DE69029739T2

DE69029739T2 - Antifungaler mikroorganismus

Info

Publication number: DE69029739T2
Application number: DE69029739T
Authority: DE
Inventors: Maria Fattori; Stefaan Horemans; Marc Lefebvre; Keith Powell; Annabel Renwick
Original assignee: Zeneca Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1989-10-17
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2010-10-17
Also published as: AU6614190A; MY107283A; PL166131B1; SK279149B6; RU2108038C1; JPH05501407A; FI102615B; GB8923407D0; PL166864B1; ATE147580T1; HU9201282D0; BG96249A; FI921722A; AU652132B2; EP0496791A1; FI921722A0; ZA908268B; CZ284515B6; CZ503590A3; EP0496791B1

Description

Die Erfindung betrifft einen antifungalen Mikroorganismus, und zwar insbesondere neue Stämme von Pseudomonas fluorescens, und deren Verwendung zum Schutz von Pflanzen gegen Pilzbefall.
Die Suche nach Mikroorganismen mit interessanten Eigenschaften, indem eine große Anzahl, typischerweise viele Tausende, von Isolaten aus dem Erdboden hinsichtlich der betreffenden Aktivität für die beabsichtigte Verwendung durchmustert werden, ist eine übliche mikrobiologische Praxis. Eine derartige Verwendung ist die Isolation von biologischen Schädlingsbekämpfungsmitteln (BCAs), die gegen ausgewählte Pflanzenpathogene wirksam sind. Diese BCAs bieten Alternativen oder Ergänzungen zu chemischen Mitteln zur Pathogenbekämpfung.
In der normalen Praxis werden Erdbodenproben von Feldstandorten entnommen, an denen das betreffende Pathogen unterdrückt zu werden scheint, weil dies darauf hindeuten kann, daß Mikroorganismen in der Erde selber die Pathogenität inhibieren können. Die Mikroorganismen werden dann im Laboratorium aus den individuellen Proben isoliert, indem sie von den Wurzen abgewaschen und auf Agar gezüchtet werden, und zwar bei einer oder zwei Temperaturen, die typischerweise die optimale Temperatur für das mikrobiologische Wachstum darstellen, gewöhnlich 25 bis 30ºC. Dann werden die Isolate am Anfang gegen eine Vielzahl von Pathogenen in Agar in einer Reihe von Petrischalen unter Anwendung des Doppelkulturverfahrens durchmustert. Hierbei handelt es sich um die erste Durchmusterung. Vielversprechende Isolate aus dieser Durchmusterung werden dann in einer Reihe von zweiten Durchmusterungen, bei denen Erdboden verwendet wird, genauer untersucht.
Nach unserer Erfahrung ist die traditionelle erste Durchmusterung weder genau noch ausreichend selektiv für Isolate, die schließlich durch die sich anschließenden Durchmusterungstests und Feldversuche kommen. Durch die traditionelle erste Durchmusterung kommt eine große Anzahl von Isolaten (typischerweise im Bereich von 20 %), die vielversprechend sind, wobei aber die meisten davon in den sich anschließenden Tests ausgeschieden werden. Außerdem wissen wir nun, daß die erste Durchmusterung, abgesehen davon, daß Isolate durchkommen, bei denen sich anschließend herausstellt, daß sie die nützliche Aktivität nicht haben, bei bestimmten Isolaten versagt, von denen wir nun wissen, daß sie sehr wohl durch die sich anschließenden Durchmusterungstests kommen. Das Ergebnis ist, daß durch diese traditionellen Tests Isolate kommen, die schlecht sind, und Isolate, bei denen es sich um gute Inhibitoren der Pathogenizität handelt, nicht durchkommen.
Es besteht daher eindeutig ein Bedarf für ein neues Verfahren zur Durchmusterung von Erdbodenisolaten, um eine hohe Zahl potentiell guter Isolate zu gewinnen und Materialien mit geringer Aktivität soweit wie möglich auszuscheiden.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Durchmusterung von potentiellen antifungalen Mitteln bereitgestellt, bei dem die inhibierende Wirkung des antifungalen Mittels in zwei Tests geprüft wird, und zwar in einem ersten Test hinsichtlich der Inhibition der Pathogenentwicklung in sterilisierter Erde, die mit dem Mycelium von Pythium- Spezies befallen ist, und in einem zweiten Test, wieder hinsichtlich der Inhibition der Krankheitsentwicklung in einer wachsenden Pflanze einer Spezies, die gegen die Erkrankung empfindlich ist und durch den Krankheitskomplex in Gegenwart des Komplexes infolge Pilzbefalls abstirbt, Mittel identifiziert werden, die im Vergleich mit der Kontrolle in beiden Tests einen potentiellen inhibierenden Effekt ergeben und diese der weiteren Untersuchung unterzogen werden.
Die Erfindung eignet sich besonders, aber nicht ausschließlich, zur Durchmusterung von Mikroorganismen aus Erdbodenproben auf potentielle BCAs, aber es gibt keinen inneren Grund dafür, warum das Verfahren der Erfindung ohne irgendeine Anpassung nicht auch für chemische Mittel angewendet werden sollte.
Wie bereits oben angedeutet, ist die traditionelle Art und Weise, auf die Mikroorganismen isoliert werden können, selber nicht selektiv. Die vorliegende Erfindung stellt somit ferner ein Verfahren zur Vordurchmusterung zur Isolierung von Mikroorganismen aus Erdproben bereit, wobei bei dem Verfahren in einen verschließbaren Behälter eine Schicht aus feuchtem sterilen Sand gegeben wird, die Erdprobe in feuchtem Zustand daraufgegeben wird und in die Erdprobe der Samen einer Pflanze eingesät wird, die gegen die betreffende Erkrankung anfällig ist, der Behälter verschlossen wird, der Behälter unter Umgebungsbedingungen aufbewahrt wird, welche die Entwicklung der Erkrankung fördern, der Samen keimen gelassen wird und dessen Wurzeln sich aus der Erdschicht in die Sandschicht erstrecken gelassen werden, die Röhre der Länge nach durch beide Schichten präpariert wird, nur aus der Sandschicht Wurzeln gewonnen werden und aus den gewonnenen Wurzeln Mikroorganismen isoliert werden.
Die chemischen oder mikrobiologischen Mittel, welche durch die zwei in dieser Erfindung beschriebenen Tests kommen, können dann hinsichtlich der Inhibition einer Pilzinfektion durchmustert werden, und zwar mit einem oder mehr als einem zusätzlichen Test, der unter folgenden ausgewählt ist:
(a) Infektion von Zuckerrüben durch Aphanomyces cochlioides bei einer Temperatur von 12 bis 15ºC,
(b) Infektion von Erbsen durch Pythium ultimum bei einer Temperatur von 12 bis 15ºC,
(c) Infektion von Erbsen durch Pythium ultimum bei einer Temperatur von 24 bis 27ºC,
(d) Infektion von Erbsen durch Rhizoctonia solani bei einer Temperatur von 24 bis 27ºC,
(e) Infektion von Weizen durch Fusarium culmorum bei einer Temperatur von 18 bis 21ºC,
(f) Infektion von Sojabohnen durch Phytophthora megasperma bei einer Temperatur von 20 bis 24ºC,
(g) Infektion von Kartoffelschnitzen durch Fusarium moniliforme bei einer Temperatur von 20 bis 24ºC,
(h) Infektion von Kartoffelschnitzen durch Fusarium sambusinum bei einer Temperatur von 20 bis 24ºC, und
