DE60116172T2

DE60116172T2 - Immunoassay für C-reaktives Protein

Info

Publication number: DE60116172T2
Application number: DE60116172T
Authority: DE
Inventors: Edward R. Scalice; John L. Daiss
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-03-31
Also published as: ATE314653T1; EP1139101B1; EP1139101A9; DK1139101T3; ES2254330T3; US20020142356A1; EP1139101A3; JP5031148B2; DE60116172D1; HK1038069A1; JP2002040024A; US6838250B2; EP1139101A2

Description

Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro-Diagnostic Immunoassay zum Nachweis von C-reaktivem Protein (CRP).
Hintergrund der Erfindung
Die meisten Immunoassays für hohe Konzentrationen und hohe Molekulargewichte laufen nur unter Schwierigkeiten auf klinisch chemischen Analysegeräten, die kolorimetrische oder chemilumineszente Nachweisverfahren verwenden.
Typischerweise nutzen, die am Markt befindlichen Immunoassays für hohe Molekulargewichte und hohe Konzentrationen die Multivalenz des Analytes als Vorhersage. Am Ende wird das Analyt mit irgendeinem Cross-Linking-Verfahren nachgewiesen, sei es durch Agglutination (in turbidometrischen oder nephelometrischen Assays), durch Präzipitation (radiale Immunodiffusion) oder durch Sandwich-Immunoassays. Diese Arten von Immunoassays haben alle signifikante Nachteile, wenn sie auf automatisierte Systeme übertragen werden. Radial-Immuno-Diffusionsassays sind sehr langsam (Stunden bis Tage) und benötigen erheblich Mengen an sorgsam ausgewähltem Antiserum. Agglutination-basierte Assays benötigen sowohl anfängliche Verdünnung als auch erhebliche Mengen an Immuno-Materialien. Darüber hinaus benötigt jedes dieser Verfahren spezielle optische Systeme, die in aller Regel nicht in heutigen klinischen Analysegeräten vorhanden sind. Sandwich- oder „two-site"-Immunoassays benötigen entweder hohe anfängliche Verdünnungen oder ungewollt hohe Konzentrationen teuerer Immuno-Materialien.
Die Fähigkeit der heutigen Immunoassayformate ist dort am ausgeprägtesten, wo es um Analyte mit hohen Konzentrationen und niedrigen Molekulargewichten geht, wie bei therapeutischen Medikamenten oder Drogen. Traditionell basieren diese kompetitiven Immunoassays auf der Kompetition einer limitierten Anzahl von Medikament-spezifischer Bindungsstellen (immobilisierte Antikörpermoleküle), zwischen frei verfügbarem Medikament und einem Enzym, bestehend aus einem vom Medikament stammenden Hapten und Meerrettich-Peroxidase (HRP). Typischerweise beinhalten die Selektionskriterien für die Reaktion dieser diagnostischer Tests folgendes: 1. Die Kd (Dissoziationskonstante) des Medikaments-Antikörper-Komplexes muß (innerhalb eines Faktors 10) ähnlich der Konzentration des Medikamentes im Serum der Probe sein, 2. die Kd des Markierung:Antikörper-Komplexes muß wesentlich niedriger (1 bis mehrere Ordnungen niedriger, abhängig von der Konzentration des Analyten) sein, als die des Wirkstoff:Antikörper-Komplexes, unter den gleichen Bedingungen. Ein Problem, dem man begegnet, ist die Herstellung von Antikörpern und Markierungen mit den nötigen Affinitätserfordernissen.
Es ist schwierig, die obigen Bedingungen in Bezug auf hohe Konzentrationen und hohes Molekulargewicht der Analyte zu erfüllen. Insbesondere die zweite Bedingung (höhere Affinität für das markierte Analyt) welche oben angegeben ist, ist schwierig zu erfüllen. Für kleine Moleküle, wie Medikamente, kann die Affinität des Antikörpers für die Markierung durch verschiedene Effekte erhöht werden. So zum Beispiel durch den „Linkereffekt" (zusätzliche Bindungsenergie aufgrund einer Interaktion des Antikörpers mit dem Linker), multiple Substitution der Markierung mit dem Hapten und, möglicherweise, eine vorteilhafte Orientierung des Medikaments auf der Markierungsoberfläche. Äquivalente Effekte für makromolekulare Analyte sind nicht wahrscheinlich, da das Epitop für die Interaktion mit dem Analyt und dem Analyt:Enzymkonjugat identisch ist und gänzlich auf dem Analyten liegt. Anders ausgedrückt, der Analyt sieht für den Antikörper jeweils gleich aus, ob er frei in Lösungen vorkommt oder konjugiert an ein HRP-Molekül.
