahrnují chimérické molekuly obsahující vazebnou doménu imunoglobulinu nebo ekvivalentu fúzovaného s jiným polypeptidem. Klonování a exprese chimérických protilátek se popisují v EP-A-0120694 a EP-A-0125023.

Zjistilo se, že fragmenty celých protilátek vykonávají funkci navázání antigenů. Příklady vazebných fragmentů jsou (i) Fab fragment obsahující VL, VH, CL a CH1 domény; (ii) Fd fragment obsahující domény VH a CH1; (iii) fragment Fv obsahující domény VL a VH jedné protilátky;

(iv) fragment dAb (Ward, E. S. et al., Nátuře 341, 544-564 (1989), který obsahuje doménu VH;

(v) izolované oblasti CDR; (vi) fragmenty F(ab')2, což jsou bivalentní fragmenty obsahující dva spojené fragmenty Fab, (vii) jednořetězcová molekuly Fv (scFv), kde doména VH a VL jsou spojeny peptidovým linkerem, který umožňuje spojení dvou oblastí za vytvoření vazebného místa pro antigen (Bird et al., Science, 242, 423-426. (1988), (viii) bispecifické jednořetězcové diméry Fv (PCT/US92/09965) a (ix) „diabodies“, což jsou multivalentni a multispecifické fragmenty konstruované fúzí genů (WO 94/13804; Holliger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90 64446448, 1993).

„Diabodies“ jsou multiméry polypeptidů, kde každý polypeptid obsahuje první doménu, která zahrnuje vazebnou oblast lehkého řetězce imunoglobulinu, a druhou doménu, jež zahrnuje vazebnou oblast těžkého řetězce imunoglobulinu. Tyto dvě domény jsou spojeny (např. peptidovým linkerem), ale nejsou schopny se spojit vzájemně za vzniku vazebného místa pro antigen: vazebná místa pro antigen se tvoří spojením první domény jednoho polypeptidu v multiméru s druhou doménou jiného polypeptidu v multiméru (WO 94/13804).

V případě, že se používají bispecifické protilátky, mohou to být běžné bispecifické protilátky, které se mohou vyrábět různými způsoby (Holliger, P. a Winter G., Current Opinion Bitechnol. 4, 446-449 (1993)) například chemickou cestou nebo z hybridních hybridomů nebo to mohou být libovolný ze shora zmíněných bispecifických protilátkových fragmentů. Může se preferovat spíše použití dimérů scFv nebo „diabodies“ než celých protilátek. „Diabodies“ a scFv se mohou konst

-4CZ 295531 B6 ruovat bez oblasti Fc, za použití pouze variabilních oblastí, které silně redukují účinky antiidiotypické reakce. Jiné formy bispecifických protilátek zahrnují jeden řetězec „Janusins“ popsaný v publikaci Traunecker et al., Embo Joumal, 10, 3655—3659, (1991).

Bispecifické „diabodies“ narozdíl do bispecifických celých protilátek se mohou také zvláště používat, protože jejich konstrukce a exprese v bakteriích E. coli je snadná. Snadno se mohou vybrat „diabodies“ (a řada jiných polypeptidů, jako jsou fragmenty protilátek) vhodné vazebné specifity za použití fágové knihovny (WO 94/13804). V případě, že jedno rameno „diabody“ se udržuje konstantní, například se specifitou řízenou proti antigenu X, může se pak vytvořit knihovna, kde další rameno je variabilní a vyberou se protilátky s vhodnou specifitou.

Vazebná doména pro antigen

Tento termín popisuje část protilátek, která obsahuje oblast, která se specificky váže na část nebo na celý antigen a je s ním komplementární. V případě, že antigen je velký, protilátka se může vázat pouze na jeho část, která se nazývá epitop. Vazebnou doménu pro antigen může tvořit jedna nebo více variabilních domén protilátek. Upřednostňuje se, aby vazebná doména pro antigen byla variabilní oblast (VL) lehkého řetězce protilátek a variabilní oblast (VH) těžkého řetězce protilátek.

Specifický

Termín „specifický“ označuje situaci, kdy jeden člen specifického vazebného páru nevykazuje podstatnou vazbu na jinou molekulu než je jeho specifický vazebný partner. Termín se vztahuje také na případ, když například vazebná doména pro antigen je specifická pro určitý epitop, který je nesen řadou antigenů, přičemž v tomto případě specifický vazebný člen nesoucí vazebnou doménu pro antigen bude se schopen vázat na různé antigeny nesoucí tento epitop.

Funkčně ekvivalentní forma varianty.

Tento termín zahrnuje molekulu (variantu), která ačkoli vykazuje strukturální odlišnosti s jinou molekulou (rodičovskou), si uchovává podstatnou homologii a také alespoň některé z biologických funkcí rodičovské molekuly, např. schopnost vázat se na určitý antigen nebo epitop. Varianty se mohou vyskytovat ve formě fragmentů, derivátů nebo mutantů. Varianta, derivát nebo mutant se může získat modifikací rodičovské molekuly adicí, delecí, substitucí nebo inzercí jedné nebo více aminokyselin nebo spojením s jinou molekulou. K těmto změnám může dojít na úrovni nukleotidu nebo proteinu. Kódovaným polypeptidem může být například fragment Fab, který se pak naváže na zakončení FC z jiného zdroje. V jiném případě se může navázat markér, jako je například enzym, fluorescein atd.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je izolovaná protilátka nebo její fragment, která je specifická k onkofetální doméně ED-B fibronektinu (FN) a přímo se na ni váže, kde tato protilátka nebo fragment má disociační konstantu Kd pro ED-B nižší než 1 x 10~⁷ M, měřeno jako vyčištěný monomer.

Specificky se vázající členy podle vynálezu vážou doménu ED-B přímo. V jednom provedení se specificky se vázající člen váže po aplikaci proteázy thermolysinu na FN na libovolný nebo na všechny FN obsahující ED-B. V dalším provedení se specificky se vázající člen váže na libovolný nebo všechny FN obsahující homologní repetice typu ΠΙ, které zahrnují doménu ED-B. Známé FN jsou identifikovány ve dvou pracích Camemolla et al., J. Biol. Chem. 2468924692 (1992) a Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989). Odkaz na „všechny FN obsahující ED-B“ se může brát jako odkaz na všechny FN identifikované v těchto pracích jako obsahující ED-B.

-5CZ 295531 B6

Specificky se vázající člen přednostně váže lidský ED-B a přednostně B+FN nejméně jednoho dalšího druhu, jako je myš, krysa a/nebo kuře. Přednostně je specificky se vázající člen páru schopen vázat jak lidskou, tak ne-lidskou ED-B fibronektinu, jako je myší ED-B, což umožňuje testování a analýzu sbp člena ve zvířecím modelu.

Specificky se vázající párový člen podle vynálezu váže ED-B fibronektinu bez soutěžení s veřejně dostupnou uloženou protilátkou BC-1, diskutovanou zde na jiném místě. BC-1 je striktně specifická pro lidskou isoformu B+. Specificky se vázající párové členy podle vynálezu se nevážou na stejný epitop jako BC-1.

Navázání specificky se vázajícího člena podle vynálezu na B+FN může být inhibováno doménou ED-B.

Podle vynálezu vazebná doména vykazuje, jestliže se měří jako čištěný monomer, hodnotu disociační konstanty (Kd) 6 x 10 ⁸ M nebo v případě ED-B FN menší.

V souladu s vynálezem je vazebná doména reaktivní, tj. je schopna se vázat, e ED-B fibronektinu bez předchozího ošetření ED-B fibronektinu N-glykanázou.

Specificky se vázající párové členy podle vynálezu mohou být ve formě izolátů nebo v čištěné formě, tzn. v přípravku nebo formulaci neobsahující jiné specifické vazebné párové členy, například protilátky nebo fragmenty protilátek nebo neobsahující jiné specificky se vázající na ED-B fibronektinu. Přednostně jsou specificky se vázající párové členy podle vynálezu ve v podstatě čisté formě. Mohou být „monoklonální“ ve smyslu toho, že pocházejí z jednoho klonu, místo toho, aby byly omezeny na protilátky získaní tradiční technologií hybridomů. Jak uvedeno, specificky se vázající párové členy podle vynálezu se mohou získat za použití technologie vyjádření bakteriofága a/nebo exprese v rekombinantních, například bakteriálních hostitelských buňkách. Neexistuje dřívější zpráva o monoklonálním specificky se vázajícím párovém členu, který přímo váže ED-B fibronektinu.

Přednostně obsahuje specificky se vázající člen protilátku. Specificky se vázající člen může obsahovat polypeptidovou sekvenci ve formě fragmentu protilátky, jako je jediná řetězec Fv (scFv). Mohou se také využívat jiné typy fragmentů protilátek, jako jsou Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb nebo „diabody“ (Winter, G a C. Milstein, Nátuře 349,293-299, 1991; WO 94/13804). Specificky se vázající člen může být ve formě celé protilátky. Celá protilátka může být v libovolné z forem protilátkových izotypů, např. IgG, IgA, IgD, IgE a IgM a v libovolné formě izotypových podtříd, například IgGl nebo IgG4.

Protilátka může být libovolného původu, například lidského, myšího, ovčího nebo králičího. Další odvození jsou odborníkům zřejmá. Přednostně je protilátka lidského původu. Termín „lidský“ znamená protilátku, která je částečně nebo zcela odvozena z knihovny lidské cDNA, proteinů nebo peptidů. Tento termín zahrnuje humanizované peptidy a proteiny, které nemají lidské původ, jež byly modifikovány za účelem dodat molekule protilátky lidské charakteristiky a tak jí umožnit obejít obranu lidského imunitního systému.

Specificky se vázající člen se může také vyskytovat ve formě inženýrsky konstruované protilátky, například bispecifické molekuly protilátky (nebo fragmentu, jako je F(ab')2), která má jedno rameno vázající antigen (tj. specifickou doménu) proti ED-B fibronektinu podle vynálezu a další rameno proti odlišné specificitě, nebo bivalentní nebo multivalentní molekuly.

Vedle sekvencí protilátek může specificky se vázající člen obsahovat jiné aminokyseliny, např. tvořící peptid nebo polypeptid nebo udílející molekule vedle schopnosti vázat antigen další funkční charakteristiku. Specificky se vázající člen může například obsahovat značku, enzym nebo jeho fragment atd.

