DE69712937T2

DE69712937T2 - Verfahren zur Bestimmung einer Kalibrierungskurve und Analyseverfahren und diesen Verfahren verwendendes Gerät.

Info

Publication number: DE69712937T2
Application number: DE69712937T
Authority: DE
Inventors: Kikuo Hirai; Yoshihiko Makino
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 1996-01-09
Filing date: 1997-01-09
Publication date: 2003-03-20
Anticipated expiration: 2017-01-10
Also published as: EP0790500A3; DE69712937D1; JP3645023B2; JPH09189695A; US5948368A; US5795791A; EP0790500A2; EP0790500B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer Kalibrierungskurve sowie ein Analyseverfahren und eine Vorrichtung, welche diese Kalibrierungskurve verwenden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Regressionsfonktion einer Kalibrierungskurve zur quantitativen Analyse eines Analyts, wobei die Genauigkeit in allen Konzentrationsbereichen groß ist, wenn eine s-förmige Kalibrierungskurve verwendet wird.

Stand der Technik

Bei der herkömmlichen quantitativen Analyse eines Analyts in einer flüssigen Probe wird die Konzentration des Analyts in einer Testprobe anhand eines analytisch gemessenen Werts (Absorptionsfähigkeit, Transmission oder Reflexion der optischen Dichte, einer anderen physikalischen Messgröße oder eines Signals, das eine solche physikalische Messgröße anzeigt) bestimmt, nachdem er einer geeigneten chemischen oder enzymatischen Reaktion ausgesetzt wurde. Bei einem solchen Verfahren wird üblicherweise die Konzentration des Analyts anhand einer Kalibrierungskurve (häufig auch als Standardkurve oder Arbeitskurve bezeichnet) bestimmt, welche zuvor durch Auftragen der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen des Analyts in den Standardproben und den analytisch gemessenen Werten, wie der optischen Dichte der Standardproben, erstellt wurde. Besitzt die Kalibrierungskurve in der Region der quantitativen Analyse über einen großen Bereich eine angemessene Linearität, kann die Kalibrierungskurve mit einer relativ geringen Anzahl Standardproben erstellt werden, die sich nahe des oberen Grenzwertes, des unteren Grenzwertes und in der Mitte des Bestimmungsbereichs der quantitativen Analyse befinden.
In der Praxis jedoch gibt es viele Kalibrierungskurven, die im allgemeinen nicht linear sind. Beispiele solcher Kalibrierungskurven umfassen die von immunologischen Reaktionen, wie einem Enzymimmunoassay (EIA). In dem Immunoassay ist die Antigen- Antikörper-Reaktion, die Grundlage der Messung ist, nach dem Massenwirkungsgesetz im wesentlichen reversibel; die Kalibrierungskurve neigt daher zu einer S-Form, Diesen s-förmige Typ Kalibrierungskurve findet man auch bei einem Enzymreaktionssystem, bei dem die Bindungskonstante zwischen dem Enzym und dem Substrat aufgrund der Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes variiert, sowie bei einem allosterischen Enzymreaktionssystem mit einer regulatorischen Funktion, wie einer Endprodukt-Inhibierung. Ferner verändert sich die Form der Kalibrierungskurve in dem Enzymimmunoassay leicht in Abhängigkeit vom Typ des Mess-Systems und der Reaktionsbedingung. Zudem, da der Enzymimmunoassay das Ultramikroanalyseverfahren für Mikrosubstanzen ist, sind die Messdaten relativ weit zerstreut. In dem Enzymimmunoassay muss man daher eine große Anzahl Standardproben, die den gesamten Bestimmungsbereich der quantitativen Analyse abdecken, herstellen und analysieren, um eine Kalibrierungskurve zu erstellen.
Auf dem Gebiet der klinischen Untersuchungen, wo Schnelligkeit, Wirtschaftlichkeit und Einfachheit erforderlich sind, besteht ein Bedarf eine Kalibrierungskurve mit hoher Genauigkeit aus möglichst wenigen Standardproben zu erstellen. Bislang wurde daher versucht eine Kalibrierungskurve dadurch zu erstellen, indem man eine Regressionsformel aufstellt, mit der man die Kalibrierungskurve aus den Messwerten einer kleinen Anzahl Standardproben erstellen kann.
Das Regressionsmodell einer Kalibrierungskurve kann grundsätzlich in zwei Typen geteilt werden: dem Typ der theoretischen Formel und dem der empirischen Formel. Da eine theoretische Formel selten auf praktische Fälle anwendbar ist und es aufgrund einer komplizierten nicht-linearen Funktion höheren Grades schwierig ist sie statistisch auszuwerten, wird häufig eine empirische Formel, die auf einer tatsächlichen Messung beruht, verwendet. Empirische Formeln können auch grundsätzlich in zwei Typen klassifiziert werden. Die eine beruht auf einem Versuch mit einer nicht-geteilten Darstellung, worin eine einzige Regressionskurve die gesamte Kalibrierungskurve abdeckt. Die andere beruht auf einem Versuch mit einer geteilten Darstellung, worin die Kalibrierungskurve in einer Anzahl Regressionsgleichungen aufgeteilt ist, die für jeden Teilbereich berechnet werden.
Versuche mit geteilter Darstellung umfassen: ein lineares Interpolationsverfahren, wobei die Interpolation auf Grundlage linearer Abschnitte erstellt wird, die man durch Verbinden von zwei benachbarten Punkten auf einer Kalibrierungskurve durch eine gerade Linie erhält; und ein Anpassungsverfahren mittels einer Spline-Funktion, worin alle Intervalle zwischen zwei benachbarten Punkten durch kubische polynominale Funktionen abgedeckt sind, welche den stetigen Verlauf mit den angrenzenden Funktionen erhalten. Weder die beiden Verfahren noch andere Ansätze können s-förmige Kalibrierungskurven angleichen ohne den Einsatz zahlreicher analytischer Messwerte.
Als Versuch mit einer nicht-geteilten Darstellung ist ein Regressionsverfahren mit einer logistischen Kurve bekannt; ein Regressionsverfahren mit einer logit-log-Umwandlungsformel; ein Verfahren mit einer gleichseitigen Hyperbel; und ein Verfahren, das eine polynominale kubische oder höhergradige Expression auf eine s-förmige Kalibrierungs kurve anwendet. Davon lässt sich das Verfahren mit der gleichseitigen Hyperbel nicht gut auf eine s-förmige Kalibrierungskurve angleichen.
Logistische Kurven sind als empirische Formeln für s-förmige Kurven bekannt. Eine besonders weit verbreitete logistische Kurve ist durch nachstehende Formel gezeigt, die vier Koeffizienten hat:
worin
x für die Konzentration,
y für den analytischen Messwert (Daten wie der optischen Dichte), und
a, b, c und d für Koeffizienten stehen.
(Rodbard et al: statistische Analyse von Radioimmunoassays und immunoradiometrischen (markierten Antikörper) Assays. Eine generalisierte, gewogene, iterative Methode der kleinsten Quadrate für logistische Kurvenanpassung. Symposion über RIA und verwandte Verfahren in der Medizin, Seite 165, Int. Atomic Energy Agency, Wien, 1974).
Diese logistische Kurve ist eine s-förmige Kurve, wie in Fig. 1 gezeigt, und eignet sich ausgezeichnet als Modell für eine Kalibrierungskurve, die man aus einer kleinen Anzahl Messpunkte und Standardproben gewinnen kann, da diese Kurve nicht nur im Mittelbereich einen linearen Teil hat, sondern auch Kurventeile an beiden Enden und ferner einen asymptotischen Teil außerhalb des Endes besitzt. Die statistische Behandlung dieser logistischen Kurve ist jedoch kompliziert, da die obige Formel, welche die Kurve darstellt, nicht linear ist und die Regression dieser Formel eine iterative Methode der kleinsten Quadrate erfordert. Zudem ist es notwendig, die analytischen Messwerte (das Signal oder den ΔOD-Wert in den nachstehenden Beispielen) genau zu ermitteln, wenn die Menge des Antigens (Konzentration: x) gleich null beziehungsweise unendlich (∞) ist. Um den Messwert für die unendliche Menge Antigen zu erlangen, ist es erforderlich, eine Standardprobe, welche einen großen Überschuss Antigen enthält, herzustellen und zu lagern. Dies ist in der Tat besonders schwierig im Vergleich zur Herstellung und Lagerung einer Standardprobe, die eine normale Menge Antigen (Analyt) enthält. Ferner ist es wahrscheinlich, dass sich das Signal aufgrund des Hook-Phänomens (auch als Prozonen-Phänomen bezeichnet) verändert und die Kalibrierungskurve einen maximalen Wert (oder minimalen Wert) erreicht, wenn eine übermäßige Menge Antigen im Vergleich zum Antikörper in einem Immunoassay vorliegt. In einem solchen Fall erhält man für eine unendliche Menge Antigen kein Signal.
Bei einer logit-log-Umwandlung wird eine logit-Umwandlung der vertikalen Achse (gezeigte oder gemessene Werte) der Kalibrierungskurve und eine logarithmische Umwandlung der horizontalen Achse (Konzentration: Dosis) der Kalibrierungskurve durchgeführt. Damit kann man eine s-förmige Kurve durch Verwenden des folgenden einfachen linearen Polynominals linearisieren:
worin
B&sub0; und Bx die gemessenen Werte bei der Konzentration 0 (null) beziehungsweise bei der Konzentration x sind; und N der gemessene Wert für eine unendliche Konzentration ist. (Rodbard et al.: Rapid calculation of radioimmunoassay results, J. Lab. Clin. Med., 74, Seite 770, 1969).
Die logit-log-Umwandlung kann in der einfacheren Regression durch die einfache Methode der kleinsten Quadrate durchgerührt werden und ist gegenüber der oben beschriebenen logistischen Kurve überlegen. Selbst diese logit-log-Umwandlung hat jedoch einen Nachteil darin, dass eine weitere Abweichung von der geraden Linie auftritt, sofern nicht sowohl das Signal B&sub0; bei der Konzentration null und das Signal N bei unendlicher Konzentration genau bestimmt sind. In anderen Worten, es ist schwierig, eine Kalibrierungskurve zu erstellen, wenn die Anzahl Messpunkte kein ist.
Ein weit verbreitetes herkömmliches Verfahren ist die Annäherung einer s-förmigen Kalibrierungskurve durch ein kubisches (dreigradiges) Polynominal. Dieses Verfahren ist wirksam in dem Fall, dass nur ein linearer Teil einer s-förmigen Kurve als Arbeitsbereich einer Kalibrierungskurve verwendet wird. Diese Methode eignet sich jedoch nicht für den gesamten Bereich der Datenpunkte, einschließlich nicht nur des linearen Teils der sförmigen Kurve, sondern auch der Kurventeile an beiden Enden und ferner einen asymptotischen Teil außerhalb des Endes. Der Versuch, die Genauigkeit in der Mitte der s-förmigen Kurve zu verbessern, führt daher zu einer Verringerung der Genauigkeit an beiden Enden. Hingegen führt der Versuch, beide Enden der Kurve als Arbeitsbereich zu verwenden, dazu, dass man die Genauigkeit bis zu einem bestimmten Ausmaß im Mittelbereich der Kurve opfert. Diese werden nicht besser, selbst wenn mehr Messpunkte von Standardproben eingesetzt werden. Es gibt eine bestimmte Grenze was das Anwenden eines Modells (einer Funktion) auf eine gesamte Kalibrierungskurve angeht.