Kompetitive Immunoassays, welche von C-reaktivem-Protein (CRP) in quantitiver Art verwendet werden, sind aus dem Stand der Technik bekannt. Englebienne und Weiland (Journal of Immunological Methods (1996), 191: 159–170) offenbaren die Verwendung eines Referenzanalyten (Antigen der mit dem CRP-Analyten kompetitiert) für die Bindung an den Anti-Analyt-Antikörper.
Monoklonale Antikörper gegen C-reaktives-Protein sind aus dem Stand bekannt. So offenbart beispielsweise WO 91/00872 eine Hybridoma-Zellinie, die in der Lage ist, ein anti-human CRP-Antikörper herzustellen, welcher ein Calzium-unabhängiges Epitop auf nativem humanem CRP erkennt. Kilpatrick et al. (Molecular Immunology) 1982) 19: 9 Seite 1159–1165) offenbaren die Herstellung zweier monoklonaler Antikörper, die CRP in der Gegenwart von 2,5 mM CA²⁺ binden. Ein vierter monoklonaler Antikörper gegen CRP wird weiter offenbart, der die Gegenwart von Ca²⁺ nicht benötigt.
Immunoassaysysteme, welche anti-ideotypische Antikörper an Stelle von Antigenen verwenden, sind gleichermaßen aus dem Stand der Technik bekannt. US 4,699,880 offenbart solche kompetitive Immunoassays und Verfahren, um anti-ideotypische-Antikörper herzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir haben die Unzulänglichkeiten der Verwendung konventioneller Verfahren für den Nachweis von Analyten mit hoher Konzentration und niedrigem Molekulargewicht in einer Situation, wo der Zielanalyt in hoher Konzentration mit hohem Molekulargewicht vorliegt. Wir beschreiben hierin ein Verfahren zur Gewinnung von anti-ideotypischen monoklonalen Antikörperpopulationen, die sich gegen einen Antikörper richten, welcher spezifisch ist für ein Antigen-Target mit hoher Konzentration, mit hohem Molekulargewicht und wobei besagte anti-ideotypische Antikörperpopulationen eine große Spanne an Bindungsaffinitäten für den ausgewählten Antikörper hat, welcher spezifisch ist für besagtes Target-Antigen und wobei eine Untergruppe jener anti-ideotypischer Antikörperpopulationen ausgewählt werden kann, mit der benötigten Affinität für eine bestimmte Anwendung. Anti-ideotypische Antikörperpopulationen werden ausgewählt, die eine hohe Affinität für den Antikörper haben, der gegen das Zielantigen gerichtet ist, wobei diese Affinität höher ist als die, des Zielantikörpers für den Antikörper. Zusätzlich, beschreiben wir ein Verfahren wie man einen Antikörper mit niedriger Affinität für das Zielantigen erhält.
Diese Erfindung betrifft neue CRP-Immunoassayzusammensetzungen. Besagte Zusammensetzungen umfassen den anti-human-CRP monoklonalen Antikörper mit niedriger Affinität (Kd ~ 10^–7 M) (CRPS-23), und einen anti-ideotypischen Antikörper, welcher gegen CRPS-23 gezogen wurde. Wir haben herausgefunden, daß bei der Bindung von CRPS-23 and CRP vorteilhafterweise die Bindung nicht sensitiv ist für ionisiertes Calcium. Die Hybridom-Zellinie für diesen Antikörper wurde mit der Nummer PTA-1354 bei der ATCC hinterlegt.
In einer weiteren Ausführungsform unserer Erfindung, bezieht sich unsere Erfindung auf Verfahren für kompetitive Immunoassays, Kits und insbesondere auf einen Immunoassay für CRP. Ausgehend von einem Antikörper, welcher die geeignete Affinität für das Targetanalyt (anti-Analyt-Antikörper) aufweist, ist es möglich, einen anti-ideotypischen Antikörper herzustellen und auszuwählen, welcher i) eine hohe Affinität für den anti-Analyt-Antikörper auf weist und ii) welcher mit dem Target-Antigen in einer beidseitigen sich ausschließenden Weise kompetitiert, um die Bindung an den anti-Analyt-Antikörper.
Wir beschreiben im folgenden die Entwicklung eines kompetitiven Enzymimmunoassays für humanes C-reaktives Protein basierend auf der Verwendung von anti-ideotypischen Antikörpern, welche eine höhere Affinität als CRP für einen anti-CRP-Antikörper haben. Die Erfindung umfaßt zwei neue Immuno-Materialien. Das erste ist ein monoklonaler Antikörper gerichtet gegen humanes CRP mit verhältnismäßig niedriger Affinität, CRPS-23 der zusätzlich die sehr vorteilhafte Eigenschaft hat, daß dessen Interaktion mit CRP unempfindlich für ionisiertes Calcium ist (K_D differiert um weniger als Faktor 2, wenn [CA^D] variiert wird von 0 bis 1 mM). Die Konformation von CRP ist abhängig von Calcium und die Tatsache, daß die Bindung des Antikörpers an CRP hiervon nicht so sehr abhängt, ist nützlich und in der Tat sogar vorteilhaft. Da biologische Proben, welche das Antigen CRP beinhalten, unterschiedliche Calciumwerte haben können, ist eine Bindungsunempfindlichkeit vorteilhaft in einem Immunoassay für CRP.