-6CZ 295531 B6

Vazebná doména může obsahovat část nebo celou doménu VH kódovanou segmentem zárodečné linie nebo znovu uspořádaným genovým segmentem. Vazebná doména může obsahovat část nebo celou doménu VL kappa nebo VL lambda.

Vazebná doména může obsahovat VH1, VH3 nebo VH4 genové sekvence zárodečné linie nebo jejich znovu uspořádanou formu.

Specificky se vázající člen podle vynálezu může obsahovat těžký řetězec variabilní oblasti („VH“ oblasti) získaný z lidské zárodečné linie DP74, sekvenci, která je zobrazena na obr. č. l(a), zbytky 1 až 98. Nomenklatura „DP“ se popisuje v publikaci Tomlinson I. M. et al., (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798. Aminokyselinová sekvence CDR3 může být ser Leu Pro Lys. Aminokyselinová sekvence CDR3 může být Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu. Pak vazebná doména specificky se vázajícího člena podle vynálezu může zahrnovat VH doménu, která obsahuje aminokyselinové sekvence na obr. č. l(a) pro CGS1 a CGS2.

Vazebná doména může obsahovat variabilní oblast lehkého řetězce („VL“ doménu) získanou z lidské zárodečné linie DPL16, sekvenci, která je zobrazena na obr. č. l(b) jako kodony 1 až 90.

Doména VL může obsahovat sekvenci CDR3 Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val. Doména VI může obsahovat sekvenci CDR3 Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.

Specificky se vázající členy podle vynálezu mohou obsahovat funkčně ekvivalentní varianty sekvencí, které jsou zobrazeny na obr. č. 1, např. kde se začlenily, deletovaly, substituovaly nebo přidaly jedna nebo více aminokyselin, což poskytlo uvedené vlastnosti. Může se změnit sekvence CDR3 nebo se může provést jedna nebo více změn v rámcových oblastech nebo rámec může být nahrazen jinou rámcovou oblastí nebo modifikovanou formou za vzniku specifického vazebného člena, který váže ED-B.

Jeden nebo více CDR z domén VI nebo VH zde popsaných protilátek, které vážou antigen, se může použít při tzv. „implantaci CDR“, při které je jedna nebo více sekvencí CDR prvních protilátek umístěna do sekvencí rámce, který nesouvisí s protilátkami, např. jiných protilátek, jak se popisuje v EP-B-0239400. CDR sekvence pro CGS1 a CGS2 jsou uvedeny na obr. č. 1 (a) a 1 (b).

Specificky se vázající člen podle vynálezu může být ten, který při vazbě s ED-B fibronektinu konkuruje protilátkám nebo zde popsanému scFv. Konkurence mezi specificky se vázajícími členy se může jednoduše testovat in vitro, například připojením specifické reportní molekuly k jednomu specificky se vázajícímu členu, který se může detekovat v přítomnosti jiných nepřipojených vazebných členů, což umožňuje identifikaci specificky se vázajícího člena, který se váže na stejný epitop nebo přesahující epitop.

Specificky se vázající člen podle vynálezu se může využít při metodě, která způsobuje nebo umožňuje vazbu specificky se vázajícího člena na jeho epitop. Navázání může následovat po aplikaci specificky se vázajícího člena savci, například člověku nebo hlodavci, jako je myš.

Vynález popisuje použití specificky se vázajícího člena jako diagnostického činidla v případě nádorů. Experimentální důkaz na zvířecím modelu, jak se popisuje dále v textu, ukazuje, že specificky se vázající členy podle vynálezu se používají při in vivo lokalizaci nádoru.

Preferovanými specificky se vázajícími členy podle vynálezu jsou ty, které se váží na lidské nádory, například v sekci kryostatu, které vykazují invazivní a angiogenní fenotyp a které se vážou na embryonální tkáně, např. v sekci kryostatu. Navázání se může demonstrovat imunocytochemickým barvením.

V preferovaném provedení vynálezu se specificky se vázající člen neváže nebo se v podstatě neváže na tenaskin, což je extracelulární matricový protein.

V jiném preferovaném provedení vynálezu se specificky se vázající člen neváže na nebo se v podstatě neváže na normální lidskou kůži, například v sekci kryostatu a/nebo jak se demonstrovalo použitím imunocytochemického barvení.

Další provedení specificky se vázajících členů podle vynálezu se neváže nebo se v podstatě neváže na jeden nebo více normálních tkání (např. v sekci kryostatu a/nebo jak se demonstruje použitím imunocytochemického barvení) vybraných ze skupiny, která zahrnuje játra, slezinu, ledviny, žaludek, tenké střevo, tlusté střevo, vaječníky, děloha, močový měchýř, pankreas, suprarenální žlázy, skeletový sval, srdce, plíce, štítná žláza a mozek.

Specificky se vázající člen pro ED-B se může použít jako činidlo pro cílové zavádění in vivo, které se může použít při demonstraci přítomnosti a lokalizace nádorů, které exprimují nebo jsou jinak spojeny s ED-B fibronektinu. Mohou se používat jako zobrazovací činidlo. Vynález popisuje metodu stanovení přítomnosti buňky nebo nádoru, který exprimuje nebo je jinak spojen s expresí ED-B fibronektinu, přičemž způsob zahrnuje kontakt buněk se specificky se vázajícím členem a stanovení navázání specificky se vázajícího člena na buňky. Způsob se může uskutečnit in vitro na testovacím vzorku buněk, které se izolovaly z těla.

Reaktivita protilátek v buněčném vzorku se může stanovit vhodným způsobem. Jedna z možností je označení s jednotlivými reportními molekulami. Reportní molekuly mohou přímo a nepřímo generovat detekovatelný a přednostně měřitelné signály. Spojení reportních molekul může být přímé nebo nepřímé, kovalentní, například prostřednictvím peptidové vazby nebo nekovalentní. Spojení prostřednictvím peptidové vazby může být jako výsledek rekombinantní exprese genové fúze, která kóduje protilátky a reportní molekulu.

Jedním z výhodných spojení je kovalentní spojení každé protilátky a jediným fluorochromem, fosforem nebo laserovým barvivém se spektrálně izolovanými absorpčními nebo emisními charakteristikami. Mezi vhodné fluorochromy patří fluoroscein, rhodamin, fykoerytrina texasová červeň. Vhodná chromogenní barviva zahrnují diaminobenzidin.

Jiné reportní molekuly zahrnují makromolekulové koloidní partikule nebo částicový materiál, takový jako jsou latexové kuličky, které jsou obarvená, magnetická nebo paramagnetická abiologicky nebo chemicky aktivní činidla, která mohou přímo nebo nepřímo způsobovat detekovatelné signály, aby mohly být pozorovány vizuálně, elektronicky detekovatelné nebo jinak zaznamenávány. Těmito molekulami mohou být například enzymy, které katalyzují reakce, které vyvíjí nebo mění barvy a způsobují změny elektrických vlastností. Molekuly mohou být molekulárně excitabilní tak, že elektronická transitace mezi energetickými stádii vede k charakteristické spektrální absorpci nebo emisi. Mohou zahrnovat chemické entity používané ve spojení s biosenzory. Jsou to spojení biotin/avidin nebo biotin/streptavidin a detekční systémy založené na alkalické fosfatáze.

Mód stanovující vazbu není rysem vynálezu a odborník je schopen vybrat vhodný mód na základě svých preferencí a obecných znalostí.

Signály generované jednotlivými konjugáty protilátka-reportní molekula se mohou používat k získání kvantifikovatelných absolutních nebo relativních dat relevantního navázání protilátek v buněčných vzorcích (normálních a testovaných). Navíc při použití obecného barvení jádra je možné stanovit ve vzorku celkovou buněčnou populaci, což umožňuje stanovit kvantitativní poměry jednotlivých buněčných populací vztahujících se k celkovému počtu buněk. V případě že se k radioaktivně značené nukleotidy ¹²³I, ⁱⁿIn nebo ^99mTc připojí k protilátkám, pak se tyto protilátky přednostně lokalizují v nádoru spíše než v normálních tkáních. Přítomnost radioaktiv

-8CZ 295531 B6 nich značek v nádorové tkáni se může detekovat a kvantifikovat za použití gama snímače. Kvalita získaného zobrazení nádoru se přímo koreluje s poměrem signál: zvukový signál.

Protilátky se mohou používat jako diagnostická činidla pro sledování nově vaskularizovaných nádorů a mohou se také používat, např. v modifikované formě, pro zavedení cytotoxických činidel nebo při koagulaci v nových krevních cévách, přičemž vyvíjející se nádory trpí nedostatkem kyslíku a nutrientů a tvoří tak nepřímou formu terapie nádoru.

Vynález dále popisuje použití shora specifikovaného specificky se vázajícího člena, který se používá jako terapeutické činidlo při spojování, vázání nebo manipulaci jako fúzní protein, aby získal funkci efektoru. Specificky se vázající člen podle vynálezu se může použít pro cílené zavedení toxinu, radioaktivních látek, T-buněk, smrtících buněk nebo jiných molekul do nádoru, který exprimuje neboje spojen s antigenem ve středu zájmu.

Vynález dále popisuje způsoby léčby, které zahrnují aplikaci specificky se vázajícího člena, farmaceutických kompozic obsahující takový specificky se vázající člen a použití uvedeného specificky se vázajícího člena při výrobě medikamentu vhodného pro aplikaci, například při metodě přípravy medikamentu nebo farmaceutické kompozice, která obsahuje specificky se vázající člen s farmaceuticky přijatelným excipientem.

V souladu s vynálezem se mohou uvedené kompozice aplikovat jednotlivcům. Přednostně se aplikuje „terapeuticky účinné množství“, které je pro pacienta přínosem. Takový přínos může být přinejmenším zlepšené nejméně jednoho symptomu. Aktuální aplikované množství rychlost a časový průběh aplikace závisí na povaze a stavu onemocnění, které se léčí. Zodpovědnost za předpis léčby, například rozhodnutí o dávce atd., nesou praktičtí lékaři a jiné terapeuti. Vhodná dávka protilátek je v oboru dobře znám, uvádí se v publikaci Ledermann J. A. et al., (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; Bagshawe K. D. et al., (1991) Antibody, Immunokonjugates and Radiopharmaticals 4: 915-922.

Kompozice se může aplikovat samotná nebo v kombinaci s jinou léčbou, buď současně, nebo sekvenčně, což závisí na léčeném stavu.

