CN111690061B - 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用 - Google Patents
人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原f1的抗体及应用 Download PDFInfo
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Abstract
人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原F1的抗体及应用，所述抗体的，轻链可变区具有SEQ ID NO:1核苷酸序列和SEQ ID NO:2氨基酸序列，其中轻链超变区序列具有SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5；重链可变区具有SEQ ID NO:6核苷酸序列和SEQ ID NO:7氨基酸序列，重链超变区具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。该抗体能够特异性结合鼠疫耶尔森菌抗原（F1）。
Description
技术领域
本发明涉及抗炭疽单抗的基因、基因编码的多肽、鼠源单抗及人鼠嵌合抗体制备技术，以及所述基因和多肽在制备炭疽治疗、预防性药物中的应用。
背景技术
鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)感染引起的一种烈性传染病，该病发展迅速，若不及时治疗，死亡率极高，历史上曾导致上亿人死亡。人感染鼠疫主要是由于与患病的啮齿类动物接触或者被感染的跳蚤叮咬后，可罹患腺鼠疫，腺鼠疫可发展为鼠疫败血症或继发性肺鼠疫，往往造成人间鼠疫流行。近年来，鼠疫主要在中国、非洲、南美洲和印度的一些地区流行。尽管目前鼠疫的发病率较低，但存在于自然界动物宿主体内的鼠疫耶尔森菌经常引起小范围的鼠疫暴发。因此为了避免大范围的鼠疫暴发，需要全方位、多重的有效手段来控制鼠疫。
目前，人类鼠疫的防治措施主要是疫苗接种和抗生素治疗。疫苗必须在暴露前一定时间内进行接种，一般需要多次接种才能起作用，大量的抗生素可用来治疗鼠疫患者，控制疾病的蔓延，鼠疫耶尔森菌对抗生素的耐药性较低，但目前已经在马达加斯加岛分离到通过转移质粒获得多重耐药性的鼠疫耶尔森菌，并且抗生素有一定的不良反应，不能持续使用。由于疫苗接种和抗生素治疗的缺点和局限性，具有快速、特异等优点的免疫学治疗备受关注。
已有研究表明，针对鼠疫耶尔森菌F1抗原、V抗原的单克隆抗体(单抗)或多克隆抗体能抵抗该菌皮下、鼻内或者气溶胶攻击，如F1鼠源单抗F1-04-A-G1在腺鼠疫和肺鼠疫小鼠模型中具有保护作用。由于鼠疫致死性高、发病少，故新型鼠疫疫苗在研发过程中的有效性需要以“动物法则”的方式证明，通过疫苗免疫的人血清在动物体内抵抗鼠疫耶尔森菌感染的被动保护效果来判断其有效性。抗鼠疫耶尔森菌F1单抗的小鼠被动免疫保护试验，既是抗抵抗鼠疫感染的有效性证明，又是“动物法则”得以运用的依据和方法性证明。
课题组前期以抗鼠疫耶尔森菌F1抗原鼠源单抗4C6被动免疫小鼠后发现，在受到鼠疫强毒菌攻击时，单克隆抗体对小鼠具有免疫保护作用。该结果也提示我们单克隆抗体可以作为一种方便、快速而有效的鼠疫治疗手段，为将来开发单克隆抗体治疗鼠疫提供了有力证据。因此为了更好的应用于临床治疗，开发人源化抗鼠疫耶尔森菌F1抗体极其重要。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原F1的抗体及应用，通过单克隆抗体技术筛选到了对鼠疫抗原F1具有高度亲和力的单克隆抗体，并获取了赋予所述抗体异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并对所述抗体的重链和轻链恒定区进行了人源化改造，最终获得了具有特异的抗原结合性、优异的毒素中和活性以及良好的动物保护功能。
技术方案：一种抗F1的人鼠嵌合单克隆抗体，所述抗体的轻链可变区具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
编码所述人鼠嵌合单克隆抗体的核酸，上述重链可变区具有SEQ ID NO:6所示的DNA序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
编码上述人鼠嵌合单克隆抗体的超变区，所述轻链超变区具有SEQ ID NO:3、SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，重链超变区具有SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
上述单克隆抗体在制备诊断和治疗鼠疫抗体药物中的应用。
有益效果：本发明提供了一种具有高保护性、高特异性、高亲和力抗F1的人鼠嵌合单克隆抗体hmYF202。F1是鼠疫耶尔森菌表达的蛋白，因此本发明的单克隆抗体hmYF202可应用于有关鼠疫的诊断、治疗及预防研究中。
本发明以鼠疫抗原F1为靶分子，制备出鼠源单抗2D2，在YF202的基础上制备出人鼠嵌合抗体hm YF202。对制备的鼠源单抗YF202及人鼠嵌合抗体hm YF202做功能鉴定。免疫学检测显示，该鼠源单抗和人鼠嵌合抗体能够与鼠疫F1抗原特异性结合，体外中和实验结果证实，YF202和hm YF202抗体能够有效的阻断鼠疫耶尔森菌强毒株的致病作用。以BALB/c小鼠为模型，体内试验证实hm YF202抗体保护率达100％。
附图说明
图1为重组F1蛋白的SDS-PAGE检测结果，M，marker；1，2，纯化的F1蛋白。可见蛋白纯度达90％以上；
图2为纯化YF202抗体的SDS-PAGE检测结果，M，marker；1，YF202抗体；可见纯化的抗体纯度很高；
图3为抗F1单克隆抗体YF202的酶联免疫吸附试验检测结果，可见YF202抗体与F1蛋白的结合能力较强；
图4为hm YF202重组表达质粒构建的核酸电泳结果，逆转录PCR扩增YF202重、轻链。M，DL2000；1，YF202重链可变区YF202VH；2，YF202轻链可变区YF202VK；
图5为hm YF202重组表达质粒构建的核酸电泳结果，M，DL10000；1，重组表达hmYF202重链质粒即pFUSE-CHIg-hG1—hm YF202；2，线性化重链模板质粒pFUSE-CHIg-hG1；3，hm F1-4C6重链可变区即hm YF202VH；4，重组表达hm YF202轻链质粒即pFUSE-CLIg-hk-hmYF202K；5，线性化轻链模板质粒pFUSE-CLIg-hk；6，hm YF202轻链可变区即hm YF202VK；
图6为纯化抗体hm YF202的SDS-PAGE检测结果，M，marker；1，hm YF202纯化抗体；2，对照IgG；3，培养上清；4，流穿；5，未转染质粒293F培养上清；