Das zweite Immuno-Material ist ein anti-ideotypischer Antikörper, welcher gegen CRPS-23 gezogen wurde und welcher ausgewählt wurde, aufgrund der Fähigkeit mit humanem CRP um die Bindung an CRPS-23 zu kompetitieren, so daß sich die Bindung von CRP und die Bindung des anti-ideotypischen Antikörpers an CRPS-23 gegenseitig ausschließen. Eine Hybridom-Zellinie, die in der Lage ist, einen solchen anti-ideotypischen Antikörper zu generieren, wurde unter der Nummer PTA-1353 bei der ATCC hinterlegt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Durchführen eines kompetitiven Immunoassays zum Nachweis von C-reaktivem-Protein, umfassend die folgenden Schritte, zur Verfügung: entweder In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem immobilisiertem anti-human-C-reaktivem-Protein-Antikörper mit einer Affinität für CRP, die Näherungsweise 10^–7 M ist, und einem markiertem anti-ideotypischen Antikörper, der an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) mit relativ hoher Affinität (Kd < 10^–8 M) binden kann, wobei die Bindung am CRPS-23 (ATCC PTA-1354) die Bindung an C-reaktives Protein ausschließt und umgekehrt oder In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem immobilisierten anti-ideotypischen Antikörper, der an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) mit relativ hoher Affinität (Kd < 10^–8 M) binden kann, wobei die Bindung an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) die Bindung an C-reaktives Protein ausschließt und umgekehrt und mit einem markierten anti-human-C-reaktivem-Protein-Antikörper mit einer Affinität für CRP, die Näherungsweise 10^–7 M ist; Nachweisen der Markierung; und Korrelieren des Nachweises der Markierung mit der Menge an C-reaktivem-Protein in der Probe.
Bevorzugterweise ist der anti-human-C-reaktive-Protein-Antikörper, welcher in der vorliegenden Erfindung Verwendung findet CRPS-23 (ATCC PTA-1354) und der anti-ideotypische Antikörper ist in der Lage an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) zu binden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch einen Kit für einen kompetitiven Immunoassay zur Verfügung, umfassend: einen ersten Antikörper, wobei der erste Antikörper einen anti-human-C-reaktives-Protein-Antikörper mit einer Affinität für CAP ist, die näherungsweise 10^–7 M ist; und einen zweiten Antikörper, wobei der zweite Antikörper ein anti-ideotypischer Antikörper ist, der an den ersten Antikörper binden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine Hybridom-Zellinie zur Verfügung, identifiziert als CRPS-23 (ATCC PTA-1354), die einen anti-human-C-reaktives-Protein-Antikörper mit niedriger Affinität erzeugen kann. Die Erfindung stellt weiter ein anti-ideotypischen Antikörper zur Verfügung, der gegen einen anti-human-C-reaktives-Protein-Antikörper mit niedriger Affinität erzeugt worden ist, der an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) mit einer relativ hohen Affinität (Kd < 10^–8 M) binden kann, wobei die Bindung an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) die Bindung an C-reaktives Protein ausschließt und umgekehrt. Die vorliegende Erfindung stellt weiter eine Hybridom-Zellinie zur Verfügung, identifiziert als C23id26.3 (ATCC PTA-1353), die anti-ideotypischen Antikörper erzeugen kann.
Wenigstens zwei in der Vergangenheit erteilte U.S. Patente beschreiben Immunoassays, welche anti-ideotypische Antikörper verwenden: U.S. Patent Nr. 4,828,981, erteilt am 9. Mai 1989 und U.S. Patent Nr. 5,219,730, erteilt am 15. Juni 1993.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: zeigt einen Graphen, welcher die Schätzung von Affinitätskonstanten für Kompetitionsprofile von anti-CRP-Antikörpern und löslichem CRP in einem ELISA wiedergibt. Dargestellt sind 5 Kompetitionsprofile von Antikörpern gegen CRP, die eine Bandbreite von Affinitäten aufzeigen, die wiederum mittels Konzentrationsmessungen von CRP, welches eine 50%ige Reduktion der Maximalabsorption ergibt, ermittelt wurden. Der nominal Affinitätswert für CRPS-10 ist 0,4 nM und der nominal Affinitätswert für CRPS-23 ist 0,4 μM.