Farmaceutické kompozice podle vynálezu a jejich použití v souladu s vynálezem může obsahovat vedle aktivní složky, farmaceuticky přijatelný excipient, nosič, pufr, stabilizátor nebo jiné materiály, které jsou dobře známy v oboru. Takové materiály by neměly být toxické a neměly by interferovat s účinnosti aktivní ingredience. Přesná povaha nosiče nebo jiného materiálu závisí na způsobu aplikace, která může být orální nebo injekcí např. intravenózní.

Farmaceutická kompozice pro orální aplikaci může být v tabletové, kapslové, práškové a kapalné formě. Tableta může obsahovat pevný nosič, jako je želatina nebo adjuvans. Kapalné farmaceutické kompozice obecně obsahují kapalný nosič, jako je voda, nafta, živočišné nebo rostlinné oleje, minerální olej nebo syntetický olej. Může se používat fyziologický roztok, dextróza nebo roztok jiný sacharidový roztok nebo glykoly, jako je atylenglykol, propylenglykol nebo polyethylenglykol.

Při intravenózní injekci nebo injekci do místa aplikace bude aktivní ingredience ve formě parenterálně přijatelného vodného roztoku, který neobsahuje žádné pyrogeny a má vhodné pH, je vhodně izotonická a stabilní. Odborníci jsou schopni snadno připravit vhodné roztoky za použití například solí, jako je například injekce chloridu sodného, Ringerova injekce, Laktátová Ringerova injekce. Roztoky mohou zahrnovat konzervační činidla, stabilizátory, pufry, antioxidanty a/nebo jiná aditiva, je-li to nutné.

Specificky se vázající člen podle vynálezu se může připravit expresí z nukleové kyseliny, která ho kóduje. Nukleová kyselina kódující specificky se vázající člen umožňuje způsob produkce uvedeného specificky se vázajícího člena, který zahrnuje expresi této kódující nukleové kyseliny.

-9CZ 295531 B6

Exprese lze běžně dosáhnout kultivací rekombinantních hostitelských buněk, které obsahují uvedenou nukleovou kyselinu, za vhodných podmínek.

Nukleová kyselina může kódovat libovolné zde uvedené aminokyselinové sekvence domén protilátek vázající antigen nebo libovolnou funkčně ekvivalentní formu. Změny se mohou provést na úrovni nukleotidů adicí, substitucí, delecí nebo inzercí jednoho nebo více nukleotidů. Tyto změny se mohou nebo nemusí odrazit na úrovni aminokyseliny v závislosti na degeneraci genetického kódu.

Systémy klonování a exprese polypeptidu u různých hostitelských buněk jsou dobře známy. Vhodné hostitelské buňky zahrnují bakterie, savčí buňky, kvasinky a bakuloviry. Savčí buněčné linie, které jsou dostupné pro expresi heterogenního polypeptidu zahrnují buňky vaječníků čínských morčat, buňky HeLa, ledvinové buňky novorozených morčat a mnoho dalších. Běžným preferovaným bakteriálním hostitelem je E. coli.

Exprese protilátek a fragmentů protilátek v prokaryontních buňkách, jako jsou bakterie E. coli, je v oboru dobře zavedena. Přehled informací je uveden v publikaci Plůckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). Při produkci specificky se vázajícího člena je možné také využít jeho exprese v kultivovaných eukaryontních buňkách (Reff, Μ. E. (1993) Curr. Opinion Biotech; Trill J. J. et al., (1995) Curr Opinion Biotech 6: 553-560.

Vhodné vektory se mohou vybrat nebo konstruovat. Měkly by obsahovat vhodné regulační sekvence, mezi něž patří promotorové sekvence, polyadenylační sekvence, zesilovací sekvence, markerové geny a jiné sekvence, je-li třeba. Další detaily jsou uvedeny např. v publikaci Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2^ndedition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Rada známých metod a protokolů vhodných při manipulaci nukleové kyseliny, například při přípravě konstrukcí nukleových kyselin, mutagenezi, sekvenování zavedení DNA do buněk a expresi genu a analýze proteinů, se detailně popisují v publikaci Short Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, 1992.

Dále vynález popisuje hostitelskou buňku, která obsahuje zde popsanou nukleovou kyselinu. Dále vynález popisuje způsob zahrnující zavedení uvedené nukleové kyseliny do hostitelské buňky. Při zvědění nukleové kyseliny do hostitelské buňky se může použít libovolný dostupný způsob. V případě eukaryontních buněk vhodný způsob může zahrnovat transfekci s fosforečnanem vápenatým, DEAE-dextranem, elektroporaci, transfekci zprostředkovanou lipozómy a transdukci za použití retrovirů nebo jiných virů, např. vakcinie nebo v případě hmyzích buněk bakuloviry.

V případě bakteriálních buněk vhodné metody mohou zahrnovat transformaci chloridem sodným, elektroporaci a transfekci za použití bakteriofága.

Po zavedení DNA může následovat exprese nukleové kyseliny, například v kultivovaných hostitelských buňkách za podmínek vhodných pro expresi genu.

V jednom provedení vynálezu je nukleová kyselina začleněna do genomu (např. chromozom) hostitelské buňky. Integrace se může podpořit v souladu se standardními metodami inkluzí sekvencí, které podporují rekombinaci s genomem.

Následující produkce specificky se vázajícího člena se může například používat libovolným zde popsaným způsobem, jako je například při formulaci farmaceutického nebo diagnostického produktu, jako je kit, který obsahuje mimo specificky se vázajícího člena jedno nebo více činidel, které slouží při stanovení navázání specificky se vázajícího člena na buňky, jak se diskutuje shora v textu.

Další předměty vynálezu a jejich provedení jsou pro odborníka zřejmé. Uvedené příklady provedení slouží k doložení vynálezu a nemají omezující charakter.

-10CZ 295531 B6

Přehled obrázků na výkresech

Na obrázky č. 1 jsou uvedeny aminokyselinové sekvence VH a VL scFvs CGS-1 a CGS-2. Obrázek č. l(a) ukazuje sekvence VH; obrázek č. 1 (b) ukazuje sekvence VL. CDR (1, 2 a 3) jsou označeny. Lidská zárodečná linie VH, který vykazuje největší homologii k oběma scFvs je segment DP47 rodiny VH3; segment VL obou klonů je DPL16, lehký řetězec se používá pro vybudování původní knihovny scFv (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994)). Zbytky, kterými se odlišují jeden klon od druhého, jsou podtrženy.

Obrázek č. 2: Na obrázku č. 2A je zobrazen model doménové struktury lidské FN podjednotky. Označeny jsou variabilní oblasti IIICS, ED-A a ED-B, které jsou způsobeny alternativním sestřihem pre-mRNAFN. Obrázek také ukazuje termolyzínem obsahujícím ED-B (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342(1987)). Obrázek 2B ukazuje 4 až 18 % SDS-PAGE plazmy a WI38VA FN a produkty jejich Štěpení termolyzínem obarvené Coomassieovou modří a imunobloty, které se testovaly sondou BC-1, IST-6, CGS-1 a CGS-2. V dráze (1) jsou neštěpené a v dráze (3) jsou štěpené FN plazmy za použití termolyzinu, přičemž koncentrace FN jel pg/ml a 10 pg/ml (dráha (4)). V dráze (2) jsou neštěpené a v dráze (5) jsou štěpené WI38VA FN plazmy za použití termolyzinu, přičemž koncentrace FN je 1 pg/ml a 5 pg/ml (dráha (6)) a 10 pg/ml (dráha 7). Čísla na pravé straně indikují hlavní produkty štěpní termolyzínem, které jsou zobrazeny na obr. č. 2A. Hodnoty na levé straně indikují standardy molekulové hmotnosti v kilodaltonech (kD).

Obrázekč. 3. Na obrázku č. 3A jsou zobrazeny repetiční sekvence FN typu III, které jsou obsaženy ve fúzi a rekombinantní proteiny exprimované v bakteriích E. coli a reaktivita těchto proteinů s CGS-1 a CGS-2 a s mAbs BC-1 a IST-6. Obrázek č. 3B zobrazuje gel obarvený Coomassiovou modří a imunobloty, které se testovaly sondou CGS-1, CGS-2, BC-1, IST-6. Číslování drah odpovídá číslování peptidových konstrukcí ve vrchní části obrázku. Hodnoty nalevo označují molekulovou hmotnost standardů v kD.

Na obrázku č. 4 je uveden infračervený zobrazovač myší; zobrazovač myší se používá při experimentech cíleného zavádění a tvoří ho červená, nefluorescenční skříňka, která je vybavena wolframovou halogenovou lampou, excitačními a emisními filtry, které jsou specifické pro CY7 fluorofor a počítačem řízenou osmi bitovou monochromatickou CCD-kameru.

Obrázek č. 5 zobrazuje cílové zavádění fluorescenčně značených protilátkových fragmentů proti F9 myšímu teratokarcinomu za použití monomemích scFv(CGS-l) a dimemích scFv(CGS-l)2 řízených kB-FN. Jako negativní kontrola sloužily dimerní scFv(D 1.3)2 s vazebnou specifitou k lysozymu.

Obrázek č. 6 zobrazuje cílené zavádění fluorescenčně značených protilátkových fragmentů proti F9 myšímu teratokarcinomu za použití afinitních maturovaných scFv(CGS-2) a méně afinitních scFv(28SI) řízených do stejného epitopu B-FN. Cílené zavádění se detekuje jak u velkých (přibližně 0,6 g) tak i u malých nádorů (přibližně 0,2 g), které se po 48 hodinách pokryjí černou krustou, která částečně zastře obraz.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Izolace lidského scFvs specifických pro oblast ED-B lidského FN.

Fágová knihovna lidských scFv ((Nissim et al., EMBOJ. 13, 692-698(1994) se používá při selekci rekombinantních protilátek. Jako zdroj antigenu při selekci se použily dvě různé formy izoformy ED-B. V obou případech izoformou byl rekombinantní lidský protein.

-11 CZ 295531 B6

Rekombinantní peptidy FN, které obsahují repetice typu III2-11 (B-) a 2-11 (B+), se exprimovaly v bakteriích Escherichia coli.

