DE69635080T2

DE69635080T2 - Radiometall-bindende analoge von lhrh

Info

Publication number: DE69635080T2
Application number: DE69635080T
Authority: DE
Inventors: J. William MCBRIDE; Habibe Karacay; L. Gary GRIFFITHS
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2006-06-08
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: WO1996040756A1; EP0836618A1; DE69635080D1; CA2223432C; ATE302211T1; JPH11513977A; AU712968B2; US5753206A; AU6150196A; EP0836618B1; CA2223432A1; USRE37710E1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Derivate von Luteinisierendes Hormon Releasing Hormon (LHRH), bei denen eine oder mehrere der Aminosäureseitenketten chelatbildende Gruppierungen enthalten, die Radionuklide fest binden können.
Luteinisierendes Hormon Releasing Hormon (LHRH) ist ein Decapeptid mit der Struktur (<G)HWSYGLRPG-NH₂ (SEQ ID NO: 1), bei dem <G Pyroglutaminsäure ist. LHRH kontrolliert die die in der Hypophyse erfolgende Synthese der Gonadotropine Luteinisierendes Hormon (LH) und Follikelstimulierendes Hormon (FSH). LH und FSH kontrollieren die Synthese der Sexualsteroide in den Gonaden. Es ist gezeigt worden, dass Analoga von LHRH, wenn sie an der Position 6, 10 oder an beiden Positionen substituiert werden, eine sowohl stärkere als auch länger andauernde Bioaktivität zeigen als natives LHRH. Es sind über 3000 LHRH-Peptide sowohl in vitro als auch in vivo bewertet worden (siehe z.B. Schally, et al., BASIC ASPECTS; GNRH ANALOGUES IN CANCER AND IN HUMAN REPRODUCTION, Vickery & Lunenfeld, Herausgeber, Band 1, S. 5–31 (Kluwer Academic Publishers, Dordecht, 1989); Schally et al., ADVANCES IN GYNECOLOGY AND OBSTETRICS. GENERAL GYNECOLOGY, Belfort et al., Herausgeber, Band 6, S. 3–20 (Parthenon Publishers, Carnforth, UK, 1989); Vickery et al., Endocrine Rev. 7: 115 (1986); Dutta et al., Drugs of the Future. 13: 761 (1988)). Mehrere dieser Analoga sind klinisch verwendet worden, einschließlich: [D-Leu⁶, NH-Et¹⁰]-LHRH (Vilchez-Martinez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 59: 1226 (1974); [D-Trp⁶]-LHRH (Coy et al., J. Med. Chem. 19: 423 (1976); [D-Ser(tBu)⁶, NH-Et¹⁰]-LHRH (Koenig et al., In: PROCEEDINGS OF THE FOURTH AMERICAN PEPTIDE SYMPOSIUM, Walter und Meienhofer, Herausgeber, 883–888 (1975)); [D-Ser(tBu)⁶, NH-NH-CO-NH₂ ¹⁰]-LHRH (Dutta et al., J. Med. Chem. 21: 1018 (1978); [D-Nal(2)⁶]-LHRH (Nestor et al., J. Med. Chem. 25: 795 (1982)).
Zusätzlich können Veränderungen an den Positionen 1, 2, 3, 6 und gegebenenfalls an den Positionen 5 und 10 des LHRH-Moleküls zu wirkungsvollen Antagonisten führen (siehe Karten M. J. et al., Endocrine Review 7: 44 (1986) und Bajusz, S. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 32: 425 (1988). Diese Antagonisten inhibieren die Freisetzung von LH und FSH aus der Hypophyse und haben als solche ein Potential als klinische Mittel in der Abbildung, Diagnose und Behandlung von Hormonabhängigen Krebsarten, wie etwa Prostata-, Brust-, Eierstock-, Endometrium- und Pankreaskrebs.
Der Mechanismus der LHRH-Analogonwirkung steht zumindest teilweise mit der Tatsache in Zusammenhang, dass die Dichte der LHRH-Rezeptoren von humanen Tumoren wesentlich größer sein kann als die LHRH-Rezeptordichte normaler Zellen. Weiterhin besitzen die LHRH-Rezeptoren von Tumorzellen eine hohe Affinität für LHRH-Peptide. Beispielsweise besitzen 80% der epithelialen Eierstocktumoren heraufregulierte LHRH-Rezeptordichten, und die Rezeptoren besitzen außerdem hohe Affinitäten für die LHRH-Peptide (siehe Emons et al., Cancer Res. 53: 5439 (1993); Irmer et al., Cancer Res. 55: 817 (1955)). Dem entsprechend ist für LHRH-Rezeptoren auch gezeigt worden, dass sie in Brustkrebstumoren heraufreguliert werden (Fekete et al., J. Clin. Lab. Anal. 3: 137 (1989), Fekete et al., J. Clin. Lab. Anal., 3: 137 (1989)), ebenso in endometrialem Krebs (Srkalovic et al., Cancer Res. 50: 1841 (1990)), Prostatatumoren (Srkalovic et al., Endocrinol. 127: 3052 (1990)) und Pankreaskrebs (Schally et al., J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 37: 1061 (1990)).
Es ist gezeigt worden, dass Analoga von LHRH selektiv an hormon-empfindliche Tumore binden werden, die durch eine Überexpression von Hormonrezeptoren auf der Zelloberfläche charakterisiert sind. Wenn auf LHRH reagierende Tumore mit LHRH-Peptidanaloga behandelt werden, binden die Analoga an die Rezeptoren auf der Zelloberfläche und werden dann internalisiert (siehe Jackson et al., Cancer Treat. Rev. 16: 161 (1989)). Es sind einige Studien durchgeführt worden, bei denen LHRH-Antagonisten und Antagonisten-Derivate, die an das zielsteuernde LHRH-Peptid angeheftete zytotoxische Gruppierungen enthalten, dazu verwendet wurden, um das Zytotoxin in die Zelle zu befördern. LHRH-Analoga, die mit spezifischen zytotoxischen Gruppierungen modifiziert sind, können daher als Träger für chemotherapeutische Mittel nützlich sein (siehe z.B. EP 0 450 461 A2 und EP 0 364 819 A2 ). Es ist weiterhin gezeigt worden, dass im Fall lipophiler Analoga verschiedene Substituenten an die Seitenkette der Aminosäure an Position 6 von LHRH angeheftet werden können, während diese nach wie vor ihre Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo beibehalten (Janaky, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 972 (1992)). Zytotoxische Metallkomplexe, die Platin, Nickel und Kupfer angeheftet an die Seitenkette des Lysins an Position 6 enthalten, haben eine hohe in vitro-Aktivität bei humanen Brustkrebszellen gezeigt (siehe Bajusz, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6313 (1989)).
Einige Peptide besitzen selbst Reste oder sind der Einführung von Resten zugänglich, die eine direkte Bindung von Radiometallen an das Peptid erlauben. Beispielsweise enthält Somatostatin eine Disulfidbrücke, die bei Reduktion zwei Sulfhydryl-enthaltende Cystein-Seitenketten bereitstellt, die ^99mTc direkt binden können (siehe US-Patent Nr. 5,225,180, siehe außerdem WO 94/28942, WO 93/21962 und WO 94/23758). Komplexe dieses Typs neigen jedoch dazu, heterogen und instabil zu sein, darüber hinaus begrenzt die Verwendung freier Sulfhydryle in dieser Weise die Radiometalle, die verwendet werden können, um das Peptid zu markieren, auf diejenigen, die freie SH-Gruppen fest binden. Dieses Verfahren leidet auch unter dem Problem, dass die direkte Bindung des Metalls an eine Aminosäureseitenkette die Peptidkonformation stark beeinflussen kann, wodurch die Rezeptorbindungseigenschaften der Verbindung nachteilig verändert werden können.
Alternativ können chelatbildende Mittel mittels positionsspezifischer Reaktionen, die bestimmte Aminosäurereste einbeziehen, in Peptidseitenketten eingeführt werden. Beispielsweise ist der Lysinrest an Position 6 von LHRH direkt mit einer chelatbildenden Gruppe acyliert worden (Bajusz et al., siehe oben). Diesem Verfahren sind inhärent Grenzen gesetzt durch den Mangel an erreichbarer Selektivität, wenn mehr als eine Seitenkette potentiell mit dem Chelatbildner reagieren kann, oder wenn die Peptidsequenz keine Aminosäure enthält, die auf diese Weise derivatisiert werden kann.
Die meisten Peptide enthalten entweder kein Metall-bindendes Sequenzmotiv oder sind aus verschiedenen Gründen, wie den oben beschriebenen, keinen geeigneten Sequenzmodifikationen zugänglich, die die Einführung eines solchen Motivs erlauben würden. Es müssen daher einige Mittel in das Peptid eingeführt werden, um das Peptid zur Bindung von Radiometallen zu befähigen. Ein bevorzugter Ansatz ist die Anheftung eines Metall-bindenden Liganden an das Peptid, sodass ein einziger, stabiler Komplex ausgebildet wird. Die Liganden, die verwendet werden, um Metalle zu binden, enthalten oft eine Vielzahl von Heteroatomen, wie etwa Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Sauerstoff, die eine hohe Affinität für Metalle besitzen.
Diese Liganden werden typischerweise an den N-Terminus des gewünschten Peptids angeheftet. Dies erlaubt es, die Peptidkette unter Verwendung konventioneller Verfahren der Peptidsynthese zu konstruieren, gefolgt von der Anheftung des Liganden nach Abschluss der Peptidsynthese. Beispielsweise haben Maina et al. die Anheftung eines Tetra-Amin-Chelatbildners an den N-Terminus eines Somatostatin-Analogons beschrieben, was dann die ^99mTc-Markierung des Peptids erlaubte (siehe J. Nucl. Biol. Med. 38: 452 (1994)). Wiederum jedoch ist die Anwendung dieses Verfahrens auf die Fälle beschränkt, bei denen der N-Terminus des Peptids die Anwesenheit eines (gewöhnlich ausladenden) Chelatbildners ermöglichen kann, ohne dass es zu einer nachteiligen Beeinflussung der Bindungseigenschaften des Peptids kommt.
Bajusz et al., oben, beschreiben auch den Einbau eines geschützten, Chelat-derivatisierten Lysinrests in eine wachsende Peptidkette während der Peptidsynthese. Dieses Verfahren erfordert jedoch die Herstellung eines geeignet derivatisierten Lysin-Derivats, das auch eine α-Aminoschutzgruppe trägt, die mit der Peptidsynthese kompatibel ist. Es wäre eindeutig zu bevorzugen, in der Lage zu sein, geschützte Aminosäurederivate, die zur Verwendung bei der Peptidsynthese kommerziell erhältlich sind, verwenden zu können, und nachfolgend geeignete Aminosäureseitenketten in selektiver Weise zu entschützen und zu derivatisieren.
Die WO 91/01144 beschreibt ein LHRH-Peptid, bei dem eine chelatbildende Gruppe entweder an eine Seitenketten-Aminogruppe des Peptids, z.B. an die Aminogruppe eines Lysins und/oder an die terminale N-Aminogruppe des Peptids angeheftet werden kann.
Die EP-A-0364819 lehrt, dass ein Lysinrest, der an der Position 6 von LHRH eingeführt wird, mit einer chelatbildenden Gruppe Q komplexiert werden kann.
Die WO 95/04540 beschreibt die Modifikation der sechsten Position von LHRH durch die Einführung eines Aminoacylrests oder Peptids.
Es ist daher erkennbar, dass ein Mittel zur Anheftung einer chelatbildenden Gruppierung an eine beliebige vorab festgelegte Position innerhalb eines Peptids außerordentlich erstrebenswert wäre. Es wäre außerdem erstrebenswert, Zugang zu einem Verfahren zu haben, dass es erlauben wird, diese chelatbildende Gruppierung bei jedem gewünschten Stadium während der Peptidsynthese an das Peptid zu koppeln.