2: zeigt zwei Formate, wie sie bei kompetitiven Immunoassays gestaltet sein können, unter Verwendung eines anti-CRP-Antikörpers mit niedriger Affinität sowie dem korrespondierenden anti-ideotypischen Antikörper. Im Format 1 (2A) wird der anti-ideotypische Antikörper C23id2-6.3, welcher als CRP-Surrogat dient an der Oberfläche einer Plastikmikrotiterplatte fixiert. Der HRP-konjugierte anti-CRP-monoklonale-Antikörper CRPS-23 wird zusammen mit der Probe in das Reaktionsgefäß gegeben, in dem CRP vorliegt. Schlußendlich reflektiert die Menge an HRP-CRPS-23, die an den immobilisierten anti-ideotypischen Antikörper bindet, die Menge an CRP. Im Format 2 (2B) ist der CRPS-23 monoklonale Antikörper immobilisiert und der HRP-konjugierte anti-ideotypische Antikörper kompetitiert in der Probe mit CRP, um die Bindungsstellen des CRPS-23.
3: CRP-Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurven für jedes Format in konventionellen Mikrotiterplatten. Beide Formate weisen für steigende Konzentrationen an CRP fallende Dosis-Wirkungs-Kurven auf, und die Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve liegt jeweils für jeden Assay in dem jeweils klinisch relevanten Bereich. Format 1 wird in (A) gezeigt; Format 2 wird in (B) gezeigt. Die Absorption bei 414 nm spiegelt die Menge an detektierbarer HRP-Aktivität wieder. In (A) definieren die diamantförmigen Punkte die Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve mit dem immobilisierten C23id2-6,3 und dem HRP-markierten CRPS-23; die geschlossenen, schwarzen Vierecke definieren die Dosis-Wirkungs-Beziehung für den Fall, bei dem CRPS-23 substituiert wurde für C23id2-6,3, als Kontrolle. In (B) definieren die geschlossenen schwarzen Vierecke die Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve, die erhalten wurde für immobilisiertes CRPS-23, und mit HRP-markierten C23id2-6,3; die geschlossenen schwarzen Diamanten definieren die Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve, bei dem C23id2-6,3 als Kontrolle substituiert wurde für CRPS-23.
4: CRP-Dosis-Wirkungs-Kurven der Formate 1 und 2 in Dünn-Film-Immunoassays unter Verwendung von gespotteten Markierungen. In jedem Format wurde der immobilisierte Antikörper in einem Trockenfilm inkorporiert mittels Beschichtungsverfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Das HRP-markierte Reagenz wurde mit der Probe, die CRP enthielt, vermischt, und das Gemisch mittig auf den dünnen Film gespottet. Nach 5-minütiger Inkubation wurde der dünne Film gewaschen, und zwar durch kontrollierte Zugabe einer Waschlösung, um ungebundene Elemente an die Ränder der Inkubationszonen zu treiben. Die gebundene Fraktion (HRP-Aktivität) wurde mittels simultaner Zugabe von Peroxid gemessen, das eine Farbentwicklung, die von einem Farbstoff stammte, der zuvor in den Dünn-Film eingebracht worden war, herrührte. Die maximale Farbentwicklung (V_max) ist als Funktion von [CRP] geplottet. Format 1 wird mit geschlossenen schwarzen Vierecken dargestellt. Format 2 wird mit geschlossenen schwarzen Kreisen dargestellt.
5: CRP-Dosis-Wirkungs-Kurven bei Dünn-Film-Immunoassays unter Verwendung von Markierungen, welche mittels Tintenstrahldruck inkorporiert wurden. Format 1 wird mit schwarzen geschlossenen Vierecken dargestellt; Format 2 mit schwarzen geschlossenen Dreiecken.
6: CRP-Dosis-Wirkungs-Kurven bei Dünn-Film-Immunoassays unter Verwendung von Markierungen, welche mittels Tiefdruck inkorporiert wurden. HRP-Konjugate wurden mittels Tiefdruck auf Immuno-Rate-Dünn-Film-Beschichtungen aufgebracht, welche den immobilisierten komplementären Antikörper enthielten. Serumproben, die CRP in verschiedenen Konzentrationen enthielten, wurden auf Beschichtungen der jeweiligen Formate gespottet. Nach 5-minütiger Inkubation wurde der Dünn-Film gewaschen, und zwar durch kontrollierte Zugabe einer Waschflüssigkeit, um auf diese Weise ungebundene Elemente an den Rand der Inkubationszone zu treiben. Die gebundene Fraktion (HRP-Aktivität) wurde mittels gleichzeitiger Zugabe von Peroxid, welches eine Farbreaktion zur Folge hatte, die durch einen zuvor eingebrachten Farbstoff in den Dünn-Film, hervorgerufen wurde. Die maximale Rate an Farbentwicklung (V_max) ist als Funktion von [CRP] geplottet. Format 1 wird mit geschlossenen kreisen dargestellt; Format 2 mit geschlossenen schwarzen Vierecken.
