DE69722714T2

DE69722714T2 - Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verfahren zur Anzucht krankheitsresistenter Sämlinge

Info

Publication number: DE69722714T2
Application number: DE69722714T
Authority: DE
Inventors: Masataka Kobe-shi Aino; Yoshio Miki-shi Maekawa; Taizo Takasago-shi Akiyama; Yukihiko Kakogawa-shi Yoshimi
Original assignee: Hyogo Prefectural Government; Taki Chemical Co Ltd
Current assignee: HYOGO PREFECTURAL GOVERNMENT KOBE JP; Taki Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-05-20
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2017-05-16
Also published as: DE69722714D1; EP0808571A1; JPH09308372A; US5935571A; JP2835598B2; EP0808571B1

Description

Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Topfballenmischung zur Aufzucht (Anzucht) von Sämlingen, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und außerdem ein Verfahren zur Aufzucht krankheitstoleranter (krankheitsresistenter) Sämlinge. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, durch den Erdboden übertragene Krankheiten an Kultur- und Blütenpflanzen zu verhindern, wobei die Erzeugbarkeit von Feldfrüchten verbessert wird.
Hintergrund der Erfindung:
Die gegenwärtige, sowohl einheimische als auch ausländische Agrartechnologie wird auf eine umweltschonende Landwirtschaft ausgerichtet und es wird gewünscht, ökologisch verträgliche Agrartechniken einzusetzen. Angesichts dieser Situation besteht für uns eine vordringliche Notwendigkeit, Maßnahmen zur Verhinderung von durch den Erdboden übertragenen Krankheiten an Kultur- und ebenso an Blütenpflanzen zu ergreifen, es gibt jedoch keine bekannten Chemikalien für die Landwirtschaft, die hinsichtlich der Verhinderung dieser durch den Erdboden übertragenen Krankheiten wirksam sind, ohne dabei die Umwelt zu belasten, und es war schwierig, derartige Krankheiten zu verhindern.
Zuvor wurden in der Pflanzenzucht bzw. Landwirtschaft in geschlossener Umgebung o. ä. große Mengen an Bodendesinfektionsmitteln zur Desinfektion des Erdbodens eingesetzt, um Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden und die von Verletzungen durch das ständige Abschneiden verursacht werden, zur Aufrechterhaltung der Produktivität zu verhindern.
Diese Bodendesinfektionsmittel sind jedoch problematisch, da sie negative Einflüsse auf die Ökologie einschließlich des Menschens aufweisen und daher in Zukunft nicht eingesetzt werden sollten. Dementsprechend ist es nun vom besonderen Interesse, in diesem Bereich anstelle der Bodendesinfektionsmittel an dere, umweltverträgliche Stoffe zu entwickeln, um Krankheiten zu verhindern, die durch den Erdboden übertragen werden.
Auf der anderen Seite wurden zur Förderung der Ausrichtung hin zu einer umweltschonenden Landwirtschaft zahlreiche Versuche unter Verwendung von Stoffen durchgeführt, die Mikroben beinhalten, welche im Erdboden wachsen und dort Antagonisten produzieren (Antimykotika und antibakterielle Substanzen gegen Phytopathogene), wodurch Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, verhindert werden. Derartige mikrobische Stoffe sind jedoch problematisch, da sie in ihrer Anwendbarkeit begrenzt sind, die Reproduzierbarkeit ihrer Wirksamkeit (Effekte) schlecht ist, ihre Wirksamkeit nicht langanhaltend ist und ihre Anwendung häufig schwierig ist.
In Bezug auf die oben geschilderte Situation haben wir, die vorliegenden Erfinder, zahlreiche Untersuchungen zur Verhinderung von Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, unter Verwendung verschiedener mikrobischer Stoffe durchgeführt. Wir haben bereits einen Weg zur Verhinderung von Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, unter Verwendung fluoreszierender Bakterien (Fluoreszenzbakterien), die in der Endorhizosphäre von Kulturpflanzen wachsen, beschrieben (siehe japanische Patentanmeldung, Offenlegungsnummer 7-163334).
Zusätzlich haben wir bereits Samen, die gleichzeitig mit diesen Fluoreszenzbakterien und N-Acyllactamen behandelt wurden, zur Gewährleistung der Verhinderung von durch den Erdboden übertragenen Krankheiten an Kulturpflanzen, wodurch das Wachstum der Kulturpflanzen gefördert wird, vorgeschlagen (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 7-23515).
Weiterhin haben wir bereits einen Stoff zur Verhinderung der Bakterienwelke vorgeschlagen, der Fluoreszenzbakterien enthält, die in der Lage sind, kristallines 2,4-Diacetylphloroglucinol herzustellen, und die keine Antibiotikaresistenz aufweisen, wobei die Bakterien im wesentlichen aus der Endorhizosphäre von Kulturpflanzen isoliert wurden (siehe japanische Patentanmeldung 7-99628).
Außerdem haben wir bereits ein Verfahren zur Verhinderung der Bakterienwelke vorgeschlagen, das die Verwendung von Mikroben vorsieht, die eine Phenoltoleranz aufweisen und die keine antimikrobiellen Substanzen produzieren können, wobei diese Mikroben im wesentlichen aus der Endorhizosphäre von Kulturpflanzen isoliert wurden (siehe japanische Patentanmeldung Nr. 7-99629).
Wir haben bestätigt, daß die oben angeführten Stoffe mit Fluoreszenzbakterien, die in der Endorhizosphäre von Kulturpflanzen wachsende Fluoreszenzbakterien umfassen, wirksam sind in bezug auf die Verhinderung der Bakterienwelke von Kulturpflanzen, die in einem Temperaturbereich angezogen wurden, in dem die Fluoreszenzbakterien wachsen können. Wir haben jedoch herausgefunden, daß die Stoffe ihre Wirkungen, beispielsweise in der Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung o. ä., bei der die Temperatur 40°C oder mehr betragen kann, nicht zufriedenstellend aufzeigen konnten. Unter solchen Hochtemperaturbedingungen ist die Kolonisierung der Fluoreszenzbakterien in der Endorhizosphäre von Kulturpflanzen bedeutend verringert, so daß die Fluoreszenzbakterien ihre Wirkung in Kulturfeldern, bei denen der Schweregrad der Bakterienwelke hoch ist, oder in der Langzeitkultivierung von Kulturpflanzen nicht zufriedenstellend aufzeigen können.
Mit der gegenwärtigen Entwicklung in der intensiven Landwirtschaft hinsichtlich der Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung nimmt die Häufigkeit von Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, zu. Beispielweise nehmen Kombinationserkrankungen aus Bakterien- und Pilzerkrankungen zu. Dennoch können auf Kulturfeldern, bei denen solche Kombinationskrankheiten auftreten, einige Pflanzen weiterhin gut wachsen. Wir, die vorliegenden Erfinder, haben diese Tatsache speziell beobachtet und unsere Untersuchungen weiter vorangetrieben. Wir haben speziell an gesunden Pflanzen, die in der Nähe von Pflanzen mit Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, wachsen, nach gram-negativen Bakterien gesucht, von denen angenommen wird, daß sie die höchste Kompatibilität zu Pflanzenwurzeln besitzen.
