DE69121447T2 - Immuntestelement und Verfahren für Immuntest - Google Patents
Immuntestelement und Verfahren für ImmuntestInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Trocken-Immunoassayelement, bei dem ein homogener Enzymimmunoassay benutzt wird, und ein Immunoassayverfahren, bei dein das Trocken-Immunoassayelement verwendet wird.
- Analysen von den Bestandteilen, die aus dem lebenden Körper stammen, oder von Chemikalien, die in den Körperflüssigkeiten, wie Blut und Urin, enthalten sind sind zur Diagnose des Zustandes von Erkrankungen oder zur Überprüfung der Entwicklung der Heilung nützlich, und sie nehmen deshalb wichtige Bereiche auf dem Gebiet von klinischen Tests ein. Der sogenannte Enzymimmunoassay ist im Stand der Technik als eine der Methoden zur Analyse solch eines Bestandteils (Ligand), der im allgemeinen in einer kleinen Menge in den Körperflüssigkeiten vorhanden ist, bekannt. Der Enzymimmunoassay kann klassifiziert werden in heterogene Systeme, für die B/F(Bound/Free, Gebunden/Frei)-Trennung bewirkt werden muß, und homogene Systeme, für die B/F-Trennung nicht erforderlich ist. Die Reaktionen bei dem homogenen System basieren auf dem Phänomen, daß die Enzymaktivität des markierenden Enzyms (Markierungsenzym) durch einige störungen beeinflußt wird, die durch die Anbindung eines Antikörpers an das Antigen (Ligand) verursacht sind, und die Inhibierung aufgrund der Antigen-Antikörper-Bindung wird im allgemeinen ausgenutzt. Es wird angenommen, daß die Enzymaktivität durch eine sterische Hinderung hinsichtlich des Anbindens des Enzyms an das Substrat oder einer Veränderung hinsichtlich der dreidimensionalen Struktur des Enzyms unterdrückt wird, wenn der Antikörper, bei dem es sich im allgemeinen um ein großes Molekül handelt, an das Antigen in dem Enzym-markierten Antigen gebunden ist. Mittlerweile wird bei den klinischen Routinetests, bei denen eine große Anzahl an Prüfproben zu handhaben sind, gefordert, daß die einzelnen Proben durch einfache Arbeitsweisen, am liebsten durch automatisierte Arbeitsweisesequenz, schnell analysiert werden sollen.
- Um dieser Anforderung zu entsprechen, wurden Trockenanalyseelemente vorgeschlagen (vergleiche z.B. die JP-OPS ungeprüfte japanische Patentpublikation Nrn. 53888/1974 (entspricht der US-PS 3 992 158), 77356/1984 (entspricht der EP-A-0 097 952) und 102388/1984 und US-PS Nr. 4 459 358).
- Ein Trockenanalyseelement ist bekannt geworden, bei dem eine homogene enzymimmunologische Reaktion verwendet wird (vergleiche die JP-OPS Nr. 321360/1989 (entspricht der EP- A-0 347 839)). Dieses bekannte Trockenanalyseelement umfaßt die folgenden drei Bestandteile in der gleichen oder anderen Schichten in einer mehrschichtigen Verbundstruktur:
- (A) ein Antigen mit einem hohen Molekulargewicht (ein Kopplungsprodukt eines Liganden oder eines Derivates davon mit einer Hochmolekulargewichts-Verbindung; nachstehend als "polymerisiertes Antigen" bezeichnet),
- (B) ein wasserunlösliches Hochpolymersubstrat; und
- (C) ein Konjugat aus einem Antikörper gegen den Liganden und einem Enzym für das Substrat.
- Das Antigen, das durch Betupfen auf das Analyseelement aufgetragen wird, bindet an das Antikörper-Enzym-Konjugat durch eine kompetitive Reaktion mit der Reaktion des polymerisierten Antigens. Der Komplex aus Antigen-Antikörper- Enzym reagiert mit dem wasserunlöslichen Hochpolymersubstrat unter Bildung eines löslichen Produkts mit Niedermolekulargewicht. Andererseits zeigt der durch die Bindung mit dem polymerisierten Antigen gebildete Komplex aus polymerisiertes-Antigen-Antikörper-Enzym keine Enzymaktivität gegenüber dem Hochpolymersubstrat. Dementsprechend nimmt das durch die Enzymreaktion hergestellte Produkt zu, wenn die Menge des Antigens in der Probe erhöht wird. Dieses Produkt wird in eine Nachweisschicht diffundieren gelassen, wo die Menge des Produkts durch Messung der optischen Dichte einer Absorption, die von der gefärbten chemischen Gruppe herrührt, bestimmt wird, um die quantitative Analyse des Antigens in der Probe zu ermöglichen.
- Da jedoch bei diesem bekannten Analyseelement ein Hochpolymersubstrat, gebunden an einen Farbstoff, wie Farbstoff- Stärke, verwendet wird und der an Amylose gebundene Farbstoff, die das durch die Wirkung der Amylase gebildete Zersetzungsprodukt darstellt, bestimmt wird, müssen das Hochpolymersubstrat und das Reaktionsprodukt vor der Messung oder dem Nachweis getrennt werden. Es ist deshalb erforderlich, eine lichtabschirmende Schicht, die beispielsweise feine Teilchen von Titandioxid enthält, zwischen der das nichtumgesetzte Substrat enthaltenden Reagensschicht und der Nachweisschicht für die Aufnahme des Reaktionsprodukts bereitzustellen. Das Analysenelement mit einer solchen Laminatstruktur ist nicht bevorzugt, weil es notwendigerweise einige Zeit benötigt, bis das in der Reagensschicht gebildete lösliche Reaktionsprodukt in die Nachweisschicht diffundiert ist, was dazu führt, daß eine schnelle quantitative Bestimmung, die einen Hauptgesichtspunkt bei dem Trockenanalyseelement darstellt, nicht durchgeführt werden kann.
- Es ist möglich, die Diffusionsfähigkeit des Reaktionsproduktes durch Einführung einer hydrophilen Gruppe, wie einer Carboxyl- oder Sulfogruppe, in das Substrat zu verbessern, um die Diffusion des Reaktionsproduktes zu beschleunigen. Jedoch ist die Stelle, an der eine solche Substituentengruppe eingeführt werden kann, begrenzt und deren Einführung kann den Nachteil verursachen, daß der molekulare Extinktionskoeffizient der Farbstoffposition, durch die Empfindlichkeit der Analyse bestimmt ist, erniedrigt wird.
- Dementsprechend ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Immunoassayelement unter Verwendung eines homogenen Enzymimmunoassays mit der Fähigkeit einer schnellen Analyse eines Analyten bei einer hohen Empfindlichkeit durch eine einfache Arbeitsweise bereitzustellen.
- Eine zweite Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum quantitativen Analysieren eines Analyten unter Verwendung des vorstehend genannten Immunoassayelements.
- Die erste Aufgabe der Erfindung wird durch die Bereitstellung eines Immunoassayelements zur quantitativen Analyse eines Liganden durch Bestimmung der Enzymaktivitätsänderung eines markierenden Enzyms, die durch eine kompetitive Reaktion zwischen
- 1) dem Liganden;
- 2) einem verknüpften Produkt aus dem Liganden oder einem Derivat davon mit einer hinsichtlich des Liganden gemeinsamen antigenen Determinante und einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht; und
- 3) einem Antikörper, der sich in spezifischer Weise mit dem Liganden oder dem Derivat davon umsetzen und verbinden kann, und der mit dem markierenden Enzym markiert worden ist, verursacht wird,
- wobei das Element
- eine Substratschicht, enthaltend ein nicht-diffusionsfähiges Substrat, das ein diffusionsfähiges Material in Anwesenheit des Enzyms bildet, umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß es weiter eine Reagensschicht, enthaltend ein Fragmentierungsenzym zur weiteren Fragmentierung des diffusionsfähigen Materials in ein Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht, umfaßt, erreicht.
- Das verknüpfte Produkt aus dem Liganden und einer Verbindung mit Hochmolekulargewicht (nachstehend als "polymerisiertes Antigen" bezeichnet) und dem Enzym-markierten Antikörper kann in der Substratschicht oder einer getrennten Schicht, die auf der Substratschicht übereinander angeordnet ist, enthalten sein.