Konstrukce se připravila za použití cDNAFN z klonů pFH154 (Komblihtt et al., EMBO J. 4, 1755 (1985)), xF10 a xF2 (Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989)). Konstrukce cDNA vrozsahu 2229-4787 bází (Komblihtt, Proč. Nati. Acad. Sci USA 90 7179-7182, 1987) se začlenila do vektoru pQE-3/5 za použití kitu QIAexpress od Qiagen (Chatsworth, CA). Rekombinanty FN-III2-11 (B-) a (B+) se čistily imunoafínitní chromatografíí za použití mAb 3E3 (Pierschbacher et al., Cell 26, 259-267(1981)), které jsou spojeny se sefarózou4B (Pharmacia). Fragmenty DNA pro přípravu rekombinantních fragmentů FN, které obsahují typ III homologní rekombinantních fragmentů FN, které obsahují typIII homologní repetice 7B89, 789, ED-B a FN-6, se připravily polymerázovou řetězcovou reakcí (PCR) za použití UltMa DNA polymerázy (Perkin Elmer), cDNA z klonů FN 2-11 (B+) a FN 2-11 (B-) jako templátu. Primery se navrhly tak, aby umožnily klonování PCR produktů do pQE-12 za použití kitu QIAexpress od Qiagen (Chatsworth, CA). Pak následuje transformace buněk bakterie E. coli a exprese. Všechny klony cDNA se sekvenovaly za použití Sequenase 2.0 DNA sekvenčního kitu (USB).

Rekombinantní proteiny se čistily Ni-NTA chromatografíí (IMAC), podle instrukcí výrobce (Qiagen), za použití hexahistidinového úseku na C-konci fragmentů FN. Fúzní protein ED-BPGal se připravil klonováním ED-B cDNA do bakteriofágového vektoru Xgt 11 za vzniku klonu XED-B. Klon ÁchFN60 (obsahující část sekvence ED-B) se získal jako fúzní protein z klonovaného kuřecího FN pchFN60 (Norton and Hyneš, Mol. Cell. Biol. 7, 4297-4307 (1987)).

Při selekci fágové knihovny lidského scFv se testoval každý ze dvou různých rekombinantních antigenů (7B89 a ED-B) ve třech kolech. Imunozkumavky (Nunc; Maxisorp, Roskilde, Denmark) se pokiyly antigeny přes noc v koncentraci 50 pg/ml v PBS (20 mM fosforečnanový pufr, 0,15MNaCl, pH 7,2). Prvním antigenem je rekombinantní fragment 7B89, ve kterém oblast ED-B je lemována přilehlou homologní repeticí typu III FN; tento antigen se nanášel při teplotě 4 °C přes noc. Druhý používaný antigen je rekombinantní ED-B (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)), který má na C-konci hexahistidinový úsek; tento protein neobsahuje zbytky lyzinu, což znamená, že terminální aminoskupina první aminoskupiny je dostupná pro místně specifickou kovalentní imobilizaci ED-B na reaktivní destičky pro test ELISA (Nunc; Covalink). Potahování se provedlo přes noc při teplotě místnosti.

Po třech kolech testování se buňky bakterie E. coli infikovaly eluovaným fágem HB2151 a nanesly se na plotny, jak se popisuje v publikaci (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994)). Po každém kole selekce se testovalo 95 na ampicilin rezistentních jednotlivých kolonií, aby se testem ELISA identifikovaly antigen specifické scFvs. Pro další analýzu afmitní maturaci se vybraly klony, které vykazují nejsilnější signál testu ELISA na imobilizované antigeny. Tyto klony také demonstrují při imunocytochemickém barvení specifické zbarvení sekcí multiforem glioblastomu a nádorů prsu, jak se popisuje detailněji v příkladu 4.

Příklad 2: Afinitní maturace lidského scFvs specifického pro oblast ED-B lidského FN.

Klony 35GE (vybrán za použití 7B89) a 28SI (vybrán pomocí samotné domény ED-B) se vybraly jako kandidáti protilátek pro afinitní maturaci. za účelem obměnit lehké řetězce za účelem vylepšení afinity se pak zkoumaly jednotlivé maturační strategie založené na nahodilosti šesti centrálních zbytků (DSSGNH) lehkého řetězce CDR3 za použití degenerovaných oligonukleotidů a PCR (Obr. č. 1), což umožňuje potenciální sekvenční diverzitu 201⁶= 6.4 x 10⁷. Tato oblast (podél těžkého řetězce CDR3) je lokalizována v centru vazebného místa antigenu (Padlan, 1994). Dále se mutoval zbytek argininu, který přímo předchází řadě šesti zbytků k šeřinu za účelem zabránit možnosti elektrostatických účinků dominující selekce.

-12CZ 295531 B6

Plazmid získaný z jedné bakteriální kolonie, který exprimuje „rodičovský“ scFv fragment se aplifíkoval PCR sprimery LMB3 (5'CAG GAA ACA GCT ATG AC 3') a CDR3-6-VLFOR (5 'CTT GGT CCC TCC GCC GAA TAC CAC MNN MNN MNN MNN MNN MNN AGA GG A GTT ACA GTA ATA GTC AGC CTG 3') (94C (1') - 55C (1') - 72C (1 '30”), 52 cyklů;

v publikaci Marks et al., (1991), J. Mol. Biol., 222, 581-597 se popisují použité pufry a podmínky PCR). Výsledný produkt se čistil na gelu (za účelem odstranit stopy plazmidu, který obsahuje původní gen scFv) a použil se jako templát při druhé amplifikaci s primery LMB3 a Jl-NotFOR (5 ΆΤΤ GCT TTT CCT TTT TGC GGC CGC GCC TAG GAC GGT CAG CTT GGT CCCTCC GCC 3') (94C (1') - 55C (1') - 72C (1', 30”, 25 cyklů). Surový produkt PCR, který se na agarózovém gelu jeví jako jediný pruh se správnou molekulovou vahou se přímo čistil ze směsi PCR za použití Spin-Bind (FMC, Rockland, ME, USA), se štěpil s restrikčními enzymy Ncol/Notl a ligoval se do na gelu čištěného fágemidu pHENl (Hoogenboom et al., Nucl. Acids. Res. 19, 4133-4137 (1991) štěpeným restrikčními enzymy Ncol/Notl, kteiý obsahuje inzert Ncol/Notl, což umožňuje separaci vektoru, který je štěpen dvakrát od vektoru, jenž je štěpen pouze jednou. Vektor se připravil plazmid maxi-prep kit Qiagen (Chatsworth, CA, U.S.A.). Při ligaci se smísilo přibližně 5 pg štěpeného plazmidu a inzertu. Ligační směs se extrahovala jednou s fenolem, jednou se směsí fenol/chloroform/izoamylalkohol (25:25:1), pak se precipitovala etanolem za použití glykogenu (Boehringer, Mannheim, SRN) jako nosiče a sušila se na speed-vaku.

Peletka se resuspendovala ve 20 μΐ vody a elektroporací se vnesl do elektrokompetentních buněk E. coli TG1 (Gibson T. J. (1984), PhD thesis. (University of Cambridge, Cambridge, UK). V typickém případě se používají elektrokompetentní buňky s titrem 10⁹ transformantů a pg v případě, že se používá glycerol, nebo 10¹⁰ transformantů na pg čerstvě připravených elektrokompetentních buněk. Elektroporace vede v typickém případě k vytvoření více jak 10⁷ klonů.

Maturační knihovna se pak zpracovala stejným způsobem jako knihovna podle Nissima (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994)) za vzniku fágových partikulí, které se používají při selekci v jednom cyklu imunoblotů, kde se používá jako antigen 7B89 (v koncentraci 10 pg/ml), pak následuje kinetická selekce (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992). Tato selekce proběhla inkubací biotinylovaných 7B89 (v koncentraci 10 nM) s fágovou suspenzí (přibližně 10¹² t.u.) z prvního kola výběru v 2 % roztoku mléka a PBS (2% MPBS) po dobu 5 minut, pak se přidaly 7B89 (v koncentraci 1 μΜ), které nejsou značené biotinem, a po dobu 30 minut probíhala kompetice. Do reakční směsi se přidalo 100 μΐ částic dyna (Dynal:M480) potažených streptavidinem, které byly předem zablokovány v 2% MPBS, vše se 2 minuty míchalo a pak se částice zachytily na magnetu a desetkrát se promyly roztokem PBS + 0,1 % Tween-20 nebo PBS. Fág se z částic eluoval 0,5 ml trietylaminu v koncentraci 100 mM. Tento roztok se pak neutralizoval 1 M Tris, pH 7,4 o objemu 0,25 ml a použil se pro infekci exponenciálně rostoucích buněk HB2151 (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994)). 95 jednotlivých kolonií rezistentních na ampicilin se použilo při produkci supernatantů, které obsahují scFv (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698 (1994) a které se testovaly testem ELISA, BIAcore a imunochemicky za účelem identifikace kolonií s nejsilnější schopností se vázat. Ty se pak subklonovaly mezi restrikční místa Sfil/Notl expresivního vektoru pDN268 (Neri et al., (1996a), Bio/Techniques, 20, 708-713; Neri et al., (1996b), Nátuře Biotechnology, 14, 385-390), který připojil k C-konci scFv fosforylovatelný úsek, epotip FLAGa hexahistidinový úsek.

Jednotlivé kolonie relevantních protilátek subklonovaných do pDN268 se kultivovaly při teplotě 37 °C v 2xTY, který obsahuje 100 mg/1 ampicilinu a 0,1 % glukózy. Když buněčná kultura dosáhla hodnoty OD⁶⁰⁰, 0,8, přidalo se IPTG tak, aby konečná koncentrace byla 1 mM a kultivace pokračovala 16 až 20 hodin při teplotě 30 °C. Po centrifugaci (GS-3 Sorvall rotoru, při 7000 ot/min. a po dobu 30 min) se supematant filtroval, zakoncentroval a za použití přístroje Minisette (Filtron) s tangencionálním tokem přešel do pufřu (50 mM fosforečnan, pH 7,4, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol). Čištěné protilátky se analyzovaly SDS-PAGE (Laemmli,

-13CZ 295531 B6

1970) a dialyzovaly se proti PBS při teplotě 4 °C. Čištěné scFv se dále zpracovávaly gelovou filtrací za použití přístroj FPLC vybaveného kolonou S-75 (Pharmacia), jelikož je známo, že multivalentní fragmenty scFv mohou vykazovat dobré navázání na BIAcore (Jonsson et al., BioTechniques 11, 620-627(1991) účinkem avidity (Nissim et al., EMBOJ. 13, 692-698 (1994); Crothers and Metzger et al., Immunochemistry 9, 341-357 (1972). Koncentrace protilátek monomerických frakcí čištěných na FPLC se stanovila spektrofotometricky za předpokladu, že absorbance při vlnové délce 280 nm je pro roztok scFv v koncentraci 1 pg/ml 1,4 jednotek.