图7为抗F1单克隆抗体hm YF202的酶联免疫吸附试验检测结果。
具体实施方式
实施例1hm YF202抗体的制备
经课题组前期鼠源单抗的检测，我们选择YF202杂交瘤细胞株制备人鼠嵌合抗体hm YF202。
1)抗体可变区基因片段的扩增及验证：
YF202抗体杂交瘤细胞培养至对数生长期，Trizol-氯仿-异丙醇法抽提细胞总RNA；将干燥后的细胞总RNA溶于20μL水中，测定OD260/OD280，值为1.9。取14μL的RNA进行逆转录，以总RNA中的mRNA为模板，以OligodT15为引物，反转录扩增获得单链cDNA。
设计19条VH上游引物和17条Vκ上游引物，4条VH下游引物和3条Vκ下游引物引物：
Vκ5’上游引物：
Vκ-1
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TCC AGC TGA CTC AGC C-3’
Vκ-2
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCW CCC AGT C-3’
Vκ-3
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGM TMA CTC AGT C-3’
Vκ-4
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGY TRACAC AGT C-3’
Vκ-5
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TRA TGA CMC AGT C-3’
Vκ-6
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYATTM AGA TRA MCC AGT C-3’
Vκ-7
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTC AGA TGA YDC AGT C-3’
Vκ-8
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TYC AGA TGA CAC AGA C-3’
Vκ-9
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TTC TCA WCC AGT C-3’
Vκ-10
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG WGC TSA CCC AAT C-3’
Vκ-11
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTS TRA TGA CCC ART C-3’
Vκ-12
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTK TGA TGA CCC ARA C-3’
Vκ-13
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CBC AGK C-3’
Vκ-14
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TAA CYC AGG A-3’
Vκ-15
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CCC AGW T-3’
Vκ-16
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTG TGA TGA CAC AAC C-3’
Vκ-17
5’-GGG CCC AGG CGG CCG AGC TCG AYA TTT TGC TGA CTC AGT C-3’
Vκ3’下游引物
VκR1
5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT KAT TTC CAG YTT GGT CCC-3’
VκR2
5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT TAT TTC CAA CTT TGT CCC-3’
VκR3
5’-AGA TGG TGC AGC CAC AGT TCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3’
VH 5’上游引物
VH 1
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR MAG CTT CAG GAG TC-3’
VH 2
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTB CAG CTB CAG CAG TC-3’
VH 3
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG CTG AAG SAS TC-3’
VH 4
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC-3’
VH 5
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAG CTB CAG CAR TC-3’
VH 6
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTY CAR CTG CAG CAG TC-3’
VH 7
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAC GTG AAG CAG TC-3’
VH 8
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAS STG GTG GAA TC-3’
VH 9
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AWG YTG GTG GAG TC-3’
VH 10
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAG SKG GTG GAG TC-3’
VH 11
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAM CTG GTG GAG TC-3’
VH 12
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC-3’
VH 13
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG CAR CTT GTT GAG TC-3’
VH 14
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTR AAG CTT CTC GAG TC-3’