- Die zweite Aufgabe der Erfindung wird durch Bereitstellung eines Immunoassayverfahrens zur quantitativen Analyse der Menge eines Liganden in einer Probe durch Bestimmung der Enzymaktivitätsänderung eines markierenden Enzyms, die durch eine kompetitive Reaktion zwischen
- 1) dem Liganden;
- 2) einem verknüpftem Produkt aus dem Liganden oder einem Derivat davon mit einer hinsichtlich des Liganden gemeinsamen antigenen Determinante und einer Verbindung mit hohem Molekulargewicht; und
- 3) einem Antikörper, der sich in spezifischer Weise mit dem Liganden oder dem Derivat davon umsetzt und verbindet, und der mit dem markierenden Enzym markiert worden ist, verursacht wird, wobei das Verfahren die Stufen umfaßt:
- (a) Auftragen der Probe auf eine Substratschicht, die ein nicht-diffusionsfähiges Substrat zur Bildung eines diffusionsfähigen Materials in Anwesenheit des markierenden Enzyms enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe auf die Substratschicht des Elements nach Anspruch 1 aufgetragen wird, nachdem die Probe mit dem verknüpften Produkt und dem Antikörper vermischt worden ist, um die kompetitive Reaktion zu vervollständigen, und daß das Immunoassay-Verfahren weiter umfaßt:
- (b) Wandemlassen des in der Substratschicht gebildeten diffusionsfähigen Materials in die Reagensschicht des Elements; und
- (c) Messen der Menge des in der Reagensschicht gebildeten Produkts mit niedrigerem Molekulargewicht, erreicht.
- Die Enzymaktivität des Enzyms des Enzym-markierten Antikörpers, der an das polymerisierte Antigen gebunden ist, gegenüber einem nicht-diffusionsfähigen Substrat ist durch die sterische Hinderung behindert. Im Gegensatz dazu behält das Enzym des Enzym-markierten Antikörpers, der mit dem in der Probe enthaltenen Antigen (d.h. dem Liganden) verbunden ist, seine ursprüngliche Enzymaktivität gegenüber dem nicht-diffusionsfähigen Substrat. Als ein Ergebnis ist die Menge an in der Substratschicht gebildeten diffusionsfähigern Material proportional zu der Menge an in der Probe enthaltenem Antigen. Das in der Substratschicht gebildete diffusionsfähige Material wandert schnell in die Reagensschicht, wo es weiter in ein Produkt mit kleinerem Molekulargewicht zersetzt wird. Das Produkt mit Niedermolekulargewicht kann in einer Nachweisschicht nachgewiesen werden. Das nicht-umgesetzte nicht-diffusionsfähige Substrat wird in der Substratschicht festgehalten.
- Die Figur 1 ist eine Erläuterung, die die Hauptstruktur einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immunoassayelements zeigt;
- Figur 2 ist eine Erläuterung, die eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immunoassayelements zeigt;
- Figur 3 ist eine Erläuterung, die eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immunoassayelements zeigt;
- Figur 4 ist eine graphische Darstellung, die die Kalibrierkurve darstellt, wenn das Immunoassayelement des Beispiels 1 verwendet wird; und
- Figur 5 ist eine graphische Darstellung, die die Kalibrierkurve zeigt, wenn das Immunoassayelement des Beispiels 2 verwendet wird.
- Figur 1 zeigt eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Immunoassayelements.
- Unter Bezugnahme auf Figur 1 wird ein transparenter Träger mit 10 bezeichnet, auf dem eine Reagensschicht 12 und eine Substratschicht 14 auflaminiert worden sind. Die Substratschicht 14 ist aus einem wasserdurchlässigen Material zusammengesetzt und enthält ein nicht-diffusionsfähiges Substrat für ein markierendes Enzym, das ein Konjugat mit dem Antikörper bildet. Dieses Substrat bildet in Anwesenheit eines Antigen-Antikörper-Enzymkomplexes ein diffusionsfähiges Material, das in einer Menge gebildet wird, die proportional zu der Menge des Liganden (Antigens), d.h. dem quantitativ zu bestimmenden Analyten, ist.
- Die Reagensschicht 12 ist aus einem wasserdurchlässigen Material zusammengesetzt und enthält ein Fragmentierungsenzym. Das Fragmentierungsenzym fragmentiert das diffusionsfähige Material, das aus der Substratschicht diffundiert oder gewandert ist, in ein Produkt mit Niedermolekulargewicht. Die Substratschicht enthält weiter eine Reagenszusammensetzung zum Nachweisen des so fragmentierten Produkts mit Niedermolekulargewicht.
- Die Substanz, die durch die Erfindung analysiert werden soll (nachstehend einfach als "Analyt" bezeichnet) ist ein Ligand, der eine antigene Determinante besitzt und in der Probe enthalten ist.
- Der Analyt ist nicht eingeschränkt, und viele Arten von Analyten können durch die Erfindung analysiert werden. Die typischen Beispiele umfassen Blut (Gesamtblut, Blutplasma, Blutserum), Lymphflüssigkeit und Urin. Es ist bevorzugt, suspendierte Teilchen, wie Blutzellen, im Falle des Vorhandenseins solcher Teilchen auszuschließen. Jedoch kann eine Probe direkt auf das erfindungsgemäße Analysenelement ohne das Ausschließen solcher suspendierten Teilchen getüpfelt werden, wenn das Analysenelement eine Filterschicht besitzt, gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform.
- Durch die Verwendung des erfindungsgemäßen Analysenelements können irgendwelche Liganden analysiert werden, solange jeder Ligand als ein Antigen wirkt und ein Antikörper dafür bereitgestellt werden kann. Beispiele solcher Liganden umfassen Arzneimittel-Wirkstoffe, wie Digoxin, Theophyllin, Phenobarbital, Phenytom, Penicillin, Amikacm, Derivate dieser Arzneimittel (beispielsweise Komplexe der Arzneimittel mit lebenden Bestandteilen, wie Proteinen), Prostaglandin und Hormone, wie Testosteron, Progesteron und Thyroxin.
- Auf dem erfindungsgemäßen Analysenelement finden kompetitive Bindungsreaktionen zwischen dem Liganden und dem polymerisierten Antigen zu einem Enzym-markierten Antikörper statt. Dementsprechend ist es bevorzugt, daß der Ligand ein relativ niedriges Molekulargewicht besitzt, um keinen signifikanten Einfluß auf die Enzymaktivität auszuüben. Beispielsweise zeigt das erfindungsgemäße Analysenelement seinen vorteilhaften Gesichtspunkt, wenn es zur Analyse eines Liganden mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 20.000 Dalton verwendet wird.
- Das polymerisierte Antigen, d.h. das verknüpfte Produkt aus dem Liganden und einem großen Molekül oder einer Verbindung mit Hochmolekulargewicht, ist an einen Antikörper gebunden, um die Aktivität des Enzyms, das mit dem Antikörper für die Markierung des letzteren konjugiert ist, zu unterdrücken
- Es ist bevorzugt, daß die verwendete Verbindung mit Hochmolekulargewicht wasserlöslich ist, und ein Molekulargewicht von nicht weniger als 50.000 Dalton besitzt. Beispiele geeigneter Verbindungen mit Hochmolekulargewicht sind Proteine, wie Gelatine, Hämocyanin und Ferritin, und Polyethylenglykol. Es reicht aus, daß diese Verbindungen die vorstehend genannten Bedingungen erfüllen, wenn sie an die Liganden gebunden sind, und solche mit relativ niedrigeren Molekulargewichten, wie Rinderserumalbumin, können auch verwendet werden, indem sie polymerisiert werden, beispielsweise durch Autopolymerisation.
- Die Verfahren zur Verknüpfung des Liganden an die Verbindung mit hohem Molekulargewicht können unter Berücksichtigung der funktionellen Gruppen der beiden Reaktanten ausgewählt werden. Verwendbare funktionelle Gruppen umfassen beispielsweise eine Aminogruppe, Carboxylgruppe, Hydroxylgruppe, Thiolgruppe, Imidazolgruppe und Phenylgruppe. Beispielsweise können die Aminogruppen miteinander durch eine Anzahl an bekannten Verfahren verknüpft werden, wie Isocyanatverfahren, Glutaraldehydverfahren, Difluorbenzolverfahren und Benzochinonverfahren. Eine Aminogruppe kann mit einer Carboxylgruppe durch ein Verfahren verknüpft werden, bei dem die Carboxylgruppe in Succinylimidester umgewandelt wird, oder durch andere Verfahren, umfassend das Carbodiimidverfahren, Woodward-Reagens-Verfahren und das Periodsäure-Oxidations-Verfahren (Nakane-Verfahren), bei dem die Aminogruppe mit einer Zuckerkette verknüpft wird. Wenn eine Thiolgruppe verwendet wird, wird eine der Carboxylgruppen zu Succinylimidester umgewandelt, der mit Cystein unter Einführung einer Thiolgruppe umgesetzt wird, und anschließend werden beide Gruppen miteinander unter Verwendung eines bifunktionellen Verknüpfungsreagenses, das sich mit der Thiolgruppe umsetzt, verknüpft. Die Verfahren, bei denen die Phenylgruppe verwendet wird, umfassen das Diazotierungsverfahren und das Alkylierungsverfahren. Das Verknüpfungsverfahren ist nicht auf die vorstehend genannten Verfahren beschränkt und kann ausgewählt werden aus den Verfahren, die in "Method in Immunology and Immunochemistry", Bd. 1 (C.A. Williams, M.W. Chase, Academic Press (1967)) oder in "KOSO MENEKI SOKUTEI-HO" (Enzyme Immunoassay), herausgegeben von Ishikawa, Kawai und Miyai, Igaku Shoin, 1978, beschrieben sind. Liganden können an die Hochpolymerverbindung in irgendeinem gewünschten Verhältnis verknüpft werden. Nach der Beendigung der Verknüpfungsreaktion wird das Reaktionsprodukt durch Gelfiltration oder durch Ionenaustauschchromatographie aufgereinigt und kann durch das Lyophilisierungsverfahren nach Wunsch getrocknet werden.