Nachdem die gesuchten gram-negativen Bakterien erfolgreich gefunden wurden, haben wir von ihnen diejenigen selektiert, die in der Endorhizosphäre von Pflanzen Kolonien bilden können, um ihre Funktion der Hemmung oder Verhinderung von Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, wie Bakterienwelke, aufzuzeigen. Wir haben zwei Stämme entdeckt, die endosymbiotisch und mutualistisch in der Endosrhizosphäre von Pflanzen, wie Solanaceae, in großer Häufigkeit Kolonien bilden können. Wir haben weiterhin die Inkubationsweise dieser beiden Stämme und die Aufbringungsweise auf Kulturfelder untersucht, und als ein Ergebnis haben wir gefunden, daß die beiden Stämme nicht nur in der Endorhizosphäre von Solanaceae-Pflanzen, sondern auch in jener von Cruciferae-, Erdbeeren-, Kartoffeln-, Nelkenpflanzen und weiteren Pflanzen endosymbiotisch und mutualistisch koloniebildend sind, wenn diese beiden Stämme in die Endorhizosphäre von Sämlingen eingebracht werden. Die Sämlinge, die endosymbiotisch mit den zwei Stämmen wachsen, zeigen eine starke Resistenz gegenüber bakteriellen und pilzinduzierten Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden. Auf Grundlage dieser Ergebnisse haben wir die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Zusammenfassung der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung stellt eine Topfballenmischung zur Aufzucht (Anzucht) von Sämlingen, die endosymbiotische, in der Endorhizosphäre von Pflanzen mutualistisch koloniebildende Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescence FPT-9601 und Pseudomonas sp. FPH-9601 (nachfolgend bezeichnet als endosymbiotische Pseudomonaden), umfaßt, ein Verfahren zur Herstellung der Topfballenmischung und ein Verfahren zur Aufzucht krankheitstoleranter (krankheitsresistenter) Sämlinge in dieser Topfballenmischung bereit.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen bereit, wobei die Topfballenmischung endosymbiotische Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescence FPT-9601 und Pseudomonas sp. FPH-9601, zusammen mit 1-[3-(4-Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon enthält, von dem angenommen wird, daß es das enzymatische System in Pflanzen beeinflußt, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Topfballenmischung und ein Verfahren zur Anzucht krankheitstoleranter Sämlinge in dieser Topfballenmischung bereit.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Anzucht krankheitstoleranter Sämlinge verwendet eine Topfballenmischung, die endosymbiotische Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescence FPT-9601 und Pseudomonas sp. FPH-9601, enthält, wobei krankheitstolerante Sämlinge in der Topfballenmischung angezogen werden und die beiden Stämme zunächst dort in der Endorhizosphäre Kolonien bilden und anschließend in Kulturfeldern die Kolonien mit dem dortigen Pflanzenwachstum in der Endorhizosphäre vergrößert werden. Entsprechend diesem Verfahren ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß sie Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, wie Bakterienwelke, Fusariumwelke und Mehltau bzw. Krautfäule an Kulturpflanzen, wie Kartoffeln, Paprika, Tomaten, Auberginen, Erdbeeren, Kohl und Nelken, verhindert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
Die erfindungsgemäße Topfballenmischung zur Aufzucht von Sämlingen, das Verfahren zu ihrer Herstellung und das Verfahren zur Anzucht krankheitstoleranter Sämlinge werden nun nachfolgend im Detail beschrieben. Die zwei erfindungsgemäß verwendeten Stämme sind dadurch gekennzeichnet, daß sie endosymbiotische Pseudomonaden sind. Genauer gesagt, können die zwei endosymbiotisch wachsenden Stämme, wie nachfolgend angeführt wird, leichter in die Endorhizosphäre von Pflanzen, die sich in der Phase der beschleunigten Keimung und in der Sämlings-(Jungpflanzen-)Phase befinden, eindringen als solche Stämme, die einzeln wachsen, und die beiden Stämme wachsen gemeinsam, unmittelbar nachdem sie in die Endorhizosphäre von Pflanzen, die sich in einer der o. a. Phasen befinden, eingedrungen sind, dort schnell, endosymbiotisch und synergistisch.
Die einzelnen Aktivitäten dieser endosymbiotischen Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescence FPT-9601 (nachfolgend bezeichnet als Ps. FPT) und Pseudomonas sp. FPH-9601 (nachfolgend bezeichnet als Ps. FPH) sind nachfolgend detailliert beschrieben.
Bezug nehmend auf das Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Band 2, 1986 wird Ps. FPT im Hinblick auf seine taxonomischen Eigenschaften, die nachfolgend angeführt werden, in die Pseudomonas fluorescence Biotyp IV-Gruppe eingeordnet, wobei Ps. FPT dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Antibiotikum, kristallines 2,4-Diacetylphloroglucinol, produziert.
Genauer gesagt, zählt Ps. FPT zum Typ der psychrotrophen, oligotrophen Bakterien mit einer hohen Impfkolonisierungsrate in der Endorhizosphäre von Solanaceae- und Cruciferae-Kulturpflanzen. Dieser Stamm zeigte in einem antimikrobiellen Ansatz in einem üblichen Medium starke antimikrobielle Aktivitäten gegenüber Phytopathogenen der Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, wie Pathogenen der Fusariumwelke, gram-positive Bakterien und Pathogenen der Bakterienwelke.
Auf der anderen Seite ist Ps. FPH im Hinblick auf seine taxonomischen Eigenschaften, die nachfolgend erwähnt werden, ein Stamm, der den beiden Pseudomonas chlororaphis- und Pseudomonas fluorescens-Stämmen ähnelt. Ps. FPH ist vom Typ eines psychotrophen Bakteriums, das spezifisch eine hohe Impfkolonisierungsrate in der Endorhizosphäre von Solanaceae-Kulturpflanzen aufweist.
Zudem ist Ps. FPH dadurch gekennzeichnet, daß es fluoreszierenden Schleim produziert. In einem antimikrobiellen Ansatz in einem üblichen Medium gegenüber Phytopathogenen der Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, zeigt dieser Stamm überhaupt keine antimikrobielle Aktivität gegenüber den getesteten phytopathogenen Bakterien (Pathogenen der Tomatenbakterienwelke) sowie gegenüber den getesteten phytopathogenen Pilzen (Pathogenen der Rizoctonia-Krankheit, Pathogenen J1 und J2 der Fusariumwelke bei Tomaten, Pathogene der Kronen- (Fuß-) und Wurzelfäule bei Tomaten, Pathogenen der Nelkenfusariumwelke).
Diese endosymbiotischen Pseudomonaden, Ps. FPT und Ps. FPH, wurden aus der Endorhizosphäre von Tomaten (der Sorte Kantaro Jr.), die eine Krankheit, die durch den Erdboden übertragen wird, aufweisen, aus einem Kulturfeld in Aboshi-ku, Himeji-shi, Hyogo-ken, Japan, isoliert.
Die zwei Stämme wurden in dem National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology of Japan unter der Hinterlegungsnummer für Mikroben FERM BP-5478 in bezug auf Ps. FPT und unter der Hinterlegungsnummer für Mikroben FERM BP-5479 in bezug auf Ps. FPH hinterlegt.
Nachfolgend werden die taxonomischen Eigenschaften der Ps. FPT-Stämme im Detail beschrieben.

a) Morphologische Eigenschaften: Gram-negative Stäbchen, 0,5 bis 1,0 μm × 1,5 bis 2,0 μm. Bewegungsvermögen: Freibeweglich durch polares Flagellum. Endosporenbildung: -.
b) Wachstumsbedingungen: In einem PDA-Medium werden in 3 bis 4 Tagen kreisförmige, flache und cremefarbige Kolonien gebildet. (PDA-Medium: Hergestellt durch Lösen von 3 bis 5-facher Kartoffeldextrose, gefolgt von der Zugabe von 1, 5% Agar.)
c) Physiologische Eigenschaften: Es produziert kristallines 2,4-Diacetylphloroglucinol. Wachstumstemperatur: 15°C bis 35°C (Zellen des Stammes flokkulieren bei 37°C). OF-Test (Glucoseoxidation/Glucosefermentations-Test): oxidativ. Cytochromoxidase-Reaktion: -/± (Minus (-) gilt für den herkömmlichen Nachweisbereich). Nitratreduktion: Denitrifikation. Indolproduktion: -. H₂S-Produktion: -. Acetoinproduktion: +. Lävanbildung aus Sucrose: +. L-Argenindihydrolase: +. Urease: -. Gelatineverflüssigung: +. α-Glucosidase: -/±. β-Glucosidase: ±/+. β-Galactosidase: -. Säureproduktion: aus Zitronensäure, Glucose, Sucrose, D-Melibiose, L-Arabinose. Kohlenstoffquellen für das Wachstum: Glucose, L-Arabinose, D-Mannose, D-Mannitol, N-Acetyl-D-glucosamin, Kaliumgluconat, n-Capronsäure, dl-Maleinsäure, Natriumcitrat.