(i) Infektion von Zuckerrüben durch Phoma-Spezies bei einer Temperatur von 15 bis 19ºC.
Wenn somit alle möglichen Bestandteile der Erfindung zusammengenommen werden, können potentielle BCAs nach einem Verfahren isoliert werden, das nur zur Gewinnung von wurzelaktiven Organismen ausgestaltet ist, in zwei anfänglichen Tests durchmustert werden, durch welche Organismen mit einem hohen Aktivitätspotential identifiziert werden, und welche dann in einer Reihe von strengen Tests durchmustert werden, durch welche Mittel identifiziert werden, die sich anschließend als sehr robust erweisen, wenn sie unter einer Vielzahl von Feldbedingungen geprüft werden. Dies stellt einen Hauptvorteil gegenüber den traditionellen Verfahren dar, welche, wie oben angegeben, dazu neigen, Organismen auszuscheiden, die durch die Tests dieser Erfindung kommen und eine sehr große Anzahl von Organismen durchkommen lassen, die sich in den Tests der vorliegenden Erfindung als größtenteils inaktiv oder weniger aktiv als die Kontrolle erweisen.
Die Erfindung umfaßt ein antifungales Mittel, das die gleiche oder eine bessere Inhibition von Pilzinfektionen als ein vergleichbares chemisches Mittel zeigt, was sich durch die oben erwähnten Durchmusterungstests der Erfindung ergibt.
Nach dem Verfahren der Erfindung wurden vier Mikroorganismen isoliert und beurteilt, und es zeigte sich, daß sie besonders wirksam gegen eine Vielzahl von Pilzerkrankungen sind, die generell mit dem Absterben infolge des Pilzebefalls verbunden sind, und somit umfaßt die Erfindung ferner antifungale Mittel, welche die Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas fluorescens aufweisen, deren Kulturen am 1. September 1989 nach dem Budapester Vertrag bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, United Kingdom unter den Zugangs-Nrn. 40186, 40187, 40188 und 40190 hinterlegt wurden.
Die Erfindung umfaßt ferner eine antifungale landwirtschaftliche Zusammensetzung, die als aktiven Bestandteil einen oder mehrere der Mikroorganismen im Gemisch mit einer Trägerzusammensetzung enthält, die für die landwirtschaftliche Praxis geeignet ist.
Beispiele für die landwirtschaftlichen Formulierungen, die verwendet werden können, sind Samen-Überzugszusammensetzungen, Flüssigkeiten zum Durchtränken von Wurzeln oder Erdboden und Körner- oder Pulverzusammensetzungen. Die Grundmaterialien für diese sind im Stand der Technik wohlbekannt.
Um ein Beispiel für die Effizienz der Durchmusterung nach der vorliegenden Erfindung zu geben, wurde ein traditionelles In-vitro-Verfahren zum Durchmustern von 7000 Isolaten angewendet, und es ergab sich eine "Durchlaß"-Rate von etwa 20 %, wohingegen nach dem Verfahren der Erfindung lediglich 4 bis 5 % der Isolate durchkamen. Ein wichtiger Punkt ist daher, daß die Ansammlungen der Organismen, welche durch jeden der zwei Minimumtests der Erfindung kamen, sehr ähnlich waren, wohingegen eine sehr unähnliche Ansammlung von Organismen durch die traditionelle Agar-Durchmusterung kommt. Einige der Organismen, die ausgeschieden worden wären, wenn man sich auf das traditionelle Durchmusterungsverfahren verlassen hätte, zeigten in sich anschließenden Durchmusterungstests und in Feldversuchen eine hohe Aktivität. Dies ist der Hauptvorteil der Erfindung: Die Anfangsdurchmusterung verringert die Gesamtanzahl an Organismen, die eine weitere Durchmusterung erforderlich machen, und ein hoher Anteil von solchen Organismen, für die eine weitere Durchmusterung angebracht ist, ergibt im Anschluß daran auf dem Feld die Aktivität, nach der gesucht wurde. Es wird angenommen, daß dies auf dem folgenden Grund beruht. Die Testparameter, beispielsweise die Temperatur und die Nährstoffzusammensetzung, des traditionellen Verfahrens sind so optimiert, daß das Wachstum der Mikroorganismen in Agar gefördert wird. Eine derartige Pflege ist jedoch weit entfernt von den rauhen Umweltbedingungen, unter denen die Mikroorganismen verwendet werden sollen. Daher sind viele der Mikroorganismen, welche diese anfängliche Durchmusterung überleben, generell schwach, und können nur in der geschlossenen Umgebung der Agarkultur überleben und scheiden daher anschließend aus, wenn die strengeren zweiten und weiteren Durchmusterungen beginnen, sich näher an die reale Umwelt auf dem Feld anzunähern. Andererseits wird es in einer Charge von Isolaten, und unsere Erfahrung deutet darauf hin, daß dies zutrifft, Mikroorganismenstämme geben, welche die Feldbedingungen bevorzugen, unter denen beispielsweise die Temperaturen niedrig sind oder die Nährstoffe weniger üppig vorliegen oder eine unterschiedliche Zusammensetzung haben. Derartige Mikroorganismen lassen sich in den Agartests nicht gut kultivieren und würden normalerweise ausgeschieden. Unsere Gewißheit ist, daß die zwei Durchmusterungen im Kern unserer Erfindung Testumgebungen darstellen, die den Feldbedingungen ähnlicher sind und so einen realistischeren Hinweis darauf geben, ob die Mikroorganismen in der Umgebung, in der sie verwendet werden sollen, gedeihen.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Inhibition einer Pilzerkrankung in einer Pflanze bereit, bei dem auf die Pflanze, auf deren Samen oder auf das Wachstumsmedium der Pflanze eine wirksame Dosis eines antifungalen Mittels der vorliegenden Erfindung aufgebracht wird.
Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren zum Schutz von Kulturpflanzen gegen Pilzinfektion bereit, bei dem auf die Pflanzen, die Wurzeln oder den Samen davon oder auf die Erde, welche die Pflanzen umgibt, eine fungicid wirksame Dosis eines oder mehrerer der Pseudomonas-fluorescens- Stämme aufgebracht wird.
Der Stamm NCIB 40187 wurde aus Weizenwurzeln isoliert, die aus Pflanzen gesammelt wurden, welche auf einem Feld der Farm Badbury 2, Draycott Farm, Chiseldon, Swindon, Wiltshire, Vereinigtes Königreich, wachsen.
Die Stämme NCIB 40186 und 40188 wurden aus der Erde isoliert, die von einem Feld mit der Bezeichnung Stockoy Field in Jodoigne in Belgien entnommen wurde.
Der Stamm NCIB 40190 wurde aus den Wurzeln von Weizenkeimlingen aus dem Lower Garston field, Rushall Farm, Newbury, U.K. isoliert.
Es folgt nun die Beschreibung der Isolation, Charakterisierung und Durchmusterung der Bakterienisolate auf Aktivität gegen verschiedene Pilze, die Kulturpflanzen infizieren. Es wurde eine sehr große Zahl von Mikroorganismen isoliert, indentifiziert und durchmustert, nämlich auf die im folgenden beschriebene Art und Weise, wobei die vier Stämme der vorliegenden Erfindung aufgrund ihrer herausragenden Leistung in den Durchmusterungstests ausgewählt wurden.