- Die Liganden an sich können polymerisiert werden, um ein polymerisiertes Antigen zu erhalten. Die Polymerisation des Liganden kann in zu den vorstehend genannten Verknüpfungsverfahren ähnlicher Weise bewirkt werden. Beispielsweise kann der Ligand unter Verwendung eines bifunktionellen Vernetzungsreagenses, wie Carbodiimid oder Glutaraldehyd, polymerisiert werden.
- Anstelle des Liganden kann die Verbindung mit dem hohen Molekulargewicht an ein Derivat des Liganden, das immunologische Kreuzreaktivität gegenüber einem entsprechenden Antikörper für den Liganden aufweist, gebunden werden. Mittlerweile umfassen die Derivate des Liganden nicht nur diese, die analoge chemische Strukturen besitzen, sondern auch solche, die analoges Verhalten hinsichtlich ihrer immunologischen Reaktivitäten zeigen. Beispielsweise können auch Derivate von Caffein als Materialien zur Bildung des polymerisierten Antigens verwendet werden, wenn ein Antikörper gegen Theophyllin als dem Liganden mit Caffein immunologisch kreuzreagiert.
- Wenn der Ligand oder ein Derivat davon keine geeignete funktionelle Gruppe zum Verknüpfen an eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht besitzt, können eine Aminogruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Thiolgruppe in den Liganden oder das Derivat davon eingeführt werden. Solch eine Gruppe kann durch einen Spacer eingeführt werden, um dessen Verknüpfung an eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht zu erleichtern. Beispielsweise kann für den Fall, daß Theophyllin der Ligand ist, eine Carboxylgruppe unter Erhalt von 8-Propylcarboxyltheophyllin, das an eine Verbindung mit hohem Molekulargewicht gebunden ist, eingeführt werden.
- Der mit einem Enzym markierte Antikörper ist ein spezifischer Antikörper gegen den Liganden, der ein Analyt ist. Im Falle, daß ein Derivat des Liganden zur Bildung des Großmolekül-Antigens verwendet wird, ein Antikörper, der sich mit der antigenen Determinante, die hinsichtlich des Liganden und des Derivats davon gemeinsam ist, umsetzt. Der Antikörper kann derjenige sein, der durch herkömmliche Verfahren erhalten werden kann, ein monodonaler Antikörper kann vorzugsweise verwendet werden, um die Empfindlichkeit zu verbessern. Der Antikörper kann ein Fragment von F(ab')&sub2;, Fab' oder Fab sein.
- Das an den Antikörper als die Markierung gebundene Enzym zersetzt das nicht-diffusionsfähige Substrat, das aus einem Hochpolymer gebildet ist, unter Bildung eines diffusionsfähigen Produktes, das in ein weiteres Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht durch die Wirkung des Fragmentierungsenzyms fragmentiert werden kann. Das nicht-diffusionsfähige Substrat wird nicht in eine wäßrige Probenflüssigkeit dispergiert und es wird weder dispergiert noch wandert es in die Reagensschicht von sich aus. Das Fragmentierungsenzym wandelt das diffusionsfähige Produkt, das aus dem nicht-diffusionsfähigen Substrat durch die Wirkung des an den Antikörper als die Markierung gebundenen Enzyms gebildet wird, um, unter Bildung eines niedermolekularen Produkts, das nachgewiesen werden kann, wobei das Fragmentierungsenzym in der Reagensschicht des erfindungsgemäßen Analysenelements enthalten ist. Eine geeignete Kombination kann so ausgewählt werden, daß ein Enzym auf das nicht- diffusionsfähige Substrat unter Bildung einer diffusionsfähigen Substanz einwirkt, die weiter durch das Fragmentierungsenzym unter Bildung eines leicht nachzuweisenden Produkts mit niedrigerem Molekulargewicht zersetzt wird.
- Beispiele des geeigneten Enzyms (Markierungsenzym) umfassen Hydrolasen, die diffusionsfähige Oligomere aus nicht- diffusionsfähigen Substraten, die aus Polymeren zusammengesetzt sind, bilden. Das spezielle Beispiel ist Glucosidase. Beispiele der Glucosidase sind α-Amylase, β-Amylase und Dextranase. Weitere geeignete Hydrolasen sind Cellulase, Kollagenase, Mannase, Lipase und Ribonudease (RN).
- Das Enzym und der Antikörper können in ähnlicher Weise zu der Verknüpfung zwischen der Verbindung mit hohem Molekulargewicht und dem Antigen konjugiert werden.
- Es ist bevorzugt, daß das Enzym nicht durch irgendeinen in der Probe anwesenden Hinderungsfaktor beeinflußt wird und daß ein kompetitives Enzym von gleicher Art nicht in der Probe anwesend ist. Wenn jedoch ein gleiches Enzym wie das Markierungsenzym in der Probe anwesend ist, kann der Enzyminhibitor verwendet werden. Solch ein Enzyminhibitor kann derjenige sein, der das Enzym in der Probe in einem solchen Ausmaß inhibiert, das größer ist als das Ausmaß der Inhibierung der Aktivität des Markierungsenzyms. Es ist am meisten bevorzugt, daß der Enzyminhibitor in vollständiger Weise das Enzym in der Probe inaktiviert, ohne das Markierungsenzym zu desaktivieren. Bei der Verwendung unter Praxisbedingungen ist es jedoch ausreichend, daß der Blindwert bei dem Bestimmungsschritt nicht angehoben wird und daß der Enzyminhibitor inaktiviert werden kann, um die Aktivität des Enzyms in der Probe nach der Beendigung des Bestimmungsvorgangs wieder herzustellen. Es reicht aus, daß der Enzyminhibitor das Enzym in dem Enzym-markierten Antikörper nicht inhibiert und daß es die Aktivität des freien Enzyms inhibieren kann. Der Enzyminhibitor kann aus den bekannten Enzyminhibitoren so ausgewählt werden, daß das ausgewählte Enzym über die speziellen Merkmale, wie vorstehend genannt, verfügt. Andernfalls wird ein Antikörper gegen das Enzym, das in der Probe unter Verursachung eines Problems enthalten ist, hergestellt und als ein Enzyminhibitor verwendet.
- Beispiele des Substrats für die genannten α-Amylase, β- Amylase oder Dextranase sind carboxymethylierte Stärke, Stärke, Amylose oder Amylopectin.
- Wenn α-Amylase als das Enzym für das Enzym-markierte Antigen verwendet wird und Glucoamylase oder α-Glucosidase (die nachstehend detailliert beschrieben werden) als das Fragmentierungsenzym verwendet wird, können ein Derivat von oligosaccharid, das durch Modifizierung von nicht-reduziertem terminalem Glucoserest mit einer Carboxymethylgruppe hergestellt wird (beschrieben in der JP-OPS Nr. 31699/1984 (entsprechend dem Chemical Abstracts, 101 (1984), 19761z) oder ein Derivat von Amylose (beschrieben in der JP-OPS Nr. 39300/1984 (entsprechend der EP-A-0 104 780); Clinica Chemica Acta, 138, S. 21-29 (1984)), verwendet werden. Diese modifizierten Substrate dienen als die Substrate für α-Amylase, dienen jedoch nicht als die Substrate für Glucoarnylase oder α-Glucosidase.