FPH wird nachfolgend detailliert beschrieben:

a) Morphologische Eigenschaften: Gram-negative Stäbchen, 0,2 bis 0,5 μm × 1,0 bis 1,5 μm. Bewegungsvermögen: Ja, freibeweglich durch polares Fragellum. Endosporenbildung: -.
b) Wachstumsbedingung: In einem PDA-Medium werden in 2 bis 3 Tagen kreisförmige, flache und cremefarbige Kolonien gebildet.
c) Physiologische Eigenschaften: Produktion von fluoreszierendem Schleim: +. Wachstumstemperatur: 15°C bis 37°C. OF-Test (Glucoseoxidation/Glucosefermentations-Test): -. Cytochromoxidase: +. Nitratreduktion (zur Produktion von Nitriten aus Nitraten): +. Indolproduktion: -. H₂S-Produktion: -. Acetoin-Produktion: -. Lävanbildung aus Sucrose: -. L-Arginindihydrolase: -. Urease: -. Gelatineverflüssigung: -. α-Glucosidase: -. β-Glucosidase: +. β-Galactosidase: -. Acylamidase: +. Säureproduktion: aus Zitronensäure.

Kohlenstoffquellen für das Wachstum: Glucose, D-Mannose, D-Mannitol, N-Acetyl-D-Glucosamin, Kaliumgluconat, dl-Maleinsäure, Natriumcitrat, Phenylacetat, Ethanol.
Als nächstes wird eine Methode zur Inkubation von Ps. FPT und Ps. FPH beschrieben. Ps. FPT und Ps. FPH können auf die gleiche Weise inkubiert werden. Beispielsweise werden die Zellen der zwei Stämme in einem Flüssigmedium, das 0,8 g/l Kartoffelextrakt und 4 g/l Glucose enthält, bei 25°C für zwei Wochen statisch (ohne Bewegung) inkubiert, um vermehrte Zellen der Ps. FPT- und Ps. FPH-Stämme zu erhalten.
Nun werden die endosysmbiotischen Eigenschaften der beiden Ps. FPT- und Ps. FPH-Stämme detailliert beschrieben.
Wenn Zellen der beiden Ps. FPT- und Ps. FPH-Stämme in einem Medium coinkubiert werden, so ist das Wachstum der Ps. FPT-Zellen aufgrund der mikrobiziden Substanzen (2,4-Diacetylphloroglucinol und seine Derivate), die durch die Ps. FPT-Zellen produziert werden, inhibiert. Entsprechend ist in einem üblichen Medium die endosymbiotische, mutualistische Kolonisierung der beiden Stämme nicht möglich. Offensichtlich verhalten sich die beiden Stämme in Gegenwart von Pflanzen jedoch unterschiedlich.
Nachfolgend werden die endosymbiotischen Eigenschaften der zwei Stämme in Gegenwart von Pflanzen beschrieben.
Tomatensamen wurden in eine Topfballenmischung, die durch Vermischen der zwei Kulturmedien hergestellt wurde, ausgesät, wobei das eine Medium dort vorwiegend inkubierte Ps. FPT-Zellen und das andere dort vorwiegend inkubierte Ps. FPH-Zellen besaß, dann zum Keimen gebracht und zu Sämlingen aufgezogen. Dann wurden die Kolonisierungsgegebenheiten der beiden Inocola in der Endorhizosphäre der Sämlinge beobachtet, mit der Folge, daß die Impfkolonisierungsrate der beiden gemeinsam inkubierten Stämme höher war als die eines einzeln inkubierten Stamms.
Beide Stämme wachsen unmittelbar nach Penetration der Pflanzen endosymbiotisch und mutualistisch sowohl in den Stämmen knapp über dem Boden als auch in den Hauptwurzeln, während sie mit dem Wachstum der Pflanze Richtung Wurzelspitze wandern und dabei die Stellen der Pflanze vergrößern, an denen sie ihre Kolonien bilden. Vier Monate nachdem die Pflanzen in ein Kulturfeld ausgesetzt wurden, erreichen die so vergrößerten Stellen der Pflanze, an denen die beiden Stämme ihre Kolonien bilden, die Haarwurzeln der Pflanzen. Dieses Phänomen kann einfach durch erneute Isolierung der Kolonien der beiden Stämme aus der Endorhizosphäre der Pflanzen nachvollzogen werden. Die beiden Stämme bilden ihre Kolonien in der Endorhizosphäre der Pflanzen aktiver, wenn die Stämme gemeinsam und nicht einzeln vorhanden sind. Somit vergrößern die beiden Stämme mit dem Wachstum der Pflanzenwurzel die Stellen der Pflanzen, an denen sie ihre Kolonien bilden. Es wird angenommen, daß diese endosymbiotische, mutualistische Kolonisierung der Pflanzen durch die beiden Stämme stark mit der Aktivität der beiden Stämme in Bezug auf die Verhinderung von Pflanzenkrankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, verbunden ist.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen detailliert beschrieben.
Zunächst wird in der vorliegenden Erfindung eine Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen bei 100°C oder mehr, vorzugsweise bei 160°C bis 200°C, für 0,5 bis 1 Stunde trockensterilisiert. Die Trockensterilisation bei Temperaturen von mehr als 200°C ist im Hinblick auf die Apparaturkosten und dem benötigten Brennstoff nicht wirtschaftlich.
Das Ziel der Trockensterilisation der Topfballenmischung ist, die darin existierenden Mikroben zu vernichten und damit die Topfballenmischung zu sterilisieren.
Die verwendete Topfballenmischung ist nicht speziell definiert und sie kann eine beliebige sein, die Luftdurchlässigkeits- und Feuchtigkeitsrückhalteeigenschaften aufweist. Hierzu wird eine Topfballenmischung bevorzugt, die durch Mischen von Vermiculite oder Moostorf mit Lehm und Humusboden hergestellt wird.
Anschließend werden die sterilisierten Topfballenmischungen jeweils mit Ps. FPT-Zellen und Ps. FPH-Zellen getrennt angeimpft und dann in einem Sterilraum bis zu einer Zellkonzentration von 10⁵ Koloniebildenden Einheiten (KBE)/g oder höher inkubiert. Die Inkubation kann im allgemeinen bei 15°C bis 30°C für 3 Wochen oder länger durchgeführt werden.
Die Inkubutation sollte fortgeführt werden, bis eine Zellkonzentration von 10⁵ KBE/g oder höher erreicht ist. Dies geschieht daher, da bei einer Zellkonzentration geringer von 10⁵ KBE/g zuviel Zeit benötigt wird, bis die gewünschte Kolonisierung der Zellen in den Sämlingen erreicht ist.
Anschließend werden die beiden Topfballenmischungen vor der Aussaat gemischt. Das Verhältnis der zu mischenden Topfballenmischungen sollte so sein, daß die Zellkonzentration in jeder Topfballenmischung 10⁵ KBE/g oder höher ist. Dies liegt daran, daß bei einer Zellkonzentration von weniger als 10⁵ KBE/g in der jeweiligen Topfballenmischungen zuviel Zeit benötigt wird, bis die gewünschte Kolonisierung der Zellen der beiden Stämme in den Sämlingen erreicht ist.
Nun wird nachfolgend eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens zur Herstellung einer solchen Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen beschrieben.