7: CRP-Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurven von Immunoassays, die für den VITROS^® ECi automatisierten Immunoassayanalizer konfiguriert wurden. In diesen Variationen ist die immobilisierte Komponente konjugiert mit Biotin und zunächst anfänglich als lösliche Komponente vorhanden. 50 μl des biotinylierten Reagenz wurden einem Streptavidin-beschichteten Reaktionsgefäß zugegeben, und zwar nach der Zugabe von 40 μl einer Probe, welche CRP beinhaltete, und vor der Zugabe von 50 μl des HRP-konjugierten Reagenzes. Nach 8-minütiger Inkubation wurde das Reaktionsgefäß ausgiebig gewaschen und die mit dem Reaktionsgefäß assoziierte HRP-Aktivität wurde mittels einem chemilumineszenten Substrat nachgewiesen. Format 1 wird in (A) gezeigt; Format in (B).
Detaillierte Beschreibung
Anti-ideotypische Antikörper, wie sie hierin beschrieben werden, sind definitionsgemäß Antikörper, die an die V_H und/oder V_L-Domäne des verwandten Antikörpers, in diesem Fall CRPS-23, binden. Vorliegend hat der Anti-Ideotyp zusätzlich die Eigenschaft, dessen Bindung an dessen verwandten Antikörper die Bindung des Analyten CRP ausschließt. Eine „Probe" geschlossen, wie sie hierin verwendet wird, bezieht sich auf jegliche Substanz, die ein Analyt von Interesse beinhalten könnte.
Eine „Probe" kann eine biologische Flüssigkeit sein, sowie gesamtes Blut oder Gesamtblutkomponenten, einschließlich roter Blutkörperchen, weißer Blutkörperchen, Blutplättchen, Serum und Plasma, Aszites, Harn, Cerebrospinalflüssigkeit, und andere Bestandteile des Körpers, welche möglicherweise des Analyt des Interesses beinhalten könnten. Optional können Proben auch erhalten werden aus Wasser, Erde und der Vegetation.
Ein kompetitiver Immunoassay bezieht sich auf einen Immunoassay, der so gestaltet ist, daß das Analyt, welches gemessen werden soll und ein markiertes Nachweismolekül um eine begrenzte Anzahl sich gegenseitig ausschließender Bindungsstellen kompetitieren. Bei diesen Arten von Immunoassays steht die Menge an Analyt in einem inversen Verhältnis zur Bindung des Nachweismoleküls.
Der Assay kann mit jeder Enzymmarkierung durchgeführt werden, die an ein Nachweismolekül gebunden werden kann, so daß ein Markierungs-Nachweis-Molekül entsteht. Enzyme wie Oxidasen, zum Beispiel Glukoseoxidase, Peroxidasen, zum Beispiel Meerrettichperoxidase (HRP), alkalische Phosphatase und Galaktosidasen sind bevorzugte Markierungen.
Ein Fachmann, wie zum Beispiel ein klinischer Chemiker ist in der Lage ein geeignetes Substrat für eine gegebene Markierung festzulegen. Das Substrat kann ein Material sein, welches direkt durch die Enzymmarkierung umgesetzt wird oder ein Material, welches in einer Reihenfolge von Reaktionen involviert ist, die eine enzymatische Reaktion der Markierung beinhaltet.
Andere Markierungen, die effektiv bei der Erfindung eingesetzt werden können: fluoreszente Markierungen, wie zum Beispiel Fluoreszein, Dansyl; chemilumineszente Markierungen und radioaktive Markierungen einschließlich zum Beispiel ¹²⁵I oder ¹⁴C.
Die Effektivität und Vorteile der Erfindung werden näher durch die folgenden Beispiele illustriert.
Beispiel 1 Herstellung eines anti-CRP-monoklonalen-Antikörpers mit niedriger Affinität.