Isolation der Mikroorganismen

Aus Dialyseschlauch mit einer Länge von 35 cm und einer Weite von 5,5 cm wurde ein Schlauch hergestellt, der 5 bis 7 cm von einem Ende einen Knoten hatte. Feiner Sand wurde gewaschen und getrocknet und bis zu einer Höhe von 12 cm in den Schlauch eingegossen und mit 20 ml destilliertem Wasser feucht gemacht. Die Schläuche mit dem Sand wurden dann in Glasröhren (7 cm im Durchmesser, Länge 30 cm) als Träger gegeben. Dann wurden die Röhren am Boden mit Gummistopfen, die mit Aluminiumfolie bedeckt waren, verschlossen, und der obere Teil wurde mit einem Baumwollestopfen verschlossen und dann mit Aluminiumfolie umwickelt. Diese Anordnung wurde zweimal 60 min bei 121ºC autoklaviert.
Dann wurde eine Erdbodenprobe aus dem Zielerdboden entnommen und bei einer Feuchtigkeit von 40 % bei 4ºC gehalten, bis sie innerhalb von 2 Tagen nach der Sammlung verwendet wurde. Die Erdbodenprobe wurde durch ein Sieb mit 4 mm gesiebt und in die Schläuche gegeben, und zwar bis zu einer Höhe von 3 cm oberhalb des Sandes. Dann wurde Samen (Erbse, Weizen, Zuckerrübe, Sonnenblume, Mais oder Sojabohne) ausgesäht und mit dem Erdboden bis zu einer Gesamthöhe von 6 cm bedeckt. Dann wurden die Schläuche aufrecht in einen Drahtkorb gesetzt, der dann von einem Kunststoffbehälter umschlossen wurde, der Löcher aufwies, um den Luftaustausch zu gestatten und Verluste durch Verdampfen zu minimieren. Dann wurden die Körbe in eine Zuchtkammer gestellt und vier Wochen bei Temperaturen von 10ºC bis 24ºC und 70 % relativer Feuchtigkeit inkubiert, und zwar mit einem Zyklus von 16 h Tag/8 h Nacht.
Nach vierwöchiger Inkubation wurde der Kunststoffdialyseschlauch mit einem vorher sterilisierten Skalpell aufgeschnitten. Die Wurzeln jeder Pflanze wurden von dem Erdboden und dem Sand befreit, worauf die Pflanzen in einen weißen Kunststofftrog gegeben wurden. Die Kronen- und Spitzenregionen der Pflanzen wurde abgeschnitten und gesondert in sterilem Wasser gewaschen.
Die Schnittsektionen wurde in sterile Erlenmeyer-Kolben gegeben, die 20 ml deionisiertes Wasser und eine Lage Glasperlen enthielten. Dann wurden die Kolben auf einem Orbital-Inkubator mit 120 Upm 30 min geschüttelt. Unter Verwendung einer sauberen Lösung der Wurzel- und Wurzel- und Kronen-Waschungen aus den Kolben wurde eine 1:9 Verdünnung in steriler Ringer'scher Lösung auf eine Verdünnung von 10&supmin;³ hergestellt. Dann wurde ein Aliquot von 100 µl jeder Lösung auf die Oberfläche von drei Agarmedien mit den folgenden Zusammensetzungen ausgestrichen:

1/10 TRYPTON-SOYA-AGAR

Trypton-Sojabrühe 3,0 g
Bakteriologischer Agar 17,5 g
Deionisiertes Wasser 1000 ml
[Das Medium wurde 15 min bei 121ºC autoklaviert.]