Zusammenfassung der Erfindung
Wir beschreiben Analoga von LHRH, die Radionuklide binden können, wobei sie die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den LHRH-Rezeptor beibehalten. Wir beschreiben außerdem Verfahren zur Herstellung und Radiomarkierung von Analoga von LHRH, die Radionuklide binden können und dabei die Fähigkeit zur spezifischen Bindung an den LHRH-Rezeptor beibehalten. Wir beschreiben außerdem diagnostische und therapeutische Verfahren zur Verwendung der radiomarkierten Analoga von LHRH zur Abbildung oder Behandlung eines Tumors, einer infektiösen Läsion, eines Myokardinfarkts, eines Gerinnsels, eines Arterioskleroseherds, oder eines normalen Organs oder Gewebes.
Peptide:
Dies wird, unter anderem, erreicht durch die Bereitstellung eines Peptids, welches die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfasst,
worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist,
X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist,
X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist,
X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist,
X⁶ Leucin oder Tryptophan ist,
X⁷ Arginin oder Lysin ist,
X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist, und worin X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist,
R² H ist, W 1–20 Atome lang ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit mindestens einem Heteroatom substituierten Kette,
Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist, oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist,
A und D gleich oder verschieden sind und jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP²,
R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils H sind, und R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe enthält.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist X⁵ aus der Gruppe ausgewählt, bestehend aus:
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist X¹ Pyroglutaminsäure, X² Histidin und X⁸ Glycinamid. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen ist X³ Tyrosin, X⁴ Leucin, X⁶ Tryptophan und X⁷ Lysin. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist X⁵
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist X³ Tryptophan, X⁴ Tyrosin, X⁶ Leucin, X⁷ Arginin und X⁵ ist
In Übereinstimmung mit weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Peptide bereitgestellt, bei denen X¹ D-Acetylnaphthylalanin ist, X² D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D-Tryptophan ist, X⁴ Arginin ist, X⁶ Leucin ist, X⁷ Arginin ist und X⁸-NH₂ D-Alaninamid ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist X⁵
In Übereinstimmung mit einer wiederum anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Peptide bereitgestellt, bei denen X¹ D-Acetylnaphthylalanin ist, X² D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D-Tryptophan ist, X⁴ Arginin ist, X⁶ Tryptophan ist, X⁷ Lysin ist und X⁸-NH₂ Glycinamid ist.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um eine metallchelatbildende Zusammensetzung herzustellen, welches das Inkontaktbringen einer Lösung eines Peptids mit Zinnionen umfasst, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfasst,
worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist,
X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist,
X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist,
X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist,
X⁶ Leucin oder Tryptophan ist,
X⁷ Arginin oder Lysin ist,
X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist,
X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist,
R² H ist, W 1–20 Atome lang ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit mindestens einem Heteroatom substituierten Kette,
Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist, oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist,
A und D gleich oder verschieden sind und jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP²,
R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils H sind, und
R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe enthält, und anschließend Inkontaktbringen dieser Lösung mit ^99mPertechnetat, ¹⁸⁶Perrhenat oder ¹⁸⁸Perrhenat und Zurückgewinnen des radioaktiv markierten Peptids.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Radionuklid unter ¹⁸⁸Re- oder ¹⁸⁶Re-Perrhenat und ⁹⁹Tc-Pertechnetat ausgewählt.
In Übereinstimmung mit einer wiederum anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Peptide bereitgestellt, die spezifisch an Zellen oder Gewebe binden, die LHRH-Rezeptoren exprimieren.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids bereitgestellt, das hergestellt wird durch Inkontaktbringen einer Lösung eines Peptids mit Zinnionen, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfasst,
worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist,
X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist,
X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist,
X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist,
X⁶ Leucin oder Tryptophan ist,
X⁷ Arginin oder Lysin ist, und
X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist,
X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist; R² H ist; W 1–20 Atome lang ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit zumindest einem Heteroatom substituierten Kette;
Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist, oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist;
A und D gleich oder verschieden sind und jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP²,
R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils H sind, und
R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe umfasst;
und dann Inkontaktbringen der Lösung mit ^99mPertechnetat, ¹⁸⁶Perrhenat oder ¹⁸⁸Perrhenat, und Zurückgewinnen des radioaktiv markierten Peptids
bei der Herstellung einer Zusammensetzung für das Abbilden von Gewebe, welches die Verabreichung eines radioaktiv markierten Peptids, welches spezifisch an Zellen oder Gewebe bindet, die LHRH-Rezeptoren exprimieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger an einen humanen Patienten umfasst, und, nach einer für das Lokalisieren des radioaktiv markierten Peptids und das Klären des nicht zum Zielgewebe gehörenden Hintergrunds ausreichenden Zeit, Detektieren der Anlagerungsstelle oder -stellen des radioaktiv markierten Peptids mit einer externen Abbildungskamera.
Vorzugsweise umfasst das Gewebe einen Tumor, eine infektiöse Läsion, einen Myokardinfarkt, ein Gerinnsel, einen Arterioskleroseherd oder ein normales Organ oder Gewebe.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids bereitgestellt, das hergestellt wird durch Inkontaktbringen einer Lösung eines Peptids mit Zinnionen, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfasst,
worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist,
X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist,
X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist,
X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist,
X⁶ Leucin oder Tryptophan ist,
X⁷ Arginin oder Lysin ist, und
X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist,
X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist; R² H ist; W 1–20 Atome lang ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit mindestens einem Heteroatom substituierten Kette;
Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist, oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist;
A und D gleich oder verschieden sind und jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP²,
R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils H sind, und
R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe umfasst;
und dann Inkontaktbringen der Lösung mit ^99mPertechnetat, ¹⁸⁶Perrhenat oder ¹⁸⁸Perrhenat, und Zurückgewinnen des radioaktiv markierten Peptids
bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
Bei einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, welches das Koppeln von Aminosäuren und Aminosäureanaloga durch Festphasenpeptidsynthese umfasst.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche eine wirksame Menge eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
In Übereinstimmung mit einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, welche eine wirksame Menge einer metallchelatbildenden Zusammensetzung, hergestellt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Detaillierte Beschreibung
Wir beschreiben Analoga von Luteinisierendes Hormon Releasing Hormon (LHRH), die zur Bindung von Radionukliden befähigt sind. Die Herstellung dieser Analoga erfolgt durch positionsspezifisches Einführen Radionuklid-chelierender Aminosäurederivate in Peptide, die durch Festphasen- oder Flüssigphasenverfahren synthetisiert werden.
Die Synthese der Analoga beinhaltet die Verwendung unterschiedlich geschützter Bis-aminosäurederivate, bei denen eine der Aminofunktionen selektiv entschützt werden kann. Diese Derivate werden bei der Peptidsynthese durch konventionelle Peptid-Kopplungsmethodik in eine wachsende Peptidkette eingeführt. Eine der Aminofunktionen wird dann selektiv entschützt, was die nachfolgende Ankopplung entweder eines chelatbildenden Moleküls oder die Anfügung eines weiteren Aminosäurerestes zur Fortsetzung der Peptidsynthese erlaubt.
Wenn die Peptidsynthese fortgesetzt wird, kann die selektive Entschützung der zweiten Aminogruppe der Bis-aminosäure an einem beliebigen Punkt während der Peptidsynthese verwirklicht werden, um die chelatbildende Gruppierung einzuführen. Sobald die Peptidsynthese abgeschlossen ist, erbringen Spaltung, Entschützung und Reinigung das Peptidderivat. Dieses Derivat wird dann mit einem Radiometall markiert, um es in radiodiagnostischen und radiotherapeutischen Anwendungen zu verwenden.
Wenn das chelatbildende Molekül zuerst an die entschützte Aminogruppe gekoppelt wird, so besteht der zweite Schritt alternativ darin, die andere Aminogruppe zu entschützen und mit der Peptidsynthese fortzufahren. Schließlich erbringen Spaltungs-, Entschützungs- und Reinigungsschritte das reine Peptidderivat, das dann wie zuvor radioaktiv markiert wird.