Zunächst werden die Zellen der zwei Stämme getrennt in einer wäßrigen Lösung aus Natriumalginat suspendiert, so daß eine Zellkonzentration von 10⁴ Zellen/ml oder höher, vorzugsweise 10⁶ Zellen/ml oder höher, erreicht wird.
Die Konzentration von Natriumalginat in der wäßrigen Lösung beträgt vorzugsweise 0,01 bis 1 Gew.-%. Die resultierenden Zellsuspensionen werden getrennt zugegeben und mit einer trockensterilisierten Topfballenmischung in einem Verhältnis von 20 bis 30% (v/v) gemischt. Während des Mischens der Zellsuspension mit der trockenstertlisierten Topfballenmischung werden zweiwertige Kationen, die auf der Oberfläche der Topfballenmischung vorhanden sind, durch Natriumalginat ersetzt, wobei ein wasserunlöslicher Film an der Oberfläche der Topfballenmischung gebildet wird. Folglich werden die Zellen an der Oberfläche der Topfballenmischung auf dem wasserunlöslichen Film immobilisiert und die Zellen vermehren sich hierauf.
Die Immobilisierung der Zellen in der Topfballenmischung soll für die zwei Stämme getrennt durchgeführt werden.
Das Ziel der Immobilisierung der Zellen in der Topfballenmischung besteht darin, ein Ablösen der Zellen, hervorgerufen durch Bewässerung, zu vermeiden und die Kolonisierung der Zellen in der Endorhizosphäre der Sämlinge effizient zu erreichen.
In der vorliegenden Erfindung wird die Topfballenmischung, welche Zellen der zwei Stämme umfaßt und die nach dem oben beschriebenen Verfahren erhältlich ist, zur Anzucht krankheitstoleranter Sämlinge verschiedener Kulturpflanzen verwendet.
Wir, die vorliegenden Erfinder, haben herausgefunden, daß die Impfkolonisierungsrate der Stämme in der Endorhizosphäre von Sämlingen bei Temperaturen, beispielsweise während der Sommersaison, merklich verringert ist. Daher haben wir zur Lösung dieses Problems weiter geforscht und haben gefunden, daß 1-[3-(4-Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon ein extrem wirksames Stimulationsmittel für Pseudomonaden hinsichtlich der Kolonisierung in der Endorhizosphäre ist.
Dieses Stimulationsmittel kann bezüglich seiner Verwendung in die oben angeführte Topfballenmischung, die Zellen der zwei Stämme enthält, in einer Menge von 10 ppm oder mehr, vorzugsweise von 50 bis 200 ppm, gegeben werden. Wenn dieser Gehalt weniger als 10 ppm beträgt, kann das Stimulationsmittel seine Wirksamkeit nicht zufriedenstellend entfalten; wenn der Gehalt jedoch mehr als 200 ppm beträgt, wird die Wirksamkeit des Stimulationsmittels nicht weiter verstärkt.
Die Zugabe des Stimulationsmittels zu der Topfballenmischung führt nicht nur bei üblichen Temperaturen, sondern auch bei hohen Temperaturen zu einer Zu nahme der Impfkolonisierungsrate der Stämme und ebenso zu einer Verkürzung der Zeit, die zur Impfkolonisierung der Stämme benötigt wird.
Die Samen einer gewünschten Kulturpflanze werden in die Topfballenmischung, die auf zuvor angeführte Weise hergestellt wird, ausgesät und in dieser angezogen, und anschließend werden die so angezogenen Sämlinge auf ein Kulturfeld ausgepflanzt. Das Verfahren zur Anzucht der Samen in der Topfballenmischung und das Verfahren zur Anzucht der Sämlinge in einem Kulturfeld unterscheiden sich überhaupt nicht von üblichen Verfahren.
Die durch den Erdboden übertragenen Krankheiten, gegen welche die vorliegende Erfindung spezifisch wirksam ist, sind Bakterienwelke, Fusariumwelke und Mehltau bzw. Krautfäule, die Erfindung ist aber nicht auf diese beschränkt.
Die Kulturpflanzen, bei denen die vorliegende Erfindung eine spezifische Wirksamkeit besitzt, sind ausgewählt aus Solanaceae, Cruciferae, Rosaseae und Caryophyllaceae und konkreter Kartoffeln, Tomaten, Gurken, Auberginen, Paprika, Kohl, Erdbeeren, Nelken oder anderen. Die Erfindung ist aber nicht auf diese beschränkt.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen:
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele genauer beschrieben, wobei die Prozentwerte, soweit spezifisch nicht anders angegeben, Gewichtsprozente darstellen.
Beispiel 1:
Nachweis und Isolation der erfindungsgemäßen Stämme:
Pflanzen wurden mitsamt des Bodens in der sie umgebenden Rhizosphäre gesammelt und ihre Wurzeln in Stadtwasser, das sich in einem Behältnis befand, getaucht und in diesem zur Entfernung des Bodens gewaschen. Ihre Stämme wurden ebenso mit Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Wurzeln in einer 0,005 %igen wäßrigen Lösung des Aerosols OT getaucht in dieser geschüt telt, um die Substanzen, die auf den Oberflächen der Wurzeln festgehalten wurden, von diesen zu entfernen. Die Wurzeln wurden weiterhin mit sterilisiertem Wasser gewaschen, anschließend in einer 80 %igen Ethanollösung getaucht und in dieser für 1 Minute geschüttelt. Anschließend wurde das auf den Wurzeln haftende Ethanol mit sterilisiertem Wasser entfernt und die Wurzeln wurden in einer 1 %igen wäßrigen Natriumhypochloridlösung für 10 Minuten getaucht und geschüttelt. Das auf den Wurzeln haftende Natriumhypochlorid wurde mit sterilisiertem Wasser entfernt und die Stämme wurden abgeschnitten. Die so erhaltenen Wurzeln wurden in diesem Experiment als Probe verwendet.
Die Probe wurde in etwa 1 cm lange Stücke geschnitten und diese Stücke wurden auf eine Kartoffel-Dextrose-Agarplatte, die 5 mg/l Kristallviolett enthielt, gebracht.
Diese Agarplatte wurde bei 20 bis 23°C für etwa 2 Wochen zur Bildung der Bakterienkolonien inkubiert.
Wenn Ps. FPT-Zellen in der Probe existieren, bilden sie Kolonien und Kristalle (2,4-Diacetylphloroglucinol) in den Wurzeln und ihrer Umgebung. Die 2,4-Diacetylphloroglucinolkristalle emitieren bläulich-weißes Fluoreszenzlicht, wenn sie ultravioletter Strahlung bei einer Wellenlänge von 365 nm ausgesetzt werden. In Abhängigkeit von der An- oder Abwesenheit der Kolonien und der Kristalle kann die An- oder Abwesenheit von Ps. FPT in der Probe bestimmt werden.
Demgegenüber kann die An- oder Abwesenheit von Ps. FPH in der Probe wie folgt bestimmt werden. Wenn sich fluoreszenzschleimproduzierende Kolonien auf der Agarplatte bilden, werden die Kolonien auf einer King B-Agarplatte, die 200 mg/l Streptomycin, 100 mg/l Natriumampicillin und 100 mg/l Nalidixinsäure enthält, repliziert. Wenn sie weiterhin auf der King B-Agarplatte wachsen, handelt es sich um Ps. FPH-Kolonien.
Soweit spezifisch nicht anders angegeben, wurden die Ps. FPT- und Ps. FPH-Stämme gemäß den oben genannten Verfahren nachgewiesen.