Aufgaben und Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wurde in Anbetracht der vorstehend genannten Umstände gemacht und eine erste Aufgabe davon ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur quantitativen Analyse eines Analyts mit hoher Genauigkeit sowohl in niedrigen, mittleren als auch hohen Konzentrationsbereichen.
Eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Bestimmung einer Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve für einen breiten Bereich, der sowohl die niedrigen, mittleren als auch hohen Konzentrationsbereiche abdeckt, durch die Verwendung einer kleinen Anzahl Standardproben mit einem einfachen und schnellen Verfahren.
Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Vorrichtung zur quantitativen Analyse eines Analyts in einer Probe, worin die oben genannte Kalibrierungskurve einfach und schnell hergestellt werden kann und die quantitative Analyse mit großer Genauigkeit über einen breiten Bereich, der alle Konzentrationsbereiche abdeckt, durchgeführt werden kann.
Die erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren zur quantitativen Analyse eines Analyts in einer Probe unter Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve erreicht, welche unter Verwendung der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen des Analyts in Standardproben und analytisch gemessenen Werten der Standardproben erstellt worden ist:
wobei die Kalibrierungskurve wie folgt in mindestens drei Teile unterteilt ist:
(a) einen Teil der Kalibrierungskurve für einen niedrigen Konzentrationsbereich, welcher durch eine mehrgradige Funktion dargestellt ist,
(b) einen Teil der Kalibrierungskurve für einen mittleren Konzentrationsbereich, welcher durch eine exponentielle Funktion dargestellt ist, und
(c) einen Teil der Kalibrierungskurve für einen hohen Konzentrationsbereich, welcher durch eine mehrgradige Funktion dargestellt ist;
und wobei die benachbarten beiden Teile der Kalibrierungskurve an den Grenzen der entsprechenden obigen Konzentrationsbereich eine identische Steigung aufweisen.
Die zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren zur Bestimmung einer Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve zur quantitativen Analyse eines Analyts erreicht, wobei die Kalibrierungskurve unter Verwendung der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen des Analyts in Standardproben und analytischen gemessenen Werten der Standardproben erstellt worden ist, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
(a) Darstellen der Kalibrierungskurve für einen niedrigen Konzentrationsbereich durch eine mehrgradige Funktion;
(b) Darstellen der Kalibrierungskurve für einen mittleren Konzentrationsbereich durch eine exponentielle Funktion;
(c) Darstellen der Kalibrierungskurve für einen hohen Konzentrationsbereich durch eine mehrgradige Funktion; und
(d) Annehmen als Grenzbedingungen für die entsprechenden obigen Konzentrationsbereiche, dass die benachbarten beiden Teile der Kalibrierungskurve an den Grenzstellen eine identische Steigung aufweisen, wodurch die Funktionen der Kalibrierungskurve für die entsprechenden Konzentrationsbereiche festgelegt sind.
Praktischerweise werden quadratische Funktionen (Funktionen zweiten Grades) als mehrgradige Funktionen ausgewählt, welche die niedrigen und hohen Konzentrationsbereiche der Kalibrierungskurve darstellen, da die Anzahl Datenpunkte (Standardproben) für die Regression der Funktionen dieser Bereiche verringert werden kann. Selbst mit einer solchen geringen Anzahl Datenpunkten kann die Genauigkeit ohne wesentliche Opfer aufrechterhalten werden, da der stetige Verlauf durch die Grenzbedingungen mit den angrenzenden Bereichen mittlerer Konzentration gesichert ist. Die mehrgradigen Funktionen können jedoch von kubischem oder höherem Grad sein, je nach Kurvenverlauf in den Niedrig- oder Hoch-Konzentrationsbereichen der Kalibrierungskurve.
In dem Fall, dass eine quadratische Funktion zur Darstellung eines Teils der Kalibrierungskurve für die Hoch- und Niederkonzentrationsbereiche verwendet wird, lässt sich die Regressionsfunktion der gesamten Kalibrierungskurve durch nachstehende Schritte (a) bis (g) erstellen. Das heißt,
(a) Auftragen entsprechender Konzentrationen (pi) des Analyts in der Standardprobe und der logarithmischen Werte (log qi) der entsprechenden analytischen gemessenen Werte (qi) in das rechtwinklige Koordinatensystem;
(b) Finden des mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;), welcher einen linearen Abschnitt in diesem semi-logarithmischen Graph darstellt;
(c) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils dieses mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;) durch
Y = exp(b·X + d)
d. h.
X = (lnY - d)/b (1)
worin Y der analytisch gemessene Wert (qi), wie beispielsweise die optische Dichte oder eine andere physikalische Größe, ist,
X für die Konzentration des Analyts in der Standardprobe (pi) steht und
b und d Koeffizienten darstellen;
(d) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des niedrigen Konzentrationsbereichs (von der minimalen Konzentration p&sub0; in den Standardproben zu der Konzentration p&sub1;) als
X = e·Y² + f·Y + g (2)
worin e, f und g Koeffizienten darstellen;
(e) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des hohen Konzentrationsbereichs (von der Konzentration p&sub2; zu der maximalen Konzentration p&sub3; in den Standardproben) durch
X = l·Y² + m·Y + n (3),
wobei l, m und n Koeffizienten darstellen;
(f) Festsetzen von Grenzbedingungen derart, dass der differenzierte Wert (dX/dY) der Formel (1) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) und der differenzierte Wert (dX/dY) der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (3) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) entspricht; und
(g) Berechnen entsprechender Koeffizienten in den Formeln (1), (2) und (3) und davon ausgehend Auffinden der stetigen Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve für den gesamten Konzentrationsbereich, welcher den Bereich von p&sub0; bis p&sub3; abdeckt.
Die Schritte (a) und (b) zum Finden des mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub1;) müssen nicht zwingend zusammen mit den Schritten (c) bis (g) erfolgen. Das heißt, der mittlere Konzentrationsbereich (p&sub1;-p&sub2;) kann als Bereich zwischen den Konzentrationen an beiden Enden (oder den Konzentrationen in der Nähe beider Enden) eines mittleren Konzentrationsbereichs eingestellt werden, der durch eine exponentielle Funktion zur Messung des Analyts dargestellt ist. In diesem Fall eignet sich der mittlere Konzentrationsbereich hauptsächlich für Einzelchargen von Assaykits oder einzelne Analysegeräte. Und die Standardproben mit Konzentrationen p&sub1; und p&sub2;, welche an den Grenzen des mittleren Konzentrationsbereichs liegen, werden an die Nutzer individueller Assaykits oder individueller Analysegeräte geliefert oder verteilt.
Dieser Fall der vorliegenden Erfindung lässt sich als Verfahren zum Erstellen einer Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve definieren, das folgende Schritte umfasst:
(a) Bereitstellen eines mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;), welcher vorläufig als der Bereich eines linearen Abschnitts in einen semi-logarithmischen Graph definiert ist, wobei die entsprechenden Konzentrationen (pi) des Analyts in den Standardproben und die logarithmischen Werte (log qi) der entsprechenden analytisch gemessenen Werte (qi) in einem rechtwinkligen Koordinatensystem aufgetragen sind, wobei der lineare Abschnitt an beiden Enden die Intermediatkonzentrationen p&sub1; und p&sub2; aufweist;
(b) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;) durch
Y = exp(b·X + d)
d. h.
X = (lnY - d)/b (1)
wobei Y den analytischen gemessenen Wert (qi), wie beispielsweise die optische Dichte oder eine andere physikalische Messgröße, bezeichnet,
X die Konzentration des Analyts in der Standardprobe (pi) bezeichnet, und
b und d Koeffizienten darstellen;
(c) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des niedrigen Konzentrationsbereichs (von der Mindestkonzentration p&sub0; in der Standardprobe zu der Konzentration p&sub1;) durch
X = e·Y² + f·Y + g (2)
worin e, f und g Koeffizienten darstellen;
(d) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des hohen Konzentrationsbereichs (von der Konzentration p&sub2; zu der Maximalkonzentration p&sub3; in der Standardprobe) durch
X = l·Y² + m·Y + n (3),
wobei l, m und n Koeffizienten darstellen;
(e) Festsetzen von Grenzbedingungen derart, dass der differenzierte Wert (dX/dY) der Formel (1) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) entspricht und der differenzierte Wert (dX/dY) der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (3) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) entspricht; und
(f) Berechnen der entsprechenden Koeffizienten in den Formeln (1), (2) und (3) und ausgehend davon Auffinden der stetigen Regressionsfunktion der Kalibrierungs kurve für den gesamten Konzentrationsbereich, welcher den Bereich von p&sub0; bis p&sub3; abdeckt.
Eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist das Erhalten einer Vorrichtung zur quantitativen Analyse eines Analyts in einer Probe unter Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve, welche unter Verwendung der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen des Analyts in Standardproben und den analytischen gemessenen Werten der Standardproben erstellt worden ist, wobei die Vorrichtung umfasst:
1) Eingabemittel zum Eingeben der bekannten Konzentrationen (pi) des Analyts in mehreren Standardproben und ihrer analytischen gemessenen Werte (qi);
2) einen Prozessor zum Empfangen der Dateneingabe von den Eingabemitteln und zum Ausführen der nachfolgend erwähnten Operationen, um eine Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve auf Basis der Eingabe (pi) und (qi) zu bestimmen, wobei die Operationen die Schritte umfassen:
(a) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils eines mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;), welcher als der Bereich eines linearen Abschnitts in einem semi-logarithmischen Graph definiert ist, in dem entsprechende Konzentrationen (pi) der Standardprobe und die logarithmischen Werte (log qi) der entsprechenden analytischen gemessenen Werte (qi) in einem rechtwinkligen Koordinatensystem aufgetragen sind, wobei der lineare Abschnitt an beiden Enden die Intermediatkonzentrationen p&sub1; und p&sub2; aufweist, durch
Y = exp(b·X + d)
das heißt
X = (lnY - d)/b (1)
wobei 7 den analytischen gemessenen Wert (qi), wie beispielsweise optische Dichte oder eine andere physikalische Messgröße, bezeichnet,
X die Konzentration des Analyts in der Standardprobe (pi) bezeichnet, und
b und d Koeffizienten darstellen;
(b) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des niedrigen Konzentrationsbereichs (von der minimalen Konzentration p&sub0; in der Standardprobe zu der Konzentration p&sub1;) durch
X = e·Y² + f·Y + g (2)
worin e, f und g Koeffizienten darstellen;
(c) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des hohen Konzentrationsbereichs (von Konzentration p&sub2; zu der maximalen Konzentration p&sub3; in der Standardprobe) durch
X = l·Y² + m·Y + n (3),
wobei l, m und n Koeffizienten darstellen;
(d) Festsetzen von Grenzbedingungen derart, dass die differenzierten Werte (dX/dY) der Formel (1) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) entspricht und der differenzierte Wert (dX/dY) der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (3) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) entspricht; und
(e) Berechnen entsprechender Koeffizienten in den Formeln (1), (2) und (3) und ausgehend davon Auffinden der stetigen Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve für den gesamten Konzentrationsbereich, welcher den Bereich von p&sub0; bis p&sub3; abdeckt; und
3) einen Kalibrierungskurvengenerator zur Erzeugung der Kalibrierungskurve, welche zur quantitativen Analyse des in einer Testprobe enthaltenen Analyts verwendet werden soll, wobei die Kalibrierungskurve ausgehend von der durch den Prozessor bestimmten Regressionsfunktion erstellt wird.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Kalibrierungskurve gemäß einem herkömmlichen Modell einer logistischen Kurve;
Fig. 2 zeigt ein Korrelationsdiagramm zwischen den durchschnittlichen analytischen Messwerten (dODmittel) in trockenen Analyseelementen zum Analysieren von CRP bei entsprechenden Konzentrationen und Standardabweichungen (S.D.) davon;
Fig. 3 ist ein Diagramm, das die Wechselwirkung zwischen den CRP-Konzentrationen, welche durch trockene Analyseelemente für die CRP-Analyse gewonnen und von der Kalibrierungskurve abgelesen wurden, und die Standardabweichungen (S.D.) davon zeigt;
Fig. 4 zeigt ein schematisches Diagramm, dass den Grundsatz des Verfahrens zur Bestimmung einer Regressionsfunktion einer erfindungsgemäßen Kalibrierungskurve erläutert;
Fig. 5 zeigt ein schematisches Diagramm, worin die vertikale Achse logarithmische Werte aufweist, und das ebenfalls das Prinzip der Erfindung erläutert;
Fig. 6 ist ein Blockdiagramm, welches eine Grundkonstruktion einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung zeigt;
Fig. 7 zeigt ein Fließdiagramm, das die Vorgänge in der Ausführungsform der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung erläutert;
Fig. 8 zeigt eine bestimmte Kalibrierungskurve aus dem Beispiel, wobei die CRP- Konzentration und dODr aufgetragen sind;
Fig. 9 zeigt eine Regressionskurve zum Analysieren von CRP, erstellt in dem Beispiel durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Erstellung der Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve; und
Fig. 10 zeigt eine Regressionskurve, als Vergleichsbeispiel, erstellt durch ein herkömmliches Modell einer logistischen Kurve mit den Daten aus Tabelle 3.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Wie in dem Absatz der Beschreibung zum Hintergrund der Erfindung erwähnt, ist es schwierig, eine gesamte s-förmige Kalibrierungskurve durch nur eine Funktion darzustellen und gleichzeitig eine hohe Genauigkeit über alle Konzentrationsbereiche zu gewährleisten. Es wäre nicht unmöglich, wenn man eine extrem komplizierte Funktion einführt; jedoch erfordert eine solche Komplexität eine größere Anzahl Koeffizienten zur Auflösung mit dem daraus resultierenden Erfordernis einer größeren Anzahl Standardproben für die Messung.
Erfindungsgemäß wird eine s-förmige Kalibrierungskurve in drei Teile unterteilt, mit einem niedrigen, einem mittleren und einem hohen Konzentrationsbereich, und die entsprechenden Teile werden durch unterschiedliche Funktionen dargestellt. Werden Funktionen wie in diesem Fall verändert, verändert sich die Genauigkeit gewöhnlich abrupt in der Nähe der Grenzbereiche. Um ein solches Phänomen zu vermeiden, werden die Grenzbedingungen für zwei benachbarte Funktionen so gewählt, dass die zwei Funktionen erfindungsgemäß die gleiche Tangente (Steigung) am Grenzpunkt (Kontaktpunkt) aufweisen.
Mathematisch gesehen, haben zwei aneinander grenzende Funktionen den gleichen differenzierten Wert am Grenzpunkt. Durch diese Grenzbedingungen gehen die zwei aneinander grenzenden Funktionen glatt ineinander über und die Genauigkeit zwischen ihnen variiert nicht wesentlich. Zudem lässt sich durch das Einführen der Grenzbedingung wenigstens ein Messpunkt (oder eine Standardprobe) von denen einsparen, die man benötigt, um Koeffizienten für die Bestimmung der Funktion jedes Konzentrationsbereichs zu erlangen.
Es wurde gefunden, dass die s-förmige Kalibrierungskurve einen mittleren Konzentrationsbereich hat, der durch eine exponentielle Funktion dargestellt werden kann. Auf Basis dieses Funds erfolgt die Darstellung und Regression des mittleren Konzentrationsbereichs erfindungsgemäß durch eine exponentielle Funktion. In diesem mittleren Konzentrationsbereich bestimmen definitiv zwei Messpunkte (Standardproben) die exponentielle Funktion, wie sich durch die Tatsache zeigt, dass man eine gerade Linie erhält, wenn eine exponentielle Funktion auf einem semi-logarithmischen Graph aufgetragen wird. Werden die Konzentrationen an beiden Enden des mittleren Konzentrationsbereichs (oder nahe daran liegende Konzentrationen) als Konzentrationen für Messpunkte (Standardproben) angenommen, können diese Daten (Konzentrationen oder andere analytische gemessene Werte) auf den zwei Messpunkten auch als Daten für die Grenzpunkte mit benachbarten niedrigen und hohen Konzentrationsbereichen verwendet werden. Als Ergebnis lässt sich die Anzahl Messpunkte (Standardproben), die zur Bestimmung der Regressionsfunktion der gesamten Kalibrierungskurve notwendig sind, weiter verringern.
Nachstehend wird beschrieben, dass eine s-förmige Kalibrierungskurve einen mittleren Konzentrationsbereich besitzt, der durch eine exponentielle Funktion dargestellt werden kann.
Durch Verwenden trockener analytischer Elemente zur Analyse von CRP (C-reaktivem Protein), das in dem nachstehend beschriebenen Ausführungsbeispiel verwendet wurde, wurde die Streuung der Farbentwicklung (C.V. (%)) für diese analytischen Elemente überprüft. Standardproben in flüssiger Form mit verschiedenen CRP-Konzentrationen wurden auf die analytischen Elemente getupft und bei 37ºC aufbewahrt. Die optische Dichte des reflektierten Lichts wurde bei 650 nm von der PET-Trägerseite des Elements gemessen. Die Differenz zwischen der reflektierten optischen Dichte, die nach Ablauf von vier Minuten beziehungsweise sechs Minuten nach dem Auftupfen gemessen wurde (ΔOD&sub6;&submin;&sub4;: auch bezeichnet als dOD&sub6;&submin;&sub4; oder wie hiernach und in den angefügten Zeichnungen als dODr), wurde ermittelt. 50 Messungen für jede Konzentration wurden durchgeführt, um den Mittelwert (dODmittel), die Standardabweichung (S.D.) für jeden der Mittelwerte und den Variationskoeffizienten C.V. (= (S.D./dODmittel) · 100) zu erlangen. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die gleichen CRP-Konzentrationen wie in Tabelle 1 gezeigt, galten für die experimentellen Ergebnisse des anderen Tags. Tabelle 1
Unabhängig von der CRP-Konzentration waren die Werte des C.V. (%) fast konstant (3% oder so). Eine hohe Korrelation wurde, wie in Fig. 2 gezeigt, zwischen dODmittel und der Standardabweichung (S.D.) beobachtet.
Eine Kalibrierungskurve wurde aus den dOD&sub6;&submin;&sub4;-Werten, welche mit obiger Messung gewonnen wurden, erstellt. Aus dieser Kalibrierungskurve wurden die Konzentrationen von CRP in den entsprechenden Beispielen ermittelt. Die Standardabweichungen (S.D.) der analytischen Werte (Konzentrationen) sind in Tabelle 2 und Fig. 3 gezeigt. In einem Konzentrationsbereich von wenigstens bis zu 10 mg/dl war die Standardabweichung der gezeigten Werte der CRP-Konzentration fast konstant (etwa 0,25).