WURZELEXTRAKT-AGAR

Frische Weizenwurzeln 10 g
Agar Nr. 3 17,5 g
Deionisiertes Wasser 1000 ml
[Die frischen Wurzeln wurden ausgewogen und mit einer kleinen Menge deionisiertem Wasser unter Verwendung eines Futtermischers vermischt. Die dicke Suspension wurden dann in einen Beutel aus vier Schichten kleinmaschigem Musselin gegeben, der dann in einem 2 l Becherglas in dem restlichen deionisierten Wasser suspendiert und 4 Tage bei 20ºC inkubiert wurde. Der Musselin-Beutel wurde dann entfernt, und der Agar wurde zu dem Wurzelextrakt gegeben. Dann wurde das Medium 15 min bei 121ºC autoklaviert.]

ERDBODENEXTRAKT-AGAR

Erdbodenprobe 10 g
Agar Nr. 3 17,5 g
Deionisiertes Wasser 1000 ml
[Der Erdboden wurde ausgewogen und in einem 2 l Becherglas in das deionisierte Wasser gegeben. Dann wurde die Erdbodensuspension bedeckt und 4 Tage bei 20ºC inkubiert, woraufhin sie durch eine vierfache Schicht aus kleinmaschigem Musselin drainiert wurde. Dann wurde der Agar dazugegeben, und das Medium wurde 15 min bei 121ºC autoklaviert.]
Für jede Verdünnung gab es drei Wiederholungen. Die Agarplatten wurden bei 12ºC bis zu fünf Tage inkubiert, und im Anschluß daran wurde die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte ausgezählt und aufgezeichnet. Sofern möglich, wurde von jeder Pflanze, Nische und Agarkombination, die 50 oder weniger Kolonien enthielt, eine Platte ausgewählt. Wenn dies nicht möglich war, wurde ein Gitter aus 50 Schnitten auf der Platte gezogen und es wurden die Kolonien genommen, die sich auf oder am nächsten zu den jeweiligen Schnitten befanden. Diese Auswahl der Kolonien war daher völlig zufällig.
Die individuellen Kolonien wurden unter Verwendung einer sterilen Schleife von den Platten entnommen und auf Petrischalen mit einem Durchmesser von 5 cm subkultiviert, die 1/10 Trypton-Soja-Agar (1/10 TSA) enthielten. Die Platten wurden dann 5 Tage bei 12ºC inkubiert. Die Isolate wurden anschließend auf die Reinheit überprüft. Wenn eine gemischte Kultur vorlag, wurde das Isolat zum Erhalt von Einzelkolonien auf 1/10 TSA-Schrägkulturen ausgestrichen. Dann wurde eine Kolonie ausgewählt und auf 1/10 TSA subkultiviert. Die Kultursammlung wurde bei 4ºC aufbewahrt.

CHARAKTERISIERUNG DER MIKROORGANISMEN

Morphologie

Die Mikroorganismen hatten die folgenden morphologischen Charakteristiken:
Zell-Morphologie:
Gram-negative Stäbchen
Kolonien-Morphologie:
NCIB 40186: Gebrochenweiß, rund, regulär, vollständig, gering konvex, glatt, glänzend, halbdurchsichtig, 1,5 bis 2 mm im Durchmesser.
NCIB 40187: Gebrochenweiß, rund, regulär, vollständig, erhöht, glatt, glänzend, halbdurchsichtig, 1 mm Durchmesser.
NCIB 40188: Gebrochenweiß, rund, regulär, vollständig, gering konvex, glatt, glänzend, halbdurchsichtig, 1,5 bis 2 mm Durchmesser.
NCIB 40190: Gebrochenweiß, rund, regulär, vollständig, flach, glatt, glänzend, halbdurchsichtig, 1 mm Durchmesser.
Züchtungstemperatur:
Alle Stämme 37ºC +ve
41ºC -ve
45ºC -ve
Fluoreszenz: Alle Stämme +ve
Catalase: Alle Stämme +ve
Oxidase: Alle Stämme +ve
Fermentation:
in Glucose OF Alle Stämme -ve RAPID-TEST (API)

ERSTE DURCHMUSTERUNG

Erdboden-Petrischalen-Durchmusterung

Petrischalen (5 cm) wurden mit 10 ml Kartoffeldextroseagar (PDA) gefüllt. Dann wurden Agarpfropfen (5 mm) von 7 Tage alten Kulturen von Pythium ultimum, die bei 20ºC gezüchtet worden waren, zentral auf das PDA gegeben. Die Platten wurden 5 Tage bei 20ºC inkubiert, wobei während dieser Zeit P. ultimum auf der Platte kolonisierte.
Minster Mendip-Lehm wurde 60 min bei 120ºC autoklaviert. Dann wurden dazu Weizenkeimlinge gegeben (1 % G/G) und gut durchmischt. Etwa 8 g Erde wurden in jede Petrischale gegeben, um den Pythium-Rasen zu bedecken.
Die Testbakterien wurden in 1/10 TSB oder auf 1/10 TSA- Platten bei 12ºC 48 h gezüchtet.
Zu jeder Petrischale wurden 2 ml der Kultur gegeben. Es wurden Doppelplatten angefertigt.
Behandlungen: 1/10 TSB alleine
Metalaxyl (100 ppm)
Testorganismus
1/10 TSB zu Erde auf PDA gegeben
nicht mit Pythium inokuliert
Die Platten wurden 4 Tage bei 10ºC inkubiert.
Die Aktivität, die auf einer Skala von 1 bis 3 bewertet wurde, wurde auf der Grundlage der vollständigen Inhibition des Pilzwachstums in dem Erdboden ausgewählt.