Na přístroji BIAcore (Pharmacia Biosensor) se měřilo navázání monovalentní scFV při koncentračním rozmezí 0,1 až 1 μΜ v PBS. Při uvedeném měření se použila tato činidla: (i) 1000 jednotek rezonance (RU) biotinovaného rekombinantního FN fragmentu 7B89, který je imobilizován na čipu potaženém streptavidinem, který se specificky vázal 250 RU scFv; (ii) 200 RU rekombinantního ED-B, chemicky imobilizovaném na N-terminální aminoskupíně, která se specificky váže 600 RU scFv; (iii) 3500 RU fibronektinu WI38VA bohatého na ED-B (uvedeno v příkladu 3), který se specificky vázal 150 RU scFv. Kinetická analýza dat se uskutečnila podle instrukcí výrobce. Na základě kvalitativní BIAcore analýzy supematantů obsahujících protilátky se vybrala jedna afinitně maturovaná verze každého scFv klonu: klon CGS-1 z výběru pomocí fragmentu 78B9 aa CGS-2 z výběru s ED-B rekombinantním FN fragmentem. V tabulce č. 1 jsou uvedeny asociační iychlostní konstanty (ko_n) a disociační rychlostní konstanty (k_off) dohromady s rovnovážnými disociačními konstantami (Kd) scFv a původního klonu 28SI. Ačkoli oba klony CGS-1 a CGS-2 mají Kd v nanomolámím rozmezí, klon CGS-2 vykazuje největší zlepšení ve srovnání s rodičovským klonem. Jeho Kd s ohledem na všechny tři testované proteiny na senzorovém čipu (tabulka č. 1) je 1 nM (původní hodnota byla 110 nM). Vylepšení se provedlo hlavně pomalejší kinetickou disociační konstantou (přibližně 10⁴ s^_1), což se měřilo monomerickými protilátkovými přípravky (data nejsou uvedena).

Strategie maturace se jeví být obecná a má výslednou afinitu vylepšenou protilátkami proti proteinu, který se váže na maltózu, cytochromuC, extracelulámí doméně myšího endoglinu (D. N., L. Wyder, R. Klemenz), cytomegaloviru (A. P., G. Neri, R. Botti, P. N.), jadernému nádorovému merrovému HMGI-C proteinu (A.P., P. Saldani, V. Giancotta, P. N.) a placentové alkalické fosfatáze, což je markér nádoru vaječníků (M. Deonarain and A. A. Epenetos). Strategie se proto zdá být nejméně stejně účinná jako jiné maturační strategie (Merks et al., (1992), Bio/Technology, 10, 779-783; Low et al., 1996) a výsledkem jsou protilátky se stejnými afinitami jako ty získané z velmi velkých fágových protilátkových knihoven (Griffiths et al., (1994), EMBO J. 13, 3245-3260; Vaughan et al., (1996) Nátuře Biotechnol., 14, 309-314).

Afinitní maturované klony CGS-1 a CGS-2 se sekvenovaly a zanesly se do databáze genů lidských zárodečních protilátek V (V-BASE), pak překládaly za použití softwaru MacVector. Gen VH obou klonů byl nejvíce homologní s lidskou zárodečnou linií DP47 (VH3) a navíc každý klon měl různé sekvence VH CDR3 (obr. č. 1). Gen VL obou klonů zárodečné linie DPL16 se použil při konstrukci repertoáru lidského syntetického scFv, jak popisuje (Nissim et al., EMBO J. 13, 692-698(1994)). Sekvence VL CDR3 se lisí od každé jiné čtyřmi ze šesti náhodných zbytků (obr. č. 1).

-14CZ 295531 B6

Tabulka č. 1

Kinetické a disociační konstanty monomemích scFv fragmentů CGS-1 a CGS-2 k proteinům obsahujícím doménu ED-B

Ant iq en	ED-B	7B89	FN WI38V A
ScFv	CGS-1	S128	CGS-2	CGS-1	S128	CGS-2	CGS-1	S128	CGS-2
koff (s	7,0 x	2,7 x	1,5 x	3,9 x	3, 0 x	2,3 x	5, 0 x	7,1 x	6, 5 x
	10'³	10‘^z	10‘^J	10'³	10’²	IQ’⁴	10’³	10^-2	10⁴
k_on(M*	1, 3 x	2,5 x	1,3 x	1,1 x	2, 9 x	1,1 x	4,1 x	1,2 x	2,9 x
V¹) ·	10⁵	10⁵	10⁵	10⁵	10⁵	10⁵	10⁵	10⁶	10⁵
K_d(M)	5,4 X	1,1 x	1,1 x	3, 5 x	1,0 x	2,1 x	1,2 x	5,9 x	2,4 x
*	10’⁸	10‘⁷	10‘^?	10'^B	ΙΟ⁷	10’⁹	10‘⁹	10’⁸	10⁹

Experimenty se provedly způsobem, který se popisuje v sekci Materiály a metody. *hodnoty ko_ffa ko„ dosahují přesnosti +/-30%, což závisí na přesnosti stanovení koncentrace a ve vztahu k mírně odlišným výsledkům, které se získaly, když se použily odlišné oblasti sensogramů. K_d = Řoffdíon·

Příklad 3: Specifíta afínitních maturovaných scFvs u fibronektinů, které obsahují ED-B.

Imunoreaktivita dvou afínitních maturovaných scFvs, CGS-1 a CGS-2 se zpočátku odhadla pomocí testu ELISA a porovnala se přímo mAb BC-1 (které rozpoznávají izoformu B-FN) a mAb IST-6, které rozpoznávají pouze izoformy FN, kterým chybí doména ED-B (Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148(1989); Camemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992)). Poté proběhla analýza specifity za použití extenzivního panelu fragmentů FN, které se získaly aplikací termolyzinu, a rekombinantních fúzních proteinů.

Antigeny, které se používaly v testu ELISA a při imunoblotování, se připravily následovně. FN se čistil z lidské plazmy a z upraveného média pro buněčnou linii WI38VA13, jak se popisuje v publikaci Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342(1987). Čištěné FN se štěpily termolyzinem (proteáza typX; Sigma Chemical Co.), jak se popisuje v publikaci Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148(1989). Nativní fragmenty FN s molekulovou hmotností 110 000 (B-) a (B+) s molekulovou hmotností 120 000 (obr. č. 2) se čistily po štěpení FN, jak se popisuje v publikaci (Borsi et al., Anal. Biochem. 192, 372-379 (1991)). Velká izoforma tenaskinu-C se čistila, jak se popisuje v publikaci Saganati et al., Eur J. Biochem. 205, 545-549 (1992)). Rekombinantní proteiny se exprimovaly a čistily, jak se popisuje v příkladu 1. SDS-PAGE a westemovo blotování se provádí, jak se popisuje v publikaci Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 11391148(1989).

Všechny antigeny, které se užívaly při testu ELISA, se naředily roztokem PBS na koncentraci v rozmezí 50 až 100 pg/ml a potáhly se při teplotě 4 °C na buňky Imuno-destiček (Nunc, Roskilde, Dánsko). Nenavázané antigeny se odstranily promytím PBS a destičky se pak blokovaly roztokem PBS s 3% (m/v) boviním sérovým albuminem (BSA) po dobu 2 h při teplotě 37 °C. Pak následovaly čtyři promytí roztokem PBS a 0,5 % Tween 20 (PBST). Protilátky se pak nechaly navázat při teplotě 37 °C po dobu 1,5 h; scFv se preinkubovaly s antisérem, které je určeno proti úseku sekvence: mAbM2 (Kodak, New HavenCT) pro FLAG úsek nebo 9E10 (ATCC, Rockville, MD) pro myc úsek. Jako kontrolní protilátky se použily mAb BC-1 a IST-6. Po čtyřech promytích roztokem PBST se plotny inkubovaly po dobu 1 h při teplotě 37 °C s biotinem značenými kozími protilátkami IgG (Bio-SPA Division, Milan, Italy) ředěnými 1 : 2000 (v roztoku PBST + 3 % BSA). Promytí se opakovalo a přidal se komplex streptavidin

- 15CZ 295531 B6

- biotinovaná alkalické fosfatáza (Bio-SPA Division, Milan, Italy) (ředěný 1 : 800 v roztoku PBST, který obsahuje 2 mM MgCl₂) po dobu 1 h při teplotě 37 °C. Reakce se vyvinula za použití tablet fosfatázového substrátu (Sigma) v 10 % dietanolaminu, pH 9,8 a optická hustota se odečítala při vlnové délce 405 nm. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. 2.

Tabulka č. 2

	CGS-1	CGS-2	BC-1	IST-6
FN plazmy	0,07	0, 04	0, 09	1,73
FN WI38VA	1,16	0,72	1,20	1, 12
nllO kD (B—)	0, 03	0, 01	0,05	1,20
nl20 kD (B+)	0,82	0,81	1,20	0, 02
rec FN7B89	1,11	1, 02	1, 02	0, 01
rec FN789	0,01	0,01	0,05	1,25
rec EĎ-B	1,21	1,32	0, 15	0,04
reC FN-6	0,01	0,01	0, 08	0, 03
tenaskin	0, 01	0, 02	0,06	0,02

Imunoreaktivita scFv a monoklonálních protilátek s antigeny odvozenými od fibronektinu se měřily testem ELISA. Hodnoty reprezentují OD měřené při vlnové délce 405 nm po subtrakci signálu pozadí. Data jsou průměr čtyř experimentů, které vykazují maximum 10 % standardní odchylky.

Identita různých forem fibronektinu používaného v experimentu je následující: Plazmový FN = lidskému plazmovému fibronektinu; WI38-VAFN = fibronektin ze supematantů fibroblastů transformovaných SV-40 (Zardi et al., EMBOJ. 6, 2337-2342(1987)); nllOkD = domény 4 fibronektinu ošetřeného termolyzinem bez ED-B; nl20kD = domény 4 fibronektinu ošetřeného termolyzinem s ED-B; rec FN7B89 = doména ED-B, která je lemována přilehlými FN homologní repeticemi typu III s doménou ED-B; rec ED-B = samotnému rekombinantnímu ED-B; rec FN6 = doména 6 rekombinantního FN.