- Das Fragmentierungsenzym kann ein Enzym der gleichen Art wie das Markierungsenzym sein. In solch einem Fall ist es bevorzugt, daß das Markierungsenzym ein endoaktives Enzym ist, das das Molekül intramolekular unter Bildung eines oligomeren fragmentiert und daß das Fragmentierungsenzym eine Exoaktivität besitzt, um das Molekül an dessen Terminal unter Bildung eines Monomeren anzugreifen. Beispielsweise wird in dem Fall, daß das nicht-diffusionsfähige Substrat ein Polymeres (z.B. Stärke) ist, ein Fragmentierungsenzym zum Zersetzen des diffusionsfähigen Oligomeren (z.B. Maltose), die durch die Wirkung des Markierungsenzyms auf ein Monomeres (z.B. Glucose) gebildet wurde, verwendet. Beispiele des Fragmentierungsenzyms umfassen Hydrolasen für Saccharide. Spezielle Beispiele sind α-Amylase, β-Amylase, Dextranase, Glucoamylase und α-Glucosidase.
- Wenn Carboxymethylcellulose als das nicht-diffusionsfähige Substrat verwendet wird und Cellulase als das Markierungsenzym verwendet wird, können C1-Enzyme als das Fragmentierungsenzym verwendet werden. In gleicher Weise kann bei Verwendung der Kombination von Galactan und Galactanase β- Galactosidase als das Fragmentierungsenzym verwendet werden; und falls die Kombination von RNA und Ribonudease verwendet wird, kann Exoribonudease als das Fragmentierungsenzym verwendet werden.
- Die Kombination von dem Markierungsenzym, dem nicht-diffusionsfähigen Substrat und dem Fragmentierungsenzym kann ausgewählt werden aus den Enzymen und Substraten, die in den bekannten Veröffentlichungen (beispielsweise "Enzyme Handbook" (Bunji Maruo and Nobuo Tamiya, Asakura Shoten, 1982); und "Biochemical Handbook" (Nobumasa Imura et al., Maruzen, 1984) beschrieben sind.
- Das Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht, das durch die Fragmentierung in der Reagensschicht durch die Wirkung des Fragmentierungsenzyms gebildet wird, kann optisch unter Verwendung eines bekannten Nachweisreagenses nachgewiesen werden.
- Zum Nachweis der Glucose als Endprodukt, die durch die Wirkung des vorstehend genannten Fragmentierungsenzyms gebildet wird, können irgendeines oder irgendeine der bekannten Verfahren verwendet werden. Beispielhaft genannt seien ein Verfahren, bei dem Wasserstoffperoxid, das durch die Oxidation von Glucose in Anwesenheit von Glucoseoxidase gebildet wird, nachgewiesen wird (z.B. das Verfahren, bei dem ein Trinder-Reagens verwendet wird, wie in Ann. Clin. Biochem., 6, 24 (1964) und J. Clin. Pathol 22, 246 (1969) beschrieben ist, das Verfahren, bei dem ein Trinder-Reagens verwendet wird, wie in der JP-OPS Nr. 50991/1974 (entsprechend den US-Psen 3 886 045, 3 992 158) und der JP-OPS Nr. 164356/1980 (entsprechend der US-PS 4 292 272) beschrieben ist, das Verfahren, bei dem ein Reagens, das einen Triaryl-substituierten Imidazol-Leukofarbstoff enthält, verwendet wird, wie in der JP-OPS Nr. 26188/1978 (entsprechend der US-PS 4 089 747) und der JP- OPS Nr. 45557/1987 (Chemical Abstracts, 99, (1983): 209284j) beschrieben ist, das Verfahren, bei dem ein Reagens, das einen mit einem Diarylmonoaralkyl-substituierten Imidazol-Leukofarbstoff enthält, verwendet wird, wie in den JP-OPSen Nrn. 193352/1984 (entsprechend der EP-A-0 122 641) und 224677/1985 (entsprechend der US-PS 4 665 023)) beschrieben ist, ein Verfahren, bei dem NADH, das in Anwesenheit von Glucosedehydrogenase und NAD hergestellt wird, nachgewiesen wird, und ein Verfahren, bei dem Glucose-6- phosphat, das in Anwesenheit von Hexokinase hergestellt wird, nachgewiesen wird. Unter diesen Nachweisverfahren ist das aufgrund seiner hohen Nachweisempfindlichkeit am meisten bevorzugte Verfahren, bei dem Glucose in Anwesenheit von Glucoseoxidase oxidiert wird, unter Bildung von Wasserstoffperoxid, der unter Verwendung von Peroxidase und einem Leukofarbstoff nachgewiesen wird.
- Diese Nachweisreagentien können in der Reagensschicht zusammen mit dem Fragmentierungsenzym enthalten sein oder sie können in einer weiteren Schicht, die unterhalb der Reagensschicht angeordnet ist (z.B. in einer zweiten Reagensschicht oder einer Nachweisschicht) enthalten sein, um das gebildete Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht nachzuweisen. Wenn ein Leukofarbstoff verwendet wird, ist es bevorzugt, daß der Farbstoff in dem hydrophilen Bindemittel in der Lösung in einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel unter Berücksichtigung der Stabilität des gebildeten Farbstoffs dispergiert ist.
- Das erfindungsgemäße Trocken-Immunoassayelement kann eine ähnliche Schichtstruktur zu der der verschiedenen Trockenanalysenelemente aufweisen. Das Element kann von einem mehrschichtigen Aufbau sein, umfassend zusätzlich zu der Substratschicht und der Reagensschicht einen Träger, eine Auftragungsschicht, eine Nachweisschicht, eine lichtabschirmende Schicht, eine Haftschicht, eine wasserabsorbierende Schicht, eine unterschichtende Schicht usw. Beispiele solcher Analysenelemente sind in den Beschreibungen der JP-OPSen Nr. 53888/1974 (entsprechend der US-PS Nr. 3 992 158), 40191/1976 (entsprechend der US-PS 4 042 353) und 164356/1980 (entsprechend der US-PS 4 292 272) beschrieben.
- Wenn ein lichtdurchlässiger und wasserundurchlässiger Träger verwendet wird, kann das erfindungsgemäße Trocken-Immunoassayelement praktischerweise in der folgenden Konstruktion vorliegen. Es soll jedoch bemerkt werden, daß die Erfindung nicht auf die folgenden Konstruktionen beschränkt ist.
- (1) Konstruktion mit einer Reagensschicht, die auf einem Träger aufgebracht ist, und einer Substratschicht, die auf der Reagenschicht darüberliegend angeordnet ist;
- (2) Konstruktion mit dem Träger und einer Nachweisschicht, einer Reagensschicht und einer Substratschicht, die in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet sind;
- (3) Konstruktion mit dem Träger und einer Reagensschicht, einer lichtabschirmenden Schicht und einer Substratschicht, die in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet sind;
- (4) Konstruktion mit dem Träger und einer Nachweisschicht, einer Reagensschicht, einer lichtabschirmenden Schicht und einer Substratschicht, die in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet sind;
- (5) Konstruktion mit dem Träger und einer Nachweisschicht, einer lichtreflektierenden Schicht, einer Reagensschicht und einer Substratschicht, die in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet sind;
- (6) Konstruktion mit dem Träger und einer zweiten Reagensschicht, einer lichtreflektierenden Schicht, einer ersten Reagensschicht und einer Substratschicht, die in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet sind; und
- (7) Konstruktion mit dem Träger und einer Nachweisschicht, einer zweiten Reagenssschicht, einer lichtreflektierenden Schicht, einer ersten Reagensschicht und einer Substratschicht, die in dieser Reihenfolge übereinander angeordnet sind.
- Bei den unter (1) bis (5) beschriebenen Konstruktionen kann die Reagensschicht aus Mehrfachschichten zusammengesetzt sein. Die Reagensschicht kann eine immunologische Reaktionsschicht sein, die eine Komponente enthält, die zur Teilnahme an einer immunologischen Reaktion fähig ist, wie es nachstehend beschrieben wird.
- Eine wasserabsorbierende Schicht kann zwischen den Träger und die Reagens- oder Nachweisschicht angeordnet werden. Filternde Schichten können zwischen den benachbarten Schichten angeordnet sein. Eine Auftragungsschicht kann auf der Substratschicht angeordnet werden oder die Substratschicht kann eine Auftragungsschicht sein, die auch als eine Auftragungs- bzw. Ausbreitungsschicht wirksam ist.
- Die Substratschicht 14 ist aus einer wasserdurchlässigen Schicht zusammengesetzt und enthält ein nicht-diffusionsfähiges Substrat, bei dem es sich um ein Substrat für das den Antikörper markierende Enzym handelt.
- Um die Wasserdurchlässigkeit der Substratschicht sicherzustellen, ist es bevorzugt, daß sich die Substratschicht aus einem porösen Medium oder einer Schicht, die aus einem hydrophilen Polymeren-Bindemittel zusammengesetzt ist, zusammensetzt.