Tabelle 2

CRP-Konzentration, abgelesen aus der Kalibrierungskurve (mg/dl) S.D. (mg/dl)
1,8 0,28
10,1 0,23
17,0 0,18
1,7 0,25
CRP-Konzentration, abgelesen aus der Kalibrierungskurve (mg/dl) S.D. (mg/dl)
1,7 0,22
2,6 0,27
2,6 0,27
4,3 0,32
4,3 0,28
Durchschnitt 0,25
Unabhängig von der CRP-Konzentration war die Variation C.V. der dODr-Werte und die Standardabweichung (S.D.) der gezeigten Werte der CRP-Konzentration, die von der Kalibrierungskurve abgelesen wurden, fast konstant. Aus diesen Tatsachen wird eine Funktion für eine unter solchen Bedingungen anwendbare Kalibrierungskurve abgeleitet.
Die Funktion einer Kalibrierungskurve lautet
y&sub0; = F(x&sub0;)
für die dODr (y&sub0;) bei einer bestimmten CRP-Konzentration (x&sub0;), wenn die Kalibrierungskurve F und die S.D.-Zielfunktion G für den angezeigten Konzentrationswert mit der CRP-Konzentration x beziehungsweise dODr y angepasst werden. Wie oben beschrieben, ist der C.V. der dODr konstant; daher ist die Standardabweichung (S.D.) der dODr gleich α·y&sub0;, wenn dODr = y&sub0;, worin α für einen konstanten Wert (etwa 0,03 in dem oben genannten Fall) steht.
Betrachtet man die Ableitung (F') der Funktion (F) der Kalibrierungskurve, ist das Verhältnis zwischen der S.D. der CRP-Konzentration (wie angezeigt) bei einer vorgegebenen CRP-Konzentration (x&sub0;) und einer S.D. der dODr (= y&sub0;) gleich:
F'(x&sub0;) = = [S.D. der dODr bei y&sub0;]/[S.D. der angezeigten CRP-Konzentration bei x&sub0;] = α·y&sub0;/G(x&sub0;)
Setzt man anstelle von G(x) die S.D.-Zielfunktion ein, kann F(x) als Differentialgleichung gelöst werden. Als Ergebnis aus Tabelle 2 und Fig. 3 kann man annehmen, dass G(x) = 0,25. Als Ergebnis aus Tabelle 1 und Fig. 2 ist α = 0,03 (3%, wenn C.V. als Prozent angegeben ist). Demnach gilt:
F'(x&sub0;) = 0,03·F(x)/0,25
das heißt
F'(x&sub0;)/F(x) = 0,03/0,25 = konstant
Wird diese durch die Verwendung der Koeffizienten b und d verallgemeinert, kann sie wie folgt dargestellt werden:
F(x) = exp(b·X + d)
Damit wurde nun gefunden, dass das Grundprofil der Kalibrierungskurve zur Analyse von CRP durch eine exponentielle Funktion dargestellt werden kann.
Wie gesehen versteht es sich, dass zumindest ein Teil (der mittlere Konzentrationsbereich in der Praxis) einer s-förmigen Kalibrierungskurve durch eine exponentielle Funktion dargestellt werden kann. Erfindungsgemäß werden ein hoher Konzentrationsbereich und ein niedriger Konzentrationsbereich, welche den mittleren Konzentrationsbereich umgeben, durch mehrgradige Funktionen dargestellt und deren Grenzbedingungen werden so gewählt, dass die zwei Funktionen die gleiche Steigung (differenzierter Wert and den Grenzpunkten) besitzen; auf diese Weise kann eine Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve erstellt werden, welche den gesamten Konzentrationsbereich abdeckt. Für den Fall, dass die niedrigen und hohen Konzentrationsbereiche durch quadratische Funktionen (Funktionen zweiten Grades) dargestellt werden, wird das Verfahren zur Bestimmung einer Regressionsfunktion einer erfindungsgemäßen Kalibrierungskurve nachstehend ausführlich beschrieben.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung einer typischen s-förmigen Kalibrierungskurve. Die Abszisse steht für die Konzentration X und die Ordinate für den analytischen Messwert Y (beispielsweise dODr in dem Beispiel). In Fig. 5 gibt die vertikale Achse die logarithmischen Werte der gemessenen Y-Werte an. Um die Erläuterung zu vereinfachen, sind hier vier Messdatenpunkte A&sub0;, A&sub1;, A&sub2; und A&sub3; aufgetragen. Die Konzentrationen der entsprechenden Proben sind p&sub0;, p&sub1;, p&sub2; und p&sub3; und deren analytische Messwerte sind q&sub0;, q&sub1;, q&sub2; und q&sub3;. Die Zone II mit A&sub1;-A&sub2; beim dem mittleren Konzentrationsbereich p&sub1;-p&sub2; macht einen linearen Teil der semi-logarithmischen Kurve, wie in Fig. 5 gezeigt, aus und kann durch eine exponentielle Funktion dargestellt werden.
Werden die Zone I (p&sub0;-p&sub1;: niedriger Konzentrationsbereich) und die Zone III (p&sub2;-p&sub3;: hoher Konzentrationsbereich) durch Funktionen zweiten Grades dargestellt, werden die entsprechenden Zonen wie folgt ausgedrückt:
Zone II (mittlerer Konzentrationsbereich):
Y = exp(b·X + d)
das heißt
X = (lnY - d)/b (1)
worin b und d Koeffizienten sind.
Zone I (niedriger Konzentrationsbereich):
X = e·Y² + f·Y + g (2)
worin e, f und g Koeffizienten sind.
Zone III (hoher Konzentrationsbereich):
X = l·Y² + m·Y + n (3)
wobei l, m und n Koeffizienten sind.
In der Zone II verläuft die Kalibrierungskurve durch A&sub1;(p&sub1;, q&sub1;) und A&sub2;(p&sub2;, q&sub2;). Entsprechend gilt:
b = (lnq&sub2; - lnq&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;) = [ln(q&sub2;/q&sub1;)]/(p&sub2; - p&sub1;) (4)
d = lnq&sub2; - b·p&sub2; = lnq&sub2; - [(lnq&sub2; - lnq&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;)]·p&sub2; = (p&sub2;·lnq&sub1; -p&sub1;·lnq&sub2;)/(p&sub2; - p&sub1;) (5)
Somit lassen sich die Koeffizienten b und d leicht ermitteln.