Die Konzentrationsspanne von C-reaktivem Protein, welche in humanem Serum gefunden wurde, beginnt bei einem normalen Wert von weniger als 5 mg/l (40 nM) und reicht bis zu 300 mg/l (2,6 μM). Um einen geeigneten kompetitiven Immunoassay für CRP zu entwickeln, war es nötig einen monoklonalen Antikörper hervorzubringen, der eine Kd für CRP innerhalb der gleichen Konzentrationsspanne, d.h. zwischen 40 nM und 2,6 μM, hat. Monoklonale Antikörper gegen CRP wurden nach Immunisierung von CAFI-Mäusen, generiert mit CRP-Limulus Hemocyanin-Konjugaten und mittels eines ELISA auf die Bindung von CRP hin gescreent. Resultierende CRP-reaktive Kulturen wurden kloniert und die ausgestoßenen Antikörper auf Affinität für CRP mittels kompetitiver ELISA-Technik gemessen. Anfänglich wurden die Antikörperkulturen auf einer CRP-ELISA-Platte titriert, um die Konzentration zu ermitteln, bei der die höchste Absorption ein Plateau erreicht. Die niedrigste Konzentration, bei der das Plateau maximaler Absorption auftrat, wurde in einem kompetitivem ELISA verwendet, um sicherzustellen, daß die Antikörperkonzentration limitierend ist. Lösliches CRP, bei variierenden Konzentrationen, wurde mit Proben-Antikörper vermischt und danach auf die ELISA-Platte gegeben, um ein Inhibitionsprofil zu erhalten. Konzentration, welche eine 50%ige Reduktion der höchsten Absorption aufzeigte, stellt in etwa den Kd der Antikörper:CRP-Interaktion dar. 1 zeigt Affinitätsmessungen verschiedener Antikörper wie sie von ihrem Inhibitionsprofil herrühren. Antikörper CRPS-23 (IgGl, κ) zeigte einen Kd von 0,4 μM, was die erste wichtige Voraussetzung erfüllte (relativ niedrige Affinität für das Analyt), die nötig war, bei der Entwicklung eines kompetitiven Immunoassays für CRP.
Beispiel 2 Herstellung eines anti-ideotypischen Antikörpers gegen CRPS-23.
CAFI-Mäuse wurden mit CRPS-23-Antikörper konjugiertem Limulus Hemocyanin immunisiert. Die Mäuse wurden geopfert und Splenozyten wurden von den immunisierten Mäusen erhalten, welche mit SP2/0-Ag14-Myelomazellen fusioniert wurden. Die resultierenden Hybridom-Zellinien wurden zunächst mittels konventionellem ELISA gescreent, auf die Sekretion von Antikörpern welche das immobilisierte Fab-Fragment, welches aus CRPS-23 gewonnen worden war, binden. Dieser Screen definierte eine Population von Antikörpern mit nominal Reaktivität für das CRPS-23-Fab-Fragment.
Weitere Selektion wurde durchgeführt, um jene Antikörper zu identifizieren, mit essentiellen Eigenschaften für den kompetitiven Immunoassay. Die Kriterien für die Auswahl eines geeigneten anti-ideotypischen Antikörpers waren:

1. er sollte CRPS-23 mit relativ hoher Affinität (Kd < 10^–8 M) binden, und
2. die Bindung an CRPS-23 sollte die Bindung an den Analyten CRP ausschließen.

Positive Klone wurden erneut mittels Oberflächenplasmonenresonanz, mittels eines Biacore-Instrumentes, gescreent, um die Affinität des anti-ideotypischen Antikörpers für CRPS-23 (reflektiert durch dessen „off-Rate") zu messen und die gegenseitige Exklusivität der Bindung zu messen. Hasen-anti-Maus-IgG (FC) wurde auf der Biosensoroberfläche immobilisiert und verwendet, um anti-ideotypische Antikörper des Überstandes der Hybridoma-Kulturen einzufangen. CRPS-23-Fab-Fragmente mit einer Konzentration von 0,2 nM wurden alleine und in Gegenwart von 0,9 nM CRP über der Oberfläche des immobilisierten anti-ideotypischen Antikörpers injiziert und die relative Massenakkumulation verglichen. Ein anti-ideotypischer Anikörper, C23id2-6,3 (IgGl, κ) erfüllte unsere Kriterien für einen anti-ideotypischen Antikörper. Dieser hat das Fab-Fragment des CRPS-23 mit scheinbar hoher Affinität gebunden, was durch dessen verhältnismäßig langsame „off-Rate" von der Biosensoroberfläche angedeutet wurde und dessen Bindung wurde um etwa 33% in der Gegenwart von relativ niedrigen Konzentrationen von CRP, welches als Kompetitor verwendet wurde inhibiert.
Beispiel 3 Herstellung eines kompetitiven Immunoassays unter Verwendung von anti-ideotypischen Antikörpern in einem konventionellen ELISA.
Zwei Versionen eines ELISA-basierten kompetitierenden Immunoassays wurden unter Verwendung des anti-CRP-Antikörpers CRPS-23 und dessen anti-Ideotypen C23id2-6,3 entwikkelt, zusammen mit deren HRP-konjugierten Partnern. Die beiden ELISA-Formate sind in 2 illustriert und die korrespondierenden Dosis-Wirkungs-Kurven für CRP werden in 3 gezeigt. Wie in der Figur gezeigt, besteht Format 1 aus einem anti-ideotypischen immobilisierten Antikörper auf der Plattenoberfläche und der HRP-markierte-anti-CRP-Antikörper kompetitiert mit löslichem CRP um Bindungsstellen auf dem immobilisiertem anti-ideotypischen Antikörper. Format 2 verwendet die entgegengesetzte Orientierung der Reagenzien, wobei der anti-CRP-Antikörper immobilisiert ist, wohingegen der HRP-markierte anti-ideotypische Antikörper und CRP in Lösung um die Bindungsstellen des anti-CRP auf der Platte kompetitieren. Standard-ELISA-Verfahren wurden verwendet, um Antikörper zu immobilisieren, nicht-spezifische Bindungsstellen abzublocken, Markierungen zu titrieren, sowie für Signalgeneration und Detektion. Wie illustriert, wurden für beide Formate mit steigenden CRP-Konzentrationen sinkende Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurven beobachtet.