Die Radiometall chelierenden Peptide der vorliegenden Erfindung sind im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten und -Geweben stabil. Sowohl die Reagenzien als auch die Bedingungen des vorliegenden Verfahrens sind gegenüber denen im Stand der Technik stark vereinfacht, und die markierten Peptide sind besonders geeignet für radiodiagnostische und radiotherapeutische Anwendungen unter Verwendung von Technetium- oder Rhenium-Markierung.
Der oben dargestellte Ansatz erlaubt die Platzierung einer Radiometall bindenden Aminosäure an beliebiger Stelle in der LHRH-Peptidsequenz. Das Anbringen der chelatbildenden Gruppierung an einer Aminosäureseitenkette anstatt am N-Terminus eines Peptids hat den zusätzlichen Vorteil, den Metallkomplex räumlich von dem Peptidrückgrat zu trennen und dadurch die Auswirkung des Metallkomplexes auf die Peptidkonformation zu minimieren.
Es ist bekannt, dass die Peptidkonformation stark durch Ladung und hydrophile/hydrophobe Wechselwirkungen beeinflusst wird, und es ist daher wichtig, diese Variablen zu berücksichtigen, wenn ein chelatbildender Ligand, der in Peptiden verwendet werden soll, entworfen wird. Es ist bevorzugt, dass eine Vielzahl chelatbildender Komplexe variierender Ladung und Hydrophilität hergestellt und getestet wird, um das metallkomplexierte LHRH-Peptid, das die optimale Kombination von Zielselektivität und Chelatstabilität zeigt, auszuwählen.
Die radiomarkierten LHRH-Peptide der vorliegenden Erfindung binden spezifisch an eine erkrankte Zelle oder ein Gewebe, die/das sowohl eine hohe LHRH-Rezeptordichte als auch eine hohe Affinität für LHRH zeigt. Die Radioaktivität des Radionuklids erlaubt die Diagnose und/oder Behandlung des Tumors oder des erkrankten Gewebes. Die Erfindung schließt auch pharmazeutische Zusammensetzungen ein, die eine wirksame Menge wenigstens eines der radioaktiv markierten Peptide der Erfindung in Kombination mit einem pharmazeutisch geeigneten, sterilen Hilfs- oder Trägerstoff (siehe Beschreibung z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences; Drug Receptors and Receptor Theory, 18. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)) umfassen. Die Erfindung beinhaltet auch Kits zur Markierung von Peptiden, die praktisch und in einem klinischen Umfeld leicht anwendbar sind.
Design und Synthese von Peptiden, die chelatbildende Aminosäurederivate einbeziehen
Wir beschreiben Peptide, die Radiometall-chelierende Aminosäurederivate enthalten, die durch die Anwesenheit wenigstens einer Thiol- oder Thiocarbonylgruppe gekennzeichnet sind, und die wenigstens einen Stickstoff aufweisen, der entweder als tertiäres Amin oder als sekundäres Amid vorliegt. Die Schwefel- und Stickstoffatome sind geeigneter Weise so angeordnet, dass sie einen mehrzähnigen Liganden ausbilden, der befähigt ist, fest und in bevorzugter Weise an reduzierte Radionuklide zu binden. Diese Aminosäurederivate werden in Peptide eingebaut, die fest an den LHRH-Rezeptor binden. Diese Peptide können allgemein durch die Formel (SEQ ID NO: 2) dargestellt werden: X¹-X²-X³-S-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-P-X⁸-NH₂ worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist,
X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist,
X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist,
X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist,
X⁵ eine Radiometall-chelierende Aminosäure gemäß unten stehender Beschreibung ist;
X⁶ Leucin oder Tryptophan ist,
X⁷ Arginin oder Lysin ist,
X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist.
Die Radiometall-chelierenden Aminosäurederivate können durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül, ein niedermolekulares Alkyl, ein substituiertes niedermolekulares Alkyl, oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist,
R² H, niedermolekulares Alkyl oder substituiertes niedermolekulares Alkyl ist, W 1–20 Atome lang ist und ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Cycloalkyl, Aryl oder Alkaryl, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit mindestens einem Heteroatom substituierten Kette,
Z ein Peptid mit 1–5 Resten ist, oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist,
A und D gleich oder verschieden sind und jeweils ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, CH₂CH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP²,
R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils H, niedermolekulares Alkyl oder substituiertes niedermolekulares Alkyl sind, und
R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, niedermolekulares Alkyl oder substituiertes niedermtolekulares Alkyl, Aryl oder substituiertes Aryl sind.
Wir beschreiben außerdem Radiometall-chelierende Aminosäurederivate, die dargestellt sind als:
Jede der chelatbildenden Aminosäuren kann durch Verfahren hergestellt werden, die dem begabten Praktiker auf dem Gebiet der organischen Synthese wohlbekannt sind. Detaillierte Protokolle für die Synthese repräsentativer Chelate sind in den unten zu findenden Beispielen angegeben.
Die chelatbildenden Aminosäuren werden aus Untereinheiten konstruiert, die durch einfache Kopplungs- oder Kondensationsreaktionen verbunden werden, wie etwa durch die Kondensation einer Amino-, Hydrazino- oder Hydrazido-Funktion mit einer aktivierten Carboxylgruppe oder die reduktiven Aminierungsreaktionen zwischen Aminen und Aldehyden. Wie hier verwendet, ist der Begriff „Kondensation" dazu gedacht, um Reaktionen zu umfassen, die die Untereinheiten der chelatbildenden Gruppierung zusammenfügen, und umfasst damit Reaktionen wie reduktive Aminierung zusätzlich zu Reaktionen, die der klassischen Definition einer Kondensationsreaktion entsprechen.
Nach einer Kondensationsreaktion können zusätrliche funktionelle Gruppen an der Untereinheit entschützt werden, um zusätrliche Kondensationsreaktionen zu erlauben. Beispielsweise kann eine zweite Untereinheit, die eine freie Carboxylgruppe und eine geschützte Aminofunktion trägt, mit einer Amino-, Hydrazino- oder Hydrazido-Funktion an einer ersten Untereinheit kondensiert werden. Die Aminofunktion an der Gruppierung der zweiten Untereinheit kann dann entschützt und weiter an eine dritte Untereinheit gekoppelt werden.
Verfahren zur Aktivierung von Carboxylgruppen für solche Kondensationsreaktionen sind Fachleuten auf dem Gebiet der organischen Synthese und Peptidsynthese wohlbekannt und beinhalten die Verwendung von aktiven Estern und Carbodiimid-Kopplungsmitteln. Für den Schutz von Funktionen an den Untereinheiten werden geeignete Schutzgruppen verwendet, wenn die Reaktivität der Funktionen mit einer Reaktion unvereinbar ist, die zum Anfügen der Untereinheiten verwendet wird. Schutzgruppen, sowohl für Amino- als auch für Carbonsäurefunktionen, sind in der Technik wohlbekannt (siehe z.B. Greene, oben). Die Untereinheiten, die verwendet werden, um das Chelat zu konstruieren, werden entweder durch in der Technik wohlbekannte Verfahren problemlos hergestellt oder sind von Anbietern, wie etwa Advanced ChemTech (Lexington, KY), Milligan (Burlington, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) oder Aldrich Chemical Corp. (Milwaukee, WI), kommerziell erhältlich.
Die Kondensationsreaktionen, die verwendet werden, um die Untereinheiten zusammenzufügen, können entweder vor der Peptidsynthese oder während des Prozesses der Peptidsynthese durchgeführt werden. Wenn das Aminosäurederivat vor der Peptidsynthese aus seinen Untereinheiten zusammengesetzt wird, müssen die α-Amino- und α-Carboxylfunktionen geeignet in einer Weise geschützt werden, die nachfolgend mit der selektiven Entschützung und Aktivierung dieser Funktionalitäten bei der Peptidsynthese kompatibel ist. Beispiele solcher Schutzgruppen sind in der Technik wohlbekannt und beinhalten die Gruppen Fluorenmethyloxycarbonyl (Fmoc), Benzyloxycarbonyl (Cbz), ^tButoxycarbonyl (Boc) und Allyloxycarbonyl (Alloc) für den Schutz von Amino. Gruppen für den Schutz von Carboxyl beinhalten die Methyl-(Me), Benzyl-(Bn), ^tButyl-(^tBu) bzw. Allylester. Die Amino- und Carboxylschutzgruppen müssen so ausgewählt werden, dass jede Gruppe in Gegenwart der anderen selektiv entschützt werden kann. Dies schließt z.B. die Verwendung der Cbz-Gruppe für den Schutz der Aminofunktion in Gegenwart einer als Benzylester geschützten Carboxylgruppe aus (siehe Green, oben). Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die α-Aminogruppe als Fmoc-Gruppe geschützt, und die α-Carboxylgruppe ist ein Methylester. Die Thiolschutzgruppe, die in den Verbindungen der Erfindung verwendet wird, kann jedwede organische oder anorganische Gruppe sein, die unter milden Bedingungen leicht entfernbar ist, um das freie Sulfhydryl in Gegenwart des Proteins zu regenerieren, ohne die Aktivität des Proteins wesentlich zu verändern. Geeignete Schutzgruppen sind in Green, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley Interscience, NY, 1981) S. 193–217, aufgelistet. Beispiele für geeignete Schutzgruppen beinhalten Tritylgruppen, Thiolester, Thiocarbamate und Disulfide. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Thiolschutzgruppe eine Tritylgruppe. Fachleute sind vertraut mit den Prozeduren des Schützens und Entschützens von Thiolgruppen. Beispielsweise können Benzoat-Thioester mittels Hydroxylamin unter milden und selektiven Bedingungen entschützt werden.
Sobald der Zusammenbau der geschützten chelatbildenden Gruppierung abgeschlossen ist, wird die α-Carboxyfunktion entschützt und unter Verwendung konventioneller Verfahren der Peptidsynthese an den Amino-Terminus der Peptidkette gekoppelt (siehe Bodanszky etal., THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS (Springer Verlag, Heidelberg, 1984)).
Wenn das Aminosäurederivat bei der Peptidsynthese aus seinen Untereinheiten zusammengesetzt wird, so wird die Peptidkette durch konventionelle Festphasensynthese zusammengesetzt, bis der Punkt erreicht ist, an dem das Derivat einzubauen ist. Die differentiell geschützte Bis-Aminosäure wird dann an den Amino-Terminus der Peptidkette gekoppelt, gefolgt von einer selektiven Entschützung einer der Aminogruppen des Derivats.