Die Samen einer Tomatenpflanze (der Sorte Ohgata Fukuju) wurden in eine 80%ige Ethanollösung für 1 Minute unter vorsichtigem Rühren getaucht und dann herausgenommen. Sie wurden für 10 Minuten in eine 1%ige wäßrige Natriumhypochloridlösung getaucht, um dadurch die Oberfläche der Samen zu sterilisieren, und anschließend mit Wasser gewaschen. Diese Samen wurden in Kulturgefäßen in einer Menge von 3 Samen/Gefäß ausgesät, wobei jedes Kulturgefäß ein (White-) Agarmedium (ohne Sucrosezugabe) im unteren Abschnitt (mit einer Tiefe von 6 cm), eine Schicht aus Seesand im mittleren Abschnitt (mit einer Tiefe von 0,5 cm) und ein Agar-Agar-Medium im oberen Teil (mit einer Tiefe von 1 cm) aufwies.
Nach der Aussaat wurden die Samen unter Licht und aeroben Bedingungen bei 28°C angezogen. Nachdem die Spitzen der aus dem Samen wachsenden Wurzeln die Seesandschicht erreichten, wurde eine Zellsuspension mit 10⁸ Zellen/ml Ps. FPT in sterilisiertem Wasser und eine Zellsuspension mit 10⁸ Zellen/ml Ps. FPH in sterilisiertem Wasser auf die Oberfläche des Mediums, entweder einzeln oder kombiniert, gegeben. Die Menge jeder einzeln aufgegebenen Zellsuspension betrug etwa 1% (v/v) in Bezug auf das Volumen des Mediums in dem Gefäß, während die jeweilige Menge der gemeinsam aufgebrachten Zellsuspensionen etwa 0,5% (v/v) in Bezug auf dasselbe betrug.
Diese wurden weiterhin unter Licht und aeroben Bedingungen bei 25°C für 3 Tage angezogen. Dann wurde in jedes Gefäß eine Zellsuspension mit 10⁸ Zellen/ml eines Pathogens der Bakterienwelke auf die Oberfläche des Mediums in einer Menge von etwa 2% (v/v) in Bezug auf das im Gefäß vorhandene Medium aufgegeben.
Nach Animpfen der Zellen des Bakterienwelkepathogens wurden die Sämlinge unter Licht und aeroben Bedingungen bei 30°C angezogen. Getrennt von diesen Testgefäßen wurde sterilisiertes Wasser an Stelle der Ps. FPT- und/oder der Ps. FPH-Zellsuspensionen auf die Kulturgefäße in der Kontrollgruppe gegeben und die Kontrollsämlinge wurden auf die gleiche Weise wie die Testsämlinge angezogen.
Diese Sämlinge wurden für vier Wochen nach dem Animpfen mit pathogenen Zellen angezogen und es wurde das Auftreten der Bakterienwelke in diesen Sämlingen untersucht. Zusätzlich wurden die Ps. FPT- und Ps. FPH-Zellen von den angezogenen Sämlingen re-isoliert.
Von den erhaltenen Daten wurde die Auftrittsrate der Bakterienwelke in den Sämlingen, die Rate der Sämlinge mit Impfkolonisierung in der Endorhizosphäre und die Rate der impfkolonisierten Wurzellänge der Sämlinge berechnet. Die so erhaltenen Daten sind untenstehend in Tabelle 1 angeführt. Die Auftrittsrate der Bakterienwelke in den Sämlingen (nachfolgend als Auftrittsrate bezeichnet), die Rate der Sämlinge mit Impfkolonisierung in der Endorhizosphäre (nachfolgend als Rate impfkolonisierter Sämlinge bezeichnet) und die Rate der impfkolonisierten Wurzellänge der Sämlinge (nachfolgend als Rate der impfkolonisierten Wurzellänge bezeichnet) wurden entsprechend den nachfolgenden Formeln berechnet
Auftrittsrate (%) = [(Anzahl der erkrankten Sämlinge)/(Anzahl aller getesteten Sämlinge)] × 100
Rate impfkolonisierter Sämlinge (%) = [(Anzahl der Sämlinge, von denen Ps. FPT- und/oder Ps. FPH-Zellen re-isoliert wurden)/(Anzahl aller getesteten Sämlinge)] × 100
Rate der impfkolonisierten Wurzellänge (%) = [(Länge der Wurzeln der Sämlinge, von denen Ps. FPT- und/oder Ps. FPH-Zellen re-isoliert wurden)/(Wurzellänge aller getesteten Sämlinge)] × 100
(Die Wurzellänge der Sämlinge wurde gemäß dem Gitterlinienverfahren nach Marsh (von 1971) gemessen, wobei die Gesamtlänge der Wurzeln auf einer Zählplatte durch Messen der Anzahl von Kreuzungspunkten an Gitterlinien (5 mm × 5 mm) bestimmt wird.)
Tabelle 1:
Beispiel 2:
Eine kommerziell erhältliche Topfballenmischung eines Systems zur Einzelanzucht von Sämlingen (System für zellgezüchtete Sämlinge, Metromix-350, Markenname des Produkts der Scott Co. / USA) wurde bei 120°C für eine Stunde trockensterilisiert (die Trockensterilisation wird nachfolgend als Wärmebehandlung bezeichnet). Andererseits wurden Ps. FPT- und Ps. FPH-Zellen getrennt in sterilisiertem Wasser suspendiert, so daß man Zellsuspension mit jeweils 10⁹ Zellen/ml erhielt.
Diese Zellesuspensionen wurden getrennt auf die Topfballenmischung jeweils in einer Menge von 10% (v/v) in bezug auf die Topfballenmischung gegeben. Somit wurde eine Ps. FPT-haltige Topfballenmischung und eine Ps. FPH-haltige Topfballenmischung hergestellt.
Unabhängig hiervon wurde sterilisiertes Wasser zu der wärmebehandelten Topfballenmischung in einer Menge von 10% (v/v) in bezug auf die Topfballenmischung gegeben. Diese wurde als Kontroll-Topfballenmischung verwendet. Zusätzlich wurde die Ps. FPT-haltige Topfballenmischung und die Ps. FPH-haltige Topfballenmischung in einem 1/1-Verhältnis zur Herstellung einer gemischten Topfballenmischung gemischt.
Diese vier Topfballenmischungen wurden separat in Einzelfächer eines Systems zur Einzelanzucht von Sämlingen gefüllt. Anschließend wurden Tomatensamen (der Sorte Momotaro), Paprikasamen (der Sorte Kyonami) und Auberginensamen (der Sorte Senryo Nr. 2) in jedes Einzelfach ausgesät. Die Sämlingsanzahl betrug für jede getestete Pflanze 30.
Nach der Aussaat wurden diese für 4 Wochen in einer kontrollierten Umgebungsbox des Systems zur Einzelanzucht von Sämlingen angezogen. Anschließend wurde die Rate der impfkolonisierten Sämlinge des jeweiligen Stamms ermittelt.
Die ermittelten Daten werden in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt.
Beispiel 3:
Vermiculit, Rote Böden (ein Ausdruck der japanischen Bodenklassifizierung) und eine kommerziell erhältliche Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen (Taki Engei Baido; Markenname des Produkts der Taki Chemical Co.) wurden in einem 18/8/1-Verhältnis gemischt und bei 180°C für eine Stunde wärmebehandelt, um eine Proben-Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen herzustellen. Auf der anderen Seite wurden Ps. FPT- und Ps. FPH-Zellen getrennt in sterilisiertem Wasser suspendiert, so daß Zellsuspensionen von 10² Zellen/ml, 10³ Zellen/ml, 10⁴ Zellen/ml, 10⁵ Zellen/ml, 106 Zellen/ml und 10⁷ Zellen/ml für jeden Stamm erhalten wurden. Die jeweilige Zellsuspension wurde auf die Proben-Topfballenmischung in einer Menge von 20% (v/v) in Bezug auf die Probe gegeben und bei 25°C für 2 Wochen statisch (unbewegt) belassen. Von diesem getrennt wurde sterilisiertes Wasser zu der wärmebehandelten Proben-Topfballenmischung in einer Menge von 20% (v/v) in Bezug auf die Probe gegeben und statisch bei 25°C für 2 Wochen belassen.