FUSARIUM-KARTOFFEL-DURCHMUSTERUNG

Eine sterile Filterpapierscheibe (Durchmesser 9 cm) wurde mit Wasser gründlich durchfeuchtet und auf den Boden einer sterilen Petrischale gelegt. Für jede Behandlung wurden zwei Platten präpariert.
Die Fusarium-Kulturen (Fusarium sambusinum, Fusarium culmorum und Fusarium moniliforme) wurden auf Kartoffeldextroseagar 14 Tage bei 20ºC im Licht gezüchtet, um Conidien zu bilden. Die Conidien wurden dann in steriler Kochsalzlösung (0,85 %) suspendiert und mit einem Spektrophotometer auf eine Transmission von 20 % bei 420 nm eingestellt.
Eine halbe Schleife der 24 h bei 20ºC auf Nähragar (Oxoid) gezüchteten Bakterien wurde in 2,5 ml steriler Kochsalzlösung suspendiert. Als Kontrolle wurde Captan mit einer Konzentration von 2,0 g/l hergestellt. Kochsalzlösung alleine wurde ebenfalls als Kontrolle verwendet.
Die Fusarium-Suspension (50 µl) wurde in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen gegeben, und zwar ein Röhrchen pro Behandlung.
Ein Kartoffelschnitz mit weniger als 10 mm Dicke, durch den vier Vertiefungen unter Verwendung eines Korkbohrers mit einem Durchmesser von 10 mm geschnitten worden waren, wurde in jede Petrischale gegeben. Die Oberfläche des Kartoffelschnitzes wurde mit Ethanol sterilisiert und mit sterilem Filterpapier getrocknet. Die Schnitze wurden innerhalb von 30 min nach dem Schneiden verwendet (oder innerhalb von 60 min, wenn sie bei 4ºC gehalten wurden).
Eine 50 µl Probe der Suspension der Fusarium-Sporen (10&sup6; Conidien/ml) wurde in drei der vier Vertiefungen eines Kartoffelschnitzes gegeben. Eine Probe der Bakteriensuspension (50 µl, etwa 10&sup8; Zellen pro ml) wurde mit der Fusarium-Suspension in einer der drei Vertiefungen gemischt, und Benomyl in einer Konzentration von 100 ppm in einer weiteren, wobei eine dritte Vertiefung als nichtinokulierte Kontrolle diente.
Die Petrischalen wurden mit ihren Deckeln verschlossen und 3 Tage bei 20ºC inkubiert.
Der Anteil an erkranktem Gewebe wurde anhand einer subjektiven Skala von 0 bis 3 bestimmt.

DURCHMUSTERUNG GEGEN PHOMA BETAE

Zuckerrübenstücke, 2,5 x 2,5 x 1,5 mm, wurden aus dem Inneren der Wurzel ausgeschnitten und mit etwa 13 ml sterilem Wasser in einem Kunststoffbehälter befeuchtet.
Eine Probe einer Phoma-betae-Kultur wurde mit oder ohne eine Probe des putativ antifungalen Mikroorganismus auf die Oberfläche gegossen, woraufhin die Stücke drei Wochen inkubiert wurden.
Am Ende der Inkubationsperiode wurden die Rübenstücke hinsichtlich der Fäulnis beurteilt.

ZUCKERRÜBE/ERDBODEN-DURCHMUSTERUNG

Natürlicher Erdboden, von dem bekannt war, daß er das Absterben aufgrund Pilzbefalls von Zuckerrüben verursacht, wurde auf eine Feuchtigkeit von 45 % gebracht. Nackte Zuckerrübensamen und Samen, die mit den Testbakterien überzogen waren, wurden in den Erdboden eingesät. Die Proben wurden dann 10 Tage mit einer 12stündigen Tageslichtbeleuchtung bei 15ºC inkubiert. Die antifungale Wirksamkeit der Bakterien wurde auf der Grundlage der Anzahl Sämlinge beurteilt, die aufliefen, und zwar im Vergleich mit der chemischen Bekämpfung durch Tachigaren/TMTD.

ZWEITE DURCHMUSTERUNG

Um die Wirksamkeit der ausgewählten Mikroorganismen zu untersuchen, wurden zwei Durchmusterungen angewendet: Pythium ultimum und Rhizoctonia solani.
Kulturen von P. ultimum und R. solani wurden auf PDA- Platten 7 Tage bei 20ºC gezüchtet.
Ein Gemisch aus 200 g Silbersalz, 5 g Maismehl, 4 g, Beemax-Weizenkeime und 40 ml Wasser wurde 20 min bei 120ºC autoklaviert und dann in einen Kolben gegeben und mit 1/4 einer Platte Pythium inokuliert. Für Rhizoctonia wurde das gleiche Substrat verwendet, allerdings ohne das Maismehl.
Die Kolben wurden 7 Tage bei 20ºC inkubiert.

Verdünnungsreihe

Der Inhalt jedes Kolbes mit Pythium ultimum wurde mit feinem Sand auf ein Endgewicht von 300 g vermischt.
Ein Kolben mit Pythium in 8 l Mendip-Minster-Lehm = 2 Normal (2 N).
Dies wird mit sauberem Mendip-Lehm auf weitere Verdünnungen verdünnt, die erforderlich sind. Die Isolate wurden normalerweise gegen Pythium durchmustert, und zwar mit N/8 und N/32 bei 12 - 15ºC.
3/4 Kolben Rhizoctonia-solani-Inokulum in 6 l Mendip- Minster-Lehm = Normal.
Bei der Durchmusterung wurden Konzentrationen von N/4 und N/16 verwendet.
Der Versuch wurde in Töpfen mit 3 Zoll durchgeführt, wobei die Töpfe zu 3/4 mit infizierter Erde gefüllt wurden. In jeden Topf wurden 5 Erbsen gesät und mit sauberer Erde bedeckt. Dann wurden 35 ml Wasser oder Bakteriensuspension als Beize in jeden Topf gegeben. Für jede Behandlung wurden 5 Replikatöpfe hergestellt. Bei den BCA-Durchmusterungen wurden die Bakterien bei 20ºC in 1/10 TSB 48 h gezüchtet. Die gesamte Suspension (35 ml) wurde zu den Töpfen gegeben. Die Kontrollen waren normalerweise 1/10 TSB und chemisch. Zu den Rhizoctonia-Durchmusterungen wurde als Beize Pencycuron in Konzentrationen von 10, 100 oder 200 ppm gegeben und zu den Pythium-Durchmusterungen Metalaxyl mit 100 ppm.
Hinsichtlich des Tests auf R. solani wurden die Pflanzen 7 bis 14 Tage bei 20 - 25ºC gezüchtet und hinsichtlich Pythium 14 Tage bei 12 bis 15ºC. Das Auflaufen der Sämlinge wurden wöchentlich beobachtet. Die Pflanzen wurden täglich gewässert. Es wurde besonders sorgfältig darauf geachtet, daß sichergestellt war, daß der Erdboden während der Versuche feucht war, weil beide Erkrankungen das Absterben durch Pilzbefall hervorrufen.