Die entsprechenden Koeffizienten in Zone I (niedriger Konzentrationsbereich) müssen nun gefunden werden. Die Grenzbedingung für Zone I und Zone II besteht darin, eine gleiche Steigung oder gleiche differenzierte Werte (dX/dY) an dem Grenzpunkt A&sub1;(p&sub1;, q&sub1;) zu erreichen. Die Ableitung (1) bezüglich des Messwertes Y ist
dX/dY = l/(b·Y) (6);
die Ableitung (2) ist
dX/dY = 2e·Y + f (7).
Da die Formeln (6) und (7) den gleichen Wert am Grenzpunkt A&sub1;(p&sub1;, q&sub1;) besitzen, gilt
l/(b·q&sub1;) = 2e·q&sub1; + f (8).
Auf der anderen Seite verläuft die quadratische Kurve der Formel (2) durch A&sub0;(p&sub0;, q&sub0;) und A&sub1;(p&sub1;, q&sub1;) in Zone I. Damit gilt:
p&sub0; = e·q&sub0;² + f·q&sub0; + g (9)
p&sub1; = e·q&sub1;² + f·q&sub1; + g (10)
Die Formeln (9) und (10) werden zu folgender Formel zusammengefasst:
p&sub1; - p&sub0; = e(q&sub1;² - q&sub0;²) + f(q&sub1; - q&sub0;) = (q&sub1; - q&sub0;)[e(q&sub1; + q&sub0;) + f]
Werden beide Seiten durch (q&sub1; - q&sub0;) geteilt, ergibt sich
(p&sub1; -p&sub0;)/(q&sub1; - q&sub0;) = e(q&sub1; + q&sub0;) + f (11).
Die Formeln (8) und (11) ergeben:
l/(b·q&sub1;) - (p&sub1; - p&sub0;)/(q&sub1; - q&sub0;) = 2e·q&sub1; - e(q&sub1; + q&sub0;) = e(q&sub1; - q&sub0;).
Damit erhält man
e = [l/(b·q&sub1;) - (p&sub1; - p&sub0;)/(q&sub1; - q&sub0;)]/(q&sub1; - q&sub0;) (12).
Aus der Formel (8) ergibt sich:
f = l/(b·q&sub1;) - 2e·q&sub1; (13).
Demnach wird der Koeffizient f aus dem Koeffizienten b (der sich aus der Formel (4) ergibt) und dem Koeffizienten e (der der Formel (12) entnommen werden kann) bestimmt.
Der verbleibende Koeffizient g findet sich in der Formel (9).
g = p&sub0; - e·q&sub0;² - f·q&sub0; (14).
Für die Zone III (hoher Konzentrationsbereich: A&sub2;-A&sub3;) können die Koeffizienten l, m und n auf ähnliche Weise gefunden werden. Die Ableitung (3) am Grenzpunkt A&sub2;(p&sub2;, q&sub2;)
dX/dY = 2·l·Y + m (15)
ist gleich dX/dY (= l/(b·Y)) der Formel (6). Demnach ergibt sich
l/(b·q&sub2;) = 2·l·q&sub2; + m (16).
Andererseits verläuft die quadratische Kurve der Formel (3) durch die Punkte A&sub2;(p&sub2;, q&sub2;) und A&sub3;(p&sub3;, q&sub3;) in Zone III.
Daraus ergibt sich
p&sub2; = l·q&sub2;² + m·q&sub2; + n (17)
p&sub3; = l·q&sub3;³ + m·q&sub3; + n (18).
Das Subtrahieren der Formel (17) von der Formel (18) ergibt:
p&sub3; - p&sub2; = l(q&sub3;² - q&sub2;²) + m(q&sub3; - q&sub2;) = (q&sub3; - q&sub2;) [l - (q&sub3; + q&sub2;) + m].
Das Dividieren beider Seiten durch (q&sub3; - q&sub2;) ergibt:
(p&sub3; - p&sub2;)/(q&sub3; - q&sub2;) = l·(q&sub3; + q&sub2;) + m (19).
Das Subtrahieren der Formel (19) von der Formel (16) ergibt:
l/(b·q&sub2;) - (p&sub3; - p&sub2;)/(q&sub3; - q&sub2;) = 2·l·q&sub2; - l·(q&sub3; + q&sub2;) = l·(q&sub2; - q&sub3;).
Damit erhält man
l = [l/(b·q&sub2;) - (p&sub3; - p&sub2;)/(q&sub3; - q&sub2;)]/(q&sub2; - q&sub3;) (20).
Aus der Formel (16) ergibt sich:
m = l/(b·q&sub2;) -2·l·q&sub2; (21).
Aus der Formel (17) erhält man:
n = p&sub2; - l·q&sub2;² - m·q&sub2; (22).
Zusammenfassend ergibt sich:
für die Zone I (niedriger Konzentrationsbereich: p&sub0; ≤ X ≤ p&sub1;, q&sub0; ≥ Y ≥ q&sub1;)
X = e·Y² + f·Y + g;
für die Zone II (mittlerer Konzentrationsbereich: p&sub1; ≤ X ≤ p&sub2;, q&sub1; ≥ Y ≥ q&sub2;)
X = (lnY - d)/b;
für die Zone III (hoher Konzentrationsbereich: p&sub2; ≤ X ≤ p&sub3;, q&sub2; ≥ Y ≥ q&sub3;)
X = l·Y² + m·Y + n;
und die Koeffizienten sind wie folgt:
b = (lnq&sub2; - lnq&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;) = ln(q&sub2;/q&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;)
d = lnq&sub2; - b·p&sub2; = (p&sub2;·lnq&sub1; - p&sub1;·lnq&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;)
e = [l/(b·q&sub1;) - (p&sub1; - p&sub0;)/(q&sub1; - q&sub0;)]/(q&sub1; - q&sub0;)
f = l/(b·q&sub1;) - 2e·q&sub1;
g = p&sub0; - e·q&sub0;² - f·q&sub0;
l = [l/(b·q&sub2;) - (p&sub3; - p&sub2;)/(q&sub3; - q&sub2;)]/(q&sub2; - q&sub3;)
m = l/(b·q&sub2;) - 2·l·q&sub2;
n = p&sub2; - l·q&sub2;² - m·q²
Wie erläutert, wird eine Kalibrierungskurve, die eine s-förmige Kurve darstellt, erfindungsgemäß in drei Teile geteilt: einen Teil für einen niedrigen Konzentrationsbereich, der durch eine Funktion höheren Grades dargestellt wird; einen Teil für einen mittleren Konzentrationsbereich, der durch eine exponentielle Funktion dargestellt wird; und einen Teil für einen hohen Konzentrationsbereich, der durch eine Funktion höheren Grades dargestellt wird. Die zwei aneinander grenzenden Teile werden derart gestaltet, dass sie im Grenzpunkt die gleiche Steigung als Grenzbedingung haben. Auf diese Weise kann eine Regressionsfunktion für die Kalibrierungskurve bestimmt werden, die alle entsprechenden Konzentrationsbereiche abdeckt. In diesem Verfahren muss man nur eine kleine Anzahl Standardproben messen, um die Kalibrierungskurve zu erstellen. Ferner ist die Genauigkeit der erhaltenen Kalibrierungskurve über alle Konzentrationsbereiche hoch.
Die Regressionsfunktion der auf diese Weise bestimmten Kalibrierungskurve kann man in der Praxis sogar für Konzentrationen unter der Mindestkonzentration (p&sub0;) verwenden, um die Funktion für einen niedrigen Konzentrationsbereich zu bestimmen, und für Konzentrationen über der Maximalkonzentration (ps), um die Funktion für einen höheren Konzentrationsbereich zu bestimmen.