- Die poröse Schicht kann fibrös oder nicht-fibrös sein. Als die fibrösen Materialien können Filterpapier, Vliesstoffe, gewebte Stoffe (z.B. Stoffe mit Leinwandbindung), gewirkte Stoffe (Z.B. Trikot-gewirkte Stoffe) oder aus Glasfasern hergestelltes Filterpapier verwendet werden. Beispiele des nicht-fibrösen Materials umfassen einen Membranfilter, zusammengesetzt aus Celluloseacetat und beschrieben in der JP-OPS Nr. 53888/1974 (entsprechend der US-PS 3 992 158) und eine partikuläre Strukturschicht, die miteinander verbundene Räume enthält und aus anorganischen oder organischen feinen Teilchen zusammengesetzt ist, wie in den JP- OPSen Nrn. 90859/1980 (entsprechend der US-PS 4 258 001) und 70163/1983 (entsprechend der US-PS Nr 4 486 537) beschrieben ist. Eine laminierte Struktur, die aus teilweise gebundenen porösen Mehrfachschichten hergestellt ist, kann auch vorzugsweise verwendet werden. Beispiele solcher Strukturen sind in den JP-OPSen Nrn. 4549/1986 (entsprechend der EP-A-0 166 365), 116258/1987 (Chemical Abstracts, 108, (1988): 3041y), 138756/1987 (EP-A-0 226 465), 138757/1987 (EP-A-0 226 465) und 138758/1987 (EP-A-0 226 465) beschrieben.
- Die poröse Schicht kann eine Auftragungsschicht sein, die eine sogenannte Abmeßfunktion zum Auftragen einer Flüssigkeit über eine Fläche, die im wesentlichen proportional zu dem Volumen der zugeführten Flüssigkeit ist, aufweisen. Bevorzugte Materialien für die Auftragungsschicht sind gewebte und gewirkte Textilien. Die gewebten Textilien oder dergleichen können der Glimmentladungsbehandlung unterworfen werden, wie in der JP-OPS Nr. 66359/1982 (entsprechend der GB-A-2 087 974 und der US-PS 4 783 315) beschrieben ist. Um die Fläche oder Geschwindigkeit für das Auftragen einzustellen, kann die Auftragungsschicht ein hydrophiles Polymeres oder ein Benetzungsmittel enthalten, wie in den JP-OPSen Nrn. 222770/1985 (entsprechend der EP-A-0 162 301), 219397/1988 (entsprechend der DE-A 37 17 913), 112999/1988 (entsprechend der DE-A 37 17 913) und 182652/1987 (entsprechend der DE-A 37 17 913) beschrieben ist.
- Es stellt ein geeignetes Verfahren dar, bei dem das Substrat in eine poröse Membran imprägniert oder auf eine poröse Membran aufgeschichtet wird, die aus beispielsweise Papier, Stoff oder einem Hochpolymeren hergestellt ist, und den Verbund dann auf eine weitere wasserdurchlässige Schicht, beispielsweise eine Reagensschicht, die auf den Träger durch ein Verfahren, wie in der JP-OPS Nr. 164356/1980 (entsprechend der US-PS 4 292 272) beschrieben, darüberliegend angeordnet ist, aufzutragen. Ein weiteres Verfahren umfaßt die Stufen von Befestigen einer porösen Schicht auf eine weitere wasserdurchlässige Schicht (z.B. eine Reagensschicht) durch ein wie oben beschriebenes Verfahren und Auftragen einer Zusammensetzung, enthaltend das Substrat, auf die poröse Schicht. Irgendeines der bekannten Verfahren kann für die Imprägnierung oder das Beschichten der porösen Schicht angewendet werden. Das Beschichten kann durch die Auswahl einer geeigneten Methode bewirkt werden, beispielsweise Tauchbeschichten, Beschichten mit Abstreifvorrichtung, Trichterbeschichten und Gießbeschichten.
- Obwohl die Dicke der Substratschicht, die nach irgendeinem der vorstehend genannten Verfahren hergestellt wurde, nicht eingeschränkt ist, liegt die geeignete Dicke im Bereich innerhalb von 1 µm bis 50 µm, vorzugsweise von 2 µm bis 30 µm, wenn die Schicht als eine Beschichtungsschicht bereitgestellt wird. Wenn sie durch ein anderes Verfahren bereitgestellt wird, beispielsweise durch Aufstapelung eines Laminats, kann deren Dicke innerhalb eines breiten Bereiches von einigen Zehn µm bis einigen Hundert µm variieren.
- Wenn die Substratschicht aus einer wasserdurchlässigen Schicht, zusammengesetzt aus einem hydrophilen Polymeren- Bindemittel, aufgebaut ist, sind die speziellen Beispiele der geeigneten hydrophilen Polymere Gelatine und Derivate davon (wie Phthalat-derivatisierte Gelatine), Derivate von Cellulose (wie Hydroxyethylcellulose), Agarose, Natriumalginat, Acrylamid-Copolymere, Methacrylamid-Copolymere, Copolymere aus Acrylamiden oder Methacrylamiden mit verschiedenen Vinylmonomeren, Polyhydroxymethylmethacrylat, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Natriumpolyacrylat und Copolymere von Acrylsäure mit verschiedenen Vinylmonomeren.
- Die aus einem hydrophilen Polymeren-Bindemittel zusammengesetzte Substratschicht kann durch Auftragen einer wäßrigen Lösung oder Dispersion des Substrats einer zusätzlichen anderen Reagenszusammensetzung und eines hydrophilen Polymeren-Bindemittels auf eine weitere Schicht, wie eine Träger- oder eine Nachweisschicht, und anschließendem Trocknen der aufgetragenen Lösung oder Dispersion bereitgestellt werden, wie in der JP-PS Nr. 21677/1988 (entsprechend der US-PS Nr. 3 992 158), den JP-OPSen Nrn. 164356/1980 (entsprechend der US-PS 4 292 272) 101398/1979 (entsprechend der US-PS 4 132 528) und 292063/1986 (Chemical Abstracts, 106, 210567y) beschrieben ist. Die Dicke der getrockneten Substratschicht, die ein hydrophiles Polymeres als das Bindemittel enthält, liegt im Bereich von etwa 2 µm bis etwa 50 µm, vorzugsweise von etwa 4 Mm bis etwa 30 µm, und die Deckfähigkeit davon liegt im Bereich von etwa 2 g/m² bis etwa 50 g/m², vorzugsweise von etwa 4 g/m bis etwa 30 g/m².
- Mit dem Ziel der Verbesserung von Merkmalen, wie Beschichtungsfähigkeit, Diffusionsfähigkeit des diffusionsfähigen Materials, Reaktivität und Lagerungsstabilität, können der Substratschicht zusätzlich zu dem nicht-diffusionsfähigen Substrat verschiedene organische oder anorganische Zusatzstoffe zugesetzt werden. Beispiele dafür sind Aktivierungsmittel für Enzyme, Coenzyme, grenzflächenaktive Mittel, pH-Pufferreagentien, Feinteilchen, Antioxidantien etc. Für Beispiele für das Puffersystem, das in der Substratschicht enthalten sein kann, kann auf die pH-Pufferreagentien verwiesen werden, wie sie in "KAGAKU BINRAN, KISOHEN" (herausgegeben von Japanese Chemical Society, MARUZEN, Tokio, 1966), Seiten 1312-1320; R.M.C. Dawson et al., "Data for Biological Research", 2. Auflage (Oxford bei der Clarendon Press, 1969), Seiten 476-508; "Biochemistry", 5, Seiten 467-477 (1966); und "Analytical Biochemistry", 104, Seiten 300-310 (1980) beschrieben sind. Spezielle Beispiele geeigneter Puffer sind Pufferreagentien, enthaltend Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris), Pufferreagentien, enthaltend Phosphate, Pufferlösungen, enthaltend Borate, Pufferreagentien, enthaltend Citronensäure oder Citrate, Pufferreagentien, enthaltend Glycin, Pufferlösungen, enthaltend BICINE, und Pufferreagentien, enthaltend HEPES.
- Die Reagensschicht 12 enthält ein Fragmentierungsenzym und kann eine Nachweis-Reagenszusammensetzung zum Nachweis des Produkts mit niedrigerem Molekulargewicht, das durch die Wirkung des Fragmentierungsenzyms, wie gewünscht, gebildet wird, enthalten.