DURCHMUSTERUNG GEGEN PHYTOPHTHORA MEGASPERMA

Ein Pfropfen mit einem Durchmesser von 5 mm, der aus einer Plattenkultur von P. megasperma entnommen worden war, wurde auf einer Platte mit einem Durchmesser von 9 cm 13 Tage bei 25ºC auf V-8-Medium kultiviert. V-8-Medium hat die folgende Zusammensetzung:
V-8 Campbell-Saft 180 ml
CaCO&sub3; 2,7 g
Destilliertes Wasser 720 ml
Difco-Agar 13,5 g
[Die Bestandteile, mit Ausnahme des Agars, wurden gemischt und 30 min auf Dampfhitze erhitzt, filtriert, auf pH 7,2 eingestellt und mit dem Agar versetzt, worauf das Medium 20 min bei 120ºC sterilisiert wurde.]
Feuchte Hirse (50 g plus 20 ml destilliertes Wasser) wurde bei 110ºC zweimal 45 min lang sterilisiert. Dann wurde eine 1/4 P.-megasperma-Platte umgekehrt auf die Oberfläche der Hirse gestellt und in der Dunkelheit bei 25ºC 28 Tage lang inkubiert.
Die mit P. megasperma infizierte Hirse (die 22,5 g wog) wurde gründlich mit sterilisierter Erde (1477,5 g) und Wasser (112,5 g) in einem Mischer durchmischt. Bei dem verwendeten Erdboden handelte es sich um ein 1:1:1 V/V Gemisch aus Silbersand, Felderde mit pH 7 und Moos-Torf, das eine Stunde bei 100ºC sterilisiert worden war.
Eine Menge von 500 g des infizierten Hirse/Erdbodengemisches wurde in Leonard-Flaschen eingewogen, die dann mit Kunststoffverschlußplatten bedeckt wurden, wenn dies erforderlich war. Das untere Wasserreservoir der Leonardflaschen wurde mit 100 ml destilliertem Wasser gefüllt.
In die Oberfläche des Hirse/Erdbodengemisches wurden 4 Pflanzlöcher gemacht und in jedes davon wurde eine Sojabohne (c.v. Azzurra) eingesät und mit dem umgebenden Gemisch bedeckt.
Kulturen der Testorganismen wurden auf Nähragarplatten hergestellt, 24 h bei 28ºC kultiviert und in 250 ml NB- Flaschen (150 ml NB) bei 28ºC 24 h lang kultiviert. Eine Probe zu 75 ml der Kultur wurde 5 min bei 20ºC mit 8000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, es wurde eine weitere Probe zu 75 ml dazugegeben und rezentrifugiert, und der Überstand wurde wiederum verworfen. Das in den Zentrifugenröhrchen verbleibende Pellet wurde wiederholt mit 5 ml Mengen Kochsalzlösung (9,2 g/l) gewaschen. Schließlich wurde das Pellet zu einer Suspension in 150 ml Kochsalzlösung dispergiert.
In jede der Leonardflaschen wurden mit Hilfe einer 60 ml Spritze eine Injektion zu 30 ml der Kochsalzsuspension gegeben.
Zum Vergleich mit chemischen Mitteln wurden 30 ml Proben einer Lösung von 285,5 g Metalaxyl, 35 %, (Warenzeichen APRON) in 500 ml destilliertem Wasser in die als Kontrolle dienenden Leonardflaschen injiziert.
Außerdem wurden uninfizierte Kontrollen hergestellt, indem Proben uninfizierten Hirse/Erdbodengemisches verwendet wurden.
Die Samen wurden dann in einer Zuchtkammer bei 20 ± 2ºC unter einer Beleuchtung von 15 - 17 000 Lux gezüchtet. Die Beurteilung beruhte auf dem prozentualen Auflaufen im Vergleich mit der chemischen Bekämpfung.

FUSARIUM CULMORUM-DURCHMUSTERUNG

Eine Kultur von Fusarium culmorum wurde in PDA bei 20ºC 10 Tage lang gezüchtet, um die Bildung von Conidien zu gestatten. Die Conidien wurden gesammelt und auf einen Konzentrationsbereich von 10&sup4; bis 10&sup8; Conidien pro ml ausgezählt. Von dieser Stammlösung wurden 5 ml zu 100 g Weizensamen in einer Flasche gegeben, die dann über Nacht bei 10ºC gedreht wurde.
Eine Probe des infizierten Samens wurde in einem Gemisch aus dem Testbakterium und Silbersand 60 Minuten vor dem Einsäen eingeweicht, um einen Überzug aus etwa 10&sup6; Zellen pro Samen aufzubringen. Eine zweite Probe wurde mit Benomyl (100 ppm) zur chemischen Bekämpfung behandelt.
100 Samen wurden in einer Tiefe von 2 cm in einer Aussaatkiste in auf Torf basierendem Kompost ausgesät. Der Kompost wurde zu Beginn des Versuchs gewässert und zwei Wochen bei 20ºC aufbewahrt und am 5. Tag nach der Aussaat wieder bewässert. Nach dieser anfänglichen Bewässerung des Komposts, um die Keimung der Samen zu bewirken, wurde der Kompost trocknen gelassen, um die Entwicklung der Erkrankung zu bewirken.
Die Sämlinge wurden auf den Beginn und die Entwicklung der Krankheit untersucht. Die Erkrankungssymptome wurden auf einer Skala von 0 (ohne Smptome) bis 4 (schwer erkrankt) beurteilt.