Wenn die α-Aminofunktion zuerst entschützt wird, so werden dann alle oder ein Teil der verbleibenden Aminosäurereste in der konventionellen Weise an die Peptidkette gekoppelt. Die Seitenketten-Aminofunktion des Derivats wird dann entschützt und die chelatbildende Gruppierung wird gemäß obiger Beschreibung eingebaut. Das vollständige Peptid kann dann entschützt und mittels Standardverfahren gereinigt werden.
Wenn die Seitenketten-Aminofunktion zuerst entschützt wird, so wird die chelatbildende Gruppierung dann gemäß obiger Beschreibung eingebaut, gefolgt von der Entschützung der α-Aminogruppe. Die Peptidsynthese wird dann in der konventionellen Weise gemäß obiger Beschreibung vervollständigt.
Sobald die Peptidsynthese abgeschlossen ist, wird das vollständig geschützte Peptid entschützt und gereinigt. Verfahren zur Entschützung und Reinigung synthetischer Peptide sind in der Technik wohlbekannt (siehe z.B. Bodanszky, oben). Wenn das Peptid mittels Festphasentechnik synthetisiert wurde, muss das Peptid auch von dem Harz abgespalten werden, das als fester Träger für die Synthese verwendet wurde. Verfahren zum Erreichen dieser Abspaltung sind in der Technik ebenfalls wohlbekannt. Verfahren zur Reinigung synthetischer Peptide, wie solchen der vorliegenden Erfindung, sind Fachleuten ebenfalls wohlbekannt. Solche Verfahren beinhalten z.B. Ionenaustausch, Gelfiltrations-Chromatographie und Reversphasen-Hochdruckflüssig-Chromatographie (RP-HPLC). Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Peptid durch RP-HPLC unter Verwendung einer Octadecylsilan (C18)-Fused silica Kapillarsäulenpackung im präparativen Maßstab unter Elution mit einem Gradienten aus Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gereinigt. Die Reinheit des Peptids kann durch Standardverfahren, wie etwa analytische RP-HPLC oder Kapillarelektrophorese bestätigt werden. Die Identität des Peptids kann mittels NMR-Spektroskopie oder, bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, durch Massenspektrometrie bestätigt werden.
Chelieren von Radiometallen durch Peptide, die Metall-chelierende Aminosäurederivate einbeziehen
Sobald ein Peptid, das ein Metall-chelierendes Aminosäurederivat eingebaut hat, synthetisiert und gereinigt wurde, kann es für die spätere Verwendung gelagert werden, oder es kann mit Radionukliden umgesetzt werden, um unmittelbar in Verfahren der Radioimmuntherapie oder Radioimmundiagnostik verwendet zu werden. Wenn das Peptid für die spätere Verwendung zu lagern ist, so werden die freien Thiolgruppen vorzugsweise gegen Oxidation geschützt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann dies erreicht werden, indem man das Peptid unter einer inerten Atmosphäre lagert; alternativ kann das Peptid in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie etwa β-Mercaptoethanol, gelagert werden. Die Lagerung des Peptids in einer Form, die freie Sulfhydrylgruppen trägt, kann auch erreicht werden, indem man das Konjugat mit demjenigen Mittel mischt, das für die Reduktion des Radionuklids verwendet werden soll. Beispielsweise kann das zugegebene Reduktionsmittel ein Zinn(II)-Salz sein. Das Salz kann, wie erforderlich, aus Zinnmetall erzeugt werden, z.B. aus Folien, Granulaten, Pulvern, Drehschrauben, und dergleichen, durch das Inkontaktbringen mit wässriger Säure, z.B. HCl. Es wird für gewöhnlich in Form von SnCl₂ zu dem Peptid hinzugegeben, vorteilhafterweise in einer Lösung, die etwa 0,1 mM an HCl enthält. Das resultierende Gemisch kann als gefrorene Lösung gelagert werden, oder es wird bevorzugt als lyophilisiertes Pulver gelagert. Die Lagerung des Konjugats in Gegenwart eines Reduktionsmittels in dieser Form ist vorteilhaft, da diese nicht nur eine erneute Oxidation der Thiolfunktionen verhindert, sondern auch, wie unten diskutiert, ohne das Erfordernis eines zusätzlichen Schritts zur Reduktion des Radionuklids auskommt. Die Zusammenführung des Peptid- oder Peptid/Reduktionsmittelgemischs kann in einem einzelnen Gefäß oder Kit zur Verwendung bei der Durchführung des Radiomarkierungsverfahrens der vorliegenden Erfindung erfolgen. Es kann dann ein Radionuklid zu dem Kit hinzu gegeben werden, wie es benötigt wird, um ein radioaktiv markiertes Peptid bereitzustellen. Die Einzelgefäße oder Kits der vorliegenden Erfindung sind so gestaltet, dass sie das passende Peptid für das jeweilige diagnostische oder therapeutische Verfahren enthalten.
In Übereinstimmung mit dem vorliegenden Verfahren sind die Gefäße oder Kits vorteilhafterweise verschlossen und mit einem Mechanismus versehen, um Reagenzien unter sterilen oder halbsterilen Bedingungen zuzuführen oder zu entnehmen. Bevorzugt wird bei dem vorliegenden Verfahren ein Gefäß verwendet, das einen Port zur Spritzeninjektion enthält. Die Reagenzien in den Gefäßen oder Kits werden typischerweise in wässriger, gefrorener oder lyophilisierter Form bereitgestellt. Die Reagenzien können bei niedriger Temperatur, z.B. im Kühlschrank, für mehrere Tage bis mehrere Wochen gelagert werden, bevorzugt bei einem pH von etwa 3,5–5,5, bevorzugter bei pH 4,5–5,5, vorteilhafterweise unter einer inerten Gasatmosphäre, z.B. Stickstoff oder Argon.
Die Reagenzien können zur Erleichterung der Lagerung und Stabilisierung auch in lyophilisierter Form bereitgestellt werden. Dies erfolgt vorteilhafter Weise bei einem pH von etwa 5,5, ausgehend von einer Lösung mit flüchtigem Puffer, z.B. Ammoniumacetat, und vorzugsweise auch in Gegenwart eines Stabilisators, um Aggregation zu verhindern, z.B. einem Zucker, wie etwa Trehalose oder Sucrose. Derartige Bedingungen der Lyophilisierung sind konventionell und dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt.
Das Markierungsverfahren kann einfach dadurch erfolgen, dass man das Radioisotop direkt vom Erzeuger, z.B. in Form von wässrigem Natrium-Pertechnetat, zu dem Peptid oder dem Gemisch aus Reduktionsmittel und chelatbildendem Peptid hinzu gibt. Die Bestandteile in dem Gefäß werden dann gemischt und für diejenige Zeit inkubiert, die ausreichend ist, um die Markierung des Peptids zu bewirken. Die Dauer und die Bedingungen der Inkubation sind nicht maßgeblich, jedoch wird die Inkubation typischerweise für eine Zeitspanne ausgeführt, die hinreichend ist, um eine nahezu 100%ige Bindung des Radioisotops an das Protein zu erreichen. Wie oben angegeben, erfordern verschiedene Radionuklide mehr oder weniger ausgedehnte reduzierende Bedingungen, und somit wird die Dauer der Inkubation auch von der Identität des verwendeten Radionuklids abhängen. „Nahezu 100%ige Bindung" bezeichnet einen über 98%igen Einbau des Radionuklids, vorzugsweise über 99%ig, und, noch bevorzugter, einen 100%igen Einbau. Für gewöhnlich wird die Inkubation für eine Zeitspanne von etwa 0,1 bis etwa 60 Minuten durchgeführt, jedoch wird sie bei einer bevorzugten Ausführungsform für etwa 1 bis etwa 5 Minuten durchgeführt. Das radioaktiv markierte Peptid kann dann aus dem Gefäß entnommen und sofort verwendet werden, da eine weitere Abtrennung oder Reinigung nicht erforderlich ist.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Markierung des Peptid-Chelats durch Mischen des Peptids mit einem Radiometall-Glucoheptonat-Komplex, um eine Umkomplexierung von dem Glucoheptonat auf das Peptid zu bewirken. Dieses Verfahren ist besonders bevorzugt, wenn das Radiometall Technetium-99 ist. Dieses Verfahren wird für gewöhnlich unter Verwendung eines Glucoscan-Kits (E. I. DuPont de Nemours, Inc., Boston, MA) durchgeführt. Die Markierung erfolgt bevorzugt bei Raumtemperatur in Salinelösung. Wenn das Peptid nicht sehr gut in der Saline löslich ist, so kann ein Lösungsvermittler, wie etwa Ethanol oder 2-Hydroxypropyl-b-cyclodextrin, zugegeben werden. Die Markierung kann auch bei erhöhten Temperaturen, wie etwa 50–100°C durchgeführt werden, um die Geschwindigkeit der Markierungsreaktion zu erhöhen. Protokolle zur Markierung von Peptiden der Erfindung mit Technetium und Rhenium sind in den unten stehenden Beispielen 9 und 10 weitergehend beschrieben.
Pertechnetat zur Markierung von Peptiden mit ^99mTc wird generell aus einem kommerziell erhältlichen Generator erhalten, am gebräuchlichsten in Form von NaTcO₄ in einer Salinelösung. Es können andere Formen von Pertechnetat unter geeigneter Modifikation der Prozedur verwendet werden, wie dies vom Anbieter einer neuen Art von Generator vorgeschlagen wird, oder wie dies dem Durchschnittspraktiker ersichtlich ist. Pertechnetat wird allgemein in einer Aktivität von etwa 0,2–10 mCi/ml in Saline verwendet, z.B. in 0,9% („physiologischer" Saline), gepuffert bei einem pH von etwa 3–10, bevorzugt von etwa 4,5–9,0. Geeignete Puffer beinhalten z.B. Acetat, Tartrat, Citrat, Phosphat und dergleichen.
Im Verlauf dieser Beschreibung bezeichnen die Begriffe „reduziertes Pertechnetat" oder „reduziertes Perrhenat" die Art von Technetium- oder Rheniumion, wie sie durch Reduktion von Pertechnetat oder Perrhenat z.B. mit Zinnionen, und durch Komplexbildung mit der/den Thiolgruppe(n) gebildet wird. Es wird generell angenommen, dass reduziertes Pertechnetat in Form von Tc(III) und/oder Tc(IV) und/oder Tc(V) in solchen Chelaten vorliegt, und dass reduziertes Perrhenat in Form von Re(III) und/oder Re(IV) und/oder Re(V) vorliegt, jedoch sind höhere oder niedrigere Oxidationszustände und/oder multiple Oxidationszustände im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Rhenium findet sich im Periodensystem genau unterhalb von Technetium und besitzt dieselbe äußere Elektronenschalenstruktur, weshalb zu erwarten ist, dass es sehr ähnliche chemische Eigenschaften besitzt, insbesondere im Hinblick auf sein Verhalten gegenüber analogen Verbindungen. Der begabte Praktiker ist daher in der Lage, die vorliegende Erfindung auf Basis der Offenbarung hinsichtlich der Technetium-Markierung zu modifizieren, um eine effiziente Rhenium-Markierung zu erreichen.
Das Radioisotop Re-186 ist attraktiv für die Radioimmuntherapie und kann auch für Abbildungszwecke verwendet werden. Re-188 ist ein Generator-erzeugter Beta- und Gamma-Strahler mit einer Halbwertszeit von etwa 17 Stunden und ist geeignet zur Abbildung und Therapie. Die Komplexierung der Peptide der Erfindung mit Rhenium erfolgt im Wesentlichen in derselben Weise, wie dies oben für Technetium beschrieben wurde.