- Die Reagensschicht setzt sich aus einer wasserdurchlässigen Schicht zusammen, bei der es sich vorzugsweise um eine kontinuierliche Schicht, hergestellt aus einem hydrophilen Polymeren-Bindemittel, ähnlich zu den wasserdurchlässigen Schichten, wie sie bei der Beschreibung der Substratschicht beschrieben wurden, handelt. Das verwendete hydrophile Polymeren-Bindemittel kann unter Berücksichtigung des in der Substratschicht gebildeten diffusionsfähigen Produktes und dem in der Reagensschicht enthaltenen Färbungsreagenses festgelegt werden.
- Der Träger 10 kann für Licht-nichtdurchlässig (opak), für Licht-halbdurchlässig (transluzent) oder lichtdurchlässig (transparent) sein, und es ist im allgemeinen bevorzugt, daß der Träger lichtdurchlässig und wasserundurchlässig ist. Bevorzugte Materialien für den lichtdurchlässigen und wasserundurchlässigen Träger sind Polyethylenterephthalat und Polystyrol. Im allgemeinen wird eine Unterbeschichtung bereitgestellt oder der Träger wird einer Hydrophilierungsbehandlung unterworfen, um die hydrophile Schicht fest anzuhaften.
- Die in Figur 1 dargestellte Substratschicht 14 kann zusätzlich zu dem nicht-diffusionsfähigen Substrat ein polymerisiertes Antigen und einen Enzym-markierten Antikörper enthalten, um eine Schicht für die immunologische Reaktion (immunologische Reaktionsschicht) zu bilden, in der eine immunologische Reaktion stattfinden kann. Mit solch einer Konstruktion findet eine homogene immunologische Enzymreaktion in dem Element nur durch Tüpfeln einer Probe auf das Element statt.
- Andernfalls ist irgendein Vertreter des polymerisierten Antigens oder des Enzym-markierten Antikörpers in der Substratschicht enthalten, und der andere ist in einer wasserdurchlässigen Schicht, die auf die Substratschicht laminiert ist, enthalten.
- Alternativ kann das polymerisierte Antigen und der Enzymmarkierte Antikörper in getrennten Mehrfachschichten getrennt enthalten sein.
- Wie in Figur 2 beispielsweise dargestellt ist, kann eine wasserdurchlässige Schicht 16, die den Enzym-markierten Antikörper enthält, auf der Substratschicht 14 angeordnet sein, und eine weitere wasserdurchlässige Schicht 18, die das polymerisierte Antigen enthält, kann auf der Schicht 16 laminiert sein, um das erfindungsgemäße Immunoassayelement zu bilden. In diesem Fall diffundiert und wandert der in der Probe vorhandene Ligand (Antigen) in die Schicht 16 zusammen mit dem polymerisierten Antigen, das in der Schicht 18 enthalten ist. In der Schicht 16 binden sich der Ligand bzw. das polymerisierte Antigen an den Antikörper des Enzym-markierten Antikörpers und wandern anschließend in die Substratschicht.
- Alternativ können ein polymerisiertes Antigen und ein Enzym-markierter Antikörper in einer getrennten Schicht in im wesentlichen trockenen Zustand oder bei im wesentlichen Abwesenheit von Wasser vorhanden sein.
- Wie in Figur 3 im Detail dargestellt, kann das erfindungsgemäße Analysenelement eine wasserdurchlässige Schicht 20, die auf der Substratschicht 14 darüber angeordnet ist, umfassen, wobei die wasserdurchlässige Schicht 20 ein polymerisiertes Antigen und einen Enzym-markierten Antikörper in im wesentlichen trockenen Zustand oder bei im wesentlichen Abwesenheit von Wasser enthält. Bei solch einer Ausführungsform, bei der eine Probe, die einen Analyten in einem wäßrigen Medium enthält, auf die Schicht 20 getüpfelt wird, bilden der Ligand (Antigen) in der Probe und das polymerisierte Antigen Komplexe mit dem Enzym-markierten Antikörper, und die gebildeten Komplexe wandern in die Substratschicht 14. Um zu erreichen, daß ein Großmolekül-Antigen und ein Enzym-markierter Antikörper zusammen in einer getrennten Schicht in im wesentlichen trockenen Zustand oder bei im wesentlichen Abwesenheit von Wasser enthalten sind, können entweder ein oder beide des polymerisierten Antigens und des Enzym-markierten Antikörpers in einem nicht-wäßrigen Medium, wie einem Alkohol (z.B. Ethanol) aufgelöst oder dispergiert werden, und dann wird die Lösung oder Dispersion in die wasserdurchlässige Schicht imprägniert.
- Das erfindungsgemäße Trocken-Immunoassayelement kann nach einem beliebigen der bekannten Verfahren, die in den Beschreibungen der vorstehend genannten Patente des Stands der Technik beschrieben sind, hergestellt werden.
- Das erfindungsgemäße Analysenelement kann in ein quadratisches Stückchen mit Seitenlängen jeweils im Bereich von etwa 15 mm bis etwa 30 mm oder eine Scheibe mit im wesentlichen gleicher Fläche zurechtgeschnitten werden, und es ist bevorzugt, unter dem Gesichtspunkt der Herstellung, des Verpackens, des Transports, der Lagerung und den Arbeitsweisen hinsichtlich des Messens, daß es in einem Führungsrahmen enthalten ist, der beispielsweise in der JP-PS Nr. 28331/1982 (entsprechend der US-PS Nr. 4 169 751), der ungeprüften japanischen Gebrauchsmusterveröffentlichung Nr. 142454/1981 (entsprechend der US-PS Nr. 4 387 990) der JP-OPS Nr. 63452/1982, der ungeprüften japanischen Gebrauchsmusterveröffentlichung Nr. 32350/1983 und der JP- OPS Nr. 501144/1983 (entsprechend der internationalen Veröffentlichung WO 83/00391) beschrieben ist, als einen Objektträger für die chemische Analyse zu verwenden. Für die Eignung bei einigen Verwendungen kann es in eine Bandform, die in einer Kassette oder einem Magazin enthalten ist, geformt werden, oder es kann ein kleines Stück davon auf eine Karte mit einer öffnung aufgetragen werden oder in einer solchen enthalten sein.
- Das erfindungsgemäße Analysenelement kann für die quantitative Analyse eines Analyt-Liganden in einer Probenflüssigkeit verwendet werden, indem es gemäß den Verfahrensweisen, die in der Beschreibung der vorstehend genannten vorveröffentlichten Patente beschrieben sind, verwendet wird.
- Beispielsweise werden etwa 5 µl bis etwa 30 µl, vorzugsweise 8 µl bis 15 µl, einer wäßrigen Probenflüssigkeit, wie Serum, Plasma oder Urin, auf die Substratschicht 14 getüpfelt oder in anderer Weise zugeführt. Das mit der Probenflüssigkeit betüpfelte Analysenelement wird anschließend bei einer konstanten Temperatur von etwa 20ºC bis etwa 45ºC, vorzugsweise bei einer konstanten Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 40ºC, für 1 bis 10 Minuten inkubiert. Das reflektierte Licht der Farbe oder der Farbänderung in dem Element kann von der lichtdurchlässigen Trägerseite her gemessen werden, und die Menge des in der Probe enthaltenen Liganden kann unter Verwendung einer zuvor erstellten Kalibrierungskurve, basierend auf dem Prinzip der Kolorimetrie, bestimmt werden. Das Volumen der aufgetüpfelten flüssigen Probe sowie die Zeit und Temperatur für die Inkubation werden konstant aufrechterhalten, um die Genauigkeit der quantitativen Analyse zu verbessern.
- Die Meßverfahrensweise kann unter Verwendung der chemische-Analysevorrichtung durchgeführt werden, die in den JP-OPSen Nrn. 125543/1985, 220862/1985, 294367/1986 und 161867/1983 (die zuletztgenannte Veröffentlichung entspricht der US-PS Nr. 4 424 191) beschrieben ist, um eine quantitative Analyse mit einer hohen Genauigkeit unter Einsatz extrem einfacher Verfahrensschritte zu realisieren. Mittlerweile kann eine halbquantitative Analyse durch Beurteilung des Färbungsgrades mit dem bloßen Auge ausgeführt werden, falls eine solche visuelle Beurteilung für die Aufgabenstellung oder die erforderliche Genauigkeit angemessen ist Wenn das Analysenelement das polymensierte Antigen und den Enzym-markierten Antikörper nicht enthält, wird die wäßrige Probenflüssigkeit mit einer Lösung, die das polymerisierte Antigen und den Enzym-markierten Antikörper enthält, vermischt, um die Bindungsreaktion zu vervollständigen, und anschließend auf die Substratschicht getüpfelt.