ERGEBNISSE

Mit den oben beschriebenen Tests wurden 7000 Erdbodenbakterienisolate durchmustert. Tabelle 1, die im folgenden angegeben ist, faßt die Ergebnisse dieser Tests zusammen. Die Zahlen in den Spalten beziehen sich auf eine Skala von 0 (keine antifungale Wirkung) bis 3 (keine erkennbaren Erkrankungssymptome). Die Tabelle enthält auch ein Vergleichsbeispiel eines typischen unwirksamen Bakterienstamms, der mit 53/87 bezeichnet ist. Tabelle 1

FELDVERSUCHSDATEN 1989

Die Stämme, die bei der ersten und der zweiten Durchmusterung am vielversprechendsten waren, wurden für Feldversuche als biologische Bekämpfungsmittel gegen das Absterben durch Pilzbefall von Erbsen und Zuckerrüben ausgewählt.
Figur 1 veranschaulicht die mit dem Stamm NCIB 40186 gegen das Absterben von Erbsen durch Pilzbefall erhaltenen Ergebnisse. Dieser Versuch wurde im U.K. durchgeführt. Die mit diesem Stamm erhaltene Bekämpfung betrug etwa 80 % der durch chemische Behandlung mit Metalaxyl (APRON, Warenzeichen) erzielten Bekämpfung. Der Stamm NCIB 40187 war in diesem Versuch weitestgehend unwirksam.
Die Figuren 2 und 3 zeigen die Ergebnisse von Feldversuchen mit Zuckerrüben unter Verwendung der Stämme NCIB 40186 und 40190. Diese Versuche wurden in Belgien durchgeführt. Es wurden sechs Feldorte ausgewählt. Drei Orte (1,3 und 6) wurden im März mit Zuckerrüben besät und die übrigen drei Orte wurden im Mai besät. Figur 2 zeigt die Ergebnisse der ersten Zählung, die drei Wochen nach dem Besäen vorgenommen wurde, und Figur 3 zeigt die Ergebnisse 6 bis 8 Wochen nach der Aussaat.
Zusammengefaßt zeigen diese Ergebnisse, daß das Absterben von Erbsen durch Pilzbefall, das durch Pythium ultimum verursacht wird, durch die Aufbringung des Stamms NCIB 40186 verringert wird, und zwar auf ein Ausmaß, das mit dem durch chemische Behandlung mit Metalaxyl erhaltenen vergleichbar ist. Die Zuckerrübenergebnisse zeigen, daß unter Anwendung der Stämme NCIB 40186 und 40190 im Vergleich mit unbehandelten Kontrollen an allen sechs Orten die Entwicklung der Keimlinge verbessert wurde. An drei Orten war die Entwicklung der Keimlinge in Gegenwart der Stämme vergleichbar mit der mit Metalaxyl erzielten.

FELDVERSUCHSDATEN 1990

1990 wurden mit den Mikroorganismen NCIB 40186 und 40190 Feldversuche durchgeführt, und zwar, um ihr Vermögen, Pythium-Spezies zu inhibieren, zu untersuchen. Die Versuche wurden in den Vereinigten Staaten von Amerika, Belgien und Frankreich durchgeführt, und die Ergebnisse sind im folgenden angegeben. Für die Versuchszwecke wurden die Mikroorganismen als Sameneinweichbrühe aufgebracht, woraufhin in Sand getrocknet wurde, nämlich bei den Studien in Europa, und in Form einer Gummi-Torf-Formulierung für die USA. Weitere Versuche laufen in anderen Teilen der Welt, in denen das Absterben durch Pilzbefall endemisch ist, beispielsweise bei Gemüsekulturpflanzen in Malaysia. Obwohl die Ergebnisse der weltweiten Versuche hier nicht angegeben werden können, und zwar einfach deshalb, weil diese Versuche bisher noch nicht abgeschlossen sind, und, was klar ist, nicht beschleunigt werden können, nämlich aufgrund der Grenzen, die landwirtschaftlichen Prozeduren durch die Jahreszeiten gesetzt werden, sind die Anfangsergebnisse unserer Prüfer vorteilhaft und diese besonderen Mikroorganismen haben daher zumindest ein großes Potential als kommerzielle biologische Schädlingsbekämpfungsmittel. Die weitere Untersuchung der hier erwähnten anderen Mikroorganismen wird im Laboratorium und im Zuchtraum gemäß der üblichen Praxis hinsichtlich der Wirksamkeit und Sicherheit für sowohl den Menschen als auch die Umwelt fortgesetzt. Die derzeit verfügbaren Ergebnisse bestätigen das früher festgestellte Potential, über das hier berichtet wird.
Die Stämme NCIB 40186 und 40190 wurden gegen das Absterben durch Pilzbefall von Zuckerrüben in Versuchen mit neun Parzellen in Belgien und Frankreich untersucht. Während des Aussäens im frühen Frühling war die Witterung sehr warm und trocken, was zu Problemen hinsichtlich der Krankheitsentwicklung, nämlich Absterben durch Pilzbefall, bei den Zuckerrüben führte. In jeder der Testparzellen wurden insgesamt 200 Samen eingesät. Bisher sind die Ergebnisse von neun der Versuche verfügbar.

BELGISCHE UND FRANZÖSISCHE VERSUCHE 1990

Testkulturpflanze: Zuckerrübe
Chemisches Bekämpfungsmittel: Tachigaren/TMTD
* = LSD mit 5 % Wahrscheinlichkeit

FRANZÖSISCHE VERSUCHE 1990

Testkulturpflanzen: Erbsen
Chemische Bekämpfung: Wie im folgenden angegeben
Die Anzahl der Pflanzen bezieht sich auf die mittlere Anzahl von Pflanzen, die auf einem Streifen mit einer Länge von 5 m 22 Tage nach der Behandlung aufliefen.
Die Spalte 2 in den Tabellen gibt die Anzahl Pflanzen an, die von 200 Samen 22 Tage nach dem Aussäen aufliefen. Die Buchstaben, die nach den Zahlen angegeben sind, geben die statistische Signifikanz an. Auf dem 5 % Wahrscheinlichkeitsniveau gibt es keinen signifikanten Unterschied zwischen Eintragungen mit einem gemeinsamen Buchstaben.

