DE69637131T2

DE69637131T2 - Humanisierte antikörper gegen humanes gp39, zusammensetzungen die diese enthalten und deren therapeutische verwendungen

Info

Publication number: DE69637131T2
Application number: DE69637131T
Authority: DE
Inventors: Amelia Cardiff BLACK; Nabil Hanna; Eduardo A. Kensington Padlan; Roland A. San Diego Newman
Original assignee: Biogen Idec Inc
Current assignee: Biogen Inc
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1996-11-07
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2016-11-08
Also published as: KR19990067370A; NO324272B1; NZ324500A; AU717762B2; ATE364699T1; AU1157697A; NO982062D0; US20060147446A1; EP0862630B1; US7074406B2; US6506383B1; KR100389711B1; WO1997017446A3; WO1997017446A2; NO982062L; JP2000500334A; US6001358A; DE69637131D1; EP0862630A2; HUP9902327A2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft humanisierte Antikörper, speziell für humanes gp39, DNA, welche solche Antikörper kodiert, Arzneimittel, welche solche humanisierten Antikörper als therapeutische Mittel enthalten und die Verwendung davon. Die Anmeldung beschreibt auch Verfahren für ihre Herstellung. Diese Antikörper finden insbesondere Verwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, einschließlich z.B. rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose, Diabetes und systemischem Lupus erythematodes sowie nicht-Autoimmunerkrankungen, einschließlich z.B. Transplantat-Wirt-Reaktion und zur Verhinderung von Transplantatabstoßung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Immunsystem ist zur Herstellung von zwei Typen von Antigen-spezifischen Antworten auf fremde Antigene in der Lage. Zellvermittelte Immunität ist der Ausdruck, welcher zur Bezugnahme auf Effektorfunktionen des Immunsystems, welche durch T-Lymphozyten vermittelt werden, verwendet wird. Humorale Immunität ist der Ausdruck, welcher zur Bezugnahme auf die Herstellung von Antigen-spezifischen Antikörpern durch B-Lymphozyten verwendet wird. Es ist seit langem anerkannt, dass die Entwicklung von humoraler Immunität gegen die meisten Antigene nicht nur Antikörper-herstellende B-Lymphozyten erfordert, sondern auch die Einbeziehung von T-Helferlymphozyten (hier nachstehend Th). (Mitchison, Eur. J. Immunol., 1: 18–25 (1971); Claman und Chaperon, Transplant Rev., 1: 92–119 (1969); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70: 2624–2629 (1973); Raff et al., Nature, 226: 1257–1260 (1970)). Bestimmte Signale oder "Hilfen" werden durch Th-Zellen in Antwort auf eine Stimulierung durch Thymus-abhängige (hier nachstehend TD) Antigene bereitgestellt. Da einige B-Lymphozytenhilfen durch lösliche Moleküle, welche von Th-Zellen freigesetzt werden, (zum Beispiel Lymphokine wie IL-4 und IL-5) vermittelt werden, erfordert eine Aktivierung von B-Zellen auch eine kontaktabhängige Wechselwirkung zwischen B-Zellen und Th-Zellen. (Hirohata et al., J. Immunol., 140: 3736–3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol., 143: 1745–1765 (1989)). Dies weist daraufhin, dass eine B-Zellen-Aktivierung eine obligatorische Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenmolekülen auf B-Zellen und Th-Zellen einbezieht. Eine solche Wechselwirkung wird ferner durch die Beobachtung unterstützt, dass isolierte Plasmamembrane von aktivierten T-Zellen Helferfunktionen bereitstellen können, welche für B-Zellen-Aktivierung notwendig sind. (Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 564–568 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145: 2025–2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol., 146: 1118–1124 (1991)).
Es ist ferner bekannt, dass in einem kontaktabhängigen Vorgang, welcher „T-Zellen-Helferfunktion" genannt wird, CD4⁺ T-Lymphozyten die Aktivierung und Differenzierung von B-Lymphozyten steuern und dabei die humorale Immunantwort durch Modulieren der Spezifität, Sekretion und Isotyp-kodierten Funktionen von Antikörpermolekülen regulieren (Mitchell et al., J. Exp. Med., 128: 821 (1968); Mitchison, Eur. J. Immunol., 1: 68 (1971); White et al., J. Exp. Med., 14: 664 (1978); Reinherz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 4061 (1979); Janeway et al., Immunol. Rev., 101: 39 (1988); O'Brien et al., J. Immunol., 141: 3335 (1988); Rahemtulla et al., Nature, 353: 180 (1991); und Grusby et al., Science, 253: 1417 (1991)).
Der Vorgang, durch welchen T-Zellen B-Zellen helfen zu differenzieren, wurde in zwei getrennte Phasen aufgeteilt; die induktive Phase und die Effektorphase (Vitetta et al., Adv. Immunol., 45: 1 (1989); Noelle et al., Immunol. Today, 11: 361 (1990)). In der induktiven Phase kommen ruhende T-Zellen mit Antigen-geprimten B-Zellen in Kontakt und diese Assoziation ermöglicht eine Wechselwirkung von klonotypen T-Zellen-Rezeptor (TCR)-CD4-Komplexen mit Ia/Ag-Komplexen an B-Zellen (Janeway et al., Immunol. Rev., 101: 39 (1988); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 70: 2624 (1973); Zinkernagel, Adv. Exp. Med., 66: 527 (1976); Sprent, J. Exp. Med., 147: 1159 (1978); Sprent, Immunol. Rev., 42: 158 (1978); Jones et al., Nature, 292: 547 (1981); Julius et al., Eur. J. Immunol., 18: 375 (1982); Chestnut et al., J. Immunol., 126: 1575 (1981); und Rogozinski et al., J. Immunol., 126: 735 (1984)). TCR/CD4-Erkennung von Ia/Ag resultiert in der Bildung von stabilen T-B-Erkennungspaaren und in beide Richtungen in T- und B-Zellen-Aktivierung (Sanders et al., J. Immunol., 137: 2395 (1986); Snow et al., J. Immunol., 130: 614 (1983); Krusemeier et al., J. Immunol., 140: 367 (1988); Noelle et al., J. Immunol., 143: 1807 (1989); Bartlett et al., J. Immunol., 143: 1745 (1989); und Kupfer et al., Annu. Rev. Immunol., 7: 309 (1987)). In der Effektorphase steuern aktivierte T-Zellen die B-Zellen-Differenzierung durch Sekretieren von Lymphokinen (Thompson et al., J. Immunol., 134: 369 (1985)) und durch kontaktabhängige Stimuli (Noelle et al., J. Immunol., 143: 1807 (1989); Clement et al., J. Immunol., 140: 3736 (1984); Crow et al., J. Exp. Med., 164: 1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol. 140: 3736 (1988); Jover et al., Clin. Immunol. Immun., 53: 90 (1989); Whalen et al., J. Immunol., 141: 2230 (1988); Pollok et al., J. Immunol., 146: 1633 (1991); und Bartlett et al., J Immunol., 143: 1745 (1990)), wobei beide erforderlich sind, damit T-Zellen kleine ruhende B-Zellen steuern können, damit sie zu Ig-sekretierenden Zellen terminal differenzieren (Clement et al., J. Immunol., 132: 740 (1984); Martinez et al., Nature, 290: 60 (1981); und Andersson et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77: 1612 (1980)).
Obwohl die induktive Phase der T-Zellen-Helfer Ag-abhängig und MHC-eingeschränkt ist (Janeway et al., Immun. Rev., 101: 34 (1988); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 10: 2624 (1973); Zinkernagle, Adv. Exp. Med. Biol., 66: 527 (1976)); kann die Effektorphase der T-Zellen-Helferfunktion Ag-unabhängig und nicht MHC-eingeschränkt sein (Clement et al., J. Immunol., 132: 740 (1984); Hirohata et al., J. Immunol., 140: 3736 (1988); Whalen et al., J. Immunol., 143: 1715 (1988)). Ein zusätzliches gegensätzliches Merkmal ist, dass die induktive Phase der T-Zellen-Helfer oft CD4-Moleküle erfordert und durch anti-CD4 mAb inhibiert wird (Rogozinski et al., J. Immunol., 126: 735 (1984)), wogegen die Effektorhelferfunktion keine CD4-Moleküle erfordert (Friedman et al., Cell Immunol., 103: 105 (1986) und nicht durch anti-CD4 mAbs inhibiert wird (Brian, Proc. Natl. Acad. Sc., USA, 85: 564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol., 140: 3736 (1988); Whalen et al., J. Immunol., 143: 1745 (1988); und Tohma et al., J. Immunol., 146: 2547 (1991)). Man nimmt an, dass die nicht-spezifische Effektorhelferfunktion auf spezielle B-Zellen-Targets durch die lokalisierte Natur der T-B-Zellen-Wechselwirkungen mit Antigen-spezifischen Erkennungspaaren fokussiert ist (Bartlett et al., J. Immunol., 143: 1745 (1989); Kupfer et al., J. Exp. Med., 165: 1565 (1987) und Poo et al., Nature, 332: 378 (1988)).
Obwohl die terminale B-Zellen-Differenzierung sowohl Kontakt- als auch Lymphokinvermittelte Stimuli von T-Zellen erfordert, können Zwischenstufen der B-Zellen-Differenzierung durch aktivierte T-Zellen-Oberflächen in der Abwesenheit von sekretierten Faktoren induziert werden (Crow et al., J. Exp. Med., 164: 1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 564 (1988); Sekita et al., Eur. J. Immunol., 18: 1405 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol., 145: 2025 (1990); Noelle et al., FASEB J, 5: 2770 (1991)). Diese Zwischenwirkungen an B-Zellen schließen eine Induzierung der Oberflächen-CD23-Expression ein (Crow et al., Cell Immunol., 121: 94 (1989)), Enzyme, welche mit der Zellzyklusprogression (Pollok et al., J. Immunol., 146: 1633 (1991)) und dem Reaktionsvermögen auf Lymphokine (Noelle et al., FASEB J, 5: 2770 (1989); Pollok et al., J. Immunol., 146: 1633 (1991)) in Zusammenhang stehen. Kürzlich wurden einige der Aktivierungs-induzierten T-Zellen-Oberflächenmoleküle, welche die B-Zellen-Aktivierung steuern, identifiziert. Zusätzlich haben funktionelle Studien einige Merkmale von Aktivierungs-induzierten T-Zellen-Oberflächenmolekülen, welche die B-Zellen-Aktivierung steuern, charakterisiert. Zuerst erlangen T-Zellen 4 bis 8 h nach der Aktivierung die Fähigkeit zur Stimulierung von B-Zellen (Bartlett et al., J. Immunol., 145: 3956 (1990) und Tohma et al., J. Immunol., 146: 2544 (1991)). Zweitens, die stimulierende Aktivität auf B-Zellen, welche mit den Oberflächen von aktivierten T-Zellen in Zusammenhang steht, wird bei mit Paraformaldehyd fixierten Zellen (Noelle et al., J. Immunol., 143: 1807 (1989); Cros et al., J. Exp. Med., 164: 1760 (1986); Pollok et al., J. Immunol., 146: 1633 (1991); Tohma et al., J. Immunol., 146: 2544 (1991); und Kubota et al., Immunol., 72: 40 (1991)) und bei gereinigten Membranfragmenten (Hodgkin et al., J. Immunol., 145: 2025 (1990) und Martinez et al., Nature, 290: 60 (1981)) beibehalten. Drittens, die stimulierende Aktivität auf B-Zellen ist empfindlich für eine Proteasebehandlung (Noelle et al., J. Immunol., 143: 1807 (1989); Sekita et al., Eur. J. Immunol., 18: 1405 (1988); und Hodgkin et al., J. Immunol., 145: 2025 (1990). Viertens, der Vorgang zur Erlangung dieser oberflächenaktiven Strukturen nach einer T-Zellen-Aktivierung wird durch Cycloheximid inhibiert (Tohma et al., J. Immunol., 196: 2349 (1991) und Hodgkin et al., J. Immunol., 195: 2025 (1990)).
Ein Zelloberflächenmolekül, CD40, wurde an unreifen und reifen B-Lymphozyten identifiziert, welches, wenn es durch Antikörper vernetzt wird, die B-Zellen-Proliferation induziert. Valle et al., Eur. J. Immunol., 19: 1463–1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol., 140: 1425–1430 (1988); Gruder et al., J. Immunol., 142: 4144–4152 (1989).
CD40 wurde molekular geklont und charakterisiert (Stamenkovic et al., EMBO J., 8: 1403–1410 (1989)).
CD40 wird von B-Zellen, interdigitierenden dendritischen Zellen, Makrophagen, dendritischen Follikelzellen und Thymusepithel exprimiert (Clark, Tissue Antigens 36: 33 (1990); Alderson et al., J. Exp. Med., 178: 669 (1993); Galy et al., J. Immunol. 142: 772 (1992)). Humanes CD40 ist ein Membranprotein Typ I mit 50 kDa und gehört zur Nervenwachstumsfaktorrezeptorfamilie (Hollenbaugh et al., Immunol. Rev., 138: 23 (1994)). Eine Signalgebung durch CD40 in der Gegenwart von IL-10 induziert die IgA-, IgM- und IgG-Herstellung, was darauf hinweist, dass das Isotyp-Umschalten durch diese Wechselwirkungen geregelt wird. Die Wechselwirkung zwischen CD40 und seinem Liganden resultiert in einem geprimten Zustand der B-Zelle, was sie für darauf folgende Signale empfänglich macht.
Auch ein Ligand von CD40, gp39 (der auch als CD40-Ligand oder CD40L bezeichnet wird), wurde kürzlich molekular geklont und charakterisiert (Armitage et al., Nature, 357: 80–82 (1992); Lederman et al., J. Exp. Med., 175: 1091–1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBO J., 11: 4313–4319 (1992)). Das gp39-Protein wird an aktivierten, aber nicht ruhenden CD4⁺ Th-Zellen exprimiert. Spriggs et al., J. Exp. Med., 176: 1543–1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol., 22: 2573–2578 (1992); und Roy et al., J. Immunol., 151: 1–14 (1993). Zellen, welche mit dem gp39-Gen transfiziert sind und das gp39-Protein auf ihrer Oberfläche exprimieren, können die B-Zellen-Proliferation einleiten und sie können zusammen mit anderen stimulierenden Signalen die Antikörperherstellung induzieren. Armitage et al., Nature, 357: 80–82 (1992); und Hollenbaugh et al., EMBO J., 11: 4313–4319 (1992). Der Ligand von CD40, gp39, wurde insbesondere für die Maus (Noelle et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6550 (1992); Armitage et al., Nature, 357: 80 (1992)) und für Menschen (Hollenbaugh et al., Embo. J. 11: 4313 (1992); Spriggs et al., J. Exp. Met., 176: 1543 (1992)) identifiziert. gp39 ist ein Membranprotein Typ II und ist Teil einer neuen Gensuperfamilie, welche TNF-α, TNF-β und die Liganden für FAS, CD27, CD30 und 4-1BB einschließt.
Die Expression von gp39 kann leicht in vitro an CD4⁺ T-Zellen unter Verwendung von entweder anti-CD3-Antikörper oder Phorbolmyristatacetat (PMA) plus Ionomycin induziert werden. Die Expression ist schnell und transient, erreicht ihren Höhepunkt bei 6 bis 8 Stunden und geht zwischen 24 und 48 Stunden auf nahezu ruhende Levels zurück (Roy et al., J. Immunol., 151: 2497 (1993)). Es wurde berichtet, dass in vivo gp39 bei Menschen an CD4⁺ T-Zellen in der Hülle und den zentrozytischen Zonen von Lymphfollikeln und dem periarteriolaren Lymphozytenschaft der Milz im Zusammenhang mit CD40⁺ B-Zellen vorhanden ist (Lederman et al., J. Immunol., 149: 3807 (1992)). gp39⁺ T-Zellen stellen IL-2, IL-4 und IFN-γ her (Van der Eetwegh et al., J. Exp. Med., 178: 1555 (1993)).
Einmalige Einblicke in die neue Rolle von gp39 bei der Regulierung der humoralen Immunität wurden durch Untersuchungen einer Erkrankung des Menschen, X-gebundenes Hyper-IgM-Syndrom (HIM), geliefert. HIM ist ein grundlegender X-gebundener Immundefekt, des sen Typ durch einen Verlust bei der Thymus-abhängigen humoralen Immunität, der Unfähigkeit zur Herstellung von IgG, IgA und IgE, gekennzeichnet ist. Mutationen im gp39-Gen waren für die Expression eines nicht-funktionellen gp39-Proteins und die Unfähigkeit der T-Helferzellen von HIM-Patienten zur Aktivierung von B-Zellen verantwortlich (Allen et al., Science, 259–990 (1993); Aruffo et al., Cell, 72: 291 (1993); DiSanto et al., Nature, 361: 541 (1993); Korthauer et al., Nature, 361: 539 (1993)). Diese Untersuchungen unterstützen die Folgerung, dass früh nach der T-Zellen-Rezeptoreinbeziehung des Peptid/MHC-Klasse II-Komplexes gp39 an der T-Erkennungshelferzelle induziert wird, und die Bindung von gp39 an CD40 an der B-Zelle induziert die B-Zelle, in den Zellzyklus einzutreten und zu differenzieren zu Immunglobulin (Ig)-Sekretion und Isotyp-Umschaltung.
Funktionelle Untersuchungen haben gezeigt, dass die Behandlung von Mäusen mit anti-gp39 vollständig die Antikörperantwort gegen Thymus-abhängige Antigene (SRBC und TNP-KLH) beseitigte, aber nicht die gegen Thymus-unabhängige Antigene (TNP-Ficoll) (Foy et al., J. Exp. Med., 178: 1567 (1993)). Zudem verhinderte eine Behandlung mit anti-gp39 die Entwicklung von Kollagen-induzierter Arthritis (CIA) in Mäusen, welchen Kollagen gespritzt wurde (Durie et al., Science, 261: 1328 (1993)). Schließlich verhinderte anti-gp39 die Bildung von B-Gedächtniszellen und Keimzentren in der Mäusemilz (Foy et al., J. Exp. Med., 180: 157 (1994)). Insgesamt stellen diese Daten einen umfassenden Beweis dar, dass die Wechselwirkung zwischen gp39 an T-Zellen und CD40 an B-Zellen wesentlich für die Antikörperantworten gegen Thymus-abhängige Antigene ist.
Kürzlich wurde eine Anzahl von murinen Modellen einer Autoimmunerkrankung dazu genutzt, den möglichen therapeutischen Wert einer Verabreichung von anti-gp39 auf die Entwicklung der Erkrankung zu bewerten. Eine kurze Erörterung der Ergebnisse der Untersuchungen mit diesen Modellen wird nachstehend angegeben:
Kollagen-induzierte Arthritis: CIA ist ein Tiermodell für die humane Autoimmunerkrankung rheumatoide Arthritis (RA) (Trenthorn et al., J. Exp. Med., 146: 857 (1977)). Diese Erkrankung kann in vielen Spezies durch die Verabreichung von heterologem Kollagen Typ II induziert werden (Courtenay et al., Nature, 283: 665 (1980); Cathcart et al., Lab. Invest., 54: 26 (1986)).
Um die Wirkung von anti-gp39 auf die Induzierung von CIA zu untersuchen (Durie et al., Science, 261: 1328 (1993)), wurde männlichen DBA1/J-Mäusen intradermal Kükenkollagen Typ II, emulgiert in komplettem Freund-Adjuvans, an der Schwanzbasis injiziert. Eine darauffolgende Reizung wurde 21 Tage später durchgeführt. Die Mäuse wurden dann mit dem relevanten Kontrollantikörper oder anti-gp39 behandelt. Die Gruppen der Mäuse, welche mit anti-gp39 behandelt worden waren, zeigten keine Titer an anti-Kollagenantiköpern im Vergleich zu immunisierten, unbehandelten Kontrollmäusen. Eine histologische Analyse zeigte, dass die Mäuse, welche mit anti-gp39-Antikörper behandelt worden waren, keine Anzeichen von Entzündung oder irgendwelchen der typischen pathohistologischen Manifestationen der Erkrankung, welche bei immunisierten Tieren beobachtet wurden, zeigten. Diese Ergebnisse wiesen daraufhin, dass die gp39-CD40-Wechselwirkungen bei der Induzierung von CIA absolut wesentlich sind. Wenn die anfängliche Erkennungswechselwirkung zwischen der T-Zelle und der B-Zelle nicht erhalten wird, dann treten die nachfolgenden Vorgänge, wie die Autoantikörperbildung und die resultierenden Entzündungsantworten, nicht auf.
Kürzlich wurde gezeigt, dass gp39 bei der Aktivierung von Monozyten zur Herstellung von TNF-α und IL-6 in der Abwesenheit von GM-CSF, IL-3 und IFN-γ wichtig ist (Alderson et al., J. Exp. Med., 178: 669 (1993)). TNF-α wurde mit dem CIA-Erkrankungsvorgang (Thorbecke et al., Eur. J. Immunol., 89: 7375 (1992) und RA (DiGiovane et al., Ann. Rheum. Dis., 47: 68 (1988); Chu et al., Arthrit. Rheum., 39: 1125 (1991); Brennan et al., Eur. J. Immunol., 22: 1907 (1992) in Verbindung gebracht. Folglich kann eine Inhibierung von TNF-α durch anti-gp39 grundlegende entzündungshemmende Wirkungen in den Gelenken von Mäusen mit Arthritis haben. Sowohl die Inhibierung von TNF-α als auch der T-Zellen-B-Zellen-Wechselwirkungen durch anti-gp39 kann zu Manifestationen von CIA beitragen.