- 5 mg Bacillus subtilis-Amylase wurden in 1 ml eines 0,1 M Glycerophosphats (pH 6,3) aufgelöst, und 100 µl einer 2 mg/ml-Lösung von [4-(Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbonsäure]succinimidester (CHMS) in DMF wurden zugesetzt, um die Umsetzung bei Raumtemperatur für 1 Stunde erfolgen zu lassen. Das Reaktionsgemisch wurde auf eine Sephadex-G-25- Säule aufgetragen, die mit einem 0,1 M Glycerophosphat (pH 6,3) durchflossen wurde, um die passierte Fraktion unter Erhalt von 4-(Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxyamidoamylase (CHM-Amylase) aufzufangen.
- 300 µg Papain wurden zu 10 mg Anti-Theophyllin-Maus-IgG (in 2 ml 0,1 M Acetatpuffer (pH 5,5)) zugesetzt und bei 37ºC für 18 Stunden gerührt. Eine 0,1 N NaOH-Lösung wurde der Reaktionsflüssigkeit zugesetzt, um deren pH-Wert auf pH 6,0 einzustellen, und anschließend auf eine AcA-44-Gelsäule, die zuvor mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3), enthaltend 1 mM EDTA, equilibriert worden war, gegeben, gefolgt von Elution mit der vorstehend genannten Phosphat- Puffer-Lösung. Der Peakanteil des Eluats mit Molekulargewichten von näherungsweise 100.000 wurde gesammelt und auf 1 ml aufkonzentriert, um das gewünschte Anti-Theophyllin- Maus-IgG F(ab')&sub2; zu erhalten.
- 100 µl einer 10 mg/ml-wäßrigen Lösung von 2-Mercaptoethylamin-HCl-Salz wurden zu 1 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers (enthaltend 1 mM EDTA, pH 6,0), der 6 mg des in Stufe (1- B) hergestellten Anti-Theophyllin-Maus-IgG-F(ab')&sub2; enthielt, gegeben und bei 37º für 90 Minuten gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde der Gelfiltration mittels einer Sephadex-G25 -Säule, die zuvor mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,3) equilibriert worden war, zur Entfernung von nichtumgesetztem 2-Mercaptoethylamin unterworfen, um HS- Fab' zu erhalten. 2 mg der durch Stufe (1-A) hergestellten CHM-α-Amylase wurden zu HS-Fab' zugesetzt, um die Umsetzung bei 37ºC für 90 Minuten erfolgen zu lassen. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend einer Gelfiltration unter Verwendung der AcA-34-Säule, die mit einer 0,1 M Phosphatgepufferten 5 mM Calciumchloridlösung (pH 7,0) equilibriert worden war, unterworfen, um eine Fraktion mit Molekulargewichten von nicht weniger als 200.000 zu sammeln, und die Fraktionen wurden aufkonzentriert, um das gewünschte Konjugat von α-Amylase und Anti-Theophyllin-Maus- IgG-Fab' zu erhalten.
- 5 mg 8-Propylcarboxytheophyllin wurden in 1 ml Dimethylformamid (DMF) aufgelöst, und dazu wurden 3 mg N-Hydroxysuccinimid und 5 mg wasserlösliches Carbodiiinid zugesetzt, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um das aktivierte Theophyllin herzustellen. 10 mg Pferd-Ferritin wurden in 1 ml einer 0,1 M wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat aufgelöst und mit 500 µl der vorstehend genannten aktiviertes-Theophyllin-Lösung versetzt. Nach Stehenlassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde ließ man die gemischte Lösung durch eine Sephadex-G25 -Säule, die zuvor mit einer Phosphat-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung (PBS, pH 7,0) equilibriert worden war, fließen, um nichtumgesetzte Substanzen zu entfernen, wobei 9 mg des gewünschten polymerisierten Antigens (Pferd-Ferritin-Theophyllin-Konjugat) erhalten wurden.
- 5 mg 8-Propylcarboxytheophyllin wurden in 1 ml DMF gelöst und mit 3 ing N-Hydroxysuccinimid und 5 mg wasserlöslichem Carbodiimid versetzt, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um das aktivierte Theophyllin zu erhalten. 10 mg Rinderserumalbumin (BSA) wurden in 1 ml einer 0,1 M wäßrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat aufgelöst und mit 500 µl der vorstehend genannten aktiviertes- Theophyllin-Lösung versetzt. Die gemischte Lösung wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehengelassen und anschließend wurden nichtumgesetzte Substanzen durch eine Sephadex-G25 -Säule, die zuvor mit PBS equilibriert worden war, entfernt, um 9 mg des gewünschten Großmolekül-Antigens (Theophyllin-BSA-Konjugat) zu erhalten.
- Auf eine farblose und transparente Polyethylenterephthalat(PET)-Platte (Träger), die mit einer Gelatine-Unterbeschichtung beschichtet ist und eine Dicke von 180 µm aufweist, wurde eine Reagenslösung, die ein Vernetzung-Reagens enthält, aufgebracht, gefolgt von Trocknen, um eine Reagensschicht so zu bilden, daß die entsprechenden Komponenten die unten aufgeführten Deckvermögen aufweisen.
- Alkali-behandelte Gelatine 14,5 g/m²
- Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend 9 bis 10 (durch schnittlich) Oxyethyleneinheiten) 0,2 g/m2
- Glucoseoxidase 5000 U/m²
- Peroxidase 15000 U/m²
- Glucoamylase 5000 U/m²
- 2-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl)- 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-5-phenytylimidazol (Leukofarbstoff), Acetat 0,38 g/m2
- Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]-methan 0,1 g/m²
- Eine Klebe- bzw. Haftschicht wurde auf die Reagensschicht aufgebracht, so daß sie das folgende Deckvermögen aufweist, und anschließend getrocknet.
- Alkali-behandelte Gelatine 14,5 g/m2
- Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]- methan 0,1 g/m2
- Anschließend wurde eine wäßrige Lösung, die das folgende Reagens enthielt, über die Oberfläche der Klebeschicht aufgetragen, so daß sie das folgende Deckvermögen aufwies, um die Gelatineschicht zu quellen, auf der durch gleichförmiges Pressen unter einem leichten Druck ein Trikot-gewirkter Stofflaminiert war, der durch Stricken von PET- gesponnenem Garn von 36 Gage entsprechend 50 Denier hergestellt wurde und eine Dicke von etwa 250 µm aufwies, zur Bildung einer porösen Auftragungsschicht.
- Nonylphenoxypolyethoxyethano (enthaltend 9 bis 10 (durchschnittlich) Oxyethyleneinheiten) 0,15 g/m2
- Bis[(vinylsulfonylmethylcarbonyl)amino]-methan 0,4 g/m2
- Danach wurde eine Substratschicht durch Aufbringen eines Substrats, gefolgt von Trocknen, gebildet, so daß sie die folgenden Deckvermögen aufwies, wobei ein mehrschichtiges Analysenelement zur quantitativen Analyse von Theophyllin hergestellt wurde.
- Carboxymethylstärke 4 g/m2
- Nonylphenoxypolyethoxyethanol (enthaltend 9 bis 10 (durchschnittlich) Oxyethyleneinheiten) 0,2 g/m2
- Das so hergestellte Element wurde in kleine Stücke (tips) geschnitten, wobei jedes 1,5 cm im Quadrat aufwies, und jedes Stück war in einem Trägerrahmen enthalten, der in der JP-OPS Nr. 63452/1982 beschrieben ist, um einen mehrschichtigen Trockenobjektträger A für die Analyse von Theophyllin herzustellen.
- Jeweils 0,1 mg/ml des durch Synthesebeispiel 1 hergestellten Amylase-Anti-Theophyllin-IgG-Konjugats und des durch Synthesebeispiel 2 hergestellten Theophyllin-Pferd-Ferritin-Konjugats wurden zu einem 50 mM Glycerophosphatpuffer (pH 7), der eine vorgegebene Menge an Theophyllin enthielt, zugesetzt und bei 37ºC für 20 Minuten inkubiert. Jeweils 10 µl Lösung wurden auf den vorstehend genannten Objektträger A aufgetüpfelt. Der Objektträger A wurde bei 37ºC gehalten, und die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer Wellenlänge von 650 nm wurde von der Trägerseite her gemessen. Der Unterschied in der optischen Dichte (ΔOD&sub5;&submin;&sub3;) des reflektierten Lichts, das nach der Zeitspanne von 3 Minuten bzw. 5 Minuten entsprechend gemessen wurde, ist in Figur 4 dargestellt.