Es wurden 10 g der jeweiligen Proben-Topfballenmischung, die in oben angeführter Weise behandelt wurde, zu 100 ml sterilisiertem Wasser gegeben und für 10 Minuten geschüttelt. Anschließend wurde der resultierende Überstand auf eine Kartoffel-Dextrose-Agarplatte, die 5 mg/l Kristallviolett enthielt, ausgestrichen und hierauf bei 23°C für 2 Wochen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die gebildeten Kolonien bestimmt, woraus die Anzahl der Überlebenden von Ps. FPT und Ps. FPH bestimmt wurde. In Bezug auf den Ps. FPH-Stamm wurde die Anzahl der Überlebenden gemäß der oben angesprochenen Replikations-(Vermehrungs-)Methode bestimmt.
Die Daten der so erhaltenen Anzahl der Überlebenden sind unten in Tabelle 3 gezeigt.
Anschließend wurde die Ps. FPT-haltige Topfballenmischung und die Ps. FPH-haltige Topfballenmischung, die Tabelle 3 gezeigt sind, in einem 1/1-Verhältnis auf verschiedene Weise, wie unten in Tabelle 4 gezeigt, gemischt. Unter Verwendung dieser gemischten Proben wurde der Test zur Anzucht von Sämlingen von Tomaten, Kohl, (weißen) Raps und Chinakohl unter denselben Bedingungen wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die Anzahl der getesteten Sämlinge betrug für jede Pflanze 60. Die ermittelten Daten sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 3:
Die oben in Tabelle 4 angeführten Topfballenmischungen wurden separat in Einzelfächer eines Systems zur Einzelanzucht von Sämlingen gefüllt. Anschließend wurden Tomatensamen (der Sorte House Momotaro) in jedes Einzelfach ausgesät.
Nach der Aussaat wurden diese im System zur Einzelanzucht von Sämlingen für eine Woche in einem kontrollierten Umgebungsbehälter angezogen. Dann wurden die Sämlinge in ein Gewächshaus überführt und dort weiterhin für drei Wochen nach wie vor im Einzelanzuchtsystem für Sämlinge angezogen. Diese Sämlinge wurden in einen mit Bakterienwelke infizierten Boden umgepflanzt. Die Anzahl der Sämlinge betrug 30 für jede Gruppe. Fünf Wochen nach der Umpflanzung wurden die Sämlinge zur Bestimmung ihrer Resistenz gegenüber der Bakterienwelke untersucht.
Der hier verwendete, mit Bakterienwelke infizierte Boden besaß eine Dichte pathogener Zellen von 10⁶ bis 10⁷ KBE/g.
Die ermittelten Ergebnisse sind unten in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5:
Beispiel 4:
Zu jeder der in Tabelle 4 des Beispiels 3 gezeigten Proben-Topfballenmischungen D und E wurde 1-[3-(4-Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon zugegeben. Unter ihrer Verwendung wurden die nachfolgenden Versuche zur Anzucht von Sämlingen im Zeitraum von Mitte Juli bis Mitte August 1995 durchgeführt.
Das hier verwendete 1-[3-(4-Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon lag in Form einer Mischung mit Siliciumdioxidpulver vor, das die Substanz in einer Menge 10% (w/w) bezogen auf das Siliciumdioxidpulver enthielt. Diese Topfballenmischungen wurden separat in Einzelfächer eines Einzelanzuchtsystems für Sämlinge gegeben. Anschließend wurden Tomatensamen (der Sorten Kantaro Jr., Merryroad und Momotaro) gemäß Tabelle 6 in jedes Einzelfach ausgesät.
Nach der Aussaat wurden diese in dem Einzelanzuchtsystem für Sämlinge für eine Woche in einen kontrollierten Umgebungsbehälter angezogen. Anschließend wurden die Einzelfächer in ein Gewächshaus überführt, in dem die Anzucht für weitere zwei Wochen fortgeführt wurde. Die Gesamtzeit, in der die Temperatur des Gewächshauses 30°C oder höher war, betrug mehr als 200 Stunden.
Die Impfkolonisierung der Tomatensämlinge wurde untersucht und die Rate der mit Ps. FPT und Ps. FPH impfkolonisierten Sämlinge wurde ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6:
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, daß bei den Tomatensämlingen die Zugabe von HPP in einer Menge von 10 ppm zu einer signifikanten Erhöhung der Rate impfkolonisierter Sämlinge führt.
Unter Verwendung von Teilen der hier hergestellten und in Tabelle 6 gezeigten HPP-haltigen Proben-Topfballenmischungen wurden die nachfolgenden Untersuchungen zur Anzucht von Tomatensämlingen in mit Bakterienwelke infizierten Boden durchgefürt.
Die Untersuchungen verlaufen wie folgt. Die Tomatensämlinge, die in den Einzelfächern des Einzelanzuchtsystems für Sämlinge unter Verwendung beliebiger HPP-haltiger Proben-Topfballenmischungen, wie in Tabelle 7 gezeigt, ausgesät wurden, wurden in denselben, wie in Beispiel 3 verwendeten, mit Bakterienwelke infizierten Boden ausgesetzt. Die Anzahl der Sämlinge betrug für jede Gruppe 30. Fünf Wochen nach der Umpflanzung wurden die Sämlinge zur Bestimmung ihrer Resistenz gegenüber der Bakterienwelke untersucht. Die ermittelten Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7:
Beispiel 5:
Vermiculit, Rote Böden (ein Ausdruck der japanischen Bodenklassifizierung) und eine kommerziell erhältliche Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen (Handelsname: Taki Engei Baido) wurden in einem 10/4/1-Verhältnis ge mischt und bei 80°C, 100°C oder 150°C für eine Stunde wärmebehandelt, um drei verschiedene Proben-Topfballenmischungen herzustellen, die mit Ps. FPT-oder Ps. FPH-Zellen auf unten angeführte Weise angeimpft wurden.
Auf der einen Seite wurden Ps. FPT- und Ps. FPH-Zellen jeweils separat in (1} sterilisiertem Wasser, (2) einer 0,01 %igen wäßrigen Natriumalginatlösung und (3) einer 0,1 %igen wäßrigen Natriumalginatlösung zur Herstellung verschiedener Zellsuspensionen mit einer Zelldichte von 10³ Zellen/ml, 10⁴ Zellen/ml, 10⁵ Zellen/ml oder 10⁶ Zellen/ml suspendiert.
Zu jeder der drei oben hergestellten Proben-Topfballenmischungen wurde jede dieser Zellsuspensionen in einer Menge von 20% (v/v) zugegeben und gemischt. Somit wurden hier insgesamt 72 zellhaltige Proben-Topftiallenmischungen hergestellt. Diese wurden bei 25°C für zwei Wochen statisch belassen.
Nachdem die Proben-Topfballenmischungen so für zwei Wochen belassen wurden, wurde die Anzahl überlebender Ps. FPT und jene von Ps. FPH in jeder Proben-Topfballenmischung ermittelt. Die Ergebnisse sind unten in den Tabellen 8 und 9 gezeigt.
Die in den Tabellen 8 und 9 gezeigten Proben-Topfballenmischungen wurden zur Herstellung gemischter Proben-Topfballenmischungen in einem 1/1-Verhältnis wie in Tabelle 10 kombiniert. Diese wurden getrennt in Einzelfächer eines Einzelanzuchtsystems für Sämlinge gegeben. Dann wurden Paprikasamen (der Sorte Kyoha) und Auberginensamen (der Sorte Senryo Nr. 2) in jedes Einzelfach ausgesät. Nach Aussaat wurden diese in dem Einzelanzuchtsystem für Sämlinge für 5 Wochen in einem kontrolliertem Umgebungsbehälter angezogen.