Experimentelle allergische Enzephalomyelitis (EAE): EAE ist eine experimentelle Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) (Zamvil et al., Ann. Rev. Immunol., 8: 579 (1990) und ist ein Erkrankungsmodell für den Autoimmunzustand des Menschen, Multiple Sklerose (MS) (Alvord et al., „Experimental Allergic Model for Multiple Sclerosis", NY 511 (1984)). Sie wird leicht in Säugerspezies durch Immunisierungen des Myelingrundproteins, aufgereinigt aus dem ZNS, oder eines Enzephalitis-auslösenden Proteolipids (PLP) induziert. SJL/J-Mäuse sind ein empfindlicher Mäusestamm (H-2^s) und über die Induzierung von EAE entwickeln diese Mäuse eine akute paralytische Erkrankung und es kann ein akutes zelluläres Infiltrat im ZNS identifiziert werden.
Classen und Mitarbeiter (nicht-veröffentlichte Daten) haben die Wirkungen von anti-gp39 auf die Induzierung von EAE in SJL/J-Mäusen untersucht. Sie fanden, dass die EAE-Entwicklung in den mit anti-gp39 behandelten Tieren vollständig unterdrückt war. Zudem waren die anti-PLP-Antikörper-Antworten im Vergleich mit jenen, welche für die Kontrolltiere enthalten wurden, verzögert und verringert.
EAE ist ein Beispiel einer zellvermittelten Autoimmunerkrankung, welche über T-Zellen vermittelt wird, wobei es keinen direkten Beweis für die Notwendigkeit für Autoantikörper beim Verlauf der Erkrankung gibt. Eine Beeinflussung der Wechselwirkung zwischen gp39 und CD40 verhindert die Induzierung der Erkrankung und die adoptive Übertragung der Erkrankung.
Chronische (c) und akute (a) Transplantat-Wirt-Reaktion (GVHD): Chronische und akute GVHD resultieren von Spenderzellen in Antwort auf vom Wirt verschiedenartigen MHC-Allelen. Bei cGVHD (H-2^d -> H-2^bd) kommt es zu einer erhöhten Herstellung von polyklonalem Immunglobulin aufgrund der Wechselwirkung von allospezifischen T-Helferzellen und den B-Wirtzellen. Eine in vivo-Verabreichung von anti-gp39-Antikörper blockierte die cGVHD-induzierten Serum-anti-DNA-Autoantikörper, die IgE-Herstellung, die spontane Immunglobulin-Herstellung in vitro, die damit in Zusammenhang stehende Splenomegalie und die Fähigkeit zur Übertragung der Erkrankung. Durie F.H. et al., J Clin. Invest., 94: 133 (1994). Die Antikörperherstellung blieb für ausgedehnte Zeitdauern nach dem Beenden der anti-gp39-Verabreichung inhibiert. Durch aGVHD induzierte, anti-allogenetische cytotoxische T-Lymphozyten (CTL)-Antworten wurden auch durch die in vivo-Verabreichung von anti-gp39 verhindert. Diese Daten weisen daraufhin, dass CD40-gp39-Wechselwirkungen bei der Erzeugung von beiden Formen von GVHD kritisch sind. Die Tatsache, dass die CTL-Antworten inhibiert wurden und dass eine kurze Behandlung mit anti-gp39 in einer Verhinderung der Erkrankung für eine lange Zeit resultierte, weist auf permanente Veränderungen im T-Zellkompartment durch die Coverabreichung von allogenetischen Zellen und anti-gp39-Antikörper hin.
Verschiedene Forschergruppen haben von der Herstellung von murinen Antikörpern, welche spezifisch für gp39 sind, berichtet, wobei offenbart wurde, dass sie therapeutische Nützlichkeit als Immunsuppressiva besitzen. Zum Beispiel beschreiben WO 93/09812 , veröffentlicht am 27. Mai 1993, mit dem Rechteinhaber Columbia University; EP 0,555,880 , veröffentlicht am 18. August 1993, und PCT US/94/09872 , eingereicht am 02. September 1994 von Noelle et al., und mit dem Rechteinhaber Dartmouth College, murine Antikörper, welche spezifisch für gp39 sind, und ihre Verwendung als Therapeutika.
Obwohl murine Antikörper als Therapeutika bei Menschen verwendet werden können, sind sie jedoch in mancher Hinsicht von Nachteil. Speziell murine Antikörper können bei Menschen aufgrund der Tatsache, dass sie einen Ursprung von fremden Spezies haben, immunogen sein. Dies resultiert oft in einer neutralisierenden Antikörperantwort, was besonders problematisch ist, wenn gewünscht ist, die Antikörper wiederholt zu verabreichen, z.B. bei der Behandlung eines chronischen oder wiederkehrenden Erkrankungszustandes. Da sie murine konstante Domänen enthalten, kann es auch sein, dass sie keine humanen Effektorfunktionen aufweisen.
Bei einem Versuch, solche Probleme zu beseitigen oder zu verringern, wurden chimäre Antikörper offenbart. Chimäre Antikörper enthalten Teile von zwei unterschiedlichen Antikörpern, typischerweise von zwei unterschiedlichen Spezies. Im Allgemeinen enthalten solche Antikörper humane konstante Regionen und welche von anderen Spezies, typischerweise murine variable Regionen. Zum Beispiel wurde von einigen chimären Maus/Mensch-Antikörpern berichtet, welche Bindungscharakteristika des parenteralen Mausantikörpers und Effektorfunktionen, die mit der humanen konstanten Region in Zusammenhang stehen, aufweisen. Siehe, z.B. Cabilly et al., U.S. Patent Nr. 4,816,567 ; Shoemaker et al., U.S. Patent Nr. 4,978,745 ; Beavers et al., U.S. Patent Nr. 4,975,369 ; und Boss et al., U.S. Patent Nr. 4,816,397 . Im Allgemeinen werden diese chimären Antikörper durch Herstellen einer Genomgenbibliothek aus DNA, welche von vorher existierenden murinen Hybridoma extrahiert wurde, aufgebaut (Nishimura et al., Cancer Research, 47: 999 (1987)). Die Bibliothek wird dann auf variable Genregionen aus sowohl schweren als auch leichten Ketten, welche die richtigen Antikörperfragmentumgruppierungsmuster aufweisen, durchgemustert (engl. screened). Alternativ werden cDNA-Bibliotheken aus RNA, welche von den Hybridoma extrahiert und durchgemustert wurden, hergestellt oder die variablen Regionen werden durch Polymerasekettenreaktion erhalten. Die klonierten variablen Genregionen werden dann in einen Expressionsvektor, welcher klonierte Kassetten der geeigneten schweren oder leichten humanen konstanten Kettengenregion enthält, ligiert. Die chimären Gene werden dann in einer Zelllinie der Wahl, normalerweise in einer murinen Myelomlinie, exprimiert. Solche chimären Antikörper wurden in einer Therapie des Menschen verwendet.
In einer allgemein zugeordneten Anmeldung mit der Reihennr. 07/912,292 werden „Primatized"^TM Antikörper offenbart, welche humane konstante und variable Old World-Affen-Regionen enthalten. Diese Primatized^TM Antikörper werden in Menschen unter Aufweisen ihrer niedrigen oder schwachen Immunogenität gut toleriert.
Auch sind auf dem Fachgebiet humanisierte Antikörper bekannt. Idealerweise resultiert eine „Humanisierung" in einem Antikörper, welcher weniger immunogen ist, mit einer vollständigen Beibehaltung der Antigen-bindenden Eigenschaften des ursprünglichen Moleküls. Um alle Antigen-bindenden Eigenschaften des ursprünglichen Antikörpers zu erhalten, muss die Struktur seiner Bindungsstelle genau in der „humanisierten" Version reproduziert werden. Dies kann möglicherweise durch Transplantieren der Bindungsstelle des nicht-humanen Antikörpers in einen humanen Rahmen erreicht werden, entweder (a) durch Aufpfropfen der gesamten nicht-humanen variablen Domänen auf humane konstante Regionen, um einen chimären Antikörper zu erzeugen (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6801 (1984); Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44: 65 (1988) (was die Ligand-bindenden Eigenschaften bewahrt, was aber auch die Immunogenität der nicht-humanen variablen Domänen erhält); (b) durch Aufpfropfen von nur der nicht-humanen CDRs auf einen humanen Rahmen und konstante Regionen mit oder ohne Beibehaltung der kritischen Rahmenreste (Jones et al., Nature, 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1539 (1988)); oder (c) durch Transplantieren der gesamten nicht-humanen variablen Domänen (um die Ligand-bindenden Eigenschaften zu bewahren), aber auch „Umhüllen" von ihnen mit einer humanoiden Oberfläche durch überlegtes Ersetzen von exponierten Resten (um die Antigenität zu verringern) (Padlan, Molec. Immunol., 28: 489 (1991)).
Im Wesentlichen bezieht eine Humanisierung durch CDR-Aufpfropfung das Transplantieren von nur der CDRs auf einem humanen Fragment auf einen humanen Rahmen oder konstante Regionen ein. Theoretisch sollte dies im Wesentlichen die Immunogenität beseitigen (außer wenn allotypische oder idiotypische Unterschiede bestehen). Es wurde jedoch berichtet, dass einige Rahmenreste des ursprünglichen Antikörpers auch bewahrt werden müssen (Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10,029 (1989)).
Die Rahmenreste, welche bewahrt werden müssen, können durch Computermodellierung identifiziert werden. Alternativ können kritische Rahmenreste möglicherweise durch Vergleich von bekannten Antikörperbindungsstellenstrukturen identifiziert werden (Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169–217 (1994)).
Die Reste, welche möglicherweise die Antigenbindung beeinflussen, fallen in mehrere Gruppen. Die erste Gruppe umfasst Reste, welche zur Bindungsstellenoberfläche angrenzend sind, die deshalb mit Antigenen direkt in Kontakt treten können. Sie schließen die Aminoterminalen Reste und jene, welche zu den CDRs benachbart sind, ein. Die zweite Gruppe schließt Reste ein, welche die Struktur oder relative Anordnung der CDRs entweder durch in Kontakt kommen der CDRs oder der gegensätzlichen Ketten verändern können. Die dritte Gruppe umfasst Aminosäuren mit verborgenen Seitenketten, welche die strukturelle Integrität der variablen Domänen beeinflussen können. Die Reste in diesen Gruppen werden normalerweise in den gleichen Positionen (Padlan, 1994 (Id.)) gemäß dem übernommenen Nummerierungssystem gefunden (siehe Kabat et al., „Sequences of Proteins of immunological interest, 5. Ausgabe, Veröffentlichungsnr. 91-3242 , U.S. Dept. Health & Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991).
Obwohl humanisierte Antikörper aufgrund ihrer möglichen niedrigen Immunogenität bei Menschen wünschenswert sind, ist ihre Herstellung jedoch nicht berechenbar. Zum Beispiel kann eine Sequenzmodifizierung der Antikörper in einem wesentlichen oder sogar vollständigen Verlust der Antigen-bindenden Funktion oder Verlust der Bindungsspezifität resultieren. Alternativ können „humanisierte Antikörper" noch Immunogenität bei Menschen ungeachtet der Sequenzmodifizierung aufweisen.
So besteht auf dem Fachgebiet noch ein wesentlicher Bedarf für neue humanisierte Antikörper für gewünschte Antigene. Genauer, auf dem Fachgebiet besteht ein Bedarf für humanisierte Antikörper, welche für gp39 spezifisch sind, aufgrund ihres Potentials als Immunotherapeutika.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Deshalb ist es eine Aufgabe der Erfindung, humanisierte Antikörper bereit zu stellen, welche für humanes gp39 spezifisch sind. Genauer, es ist eine Aufgabe der Erfindung, humanisierte Antikörper, welche von murinen Antikörpern abgeleitet sind, für gp39 und insbesondere 24-31, ein spezifischer muriner Antikörper, welcher an humanes gp39 bindet, bereit zu stellen. Die vorliegende Erfindung stellt folglich einen humanisierten Antikörper bereit, welcher an gp39 bindet und das Binden von gp39 an CD40 inhibiert, wobei der Antikörper eine humanisierte variable leichte Kettenregion enthält, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und wobei der Antikörper eine humanisierte variable schwere Kettenregion enthält, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, Arzneimittel bereit zu stellen, welche humanisierte Antikörper, wie in Anspruch 1 beansprucht, welche für humanes gp39 spezifisch sind, enthalten. Es ist eine speziellere Aufgabe der Erfindung, Arzneimittel bereit zu stellen, welche die humanisierten Antikörper, welche von 24-31 abgeleitet sind, ein muriner Antikörper, welcher spezifisch an humanes gp39 bindet, enthalten. Die vorliegende Erfindung stellt folglich ein Arzneimittel bereit, welches einen humanisierten Antikörper der Erfindung enthält.
Auch beschrieben werden Verfahren unter Verwendung der humanisierten Antikörper der Erfindung für humanes gp39 zur Behandlung von Erkrankungszuständen des Menschen, welche durch Modulierung der gp39-Expression und/oder Inhibierung der gp39/CD40-Bindungswechselwirkung behandelt werden können, einschließlich z.B. Autoimmunerkrankungen wie systemischer Lupus erythematodes, rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, idiopathische thrombozytopenische Purpura (ITP), Diabetes und nicht-Autoimmunzustände wie Transplantat-Wirt-Reaktion und Transplantation. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, -störung oder -zustandes, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus autoimmunhämolytischer Anämie, Goodpasture-Syndrom, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Diabetes mellitus, systemischen Lupus erythematodes und idiopathischer thrombozytopenischer Purpura besteht, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer nicht-Autoimmunerkrankung, -störung oder -zustandes, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Asthma, HIV, Leukämie und Lymphom besteht, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Transplantat-Wirt-Reaktion oder Abstoßung eines transplantierten Gewebes oder Organs bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner noch die Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper der Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, einer Störung oder eines Zustandes, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus rheumatoider Arthritis, Felty-Syndrom, Lupus erythematodes, systemischen Lupus erythematodes, Hashimoto-Thyreoiditis, Multipler Sklerose, Polyarteriitis nodosa, Myasthenia gravis, Diabetes Typ 1, Uveitis, nephrotischem Syndrom, Psoriasis, Arthritis psoriatica, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis und weiteren ekzematösen Hautentzündungen, seborrhoischer Dermatitis, Lichen planus, Pemphigus, Alterspemphigus, Epidermolysis bullosa, Urti karia, angioneurotischen Ödemen, Gefäßentzündungen, Erythem, kutanen Eosinophilien, Alopecia areata, reversibler obstruktiver Atemwegserkrankung, Migräne, Ekzem, Rhinitis und anderen allergischen Zustanden, und Erkrankungen, welche mit Darmentzündung in Zusammenhang stehen, einschließlich Zöliakie, Proktitis, eosinophile Gastroenteritis, Mastozytose, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, besteht, bereit.
Es ist noch eine andere Aufgabe der Erfindung, Nukleinsäuresequenzen bereit zu stellen, welche die humanisierten Antikörper der Erfindung für humanes gp39 kodieren. Es ist eine speziellere Aufgabe der Erfindung, Nukleinsäuresequenzen bereit zu stellen, welche humanisierte Antikörper, die von 24-31 abgeleitet sind, ein muriner Antikörper, der spezifisch an das humane gp39-Antigen bindet, kodieren. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung eine DNA-Sequenz bereit, welche einen humanisierten Antikörper der Erfindung kodiert.
Es ist eine andere Aufgabe der Erfindung, Vektoren bereit zu stellen, welche die Expression der humanisierten Antikörper, die von 24-31 abgeleitet sind, ein muriner Antikörper, der spezifisch an das humane gp39-Antigen bindet, bereitstellen. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung einen Expressionsvektor bereit, welcher eine DNA-Sequenz der Erfindung enthält.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Anmeldung beschreibt humanisierte Antikörper, welche nicht weniger als etwa ein Zehntel und stärker bevorzugt nicht weniger als ein Drittel der gp39-Antigenbindenden Affinität des murinen 24-31-Antikörpers beibehalten und/oder welche nicht weniger als etwa ein Zehntel und stärker bevorzugt nicht weniger als etwa ein Drittel der in vitrofunktionellen Aktivität des murinen Antikörpers 24-31, z.B. in B-Zellen-Tests, welche die T-Zellen-abhängige Antikörperherstellung messen, beibehalten. Genauer, die humanisierten Antikörper erhalten mindestens ein Zehntel und stärker bevorzugt mindestens etwa ein Drittel der halb-maximalen Wirksamkeit der in vitro-funktionellen Aktivität in einem B-Zellen-Test bei einer Konzentration von nicht mehr als dem Dreifachen der Konzentration des 24-31-Antikörpers.
Die vorliegende Anmeldung beschreibt auch humanisierte Antikörper, welche an das gleiche Epitop wie der murine 24-31-Antikörper binden und/oder welche zur Kompetition mit dem murinen 24-31-Antikörper zur Inhibierung der Bindung von CD40 an gp39 in der Lage sind und/oder welche die CDRs des 24-31-Antikörpers enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft humanisierte Antikörper, welche von murinem 24-31 abgeleitet sind, die die nachstehend aufgeführten humanisierten variablen leichten Sequenzen und/oder humanisierten variablen schweren Sequenzen:
und eine humanisierte variable schwere Sequenz, welche aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, aufweisen:
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression von solchen humanisierten Antikörpern kodieren, sowie Expressionsvektoren, welche die Herstellung von humanisierten Antikörpern in rekombinanten Wirtszellen bereitstellen. Diese DNA-Sequenzen werden die nachstehend aufgeführten humanisierten variablen schweren und/oder humanisierten variablen leichten Sequenzen:
und eine humanisierte variable schwere Sequenz, welche aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist, kodieren:
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorstehend identifizierten humanisierten Antikörper, welche für gp39 spezifisch sind, als Pharmazeutika. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung des Erfindungsgegenstandes humanisierte anti-gp39-Antikörper zur Behandlung von Erkrankungen, welche durch Modulierung der gp39-Expression oder durch Inhibierung der gp39/CD40-Wechselwirkung behandelt werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft genauer die Verwendung von humanisierten Antikörpern der vorstehend identifizierten humanisierten Antikörper, welche spezifisch für gp39 sind, zur Behandlung von Autoimmunstörungen, zum Beispiel rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose, Diabetes, systemischen Lupus erythematodes und ITP. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Erfindungsgegenstandes humanisierte Antikörper für gp39 zur Behandlung von nicht-Autoimmunstörungen, einschließlich Transplantat-Wirt-Reaktion und zur Inhibierung von Transplantatabstoßung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt den IDEC-Expressionsvektor N5KG1, welcher zur Expression von humanisierten und chimären Antikörpern, die von 24-31 abgeleitet sind, verwendet wurde.
2A enthält die Ergebnisse eines B-Zellen-Proliferationstests, bei welchem humane PBL mit löslichem gp39-CD8, rekombinantem humanem IL-4 und dem murinen 24-31-Antikörper oder dem murinen monoklonalen IgG1-Kontrollantikörper in Kontakt gebracht wurden, wobei gezeigt wird, dass der 24-31-Antikörper die durch gp39 induzierte B-Zellen-Proliferation.