VH 15
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAR STT GAG GAG TC-3’
VH 16
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTT ACT CTR AAA GWG TST G-3’
VH 17
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTC CAA CTV CAG CAR CC-3’
VH 18
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAC TTG GAA GTG TC-3’
VH 19
5’-GCT GCC CAA CCA GCC ATG GCC CTC GAG GTG AAG GTC ATC GAG TC-3’
VH 3’下游引物
VH R1
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT-3’
VH R2
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT-3’
VH R3
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT-3’
VH R4
5’-CGA TGG GCC CTT GGT GGA GGC TGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT-3’
将Vκ5’上游引物、Vκ3’下游引物、VH 5’上游引物，VH 3’下游引物各溶为终浓度100pmol/μL，然后均以1:1体积比例混匀，分别扩增VH、VL基因，扩增条件为95℃4分钟，95℃30秒，60℃40秒，72℃45秒，30个循环；最后72℃延伸10分钟，电泳回收、纯化扩增的基因片段(见图4)，连至pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α，测序后获得轻链、重链可变区序列，其中VH的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；VL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2)PCR的引物的设计与基因扩增
重链扩增引物：
F：5’-GGTGTCCACTCGCTAGATGTGCAGCTGCAGGAATCGGGACCT-3’
R：5’-GCCCTTGGTGGATGCTGCAGAGACAGTGAC-3’
轻链扩增引物：
F：5’-ACAGACGCTCGCTGCCAAATTGTGCTCACTCAGTCTCCAG-3’
R：5’-TGCAGCCACCGTACGTTTGATTTCCAGTTTGGTC-3’
3)扩增hm YF202抗体重链、轻链
以上述重、轻链可变区连接到pMD18-T载体测序分析正确的为模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增人鼠嵌合抗体重链、轻链基因。
(1)PCR
反应体系：
反应条件：
(2)2％琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。
(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。
4)双酶切IgG表达质粒
IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(购自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重链和轻链(Kappa)恒定区碱基编码序列。
(1)pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk模板载体的双酶切。
反应体系：
反应条件：37℃酶切过夜。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳，紫外下切胶回收。
(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。
5)Infusion PCR重组表达质粒
反应体系：
反应条件：50℃孵育15min。
取5μL反应液转化感受态细菌，铺于相应抗性的平板上，次日挑克隆送测序。将测序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒。
结果成功构建hmYF202的表达质粒。见图6。
6)hm YF202抗体的表达
(1)取250μL pFUSE-CHIg-hG1-hmYF202H(即50μg)于1mL的Opti-MEM培养基中，取250μL pFUSE-CLIg-hk-hmYF202K(即50μg)于1mL的Opti-MEM培养基中，取200μL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培养基中，将上述三种混合液室温静置5min。
(2)然后将两个质粒混合液混合均匀后，补加500μL的Opti-MEM培养基混合均匀后直接加入转染试剂293Fectin的混合液，混合均匀后静置20min。期间处理293F细胞，将293F细胞离心后用293F Expression Medium重悬，然后计数以及用台盘蓝计算细胞活力比，吸取90×106个细胞于培养瓶中，用293F Expression Medium定容为94mL。
(3)20min结束后将6mL的DNA、293Fectin的复合物加入准备好的293F细胞中。
(4)将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件8％CO2，120rmp，37℃，6天后收集细胞上清。
7)hm YF202抗体的纯化
将收集的细胞上清用0.22μm的滤膜过滤，同时将平衡液和洗脱液过滤膜。用AKATA纯化仪按照Protein A纯化的标准步骤纯化，以1mL/min的速度上样，以1.5mL/min的速度洗脱。
结果成功表达并纯化hm YF202抗体。SDS-PAGE见图6。
8)hm YF202纯化抗体酶联免疫吸附实验
用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释F1蛋白至2μg/mL包被ELISA 96孔板，每孔加入100μL，4℃过夜；PBST(PBS含0.5％Tween20)5％脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每个孔中加入100μL YF202(2μg/mL起始浓度，15个浓度梯度稀释)4℃过夜；以1:4000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉公司)100μL/孔加入到孔内，37℃孵育1h；过氧化物酶底物显色液100μL/孔，室温下15分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/690nm。