Analysevorrichtung

Nun wird eine Analysevorrichtung erläutert, die das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve verwendet. Fig. 6 ist ein Blockdiagramm, welches den allgemeinen Aufbau der erfindungsgemäßen Analysevorrichtung zeigt. Bezugsziffer 10 zeigt eine Messvorrichtung, welche ein Signal misst und nachweist (eine physikalische Größe wie die optische Dichte oder ein elektrisches Signal), welches der Menge des Analyts (Konzentration oder Aktivität) entspricht. Das nachzuweisende Signal wird durch eine enzymatische oder chemische Reaktion einer flüssigen Probe, welche den Analyt enthält, erzeugt. Wie hiernach in dem Beispiel beschrieben, wird beispielsweise die reflektierte optische Dichte eines trockenen analytischen Elements als Signal gemessen, nachdem eine Probe darauf getupft wurde. Die Eingabevorrichtung 12 empfängt das resultierende Signal (die Messdaten) und überträgt dieses Signal zu der Ausgabevorrichtung 14. Die Ausgabevorrichtung 14 bezieht sich auf eine Kalibrierungskurve, die in einem Speicher (RAM) 22 gespeichert ist, um einen analytischen Wert (Konzentration) zu berechnen und auszugeben.
Die Bezugsziffer 16 steht für einen Prozessor, der Operationen zur Bestimmung einer Regressionsfunktion für eine Kalibrierungskurve verarbeitet. Die Bezugsziffer 18 steht für ROM (ein Aufzeichnungsmedium wie eine Floppydiskette, eine Festplatte und eine optische Magnetplatte), das den Algorithmus für das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Kalibrierungskurve speichert. Das ROM 18 speichert auch ein Betriebsprogramm für die Analysevorrichtung. Der Prozessor 16 empfängt analytische Messwerte (Signale) aus der Ausgabevorrichtung 12, zusammen mit den entsprechenden bekannten Konzentrationen oder dem Gehalt des Analyts, der in einer Standardprobe enthalten ist, und betreibt die Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve, die auf dem in dem ROM 18 gespeicherten Programm beruht.
Während die Analytkonzentrationen der Standardproben über die Eingabe mittels der Eingabevorrichtung 12 eingegeben werden, können sie durch andere Eingabevorrichtungen, wie eine Tastatur oder ein Magnetlesegerät, eingegeben werden. Die Bezugsziffer 20 steht für einen Kalibrierungskurvengenerator, der eine Kalibrierungskurve auf Basis der von dem Prozessor 16 bestimmten Regressionskurve erzeugt. Die so erzeugte Kalibrierungskurve wird in den Speicher (RAM) 22 eingegeben und gespeichert, der ein Aufzeichnungsmedium wie eine Floppydiskette, eine Festplatte oder eine optische Magnetplatte sein kann.
Wenn die analytisch gemessenen Werte, wie die O.D. einer zu untersuchenden Testprobe, durch die Eingabevorrichtung 12 eingegeben werden, nachdem die Kalibrierungskurve erstellt ist, berechnet die Ausgabevorrichtung 14 die Konzentration des Analyts entsprechend den gemessenen Werten (Signalen) in der Testprobe mit Bezug auf die in dem RAM 22 gespeicherten Kalibrierungskurve und gibt sie aus.
Fig. 7 zeigt ein Flussdiagramm zur Herstellung einer Kalibrierungskurve in diesem Analysegerät. Zunächst werden verschiedene Konzentrationen aus Standardproben (Gehalt 0, 1, 2 und 3) jeweils auf mehrere trockene Analyseelemente getupft. Die Messvorrichtung 10 misst die reflektierten optischen Dichten der Elemente. Wenn die analytisch gemessenen Werte (dODr) eingegeben (Schritt 100) werden, wird die Streuung der analytisch gemessenen Werte der entsprechenden Mengen überprüft (Schritt 102). Bei dieser Überprüfung wird, falls die Standardabweichungen (S.D.) der gemessenen Daten der entsprechenden Mengen der Standardproben die vorbestimmten Schwellenwerte überschreiten, die Steuung oder Streuungen als ungeeignet gewertet und die nachfolgenden Vorgänge gestoppt. Wird beispielsweise die Lösung einer Standardprobe aus Versehen nicht auf ein trockenes Analyseelement getupft oder ist die Lösung der Standardprobe nicht gleichförmig, ergibt sich eine breite Standardabweichung (S.D.), die den vorbestimmten Schwellenwert überschreitet. In einem solchen Fall werden die nachfolgenden Operationen gestoppt. In dem Fall, in dem die Standardabweichungen innerhalb der vorbestimmten Schwellenwerte zu liegen kommen, wenn man den kleinsten oder größten der gemessenen Werte (Daten) auslässt, kann man zulassen, dass die nachfolgenden Operationen durchgeführt werden; man löscht dann solche Daten und nimmt an, dass die restlichen Daten für das jeweilige Niveau wirksam sind.
Nachdem die Streuung der analytisch gemessenen Werte der jeweiligen Mengen dahingehend bewertet wurden, dass sie die Grenzwerte nicht überschreiten, wird eine Empfindlichkeitsüberprüfung durchgeführt (Schritt 104). Hier wird die Rangordnung der Mittelwerte der analytisch gemessenen Werte (dODr) bei den jeweiligen Menge überprüft, ob die Rangordnung in der erwarteten Reihenfolge ist. Ist die erwartete Rangordnung beispielsweise:
[Messwert q&sub0; auf Niveau 0]
> [Messwert q&sub1; auf Niveau 1]
> [Messwert q&sub2; auf Niveau 2]
> [Messwert q&sub3; auf Niveau 3],
wird überprüft, ob die Rangordnung wie erwartet ist. Ist die Rangordnung nicht wie erwartet, wird die Erstellung der Kalibrierungskurve abgebrochen, da die Standardproben falsch sein können.
Ist der Schritt 104 abgeschlossen, müssen die Kalibrierungskurven für die jeweiligen Niveaus bestimmt werden (Schritt 106), indem entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung von Kalibrierungskurven nominale Werte p&sub1; für bekannte Konzentrationen und Messwerte q&sub1; (dODr) bei den entsprechenden Niveaus verwendet werden. In Schritt 106 müssen nachstehende Formeln für X (Konzentration) und Y (dODr) ermittelt werden:
für q&sub0; ≤ Y ≤ q&sub1;, X = e·Y² + f·Y + g
für q&sub1; ≤ Y ≤ q&sub2;, X = (lnY·d)/b
für q&sub2; ≤ Y ≤ q&sub3;, X = l·Y² + m·Y + n
Die nachstehenden entsprechenden Koeffizienten sind zu berechnen:
b = (lnq&sub2; - lnq&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;) = [ln(q&sub2;/q&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;)
d = lnq&sub2; - b·p&sub2; = (p&sub2;· lnq&sub1; - p&sub1;·lnq&sub2;)/(p&sub2; - p&sub1;)
e = [l/(b·q&sub1;) - (p&sub1; - p&sub0;)/(q&sub1; - q&sub0;)]/(q&sub1; - q&sub0;)
f = l/(b ·q&sub1;) - 2e·q&sub1;
g = p&sub0; - e·q&sub0;² - f·q&sub0;
l = [l/(b·q&sub2;) - (p&sub3; - p&sub2;)/(q&sub3; - q&sub2;)]/(q&sub2; - q&sub3;)
m = l/(b·q&sub2;) - 2·l·q&sub2;
n = p&sub2; - l·q&sub2;² - m·q&sub2;
Aus den berechneten Koeffizienten erfolgt eine Nachprüfung für den niedrigen Konzentrationsbereich (q&sub0; ≥ Y ≥ q&sub1;) und den hohen Konzentrationsbereich (q&sub2; ≥ Y ≥ q&sub3;) (Schritt 108). Wenn q&sub0; > -f/(2·e) > q&sub1;, hat die Regressionsfunktion X = e·Y² + f·Y + g für den niedrigen Konzentrationsbereich einen Extremwert (lokales Maximum) zwischen q&sub0; und q&sub1;. In diesem Fall kann die Regressionsfunktion nicht für die Kalibrierungskurve verwendet werden, da zwei Konzentrationen (X) für einen analytisch gemessenen Wert (Y) auftreten.
In ähnlicher Weise, wenn q&sub2; > -m/(2·l) > q&sub3; ist, hat die Regressionsfunktion X = l·Y² + m·Y + n bei dem hohen Konzentrationsbereich einen Extremwert (lokales Minimum) zwischen q&sub2; und q&sub3;. In diesem Fall kann die Regressionskurve nicht für die Kalibrierungskurve verwendet werden. Nur wenn die zwei oben beschriebenen Fälle nicht in der erstellten Formel vorkommen, gilt die Kalibrierungskurve als verifiziert.
Nachdem die Überprüfung in Schritt 108 abgeschlossen ist, werden die erhaltenen Regressionsfunktionen zum Kalibrierungsregenerator 20 gesendet, wo die Kalibrierungskurve erstellt wird (Schritt 110). Die erstellte Kalibrierungskurve wird im RAM 22 gespeichert. Werden analytisch gemessene Werte einer Testprobe eingegeben, findet die Ausgabevorrichtung die Analytkonzentration in der Testprobe, indem sie auf die im RAM 22 gespeicherte Kalibrierungskurve zurückgreift und die geschätzte Konzentration ausgibt.
Eine bevorzugte Probenanalysevorrichtung enthält eine Anzeige- oder Wamvorrichtung (nicht in Fig. 6 gezeigt) für Abweichungen (Fehler), wenn Abläufe zur Erstellung der Kalibrierungskurve in den obigen Schritten gestoppt oder unterbrochen werden. Es kann jede bekannte Anzeige- oder Wamvorrichtung verwendet werden.

Beispiele

Unter Einsatz eines trockenen Analyseelements zur Analyse von CRP, beschrieben in Beispiel 2 des ungeprüften japanischen Patents (KOKAI) Nr. 128655/1992, wurde eine Regressionsfunktion für eine Kalibrierungskurve bestimmt und erfindungsgemäß erstellt. Das Analyseelement umfasste eine Reagensschicht, eine Haftschicht, eine Ausbreitschicht aus Gewebe, die auf einem transparenten Träger in dieser Reihenfolge laminiert wurden. In der Ausbreitschicht sind Amylase-gebundene Anti-CRP-IgGs und das Substrat Carboxymethylstärke für markierte Enzymamylase imprägniert. In der Reagensschicht ist eine Indikatorzusammensetzung enthalten, welche abgebaute Produkte des Substrats Carboxymethylstärke nachweist. Die analytischen Elemente wurden insbesondere wie nachstehend beschrieben bergestellt.

(1) Synthese von Enzym-markierten Antikörpern

(1-1) Herstellung von CHM-Amylase

5 mg α-Amylase aus Bacillus subtilis wurden in 1 ml einer Lösung aus 0,1 M Glycerophosphat (pH 6,3) gelöst und es wurden 100 ul einer 2 mg/ml-Lösung [4-(Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure]succinimidester (CHMS) in DMF zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde in eine Sephadex-G- 25-Säule gefüllt und eine Lösung aus 0,1 M Glycerophosphat (pH 6,3) durch die Säule gegeben, so dass eine Eluatfraktion mit 4-(Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxyamido-α-Amylase (CHM-Amylase) bereitzustellen.

(1-2) Herstellung von Anti-CRP-Maus-IgG F (ab')&sub2;s

300 ug Papain wurden zu 10 mg Anti-CRP-Maus-IgG (in 2 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,5)) gegeben und 18 Stunden bei 37ºC gerührt. Eine 0,1 N NaOH-Lösung wurde zu der Reaktionsflüssigkeit zugegeben, um den pH-Wert davon auf pH 6,0 einzustellen. Die Flüssigkeit wurde dann in eine AcA-44-Gelsäure gefüllt, die zuvor mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3), enthaltend 1 mM EDTA, equilibriert worden war, und anschließend wurde mit der oben genannten Phosphatpufferlösung eluiert. Der Peakanteil des Eluats mit einem Molekulargewicht von etwa 100.000 wurde aufgefangen und zu 1 ml eingedickt, um die gewünschten Anti-CRP-Maus-IgG F (ab')&sub2;S zu gewinnen.