2B enthält die Ergebnisse eines B-Zellen-Differenzierungstests unter Verwendung von mit Mitomycin behandelten T-Zellen, welche mit immobilisiertem anti-CD3 aktiviert wurden, wobei in der Gegenwart von IGD⁺ B-Zellen und unterschiedlichen Konzentrationen des 24-31-Antikörpers kultiviert wurde, wobei gezeigt wird, dass der 24-31-Antikörper die T-Zellen-abhängige Herstellung des polyklonalen Antikörpers durch humane B-Zellen inhibiert.
3 enthält ein FACS von nicht-transfizierten CHO-Zellen und einem gp39-Transfektanden.
4 enthält die Aminosäuresequenz und DNA-Sequenz, welche einer bevorzugten humanisierten variablen leichten Sequenz (einschließlich der Regionen, welche die Komplementarität bestimmen) entsprechen, die als VL#1 oder bevorzugte humanisierte variable leichte Sequenz (1) bezeichnet wird.
5 enthält die Aminosäure- und DNA-Sequenz, welche einer bevorzugten humanisierten variablen Ligandsequenz (einschließlich der Regionen, welche die Komplementarität bestimmen) entsprechen, die als VL#2 oder bevorzugte humanisierte variable leichte Sequenz (2) bezeichnet wird.
6 enthält die Aminosäure- und DNA-Sequenz, welche einer bevorzugten humanisierten variablen schweren Sequenz (einschließlich der Regionen, welche die Komplementarität bestimmen) entsprechen, die als VH#1 oder bevorzugte humanisierte variable schwere Sequenz (1) bezeichnet wird.
7 enthält die Aminosäure- und DNA-Sequenz der variablen leichten Sequenz 24-31 (nicht-humanisiert).
8 enthält die Aminosäure- und DNA-Sequenz der variablen schweren Sequenz 24-31 (nicht-humanisiert).
9 vergleicht die Bindung von murinem 24-31-, chimärem 24-31- und einem humanisierten 24-31-Antikörper an gp39-exprimierenden CHO-Zellen.
10 enthält die Ergebnisse eines Kompetitionstests, welcher die Bindung von 24-31 (Biotin) und humanisiertem chimärem 24-31 an gp39-exprimierenden CHO-Zellen vergleicht.
11 enthält die Ergebnisse eines Tests, welcher die Wirkungen von murinem 24-31 und einem humanisierten 24-31-Antikörper der Erfindung auf die humane IgM-Herstellung durch B-Zellen, welche in der Gegenwart von mit Mitomycin C behandelten T-Zellen kultiviert wurden, misst.
12 enthält die Ergebnisse eines Tests, welcher die Bindung von zwei humanisierten Antikörpern der vorliegenden Erfindung an gp39-exprimierenden CHO-Zellen vergleicht.
13 enthält die Scatchard-Aufzeichnung für den murinen 24-31.
14 enthält die Scatchard-Aufzeichnung für die humanisierte Version 1.
15 enthält die Scatchard-Aufzeichnung für die humanisierte Version 2.
16 zeigt die FcRI-Bindung von H24-31.1 in der Gegenwart des gp39-CD8-Fusionsproteins und zeigt, dass H24-31.1 nur an den Fc-Rezeptor I bindet, wenn mit dem Antigen ein Komplex gebildet wird.
17 zeigt die FcRII-Bindung von H24-31.1 in der Gegenwart des gp39-CD8-Fusionsproteins und zeigt, dass H24-31.1 nur an den Fc-Rezeptor II bindet, wenn mit dem Antigen ein Komplex gebildet wird.
18 zeigt die Komplement-abhängige zelluläre Zytotoxizität unter Verwendung von Alamar Blue und zeigt, dass H24-31.1 bei ungefähr 0,5 μg/ml 50% des Zellwachstums inhibiert.
19 zeigt die Bestimmung der C1q-Bindung von gp39+CHO-gebundenem H24-31.1 (humanisierter 25-31 Version 1). Genau wurden gp39+CHO-Zellen, welche mit verschiedenen Konzentrationen an H24-31.1 markiert worden waren, in einer überschüssigen Menge an humanem C1q (Komplementfaktor 1) inkubiert und anschließend wurde mit FITC-markiertem Ziegen-anti-humaner C1q inkubiert. Die Proben wurden durch Durchflusszytometrie analysiert, um die relative Markierung der Zellen mit C1q zu bestimmen. Die Figur zeigt auch, dass das Markieren der Zellen mit C1q von der Antikörperkonzentration abhängig war und dass an einem H24-31.1-Fab-Fragment (keine C1q-Bindung) kein C1q gebunden wurde.
20 zeigt die Wirkung von H24-31.1 auf die T-Zellen-Antworten auf ein T-Zellen-abhängiges Recall-Antigen. Die Figur zeigt auch, dass das TT-induzierte Wachstum und die IL-2-Herstellung durch ≥ 1 μg/ml H24-31.1 maximal etwa 40% inhibiert wurden.
21 zeigt die Wirkung von H24-31.1 auf die T-Zellen-abhängige B-Zellen-Differenzierung. Die Figur zeigt auch, dass H24-31.1 die T-Zellen-abhängige IgG-Herstellung bei 1 ng/ml zu ungefähr 85% inhibiert. Der anscheinende Anstieg der IgG-Herstellung, welcher bei höheren Konzentrationen gesehen wird, beruht auf dem Unvermögen dieses Tests, H24-31.1 von dem durch die B-Zellen hergestellten Antikörper zu unterscheiden.
22 zeigt die Wirkung von H24-31.1-Fab auf die T-Zellen-abhängige B-Zellen-Differenzierung. Die anti-gp39-Antikörper-Inhibierung der T-Zellen-abhängigen B-Zellen-IgG-Herstellung wird auch gezeigt. Die Figur zeigt ferner, dass es keinen Unterschied bei der Inhibierung der IgG-Herstellung zwischen dem gesamten H24-31.1-Antikörper und dem Fab-Fragment gab.
23 zeigt die Wirkung von H24-31.1 auf die Erzeugung von Antigen-spezifischen B-Zellen-Antworten auf ein T-Zellen-abhängiges Recall-Antigen. Humane Milzzellen, welche für 3 Tage in vitro mit Tetanustoxoid geprimt worden waren, wurden in SCID-Mäuse bei einer Konzentration von ungefähr 1 × 10⁷ Zellen/SCID überführt. Nach sechs Tagen wurde den erhaltenen hu-SPL-SCID-Mäusen PBS (Gruppe 1) oder 300 μg H24-31.1 (Gruppen 1 und 2) injiziert. Am darauffolgenden Tag wurden alle hu-SPL-SCIDs mit Tetanustoxoid gereizt. Die Mäuse in der Gruppe 3 erhielten zwei weitere Injektionen von jeweils 300 μg H24-31.1 in einem Dreitagesintervall. Man nahm den Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten Blut ab und es wurden die Levels der humanen IgG-anti-Tetanustoxoid-Titer durch einen ELISA bestimmt. Die Figur zeigt auch, dass eine Injektion von H24-31.1 die Erzeugung von Tetanustoxoid-spezifischen Antworten um ungefähr 90% inhibierte (Gruppe 3). Die Levels des humanen Gesamt-IgG waren zwischen den drei Gruppen vergleichbar.
24 zeigt die Proliferation von humanen B-Zellen durch lösliches gp39-CD8. Unterschiedliche Konzentrationen an CD8-gp39 wurden mit angereicherten humanen B-Zellen plus IL-4 in einem Viertage-Proliferationstest inkubiert. Die CpM, welche in den Kulturen aus B-Zellen plus IL-4 ohne gp39-CD8 erhalten wurden, wurden als der Hintergrund verwendet und von den Gesamt-CpM der mit gp39-CD8 stimulierten Testkultur abgezogen. Zellen, welche mit PWM plus IL-4 kultiviert worden waren, dienten als Positivkontrolle für die B-Zellen-Proliferation. CpM stellt die mittleren CpM der durch Dreifachbestimmung getesteten Proben dar.
25 zeigt die Inhibierung der B-Zellen-Proliferation durch H24-31. Unterschiedliche Konzentrationen an H24-31.1-Antikörper wurden mit B-Zellen (1 × 10⁵), welche mit IL-4 (1000 U/ml) und 10 μg/ml gp39-CD8 kultiviert worden waren, in einem Viertage-Proliferationstest inkubiert. Zellen, welche mit PWM plus IL-4 kultiviert worden waren, dienten als Positivkontrolle für die B-Zellen-Proliferation. CpM stellt die mittleren CpM der durch Dreifachbestimmung getesteten Proben dar.
26 zeigt die Blockierung der CD40-Ig-Bindung an gp39 durch humanisierte Versionen von 24-31. Diese Figur zeigt auch, dass die murinen und humanisierten Versionen von 24-31 die Bindung von CD40-Ig blockieren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Vor der Darlegung der Erfindung werden die Definitionen von bestimmten Ausdrücken, welche in dieser Offenbarung verwendet werden, nachstehend aufgeführt:
Humanisierter Antikörper – Dies betrifft einen Antikörper, welcher von einem nicht-humanen Antikörper, typischerweise murinen, abgeleitet ist, der die Antigen-bindenden Eigenschaften des Ausgangsantikörpers beibehält oder im Wesentlichen beibehält, welcher aber in Menschen weniger immunogen ist. Dies kann durch verschiedene Verfahren erreicht werden, einschließlich durch (a) Aufpfropfen der gesamten nicht-humanen variablen Domänen auf humane konstante Regionen, um chimäre Antikörper zu erzeugen, (b) Aufpfropfen von nur der nicht-humanen CDRs auf einen humanen Rahmen und konstante Regionen mit oder ohne Beibehaltung der kritischen Rahmenreste, oder (c) Transplantieren der gesamten nicht-humanen variablen Domänen, aber „Umhüllen" von ihnen mit einem humanoiden Abschnitt durch Ersetzen von Oberflächenresten. Solche Verfahren werden in Jones et al., Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851–6855 (1984); Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44: 65–92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534–1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28: 489–498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3): 169–217 (1994) offenbart.
Komplementarität bestimmende Region oder CDR – Der Ausdruck CDR, wie hier verwendet, betrifft Aminosäuresequenzen, welche zusammen die Bindungsaffinität und -spezifität der natürlichen Fv-Region einer nativen Immunglobulin-Bindungsstelle definieren, wie von Kabat et al. (1991) beschrieben.
Rahmenregion – Der Ausdruck FR, wie hier verwendet, betrifft Aminosäuresequenzen, welche zwischen CDRs eingebracht sind. Diese Teile des Antikörpers dienen dazu, die CDRs in einer geeigneten Orientierung zu halten (ermöglicht den CDRs ein Antigen zu binden).
Konstante Region – Der Teil des Antikörpermoleküls, welcher Effektorfunktionen verleiht. In der vorliegenden Erfindung werden murine konstante Regionen mit humanen konstanten Regionen substituiert. Die konstanten Regionen des Erfindungsgegenstandes chimäre oder humanisierte Antikörper sind von humanen Immunglobulinen abgeleitet. Die schwere konstante Kettenregion kann von jedem der fünf folgenden Isotypen ausgewählt werden: Alpha, Delta, Epsilon, Gamma oder Mu. Ferner sind schwere Ketten verschiedener Unterklassen (wie die IgG-Unterklassen von schweren Ketten) für unterschiedliche Effektorfunktionen verantwortlich und so können durch Auswählen der gewünschten konstanten schweren Kettenregion chimäre Antikörper mit gewünschter Effektorfunktion hergestellt werden. Bevorzugte konstante Regionen sind Gamma 1 (IgG1), Gamma 3 (IgG3) und Gamma 4 (IgG4). Stärker bevorzugt ist eine Fc-Region des Gamma 1 (IgG1)-Isotyps. Die leichte konstante Kettenregion kann vom Kappa- oder Lambda-Typ, bevorzugt vom Kappa-Typ, sein.
Chimärer Antikörper – Dies ist ein Antikörper, welcher Sequenzen enthält, die von zwei unterschiedlichen Antikörpern abgeleitet sind, welche typsicherweise von unterschiedlichen Spezies stammen. Am stärksten typisch umfassen chimäre Antikörper humane und murine Antikörperfragmente, im Allgemeinen humane konstante und murine variable Regionen.
Immunogenität – Ein Maß für das Vermögen eines Zielproteins oder einer therapeutischen Einheit, eine Immunantwort (humoral oder zellulär) auszulösen, wenn sie an einen Empfänger verabreicht werden. Die vorliegende Erfindung befasst sich mit der Immunogenität des Erfindungsgegenstandes humanisierte Antikörper oder Fragmente davon.
Humanisierter oder chimärer Antikörper mit verringerter Immunogenität – Dies betrifft einen Antikörper oder humanisierten Antikörper, welche relativ zum Ausgangsantikörper, z.B. dem 24-31-Antikörper, eine verringerte Immunogenität aufweisen.
Humanisierter Antikörper, welcher im Wesentlichen die Bindungseigenschaften des Ausgangsantikörpers beibehält – Dies betrifft einen humanisierten oder chimären Antikörper, welcher das Vermögen zur spezifischen Bindung des Antigens, das der Ausgangsantikörper erkennt, welcher zur Herstellung eines solchen humanisierten oder chimären Antikörpers verwendet wird, beibehält. Humanisierte oder chimäre Antikörper, welche im Wesentlichen die Bindungseigenschaften von 24-31 beibehalten, werden an humanes gp39 binden. Bevorzugt wird der humanisierte oder chimäre Antikörper die gleiche oder im Wesentlichen die gleiche Antigen-bindende Affinität und Avidität wie der Ausgangsantikörper aufweisen. Idealerweise wird die Affinität des Antikörpers nicht niedriger als 10% der Ausgangsantikörperaffinität, stärker bevorzugt nicht niedriger als etwa 30%, sein und am stärksten bevorzugt wird die Affinität nicht niedriger als 50% des Ausgangsantikörpers sein. Verfahren zum Testen der Antigen-bindenden Affinität sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Tests auf halb-maximale Bindung, Kompetitionstests und Scatchard-Analyse ein. Geeignete Antigen-bindungstests werden in dieser Anmeldung beschrieben.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue humanisierte monoklonale Antikörper, welche humanes gp39 binden, und ihre Verwendung als Therapeutika. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Nukleinsäuresequenzen, welche die humanisierten Antikörper kodieren, und ihre Expression in rekombinanten Wirtszellen.
Genauer betrifft die vorliegende Erfindung humanisierte Antikörper, welche vom murinen Antikörper 24-31, der spezifisch an humanes gp39 bindet, abgeleitet sind.
Der murine Antikörper 24-31 ist ein muriner Antikörper, welcher gegen humanes gp39 gerichtet ist, der funktionell gp39 sowohl in vitro als auch in vivo inaktiviert. Deshalb weist er Eigenschaften auf, die ihn möglicherweise bei der Behandlung von Erkrankungen, wobei eine gp39-Inaktivierung und/oder Modulierung oder Inhibierung der gp39/CD40-Wechselwirkung wünschenswert ist, nützlich machen. Insbesondere schließen solche Erkrankungen Autoimmunerkrankungen wie z.B. rheumatoide Arthritis, Multiple Sklerose, ITP, Diabetes und systemischen Lupus erythematodes sowie nicht-Autoimmunerkrankungen wie Transplantat-Wirt-Reaktion und Transplantatabstoßung ein.
Obwohl der murine Antikörper 24-31 funktionelle Eigenschaften aufweist, welche ihn möglicherweise als ein Therapeutikum geeignet machen, weist er jedoch mehrere mögliche Nachteile auf. Nämlich, da er einen murinen Ursprung hat, wird er in Menschen möglicherweise immunogen sein. Da er murine konstante Sequenzen enthält, wird er auch wahrscheinlich nicht den vollständigen Bereich der humanen Effektorfunktionen aufweisen und wird wahrscheinlich schneller ausgeschieden, wenn er an Menschen verabreicht wird. Obwohl solche Nachteile bei der Behandlung von einigen Erkrankungszuständen oder Personen nicht problematisch sein sollten, rufen sie doch wesentliche Bedenken hervor, wenn die behandelte Erkrankung von chronischer oder wiederkehrender Natur ist. Beispiele von wiederkehrenden oder chronischen Erkrankungen schließen z.B. Autoimmunerkrankungen ein, wobei der Wirt kontinuierlich oder chronisch eine Autoimmunreaktion gegen eigene Antigene aufweist.
Um die mit dem murinen Antikörper 24-31 in Zusammenhang stehenden Nachteile zu lindern, nämlich die mögliche Immunogenität bei Menschen und die Abnahme der humanen Effektorfunktionen, war es von den Erfindern der vorliegenden Erfindung deshalb gewünscht, verbesserte humanisierte Derivate des murinen 24-31-Antikörpers herzustellen. Während dies das Ziel der vorliegenden Erfindung war, war das gewünschte Ergebnis keine Routineangelegenheit oder von vorhersagbarer Natur. Die Humanisierung von Antikörpern erfordert die sorgfältige Auswahl von Aminosäureresten, welche modifiziert werden müssen, und die überlegte Auswahl von Resten, welche dafür substituiert werden müssen. Dies ist deshalb, weil die Modifizierung von variablen Antikörperregionen, sogar jene, welche einige Aminosäurereste einbeziehen, wesentliche nachteilige Wirkungen auf die Antigenbindung verursachen kann. Zum Beispiel können humanisierte Antikörper eine wesentlich verringerte Antigenaffinität und/oder Antigenspezifität in Bezug auf den Ausgangsantikörper aufweisen.
Wie vorstehend angegeben, wurde von unterschiedlichen Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern, einschließlich murinen Antikörpern, in der Literatur berichtet. Siehe z.B. Padlan, Molec. Immunol., 31(3): 169–217 (1994); Padlan, Molec. Immunol., 28: 484–498 (1991); Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44: 65–92 (1988). Diese Verfahren schließen insbesondere die Humanisierung durch CDR-Aufpfropfung (Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534–1539 (1988); und die stärker maßgeschneiderte Vorgehensweise von Padlan, Molec. Immunol., 28: 489 (1991) und Padlan, Molec. Immunol., 31: 169 (1994), welche die Auswahl von nicht-essentiellen Rahmenaminosäureresten und ihre Modifizierung durch geeignete Substitutionsmutation einbezieht, ein.
Wie angegeben, können CDR-Aufpfropftechniken wesentlich die Affinität der resultierenden humanisierten Antikörper nachteilig beeinflussen, obwohl sie in manchen Fällen erfolgreich sind. Man nimmt an, dass dies geschieht, weil einige Rahmenreste die Antigenbindung beeinflussen oder wesentlich dafür sind oder sie zumindest beeinflussen. Unsere Technik; Padlan (1994) (Id.) ist ausgefeilter, da wir nur jene murine Rahmenreste beibehalten, von welchen wir annehmen, dass sie für die Beibehaltung der Antikörperbindungsstelle kritisch sind, während die Oberflächeneigenschaften des Moleküls so humanoid wie möglich gehalten werden. Demgemäß bietet diese Technik die Möglichkeit der Herstellung von humanisierten Antikörpern, welche die Antigen-bindenden Charakteristika des Ausgangsantikörpers beibehalten. Deshalb wurde diese Technik von den Erfindern der vorliegenden Erfindung als das Mittel, durch welches humanisierte Antikörper, welche vom murinen Antikörper 24-31 abgeleitet sind, der spezifisch für humanes gp39 ist, möglicherweise erhalten werden können, ausgewählt.
Das Klonieren der variablen Regionen von 24-31 (beschrieben im Detail in den Beispielen nachstehend) resultierte in der Identifizierung der V_L- und V_II-Sequenzen, welche vom Antikörper 24-31 verwendet werden, die in 7 beziehungsweise 8 gezeigt werden. Nach dem Sequenzieren wurden die variablen Regionen dann humanisiert. Wie angegeben, wurde dies im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Padlan (1994) (Id.) durchgeführt.
Dieses Verfahren umfasst im Allgemeinen das Ersetzen des nicht-humanen Rahmens durch humane Rahmenreste, während nur jene Rahmenreste beibehalten werden, von welchen wir annehmen, dass sie für die Beibehaltung der Antigen-bindenden Eigenschaften kritisch sind. Idealerweise wird diese Methodik einen humanoiden Charakter auf die Oberfläche des xenogenen Antikörpers übertragen, wodurch er weniger immunogen gemacht wird, während die inneren und in Kontakt tretenden Reste, welche seine Antigen-bindenden Eigenschaften beeinflussen, beibehalten werden.
Genauer, die V_K- und V_H-Sequenzen von 24-31, welche in den 7 und 8 dargelegt sind, wurden durch Vergleich mit humanen Antikörpern mit angegebener Sequenz, welche als „Template" bezeichnet werden, humanisiert.
Genau wurde die V_K von 24-31 unter Verwendung der Folgenden als Template humanisiert:

(a) für VL#1, die humanen V-Kappa-Untergruppe I-Sequenzen, z.B. DEN und dergleichen sowie die Keimbahn 012 (siehe Cox et al., Eur. J. Immunol. 24: 827–836 (1994)), und für VL#2, die humanen V-Kappa-Untergruppe IV-Sequenzen, z.B. LEN. Solche Templatsequenzen sind bekannt und in Kabat et al. (1991) (Id.) oder GenBank angegeben.

Die V_H#1 von 24-31 wurde unter Verwendung der Folgenden als Template humanisiert:

(a) die humane V_H-Untergruppe IV-Sequenz, 58p2 und
(b) (GenBank Zugangsnr.) Z18320 und die Keimbahn 3d75d (S. van der Maarel et al., J. Immunol., 150: 2858–2868 (1993).

Solche variablen schweren Antikörpertemplatsequenzen sind auch bekannt und in Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5. Ausg., NIH (1991) und in Gen-Bank angegeben.
Die humanen variablen schweren und leichten Templatsequenzen wurden basierend auf einer Anzahl von unterschiedlichen Kriterien ausgewählt, einschließlich insbesondere einem hohen Grad an Sequenzähnlichkeit mit 24-31 insgesamt sowie der Ähnlichkeit der „wichtigen" Reste, d.h. jene, von welchen man annimmt, dass sie in der V_L:V_H-Grenzfläche enthalten sind; jene, welche mit den Komplementarität-bestimmenden Regionen in Kontakt stehen oder welche nach innen gerichtet sind. Auch werden die Template derart gewählt, dass sie möglicherweise die elektrostatische Ladung von F_V von 24-31 so weit wie möglich bewahren, und auch derart, dass Glycine, Proline und andere spezielle Aminosäurereste, von welchen man annimmt, dass sie die Antigenbindung beeinflussen, erhalten werden.
Diese Methodik resultierte in den folgenden bevorzugten humanisierten schweren V_L- und V_H-Sequenzen, welche vom Antikörper 24-31 abgeleitet sind, die in Tabelle 1 und Tabelle 2 nachstehend dargelegt sind. Die Komplementarität-bestimmenden Regionen sind in den 7 und 8 identifiziert, welche die gesamten variablen schweren und leichten CDR-Kettensequenzen des (nicht-humanisierten) Ausgangsantikörpers 24-31 enthalten.
Wie daraus ersichtlich ist, wurden vier bevorzugte humanisierte Rahmensequenzen für sowohl die V_H- als auch die V_L-Ketten designed. Deshalb gibt es 16 unterschiedliche mögliche humanisierte Antikörper 24-31, welche unter Verwendung der vorstehend identifizierten humanisierten V_H- und V_L-Sequenzen von 24-31, ausschließend Varianten und Äquivalente, welche konservative Modifizierungen enthalten, synthetisiert werden können.
Humanisierte Antikörper 24-31, welche diese humanisierten variablen schweren und leichten Sequenzen enthalten, können durch rekombinante Verfahren erhalten werden. Es wird erwartet, dass humanisierte Sequenzen, welche jedwede Kombination der vorstehenden bevorzugten humanisierten variablen Sequenzen enthalten, in humanisierten Antikörpern, welche humanes gp39 binden, resultieren werden. Darüber hinaus wird erwartet, dass basierend auf diesen Sequenzen die Reihenfolge der Bevorzugung unter Verwendung der in der Tabelle 1 und Tabelle 2 verwendeten Nummerierung wie folgt ist:

(1) #1 V_L mit #1 V_H (Version 1)
(2) #2 V_L mit #1 V_H (Version 2)
(3) #1 V_L mit #2 V_H (Version 3)
(4) #2 V_L mit #2 V_H (Version 4)

Die vorstehend identifizierten humanisierten Sequenzen V_H und V_L können weiter modifiziert werden, z.B. durch die Einbringung von einer oder mehreren zusätzlichen Substitutionsmodifizierungen und auch durch das Anfügen von anderen Aminosäuren. Zusätzliche Modifizierungen, welche die Antigen (gp39)-Bindung nicht nachteilig beeinflussen, werden gewählt. Zum Beispiel ziehen die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine weitere Modifizierung der V_H-Kette durch Substitution von einem oder mehreren Resten 34, 43, 44 und 68 in Betracht (gemäß dem Nummerierungsschema von Kabat), Kabat et al. (1991) (Id.). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung ziehen auch eine Modifizierung des Rests 85 der V_L-Kette in Betracht. Basierend auf den Strukturmerkmalen der Antikörperbindungsstelle nimmt man an, dass eine Modifizierung von solchen Resten auch keinen nachteiligen Einfluss auf die Antigenbindung haben sollte. Darüber hinaus wird erwartet, dass die Einbringung von einer oder mehreren konservativen Aminosäuresubstitutionen nicht nachteilig die gp39-Bindung beeinflussen sollte.
Um den Erfindungsgegenstand V_H- und V_L-Sequenzen von humanisiertem 24-31 besser zu beschreiben, werden die bevorzugten humanisierten Rahmensequenzen auch in Tabelle 3 nachstehend dargelegt, wobei diese Sequenzen mit den humanen variablen schweren und leichten Templatrahmensequenzen, d.h. humane DEN VK1, humane o12/V36-Keimbahn, humane LEN VKIV, humane 58p2, humane Z18320 und humane 3d75d, sowie den nicht-humanisierten murinen V_H- und V_L-Rahmensequenzen von 24-31 verglichen werden.
TABELLE 3 Vergleiche von VK-Rahmenregionen – humanisiertes anti-gp39
Um humanisierte Antikörper herzustellen, werden DNA-Sequenzen synthetisiert, welche die vorstehend identifizierten humanisierten V_L- und V_H-Sequenzen kodieren. Wie angegeben, gibt es unter Berücksichtigung dieser vier humanisierten V_L-Sequenzen und vier humanisierten V_H-Sequenzen 16 mögliche humanisierte Antigenbindungsstellen, die synthetisiert werden können. Auch gibt es noch mehr mögliche humanisierte Antigenbindungsstellen unter Berücksichtigung der möglichen Substitution der Reste 34, 43, 44 und 68 der humanisierten V_H und des Rests 85 der humanisierten V_L durch andere Aminosäurereste und/oder der möglichen Einbringung von konservativen Substitutionsmutationen. Zwei der bevorzugten humanisierten variablen leichten Sequenzen (1) und (2) und eine bevorzugte humanisierte variable schwere Sequenz (1), einschließlich der Komplementarität-bestimmenden Regionen und der entsprechenden DNA-Sequenzen, sind in den 4, 5 beziehungsweise 6 dargelegt.
Verfahren zur Synthese einer DNA, welche ein Protein mit bekannter Sequenz kodiert, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Unter Verwendung von solchen Verfahren werden DNA-Sequenzen, welche den Erfindungsgegenstand humanisierte V_L- und V_H-Sequenzen kodieren, synthetisiert und dann in Vektorsystemen exprimiert, welche zur Expression von rekombinanten Antikörpern geeignet sind. Dies kann in jedwedem Vektorsystem durchgeführt werden, welches den Erfindungsgegenstand humanisierte V_L- und V_H-Sequenzen bereitstellt, die als ein Fusionsprotein mit humanen konstanten Domänensequenzen exprimiert werden und assoziieren, wobei funktionelle (Antigen-bindende) Antikörper hergestellt werden.
Expressionsvektoren und Wirtzellen, welche zur Expression von rekombinanten Antikörpern und insbesondere humanisierten Antikörpern geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die folgenden Bezugnahmen sind für Verfahren und Vektoren, welche zur Expression von rekombinanten Immunglobulinen geeignet sind, repräsentativ: Weidle et al., Gene, 51: 21–29 (1987); Dorai et al., J. Immunol., 13(12): 4232–4241 (1987); De Waele et al., Eur. J. Biochem., 176: 287–295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49: 1738–1745 (1989); Wood et al., J. Immunol., 145(a): 3011–3016 (1990); Bulens et al., Eur. J. Biochem., 195: 235–242 (1991); Beggington et al., Biol. Technology, 10: 169 (1992); King et al., Biochem. J., 281: 317–323 (1992); Page et al., Biol. Technology, 9: 64 (1991); King et al., Biochem. J., 290: 723–729 (1993); Chaudary et al., Nature, 339: 394–397 (1989); Jones et al., Nature, 321: 522–525 (1986); Morrison und Oi, Adv. Immunol., 44: 65–92 (1988); Benhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12051–12055 (1994); Singer et al., J. Immunol., 150: 2844–2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13(3): 215–219 (1994); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029–10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32: 6761–6767 (1992); Cotoma et al., J. Immunol. Meth., 152: 89–109 (1992). Darüber hinaus sind Vektoren, welche zur Expression von rekombinanten Antikörpern geeignet sind, kommerziell erhältlich.
Wirtzellen, von welchen bekannt ist, dass sie zur Expression von funktionellen Immunglobulinen in der Lage sind, schließen unter anderen Wirtzellen beispielhaft Säugerzellen wie Chinesische Hamsterovar (CHO)-Zellen, COS-Zellen, Myelomzellen, Bakterien wie Escherichia coli, Hefezellen wie Saccharomyces cerevisiae ein. Von diesen werden CHO-Zellen von vielen Forschern verwendet, wobei ihr Vermögen zur wirksamen Expression und Sekretion von Immunglobulinen erhalten wird.
Im Wesentlichen wird eine rekombinante Expression von humanisierten Antikörpern durch ein oder zwei allgemeine Verfahren durchgeführt. Im ersten Verfahren werden die Wirtzellen mit einem einzelnen Vektor transfiziert, welcher die Expression von sowohl der schweren als auch der leichten variablen Sequenzen, die mit ausgewählten konstanten Regionen verbunden sind, bereitstellt. Im zweiten Verfahren werden die Wirtzellen mit zwei Vektoren transfiziert, welche jeweils die Expression von entweder der variablen schweren oder leichten Sequenz, die mit den ausgewählten konstanten Regionen verbunden sind, bereitstellen.
Humane konstante Domänensequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt und wurden in der Literatur veröffentlicht. Bevorzugte humane V_L-Sequenzen schließen die konstanten leichten Kappa- und Lambda-Sequenzen ein. Bevorzugte humane schwere konstante Sequenzen schließen humane Gamma 1, humane Gamma 2, humane Gamma 3 und humane Gamma 4 ein.
Ein besonders bevorzugtes Vektorsystem umfasst die Expressionsvektoren, welche in den allgemein zugeordneten U.S. Serienar. 08/476,237 , eingereicht am 07. Juni 1995, Serienur. 08/397,072 , eingereicht am 25. Januar 1995, 08/147,696 , eingereicht am 03. November 1993, 07/977,691 , eingereicht am 13. November 1992, 07/912,122 , eingereicht am 10. Juli 1992, 07/886,281 , eingereicht am 23. März 1992, und 07/735,064 , eingereicht am 25. Juli 1991 beschrieben werden.
Insbesondere beschreiben diese Anmeldungen Vektorsysteme zur Herstellung von rekombinanten Antikörpern, welche als TCAE 5.2 und TCAE 6 bezeichnet werden, welche die Folgenden umfassen:

1) Vier Transkriptionskassetten in Tandemanordnung:
(a) eine humane leichte konstante Immunglobulin-Kettenregion; in TCAE 5.2 ist dies die humane leichte konstante Immunglobulin-Kappa-Kettenregion (Kabat-Aminosäurenummerierung 108–214, Allotyp Km3) und in TCAE 6 ist dies die humane leichte konstante Immunglobulin-Lambda-Kettenregion (Kabat-Aminosäurenummerierung 108–215, Gentyp Oz minus, Mcg minus, Ke minus Allotyp);
(b) eine humane schwere konstante Immunglobulin-Kettenregion; in beiden Konstrukten ist die humane schwere Immunglobulin-Kette eine konstante Gamma-Region (Kabat-Aminosäurenummerierung 114–478, Allotyp Gm1a, Gm12);
(c) DHFR; enthält seinen eigenen eukaryotischen Promotor und Polyadenylationsregion; und
(d) NEO; enthält auch seinen eigenen eukaryotischen Promotor und Polyadenylationsregion.
2) Die humanen leichten und schweren Immunglobulin-Kettenkassetten enthalten synthetische Signalsequenzen zur Sekretion der Immunglobulin-Ketten; und
3) Die humanen leichten und schweren Immunglobulin-Kettenkassetten enthalten spezielle DNA-Verknüpfungen, welche die Einbringung von leichten und schweren variablen Immunglobulin-Regionen ermöglichen, die den Translationsleserahmen aufrecht erhalten und nicht die Aminosäuren verändern, welche normalerweise in Immunglobulin-Ketten gefunden werden.

Der Vektor ANNEX 2 ist eine Modifizierung der TCAE-Vektoren, der zwei unterschiedliche Modifizierungen am Neomycinphosphotransferase (neo)-Startcodon enthält. Die erste Modifizierung ist, dass eine strangaufwärts liegende, außerhalb des Rahmens befindliche Translationsstartstelle hinzugefügt wurde. Die zweite Modifizierung ist, dass die Startstelle des neo-Gens modifiziert wurde, um sie weniger effizient zu machen. Der Vektor NEOSPLA ist eine Modifizierung des Vektors ANNEX 2. Das neo-Gen wurde unter Verwendung von synthetischen Donor/Akzeptor-Splicingstellen in zwei Teile aufgespalten und die leichte Kette, schwere Kette und DHFR-Gene wurden im neo-Intron platziert.
Diese Vektoren werden bevorzugt in CHO-Zellen verwendet. Der Erfindungsgegenstand Antikörper werden bevorzugt in den vorstehend beschriebenen Vektorsystemen exprimiert.
Der Erfindungsgegenstand humanisierte Antikörpersequenzen, welche vom Antikörper Nummer 24-31 abgeleitet sind, können jedoch in jedwedem Vektorsystem exprimiert werden, welches die Expression von funktionellen Antikörpern bereitstellt, d.h. jene, welche das gp39-Antigen binden.
Insbesondere entschieden sich die Erfinder der vorliegenden Erfindung zur Expression des Erfindungsgegenstandes humanisierte V_L- und V_H-Sequenzen sowie der nativen (nicht modifizierten) V_L- und V_H-Sequenzen, welche sich von 24-31 ableiten, in CHO-Zellen unter Verwendung des Expressionsvektors N5KG1, welcher humane Kappa- und humane konstante Gamma 1-Regionen enthält. Der Expressionsvektor N5KG1 ist schematisch in 1 gezeigt. Wie gehofft, bindet der von 24-31 abgeleitete chimäre Antikörper gp39, wenn er in CHO-Zellen exprimiert wird (durch nachgewiesenes Binden an CHO – gp39-Transfektand). Auch resultierten mehrere humanisierte Antikörper der Erfindung, welche von 24-31 abgeleitet sind, in funktionellen (gp39-bindenden) Antikörpern, als sie unter Verwendung dieses Vektorsystems exprimiert wurden.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die Bereitstellung der folgenden Beispiele beschrieben. Diese Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung bereitgestellt.
BEISPIEL 1
Auswahl des Antikörpers 24-31 zur Humanisierung.
Immer mehr Beweise in Tiermodellen zeigen, dass eine Verabreichung von anti-gp39 eine Vielzahl von Autoimmunvorgängen verhindert und in Allotransplantatabstoßung eingreift. Diese Ergebnisse stellen einen zwingenden Beweis bereit, dass Antikörper zu humanem gp39 einen wesentlichen therapeutischen Wert bei der Behandlung einer Autoimmunerkrankung oder der Transplantation von allogenetischem Gewebe oder Organen bei Menschen haben können. Es wurde von einem monoklonalen Antikörper (mAb), welcher spezifisch für humanes gp39 ist, berichtet (Lederman et al., J. Immunol., 199: 3817 (1992)) und seine funktionelle Aktivität beim Blockieren von gp39-CD40-Wechselwirkungen in vitro wurde bewertet. Um größere Einblicke in den funktionellen Einfluss von anti-gp39-Antikörpern auf das menschliche Immunsystem zu bekommen, wurde eine Reihe von anti-humanes gp39 mAbs erzeugt. Aus dieser Reihe erschien ein mAb hervorragend und wurde zur funktionellen Inaktivierung von gp39 in vitro und in vivo umfangreich getestet.
Genauer, es wurde eine Reihe von 6 murinen (alle IgG1) anti-gp39-Antikörpern durch Immunisieren mit einem löslichen Fusionsprotein von humanem gp39 (gp39-CD8), gefolgt von Reizen mit aktivierten humanen peripheren Blut-T-Zellen erzeugt. Eine Durchflusszytometrieanalyse der humanen peripheren Blut-T-Zellen zeigte, dass die mAbs ein Zelloberflächenmolekül erkannten, welches an aktivierten (PMA/Ionomycin), aber nicht ruhenden CD3⁺ T-Zellen exprimiert wird, und dass das Reaktivitätsmuster ähnlich zu demjenigen war, welches mit einem rekombinanten CD40-Fusionsprotein (CD40-Ig) gesehen wird (Daten nicht gezeigt). Eine Immunpräzipitation von mit [³⁵S]-markierten metabolisch aktivierten humanen peripheren Blut-T-Zellen enthüllte, dass jeder der 6 mAbs ein Molekül mit einer ähnlichen Größe (33 kDa) zu dem, welches von CD40-Ig präzipitiert wurde, präzipitierte. Schließlich wurde die Bindung von CD40-Ig an gp39 in der Gegenwart der Antikörper blockiert, was auf eine Erkennung des gleichen Moleküls hinweist, was ferner ihre Spezifität bestätigt. Obwohl alle 6 mAbs zur Blockierung der gp39-Funktion in der Lage waren, wurde ein mAb, 24-31, für eine umfangreiche Analyse ausgewählt.
BEISPIEL 2
Die T-Zellen-abhängige B-Zellen-Proliferation und -Differenzierung (Ig-Herstellung) werden durch anti-gp39 blockiert.
Eine Anzahl von Untersuchungen hat den Beweis erbracht, dass Signale, welche durch CD40 durch seinen Liganden gp39 bereitgestellt werden, die B-Zellen-Aktivierung, -Proliferation, -Differenzierung, und -Isotyp-Umschaltung induzieren. Um zu bestimmen, ob der anti-gp39 24-31 mAb die gp39-Funktion blockierte, wurden B-Zellen mit einem löslichen Fusionsprotein von gp39 (gp39-CD8) in der Gegenwart oder Abwesenheit von 24-31 kultiviert und die B-Zellen-Proliferationsantwort wurde durch Einbringung von ³H-Thymidin abgeschätzt. Die Ergebnisse, welche in 2A gezeigt sind, zeigen, dass gp39-CD8 eine starke Proliferation der B-Zellen induzierte. Die Gegenwart des anti-gp39 24-31 mAb beseitigte die durch gp39-CD8 induzierte B-Zellen-Proliferation bei Konzentrationen von nur 2,5 μg/ml vollständig. Um zu bestimmen, ob 24-31 die T-Zellen-induzierte B-Zellen-Differenzierung beeinflusste, wurden B-Zellen mit anti-CD3-aktivierten T-Zellen in der Gegenwart oder Abwesenheit von 24-31 cokultiviert. Die Herstellung von polyklonalem IgM, IgG und IgA wurde nach 12 Tagen abgeschätzt. Wie in 2B gezeigt, inhibierte die Zugabe von 24-31 die Herstellung von polyklonalem IgM-, IgG- und IgA-Antikörper (90 bis 99%). Diese Ergebnisse bestätigen frühere Berichte, welche etablierten, dass gp39-CD40-Wechselwirkungen bei T-Zellen-abhängiger B-Zellen-Differenzierung erforderlich sind (Nishioka et al., J. Immunol., 153: 1027 (1994), und sie zeigen weiter die Verwendung des neu charakterisierten anti-humanes gp39 24-31 mAb bei der Blockierung der gp39-Funktion.
BEISPIEL 3
Anti-gp39 blockiert in vivo die Tetanustoxoid-spezifische Antikörperherstellung in Scid-Mäusen, rekonstituiert mit humanen PBL.
Zahlreiche Untersuchungen haben etabliert, dass das menschliche Immunsystem in vivo unter experimentellen Bedingungen durch die Verwendung von Mäusen mit einem schwerwiegenden kombinierten Immundefekt (Scid), der mit humanen peripheren Blutlymphozyten eingebracht wurde, untersucht werden kann (hu-PBL-Scid-Mäuse) (Mosler et al., Nature, 335: 256 (1988); McCune et al., Science, 241: 1632 (1988). Chimäreneigenschaften für eine lange Zeit werden in Scid-Mäusen durch Injektion von humanen PBL erreicht und die Antigenspezifischen sekundären Antikörperantworten werden in hu-PBL-Scid-Mäusen, welche in vivo mit Antigen gereizt wurden, nachgewiesen (Carlsson et al., J. Immunol., 148: 1065 (1992); Duchosal et al., Cell Immunol., 139: 468 (1992)). Dieses System wurde genutzt, um die immunsuppressiven Wirkungen der in vivo-Verabreichung von anti-gp39 auf die Immunantworten, welche durch humane T- und B-Zellen hervorgerufen werden, zu bewerten.