CGS-1 a CGS-2 rozeznávaly rekombinantní peptid ED-B, stejně jako nativní nebo rekombinantní fragmenty FN, které obsahují sekvenci ED-B, zatímco se naváží na žádný fragment FN, kterému chybí ED-B. Navíc CGS-1 a CGS-2 nereaguje s tenaskinem (který obsahuje 15 homologních repetic typu III, jak se popisuje v publikaci Siří et al., Nucl. Acids Res. 19, 525-531 (1991)) a s plazmovým FN, který v produktech štěpení termolyzinem neobsahuje detekovatelné množství sekvence ED-B (Zardi et al., EMBOJ. 6, 2337-2342 (1987)). Naopak CGS-1 a CGS-2 silně reaguje sFN, který se čistil z buněčné linie WI38VA transformované SV-40. Přibližně 70 až 90 % molekul FN z této buněčné linie obsahuje ED-B, jak se ukazuje při štěpení termolyzinem a v experimentech sSl nukleázou za použití čištěného FN a celkové RNA, jenž se získala z buněčné linie (Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987); Borsi et al., Exp. Cell Res. 199, 98-105 (1992b)). Specifita scFvs pro ED-B komponent FN se demonstrovala použitím rozpustného rekombinantního ED-B za účelem inhibice vázání CGS-1 a/nebo CGS-2 na FN buněk WI38VA (data nejsou uvedena).

Data potvrdila, že CGS-1 a CGS-2 reagují specificky pouze s deriváty FN, které obsahují doménu ED-B. Obě vykazují stejnou reaktivitu jako mAb BC-1, mimo v případě rekombinantní ED-B, kterou nerozeznávají BC-1. Intenzita získaného signálů testu ELISA, který je relativní vzhledem mAb kontrolám, reflektuje n vysokou specifitu dvou scFvs pro antigeny obsahující ED-B.

Specifita CGS-1 a CGS-2 se zkoumala dále na imunoblotech za použití FN z plazmy a buněk WI38V a produktů po štěpení FN termolyzinem. Po štěpení termolyzinem FN z buněk WI38VA

-16CZ 295531 B6 (většina z nich obsahuje ED-B) vzniká fragment o molekulové hmotnosti 120 000 (obsahující ED-B) a minoritní fragment o molekulové hmotnosti 110 000, kterému chybí oblast ED-B (uvedeno na obr. č. 2; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)). Další štěpení domény o molekulové hmotnosti 120 000 generuje dva fragmenty; fragment o molekulové hmotnosti 85 000, který obsahuje na svém C-konci skoro celou sekvenci ED-B a sekvenci s molekulovou hmotností 35 000 (obr. č. 2a,; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342 (1987)).

Po levé straně obr. č. 2B je gel proteinových frakcí obarvený Comassieovou modří, které se analyzovaly imunoblotem. CGS-1 a CGS-2 nerozeznaly plazmový FN (dráha 1) a produkt proteinu štěpeného termolyzinem (dráha 3 obsahuje protein o molekulové hmotnosti 110 000 a dráha 4 obsahuje produkt štěpení proteinu o molekulové hmotnosti 110 000). Naopak FN z buněk WI38VA bohaté na ED-B, oba intaktní (dráha 2) a štěpení termolyzinem (dráhy 5, 6 a 7) byly rozeznávány oběma fragmenty scFvs. Nejmenší fragment získaný z FN, který by mohl být specificky rozeznán CGS-1, byl protein o molekulové hmotnosti 120 000 (zahrnuje repetice 2 až 11 typu III), zatímco CGS-2 jsou schopny rozeznat fragment o molekulové hmotnosti 85 000, který zahrnuje repetice 2 až 7 vedle N-konce ED-B (obr. č. 2B; Zardi et al., EMBO J. 6, 2337-2342(1987)). Tyto výsledky indikují, že scFvs reagují s odlišnými epitopy v sekvenci ED-B. Navázání CGS-2 na doménu s molekulovou hmotností 85 000 indikuje, že epitop tohoto klonu leží na N-konci ED-B. Naopak CGS-1 se naváží pokud je doména o molekulové hmotnosti 120 000 štěpena na fragment o molekulové hmotnosti 85 000 ukazuje, což znamená, že rozeznává epitop, který se nachází spíše na C-konci molekuly ED-B.

Specifita CGS-1 a CGS-2 se dále zkoumala imunoblotováním za použití rekombinantních fragmentů FN a fúzních proteinů, které obsahují nebo neobsahují sekvenci ED-B. Fúzní proteiny FN se připravily způsobem, jak se popisuje v publikaci Camemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989). Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na obr. č. 3; v publikaci camemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992) se uvádí spojení schématického diagramu se strukturou domén lidského FN. Získané vazebné profily v podstatě potvrzují s čištěným FN a produkty proteolytického štěpení: CGS-1 a CGS-2 silně reagovaly s fragmenty FN, které obsahovaly ED-B (dráha 2 a 4), ale nevykazují žádnou reaktivitu se sekvencemi FN, které neobsahují ED-B (dráhy 1 a 3). CGS-1 nereagují ani s lidským (dráha 5) ani s kuřecím (dráha 6) fúzním proteinem ED-B, zatímco CGS-2 reagují silně s oběma fragmenty (obr. č. 3). Tento výsledek může odrážet jisté konformační omezení epitopu ve FN, který obsahuje ED-B a který je rozeznáván CGS-1; je například možné, že epitop je citlivý kdenaturaci nebo je porušen při frakcionaci SDS-PAGE a přenosu na pevný podklad, kterým může být například nitrocelulóza.

Dohromady tyto výsledky demonstrují, že CGS-1 a CGS-2 se silně a specificky váží na FN obsahující ED-B v oblastech, které se od sebe liší a liší se také od struktury, kterou rozeznávají mAbBC-1.

Příklad 4: Použití afinitních maturovaných anti-ED-B scFvs při imunocytochemickém barvení lidských a myších nádorů.

CGS-1 a CGS-2 se používají při imunolokalizaci molekul FN, obsahují ED-B v různých normálních a neoplastických lidských tkáních. V případě normální tkáně se vybrala kůže, protože o B-FN izoformě se ví, že se exprimuje v makrofágách a fibroblastech během hojení kožních poranění (Carnemolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139—1148 (1989); Brown et al., Amer. J. Pathol. 142, 793-801 (1993). U dvou vybraných lidských nádorů se analyzovala specifita barvení pomocí anti-fibronektinových mAbs: detailněji se studovala multiforma glioblastomu, protože endoteliální buňky v cévách tohoto nádoru jsou ve stádiu vysoké proliferace se zvýšenou angiogenezí, což zahrnuje i expresi izoforem B-FN (Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994). Navíc při studiu za použití odlišného panelu normálních, hyperplastických a neoplastických tkání lidského prsu se získal další důkaz korelace mezi angiogenezí a expresí B-FN (Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 58, 11-16 (1994)).

-17CZ 295531 B6

Ve zde popsaných experimentech se imunohistochemické barvení CGS-1 a CGS-2 srovnalo s barvením mAb BC-1 (které rozeznávají izoformu B-FN) a s dalšími mAb, o kterých se ví, že reagují buď se všemi známými izoformními variantami FN (IST-4) nebo pouze s izoformami FN, které nenesou ED-B (IST-6). Charakterizace všech těchto kontrolních protilátek je uvedena v publikacích Camamolla et al., J. Cell Biol. 108, 1139-1148 (1989) a Camemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692 (1992).

Ze vzorků odebraných během operace se získaly normální a neoplastické tkáně. Už dříve se zjistilo, že pro přesnou a citlivou detekci molekul, které obsahují FN, je kritická příprava a fixace tkání (Castellani et al., Int. J. Cancer59, 612-618(1994)). Při imunohistochemické analýze se 5 μπι silné kryostatické sekce sušily na vzduchu a fixovaly se chladným acetonem po dobu 10 minut. Imunobarvení se provedlo za použití barvicího kitu s komplexem streptavidinbiotinalkalická fosfatáza (Bio-SPA Division, Milan, Italy) a naftol-AS-MX-fosforečnanu a Fast Red TR (Sigma). Jako kontrastní barvivo se použil Gillův haematoxylin a pak následovala fixace vglycergelu (Dako, Carpenteria, CA), jak se popisuje v publikaci Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994). Za účelem analyzovat specifitu dále v experimentech, kde se získalo pozitivní barvení tkání, se specifita pro ED-B demonstrovala preinkubací protilátek s rekombinantní ED-B doménou, po čemž následuje detekce, jak se popisuje shora v textu.

Výsledky těchto experimentů vykazují, že jak CGS-1, tak CGS-2 reagují se stejnými histologickými strukturami, jako jsou mAb BC-1. Vzor barvení, který se získal s kůží za použití CGS1, CGS-2 a BC-1, reflektuje na nepřítomnost ED-B ve FN, jenž se exprimoval vdermisu. Při barvení sekcí invazivního duktálního karcinomu protilátky CGS-1, CGS-2 a BC-1 vykazují distribuci barvení omezenou na hranici mezi neoplastickými buňkami a stromatem. To je v souladu se skutečností, že ačkoli celkové FN je homogenně distribuované celým stromatem nádoru, exprese B-FN je omezena do určitých oblastí. Jsou to ty oblasti invazivního duktuálního karcinomu, kde se B-FN úspěšně lokalizovaly (v 95 % případů) za použití mAb BC-1 (Kaczmarek et al., Int. J. Cancer 58, 11-16 (1994)).

Potvrdil se předchozí nález zbarvení protilátek BC-1 glioblastomového multiformního nádoru. V publikaci Castellani et al., Int. J. Cancer 59, 612-618 (1994) se pozoruje typický vzor barvení vaskulámích struktur, které jsou podobné glomerulámím, a v uvedených experimentech se zjistilo, že protilátky CGS-1 a CGS-2 vykazují kvalitativně identické výsledky.

Existuje však důležitý rozdíl mezi CGS-1 a CGS-2 a mAb BC-1: ukázalo s, že dva lidské scFv se váží na kuřecí a myší B-FN, zatímco BC-1 je striktně specifický jen pro člověka. CGS-2 reagovaly s kuřecími embryi (data nejsou uvedena) a CGS-1 a CGS-2 reagují s myšími nádory.