(1-3) Herstellung von gebundenen α-Amylase-Anti-CRP-Maus-IgG-Fab's

100 ul einer wässrigen 10 mg/ml-Lösung aus 2-Mercaptoethylamin-HCl-Salz wurde zu 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (enthaltend 1 mM EDTA, pH 6,0), welcher 6 mg der Anti- CRP-Maus-IgG-F(ab')&sub2;S aus Schritt (1-2) enthielt, gegeben und 90 Minuten bei 37ºC gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde einer Gelfiltration durch eine Sephadex-G-25- Säule unterzogen, welche zuvor mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3) equilibriert worden war, um nicht-umgesetztes 2-Mercaptoethylamin zu entfernen, so dass HS-Fab'-Fragmente gewonnen wurden. 2 mg der CHM-α-Amylase, hergestellt in Schritt (1-1), wurden zu den HS-Fab's zugegeben und 90 Minuten bei 37ºC umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann einer Gelfiltration mit einer AcA-34-Säule, die zuvor mit 0,1 M Phosphatgepufferter 5 mM Calciumchloridlösung (pH 7,0) equilibriert worden war, unterzogen, wobei eine Fraktion mit einem Molekulargewicht von nicht unter 200.000 gewonnen wurde; die Fraktion wurde dann eingedickt, wobei das gewünschte Konjugat aus α- Amylase und Anti-CRP-Maus-IgG-Fab's gewonnen wurde.

(2) Herstellung der Analyseelemente

Eine Reagenslösung mit einem Vernetzungsmittel wurde auf ein farbloses und transparentes Polyethylenterephthalat(PET)-Blatt (Träger) beschichtet, das mit einer Gelatine-Unterschicht überzogen war und eine Dicke von 180 um besaß. Das Blatt wurde dann getrocknet, wobei sich eine Reagensschicht bildete, worin die jeweiligen Bestandteile folgendes Deckvermögen hatten:
Alkali-behandelte Gelatine 14,5 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend (durchschnittlich) 9 bis 10 Oxyethyleneinheiten) 0,2 g/m²
Glucoseoxidase 5.000 U/m²
Peroxidase 15.000 U/m²
Glucoamylase 5.000 U/m²
2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)-4-[4-(dimethyl- amino)phenyl]-5-phenethyl-imidazol(Leuco-Farbstoff) acetat 0,38 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)-amino]methan 0,1 g/m²
Eine Haftschicht wurde auf die Reagensschicht aufgetragen, so dass sie nachstehende Deckkraft erhielt, und anschließend getrocknet.
Alkali-behandelte Gelatine 14,5 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)-amino]methan 0,1 g/m²
Anschließend wurde eine wässrige Lösung mit nachstehendem Reagens auf die Oberfläche der Haftschicht mit nachstehender Deckkraft aufgetragen, um die Gelatineschicht zum Aufquellen zu bringen, und es wurde ein Tricot-gestricktes Tuch, hergestellt durch Stricken von PET-gesponnenem Garn von 36 Gage, entsprechend 50 Deniers, und mit einer Dicke von etwa 250 um darauf geschichtet, indem es mit einem leichten gleichförmigen Druck angedrückt wurde, um eine poröse Ausbreitschicht herzustellen.
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend (durchschnittlich) 9 bis 10 Oxyethyleneinheiten) 0,15 g/m²
Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)-amino]-methan 0,4 g/m²
Danach wurde ein Substrat gebildet, indem ein Substrat beschichtet und dann getrocknet wurde, so dass es nachstehende Deckkraft erhielt, wobei das mehrschichtige Analyseelement zur quantitativen Analyse von CRP hergestellt wurde.
Carboxymethylstärke 4 g/m²
Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend (durchschnittlich) 9 bis 10 Oxyethyleneinheiten) 0,2 g/m²
Auf die Tricot-gestrickte Tuchschicht, die sowohl als Substratschicht als auch als Ausbreitschicht diente, wurde eine Lösung des Amylase-Anti-CRP-IgG-Konjugats (Synthesebeispiel (1)) in Ethanol aufgetragen und dann getrocknet, um eine Deckkraft von 3 mg/m² bereitzustellen. Das auf diese Weise hergestellte Analyseelement wurde in Plättchen von jeweils 15 mm · 15 mm geschnitten, und jedes Plättchen wurde in einen Diarahmen gegeben, wie beschrieben in dem ungeprüften japanischen Patent (KOKAI) Nr. 63452/1982, um eine Immunoassayplatte zur Analyse von CRP herzustellen.

(3) Messung

Auf den Immunoassay-Träger wurden 10 ul einer Probenlösung (50 mM Glycerophosphatpuffer: pH 7) mit einer bekannten Menge CRP getupft und der Träger bei 37ºC gehalten. Die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer Mittelwellenlänge von 650 nm wurde von der PET-Trägerseite gemessen. Die Differenzen der optischen Dichte (ΔOD&sub6;&submin;&sub4;, dODr) des jeweils gemessenen reflektierten Lichts nach Ablauf von 4 beziehungsweise 6 Minuten nach dem Auftragen, sind in Tabelle 3 zusammen mit den logarithmischen Werten gezeigt. Tabelle 3
Fig. 8 zeigt eine graphische Darstellung von Tabelle 3. Der mittlere Konzentrationsbereich, der den linearen Teil in Fig. 8 ausmacht, liegt zwischen Punkt A&sub1; (X = 1,4 mg/dl) und Punkt A&sub2; (X = 4,7 mg/dl). Hier werden durch Verwendung der Konzentrationen und der analytisch gemessenen Werte (dODr) der Probenlösungen, die in Tabelle 3 mit * markiert sind, A&sub0;, A&sub1;, A&sub2; und A&sub3; dargestellt. Das heißt:
A&sub0;: p&sub0; = 0,00, q&sub0; = 0,2360
A&sub1;: p&sub1; = 1,4, q&sub1; = 0,2003
A&sub2;: p&sub2; = 4,7, q&sub2; = 0,0993
A&sub3;: p&sub3; = 10,2, q&sub3; = 0,0587
Dann wurden folgende Formeln ermittelt:
bei q&sub0; ≥ Y ≥ q&sub1;, X = e·Y² + f·Y + g
bei q&sub1; ≥ Y ≥ q&sub2;, X = (lnY - d)/b
bei q&sub2; ≥ Y ≥ q&sub3;, X = l·Y² + m·Y + n
Die entsprechenden Koeffizienten wurden berechnet. Aus den zuvor beschriebenen Formeln (4), (5), (12), (13), (14), (20), (21) und (22) waren die Werte der Koeffizienten wie folgt:
b = (lnq&sub2; - lnq&sub1;)/(p&sub2; - p&sub1;) = -0,210532
d = lnq&sub2; - b·p&sub2; = -1,313295
e = [l/(b· q&sub1;) - (p, - p&sub0;)/(q&sub1; - q&sub0;)]/(q&sub1; - q&sub0;) = -433,3017
f = l/(b· q&sub1;) - 2e·q&sub1; = 149,84713
g = p&sub0; - e·q&sub0;² - f·q&sub0; = -11,23075
l = [l/(b·q&sub2;) - (p&sub3; - p&sub2;)/(q&sub3; - q&sub2;)]/(q&sub2; - q&sub3;) = 2115,1352
m = l/(b - q&sub2;) - 2·l·q³ = -467,8245
n = p&sub2; - l·q&sub2;² - m·q² = 30,331081
Fig. 9 zeigt die Kalibrierungskurve mit diesen Koeffizienten, Die Formelwerte aus dem Modell stimmen mit den Datenpunkten der Messwerte, gezeigt durch die Symbole , über den gesamten Konzentrationsbereich recht gut überein.
Als Vergleichsbeispiel wurde eine Kalibrierungskurve für die Daten der Tabelle 3 erstellt, wobei ein herkömmliches logistisches Kurvenmodell verwendet wurde. Fig. 10 ist die resultierende Kalibrierungskurve. Wie daraus zu sehen ist, unterscheiden sich die Modellformelwerte im hohen Konzentrationsbereich wesentlich von den gemessenen Datenpunkten. Im Gegensatz dazu stimmt die erfindungsgemäße Kalibrierungskurve aus Fig. 9 selbst im hohen Konzentrationsbereich recht gut mit den gemessenen experimentellen Datenpunkten überein.
Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, wird eine s-förmige Kalibrierungskurve erfindungsgemäß in drei Teile geteilt, mit einem niedrigen Konzentrationsbereich, der durch eine Funktion hoher Ordnung dargestellt wird, einem mittleren Konzentrationsbereich, der durch eine exponentielle Funktion dargestellt wird und einem hohen Konzentrationsbereich, der durch eine Funktion höherer Ordnung dargestellt wird. Die Grenzbedingungen zweier aneinander grenzender Funktionen werden so gewählt, dass die zwei Funktionen eine gleiche Steigung im Grenzpunkt aufweisen, wodurch die Regressionsfunktionen der Kalibrierungskurven in den entsprechenden Bereichen gefunden werden. Entsprechend kann die Anzahl der zu analysierenden Standardproben zum Auffinden einer Kalibrierungskurve klein sein, während die erhaltene Kalibrierungskurve eine hohe Genauigkeit aufweist.