BEKÄMPFUNGSBEHANDLUNGEN

Mit normaler Felderde durchgeführte Versuche, ohne ein zugegebenes Pathogen.

TESTBEHANDLUNGEN

Das Pathogen (Pythium) wurde in einer Menge von 200 g/m Pflanzreihe dazugegeben.

CALIFORNISCHE (USA) VERSUCHE 1990

Testkulturpflanze: Erbsen
Testpathogen: Pythium mit 30 g/m Pflanzreihe

MISSISSIPPI (USA) VERSUCHE 1990

Testkulturpflanze: Mais
Testpathogen: Fusarium (i) mit 10 g/m Pflanzreihe
(ii) mit 30 g/m Pflanzreihe
Das Auflaufen wurde in % 15 Tage nach dem Aussäen notiert.

Claims

1. Verfahren zur Durchmusterung nach einem putativ antifungalen Mittel, wobei die Verbesserung umfaßt, daß die inhibierende Wirkung des Mittels gegen den Pilzbefall in zwei Tests beurteilt wird, wobei bei dem ersten Test ein Mycelium eines Pathogens der Pythium- Spezies in einer Schicht Kulturmedium hergestellt wird, eine Schicht steriler Erde auf die Kulturschicht gegeben wird, ein Aliquot eines putativ antifungalen Mittels zu der Erdschicht gegeben wird, die Testeinheit inkubiert und die inhibierende Wirkung des antifungalen Mittels auf das Wachstum des Pathogens beurteilt wird, und im zweiten Test eine Erdprobe mit einem pathogenen Pilz inokuliert und in die von dem Pilz befallene Erde der Samen einer Pflanze eingesät wird, die durch den Pilz infiziert werden kann, ein Aliquot eines putativ antifugalen Mittels zu der Erde gegeben wird, der Samen keimen und eine Pflanze daraus wachsen gelassen wird, und die inhibierende Wirkung des antifungalen Mittels im Hinblick auf die Pflanzengesundheit mit einer uninfizierten Kontrolle verglichen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die gegen Pilzinfektion anfällige Pflanze die Zuckerrübe ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das putativ antifungale Mittel ein Mikroorganismus ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus ein die Wurzeln kolonisierender Mikroorganismus ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der die Wurzeln kolonisierende Mikroorganismus nach einem Verfahren aus einer Erdprobe isoliert wird, bei dem in einen verschließbaren Behälter eine Schicht feuchter steriler Sand gegeben wird, eine Schicht der Erdprobe in feuchtem Zustand darauf gegeben wird, und in die Erdprobe der Samen einer Pflanze gesät wird, die gegen die Pilzinfektion anfällig ist, der Behälter verschlossen wird, der Behälter unter Umgebungsbedingungen gehalten wird, welche die Krankheitsentwicklung fördern, der Samen keimen gelassen wird und dessen Wurzeln sich durch die Erdschicht in die Sandschicht erstrecken gelassen werden, der Behälter der Länge nach durch beide Schichten präpariert wird, nur aus der Sandschicht die Wurzeln gewonnen werden und von den gewonnenen Wurzeln die Mikroorganismen isoliert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Mittel, das in beiden Tests die Krankheit inhibiert, außerdem hinsichtlich der Inhibition der Pilzinfektion durchmustert wird, und zwar durch Wiederholung der zwei Tests und Durchführung mindestens eines weiteren Tests, der unter folgenden ausgewählt ist:

(a) Infektion von Zuckerrüben durch Aphanomyces cochlioides bei einer Temperatur von 12 bis 15ºC,

(b) Infektion von Erbsen durch Pythium ultimum bei einer Temperatur von 12 bis 15ºC,

(c) Infektion von Erbsen durch Pythium ultimum bei einer Temperatur von 24 bis 27ºC,

(d) Infektion von Erbsen durch Rhizoctonia solani bei einer Temperatur von 24 bis 27ºC,

(e) Infektion von Weizen durch Fusarium culmorum bei einer Temperatur von 18 bis 21ºC,

(f) Infektion von Sojabohnen durch Phytophthora megasperma bei einer Temperatur von 20 bis 24ºC,

(g) Infektion von Kartoffelschnitzen durch Fusarium moniliforme bei einer Temperatur von 20 bis 24ºC,

(h) Infektion von Kartoffelschnitzen durch Fusarium sambusinum bei einer Temperatur von 20 bis 24ºC, und

(i) Infektion von Zuckerrüben durch Phoma-Spezies bei einer Temperatur von 15 bis 19ºC.

7. Antifungales Mittel, das Pseudomonas fluorescens aufweist, der bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited unter der Zugangs-Nr. 40186 hinterlegt ist.

8. Antifungales Mittel, das Pseudomonas fluorescens aufweist, der bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited unter der Zugangs-Nr. 40187 hinterlegt ist.

9. Antifungales Mittel, das Pseudomonas fluorescens aufweist, der bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited unter der Zugangs-Nr. 40188 hinterlegt ist.

10. Antifungales Mittel, das Pseudomonas fluorescens aufweist, der bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited unter der Zugangs-Nr. 40190 hinterlegt ist.

11. Antifungale landwirtschaftliche Zusammensetzung, die als wirksamen Inhaltsstoff ein nach einem der Ansprüche 7 bis 10 beanspruchtes antifungales Mittel im Gemisch mit einer Trägerzusammensetzung, die in der landwirtschaftlichen Praxis geeignet ist, enthält.

12. Verfahren zur Inhibition des Pilzbefalls einer Pflanze, bei dem eine wirksame Dosis eines in einem der Ansprüche 7 bis 10 beanspruchten antifungalen Mittels auf den Standort der Pflanze aufgebracht wird.