Die so angezogenen Sämlinge wurden zur Bestimmung der Ps. FPT- und Ps. FPH-Impfkolonisierung in diesen Sämlingen untersucht. Die Anzahl der getesteten Sämlinge betrug 30 für jede Gruppe. Somit wurde die Rate impfkolonisierter Sämlinge für jeden Stamm ermittelt. Die ermittelten Ergebnisse sind unten in Tabelle 10 gezeigt.
Tabelle 8:
Tabelle 9:
Wie anhand der Ergebnisse in Tabellen 8 und 9 ersichtlich ist, sind sowohl Ps. FPT als auch Ps. FPH in Topfballenmischungen, die bei Temperaturen niedriger als 100°C wärmebehandelt wurden, extrem schwierig anzuziehen. Es wird deutlich, daß die Zugabe von Natriumalginat zu den Topfballenmischungen von 0,01% oder mehr die Überlebensanzahl von Ps. FPT und Ps. FPH im Verhältnis zur Konzentration des zugegebenen Natriumalginats erhöht.
Tabelle 10:
Wie anhand der obenstehenden Tabelle 10 ersichtlich wird, ist die Rate der impfkolonisierten Sämlinge in den erfindungsgemäßen Topfballenmischungen G, H und J sehr hoch.
Anschließend wurden die Auberginensämlinge und die Paprikasämlinge, die für 5 Wochen unter Verwendung einer der Proben-Topfballenmischungen F und J in einem Einzelanzuchtsystem für Sämlinge angezogen, auf Felder umgesetzt, die mit der Auberginenfusariumwelke bzw. der Paprikabakterienwelke infiziert waren, und dort weiterhin für drei Monate angezogen. Die Anzahl der Sämlinge betrug für jede umgesetzte Pflanze 60. Die Wachstumseigenschaften dieser Pflanzen wurden mit dem Ergebnis untersucht, daß die Vermeidungsrate (Schutzrate) in Bezug auf die Auberginenfusariumwelke 8% in der Probe F und 57% in der Probe J betrug und daß der Vermeidungsgrad in Bezug auf die Paprikabakterienwelke 25% in der Probe F und 63% in der Probe J betrug.
Beispiel 6:
Vermiculit, Rote Böden (ein Ausdruck der japanischen Bodenklassifizierung) und eine kommerziell erhältliche Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen (Markenname: Taki Engei Baido} wurden in einem 18/8/1-Verhältnis gemischt und bei 180°C für eine Stunde wärmebehandelt, um so eine Proben-Topfballenmischung zur Anzucht von Sämlingen herzustellen. Diese wurde mit Ps. FPT- und Ps. FPH-Zellen wie unten aufgeführt angeimpft. Auf der anderen Seite wurden Ps. FPT- und Ps. FPH-Zellen zur Herstellung von Zellsuspensionen separat in einer 0,1 %igen wäßrigen Natriumalginatlösung in einer Menge von 10⁶ Zellen/ml suspendiert.
Diese Zellsuspensionen wurden einzeln in die oben hergestellte Topfballenmischung in einer Menge von 20% (v/v) in Bezug auf die Probe gegeben und bei 25°C für 2 Wochen statisch aufbewahrt. Nach dieser Aufbewahrung wurden die beiden Proben in einem 1/1-Verhältnis gemischt. Unter Verwendung der so gemischten Proben-Topfballenmischung wurden die nachfolgenden Untersuchungen an Sämlingen durchgeführt.
Die gemischte Proben-Topfballenmischung wurden in Einzelfächer eines Einzelanzuchtsystems für Sämlinge gefüllt und Tomatensamen (der Sorte Momotaro 8), Paprikasamen (der Sorte Tosahime), Auberginensamen (der Sorte Ryoma) und Kohlsamen (der Sorte Aozora) wurden in die Einzelfächer ausgesät, in denen die Pflanzen für 4 bis 8 Wochen angezogen wurden.
Unabhängig hiervon wurden die nachfolgenden Untersuchungen an heranwachsenden Erdbeer-, Kartoffel- und Nelkenpflanzen unter Verwendung dergleichen Proben-Topfballenmischung wie oben unter den nachfolgend aufgeführten Bedingungen durchgeführt.
Für die Untersuchung zum Wachstum der Erdbeerpflanzen (der Sorte Hokowase) wurden mit der gemischten Topfballenmischung gefüllte Töpfe verwendet, in denen die unteren Teile der Ausläuferpflanzen, die aus den Ausläufern gewachsen sind, auf die gemischte Proben-Topfballenmischung gesetzt und die Ausläuferpflanzen wurden zur Wurzelbildung gebracht. Nach der Bewurzelung wurde ein Teil des Ausläufers gänzlich von der Ausläuferpflanze abgeschnitten, wogegen der andere Teil hiervon so geschnitten wurde, daß er noch eine Länge von etwa 2 cm aufwies. Diese Ausläuferpflanzen wurden eingepflanzt und in den Töpfen befestigt.
Für die Untersuchung zum Wachstum der Kartoffelpflanzen (der Sorte Sanen) wurde die oben hergestellte gemischte Topfballenmischung verwendet, um damit etwa die Hälfte der oberen Schicht einer jeweiligen Pflanzspur (Pflanzrille) (Tiefe: etwa 15 cm) in einem Kulturfeld zu bilden, wobei in diese Pflanzspur gekeimte Kartoffelknollen eingepflanzt wurden. Anschließend wurden die Knollen mit der gemischten Topfballenmischung mit einer Dicke von etwa 8 cm abgedeckt und angezogen.
Für die Untersuchung zum Wachstum der Nelkenpflanzen wurden die Rispen, nachdem sie von den Mutterpflanzen getrennt wurden, in flache Behälter gepflanzt, die mit der oben hergestellten Topfballenmischung gefüllt waren, und für 30 Tage als Nebelkultur angezogen. Nach dieser Anzucht wurden die Pflanzen zur Bestimmung der Rate der in der Endorhizosphäre impfkolonisierten Sämlinge untersucht.
Die Anzahl der in diesen Untersuchungen eingesetzten Sämlinge betrug 30 für jede Pflanze. Die ermittelten Ergebnisse sind untenstehend in Tabelle 11 gezeigt.
Tabelle 11:
Die so nach obenstehender Weise angezogenen Sämlinge wurden in bezug auf Infektionen mit Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, in Kulturfeldern eines Landwirts in Hyogo-ken, Japan, getestet. Genauer gesagt, wurden die Tomatensämlinge in ein mit Bakterienwelke infiziertes Feld (zur Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung), in ein mit Fusariumwelke infiziertes Feld (zur Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung) und in ein mit Mehltau bzw. Krautfäule infiziertes Feld (zur Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung) eingepflanzt; die Paprikasämlinge wurden in ein mit Mehltau bzw. Krautfäule infiziertes Feld (zur Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung) eingepflanzt; die Auberginensämlinge wurden in ein mit Bakterienwelke infiziertes Feld (zur Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung) eingepflanzt; die Kartoffelsämlinge wurden in ein mit Fusariumwelke infiziertes Feld (zur Freilandpflanzenzucht) eingepflanzt; und die Erdbeersämlinge und die Nelkensämlinge wurden in ein mit Fusariumwelke infiziertes Feld (zur Pflanzenzucht in geschlossener Umgebung) eingepflanzt. Nach Anzucht in diesen Feldern wurden die Sämlinge zur Bestimmung der Auftrittsrate von Krankheiten für jeden Sämling untersucht.