Claims

1. Verfahren zur quantitativen Analyse eines Analyts in einer Probe unter Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve, welche unter Verwendung der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen des Analyts in Standardproben und analytischen gemessenen Werten der Standardproben erstellt worden ist:

wobei die Kalibrierungskurve wie folgt in mindestens drei Teile unterteilt ist:

(a) einen Teil der Kalibrierungskurve für einen niedrigen Konzentrationsbereich, welcher durch eine mehrgradige Funktion dargestellt ist,

(b) einen Teil der Kalibrierungskurve für einen mittleren Konzentrationsbereich, welcher durch eine exponentielle Funktion dargestellt ist, und

(c) einen Teil der Kalibrierungskurve für einen hohen Konzentrationsbereich, welcher durch eine mehrgradige Funktion dargestellt ist;

und wobei die benachbarten beiden Teile der Kalibrierungskurve an den Grenzen der entsprechenden obigen Konzentrationsbereiche eine identische Steigung aufweisen.

2. Verfahren zur Bestimmung einer Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve zur quantitativen Analyse eines Analyts, wobei die Kalibrierungskurve unter Verwendung der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen des Analyts in Standardproben und analytischen gemessenen Werten der Standardproben erstellt worden ist,

wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Darstellen der Kalibrierungskurve für einen niedrigen Konzentrationsbereich durch eine mehrgradige Funktion;

(b) Darstellen der Kalibrierungskurve für einen mittleren Konzentrationsbereich durch eine exponentielle Punktion;

(c) Darstellen der Kalibrierungskurve für einen hohen Konzentrationsbereich durch eine mehrgradige Funktion; und

(d) Annehmen als Grenzbedingungen für die entsprechenden obigen Konzentrationsbereiche, dass die benachbarten beiden Teile der Kalibrierungskurve an den Grenzstellen eine identische Steigung aufweisen, wodurch die Funktionen der Kalibrierungskurve für die entsprechenden Konzentrationsbereiche festgelegt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die mehrgradigen Funktionen, welche den niedrigen Konzentrationsbereich und den hohen Konzentrationsbereich darstellen, quadratische Funktionen sind.

4. Verfahren zum Erstellen einer Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve zur quantitativen Analyse eines Analyts, wobei die Kalibrierungskurve durch Auftragen der Wechselbeziehung zwischen der bekannten Konzentration von in Standardproben enthaltenen Analyten und analytischen gemessenen Werten der Standardproben in ein rechtwinkliges Koordinatensystem gezeichnet wird, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Auftragen entsprechender Konzentrationen (pi) des Analyts in der Standardprobe und der logarithmischen Werte (log qi) der entsprechenden analytischen gemessenen Werte (qi) in das rechtwinklige Koordinatensystem;

(b) Finden eines mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;), welcher einen linearen Abschnitt in diesem semi-logarithmischen Graph darstellt;

(c) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils dieses mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;) durch

Y = exp(b·X + d)

d. h.

X = (lnY - d)/b (1),

wobei Y der analytisch gemessene Wert (qi), wie beispielsweise optische Dichte oder eine andere physikalische Größe, ist, wobei X die Konzentration des Analyts in der Standardprobe (pi) ist und wobei b und d Koeffizienten darstellen;

(d) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des niedrigen Konzentrationsbereichs (von der minimalen Konzentration p&sub0; in den Standardproben zu der Konzentration p&sub1;) durch

X = e·Y² + f·Y + g (2),

wobei e, f und g Koeffizienten darstellen;

(e) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des hohen Konzentrationsbereichs (von der Konzentration p&sub2; zu der maximalen Konzentration p&sub3; in den Standardproben) durch

X = l·Y² + m·Y + n (3),

wobei l, m und n Koeffizienten darstellen;

(f) Festsetzen von Grenzbedingungen derart, dass der differenzierte Wert (dX/dY) der Formel (1) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (2) an der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) und der differenzierte Wert (dX/dY) der Formel (2) an der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) dem differenzierten Wert (dX/dY) der Formel (3) an der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) entspricht; und

(g) Berechnen entsprechender Koeffizienten in den Formeln (1), (2) und (3) und davon ausgehend Auffinden der stetigen Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve für den gesamten Konzentrationsbereich, welcher den Bereich von p&sub0; bis p&sub3; abdeckt.

5. Verfahren zum Erstellen einer Regressionsfunktion einer Kalibrierungskurve zur quantitativen Analyse eines Analyts, wobei die Kalibrierungskurve durch Auftragen der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen von in Standardproben enthaltenen Analyten und analytischen gemessenen Werten der Standardproben in ein rechtwinkliges Koordinatensystem gezeichnet wird, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen eines mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;), welcher vorläufig als der Bereich eines linearen Abschnitts in einem semi-logarithmischen Graph, bei dem entsprechende Konzentrationen (pi) des Analyts in den Standardproben und der logarithmischen Werte (log qi) der entsprechenden analytisch gemessenen Werte (qi) in einem rechtwinkligen Koordinatensystem aufgetragen sind, definiert ist, wobei der lineare Abschnitt an beiden Enden die Immediatkonzentrationen p&sub1; und p&sub2; auf weist;

(b) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils eines mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;) durch

Y = exp(b·X + d),

d. h.

X = (nY - d)/b (1),

wobei Y den analytischen gemessenen Wert (qi), wie beispielsweise optische Dichte oder eine andere physikalische Messgröße, bezeichnet, wobei X die Konzentration des Analyts in der Standardprobe (pi) bezeichnet und wobei b und d Koeffizienten darstellen;

(c) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des niedrigen Konzentrationsbereichs (von der minimalen Konzentration p&sub0; in der Standardprobe zu der Konzentration p&sub1;) durch

X = e·Y² + f·Y + g (2),

wobei e, f und g Koeffizienten darstellen;

(d) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des hohen Konzentrationsbereichs (von der Konzentration p&sub2; zu der maximalen Konzentration p&sub3; in der Standardprobe) durch

X = l·Y² + m·Y + n (3),

wobei l, m und n Koeffizienten darstellen;

(e) Festsetzen von Grenzbedingungen derart, dass der differenzierte Wert (dX/dY) von der Formel (1) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) dem differenzierten Wert (dX/dY) von der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) und der differenzierte Wert (dX/dY) von der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub2;-q&sub2;) dem differenzierten Wert (dX/dY) von der Formel (3) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) entspricht; und

(f) Berechnen entsprechender Koeffizienten in den Formeln (1), (2) und (3) und ausgehend davon Auf finden der stetigen Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve für den gesamten Konzentrationsbereich, welcher den Bereich von p&sub0; bis p&sub3; abdeckt.

6. Vorrichtung zur quantitativen Analyse eines Analyts in einer Probe unter Bezugnahme auf eine Kalibrierungskurve, welche unter Verwendung der Wechselbeziehung zwischen den bekannten Konzentrationen des Analyts in Standardproben und analytischen gemessenen Werten der Standardproben erstellt worden ist, wobei die Vorrichtung umfasst:

1) Eingabemittel zum Eingeben der bekannten Konzentrationen (pi) des Analyts in mehreren Standardproben und ihre analytischen gemessenen Werte (qi);

2) einen Prozessor zum Empfangen der Dateneingabe von den Eingabemitteln und zum Ausführen der nachfolgend erwähnten Operationen, um eine Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve auf Grundlage der Eingabe (pi) und (qi) zu bestimmen,

wobei die Operationen die Schritte umfassen:

(a) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils eines mittleren Konzentrationsbereichs (p&sub1;-p&sub2;), welcher als der Bereich eines linearen Abschnitts in einem semi-logarithmischen Graph definiert ist, in dem entsprechende Konzentrationen (pi) der Standardprobe und der logarithmischen Werte (log qi) der entsprechenden analytischen gemessenen Werte (qi) in einem rechtwinkligen Koordinatensystem aufgetragen sind, wobei der lineare Abschnitt an beiden Enden die Immediatkonzentrationen p&sub1; und p&sub2; aufweist, durch

y = exp(b·X + d),

d. h.

X = (lnY - d)/b (1),

(b) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des niedrigen Konzentrationsbereichs (von der minimalen Konzentration p&sub0; in der Standardprobe zu der Konzentration p&sub1;) durch

X = e·Y² + f·Y + g (2),

wobei e, f und g Koeffizienten darstellen;

(c) Ausdrücken des Kalibrierungskurventeils des hohen Konzentrationsbereichs (von der Konzentration p&sub2; zu der maximalen Konzentration p&sub3; in der Standardprobe) durch

X = l·Y² + m·Y + n (3),

wobei l, m und n Koeffizienten darstellen;

(d) Festsetzen von Grenzbedingungen derart, dass der differenzierte Wert (dX/dY) von der Formel (1) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) dem differenzierten Wert (dX/dY) von der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub1;, q&sub1;) und der differenzierte Wert (dX/dY) von der Formel (2) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) dem differenzierten Wert (dX/dY) von der Formel (3) bei der Koordinate (p&sub2;, q&sub2;) entspricht; und

(e) Berechnen entsprechender Koeffizienten in den Formeln (1), (2) und (3) und ausgehend davon Auffinden der stetigen Regressionsfunktion der Kalibrierungskurve für den gesamten Konzentrationsbereich, welcher den Bereich von p&sub0; bis p&sub3; abdeckt;

3) einen Kalibrierungskurvengenerator zum Erzeugen der Kalibrierungskurve, welche zur quantitativen Analyse des in einer Testprobe enthaltenen Analyts verwendet werden soll, wobei die Kalibrierungskurve ausgehend von der durch den Prozessor bestimmten Regressionsfunktion erstellt wird.