Beispiel 4 Generierung von Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurven für CRP unter Verwendung anti-ideotypischer Antikörper in Trockenfilmformaten mit löslichen Markierungen.
Nachdem wir gezeigt haben, daß diese Immuno-Materialien gut in ELISA-Formaten funktionieren, haben wir deren Eignung für das Trockenfilmformat untersucht. Immuno-rate-Beschichtungen wurden für jedes Format angefertigt. Format 1-Beschichtungen bestanden aus dem anti-ideotypischen Antikörper C23id2-6,3, welcher auf Beads immobilisiert wurde und entweder mittels Rezeptor oder verteilenden Schichten beschichtet wurde. Die Beschichtungen wurden dann mittels Zugabe von löslichem HRP-markiertem anti-CRP-Antikörper CRPS-23 zu den Serumproben analysiert und auf VITROS^®-250-Analyzern laufen gelassen unter Verwendung von Standard-Immuno-Rate-Verfahren. Die Beschichtungen des 2. Formates wurden in ähnlicher Weise hergestellt und evaluiert, außer daß diese aus auf Beads immobilisiertem anti-CRP-Antikörper CRPS-23 bestanden und HRP-markierter anti-ideotypischer Antikörper wurde jeder Probe zugegeben. 4 zeigt ein Beispiel eines jeden Formates einer Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve für CRP. Beide Formate weisen sinkende Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurven für steigende CRP-Konzentrationen auf und die Kurven sinken durch den gesamten klinisch relevanten Bereich für CRP.
Beispiel 5 Generierung einer Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve für CRP unter Verwendung von anti-ideotypischen Antikörpern im Trockenfilmformat, unter Verwendung von beschichteten Markierungen.
Um die Anwendbarkeit dieser Immuno-Materialien für den Trockenfilm zu demonstrieren, wurden die HRP-Markierung unter Verwendung eines Tintenstrahldruckverfahrens in beide Beschichtungsformate eingebracht. Für Format 1 wurde HRP-konjugiertes CRPS-23 auf die Trockenfilmbeschichtung aufgebracht, welche immobilisiertes C23id2-6,3 enthielt. Dessen nominale Konzentration lag nach dem Rückfeuchten mittels 10 μl von Serumprobe bei 2,5 nM IgG. Gleichermaßen wurde HRP-konjugiertes C23id2-6,3 auf den Trockenfilm aufgebracht, welcher immobilisiertes CRPS-23 bis zu einer finalen Konzentration, nach der Rückfeuchtung mit 10 μl einer Serumprobe, von 0,5 nm IgG aufwies. Es wurde den Tintenstrahlbeschichtungen gestattet, zu trocknen, danach wurden Serumproben verschiedenster CRP-Konzentration analysiert, als Immuno-Rate-Assays auf dem VITROS^®-250-Analyzer. Beide Formate ergaben fallende Dosis-Wirkungs-Beziehungskurven bei steigenden CRP-Konzentrationen, wie dies in 5 gezeigt ist.
Beispiel 6 Generierung einer Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve für CRP im vorgefertigten Immuno-Rate-Trockenfilmformat.
Ein Verfahren zur Herstellung dieses Trockenfilms wird beschrieben. Eine komplette Immuno-Rate-Beschichtung wurde wie dies bereits für das Format 1 beschrieben wurde, hergestellt. Die anti-CRP-HRP-Markierung wurde dann in den Trockenfilm inkorporiert unter Verwendung der Immuno-Rate-Tiefdruckzylindertechnik. Die so gesamt maschinell erstellte Beschichtung wurde aufgebracht und getestet auf einem VITROS^®-250-Analyzer mit Serum-basierten Proben von verschiedenen CRP-Konzentrationen. Die resultierende, sinkende Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve, bei steigender CRP-Konzentration, kann verwendet werden, um CRP-Werte zu messen und zwar von unbekannten Proben innerhalb der Spanne des Analyten für CRP ohne Verdünnung oder Vorbehandlung (siehe 6).
Beispiel 7 Generierung von Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurven für CRP unter Verwendung von anti-ideotypischen Antikörpern auf dem VITROS^® ECI automatisierten Immunoassay-Analyzer.