Experimente, deren Ergebnisse in 2B enthalten sind, zeigten, dass eine Blockade der gp39-Funktion durch 24-31 die T-Zellen-abhängige Herstellung von polyklonalem Ig durch humane B-Zellen in vitro inhibierte. Um zu bestimmen, ob 24-31 auch die Antigenspezifische B-Zellen-Antikörperherstellung in vivo inhibieren kann, wurden C.B-17-Scid/Scid-Mäuse, welchen i.p. humane PBL injiziert (hu-PBL-Scid) worden waren und welche mit Tetanustoxoid (TT) immunisiert worden waren, mit 24-31 oder PBS behandelt und die sekundäre (IgG) anti-TT-Antikörperantwort wurde abgeschätzt. Die Immunisierung der hu-PBL-Scid mit TT resultierte bei den meisten Tieren in nachweisbaren Levels an IgG anti-TT-Antikörper innerhalb von 14 Tagen nach der Immunisierung (Tabelle 4). Jedoch beseitigte eine Behandlung mit anti-gp39 (24-31; 250 μg/Tag, zweimal wöchentlich) die sekundäre anti-TT-Antikörperantwort in 9/10 untersuchten Mäusen vollständig, was zeigt, dass eine in vivo-Blockade der gp39-Funktion auch in einer Inhibierung der Antigen-spezifischen humoralen Antworten resultierte.

Empfänger- stamm*	Behandlung¶	Anti-Tetanus-Antiköper (O.D. ± SE)§ (Häufigkeit der Mäuse, welche anti-Tetanus-Antikörper enthalten)
			Tage nach der Immunisierung
		7d	14d	21d	28d
C.B-17 Scid/Scid	PBS	< 0,02 (0/10)	2,30 ± 0,042 (7/10)*	0,224 ± 0,040 (8/10)**	0,137 + 0,007 (4/10)
	anti-gp39	0,162 (1/10)	<0,02(0/10)	<0,02(0/10)	<0,02(0/10)

Tabelle 4. Beseitigung der sekundären anti-Tetanus-Antikörperantwort nach der Einbringung von humanen PBL in mit Tetanustoxoid immunisierte C.B-17-Scid/Scid-Mäuse.* Vier bis sechs Wochen alten C.B-17-Scid/Scid-Mäusen wurden i.p. 20 × 10⁶ humane PBL und 0,25 ml Tetanustoxoid injiziert.

¶ Anti-gp39 24-31 oder PBS (250 μg/Injektion) wurden i.p. zweimal wöchentlich während dem gesamten Experiment verabreicht.
§ Der Level des humanen anti-Tetanustoxoid-Antikörpers im Serum wurde wöchentlich durch ELISA bestimmt. Alle Mäuse mit Serumlevels an humanem anti-Tetanustoxoid-Antikörper > 0,100 O.D. bei einer Verdünnung von 1:10 wurden als positiv angesehen. Nur positive Mäuse wurden bei der Berechnung der Mittelwerte ± SE, welche in der Tabelle enthalten sind, verwendet. Der Level an humanem anti-Tetanustoxoid in Sera von präimmunen Mäusen, welche nicht mit Tetanustoxoid immunisiert worden waren, war < 0,02 O.D. Die Daten wurden als Mittelwerte ± SE angegeben.
* Signifikant unterschiedlich (p = 0,222) von der mit anti-gp39 behandelten Gruppe.
** Signifikant unterschiedlich (p < 0,001) von der mit anti-gp39 behandelten Gruppe.

BEISPIEL 4
Anti-gp39-Behandlung inhibiert nicht die Antigen-spezifische T-Zellen-Proliferationsantwort von hu-PBL-Scid-Milzzellen.
Um zu bestimmen, ob eine Behandlung von hu-PBL-Scid-Mäusen mit anti-gp39 das Antwortverhalten von Antigen-spezifischen T-Zellen in vivo verändert, wurde die Proliferationsantwort von Milzzellen von mit TT immunisierten und mit 24-31 behandelten hu-PBL-Scid-Mäusen in vitro abgeschätzt. Milzzellen von Kontroll- oder mit anti-gp39 behandelten hu-PBL-Scid-Mäusen wurden mit TT oder Medium alleine kultiviert und die Proliferationsantwort wurde durch die Einbringung von ³H-Thymidin nach 6 Tagen abgeschätzt. Tabelle 5 fasst die Ergebnisse von einem solchen Experiment zusammen. Mit anti-gp39 behandelte hu-PBL-Scid-Mäuse zeigten eine ähnliche Antwort wie bei in vitro-Stimulierung mit TT, wie sie bei hu-PBL-Scid-Mäusen, welche nicht behandelt wurden, auftrat (5/10 gegen 3/10 Mäuse mit Antwort). Experimente unter Verwendung von NOD/LtSz-Scid/Scid-Mäusen als Empfänger führten zu ähnlichen Ergebnissen, obwohl in diesen Mäusen anti-TT-Antikörper nicht nachweisbar waren (Daten nicht gezeigt). Diese Daten zeigen, dass eine Behandlung mit anti-gp39 nicht in einer Deletion oder funktionellen Inaktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen in hu-PBL-Scid-Mäusen resultiert, und unterstützen die Annahme, dass eine Inhibierung der TT-spezifischen Antikörperantworten durch anti-gp39 vielmehr aufgrund der Blockade von gp39-CD40-Wechselwirkungen und darauffolgenden B-Zellen-Antworten stattfindet als durch T-Zellen-Inaktivierung.

Empfängerstamm^* Behandlung¶ Häufigkeit von Mäusen mit Antworten§

C.B-17-Scid/Scid PBS anti-gp39 3/10 5/10

NOD/LtSz-Scid/Scid PBS anti-gp39 5/10 6/10

Tabelle 5. Eine anti-gp39-Behandlung verändert nicht die anti-Tetanus-T-Zellen-Proliferationsantwort nach der Einbringung von humanen PBL in mit Tetanustoxoid immunisierte C.B-17-Scid/Scid- oder NOD/LtSz-Scid/Scid-Mäuse.

* Vier bis sechs Wochen alten C.B-17-Scid/Scid- oder NOD/LtSz-Scid/Scid-Mäusen wurden i.p. 20 × 10⁶ humane PBL und 0,25 ml Tetanustoxoid injiziert.
¶ Anti-gp39 24-31 oder PBS (250 μg/Injektion) wurden i.p. zweimal wöchentlich während dem gesamten Experiment verabreicht.
§ Milzzellen von Mäusen, welchen humane PBL injiziert worden waren und welche mit Tetanustoxoid immunisiert worden waren, wurden bei einer Konzentration von 1 × 10⁵ Zellen/ml in der Gegenwart von Medium alleine oder Tetanustoxoid (2,5 oder 5,0 μg/ml) kultiviert. Die Proliferation wurde durch die Einbringung von ³H-Thymidin nach 6 d abgeschätzt. Stimulierungsindizes wurden durch die folgende Formel berechnet: S.I. = CpM Tetanus – CpM Medium/CpM Medium. S.I. > als 2,0 wurde als positiv angesehen.

BEISPIEL 5
Erzeugung einer gp39-CHO-Transfektandenzelllinie.
Kürzlich wurde ein CHO-Transfektand, der konstitutiv Zelloberflächen-gp39 exprimiert, erzeugt, um ihn als ein Reagenz für die in dieser Anmeldung vorgeschlagenen humanisierter anti-gp39 24-31-Bindungsuntersuchungen zu verwenden. Die volle Länge des gp39-Gens (Hollenbaugh et al., Immunol. Rev., 138: 23 (1994)) wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) von humanen Phytohämagglutinin-aktivierten PBL amplifiziert und in IDEC's IN-PEP4-Vektor unter der Transkriptionskontrolle der Cytomegalovirus (CMV)-Promotor- und -Enhancerelemente kloniert. Ein CHO-Transfektand wurde in 50 nM Methotrexat etabliert und amplifiziert. Es wurde durch ELISA- (Daten nicht gezeigt) und FACS-Analyse (3) gezeigt, dass der Transfektand 50D4 Zelloberflächen-gp39 exprimiert. Der Transfektand wird auch mpg39 CHO genannt (mit membrangebundenem gp39 transfizierte CHO-Zellen).
BEISPIEL 6
Expression von Antikörpern in hohen Levels unter Verwendung eines CHO-Expressionssystems.

IDEC's geschützter N5KG1-Expressionsvektor wird in CHO-Zellen zur Expression des humanisierten anti-gp39 24-31-Antikörpers verwendet. Dieser Vektor ist schematisch in 1 gezeigt. Eine Expression von rekombinanten Antikörpern in hohen Levels wird konsistent in CHO-Zellen unter Verwendung dieses Vektors und ähnlicher Vektoren erhalten. Es wurde gefunden, dass unter Verwendung dieser Vektoren ein hoher Prozentsatz an G418-resistenten Klonen, 5 bis 10%, wesentliche Mengen an rekombinanten Proteinen exprimiert (1 bis 10 mg/l Antikörper). Diese sind normalerweise Einzelplasmidkopieintegrationsprodukte und können einfach unter Verwendung von Methotrexat amplifiziert werden, wobei 30 bis 100 pg/Zelle/Tag sekretiertes Immunglobulin erhalten werden. Tabelle 6 listet die Antikörperlevels von 3 Antikörpern, welche unter Verwendung dieses Systems in CHO-Zellen exprimiert wurden, vor und nach der Genamplifizierung auf.

Antikörper	Vor der Amplifizierung mg/l	Nach der Amplifizierung im Scheibenkolben mg/l	Nach der Amplifizierung im Fermenter mg/l
Anti-CD4 γ1	1–2	100–110	950
Anti-CD4 γ4	3–4	125–150	N.B.
Anti-CD20	5–10	200–300	650

Tabelle 6. Levels der Antikörperherstellung unter Verwendung von IDEC's CHO-Expressionstechnologie.

BEISPIEL 7
Klonieren von 24-31-V_k- und -V_H-DNA-Sequenzen
Die anti-gp39 24-31-V_k- und -V_H-Gensegmente wurden kloniert und sequenziert. Nach den Analysen ihrer Sequenzen wurden humanisierte Versionen der V-Region-Gensegmente designed. Die entsprechenden DNA-Sequenzen wurden synthetisiert und in einen Expressions vektor mit hohen Levels, der humane konstante Genregionen enthielt, kloniert. Ein CHO-Transfektand, welcher den humanisierten Antikörper 24-31 herstellte, wurde dann etabliert. Um zu bestätigen, dass die humanisierte Version des anti-gp39-Antikörpers ihre gp39-Bindungsaffinität beibehält, wurden die relativen Affinitäten der murinen und humanisierten Antikörper in direkten Bindungs- und Kompetitionstests verglichen. Zusätzlich wurde das Vermögen des humanisierten 24-31 zur Blockierung der CD40-Bindung an gp39 und zur Inhibierung der T-Zellen-abhängigen Antikörperherstellung bewertet.
1. Klonieren der 24-31-V_k- und -V_H-Gensegmente

a. Herstellung der cDNA. PolyA⁺ mRNA wurde aus jeweils 2 × 10⁶ Zellen der 24-31-Hybridom- und der NS1-Zelllinie (Carroll et al., Mol. Immunol., 10: 991 (1988)), der Fusionspartner, der bei der Erzeugung des 24-31-Hybridoms verwendet wurde, unter Verwendung eines MicroFast Track^TM mRNA-Isolierkits von Invitrogen Corporation gemäß der Arbeitsanweisung des Herstellers hergestellt. Ein erster Strang der cDNA wurde unter Verwendung von 50 pMol oligo-dT und 5 Einheiten reverse M-MLV-Transkriptase (Promega) (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) synthetisiert, gefolgt von einer Sephadex G-25-Chromatographie.
b. PCR-Amplifizierung der V_k- und V_H-cDNA. 24-31- und NS1-cDNA wurden durch PCR unter Verwendung einer Reihe von 5'-Primern, welche spezifisch für V_k- oder V_H-Leitsequenzen sind, in Kombination mit konstanten Region-3'-Primern amplifiziert. Die Reihe der 5'-V_H-Primer war identisch zu jenen, welche von Jones und Bendig (Bio/Technol., 9: 88 (1991); Errata, Bio/Technol., 9: 579 (1991)) beschrieben werden. Die Reihe der 5'-V_k-Primer (Jones et al., (Id.)) wurde modifiziert, wobei die Sal I-Klonierstelle-Erkennungssequenzen (GTCGAC) in Bgl II-Erkennungssequenzen (AGATCT) umgewandelt wurden, um die Klonierung der amplifizierten Gensegmente in IDEC's N5KG1-Expressionsvektor zu ermöglichen (siehe 1). Die 3'-V_k- und -V_H-Primer enthalten eine Bsi WI-Klonierstellensequenz bei den Aminosäurepositionen 108–109 (Nummerierung gemäß Kabat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5. Ausg., NIH (1991)) beziehungsweise eine Nhe I-Klonierstellensequenz bei den Positionen 114–115 und weisen die folgenden Sequenzen auf: TGCAGCATCCGTACGTTTGATTCCAGCTT (C_k) und GGGGGTGTCGTGCTAGCTG (A/C) (G/A) GAGAC (G/A) GTGA (Cγ1). Diese Primerreihe wurde früher vom Anmelder zur Amplifizierung und Klonierung des C2B8 anti-CD20- Antikörpers (Nishioka et al., J. Immunol., 153: 1027 (1994)) und von zahlreichen anderen V_k- und V_H-Mausgensegmenten (Daten nicht gezeigt) verwendet.