Také se prokázalo CGS-1 barvení vaskulámích struktur v sekcích myších teratokarcinomu F9. Na rozdíl od všech testovaných normálních myších tkání (játra, slezina, ledviny, žaludek, tenké střevo, tlusté střevo, vaječníky, děloha, močový měchýř, pankreas, suprarenální sval, srdce, plíce, štítné žlázy a mozku) vykazují negativní barvicí reakci s protilátkami CGS-1 a CGS-2 (data nejsou uvedena). Za použití rekombinantní ED-B domény, která zcela inhibuje získané barvení (data nejsou uvedena), se ukázalo, že struktury obarvené v sekcích teratokarcinomů F9 jsou ED-B specifické.

Příklad 5: Použití afinitních maturovaných anti-ED-B scFvs při in vivo cíleném zavádění do lidských nádorů.

Pro vývoj xenoimplantovaných nádorů u 6 až 10 týdnů starých holých myší (Balb-c nebo MF-1; Harlan UK), kdy se zavedlo 1 x 10⁷ buněk do boku jedné myši podkožní injekcí, se použila buněčná linie SKMEL-28 lidského melanomu. Myším, které nesly nádory, se aplikovala do ocasní

-18CZ 295531 B6 cévy injekce se 100 μΐ roztoku scFvi~Cy7j v PBS o koncentraci 1 mg/ml, kdy nádory dosáhly přibližného průměru 1 cm.

Značení rekombinantních protilátek s CY7 se dosáhlo přidáním 100 μΐ 1M hydrogenuhličitanu sodného, pH9,3 a 200 μΐ CY7-bis-Osu (Amersham; Cat. Nar. PA17000; 2 mg/ml v DMSO) do 1 ml roztoku protilátek v PBS (1 mg/ml). Po 30 minutách při teplotě místnosti se do směsi přidalo 100 μΐ 1 M Tris pH=7,4 a značené protilátky se separovaly od nezreagovaného barviva za použití kolon PD10 na jedno použití Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Tyto klony se uvedly do rovnováhy roztokem PBS. Eluované zelené frakce protilátek se koncentrovaly na koncentraci přibližně 1 mg/ml za použití zkumavek Centricon-10 (Amicon, Beverly, MA, USA). Dosažený poměr barvení byl obecně blízko hodnotě 1 molekula CY7 : jedna molekula protilátek. To se odhadlo spektroskopicky v 1 cm kyvětách za předpokladu, že roztok protilátek o koncentraci 1 mg/ml vykazuje při vlnové délce 280 nm na hodnotu absorbance 1,4 jednotek. Molámí extenční koeficient CY7 při vlnové délce 747 nm je 200 000 (M^cm^-1), přičemž se zanedbává hodnota absorbce CY7 při vlnové délce 280 nm. Imunoreaktivita vzorků protilátek po značení se potvrdila posunem pruhů (Neri et al., Bio/Techniques, 20, 708-713 (1996b)) afinitní chromatografií na koloně s antigenem nebo analýzou BIAcore. Myš byla snímána postaveným snímačem myší v pravidelných časových intervalech při anestezi, která se dosáhla inhalací směsi kyslíku/fluorotanu. Za účelem zjistit reprodukovatelnost výsledků se v případě každého vzorku studovalo 2 až 8 zvířat. Proběhly procedury podle projektu D. Neri UK Project Licence „Tumour Targeting“ (UK PPL 80/1056).

Infračervený snímač myší se postavil jako modifikace fotodetekčního systému podle publikace Folii, et al., (1994), Cancer Res., 54, 2643-2649, který umožňuje použití infračerveného fluoroforuCY7. Infračervená iluminace se vybrala za účelem dosáhnout lepší penetrace tkáně. Fluorescence CY7 (vlnová délka je větší jak 760 nm) je lidským okem neviditelná a je nutné použít počítačem řízenou CCD kameru. Snímač myší se skládá z černou barvou nabarvené skříňky utěsněné před vstupem světla, vybavené 100 W wolframovou halogenovou lampou excitačním filtrem o průměru 50 mm, který se specificky navrhl pro CY7 (Chromá Corporation, Brattleboro, VT, USA; 673-748 nm). Výsledný iluminační paprsek je při dobrém přiblížení homogenní v oblasti o velikosti 5x10 cm, do které se umístila myš pro snímání. Fluorescence se detekovala osmibitovou monochromatickou Pulnix CCD kamerou, vybavenou C-orámovanou čočkou a 50 mm emisním filtrem (Chromá Corporation, Brattleboro, VT, USA; 765-855 nm) a systém ImageDok (Kinetic Imaging Ltd., Liverpool, UK). Tento systém obsahuje počítač vybavený pohlcovačem záření a softwarem pro integraci sekvenčních obrázků. Při postupu průměrizování se v typickém případě snímají tři sekvenční obrázky v 50 ms; tento počet se udržuje konstantní při sériích obrázků jednoho zvířete, aby se umožnilo přímé srovnání cílené zavádění do nádorů v různých časových okamžicích. Obrázky ve formátu TIFF se opak převedly do fajlů PICT za použití programu Graphics Converter a zpracovaly se za použití programu MacDraw Pro na počítači Power Macintosh 7100/66.

Schéma přístroje je uvedeno na obr. č. 4.

Tyto experimenty ukázaly že oba scFv, které se nacházejí v nádoru, se vizualizovaly v makroskopickém měřítku.

Mikroskopická demonstrace cílení neovaskulatury vyvíjecího se nádoru se dvěma anti-ED-B scFvs je detailněji popsána dále v textu.

Holým myším a/nebo myším SCID, které nesou ve svém boku xenoimplantované buňky SKMEL-28 lidského melanomu nebo myšího F9 teratokarcinomu, se aplikovaly injekcí buď neznačené fragmenty scFv s FLAG úsekem, nebo biotinované fragmenty scFv.

Myši se usmrtily v různých časových intervalech po injekci, odebraly se nádorové a nenádorové sekce, které se pak obarvily podle běžného imunohistochemického protokolu za použití buď anti-19CZ 295531 B6

FLAGM2 protilátek (Kodak, 181), nebo detekčních činidel založených na streptavidinu. Optimálního cíleného zavádění se obecně dosáhlo 12 hodin po injekci. Ukázalo se, že protilátky CGS1 a CGS2 se váží na neovaskulaturu xenoimplantovaného nádoru a myšího teratokarcinomu.

Příklad 6: Cílené zavádění xenoimplantovaného myšího F9 teratokarcinomu do holých myší.

Po zavedení podkožní injekce 4 x 10⁶ buněk myšího F9 teratokarcinomu se na boku holých myší vyvinuly pevné nádory. Tento nádor roste u myší velmi rychle, přibližně po jednom týdnu po injekci dosahuje průměru 1 cm a je vysoce vaskularizován. Pro zobrazení cíleného zavádění protilátek se použila modifikace fotodetekční metody podle publikace Folii, et al., (1994), Cancer Res., 54, 2643-2649, která umožňuje kinetické zhodnocené cíleného zavádění do nádoru a změn na nádoru po aplikaci protilátek u stejných zvířat v různých časových okamžicích, jak se popisuje detailněji shora v textu (obe. č. 4).

Za účelem cíleného zavádění do nádoru a provedení detekce protilátek, scFv(CGS-l), scFv(CGS-2) a anti-lysozym scFv(D1.3) (McCafferty j., Griffiths, A.D., Winter, G., Chiswell, D.J. (1990) Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody domains. Nátuře (London), 348, 552-554) byly připojeny homodimerizační úsek (Pack et al., (1993), Bio/Technology, 11, 1271-1277) subklonováním protilátek do restrikčních míst Sfil/Notl expresivního vektoru pGIN50. Tento vektor je odvozen zpDN268 (Neri et al., (1996b), Nátuře Biotechnology, 14, 385-390), ve kterém je His6 úsek sekvence je nahrazen sekvencí: GGC LTD TLQ AFT DQL EDE KSA LQT ELA KEK EKL EFILAA H, který obsahuje cysteinový zbytek a amfipatický helix proteinu Fox pro kovalentní homodimerizaci fragmentů protilátek (Abate et al., 1990). Nedosáhlo se celkové kovalentní dimerizace: přibližně 30 až 50 % fragmentů protilátek tvořilo kovalentně spojené diméry.

Fragmenty protilátek se čistily afinitní chromatografíí na kolonách získaných spojením lysozymu ze slepičích vajec (D1.3) nebo 7B89 (anti-ED-B protilátky; Camemolla et al., J. Biol. Chem. 24689-24692(1992)) se sefarózou aktivovanou CNBr (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA). Supematanty se nanesly na afinitní podklad, který se pak promyl PBS, s PBS + 0,5 M NaCl a eluoval se 100 mM Et3N. Protilátky se pak dialyzovaly proti PBS.

Protilátky se značily způsobem, který se popisuje shora v textu, a pak se zavedly injekcí do ocasní cévy myší, které nesou nádor. Injekce obsahovala 100 μΐ roztoku csFvi-Cy7i v PBS a aplikovala se v okamžiku, kdy nádoiy dosáhly průměru přibližně 1 cm.

Jak se ukázalo na obr. č. 5 scFv(CGS-l) se lokalizovaly na nádoru do tří dnů. V tomto čase také zmizel nádor. Objevilo se však také zbarvení femuru. Cílené zavádění protilátek CGS-1 do nádoru se významně vylepšilo zavedením amfipatického helixu, který obsahuje cysteinový zbytek na C-konci, aby došlo k podpoření dimerizace protilátek (Pack et al., (1993), Bio/Technology, 11, 1271-1277). Ve skutečnosti lokalizace dimerů scFv(CGS-2)₂ se neprojevila podstatným zvýšením ze 24 na 72 hodin. Naopak negativní kontrola (dimerické protilátky scFv(D 1,3)2, anti-lysozymové protilátky) vykazují rychlé zmizení a nedetekovatelnou lokalizaci na nádoru nebo femuru.