Für Vorläuferstudien, wie etwa die Messung der Affinitätskonstanten, in vitro-Tests, etc. für Metall-gebundene Peptide wird praktischerweise nicht-radioaktives Rhenium verwendet. Dies ermöglicht es, die Eigenschaften der Peptid-Rheniumkomplexe ohne die mit der Handhabung von radioaktivem Rhenium verbundenen Risiken zu studieren. Die Verwendung von nicht-radioaktivem Rhenium dient auch als praktisches Modell für das Verhalten von Technetium-Komplexen des Peptids, da kein nicht-radioaktives Isotop von Technetium existiert, und da die chemischen Eigenschaften von Rhenium und Technetium sehr ähnlich sind. Sobald das Peptidderivat radioaktiv markiert worden ist, ist es wichtig zu bestätigen, dass das radioaktiv markierte Konjugat die Rezeptor-Bindungsspezifität des nativen LHRH beibehält. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von LHRH-Analoga sind in der Technik wohlbekannt. Beispielsweise kann ein kompetitiver Zellbindungstest verwendet werden. Zielzellen, beispielsweise die humanen Brust-Adenokarzinomzelllinien MCF-7, SK-BR-3 und MDA-MB-231 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) werden in einem Standard-Testformat verwendet, bei dem Zellen mit verschiedenen Konzentrationen markierter oder unmarkierter Peptide der Erfindung in Gegenwart von LHRH (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) behandelt werden. Die mit den Zellen zusammenhängende Radioaktivität wird ausgezählt, und die Konzentration an unmarkiertem LHRH, die eine 50%ige Inhibition der Bindung der markierten LHRH-Analoga bewirkt, wird bestimmt. Die Gleichgewichtsassoziationskonstante K_a und die Gesamtzahl an Rezeptorstellen pro Zelle können mittels Scatchard-Analyse bestimmt werden (siehe Fersht, ENZYME STRUCTURE AND MECHANISM, 2. Auflage (W. H. Freeman, London, 1985)).
Die Fähigkeit des radioaktiv markierten Peptids, seine Radiomarkierung in physiologischen Lösungen aufrecht zu erhalten, kann unter Verwendung von Techniken gemessen werden, die im wesentlichen denen entsprechen, die für radioaktiv markierte Antikörper verwendet werden (siehe Hnatowich et al., J. Nucl. Med. 34: 109 (1993)). Beispielsweise können diese Tests verwendet werden, um die Fähigkeit des Peptids zu bestimmen, die radioaktive Markierung in Saline- und Serum-Lösungen aufrechtzuerhalten, sowie in Gegenwart oder Abwesenheit von Materialien, wie etwa humanem Serum-Albumin, DTPA, DOTA, Cystein und Glutathion.
Die in vivo Bioaktivität der radioaktiv markierten Peptide der Erfindung lässt sich über Standardstudien der Bioverteilung in Tiermodellen problemlos bestimmen, wobei z.B. MCF-7 Tumorzellen verwendet werden, die in mit Östrogen-Dosen versehenen Nacktmäusen herangezüchtet wurden. Bei diesen Studien ist es nützlich, die Rezeptorkapazität von Mäusen zu bestimmen, die LHRH-bindende Tumore tragen, um die Mengen an radioaktiv markiertem Peptid einzuschätzen, die für die Abbildungs- und/oder Therapieversuche benötigt werden. Zu diesem Zweck wird Träger-freies ¹²⁵I-LHRH (~2000 Ci/mmol, Amersham Life Science) in Mäuse injiziert, die MCF7-Tumore tragen, und die Mäuse werden nach definierten Zeitintervallen nach der Injektion getötet. Die Hauptorgane, ebenso das Blut und der Tumor werden entnommen, gewogen und ausgewertet, um den Prozentanteil der injizierten Dosis pro Gramm (%ID/g) im jeweiligen Organ zu bestimmen. Steigende Mengen an unmarkiertem LHRH werden dann mit dem ¹²⁵I-LHRH gemischt und in die Tumortragenden Nacktmäuse injiziert, die wie oben zu denselben Zeitpunkten, wie sie im vorherigen Versuch festgelegt wurden, getötet werden. Dies ermöglicht die Bestimmung der LHRH-Rezeptorkapazität in dem Nacktmausmodell.
Radioaktiv markierte Peptide, die in vitro-Rezeptoraffinität gemäß obiger Bestimmung zeigen, werden dann in dem MCF7-Nacktmausmodell getestet. Das Tc-99m-markierte Peptid kann mittels HPLC gereinigt werden, um den Peptidträger-freien Metallkomplex für diese Studien zu erhalten, falls die LHRH-Rezeptorkapazität zu gering ist, um die Anwesenheit von überschüssigem Peptid zu tolerieren. Die Bioverteilung der Radiomarkierung wird z.B. für ^99mTc-markierte Peptide mittels einer Gamma-Kamera überwacht, die mit einem Nadelloch-Hilfsfernrohr ausgestattet ist. Bei dem anfänglichen Test werden die Tiere nach 4 Stunden getötet, und die Bioverteilung wird gemäß obiger Beschreibung bestimmt. Peptide, die eine Aufnahme durch den Tumor und ein signifikantes Tumor-zu-Nichtziel-Profil aufweisen, werden dann in einem Blocking-Test unter Verwendung von LHRH untersucht, um zu bestimmen, ob die in vivo-Aufnahme in den Tumor spezifisch ist. Das Tumor-zu-Nichtziel-Profil eines radioaktiv markierten Peptids der Erfindung ist signifikant, wenn die Größe und Position des Tumors unter Standard-Abbildungsbedingungen unter Verwendung des Peptids bestimmt werden können.
E. Verabreichung des radioaktiv markierten Peptids für die Diagnose und Therapie
Die Peptide der Erfindung können zur Diagnose oder Therapie eines jeden physiologischen Zustands verwendet werden, bei dem Zellen oder Gewebe eine hohe Anzahl an LHRH-Rezeptoren oder LHRH-Rezeptoren hoher Affinität exprimieren oder beide Bedingungen erfüllen. Die Peptide können vorteilhafter Weise gemäß obiger Beschreibung in Kits aufbewahrt werden. Diese können gefroren oder in sterilen Behältern unter einer inerten Gasatmosphäre lyophilisiert sein und werden vorteilhafterweise genau vor der Verwendung sanft aufgetaut. Die Kits sind praktischerweise ausgestattet mit sterilen Gefäßen von Puffern, Saline, Spritzen, Filtern und anderem Zubehör, um die Herstellung injizierbarer Präparationen, die zur Anwendung durch den Kliniker oder Techniker bereit sind, zu erleichtern. Der Kliniker oder Techniker kann dann praktischerweise exakt vor der Verabreichung an einen Patienten eine Lösung eines geeigneten Radionuklids zugeben. Im allgemeinen wird die Dosierung des verabreichten markierten Peptids in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Alter, dem Gewicht, der Größe, dem Geschlecht, dem allgemeinen Gesundheitszustand und der vorhergehenden Krankengeschichte des Patienten abhängen. Typischerweise ist es bevorzugt, den Empfänger mit einer Dosis des Proteins zu versorgen, die sich im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 μg/kg oder 10 mg/kg (Menge des Mittels/Körpergewicht des Patienten) bewegt, obwohl auch eine niedrigere oder höhere Dosis verabreicht werden kann.
Für therapeutische Anwendungen werden etwa 0,1–500 Mikrogramm an radioaktiv markiertem Peptid verabreicht, normalerweise täglich für eine Zeitspanne von mehreren Tagen. Die Verabreichung der radioaktiv markierten Peptide an einen Patienten kann intravenös, intraarteriell, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, intrapleural, intrathecal, durch Perfusion mittels eines regionalen Katheters, oder durch direkte Injektion in die Läsion erfolgen. Die Verabreichung durch Injektion kann eine kontinuierliche Infusion oder eine einfache oder mehrfache Bolus-Injektion darstellen.
Die radioaktiv markierten Peptide können gemäß bekannten Verfahren formuliert werden, um phannazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, wobei diese in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger kombiniert werden. Eine Zusammensetzung wird als „phannazeutisch verträglicher Träger" bezeichnet, wenn ihre Verabreichung von einem Empfängerpatienten toleriert werden kann. Sterile Phosphat-gepufferte Saline ist ein Beispiel eines pharmazeutisch verträglichen Trägers. Andere geeignete Träger sind Fachleuten wohlbekannt (siehe z.B. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage (1990)).
Für die Zwecke der Radiotherapie werden einem Patenten ein radioaktiv markiertes Peptid und ein phannazeutisch verträglicher Träger in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. Man sagt, dass eine Kombination aus einem radioaktiv markierten Peptid und einem pharmazeutisch verträglichen Träger in einer „therapeutisch wirksamen Menge" verabreicht wird, wenn die verabreichte Menge physiologisch signifikant ist. Ein Mittel ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart in einer detektierbaren Veränderung der Physiologie eines Empfängerpatienten resultiert.
Es können zusätzliche pharmazeutische Verfahren angewendet werden, um die Wirkungsdauer eines radioaktiv markierten Peptids bei einer therapeutischen Anwendung zu kontrollieren. Die die Freisetzung kontrollierenden Präparationen können durch die Verwendung von Polymeren hergestellt werden, um das Protein zu komplexieren oder zu adsorbieren. Beispielsweise beinhalten biokompatible Polymere Matrizes aus Poly(ethylen-co-vinylacetat) und Matrizes aus einem Polyanhydrid-Copolymer eines Stearinsäuredimers und Sebacinsäure (Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446–1449 (1992)). Die Freisetzungsgeschwindigkeit eines Peptids aus einer solchen Matrix hängt ab vom Molekulargewicht des Peptids, der Menge an Peptid in der Matrix und der Größe der dispergierten Partikel (Saltzman et al., Biophysical J. 55: 163–171, (1989); und Sherwood et al., oben)). Andere feste Dosierungsformen sind in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage (1990) beschrieben.
Die vorliegende Erfindung, die damit allgemein beschrieben ist, wird durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die zur Veranschaulichung bereitgestellt und nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung gedacht sind, besser verständlich werden.
Beispiele
Beispiel 1: Synthese von N^αAlloc-N^e-Fmoc-L-Lysin