Um das korrekte Primerpaar für die Amplifizierung der 24-31-V_k- und -V_H-Gensegmente zu bestimmen, wurde die 24-31-cDNA in 23 einzelnen Umsetzungen, welche einen der 11 5'-V_k-Primer in Kombination mit dem C_K-Primer oder einen der 12 5'-V_H-Primer in Kombination mit dem Cγ1-Primer enthielten, amplifiziert. Zum Vergleich wurde die NS1-cDNA unter Verwendung der gleichen Reihe an Primern amplifiziert. 1 μl cDNA (1/50 der cDNA-Probe) wurde in einem Endvolumen von 100 μl, welches 5 Einheiten Taq DNA-Polymerase (Perkin Elmer), 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, jeweils 0,25 mM dCTP, dGTP, dATP und TTP, 50 pMol konstante Region-3'-Primer und 50 pMol 5'-Primer enthielt, amplifiziert. Der Amplifizierungszyklus bestand aus Denaturierung für 1 Minute bei 95°C, Annealing für 2 Minuten bei 50°C und Verlängerung für 2 Minuten bei 72°C, was 34 Mal wiederholt wurde. Die amplifizierten Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die 24-31-PCR-Umsetzungen, welche ein einzigartiges amplifiziertes Produkt für V_k und für V_H ergaben, wurden wiederholt und die Produkte aus den in Zweifachbestimmung durchgeführten PCR-Umsetzungen wurden kloniert. Die PCR-amplifizierten Produkte wurden mit Agarosegel gereinigt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. (1989)) und mit Bgl II und Bsi WI (für V_k) oder Sal I und Nhe I (für V_H) verdaut. Die Produkte wurden aufeinanderfolgend in IDEC's Vektor N5KG1 ligiert (Ausabel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, Greene Publ. Assoc. (1992)).
Nach der Transformation von E. coli XL1-Blue-Zellen (Stratagene) wurde Plasmid-DNA hergestellt und die V_k- und V_H-Sequenzen, welche aus den in Zweifachbestimmung durchgeführten Konstrukten erhalten wurden (wobei das Sequenzieren durch Scripps Research Institute Core Facility, La Jolla, CA durchgeführt wurde). Die Sequenzen der endogenen leichten und schweren Ketten des NS1-Fusionspartners sind bekannt (Carroll et al., Mol. Immunol., 10: 991 (1988); Kabat et al., (1991) (Id.)) und wurden zur Unterscheidung der PCR-Produkte, welche aus der Amplifizierung des 24-31 resultierten, von den V-Regionen des NS1-Fusionspartners verwendet.
BEISPIEL 8
Synthese von Gensegmenten, welche humanisierte 24-31-V-Regionen kodieren.
Humanisierte Versionen, welche die am stärksten bevorzugten humanisierten 24-31-V_k- und -_H-Sequenzen enthalten, die in den Tabellen 1 und 2 als humanisierte V_L und V_H (1) identifiziert werden, wurden synthetisiert. Genau wurden vier Paare von überlappenden komplementären Oligonukleotiden (Oligos), welche die vorstehend identifizierten humanisierten V_k- oder V_H-Regionen kodieren, synthetisiert (Midland Chemicals) und durch denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Bd. 2, Greene Publ. Assoc. (1992)). Jedes Oligo weist eine Länge von ungefähr 100 Basen auf und überlappt mit 20 Basen das benachbarte komplementäre Oligonukleotid. Die V_k- und VH-5'-Oligos enthalten Bgl II- beziehungsweise Sal I-Klonierstellen und die 3'-Oligos weisen Bsi WI- beziehungsweise Nhe I-Klonierstellen auf. Jedes variable Regiongensegment wurde aus den synthetischen Oligos unter Verwendung des folgenden Verfahrens zusammengesetzt, was nachstehend in einem Diagramm angegeben ist (zusammengefasst in Watson et al., Recombinant DNA, 2. Ausg., Scientif. Amer. Books, NY, NY (1992)). Komplementäre Oligopaare (A+E, B+F, C+G, D+F) wurden unter Verwendung von 300 pMol von jedem Primer und T4-Polynukleotidkinase (Promega) gemäß der Arbeitsanweisung des Herstellers der Kinase unterworfen. Die Oligos wurden durch Erwärmen auf 95°C und langsames Kühlen auf Raumtemperatur Annealing ausgesetzt. Die Oligopaare, welche Annealing ausgesetzt worden waren, wurden unter Verwendung von 6 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) ligiert (A/E mit B/F und C/G mit D/H). Nach der Verdauung mit der geeigneten 5'- oder 3'-Klonierstellen-Restriktionsendonuklease wurden die DNA-Fragmente mit ungefähr 200 Basenpaaren durch Elektroelution, gefolgt von Polyacrylamidgelelektrophorese gereinigt (Sambrook et al., (Id.)). Die synthetischen Genfragmente wurden dann in IDEC's geschützten N5KG1-Vektor mit einer Expression auf einem hohen Level unter der Transkriptionskontrolle der CMV-Promotor- und -Enhancerelemente eingebracht. Die Ligierungsumsetzung enthielt jeweils die 2 gelgereinigten Fragmente (A/E/B/F und C/G/D/H) und N5KG1 in einem Molverhältnis von 100:100:1. Nach der Transformation der XL1-Blue-Zellen wurde Plasmid-DNA hergestellt und die Sequenzen der synthetischen Gensegmente wurden bestätigt. Das resultierende Konstrukt, h24-31, kodierte die humanisierten 24-31-V-Regionsegmente und konstanten Kappa- und Gamma 1-Regionen. Wie angegeben, enthält dieser Antikörper die humanisierten variablen schweren und humanisierten variablen leichten Sequenzen, welche in der Tabelle 1 und der Tabelle 2 als die Sequenzen „(1)" identifiziert werden, und wird als Version 1 oder H24-31.1 bezeichnet, wobei angedeutet wird, dass sie einen humanisierten Antikörper mit optimalen gp39-Eigenschaften bereitstellen. Zusätzlich wurde ein Konstrukt erzeugt, welches V_L#2 in Kombination mit V_H#1 (Version 2 des humanisierten 24-31 oder H24-31.2) enthält. Ähnliche Konstrukte wurden unter Verwendung von IDEC's geschützten Vektoren zur Expression von IDEC's Antikörpern anti-CD20 (Reff et al., Blood, 83: 425 (1994)) und anti-CD4 (Newman et al., Biol. Technology, 10: 1455 (1992)) verwendet.
BEISPIEL 9
2. Herstellung und Charakterisierung des humanisierten 24-31
a. Erzeugung von CHO-Transfektanden, welche humanisierte 24-31 herstellen (Version 1 und Version 2).
CHO-Transfektanden, welche humanisierte 24-31 (Version 1 oder Version 2) exprimieren, wurden durch Elektroporation von 4 × 10⁶ CHO-Zellen mit linearisierter h24-31-DNA (Version 1 oder Version 2), gefolgt durch Selektion in G418, erzeugt. Die Zellkulturüberstände von G418-resistenten Klonen wurden durch Sandwich-ELISA unter Verwendung von Ziegenanti-humanes Kappa, um das Immunglobulin einzufangen, auf Immunglobulin-Herstellung getestet. Die Immunglobulin-Bindung wurde durch Inkubieren mit einem Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Ziegenantikörper, welcher spezifisch für humanes IgG ist, gefolgt von HRP-Substrat, 0,4 mg/ml O-Phenylendiamin (OPD) in einem Zitratpuffer (9 bis 34 g/l C₆H₈O₇ und 14,2 g/l Na₂HPO₄), pH-Wert 5,0, einschließlich 0,0175% H₂O₂, gemessen. Die Platte wurde in einem „Vmax, Kinetikmikroplattenlesegerät"-Spektrophotometer von Molecular Devices bei 490 nm ausgelesen.
BEISPIEL 10
Blockieren der CD40-Ig-Bindung an gp39 durch humanisierten 24-31.
Nachdem etabliert wurde, dass humanisiertes anti-gp39 an gp39 bindet, wurde ein Test durchgeführt, um zu bestätigen, dass das humanisierte anti-gp39 sein Vermögen zur Blockierung der Bindung des Liganden an seinen Rezeptor beibehält. Für diesen Zweck wurden akti vierte humane periphere Blut-T-Zellen oder die gp39-transfizierten CHO-Zellen, 50D4, mit unterschiedlichen Konzentrationen an murinem 24-31 oder mit Version 1 und Version 2 des humanisierten 24-31 für 15 Minuten bei 4°C vorbehandelt. Nach dieser Vorinkubation wurde CD40-Ig-Biotin zugegeben und die Bindung wurde durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von PE-Avidin bestimmt. 26 zeigt, dass Version 1 die Bindung von CD40-Ig 50% bei 4 μg/ml verringerte, muriner 24-31 die Bindung 50% bei ungefähr 12 μg/ml verringerte und Version 2 die Bindung 50% bei 20 μg/ml oder höher verringerte.
BEISPIEL 11
Blockieren der B-Zellen-Proliferation und -Differenzierung durch 24-31.
Um zu bestätigen, dass muriner 24-31 die gp39-Funktion blockiert, werden B-Zellen mit einem löslichen Fusionsprotein von gp39 (gp39-CD8) in der Gegenwart oder Abwesenheit eines Dosisbereichs von murinem 24-31 oder humanisiertem 24-31 kultiviert. Die B-Zellen-Proliferationsantwort wird durch Einbringung von ³H-Thymidin abgeschätzt, wie in 2A gezeigt.
Die T-Zellen-abhängige B-Zellen-Differenzierung (Ig-Herstellung) wird durch mAbs für gp39 blockiert. Um zu bestätigen, dass murine 24-31-Antikörper bei der Blockierung der Funktion von nativem gp39, welches auf der Oberfläche von aktivierten humanen T-Zellen exprimiert wird, wirksam sind, wird das Vermögen des Erfindungsgegenstandes humanisierte 24-31-Antikörper zur Inhibierung der T-Zellen-induzierten B-Zellen-Differenzierung abgeschätzt. B-Zellen werden mit anti-CD3-aktivierten T-Zellen in der Gegenwart oder Abwesenheit von humanisiertem 24-31 und murinem 24-31 cokultiviert. Die Herstellung von polyklonalem IgM, IgG und IgA wird nach 12 Tagen abgeschätzt (siehe 2B). Diese Ergebnisse bestätigen, dass anti-gp39 24-31 die CD40-Bindung blockieren kann und über CD40 die T-Zellen-abhängige B-Zellen-Aktivierung beeinflusst.
BEISPIEL 12
Bindungskapazität
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Reaktivität der murinen, chimären und humanisierten (Version 1) 24-31-Antikörper mit dem gp39-Antigen relativ zur Konzentration des Antikörpers zu bestimmen.
Protokoll:
Plattenvorbereitung

1. Geben von 50 von Poly-1-lysin in jede Vertiefung auf der Platte mit 96 Vertiefungen. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Ausschütteln der Platten, um Poly-1-lysin zu entfernen.
2. Waschen von mgp39-CHO-Zellen (Chinesische Hamsterovarzellen, welche Zelloberflächenmembran-gp39 exprimieren, wie in Beispiel 5 beschrieben) 3 Mal mit HBSS durch Zentrifugieren bei 1500 UpM für 5 Minuten. Resuspendieren der Zellen in HBSS auf 2 × 10⁶ Zellen/ml.
3. Geben von 50 μl Zellsuspension in jede Vertiefung und Zentrifugieren der Platten bei 2000 UpM für 5 Minuten.
4. Zugeben von 50 μl/Vertiefung von eiskaltem 0,5%igem Glutaraldehyd und Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Ausschütteln der Platte und Abtupfen, um überschüssigen Glutaraldehyd zu entfernen. Zugeben von 150 μl/Vertiefung von 100 mM Glycin mit 0,1% BSA und Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Platten können sofort verwendet werden oder bei –20°C für eine Verwendung in der Zukunft eingefroren werden.

Bindungstest

1. Auftauen der Platte und Entfernen des Glycinpuffers.
2. Reihenverdünnen 1:2 der Testantikörper in Verdünnungspuffer, ausgehend von 1 μg/ml. Überführen von 50 μg/Vertiefung von jeder Verdünnung in Zweifachbestimmung. Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
3. Waschen der Platte 10 Mal in fließendem Leitungswasser.
4. Zugeben von 50 μl/Vertiefung einer 1:2000-Verdünnung eines Ziegen-ant-humanes IgG HRP oder Ziegen-anti-Maus-IgG HRP. Inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
5. Waschen der Platte 10 Mal in fließendem Leitungswasser.
6. Zugeben von 50 μl/Vertiefung von ABTS-Substrat und Entwickeln der Platte für 20 bis 30 Minuten. Auslesen der Platte bei einer Wellenlänge von 405 nm mit einer Untergrundwellenlänge von 490 nm.
7. Aufzeichnen eines Graphen von Extinktion gegen Antikörperkonzentration.

Ergebnisse und Folgerungen:
Die Bindungskapazitäten der drei anti-gp39-Antikörper (muriner, chimärer und humanisierte Version 1 von 24-31) relativ zur Konzentration der Antikörper waren im Wesentlichen deckungsgleich (siehe 9). Dies ist ein gutes Anzeichen, dass diese Antikörper ähnliche Bindungskapazitäten für humanes gp39 aufweisen, was darauf hinweist, dass der humanisierte Antikörper die gp39-Bindungsaffinität des murinen 24-31 beibehalten hat.
BEISPIEL 13
Kompetition zwischen Biotin-markiertem murinem 24-31 und chimärem und humanisierter Version 1 von 24-31
Um die Ähnlichkeit der Bindung zwischen 24-31 und seinen chimären und humanisierten Versionen zu bestimmen, wurde eine Untersuchung mit dem Ziel der Messung des Vermögens von jenen Derivaten, mit dem ursprünglichen murinen Antikörper bei der Bindung an gp39 zu kompetitieren, durchgeführt. In früheren Untersuchungen wurde etabliert, dass eine 2/3-Sättigung der Bindung bei ungefähr 200 ng/ml 24-31 erreicht wurde. Diese Menge wurde in den Kompetitionstests verwendet. H24-31 wurde biotinyliert, damit nur die direkte Bindung von 24-31 gemessen wurde und damit die Kompetition als verringerte Bindung von 24–31 gemessen wurde. Unterschiedliche Konzentrationen der chimären und humanisierten 24–31-Versionen wurden mit biotinyliertem murinem 24-31 bei einer Endkonzentration von 200 ng/ml gemischt und in den Vertiefungen einer mit gp39+CHO-Zellen, welche an der Platte mit Glutaraldehyd fixiert worden waren, beschichteten ELISA-Platte verteilt. Der Level der Bindung von 24-31 wurde unter Verwendung von Avidin-HRP wie nachstehend beschrieben gemessen.
Protokoll:
Plattenvorbereitung

1. Geben von 50 von Poly-1-lysin in jede Vertiefung auf der Platte mit 96 Vertiefungen. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Ausschütteln der Platten, um Poly-1-lysin zu entfernen.
2. Waschen von mgp39-CHO-Zellen 3 Mal mit HBSS durch Zentrifugieren bei 1500 UpM für 5 Minuten. Resuspendieren der Zellen in HBSS auf 2 × 10⁶ Zellen/ml.
3. Geben von 50 μl Zellsuspension in jede Vertiefung und Zentrifugieren der Platten bei 2000 UpM für 5 Minuten.
4. Zugeben von 50 μl/Vertiefung von eiskaltem 0,5%igem Glutaraldehyd und Inkubieren für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
5. Ausschütteln der Platte und Abtupfen, um überschüssigen Glutaraldehyd zu entfernen. Zugeben von 150 μl/Vertiefung von 100 mM Glycin mit 0,1% BSA und Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Die Platten können sofort verwendet werden oder bei –20°C für eine Verwendung in der Zukunft eingefroren werden.

Bindungstest

1. Auftauen der Platte und Entfernen des Glycinpuffers.
2. Verdünnen von Maus-anti-gp39-Biotin auf 200 ng/ml in PBS mit 1% BSA.
3. Reihenverdünnen der Testantikörper (Maus, chimärer und humanisierter 24-31) 1:2, ausgehend von 10 μg/ml, in Verdünnungspuffer.
4. Überführen von 50 μg der verdünnten Testantikörper und Maus-anti-gp39-Biotin in jede Vertiefung in Zweifachbestimmung. Mehrere Vertiefungen sollten 50 μl Verdünnungspuffer mit dem Maus-anti-gp39-Biotin als eine Kontrollgruppe für das Maximum enthalten. Inkubieren für 2 Stunden bei Raumtemperatur.
5. Waschen der Platten 10 Mal in fließendem Leitungswasser.
6. Zugeben von 50 μl/Vertiefung einer 1:2000-Verdünnung von Streptavidin-HRP und Inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
7. Waschen der Platten 10 Mal in fließendem Leitungswasser.
8. Zugeben von 50 μl/Vertiefung von ABTS-Substrat und Entwickeln der Platte für 20 bis 30 Minuten. Auslesen der Platte bei einer Wellenlänge von 405 nm mit einer Untergrundwellenlänge von 490 nm.
9. Berechnen der prozentualen Inhibierung unter Verwendung des Mittelwerts der Kontrollvertiefungen.

Ergebnisse und Folgerungen:
Alle drei Antikörper zeigten eine gleich gute Kompetitivität wie der Biotin-markierte 24-31 (siehe 10). Die Kompetitionsprofile sind innerhalb der Einschränkungen des Tests bei allen Konzentrationen im Wesentlichen deckungsgleich. Dies zeigt, dass der getestete humanisierte Antikörper (Version 1) seine gp39-Bindungsaffinität beibehält.
BEISPIEL 14
Modulierung der T-Zellen-abhängigen B-Zellen-Differenzierung
Um zu bestätigen, dass der humanisierte 24-31 die funktionelle in vitro-Aktivität von murinen 24-31 beibehält, wurde der humanisierte 24-31 in einem „Lipsky"-Test mit dem murinen 24-31 verglichen. Periphere mononukleäre Spenderblutzellen wurden in zwei Fraktionen, eine T- und eine B-Zellen-Fraktion, aufgeteilt. Die T-Zellen wurden zuerst mit Mitomycin C behandelt, um eine Mitose zu verhindern, und dann mit einem anti-CD3-Antikörper aktiviert. Die B-Zellen wurden zusammen mit entweder dem murinen oder dem humanisierten (Version 1) 24-31-Antikörper zugegeben. Eine Positivkontrolle ohne Antikörper und eine Negativkontrolle ohne B-Zellen waren in dem Experiment enthalten. Nach einer Inkubation von 10 Tagen wurden die Überstände auf die Gegenwart von humanem IgM getestet.
Protokoll:

1. Beschichten einer Platte mit 96 Vertiefungen mit 50 μl/Vertiefung an sterilem 4 μg/ml anti-CD3-Antikörper (verdünnt in 50 mM Tris, pH-Wert 9) für 2 Stunden bei 37°C.
2. Selektives Reinigen von T- und B-Zellen von einer Leukozytenmanschette unter Verwendung der Lympho-Kwik-Reagenzien. Aktivieren der T-Zellen mit 50 μg/ml Mitomycin C pro 5 × 10⁶ Zellen für 30 Minuten bei 37°C.
3. Waschen der Vertiefungen der Platte mehrere Male mit sterilem HBSS oder Medium, um nicht-anhaftenden Antikörper zu entfernen.
4. Geben von 1 × 10⁵ gereinigten T-Zellen (2 × 10⁶/ml) in jede Vertiefung.
5. Geben von 5 × 10⁵ gereinigten B-Zellen (5 × 10⁶/ml) in jede Vertiefung. Geben von 50 μl anti-gp39-Antikörper (10 bis 0,1 μg/ml) in jede Vertiefung in Vierfachbestimmung. Kontrollvertiefungen sollten enthalten: a) 0 Antikörper, b) 0 Antikörper, keine T-Zellen, und c) 0 Antikörper, keine B-Zellen.
6. Inkubieren der Platte bei 37°C/5% CO₂ für 12 Tage.
7. Zugang zum Zellwachstum nach 7 Tagen unter Verwendung von ³H-Thymidin oder einem anderen akzeptablen Verfahren in den Vertiefungen in Zweifachbestimmung.
8. Nach 12 Tagen Sammeln der Überstände der Vertiefungen der Zweifachbestimmungen und Durchführen von ELISA-Tests, um die Ig-Herstellung (IgM) zu bestimmen.