- Ähnlich wie in Beispiel 1 wurde ein mehrschichtiges Analysenelement mit einer Trikot-gewirkten Stoffschicht hergestellt. Auf der Trikot-gewirkten Stoffschicht, die sowohl als eine Substratschicht als auch als eine Auftragungsschicht diente, wurde eine Lösung des Amylase-Anti-Theophyllin-IgG-Konjugats (Synthesebeispiel 1) in Ethanol aufgebracht, so daß ein Deckvermögen von 3 mg/m² erhalten wurde, gefolgt von Trocknen, um einen mehrschichtigen Immunoassay-objektträger B für die Analyse von Theophyllin herzustellen.
- 10 µl einer 50 mM Glycerophosphat-Pufferlösung (pH 7), die das durch Synthesebeispiel 3 hergestellte Theophyllin-BSA- Bound (0,1 mg/ml) enthält, und auch eine vorgegebene Menge an Theophyllin enthält, wurden auf den Objektträger B getüpfelt. Der Objektträger B wurde bei 37ºC gehalten, und die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer Wellenlänge von 650 nm wurde von der PET-Trägerseite her gemessen. Figur 5 zeigt den Unterschied hinsichtlich der optischen Dichte (ΔOD&sub5;&submin;&sub3;) zwischen der optischen Dichte des reflektierten Lichts, das nach der Zeitdauer von 3 Minuten nach dem Auftüpfeln gemessen wurde, und der optischen Dichte des reflektierten Lichts, das nach der Zeitdauer von 5 Minuten nach dem Auftüpfeln gemessen wurde. Es sollte aus der in Figur 5 dargestellten Kalibrierungskurve klar zu erkennen sein, daß das gemäß der Erfindung hergestellte Trockenimmunoassayelement zur Analyse von Theophyllin zur quantitativen Analyse von Theophyllin unter Erhalt des genauen Ergebnisses verwendet werden kann.
- Ähnlich wie bei Beispiel 1 wurde ein mehrschichtiges Analysenelement mit einer Trikot-gewirkten Stoffschicht hergestellt Auf die Trikot-gewirkte Stoffschicht, die sowohl als eine Substratschicht als auch als eine Auftragungsschicht diente, wurden 3 mg/m² des Theophyllin-BSA- Konjugats (Synthesebeispiel 3) durch Imprägnieren mit einer wäßrigen Lösung des Theophyllin-BSA-Konjugats und 3 mg/m² des Amylase-Anti-Theophyllin-IgG-Konjugats (Synthesebeispiel 1) durch Imprägnieren mit einer Ethanollösung des Amylase-Anti-Theophyllin-IgG-Konjugats aufgebracht, gefolgt von Trocknen, um einen mehrschichtigen Immunoassay-Objektträger C für die Analyse von Theophyllin herzustellen.
- 10 µl einer 50 mM-Glycerophosphat-Pufferlösung (pH 7), die eine vorgegebene Menge an Theophyllin enthielt, wurden auf den Objektträger C getüpfelt Der objektträger C wurde bei 37ºC gehalten, und die optische Dichte des reflektierten Lichts mit einer Wellenlänge von 650 nm wurde von der Trägerseite her gemessen. Eine Kalibrierungskurve wurde durch Berechnen der Differenz hinsichtlich der optischen Dichte (ΔOD&sub5;&submin;&sub3;) zwischen der optischen Dichte des reflektierten Lichts, das nach der Zeitdauer von 3 Minuten nach dem Auftüpfeln gemessen wurde, und der optischen Dichte des reflektierten Lichts, das nach der Zeitdauer von 5 Minuten nach dem Auftüpfeln gemessen wurde, erstellt. Es wurde gefunden, daß Theophyllin, ähnlich dem Beispiel 2, mit hoher Genauigkeit quantitativ analysiert werden kann.
Claims (12)
1. Immunoassayelement zur quantitativen Analyse eines
Liganden durch Bestimmung der Enzyinaktivitätsänderung
eines markierenden Enzyms, die durch eine kompetitive
Reaktion zwischen
1) dem Liganden;
2) einem verknüpften Produkt aus dem Liganden oder
einem Derivat davon mit einer hinsichtlich des Liganden
gemeinsamen antigenen Determinante und einer Verbindung
mit hohem Molekulargewicht; und
3) einem Antikörper, der sich in spezifischer
Weise mit dem Liganden oder dem Derivat davon umsetzen und
verbinden kann, und der mit dem markierenden Enzym
markiert worden ist, verursacht wird,
wobei das Element
eine Substratschicht, enthaltend ein
nicht-diffusionsfähiges Substrat, das ein diffusionsfähiges Material
in Anwesenheit des Enzyms bildet, umfaßt, dadurch
gekennzeichnet, daß es weiter eine
Reagensschicht, enthaltend ein Fragmentierungsenzym zur weiteren
Fragmentierung des diffusionsfähigen Materials in ein
Produkt mit niedrigerem Molekulargewicht, umfaßt.
2. Immunoassayelement nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Antikörper in der
Substratschicht oder in einer auf der Substratschicht
angeordneten Schicht enthalten ist.
3. Immunoassayelement nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das verknüpfte Produkt in
der Substratschicht oder in einer auf der Substratschicht
angeordneten Schicht enthalten ist.
4. Immunoassayelement nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß der Antikörper und das
verknüpfte Produkt in der Substratschicht enthalten sind.
5. Immunoassayelement nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß das markierende Enzym des
Antikörpers eine endo-aktive Glucosidase ist und das
Fragmentierungsenzym eine exo-aktive Glucosidase ist.
6. Immunoassayeleinent nach Anspruch 5, dadurch
gekennzeichnet, daß das nicht-diffusionsfähige
Substrat ein Polysaccharid ist, nämlich ein Polymeres aus
Glucoseeinheiten, daß das markierende Enzym eine
endo-aktive Glucosidase mit der Fähigkeit ist, auf das
Polysacchand einzuwirken, wobei ein Oligomeres aus
Glucoseeinheiten gebildet wird, daß das Fragmentierungsenzym eine
exo-aktive Glucosidase mit der Fähigkeit ist, auf das
Oligomere einzuwirken, wobei ein Monomeres aus Glucose
gebildet wird, und daß das Produkt mit niedrigerem
Molekulargewicht ein Glucosemonomeres ist.
7. Immunoassayelement nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagensschicht oder
eine andere wasserdurchlässige Schicht eine
Reagenszusammensetzung enthält, die sich mit dem fragmentierten
Produkt unter Bildung eines Farbstoffs mit einem
Absorptionspeak in dem sichtbaren Wellenlängenbereich umsetzt.
8. Immunoassayelement nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung
sich mit dem fragmentierten Produkt unter Bildung eines
Peroxids umsetzt.
9. Immunoassayelement nach Anspruch 8, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung
einen Leukofarbstoff enthält, der sich bei Oxidation
verfärbt.
10. Iminunoassayelement nach Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagensschicht ein
hydrophiles Bindemittel enthält, und daß die
Reagenszusammensetzung eine Dispersion von einer Lösung des
Leukofarbstoffs in einem wasserunlöslichen Lösungsmittel in einem
hydrophilen Bindemittel enthält.
11. Immunoassayelement nach Anspruch 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung
eine Glucoseoxidase, eine Peroxidase und einen
Leukofarbstoff enthält.
12. Immunoassay-Verfahren zur quantitativen Analyse
eines Gehalts eines Liganden in einer Probe durch
Bestimmung der Enzymaktivitätsveränderung eines markierenden
Enzyms, die durch eine kompetitive Reaktion zwischen
1) dein Liganden;
2) einem verknüpftem Produkt aus dem Liganden oder
einem Derivat davon mit einer hinsichtlich des Liganden
gemeinsamen antigenen Determinante und einer Verbindung
mit hohem Molekulargewicht; und
3) einem Antikörper, der sich in spezifischer
Weise mit dein Liganden oder dem Derivat davon umsetzt und
verbindet, und der mit dem markierenden Enzym markiert
worden ist, verursacht wird, wobei das Verfahren die
Stufen umfaßt von:
(a) Auftragen der Probe auf eine Substratschicht,
die ein nicht-diffusionsfähiges Substrat zur Bildung eines
diffusionsfähigen Materials in Anwesenheit des
markierenden Enzyms enthält, dadurch gekennzeichnet,
daß die Probe auf die Substratschicht des Elements nach
Anspruch 1 aufgetragen wird, nachdem die Probe mit dem
verknüpften Produkt und dem Antikörper vermischt worden
ist, um die kompetitive Reaktion zu vervollständigen, und
daß das Immunoassay-Verfahren weiter umfaßt:
(b) Wandemlassen des in der Substratschicht
gebildeten diffusionsfähigen Materials in die Reagensschicht
des Elements; und
(c) Messen der Menge des in der Reagensschicht
gebildeten Produkts mit niedrigerem Molekulargewicht.
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