Unabhängig hiervon, wurde eine 0,1 %-ige wäßrige Natriumalginatlösung zu der oben erwähnten wärmebehandelten Topfballenmischung gegeben und mit dieser gemischt. Unter Verwendung der resultierenden Topfballenmischung als Kontrolle, wurden die Sämlinge auf dieselbe Weise wie oben angezogen und diese wurden dann in denselben Feldern wie oben eingepflanzt und zur Feststellung ihres Erkrankungsgrads untersucht. Die Untersuchungen an den Kulturen wurden dreimal für jede Gruppe aus 20 Sämlingen wiederholt. Mit Ausnahme der Gruppe der Tomatensämlinge wurde die Anzahl der erkrankten Sämlinge in jeder Gruppe nach einem Monat, ausgehend von dem Zeitpunkt, an dem Erkrankungen an einigen Sämlingen der Kontrollgruppe festgestellt wurden, bestimmt. Die ermittelten Ergebnisse sind unten in Tabelle 12 gezeigt.
Tabelle 12:
Wie oben detailliert beschrieben wurde, beinhaltet die erfindungsgemäße Topfballenmischung endosymbiotische Pseudomonaden, Ps. FPT und Ps. FPH. Unter Verwendung einer derartigen Topfballenmischung werden krankheitstolerante Sämlinge, die beide Stämme als Kolonien in ihrer Endorhizosphäre aufweisen, angezogen und dann in Kulturfeldern ausgepflanzt, wobei die in der Endorhizosphäre der Pflanzen gebildeten Impfkolonien mit dem Wachstum der Pflanzen vergrößert werden. Angesichts des erfindungsgemäßen Verfahrens bietet die erfindungsgemäße Topfballenmischung exzellente Wirkungen zur Vermeidung von Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, wie beispielsweise Bakterienwelke, Fusariumwelke und Mehltau bzw. Krautfäule an Kulturpflanzen, wie Kartoffeln, Paprika, Tomaten, Auberginen, Erdbeeren, Kohl und Nelken.
Wo krankheitstolerante Sämlinge mit der erfindungsgemäßen Topfballenmischung angezogen werden, nimmt häufig die Rate der Impfkolonisierung der Stämme in der Endorhizosphäre der Sämlinge bei hohen Temperaturen, beispielsweise in der Sommersaison, deutlich ab. Wenn jedoch 1-[3-(4- Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon als Stimulationsmittel für Pseudomonaden für die Kolonisierung in der Endorhizosphäre von Pflanzen zugegeben wird, kann die Rate der Impfkolonisierung zunehmen und weiterhin kann die benötigte Zeitdauer der Impfkolonisierung nicht nur bei üblichen Temperaturen, sondern auch bei hohen Temperaturen, verkürzt werden.
Somit ist die erfindungsgemäße Topfballenmischung dort zur Verhinderung von Pflanzenkrankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, extrem wirksam, wo Sämlinge unter Hochtemperaturbedingungen auf Kulturfelder ausgepflanzt werden, bei denen die Auftrittsrate von Pflanzenkrankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, hoch sein kann, oder wo Sämlinge auf Kulturfelder ausgepflanzt werden, die bereits mit Krankheiten, die durch den Erdboden übertragen werden, infiziert sind, oder wo die Kultivierung von Pflanzen auf Kulturfeldern eine lange Kultivierungsdauer benötigt.
Obwohl die Erfindung detailliert und mit Bezug auf spezielle Ausführungsformen beschrieben wurde, ist es für den Fachmann offensichtlich, daß zahlreiche Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.

Claims

Topfballenmischung zur Aufzucht (Anzucht) von Sämlingen, die endosymbiotische, in der Endorhizosphäre mutualistisch koloniebildende Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescens FPT-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5478 und Pseudomonas sp. FPH-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5479, in einer Menge von jeweils nicht weniger als 10⁵ Koloniebildenden Einheiten (KBE)/g enthält.
Topfballenmischung zur Aufzucht von Sämlingen, die endosymbiotische, in der Endorhizosphäre mutualistisch koloniebildende Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescens FPT-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5478 und Pseudomonas sp. FPH-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5479, in einer Menge von jeweils nicht weniger als 10⁵ KBE/g und 1-[3-(4-Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon in einer Menge von nicht weniger als 10 ppm enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Topfballenmischung zur Aufzucht von Sämlingen, die das getrennte Animpfen verschiedener Topfballenmischungen mit endosymbiotischen, in der Endorhizosphäre mutualistisch koloniebildenden Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescens FPT-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5478 und Pseudomonas sp. FPH-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5479, anschließend deren Inkubation zur Erreichung einer Zelldichte von jeweils nicht weniger als 10⁵ KBE/g und danach das Mischen der resultierenden zwei Topfballenmischungen in einem derartigen Verhältnis umfaßt, daß die resultierende Mischung Zellen beider Stämme in einer Menge von jeweils 10⁵ KBE/g enthält.
Verfahren zur Herstellung einer Topfballenmischung, die das getrennte Animpfen verschiedener Topfballenmischungen mit endosymbiotischen, in der Endorhizosphäre mutualistisch koloniebildenden Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescens FPT-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5478 und Pseudomonas sp. FPH-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5479, anschließend deren Inkubation zur Erreichung einer Zelldichte von jeweils nicht weniger als 10⁵ KBE/g, danach das Mischen der resultierenden zwei Topfballenmischungen in einem derartigen Verhältnis, daß die resultierende Mischung die Zellen beider Stämme in einer Menge von jeweils 10⁵ KBE/g enthält, und die Zugabe von 1-[3-(4-Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon hierzu in einer Menge von nicht weniger als 10 ppm umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer Topfballenmischung zur Aufzucht von Sämlingen nach den Ansprüchen 3 oder 4, wobei das Animpfen der verschiedenen Topfballenmischungen mit den endosymbiotischen, in der Endorhizosphäre mutualistisch koloniebildenden Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescens FPT-9601 und Pseudomonas sp. FPH-9601, durch getrenntes Suspendieren der Zellen der zwei Stämme in verschiedenen wäßrigen Natriumalginatlösungen in einer Menge von jeweils nicht weniger als 10⁴ Zellen/ml, gefolgt von einer getrennten Zugabe der resultierenden Zellsuspensionen zu verschiedenen Topfballmischungen und deren Mischen, durchgeführt wird.
Verfahren zur Herstellung einer Topfballenmischung zur Aufzucht von Sämlingen nach Anspruch 3, 4 oder 5, wobei die Topfballenmischungen bei Temperaturen von nicht weniger als 100°C wärmebehandelt werden, bevor sie mit den Stämmen angeimpft werden.
Verfahren zur Aufzucht krankheitstoleranter (krankheitsresistenter) Sämlingen, umfassend die Aufzucht von Sämlingen in einer Topfballenmischung, die endosymbiotische, in der Endorhizosphäre mutualistisch koloniebildende Pseudomonaden, Pseudomonoas fluorescens FPT-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5478 und Pseudomonas sp. FPH-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5479, in einer Menge von jeweils nicht weniger als 10⁵ KBE/g enthält.
Verfahren zur Aufzucht krankheitstoleranter Sämlingen, umfassend die Aufzucht von Sämlingen in einer Topfballenmischung, die endosymbiotische, in der Endorhizosphäre mutualistisch koloniebildende Pseudomonaden, Pseudomonas fluorescens FPT-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5478 und Pseudomonas sp. FPH-9601 mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5479, in einer Menge von jeweils nicht weniger als 10⁵ KBE/g und 1-[3- (4-Hydroxyphenyl)propanyl]-2-piperidon in einer Menge von nicht weniger als 10 ppm enthält.
Verfahren zur Aufzucht krankheitstoleranter Sämlinge nach den Ansprüchen 7 oder 8, wobei die mit der Topfballenmischung aufzuzüchtenden Sämlinge ausgewählt sind aus Sämlingen von Kartoffeln, Paprika, Tomaten, Auberginen, Erdbeeren, Kohl oder Nelken.
Verfahren zur Aufzucht krankheitstoleranter Sämlinge nach den Ansprüchen 7 oder 8, wobei die krankheitstoleranten Sämlinge in Bezug auf Bakterienwelke, Fusariumwelke oder Mehltau bzw. Krautfäule tolerant sind.