Ergebnisse und Folgerungen:
Die Ergebnisse zeigen, dass die Herstellung von humanem IgM 50% durch den humanisierten 24-31 bei einer Konzentration von niedriger als 0,01 μg/ml inhibiert wird, was ähnlich zum Inhibierungslevel ist, der mit dem murinem 24-31 erhalten wird (siehe 11). Der humanisierte Antikörper behält sein Vermögen zur Inhibierung der T-Zellen-abhängigen B-Zellen-Differenzierung (IgM-Herstellung) in diesem Experiment bei.
BEISPIEL 15
Bewertung des humanisierten 24-31, Version 2
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob der humanisierte 24-31, Version 2 im Vergleich zu Version 1 eine ähnliche gp39-Bindungskapazität in einem direkten Bindungstest aufweist.
Protokoll:
Das gleiche wie in Beispiel 13 vorstehend.
Ergebnisse und Folgerungen:
Die Ergebnisse zeigen, dass die Bindungskapazität der zwei 24-31-Versionen im Wesentlichen deckungsgleich ist (siehe 12). Dies weist daraufhin, dass die zwei Versionen eine vergleichbare Bindungsaktivität zu gp39 aufweisen.
BEISPIEL 16
Dieses Experiment wurde durchgeführt, um den K_d-Wert von 24-31 und den zwei humanisierten Versionen 1 und 2 zu messen.
Protokoll:
Eine vorher bestimmte Menge von jedem der drei Antikörper (muriner, Version 1 oder Version 2 24-31) wurde unter Verwendung von IODO-BEADS^® (Pierce) mit 125₁ markiert. Antikörper-gebundenes ¹²⁵I wurde von freiem ¹²⁵I durch Größenauftrennung an einer Sephadex-G25/DEAE/Amberlit-Säule abgetrennt.
Die direkte Bindung des ¹²⁵I-markierten Antikörpers an murinen gp39-CHO-Zellen wurde in einer Verdünnungsreihe getestet, um sowohl die Zählereignisse/μg als auch die geeignete Arbeitskonzentration (≈ Konzentration bei halb-maximaler Bindung) zu bestimmen.
¹²⁵I-markierter Antikörper wurde mit nicht-markiertem Antikörper in einer Verdünnungsreihe gemischt und inkubiert. Bezogen auf die Gesamtmenge an gebundenem Antikörper und die Menge an freiem Antikörper wurde eine Scatchard-Aufzeichnung eines Graphen von gebunden gegen gebunden-frei erzeugt. Die Antikörpergesamtkonzentration wurde auf eine Standardgröße von 75 kD für eine aktive Stelle bezogen.
Der K_d-Wert wurde durch Erzeugung einer „Best fit"-Gerade berechnet. Der Kehrwert der Steigung der Kurve ist der K_d-Wert. Der Korrelationskoeffizient, r², wurde auch mit einem Computer berechnet.
Erlebnisse:
Die Scatchard-Aufzeichnungen wurden analysiert. Die K_d-Werte dieser Analyse sind: Version 2, K_d = 14 nM; muriner 24-31, K_d = 8,51 nM; Version 1, K_d = 5,6. Die Ergebnisse sind in den 13 (murin), 14 (Version 1) beziehungsweise 15 (Version 2) gezeigt. Diese Ergebnisse liefern einen weiteren Beweis, dass der Erfindungsgegenstand humanisierte Antikörper das gp39-Antigen ähnlich zu 24-31 binden.
BEISPIEL 17
FcRI-Bindung von H24-31.1
Die FcRI-Bindung wurde an einer CHO-Zelllinie durchgeführt, welche mit dem Gen transfiziert worden war, das den humanen Fern kodiert (16). Die Bindung an dem Fe-Rezeptor durch H24-31.1 wurde mit und ohne lösliches gp39 in der Form eines Fusionsproteins, welches aus dem extrazellulären Teil von CD8 bestand, der mit dem extrazellulären Teil von humanem gp39 verbunden war, getestet. 16 zeigt, dass H24-31.1 nur an FcRI bindet, wenn mit dem Antigen ein Komplex gebildet wird.
BEISPIEL 18
FcRII-Bindung von H24-31.1
Die FcRII-Bindung wurde unter Verwendung einer Mausfibroblastenzelllinie durchgeführt, welche mit dem Gen transfiziert worden war, das den humanen FcRII kodiert (17). Die Bindung an dem Fe-Rezeptor durch H24-31.1 wurde mit und ohne lösliches gp39 in der Form eines Fusionsproteins, welches aus dem extrazellulären Teil von CD8 bestand, der mit dem extrazellulären Teil von humanem gp39 verbunden war, getestet. 17 zeigt, dass H24-31.1 nur an Fc-Rezeptor II bindet, wenn mit dem Antigen ein Komplex gebildet wird.
BEISPIEL 19
Die Wirkung von H24-31.1 bei Komplement-abhängiger zellulärer Zytotoxizität
H24-31.1 wurde in verschiedenen Konzentrationen zu gp39+CHO-Zellen in der Gegenwart von 5% Kaninchenkomplement gegeben (18). Das Wachstum der CHO-Zellen wurde mit Alamar Blue beobachtet. 18 zeigt, dass H24-31.1 50% des Zellwachstums bei ungefähr 0,5 μg/ml inhibiert.
BEISPIEL 20
Bestimmung der C1q-Bindung von gp39+CHO-gebundenem H24-31.1
Mit verschiedenen Konzentrationen an H24-31.1 markierten gp39+CHO-Zellen wurden in einer überschüssigen Menge an humanem C1q (Komplementfaktor 1) inkubiert und anschließend mit FITC-markiertem Ziegen-anti-humaner C1q inkubiert. Die Proben wurden durch Durchflusszytometrie analysiert, um das relative Markieren der Zellen mit C1q zu bestimmen (19). 19 zeigt, dass das Markieren der Zellen mit C1q von der Antikörperkonzentration abhing und dass ein H24-31.1-Fab-Fragment (keine C1q-Bindung) kein C1q bindet.
BEISPIEL 21
Wirkung von H24-31.1 auf T-Zellen-Antworten auf ein T-Zellen-abhängiges Recall-Antigen
Humane periphere Blutlymphozyten wurden in Iscoves Modified Dulbecco's Medium, welches 10% humanes AB-Serum, L-Glutamin, Natriumpyruvat und nicht-essentielle Aminosäuren enthielt, kultiviert (20). Alle Kulturen, außer eine, wurden auch mit 10 μg/ml Tetanustoxoid versetzt. Alle mit Tetanustoxoid geprimten Kulturen wurden auch mit 0 bis 10 μg/ml H24-31.1 versetzt. Nach 3 Tagen wurde der Überstand zur Bestimmung des IL-2-Gehalts verwendet. Nach weiteren 2 Tagen wurde in alle Kulturen 1 μCi ³H-Thymidin/ml für 16 Stunden gegeben. Die Zellen wurden geerntet und auf die Einbringung von Thymidin in chromosomale DNA als ein Maß für das Wachstum getestet. Kulturen ohne Tetanustoxoid wiesen EL-2-Levels unter der Nachweisgrenze, ungefähr 2 ng/ml, auf. Die selben Kulturen hatten Hintergrundlevels an eingebrachtem ³H-Thymidin von ungefähr 300 CpM und wurden von der Behandlung mit H24-31.1 offensichtlich nicht beeinflusst (nicht gezeigt). 20 zeigt, dass das durch TT induzierte Wachstum und die IL-2-Herstellung durch > 1 μg/ml H24-31.1 maximal etwa 40% inhibiert wurden.
BEISPIEL 22
Wirkung von H24-31.1 auf die T-Zellen-abhängige B-Zellen-Differenzierung
Eine Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit anti-CD3-Antikörper bei 2 μg/ml über Nacht beschichtet und wurde vor der Verwendung sehr umfangreich mit PBS gewaschen. Periphere Blutlymphozyten von einer Leukozytenmanschette wurden in eine T-Zellen-Fraktion und eine B-Zellen-Fraktion aufgeteilt. Die T-Zellen wurden mit Mitomycin C für 1 Stunde vor dem Aussäen in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen inkubiert. Die B-Zellen wurden anschließend in Iscoves Modified Dulbecco's Medium, welches mit 10% fötalem Kälberserum, L-Glutamin, Natriumpyruvat und nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt worden war, zugegeben. Die Zellen wurden in der Gegenwart von H24-31.1 bei verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 0 bis 10 μg/ml inkubiert. Nach 12 Tagen wurden die Überstände verwendet und auf die Gegenwart von humanem IgG getestet (21). Die Figur zeigt, dass der humanisierte H24-31.1 die T-Zellen-abhängige IgG-Herstellung bei 1 ng/ml ungefähr 85% inhibiert.
BEISPIEL 23
Wirkung von H24-31.1-Fab auf die T-Zellen-abhängige B-Zellen-Differenzierung
Eine Platte mit 96 Vertiefungen wurde mit anti-CD3-Antikörper bei 2 μg/ml über Nacht beschichtet und wurde vor der Verwendung sehr umfangreich mit PBS gewaschen. Periphere Blutlymphozyten von einer Leukozytenmanschette wurden in eine T-Zellen-Fraktion und eine B-Zellen-Fraktion aufgeteilt. Die T-Zellen wurden mit Mitomycin C für 1 Stunde vor dem Aussäen in die Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen inkubiert. Die B-Zellen wurden anschließend in Iscoves Modified Dulbecco's Medium, welches mit 10% fötalem Kälberserum, L-Glutamin, Natriumpyruvat und nicht-essentiellen Aminosäuren ergänzt worden war, zugemischt. Die Zellen wurden in der Gegenwart von H24-31.1 und H24-31.1-Fab bei verschiedenen Konzentrationen im Bereich von 0 bis 10 μg/ml inkubiert. Nach 12 Tagen wurden die Überstände verwendet und auf die Gegenwart von humanem IgG getestet (22). Diese Figur zeigt, dass es keinen Unterschied bei der Inhibierung der IgG-Herstellung zwischen dem gesamten H24-31.1-Antikörper und dem Fab-Fragment gab.
BEISPIEL 24
Wirkung von H24-31.1 auf die Erzeugung von Antigen-spezifischen B-Zellen-Antworten auf ein T-Zellen-abhängiges Recall-Antigen
Humane Milzzellen, welche für 3 Tage in vitro mit Tetanustoxoid geprimt worden waren, wurden in SCID-Mäuse bei einer Konzentration von ungefähr 1 × 10⁷ Zellen/SCID überführt. Nach 6 Tagen wurde den resultierenden hu-SPL-SCID-Mäusen PBS (Gruppe 1) oder 300 μg H24-31.1 (Gruppen 1 und 2) injiziert. Am folgenden Tag wurden die hu-SPL-SCID-Mäuse alle mit Tetanustoxoid gereizt. Die Mäuse in der Gruppe 3 erhielten 2 weitere Injektionen von 300 μg H24-31.1 jeweils in einem Intervall von 3 Tagen. Man nahm den Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten Blut ab und die Levels der Titer des humanen IgG-anti-Tetanustoxoid wurden durch ELISA bestimmt (23). 23 zeigt, dass die Injektion von H24-31.1 die Erzeugung der Tetanustoxoid-spezifischen Antworten um ungefähr 90% inhibierte.
BEISPIEL 25
Wirkung des H24-31.1-Antikörpers auf die humane B-Zellen-Proliferation
Das Ziel dieser Experimente war die Inhibierung der Induzierung durch lösliches gp39-CD8 der Proliferation von B-Zellen durch den H24-31.1-Antikörper zu zeigen.
Lymphozytenzubereitungen aus Leukozytenmanschetten wurden mit dem Lympho-Kwik-Reagenz nach einem durch den Hersteller empfohlenen Protokoll (Cat# LK-25-B, LK-50-B, One Lambda, Inc., CA 91303) an B-Zellen angereichert (> 90%). Angereicherte humane B-Zellen, welche mit 1000 U/ml an IL4 (Genzyme, Corp.) bei 1 × 10⁵ Zellen pro jeder der 96 Vertiefungen kultiviert worden waren, wurden mit variierenden Konzentrationen an H24-31.1-Antikörper plus 10 μg/ml gp39-CD8 für 4 Tage inkubiert. Während der letzten 16 Stunden der Inkubation wurden die Kulturen mit 1 μCi/Vertiefung an ³H-Thymidin gereizt und die Einbringung der Radioaktivität durch das Proliferieren der Zellen wurde gemessen. 24 zeigt die B-Zellen-Proliferation durch gp39-CD8 in einer dosisabhängigen Weise. 25 zeigt, dass H24-31.1 die gp39-CD8-abhängige B-Zellen-Proliferation inhibiert.
Verwendung
Die humanisierten anti-gp39-Antikörper der vorliegenden Erfindung haben ein Potential bei der Behandlung von jedwedem Erkrankungszustand, wobei die gp39-Modulierung und/oder Inhibierung der gp39-CD40-Wechselwirkung therapeutisch von Vorteil ist. Darüber hinaus kann der Erfindungsgegenstand humanisierte anti-gp39-Antikörper bei der Behandlung von Erkrankungen verwendet werden, wobei eine Suppression der Antikörperantworten auf Antigene wünschenswert ist. Solche Zustände schließen sowohl Autoimmun- als auch nicht-Autoimmunstörungen ein.
Das Vermögen der anti-gp39-Antikörper zur Verhinderung der CD40-Signalgebung in B-Zellen wird in vivo funktionell in eine beträchtliche Inhibierung von T-Zellen-abhängigen Antikörperantworten übertragen. Deshalb wird erwartet, dass Autoimmunerkrankungen, welche durch Autoantikörperherstellung vermittelt werden, von einer anti-gp39-Antikörper-Therapie profitieren werden. Diese Erkrankungen schließen systemischen Lupus erythematodes, idiopathische thrombozytopenische Purpura, Myasthenia gravis und eine Unterpopulation von Diabetikerpatienten mit anti-Insulin- und anti-Insulinrezeptor-Antikörpern ein. Zudem ist die CD40-Signalgebung in B-Zellen und dendritischen Zellen zum Regulieren von cosignalgebenden Rezeptoren wie B7.1- und B7.2-Molekülen nach oben wesentlich. Eine Blockierung dieser CD40-Signalgebung durch anti-gp39-Antikörper beeinflusst die Antigenpräsentation bei T-Zellen, was in einer Inhibierung der T-Zellen-Aktivierung und T-Zellen-vermittelten Antworten resultiert. Die therapeutische Wirksamkeit der anti-gp39-Antikörper in Erkrankungsmodellen wie CIA, EAE, NOD-Mäusen, GVHD und Transplantatabstoßung bestätigt ferner die Inhibitorwirkung der Antikörper auf die T-Zellen-vermittelten Antworten. Basierend auf diesem Wirkmechanismus, der durch die Wirksamkeit in Tiermodellen unterstützt wird, erstreckt sich das therapeutische Potential des Erfindungsgegenstandes humanisierte anti-gp39-Antikörper auf solche Erkrankungen wie RA, MS, Diabetes, Psoriasis, GVHD und Transplantatabstoßung.
Spezielle Zustände, welche möglicherweise durch Verabreichung des Erfindungsgegenstandes humanisierte Antikörper behandelt werden können, schließen die folgenden ein:
Allergische bronchopulmonale Aspergillose; autoimmunhämolytische Anämie; Acanthosis nigricans; allergische Kontaktdermatitis; Addison-Krankheit; atopische Dermatitis; Alopecia areata; Alopecia universalis; Amyloidose; anaphylaktische Purpura; anaphylaktische Reaktion; aplastische Anämie; hereditäres Angioödem; idiopathisches Angioödem; Morbus Bechterew; kraniale Arteriitis; Riesenzellarteriitis; Takayasu-Arteriitis; temporale Arteriitis; Asthma; progressive zerebelläre Ataxie; Autoimmunoophoritis; Autoimmunorchitis; polyendokrines Autoimmunversagen; Behcet-Krankheit; Berger-Krankheit; Bürger-Krankheit; Alterspemphigus; chronische Schleimhautcandidose; Caplan-Syndrom; Postmyokardinfarktsyndrom; Postpericardiotomiesyndrom; Carditis; Bauchhöhlensprue; Chagas-Krankheit; Chediak-Higashi-Syndrom; Churg-Strauss-Krankheit; Cogan-Syndrom; Kälteagglutininkrankheit; CREST-Syndrom; Morbus Crohn; Kryoglobulinämie; kryptogene idiopathische Lungenfibrose; Dermatitis herpetifomis; Dermatomyositis; Diabetes mellitus; Diamond-Blackfan-Syndrom; DiGeorge-Syndrom; diskoidaler Lupus erythematodes; eosinophile Fasziitis; Episcleritis; Drythema elevatum diutinum; Erythcma marginatum; Erythema multiforme; Erythema nodosum; familiäres Mittelmeerfieber; Felty-Syndrom; Lungenfibrose; anaphylaktische Glomerulonephritis; Autoimmunglomerulonephritis; Poststreptokokkenglomerulonephritis; Glomerulonephritis nach einer Transplantation; membranöse Glomerulopathie; Goodpasture-Syndrom; Transplantat-Wirt-Reaktion; immunvermittelte Granulozytopenie; Granuloma annulare; allergische Granulomatose; granulomatöse Myositis; Morbus Basedow; Hashimoto-Thyroiditis; Hämolytische Erkrankung des Neugeborenen; idiopathische Hämochromatose; Henoch-Schönlein-Purpura; chronische aktive und chronische progressive Hepatitis; Histiozytose X; Hypereosinophiliesyndrom; idiopathische thrombozytopenische Purpura; Job-Syndrom; juvenile Dermatomyositis; juvenile rheumatoide Arthritis (juvenile chronische Arthritis); Kawasaki-Krankheit; Keratitis; Keratoconjunctivitis sicca; Landry-Guillain-Barre-Strohl-Syndrom; lepröser Aussatz; Löffler-Syndrom; Lyell-Syndrom; Lyme-Krankheit; lymphomatoide Granulomatose; systemische Mastozytose; Mischkollagenose; Mononeuritis multiplex; Muckle-Wells-Syndrom; mukokutanes Lymphknotensyndrom; mukokutanes Lymphknotensyndrom; multizentrische Retikulohistiozytose; Multiple Sklerose; Myasthenia gravis; Mycosis fungoides; systemische nekrotisierende Vaskulitis; nephrotisches Syndrom; Overlap-Syndrom; Panniculitis; paroxysmale Kältehämoglobinurie; paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie; Pemphigoid; Pemphigus; Pemphigus erythematodes; Pemphigus foliaceus; Pemphigus vulgaris; Taubenzüchter-Krankheit; Hypersensitivitätspneumonitis; Polyarteriitis nodosa; Polymyalgia rheumatica; Polymyositis; idiopathische Polyneuritis; familiäre Azorenpolyneuropathie (engl. Portuguese familial polyneuropathics); Präeklampsie/Eklampsie; primär biliäre Zirrhose; progressive systemische Sklerose (Skleroderm); Psoriasis; psoriatische Arthritis; pulmonale alveoläre Proteinose; Lungenfibrose; Raynaud-Phänomen/Syndrom; Reidel-Thyroiditis; Reiter-Syndrom; rezidivierende Polychondritis; rheumatisches Fieber; rheumatoide Arthritis; Sarkoidose; Skleritis; sklerosierende Cholangitis; Serumkrankheit; Sezary-Syndrom; Sjogren-Syndrom; Stevens-Johnson-Syndrom; Still-Krankheit; subakute sklerosierende Panenzephalitis; sympathische Ophthalmie; systemischer Lupus erythematodes; Transplantatabstoßung; Colitis ulcerosa; undifferenzierte Bindegewebserkrankung; chronische Urtikaria; Kälteurtikaria; Uveitis; Vitiligo; Weber-Christian-Krankheit; Wegener-Granulomatose; Wiskott-Aldrich-Syndrom.
Von diesen schließen die bevorzugten Indikationen, welche durch eine Verabreichung von anti-gp39-Antikörpern behandelt oder eingestellt werden können, autoimmunhämolytische Anämie; aplastische Anämie; temporale Arteriitis; Diabetes mellitus; Felty-Syndrom; Goodpasture-Syndrom; Transplantat-Wirt-Reaktion; idiopathische thrombozytopenische Purpura; Myasthenia gravis; Multiple Sklerose; Polyarteriitis nodosa; Psoriasis; psoriatische Arthritis; rheumatoide Arthritis; systemischen Lupus erythematodes; Asthma; allergische Zustände; und Transplantatabstoßung ein.
Die Menge an Antikörper, welche zur Erzeugung einer therapeutischen Wirkung nützlich ist, kann durch Standardtechniken, welche dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Die Antikörper werden im Allgemeinen durch eine Standardtechnik in einem pharmazeutisch ver träglichen Puffer bereitgestellt und können über jedweden gewünschten Weg verabreicht werden. Wegen der Wirksamkeit der hier beanspruchten Antikörper und ihrer Toleranz bei Menschen ist es möglich, diese Antikörper wiederholt zu verabreichen, um gegen verschiedene Erkrankungen oder Erkrankungszustände bei einem Menschen anzukämpfen.
Der Erfindungsgegenstand humanisierte anti-gp39-Antikörper (oder Fragmente davon) ist auch zur Induzierung von Immunmodulation, z.B. zur Induzierung der Suppression eines Immunsystems eines Menschen oder eines Tiers, nützlich. Wir beschreiben deshalb auch ein Verfahren zur prophylaktischen oder therapeutischen Induzierung von Immunmodulation in einem Menschen oder einem anderen Tier, welche dessen bedürfen, durch Verabreichen einer wirksamen, nicht toxischen Menge eines solchen Antikörpers dieser Erfindung an einen solchen Menschen oder ein anderes Tier.
Die Tatsache, dass die Antikörper dieser Erfindung bei der Induzierung von Immunsuppression verwendet werden können, bedeutet, dass sie zur Behandlung oder Vorbeugung von Resistenz gegen oder von Abstoßung von transplantierten Organen oder Geweben (z.B. Niere, Herz, Lunge, Knochenmark, Haut, Korea, usw.); die Behandlung oder Vorbeugung von Autoimmun-, entzündlichen, proliferativen und hyperproliferativen Erkrankungen, und von kutanen Manifestationen von durch das Immunsystem vermittelten Erkrankungen (z.B. rheumatoide Arthritis, Lupus erythematodes, systemischer Lupus erythematodes, Hashimoto-Thyroiditis; Multiple Sklerose, EAE, Myasthenia gravis, Diabetes Typ 1, Uveitis, nephrotisches Syndrom, Psoriasis, atopische Dermatitis, Kontaktdermatitis und weitere ekzematöse Hautentzündungen, seborrhoische Dermatitis, Lichen planus, Pemphigus, Alterspemphigus, Epidermolysis bullosa, Urtikaria, angioneurotische Ödeme, Gefäßentzündungen, Erythem, kutane Eosinophilien, Alopecia areata, usw.); die Behandlung von reversibler obstruktiver Atemwegserkrankung, Darmentzündungen und Allergien (z.B. Zöliakie, Proktitis, eosinophile Gastroenteritis, Mastozytose, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa) und mit Nahrung in Zusammenhang stehenden Allergien (z.B. Migräne, Rhinitis und Ekzem) nützlich sind. Der Erfindungsgegenstand Antikörper kann möglicherweise auch zur Behandlung von nicht-Autoimmunzuständen, wobei eine Immunmodulation wünschenswert ist, verwendet werden, z.B. unter anderem von Transplantat-Wirt-Reaktion (GVHD), Transplantatabstoßung, Asthma, Leukämie, HIV, Lymphom.
Der Erfindungsgegenstand Antikörper kann auch vor der, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung eines Vektors oder rekombinanten Virus (der z.B. eine therapeutische DNA ent hält) verabreicht werden, um die (humorale) Wirtimmunantwort auf den Vektor zu verhindern oder zu verringern.
Der Fachmann wird in der Lage sein, durch Durchführen von Routineexperimenten zu bestimmen, was eine wirksame, nicht toxische Menge des Antikörpers für den Zweck der Induzierung einer Immunsuppression sein wird. Im Allgemeinen wird jedoch eine wirksame Dosierung im Bereich von etwa 0,05 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegen.
Die Antikörper der Erfindung können an einen Menschen oder ein anderes Tier gemäß den vorstehend erwähnten Behandlungsmethoden in einer Menge verabreicht werden, welche ausreichend ist, eine solche Wirkung in einem therapeutischen oder prophylaktischen Ausmaß zu erzeugen. Solche Antikörper der Erfindung können an einen solchen Menschen oder ein solches Tier in einer herkömmlichen Dosierungsform, welche durch Kombinieren des Antikörpers der Erfindung mit einem herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel gemäß bekannten Techniken hergestellt wird, verabreicht werden. Der Fachmann wird erkennen, dass die Form und der Charakter des pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels durch die Menge des Wirkstoffes, mit welchem sie kombiniert werden, den Verabreichungsweg und andere bekannte Variablen bestimmt werden.
Der Verabreichungsweg des Antikörpers (oder Fragments davon) der Erfindung kann oral, parenteral, durch Inhalation oder topisch sein. Der Ausdruck parenteral, wie hier verwendet, schließt intravenöse, intramuskuläre, subkutane, rektale, vaginale oder intraperitoneale Verabreichung ein. Die subkutanen und intramuskulären Formen der parenteralen Verabreichung sind im Allgemeinen bevorzugt.
Die täglichen parenteralen und oralen Dosierungsschemata unter Verwendung von Verbindungen der Erfindung zur prophylaktischen oder therapeutischen Induzierung von Immunsuppression werden im Allgemeinen im Bereich von etwa 0,05 bis 100, aber bevorzugt von etwa 0,5 bis 10, Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag liegen.
Der Antikörper der Erfindung kann auch durch Inhalation verabreicht werden. „Inhalation" bedeutet intranasale oder orale Inhalationsverabreichung. Geeignete Dosierungsformen für eine solche Verabreichung, wie eine Aerosolformulierung oder eine Inhaliervorrichtung mit abgemessener Dosis, können durch herkömmliche Techniken hergestellt werden. Die bevor zugte Dosierungsmenge einer Verbindung der Erfindung, welche verwendet wird, liegt im Allgemeinen im Bereich von etwa 10 bis 100 Milligramm.
Der Antikörper der Erfindung kann auch topisch verabreicht werden. Topische Verabreichung bedeutet nicht-systemische Verabreichung und schließt die Auf- bzw. Einbringung einer Antikörperverbindung (oder eines Fragments davon) der Erfindung extern auf die Epidermis, in die Vestibulum oris und die Instillation eines solchen Antikörpers in das Ohr, das Auge und die Nase, und wo sie im Wesentlichen nicht in den Blutstrom übergehen, ein. Systemische Verabreichung bedeutet orale, intravenöse, intraperitoneale und intramuskuläre Verabreichung. Die Menge eines Antikörpers, welche für eine therapeutische oder prophylaktische Wirkung erforderlich ist, wird natürlich mit dem gewählten Antikörper, der Natur und der Schwere des behandelten Zustandes und dem Tier, welches die Behandlung durchlauft, variieren und unterliegt letztlich der Einschätzung des Arztes. Eine geeignete topische Dosis eines Antikörpers der Erfindung wird im Allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis 100 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht täglich liegen.
Formulierungen
Obwohl es möglich ist, einen Antikörper oder ein Fragment davon alleine zu verabreichen, ist es bevorzugt, sie als ein Arzneimittel bereit zu stellen. Der Wirkstoff kann zur topischen Verabreichung 0,001 Gew.-% bis 10 Gew.-%, z.B. 1 Gew.-% bis 2 Gew.-%, der Formulierung umfassen, obwohl er bis zu 10 Gew.-% umfassen kann, aber bevorzugt nicht mehr als 5 Gew.-% und stärker bevorzugt 0,1 Gew.-% bis 1 Gew.-% der Formulierung.
Die topischen Formulierungen der vorliegenden Erfindung umfassen einen Wirkstoff zusammen mit einem oder mehreren verträglichen Träger(n) davon und gegebenenfalls jedweden anderen therapeutischen Bestandteil(e). Der/die Träger muss/müssen „verträglich" sein, in dem Sinne, dass er/sie mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist/sind und für den Empfänger davon nicht schädlich ist/sind.
Formulierungen, welche für topische Verabreichung geeignet sind, schließen flüssige oder halb-flüssige Zubereitungen ein, welche zur Penetration durch die Haut zu der Stelle, an welcher eine Behandlung erforderlich ist, geeignet sind, wie Einreibemittel, Lotionen, Cremes, Salben oder Pasten, und Tropfen, welche zur Verabreichung in das Auge, das Ohr oder die Nase geeignet sind, ein.
Tropfen gemäß der vorliegenden Erfindung können sterile wässrige oder ölige Lösungen oder Suspensionen umfassen und können durch Lösen des Wirkstoffes in einer geeigneten wässrigen Lösung eines bakteriziden und/oder fungiziden Mittels und/oder von jedwedem anderen geeigneten Konservierungsstoff hergestellt werden und bevorzugt ein oberflächenaktives Mittel einschließen. Die resultierende Lösung kann dann durch Filtration abgeklärt werden, in einen geeigneten Behälter überführt werden, der dann verschlossen und durch Autoklavieren oder Halten bei 90°–100°C für eine halbe Stunde sterilisiert wird. Alternativ kann die Lösung durch Filtration sterilisiert und durch eine aseptische Technik in den Behälter überführt werden. Beispiele von bakteriziden und fungiziden Mitteln, welche zur Aufnahme in die Tropfen geeignet sind, sind Phenylmercurinitrat oder -acetat (0,002%), Benzalkoniumchlorid (0,01%) und Chlorhexidinacetat (0,01%). Geeignete Lösungsmittel für die Herstellung einer öligen Lösung schließen Glycerol, verdünnten Alkohol und Propylenglykol ein.
Lotionen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen jene, welche zur Auf- bzw. Einbringung auf die Haut oder in das Auge geeignet sind, ein. Eine Augenlotion kann eine sterile wässrige Lösung, welche gegebenenfalls ein Bakterizid enthält, umfassen und dann durch Verfahren hergestellt werden, welche ähnlich zu jenen zur Herstellung von Tropfen sind. Lotionen oder Einreibemittel zur Aufbringung auf die Haut können auch ein Mittel zum Beschleunigen des Trocknen und zum Kühlen der Haut, wie einen Alkohol oder Aceton, und/oder ein Feuchthaltemittel wie Glycerol oder ein Öl wie Castoröl oder Arachisöl, einschließen.
Cremes, Salben oder Pasten gemäß der vorliegenden Erfindung sind halb-feste Formulierungen des Wirkstoffes für externe Aufbringung. Sie können durch Mischen des Wirkstoffes in fein verteilter oder pulverförmiger Form, alleine oder in Lösung oder Suspension in einem wässrigen oder nicht-wässrigen Fluid, mit der Hilfe einer geeigneten maschinellen Ausrüstung, mit einer Fett- oder nicht-Fett-Grundlage hergestellt werden. Die Grundlage kann Kohlenwasserstoffe wie hartes, weiches oder flüssiges Paraffin, Glycerol, Bienenwachs, eine Metallseife; einen Schleim; ein Öl mit natürlichem Ursprung wie Mandel-, Mais-, Arachis-, Castor- oder Olivenöl; Wollfett oder seine Derivate, oder eine Fettsäure wie Stearin- oder Ölsäure zusammen mit einem Alkohol wie Propylenglycol oder Macrogole umfassen. Die Formulierung kann jedwedes geeignete oberflächenaktive Mittel wie ein anionisches, kationisches oder nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel wie Sorbitanester oder Polyoxyethylenderivate davon enthalten. Suspendiermittel wie natürliche Gumme, Cellulosederivate oder anorganische Materialien wie kieselsäurehaltige Silikamaterialien und andere Bestandteile wie Lanolin können auch enthalten sein.
Der Fachmann wird erkennen, dass die optimale Menge und Bereich der einzelnen Dosierungen eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung durch die Natur und das Ausmaß des behandelten Zustandes, die Form, den Weg und die Stelle der Verabreichung und das besondere Tier, das behandelt wird, bestimmt werden, und dass solche optimalen Werte durch herkömmliche Techniken bestimmt werden können. Der Fachmann wird auch erkennen, dass der optimale Verlauf der Behandlung, d.h. die Anzahl an Dosen eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung, welche pro Tag für eine definierte Anzahl an Tagen gegeben wird, durch den Fachmann unter Verwendung von herkömmlichen Tests zur Bestimmung des Verlaufs einer Behandlung ermittelt werden kann.
Es wird angenommen, dass ein Fachmann ohne weitere Aufklärung unter Verwendung der vorstehenden Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem vollständigsten Umfang verwenden kann. Die folgenden sollen deshalb nur als veranschaulichende Beispiele angesehen werden und nicht als Einschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise.
Kapselzusammensetzung
Ein Arzneimittel dieser Erfindung in der Form einer Kapsel wird durch Füllen einer Standard-Hartgelatinekapsel aus zwei Teilen mit 50 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung, in gepulverter Form, 100 mg Lactose, 32 mg Talk und 8 mg Magnesiumstearat hergestellt.
Injizierbare parenterale Zusammensetzung
Ein Arzneimittel dieser Erfindung in einer Form, welche zur Verabreichung durch Injektion geeignet ist, wird durch Rühren von 1,5 k eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung, bezogen auf das Gewicht, in 10 k Propylenglycol und Wasser, bezogen auf das Gewicht, hergestellt. Die Lösung wird durch Filtration sterilisiert.
Salbenzusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Weißes Weichparaffin auf 100,0 g.