N^e-Fmoc-L-Lysin (10,00 g, 27,1 mmol, 100 Mol-%, Bachem Bioscience, Inc.) wurden in Dioxan (100 ml) und Na₂CO₃ (1 M, 33 ml) suspendiert, um eine milchige Suspension zu erzeugen. Allyl-Chloroformat (3,2 ml, 30,2 mmol, 111 Mol-%) wurde zu dem Dioxan (10 ml) hinzu gegeben, und diese Lösung wurde tropfenweise über 10 min zu der Suspension von N^e-Fmoc-L-Lysin hinzugegeben. Natriumcarbonat (1 M, 20 ml) wurde in zwei Portionen hinzugegeben, und es wurde eine zusätzliche Menge an Allyl-Chloroformat (0,3 ml) hinzugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 16 Stunden gerührt. Die flüchtigen Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit Diethylether (50 ml) gewaschen. Die verbleibende Lösung wurde dann mit HCl (1 M) angesäuert und mit Ethylacetat (2 × 150 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereint, mit gesättigter NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck eingedampft, um ein öliges Rohprodukt (16 g) zu erhalten. Das Rohprodukt wurde in Ether (100 ml) gelöst, wobei sich ein weißer Feststoff bildete, der durch Filtration entfernt wurde. Das Lösungsmittel aus dem Filtrat wurde unter vermindertem Druck entfernt, um ein viskoses, blassgelbes Öl zu erhalten (8,34 g, 68% Ausbeute), das schließlich einen glasigen Feststoff bildete.
Beispiel 2: Synthese von 2-(Triphenylmethylmercapto)acetylhydrazid
2-(Triphenylmethylmercapto)essigsäure (20,35 g, 60,9 mmol, 100 Mol-%) wurden in wasserfreiem THF (150 ml) gelöst und in einem Eis/Wasser-Bad gekühlt. Es wurde t-Butylcarbazat (8,61 g, 65,1 mmol, 107 Mol-%) zu der Reaktionslösung hinzugegeben, gefolgt von Diisopropylcarbodiimid (10,0 ml, 63,9 mmol, 105 Mol-%). Man ließ das Reaktionsgemisch sich langsam auf Raumtemperatur erwärmen und rührte für 28 Stunden. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, um das weiße Präzipitat zu entfernen, das sich gebildet hatte, und das Filtrat wurde zu einem weißen Schaum konzentriert, indem man das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernte. Dieses Material wurde in Chloroform (75 ml) gelöst. Dann wurde Essigsäure (75 ml) hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von Bortrifluoridetherat (10,0 ml, 81 mmol, 134 Mol-%). Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 6 Stunden gerührt und dann gequencht, indem man das Reaktionsgemisch in Wasser (200 ml) gießt, das Natriumacetat (30 g) enthält. Dieses Gemisch wurde mit Chloroform (2 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereint, mit gesättigter NaCl-Lösung (150 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um ein blassgoldenes Öl zu erhalten, das sich beim Stehenlassen verfestigte. Der Feststoff wurde in 1:1 Diethylether/Hexanen (200 ml) suspendiert und mittels Filtration gesammelt. Der Feststoff wurde mit einer weiteren Menge an 1:1 Diethylether/Hexanen (100 ml) gewaschen und getrocknet, um das gewünschte Produkt (15,44 g, 73% Ausbeute) zu erhalten; dieses besitzt eine berechnete ESMS MH⁺ von 349 und einen beobachteten Wert von 349.
Beispiel 3: Synthese von N^β-[2-(Triphenylmethylthio)acetyl]azaglycin
Glyoxylsäure-Monohydrat (0,59 g, 6,41 mmol, 110 Mol-%) wurde in Methanol (20 ml) gelöst, und es wurde 2-(Triphenylmethylmercapto)acetyl-Hydrazid (2,03 g, 5,82 mmol, 100 Mol-%) hinzugegeben. Dioxan (20 ml) wurde zu dem wolkigen Reaktionsgemisch hinzugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt. Natriumborhydrid (1,76 g) wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugegeben, und nach 30 Minuten wurde eine weitere Menge an Natriumborhydrid (0,60 g) hinzugegeben. Der Reaktionsansatz wurde für 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann gequencht, indem man das Reaktionsgemisch in HCl (1 M, 60 ml) goss. Das Gemisch wurde mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereint, mit gesättigter NaCl-Lösung (40 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck auf dem Rotationsverdampfer konzentriert, um einen Feststoff (2,5 g) zu erhalten, der eine berechnete ESMS MH⁺ von 407 besitzt, wobei 407 ermittelt wurde.
Beispiel 4: Synthese von N^α-Boc-N^β-[2-(Triphenylmethylthio)acetyl]azaglycin
N^β-[2-(Triphenylmethylthio)acetyl]azaglycin (2,39 g, 5,89 mmol, 100 Mol-%) wurde in Dioxan (50 ml) gelöst. Di-t-butyl-dicarbonat (BOC)₂O (2,07 g, 9,48 mmol, 161 Mol-%) wurde zu der Reaktionslösung hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von Na₂CO₃ (1 M, 15 ml). Dieses Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 15 Minuten gerührt, dann wurden zusätzliche Mengen an Na₂CO₃ (1 M, 10 ml) und (BOC)₂O (1,41 g) hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 18 Stunden gerührt und dann mit NaOH (6 M, 3 ml) und (BOC)₂O (1,4 g) für 1 Stunde umgesetzt. Das Reaktionsrohgemisch wurde dann mit Zitronensäure (1 M) auf pH 3 angesäuert und mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung (60 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter reduziertem Druck konzentriert, um das Rohprodukt zu erhalten. Das Rohprodukt wurde in Ether gelöst und verdünnt, um ein 1:1-Gemisch mit Hexanen zu erhalten, was zur Bildung eines weißen Präzipitats führte. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, um das gewünschte Produkt (1,48 g, 50% Ausbeute) zu erhalten; dieses weist eine berechnete ESMS MH⁺ von 507 und einen aufgefundenen Wert von 507 auf.
Beispiel 5: Synthese von 2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure
4-Phenyl-3-thiosemicarbazid (6,02 g, 36 mmol, 100 Mol-%) wurde in Methanol (40 ml) suspendiert. Es wurde Glyoxylsäure-Monohydrat (3,32 g, 36,1 mmol, 100 Mol-%) hinzugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Natriumborhydrid (1,50 g) wurde vorsichtig hinzugegeben, und das Reaktionsgemisch schäumte sehr heftig auf. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde gerührt, dann wurde NaBH₄ (0,66 g) hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von Eisessig (6 ml). Nach 15 Minuten wurde wiederum NaBH₄ (1,08 g) hinzugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 15 Stunden gerührt. Es wurde dann eine weitere Menge an NaBH₄ (1,66 g) hinzugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden gerührt, bevor sie mit HCl (1 M, 200 ml) gequencht wurde. Das Gemisch wurde dann mit Ethylacetat (2 × 150 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereint, mit gesättigter NaCl-Lösung (100 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um einen gelben Feststoff (9,03 g) zu erhalten, der im ESMS (negativer Ionenmodus) eine berechnete M-H⁺ von 224 und einen aufgefundenen Wert von 224 besitzt.
Beispiel 6: Synthese von N^β-Boc-2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure
2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure (8,93 g, 37,9 mmol, 100 Mol-%) und (BOC)₂O (9,10 g) wurden in Dioxan (100 ml) gelöst. Es wurden Natriumcarbonat (1 M, 50 ml) und Wasser (50 ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden gerührt. Es wurden Natriumhydroxid (1 M, 40 ml) und eine weitere Menge an (BOC)₂O (6,21 g) hinzugefügt, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Zitronensäure (1 M) gequencht und mit Ethylacetat (2 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereint, mit gesättigter NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, und filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um einen gummiartigen Feststoff (19 g) zu erhalten. Der Rohfeststoff wurde in Ether suspendiert, und es wurde ein weißer Feststoff durch Filtration gewonnen. Der Feststoff wurde mit Ether (100 ml) gewaschen, um das gewünschte Produkt (3,17 g) zu erhalten. Dieses besitzt eine berechnete ESMS MH+ von 326 und eine aufgefundene von 326.
Beispiel 7: Synthese von N^a-(Triphenylmethylsulfenyl)-N^b-(Boc)azaglycin
t-Butylcarbazat wurde mit Glyoxylsäure-Monohydrat in Methanol kondensiert. Dieses Rohhydrazon wurde dann mittels katalytischer Hydrierung über 10% Pd/C reduziert. Dieses Produkt wurde dann mit Dioxan und Base gemischt, und eine Dioxanlösung von Triphenylmethansulfenylchlorid wurde tropfenweise hinzugegeben. Das gewünschte N^a-(triphenylmethylsulfenyl)-N^b-(Boc)azaglycin (25 g) wurde bei der Aufarbeitung erhalten.
Beispiel 8: Festphasenpeptidsynthese von Peptiden unter Verwendung von Alloc- und Fmoc-Schutzgruppen
Die Festphasenpeptidsynthese erfolgte im Größenmaßstab von 0,050 mmol unter Verwendung eines Advanced ChemTech Modell 348-Peptidsynthesegeräts in modifizierter Weise, um unter Stickstoffdruck in derselben Weise zu arbeiten wie bei dem Modell 396. Die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Gruppe wurde für den Schutz des Stickstoffs verwendet, und Diisopropylcarbodiimid (DIC)/Hydroxybenzotriazol (HOBT) wurden verwendet, um die Carboxylgruppen für die Kopplung zu aktivieren. Es wurde eine Mehrzahl an Harzen verwendet, wie etwa Rink, Pal und TentaGel S RAM für C-terminale Amide, und Wang, 2-Chlortrityl oder TentaGel S PHB für C-terminale Säuren. Die Abspaltung der Alloc-Gruppen erfolgte in der Maschine im manuellen Modus, indem das Harz-gebundene Peptid mit Dichlormethan (3 × 2 ml Portionen) gewaschen wurde, und das Harz dann mit einer Lösung (2 ml) gemischt wurde, die Tetrakistriphenylphosphin-Palladium [0] (10 mg) und Essigsäure (0,1 ml) enthielt. Es wurde dann Tributylzinnhydrid (0,3 ml) hinzugegeben, und das Gemisch wurde für 1 Stunde gevortext. Die Reaktionszelle wurde dann geleert, das Harz wurde mit Dichlormethan (3 × 2 ml) gewaschen, und die Standard-Fmoc-Synthese wurde wieder aufgenommen. Die Abspaltung der Peptide von dem Harz erfolgte mit einer Lösung aus Trifluoressigsäure (TFA), Anisol und Ethandithiol im Verhältnis von 23:3:1 für 1 bis 3 Stunden. Das Rohgemisch der Spaltung wurde dann in Ether gegeben, um das Rohpeptid zu präzipitieren, das dann über Reversphasen-HPLC unter Verwendung eines Waters Delta Pak, Prep Pak C-18 Kartuschensystems mittels eines geeigneten Gradienten von TFA (0,1%) in Wasser und/oder TFA (0,1%) in Acetonitril (90%) und Wasser (10%) gereinigt wurde. Die Fraktionen, die die gewünschten gereinigten Peptide enthielten, wurden gesammelt, und die flüchtigen Lösungsmittel wurden unter reduziertem Druck entfernt, um die wässrigen Lösungen der Peptide zu erhalten, die dann lyophilisiert wurden. Proben der lyophilisierten Produkte wurden dann zur Elektrospray- (ESMS) oder Schnellatomen (FABMS)-Beschießung geschickt, um zu bestätigen, dass die beobachteten Massen der Produkte mit den berechneten Massen des gewünschten Peptids übereinstimmen.
Die folgende Tabelle zeigt einige der Peptidsequenzen (SEQ ID NO: 1, bzw. 3–17), die mittels der oben beschriebenen Verfahren synthetisiert wurden.