ScFv(28SI) vykazuje slabé cílení do nádoru po 6 hodinách (data nejsou uvedena), ale nebylo detekováno po 24 hodinách nebo později (obr. č. 6). Afinitní maturace vede k vylepšení cíleného zavádění; pak scFv(CGS-2) se cíleně zavádí do malých a velkých F9 nádorů s vysokou účinností, vyskytuje-li se jako monomer (obr. č. 6) nebo dimer (data nejsou uvedena). Po dvouch dnech se zjistilo, že v nádoru přetrvávají 2 % injektované dávky protilátek na gram nádoru v případě scFv(CGS-2) monomeru a v případě scFv(CGS-2) dimeru to jsou 3 až 4 %. Dávka zavedená do nádoru pomocí scFv(CGS-2) byla také vyšší než v případě scFv(CGS-l) (obrázky č. 5 a 6) a koreluje a jejich afinitou (tabulka č. 1). ScFv(28SI) a scFv(CGS-l) se jeví být náchyl

-20CZ 295531 B6 né k proteolytickému štěpní a vykazují vysoké pohlcení játrama (obr. č. 6), zatímco protilátky scFv(CGS-l) jsou podstatně více stabilní a jsou méně pohlcovány játry (obr. č. 5).

SEZNAM SEKVENCÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: PHILOGEN S.r.l. Via Roma 22, SIENA, Itálie, PSČ: 53100 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Protilátky proti ED-B doméně fíbronektinu, jejich konstrukce a použití (iii) POČET SEKVENCÍ: 12 (iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) MEDIUM: Floppy disk (B) POČÍTAČ: kompatibilní s IBM PC (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Releas #1.0, Verse #1.30(EPO) (vi) DATA O TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: PCT/GB97/01412 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 4 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Ser Leu Pro Lys

-21 CZ 295531 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 12 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu

5 10 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

CAGGAAACAG CTATGAC (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

CTTGGTCCCT CCGCCGAATA CCACMNNMNN MNNMNNMNNM NNAGAGGAGT

TACAGTAATA GTCAGCCTC 69

-22CZ 295531 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 54 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 5:

ATTGCTTTTC CÍTITTGCGG CCGCGCCTAG GACGGTCAGC TTGGTCCCTC CGCC 54 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 43 aminokyseliny (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

Gly Gly Cys Leu Thr Asp Thr Leu Gin Ala Phe Thr Asp Gin Leu Glu 15 1015

Asp Glu Lys Ser Ala Leu Gin Thr Glu Ile Ala His Leu Leu Lys Glu 20 2530

Lys Glu Lys Leu Phe Ile Leu Ala Ala His

3540 (2) NFORMACE PRO SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val

5

-23CZ 295531 B6 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val

5 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 113 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KMEN: CGS1

-24CZ 295531 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin Pro Gly Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Val

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe Ser Ser Tyr

20

25

30

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu Glu Trp Val

35

40

45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

5560

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7580

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

9095

Ala Arg Ser Leu Pro Lys Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg

100 105110 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 121 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: j ednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KMEN: CGS2

-25CZ 295531 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Glu

Ser

Gly

Leu

Val

Gin Pro Gly Gly

1

5

10

15

Ser

Leu

Arg

Leu

Ser

Cys

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe Ser Ser Tyr

20

25

30

Ala

Met

Ser

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Lys

Gly

Leu Glu Trp Val

35

40

45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

55 60

Lys	Gly	Arg	Phe	Thr Ile Ser Arg Asp Asn	Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65				70	75 80
Leu	Gin	Met	Asn	Ser Leu Arg Ala Glu Asj	) Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
				85 90	95
Ala	Arg	Gly	Val	Gly Ala Phe Arg Pro Tyr	Arg Lys His Glu Trp Gly
			100	105	110
Gin	Gly	Thr	Leu	Val Thr Val Ser Arg
		115		120

(2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 109 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZEC: jednoduchý (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(B) KMEN: CGS1

-26CZ 295531 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Ser	Ser	Glu	Leu	Thr Gin Asp Pro Ala	Val	Ser	Val	Ala	Leu	Gly	Gin
1				5	10					15
Thr	Val	Arg	Ile	Thr Cys Gin Gly Asp	Ser	Leu	Arg	Ser	Tyr	Tyr	Ala
			20	25					30
Ser	Trp	Tyr	Gin	Gin Lys Pro Gly Gin	Ala	Pro	Val	Leu	Val	Tle Tyr
		35		40				45
Gly	Lys	Asn	Asn	i Arg Pro Ser Gly Ile	Pro	Asp	Arg	Phe	Ser	Gly	Ser
	50			55			60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu

70 7580

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro Val Val Leu Asn Gly

9095

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100105 (2) INFORMACE PRO SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(B) KMEN: CGS2

-27CZ 295531 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

Ser	Ser	Glu Leu Thr Gin Asp Pro Ala	Val	Ser	Val	Ala	Leu	Gly Gin
1		5	10					15
Thr	Val	Arg Ile Thr Cys Gin Gly Asp	Ser	Leu	Arg	Ser	Tyr	Tyr Ala
		20 25					30
Ser	Trp	Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin	Ala	Pro	Val	Leu	Val	Ile Tyr
		35 40				45
Gly	Lyš	Asn Asn Arg Pro Ser Gly líc	Pro	Asp	Arg	Phe	Ser	Gly Ser
	50	55			60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gin Ala Glu 65 70 7580

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Pro Phe Glu His Asn Leu

9095

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100105

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná protilátka nebo její fragment, která je specifická k onkofetální doméně ED-B fibronektinu (FN) a přímo se na ni váže, kde tato protilátka nebo fragment má disociační konstantu Kd pro ED-B nižší než 1 x 10^-7 M, měřeno jako vyčištěný monomer.
2. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, kde tato protilátka nebo fragment má disociační konstantu Kd pro ED-B nižší než 6 x 10“⁸ M, měřeno jako vyčištěný monomer.
3. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, kdy tato protilátka nebo fragment má vazebnou doménu antigenů protilátky lidského původu.
4. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, kde tato protilátka nebo fragment se váže na všechny FN obsahující ED-B po zpracování FN proteázou thermolysinem.
5. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která se váže na B-FN bez ošetření B-FN N-glykanázou.
6. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která má variabilní oblast těžkého řetězce (VH) se sekvencí od lidské zárodečné linie DP47, kodon 1 Glu až kodon 98 Arg včetně na obr. 1, a sekvenci CDR3 Ser Leu Pro Lys.
7. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která má variabilní oblast těžkého řetězce (VH) se sekvencí odvozenou od lidské zárodečné linie DP47, kodon 1 Glu až kodon 98 Arg včetně na obr. 1, a sekvenci CDR3 Gly Val Gly Ala Phe Arg Pro Tyr Arg Lys His Glu.

-28CZ 295531 B6
8. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která má variabilní oblast lehkého řetězce (VL) se sekvencí odvozenou od lidské zárodečné linie DPL16, kodon 1 Ser až kodon 90 Ser včetně na obr. 1, a sekvenci CDR3 Pro Val Val Leu Asn Gly Val Val.
9. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle nároku 1, která má variabilní oblast lehkého řetězce (VL) se sekvencí odvozenou od lidské zárodečné linie DPL16, kodon 1 Ser až kodon 90 Ser včetně na obr. 1, a sekvenci CDR3 Pro Phe Glu His Asn Leu Val Val.
10. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 9, kde tato protilátka nebo fragment zahrnuje molekulu scFv.
11. Izolovaná protilátka nebo její fragment kteréhokoli z nároků 1 až 9, kde tato protilátka nebo fragment zahrnuje dimemí molekulu scFv.
12. Izolovaný fragment protilátky podle kteréhokoli z nároků 6 až 9.
13. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje izolovanou protilátku nebo její fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 v účinném množství ve spojení s farmaceuticky přijatelným nosičem.
14. Nukleová kyselina, která kóduje izolovanou protilátku nebo její fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 12.
15. Fág, který kóduje izolovanou protilátku nebo její fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 12.
16. Hostitelská buňka, in vitro transformovaná nebo transfektovaná nukleovou kyselinou podle nároku 14.
17. Izolovaná protilátka nebo její fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 pro použití v terapii.
18. Použití izolované protilátky nebo jejího fragmentu podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 pro výrobu léčiva pro cílené zavádění do nádorů.
19. Použití izolované protilátky nebo jejího fragmentu podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 pro výrobu prostředku pro zobrazování nádorů.
20. Způsob výroby izolované protilátky nebo jejího fragmentu podle kteréhokoli z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se exprimuje nukleová kyselina podle nároku 14 v hostitelské buňce in vitro za vzniku uvedené protilátky nebo jejího fragmentu.
21. Způsob výroby izolované protilátky nebo jejího fragmentu podle nároku 1,vyznačující se tím, že

a. knihovna protilátek nebo jejich fragmentů, exprimovaných ve fágovi, se testuje rekombinantním fibronektinovým fragmentem obsahujícím doménu ED-B odvozeným od fibronektinového proteinu,

b. pozitivními klony se infikují hostitelské bakteriální buňky,

c. pozitivní fágové klony se podrobí procesu afmitní maturace,

-29CZ 295531 B6

d. kroky (a) a (b) se opakují, přičemž dochází k selekci pozitivních klonů se zlepšenou afinitou k antigenu,

e. hostitelské buňky se infikují pozitivními klony a z těchto hostitelských buněk se čistí molekuly protilátky.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že stupeň (a) zahrnuje testování knihovny fragmentů protilátek, kde fragmenty protilátek jsou molekuly scFv.
23. Způsob podle nároku 21,vyznačující se tím, že molekuly scFv zahrnují vazebnou doménu antigenu protilátky lidského původu.
24. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že stupeň (b) zahrnuje testování rekombinantními antigeny 7B89 nebo ED-B.
25. Způsob podle kteréhokoli z nároků 21 až 24, vyznačující se tím, že nukleová kyselina pozitivního klonu se použije k produkci požadované protilátky nebo jejího fragmentu, kódovaného touto nukleovou kyselinou, expresí in vitro v hostitelské buňce, přičemž uvedená protilátka nebo její fragment zahrnuje vazebnou doménu antigenu, která je specifická k onkofetální doméně fibronektinu (FN) ED-B a přímo se na ni váže.
26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že požadovaná protilátka je ve formě úplné protilátky.
27. Způsob podle nároku 25, v y z n a č u j í c í se t í m, že požadovaný fragment protilátky je ve formě molekuly scFv.
28. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že zahrnuje izolovanou protilátku nebo její fragment podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 a jedno nebo více činidel, která umožňují stanovení vazby této protilátky nebo fragmentu na buňky.