Für das Format 1 wurde CRPS-23.1 mit HRP konjugiert und C23id2-6,3 wurde mit Biotin mittels konventioneller Verfahren ebenso konjugiert. Wie in 7A gezeigt, wurde eine Dosis-Wirkungs-Beziehungs-Kurve generiert unter Verwendung von Proben mit unterschied lichen CRP-Konzentrationen von 0,1 bis 1000 mg pro Liter. Ähnliche Daten sind für das Format 2 in 7B gezeigt.
Einige Vorteile, die beobachtet wurden, bei der Verwendung von Immunoassays mit Immuno-Materialien der vorliegenden Erfindung, sind die folgenden:

1. kompetitive Immunoassays leicht adaptiert an verschiedene Formate
2. Analytische Spanne: die analytische Spanne ist in etwa zwei Größenordnungen groß und ist innerhalb der bekannten brauchbaren Spanne der CRP-Konzentrationen in humanem Serum. Die analytische Spanne kann in kleinsten Schritten eingestellt werden durch die Konzentrationen der primären Komponenten und die Auswahl welche Komponenten immobilisiert und welche mobil sind;
3. Anwendbarkeit: Diese Assays können auf mehr als nur eine Art konfiguriert werden. Zwei Beispiele von Konfigurationen der vorliegenden Erfindungen sind wie folgt: i. Mit CRPS-23 immobilisiert und das HRP-Konjugat des anti-ideotypischen Antikörpers als mobile Phase und ii. der anti-ideotypische Antikörper immobilisiert und das HRP-Konjugat des CRPS-23 als mobile Phase;
4. Verdünnung: keine Verdünnung wird benötigt; jedoch sollte eine Verdünnung wünschenswert sein, sei es aus anderen Gründen können ähnliche Immuno-Materialien ausgewählt werden, um die Verminderung der Konzentrationen des Analytes auszugleichen;
5. Notwendigkeit geringer Materialien: Wohingegen häufig alternative Methoden nicht unerhebliche Verdünnungen oder ungewollt große Mengen an Immuno-Materialien benötigen, bedarf es bei diesen Formaten lediglich etwa 1–10 nM jeder Komponente (Menge in Mikrogramm pro Assay); und
6. Reduktion der Empfindlichkeit für heterophile Aktivität in Patientenproben: anti-CRP und anti-ideotypische Antikörper können selektiert oder modifiziert werden, so daß diese verschiedene schwere Kettensubklassen haben.

Claims

Verfahren zum Durchführen eines kompetitiven Immunoassay zum Nachweisen von C-reaktivem Protein, umfassend: i entweder In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem immobilisierten anti-human-C-reaktivem-Protein-Antikörper mit einer Affinität für CRP, die näherungsweise 10^–7 M ist, und einem markierten anti-idiotypischen Antikörper, der an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) mit relativ hoher Affinität (Kd < 10^–8 M) binden kann, wobei die Bindung am CRPS-23 (ATCC PTA-1354) die Bindung an C-reaktives Protein ausschließt und umgekehrt, oder In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem immobilisierten anti-idiotypischen Antikörper, der an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) mit relativ hoher Affinität (Kd < 10^–8 M) binden kann, wobei die Bindung an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) die Bindung an C-reaktives Protein ausschließt und umgekehrt, und mit einem markierten anti-human-C-reaktivem-Protein-Antikörper mit einer Affinität für CRP, die näherungsweise 10^–7 M ist; ii Nachweisen der Markierung; und iii Korrelieren des Nachweises der Markierung mit der Menge an C-reaktivem Protein in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der anti-human-C-reaktive-Protein-Antikörper CRPS-23 (ATCC PTA-1354) ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der anti-idiotypische Antikörper an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) binden kann.
Kit für einen kompetitiven Immunoassay, umfassend: einen ersten Antikörper, wobei der erste Antikörper ein anti-human-C-reaktives-Protein-Antikörper mit einer Affinität für CRP ist, die näherungsweise 10^–7 M ist; und einen zweiten Antikörper, wobei der zweite Antikörper ein anti-idiotypischer Antikörper ist, der an den ersten Antikörper binden kann.
Hybridom-Zellinie, identifiziert als CRPS-23 (ATCC PTA-1354), die einen anti-human-C-reaktives-Protein-Antikörper mit niedriger Affinität erzeugen kann.
Antikörper, produziert durch das Hybridom nach Anspruch 5.
Anti-idiotypischer Antikörper, der gegen einen anti-human-C-reaktives-Protein-Antikörper mit niedriger Affinität erzeugt worden ist, der an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) mit einer relativ hohen Affintät (Kd < 10^–8 M) binden kann, wobei die Bindung an CRPS-23 (ATCC PTA-1354) die Bindung an C-reaktives Protein ausschließt und umgekehrt.
Hybridom-Zellinie, identifiziert als C23id2-6.3 (ATCC PTA-1353), die anti-idiotypischen Antikörper erzeugen kann.