a: HPLC-Verfahren (Retentionszeit in Minuten). Lösungsmittel A ist 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, Lösungsmittel B ist 0,1% Trifluoressigsäure in 90:10 Acetonitril/Wasser. Die Fließgeschwindigkeit des Lösungsmittels beträgt 3 ml/min für 10 min, dann 5 ml/min für 5 min. Der Gradient ist 0 bis 100% B über 10 min, dann 100% B für 5 min.
b: Werte des Elektrospray-Massenspektrums (MH⁺)

In der Tabelle verwendete Abkürzungen:

<G:

Pyroglutaminsäure

PtscG:

2-(4-Phenyl-3-Thiosemicarbazidyl)essigsäure oder PhNHCSNHNHCH₂CO₂H

Ma:

Mercaptoessigsäure

azaG:

Azaglycin oder H₂NNHCH₂CO₂H

Dap:

2,3-Diaminopropionsäure

Nal:

2-Naphthylalanin

Cpa:

4-Chlorphenylalanin

Kd:

Der Index d gibt an, dass das D-Isomer verwendet wurde.

K(MaGC):

Die Klammer gibt an, dass eingeschlossene Aminosäuren an das e-Amin von Lysin angeheftet sind, und dass die erste angeheftete Aminosäure C ist, gefolgt von G und endend mit Ma.

iD:

iso-Asparaginsäure

iE:

Isoglutaminsäure

Beispiel 9: Radioaktive Markierung mit Tc-99m
Ein Glucoscan (DuPont) Gefäß wurde mit 2,18 mCi an NaTcO₄ in 1 ml Saline vervollständigt, um den Tc-99m-Gluceptatkomplex zu bilden. <GHWSYK(MaGC)LRPG-Amid (SEQ ID NO: 4) (IMP3) wurde, wie oben beschrieben, hergestellt. Tc-99m-IMP3 wurde hergestellt, indem man 360 μl (874 μCi) an Tc-99m-Gluceptat mit 640 μl an Peptid in Saline mischte. Das anfänglich gebildete Präzipitat verschwand beim Erhitzen auf 75°C für 15 min. Ein TLC (ITLC)-Schnellteststreifen, der in einem H₂O:EtOH:NH₄OH-Gemisch (5:2:1) entwickelt wurde, zeigte 6,2% der Aktivität am Anfang als Kolloide. Die HPLC zeigte 100% der an das Peptid gebundenen Aktivität, mit einer RT von 6,95 min, wogegen das unmarkierte Peptid bei 6,4 min unter denselben HPLC-Bedingungen (Reversphasen-C-18-Säule, Gradient von 0–100% B in 10 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min, wobei A 0,1% TFA in H₂O ist und B 90% CH₃CN, 0,1% TFA ist) eluierte. Die Ausbeute aus der HPLC-Säule betrug 85% der injizierten Aktivität.
IMP3 wurde formuliert und für die Tc-99m-Markierung in den unten gezeigten Mengen lyophilisiert:
Die lyophilisierten Gefäße wurden mit ~900 μCi an NaTcO₄ in Saline vervollständigt. Ein wolkiges Erscheinungsbild wurde in allen Gefäßen beobachtet. Die Gefäße wurden für 15 min auf 75°C erhitzt, aber die Trübheit blieb bestehen. Die ITLC-Analyse für Kolloide zeigte zu Beginn 14, 21 und 9% Kolloide für die Gefäße 1, 2, bzw. 3.
Um die Präzipitation bei der Tc-99m-Markierung zu verhindern, wurden die Verhältnisse von α-D-Glucoheptonat (αDG) und Tartrat zu Sn(II) bei den lyophilisierten Gefäßen variiert. Die folgenden Gefäße wurden formuliert und lyophilisiert (250 μg an IMP3 mit 25 μg Sn(II)), wobei die Tartrat- und αDG-Verhältnisse so waren wie unten angegeben. Die Gefäße wurden mit ~500 μCi an NaTcO₄ in 1 ml Saline vervollständigt. Die Beobachtungen sind in der Säule „Beobachtungen" angegeben. Die ITLC-Streifen waren entwickelt, nachdem sie für 15 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 15 min bei 75°C, erwärmt worden waren.