Der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung werden in einem kleinen Volumen des Vehikels dispergiert, wobei ein nicht klumpiges homogenes Produkt hergestellt wird. Zusammendrückbare Metalltuben werden dann mit der Dispersion gefüllt.
Topische Cremezusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Polawax GP 200 20,0 g.
Wasserfreies Lanolin 2,0 g.
Weißes Bienenwachs 2,5 g.
Methylhydroxybenzoat 0,1 g.
Destilliertes Wasser auf 100,0 g.

Das Polawax, Bienenwachs und Lanolin werden zusammen bei 60°C erwärmt. Eine Lösung von Methylhydroxybenzoat wird zugegeben und eine Homogenisierung wird unter Verwendung von Hochgeschwindigkeitsrühren erreicht. Die Temperatur lässt man dann auf SOOC fallen. Der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung werden dann zugegeben und darin dispergiert und man lässt die Zusammensetzung mit Rühren bei niedriger Geschwindigkeit abkühlen.
Topische Lotionszusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 1,0 g.
Sorbitanmonolaurat 0,6 g.
Polysorbat 20 0,6 g.
Cetostearylalkohol 1,2 g.
Glycerin 6,0 g.
Methylhydroxybenzoat 0,2 g.
Gereinigtes Wasser B.P. auf 100,00 ml. (B.P. = Britisches Arzneibuch)

Das Methylhydroxybenzoat und das Glycerin werden in 70 ml des Wassers bei 75°C gelöst. Das Sorbitanmonolaurat, das Polysorbat 20 und der Cetostearylalkohol werden zusammen bei 75°C geschmolzen und zu der wässrigen Lösung gegeben. Die resultierende Emulsion wird homogenisiert, man lässt mit kontinuierlichem Rühren abkühlen und der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung werden als eine Suspension in dem verbleibenden Wasser zugegeben. Die gesamte Suspension wird gerührt, bis sie homogenisiert ist.
Augentropfenzusammensetzung

Antikörper oder Fragment davon der Erfindung 0,5 g.
Methylhydroxybenzoat 0,01 g.
Propylhydroxybenzoat 0,04 g.
Gereinigtes Wasser B.P. auf 100,00 ml.

Die Methyl- und das Propylhydroxybenzoat werden in 70 ml gereinigtem Wasser bei 75°C gelöst und man lässt die resultierende Lösung abkühlen. Der Antikörper oder das Fragment davon der Erfindung werden dann zugegeben und die Lösung wird durch Filtration durch einen Membranfilter (0,022 Am Porengröße) sterilisiert und in geeigneten sterilen Behältern aseptisch verpackt.
Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation
Für einen Aerosolbehälter mit einem Fassungsvermögen von 15 bis 20 ml: Mischen von 10 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung mit 0,2 bis 0,5 k eines Gleitmittels, wie Polysorbat 85 oder Ölsäure, und Dispergieren eines solchen Gemisches in einem Treibmittel, wie Freon, bevorzugt in einer Kombination von (1,2-Dichlortetrafluorethan) und Difluorchlormethan, und Geben in einen geeigneten Aerosolbehälter, welcher für entweder intranasale oder orale Inhalationsverabreichung angepasst ist. Zusammensetzung zur Verabreichung durch Inhalation für einen Aerosolbehälter mit einem Fassungsvermögen von 15 bis 20 ml: Lösen von 10 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung in Ethanol (6 bis 8 ml), Zugeben von 0,1 bis 0,2 k eines Gleitmittels, wie Polysorbat 85 oder Ölsäure, und Dispergieren desselben in einem Treibmittel, wie Freon, bevorzugt in einer Kombination von (1,2-Dichlortetrafluorethan) und Difluorchlormethan, und Geben in einen geeigneten Aerosolbehälter, welcher für entweder intranasale oder orale Inhalationsverabreichung angepasst ist.
Die Antikörper und Arzneimittel der Erfindung sind insbesondere zur perenteralen Verabreichung, d.h. subkutan, intramuskulär oder intravenös, nützlich. Die Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung werden im Allgemeinen eine Lösung eines Antikörpers oder eines Fragments davon der Erfindung oder einen Cocktail davon, gelöst in einem verträglichen Träger, bevorzugt einem wässrigen Träger, umfassen. Eine Vielzahl an wässrigen Trägern kann verwendet werden, z.B. Wasser, bepuffertes Wasser, 0,4 k Salzlösung, 0,3%iges Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und im Allgemeinen frei von teilchenförmigem Material. Diese Lösungen können durch herkömmliche bekannte Sterilisierungstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch verträgliche Hilfssubstanzen enthalten, wie erforderlich, um an physiologische Bedingungen anzunähern, wie Mittel zum Einstellen des pH-Werts oder zum Puffer, usw. Die Konzentration des Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung in einer solchen pharmazeutischen Formulierung kann stark variieren, d.h. von weniger als etwa 0,5 k, normalerweise bei oder mindestens etwa 1 Gew.-% bis zu 15 oder 20 Gew.-%, und wird primär bezogen auf die Fluidvolumina, -viskositäten, usw. gemäß der gewählten besonderen Verabreichungsweise ausgewählt.
So kann ein Arzneimittel der Erfindung zur intramuskulären Injektion hergestellt werden, welches 1 ml steriles gepuffertes Wasser und 50 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung enthält. In ähnlicher Weise kann ein Arzneimittel der Erfindung zur intravenösen Infusion hergestellt werden, welches 250 ml sterile Ringer-Lösung und 150 mg eines Antikörpers oder Fragments davon der Erfindung enthält. Aktuelle Verfahren zur Herstellung von parenteralen verabreichbaren Zusammensetzungen sind bekannt oder werden für den Fachmann ersichtlich sein und werden detaillierter zum Beispiel in Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, beschrieben.
Die Antikörper (oder Fragmente davon) der Erfindung können zur Lagerung lyophilisiert und in einem geeigneten Träger vor der Verwendung rekonstituiert werden. Es wurde gezeigt, dass diese Technik bei herkömmlichen Immunglobulinen wirksam ist und auf dem Fachgebiet bekannte Lyophilisierungs- und Rekonstitutionstechniken können verwendet werden.
Abhängig vom beabsichtigten Ergebnis kann das Arzneimittel der Erfindung für prophylaktische und/oder therapeutische Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischer Verwendung werden die Zusammensetzungen an einen Patienten, der bereits an einer Erkrankung leidet, in einer Menge verabreicht, welche zur Heilung oder wenigstens zur teilweisen Ein dämmung der Erkrankung und seiner Komplikationen ausreichend ist. Bei prophylaktischen Verwendungen werden die Zusammensetzungen, welche die vorliegenden Antikörper oder einen Cocktail davon enthalten, an einen Patienten, der noch keinen Erkrankungszustand aufweist, verabreicht, um die Resistenz des Patienten zu steigern.
Einzelne oder multiple Verabreichungen der Arzneimittel können mit Dosislevels und Mustern durchgeführt werden, welche vom behandelten Arzt ausgewählt werden. In jedem Fall soll das Arzneimittel der Erfindung eine Menge der veränderten Antikörper (oder Fragmente davon) der Erfindung bereitstellen, welche ausreichend ist, den Patienten wirksam zu behandeln.
Es sollte auch angemerkt werden, dass die Antikörper dieser Erfindung für das Design und die Synthese von jeden Peptid- oder nicht-Peptid-Verbindungen (Mimetika), welche als der Antikörper in der gleichen Therapie nützlich sein werden, verwendet werden können. Siehe z.B. Saragovi et al., Science, 253: 792–795 (1991).

Claims

Humanisierter Antikörper, welcher an gp39 bindet und das Binden von gp39 an CD40 inhibiert, wobei der Antikörper eine humanisierte variable leichte Kettenregion enthält, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
und wobei der Antikörper eine humanisierte variable schwere Kettenregion enthält, umfassend eine Aminosäuresequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, welcher eine humanisierte variable leichte Kettensequenz (1) und eine humanisierte variable schwere Kettensequenz (1) enthält.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, welcher eine humanisierte variable leichte Kettensequenz (2) und eine humanisierte variable schwere Kettensequenz (1) enthält.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, welcher eine humanisierte variable leichte Kettensequenz (1) und eine humanisierte variable schwere Kettensequenz (2) enthält.
Humanisierter Antikörper nach Anspruch 1, welcher eine humanisierte variable leichte Kettensequenz (2) und eine humanisierte variable schwere Kettensequenz (2) enthält.
Humanisierter Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die leichte Kette eine humane Kappa- oder konstante Lamba-Region umfasst und die schwere Kette eine normale humane konstante Region umfasst, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Gamma 1, Gamma 2, Gamma 3 und Gamma 4 besteht.
DNA-Sequenz, welche einen humanisierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Expressionsvektor, welcher eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 7 enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche einen humanisierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 enthält.
Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Autoimmunerkrankung, -störung oder -zustandes, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus autoimmunhämolytischer Anämie, Goodpasture-Syndrom, rheumatoider Arthritis, Psoriasis, Multipler Sklerose, Diabetes mellitus, systemischen Lupus erythematodes und idiopathischer thrombozytopenischer Purpura besteht.
Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer nicht-Autoimmunerkrankung, -störung oder -zustandes, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Asthma, HIV, Leukämie und Lymphom besteht.
Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Transplantat-Wirt-Reaktion oder Abstoßung eines transplantierten Gewebes oder Organs.
Verwendung von mindestens einem humanisierten Antikörper gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, einer Störung oder eines Zustandes, welche aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus rheumatoider Arthritis, Felty-Syndrom, Lupus erythematodes, systemischen Lupus erythematodes, Hashimoto-Thyreoiditis, Multipler Sklerose, Polyarteriitis nodosa, Myasthenia gravis, Diabetes Typ 1, Uveitis, nephrotischem Syndrom, Psoriasis, Arthritis psoriatica, atopischer Dermatitis, Kontaktdermatitis und weiteren ekzematösen Hautentzündungen, seborrhoischer Dermatitis, Lichen planus, Pemphigus, Alterspemphigus, Epidermolysis bullosa, Urtikaria, angioneurotischen Ödemen, Gefäßentztindungen, Erythem, kutanen Eosinophilien, Alopecia areata, reversibler obstruktiver Atemwegserkrankung, Migräne, Ekzem, Rhinitis und anderen allergischen Zuständen, und Erkrankungen, welche mit Darmentzündung in Zusammenhang stehen, einschließlich Zöliakie, Proktitis, eosinophile Gastroenteritis, Mastozytose, Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, besteht.