结果见图7示：该纯化的单克隆抗体hm YF202与F1蛋白有较好的结合活性，且能识别蛋白抗原的构象表位。
序列表
<110> 中国人民解放军东部战区疾病预防控制中心
<120> 人源化抗鼠疫耶尔森菌抗原F1的抗体及应用
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacattgtga tgacccagtc tccaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120
gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagagtattt ctgtcagcaa tataacagct atccgtacac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acg 323
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gln Asn Val Gly Thr Asn
1 5
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ser Ala Ser
1
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 6
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gagtcaggac ctgacctggt gaaaccttct cagtcacttt cactcacctg cactgtcact 60
ggctactcca tcaccagtgg ttatagctgg cactggatcc ggcagtttcc aggaaacaaa 120
ctggaatgga tgggctacat acactacagt ggtagcacta actacaaccc atctctcaaa 180
agtcgaatct ctatcactcg agacacatcc aagaaccagt tcttcctgca gttgaattct 240
gtgactactg aggacacagc cacatattac tgtgcaagaa actatgctat ggactactgg 300
ggtcaaggaa ccctggtcac cgtctcctca 330
<210> 7
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr
1 5 10 15
Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp
20 25 30
Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile His
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser
50 55 60
Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu Gln Leu Asn Ser
65 70 75 80
Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asn Tyr Ala
85 90 95
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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1 5
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<211> 7
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 8
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Ala Arg Asn Tyr Ala Met Asp Tyr
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<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gggcccaggc ggccgagctc gayatccagc tgactcagcc 40
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gggcccaggc ggccgagctc gayattgttc tcwcccagtc 40
<210> 13
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gctgcccaac cagccatggc cctcgaggtg camctggtgg agtc 44
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cgatgggccc ttggtggagg ctgcagagac agtgaccaga gt 42
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cgatgggccc ttggtggagg ctgaggagac ggtgactgag gt 42
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tgcagccacc gtacgtttga tttccagttt ggtc 34
Claims (3)
1.一种抗鼠疫耶尔森菌抗原F1的人鼠嵌合单克隆抗体，其特征在于所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，重链可变区具有SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述人鼠嵌合单克隆抗体的核酸，其特征在于所述重链可变区具有SEQ ID NO:6所示的DNA序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:1所示的DNA序列。
3.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备诊断和治疗鼠疫抗体药物中的应用。
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