ppt:: Präzipitation

Das obige Protokoll wurde für die Gefäße 3, 7 und 8 wiederholt, und die Kolloide wurden nach 15 min Erhitzen auf 75°C mit 5,3%, 3,8% bzw. 4,6% bestimmt. Auf einer reversen HPLC-Säule bei Raumtemperatur wurde ein einzelner breiter Peak bei 7 min beobachtet.
Die Ergebnisse aus der Markierung anderer Peptide mit Technetium-99 sind in der unten stehenden Tabelle (SEQ ID NO: 4–8, 12, bzw. 9–11) angegeben.
Die in der Tabelle verwendeten Abkürzungen sind dieselben wie im obigen Beispiel B.
Beispiel 10: Radioaktive Markierung von IMP-3 Re-188
IMP3 (<GHWSYK(MaGC)LRPG-amid (SEQ ID NO: 4)) wurde wie oben synthetisiert. IMP3 besitzt eine Retentionszeit von 6,4 min auf einer Reversphasen-C-18-Säule bei Verwendung eines Gradienten von 0–100% B in 10 min bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min, wobei A 0,1% TFA in H₂O ist und B 90% CH₃CN, 0,1% TFA ist.
IMP3 wurde in Mengen von 1 mg und 250 μg mit 450 μg Sn(II) und α-D-Glucoheptonat in einem Verhältnis von 1:17,5 formuliert und lyophilisiert. Die lyophilisierten Gefäße von IMP3 (1 mg und 250 μg) wurden mit 617 und 578 μCi an NaReO₄ in Saline vervollständigt. Die Gefäße wurden für 15 min auf 75°C erhitzt. Die HPLC-Analyse unter den oben beschriebenen Bedingungen zeigte bei Raumtemperatur für beide Gefäße Einzelpeaks bei 7,0 min. Der Abfluss wurde gesammelt und auf einem γ-Zähler ausgezählt. Für das 1 mg-Gefäß betrug die Rückgewinnung der Aktivität 88%, wogegen die Rückgewinnung bei dem 250 μg-Gefäß 77% betrug. Kolloid-Analysen auf einem ITLC-Streifen, der in H₂O:EtOH:NH₄OH (5:2:1) entwickelt worden war, zeigten 1,4% und 1,2% der Aktivität zu Beginn der Gefäße mit 1 mg bzw. 250 μg.
Die Markierung mit Re-188 bei Raumtemperatur schritt nicht so gut voran wie bei 75°C. Bei Raumtemperatur wurden nur wenige Prozent der Aktivität (< 5%) in das Peptid eingebaut, und der Rest der Aktivität eluierte im Leervolumen (1,2 min).
Beispiel 11: In vitro-Rezeptor-Bindungstests
Die humanen Brust-Adenokarzinomzelllinien MCF-7, SK-BR-3 und MDA-MB-231 wurden bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD erworben. Man ließ die Zellen in DMEM wachsen, das mit 5% fetalem Rinderserum, 5% definiertem Pferdeserum, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und L-Glutamin (2 mM) supplementiert war. Die Zellen wurden nach der Ablösung mit Trypsin und 0,2% EDTA einer routinemäßigen Passage unterzogen.
Die Spezifität der unmarkierten Peptide wird durch kompetitiven Zellbindungstest bestimmt. Die Zielzellen werden mit frischem Medium gewaschen und auf 5 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt. 100 μl der Zellsuspension (100 μl) werden pro Well auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben. Man ermöglicht den Zellen die Anheftung und behandelt sie dann mit verschiedenen Konzentrationen der Peptide in Gegenwart von ¹²⁵I-LHRH (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL, 2.000 Ci/mmol). Nach einer 2-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur unter Schütteln wurden die Zellen zweimal gewaschen, die mit den Zellen assoziierte Radioaktivität gemessen, und die Konzentration der Peptide, die eine 50%ige Inhibition der Bindung des markierten LH-RH verusachen, wird verglichen.
Um die Rezeptorbindungskonstanten zu bestimmen, werden serielle Verdünnungen von radioaktiv markiertem LHRH mit 5 × 10⁵ Zellen in einer 96-Well-Platte inkubiert. Alle Tests wurden dreifach sowohl mit als auch ohne eine hohe Konzentration an unmarkiertem LHRH durchgeführt, um die Bestimmung spezifisch gebundener Peptide zu ermöglichen. Nach einer 2-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen gewaschen und ausgezählt. Die Gleichgewichts-Assoziationskonstante, K_a, und die Gesamtzahl an Rezeptorstellen pro Zelle werden durch Scatchard-Analyse bestimmt.
Beispiel 12: Bioverteilungsstudien
MCF-7-Tumorzellen werden in mit Östrogen-Dosen behandelte Nacktmäuse injiziert, und die Entwicklung eines Tumors wird ermöglicht. Träger-freies ¹²⁵I-LHRH (~2000 Ci/mmol, Amersham Life Science) wird in die Mäuse injiziert, und die Mäuse werden nach 5 min, 30 min, 1 h bzw. 3 h getötet (3 Tiere pro Zeitpunkt). Die Hauptorgane, ebenso wie das Blut und der Tumor werden entnommen, gewogen und ausgewertet, um den Prozentanteil der injizierten Dosis pro Gramm (%ID/g) in jedem Organ zu bestimmen.
Es werden dann steigende Mengen an unmarkiertem LHRH in 5 Dosen (von 0 bis 0,1 mg) mit dem ¹²⁵I-LHRH gemischt und in die Tumor-tragenden Nacktmäuse injiziert (3 Tiere/Dosis). Die Tiere werden dann zu den Zeitpunkten getötet, wie sie im vorherigen Versuch festgelegt wurden. Dies erlaubt dann die Bestimmung der LHRH-Rezeptorkapazität im Nacktmausmodell. Die Tc-99m-markierten Peptide, die sich hinsichtlich der in vitro-Rezeptoraffinität gemäß der obigen Bestimmung als überlegen zeigten, werden dann in dem MCF-7-Nacktmausmodell durchgetestet. Das Tc-99m-markierte Peptid wird mittels HPLC gereinigt, um den Peptidträger-freien Metallkomplex für diese Studien zu erhalten, falls die LHRH-Rezeptorkapazität zu gering ist, um die Anwesenheit von überschüssigem Peptid zu tolerieren. Die Bioverteilung der Tc-99m-Markierung (3 Tiere pro Peptid) wird mittels einer Gamma-Kamera überwacht, die mit einem Nadelloch-Hilfsfernrohr ausgestattet ist. Bei dem anfänglichen Test werden die Tiere nach 4 Stunden getötet, und die Bioverteilung wird gemäß obiger Beschreibung bestimmt. In nachfolgenden Versuchen werden diejenigen Tc-99m-markierten Peptide, die im oben beschriebenen Versuch klare Tumorbilder erbringen, an zusätzlichen Tieren getestet (3 pro Zeitpunkt), wobei die Tiere nach 15 min, 1 h, bzw. 3 h getötet werden. Die Peptide werden auch in einem Blocking-Test unter Verwendung von LHRH getestet. Die Co-Injektion von LHRH verringert die Tumoraufnahme der radioaktiv markierten Peptide in einer dosisabhängigen Weise, was zeigt, dass die in vivo-Tumoraufnahme spezifisch ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Peptid, welches die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfaßt, worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist, X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist, X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist, X⁶ Leucin oder Tryptophan ist, X⁷ Arginin oder Lysin ist, X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist, und worin X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist, R² H ist, W 1–20 Atome lang ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit mindestens einem Heteroatom substituierten Kette, Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist, oder Z ist COCH₂ oder COCH(CH₂SP²), wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist, A und D gleich oder verschieden sind und jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ H sind, und R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe enthält.
Peptid nach Anspruch 1, wobei X⁵ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
Peptid nach Anspruch 1, wobei X¹ Pyroglutaminsäure ist, X² Histidin ist und X⁸ Glycinamid ist.
Peptid nach Anspruch 3, wobei X³ Tyrosin ist, X⁴ Leucin ist, X⁶ Tryptophan ist und X⁷ Lysin ist.
Peptid nach Anspruch 4, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 4, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 4, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 3, worin X³ Tryptophan ist, X⁴ Tyrosin ist, X⁶ Leucin ist und X⁷ Arginin ist.
Peptid nach Anspruch 8, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 8, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 8, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 2, worin X¹ D-Acetylnaphthylalanin ist, X² D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D-Tryptophan ist, X⁴ Arginin ist, X⁶ Leucin ist, X⁷ Arginin ist und X⁸-NH₂ D-Alaninamid ist.
Peptid nach Anspruch 12, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 1, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 1, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 12, worin X⁵
ist.
Peptid nach Anspruch 1, worin X¹ D-Acetylnaphthylalanin ist, X² D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D-Tryptophan ist, X⁴ Arginin ist, X⁶ Tryptophan ist, X⁷ Lysin ist und X⁸-NH₂ Glycinamid ist.
Verfahren zur Herstellung einer metallchelatbildenden Zusammensetzung, welches das Inkontaktbringen einer Lösung eines Peptids mit Zinnionen umfaßt, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfaßt, worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist, X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist, X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist, X⁶ Leucin oder Tryptophan ist, X⁷ Arginin oder Lysin ist, X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist, X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist, R² H ist, W 1–20 Atome lang ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit mindestens einem Heteroatom substituierten Kette, Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist, A und D gleich oder verschieden sind und jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ H sind, und R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe enthält, und anschließend Inkontaktbringen dieser Lösung mit ^99mPertechnetat, ¹⁸⁶Perrhenat oder ¹⁸⁸Perrhenat und Zurückgewinnen des radioaktiv markierten Peptids.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Peptid spezifisch an Zellen oder Gewebe bindet, die LHRH-Rezeptoren exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Radionuklid unter ¹⁸⁸Re- oder ¹⁸⁶Re-Perrhenat und ⁹⁹Tc-Pertechnetat ausgewählt ist.
Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids, hergestellt durch Inkontaktbringen einer Lösung eines Peptids mit Zinnionen, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfaßt, worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist, X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist, X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist, X⁶ Leucin oder Tryptophan ist, X⁷ Arginin oder Lysin ist, und X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist, X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist; R² H ist; W 1–20 Atome lang ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit zumindest einem Heteroatom substituierten Kette; Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist, oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist; A und D gleich oder verschieden sind und jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ H sind, und R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe umfaßt; und dann Inkontaktbringen der Lösung mit ^99mPertechnetat, ¹⁸⁶Perrhenat oder ¹⁸⁸Perrhenat, und Zurückgewinnen des radioaktiv markierten Peptids bei der Herstellung einer Zusammensetzung für das Abbilden von Gewebe, welches die Verabreichung eines radioaktiv markierten Peptids, welches spezifisch an Zellen oder Gewebe bindet, die LHRH-Rezeptoren exprimieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger an einen Patienten umfaßt, und, nach einer für das Lokalisieren des radioaktiv markierten Peptids und das Klären des nicht zum Zielgewebe gehörenden Hintergrunds ausreichenden Zeit, Detektieren der Anlagerungsstelle oder -stellen des radioaktiv markierten Peptids mit einer externen Abbildungskamera.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Gewebe einen Tumor, eine infektiöse Läsion, einen Myokardinfarkt, ein Gerinnsel, einen Arterioskleroseherd oder ein normales Organ oder Gewebe umfaßt.
Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids, hergestellt durch Inkontaktbringen einer Lösung eines Peptids mit Zinnionen, wobei das Peptid die Aminosäuresequenz X¹-X²-X³-ser-X⁴-X⁵-X⁶-X⁷-pro-X⁸-NH₂ umfaßt, worin X¹ Pyroglutaminsäure oder D-Acetylnaphthylalanin ist, X² Histidin oder D-4-Chlorphenylalanin ist, X³ D- oder L-Tryptophan oder Tyrosin ist, X⁴ Tyrosin, Leucin oder Arginin ist, X⁶ Leucin oder Tryptophan ist, X⁷ Arginin oder Lysin ist, und X⁸-NH₂ Glycinamid oder D-Alaninamid ist, X⁵ ein Aminosäurederivat ist, welches in der Lage ist, Technetium-99m, Rhenium-186 oder Rhenium-188 stabil zu chelieren, und die folgende Struktur hat:
worin R¹ H, OH, ein Peptid, ein Zucker, ein Zielsteuerungsmolekül oder eine Schutzgruppe, welche unter den Bedingungen der Peptidsynthese entfernt werden kann, ist; R² H ist; W 1–20 Atome lang ist und aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Cycloalkyl-, Aryl- oder Alkarylgruppen, einer substituierten oder unsubstituierten Alkylenkette und einer mit mindestens einem Heteroatom substituierten Kette; Z eine Aminosäure oder ein Peptid mit 2–5 Resten ist, oder Z COCH₂ oder COCH(CH₂SP²) ist, wobei P² H oder eine Schwefelschutzgruppe ist; A und D gleich oder verschieden sind und jeweils aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus H, COCH₂NR³NR⁴C(S)NHR⁵, COCH₂NR⁶NR⁷C(S)NHR⁸, COCH₂NR⁹NR¹⁰C(O)CH₂SP², CONR¹¹NR¹²C(O)CH₂SP², NR¹³C(S)NHR¹⁴ oder COCH₂NR¹⁵COCH₂SP², R³, R⁴, R⁶, R⁷, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹², R¹³ und R¹⁵ H sind, und R⁵, R⁸ und R¹⁴ gleich oder verschieden sind und jeweils H, Aryl oder substituiertes Aryl sind, oder X⁵ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
wobei die Aminosäuresequenz mindestens eine Thiol- oder Thiocarbonylgruppe umfaßt; und dann Inkontaktbringen der Lösung mit ^99mPertechnetat, ¹⁸⁶Perrhenat oder ¹⁸⁸Perrhenat, und Zurückgewinnen des radioaktiv markierten Peptids bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1–17, welches das Koppeln von Aminosäuren und Aminosäureanalogen durch Festphasenpeptidsynthese umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge eines Peptids gemäß einem der Ansprüche 1–17 in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine wirksame Menge einer metallchelatbildenden Zusammensetzung, hergestellt nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 18–20, in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.