DE69738353T2

DE69738353T2 - Radiometall-bindende peptide analoge

Info

Publication number: DE69738353T2
Application number: DE69738353T
Authority: DE
Inventors: William J. Summit MCBRIDE; Gary L. Morristown GRIFFITHS
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1996-07-12
Filing date: 1997-07-11
Publication date: 2009-09-24
Anticipated expiration: 2017-07-12
Also published as: DE69738353D1; ES2297862T3; EP0975374B1; EP0975374A4; EP0975374A1; JP2000515514A; US6126916A; AU3724997A; WO1998002192A1; AU725827B2; US7045503B1; ATE380038T1; JP3647881B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung stellt Derivate biologisch nützlicher zyklischer und azyklischer Peptide bereit, bei denen eine oder mehr als eine Aminosäureseitenkette oder ein an der Peptidkette befestigtes Segment chelatbildende Teile enthält, die Metallionen, einschließlich Radionuklide, fest binden können. Die markierten Peptide tragen das Metall zu spezifischen in vivo-Zielen, wie beispielsweise Rezeptoren und Antigenen, und sind für die Herstellung von Zusammensetzungen für die radiodiagnostische bildgebende Darstellung, Therapie und Radiotherapie nützlich. Es werden auch neue Verfahren zum Herstellen der Peptide bereitgestellt.
Radioaktiv markierte Peptide sind für die Diagnose und Therapie einer Vielzahl von menschlichen Krankheitszuständen nützlich, die durch die Überexpression von Peptidhormonrezeptoren gekennzeichnet sind. So wurde z. B. gezeigt, dass radioaktiv markierte Analoga von LHRH (Freisetzungshormon für Luteinisierungshormon) und Somatostatin selektiv an für Hormone empfindliche Tumore binden, die durch Überexpression von LHRH-Hormonrezeptoren an der Zelloberfläche gekennzeichnet sind. In ähnlicher Weise wurden Peptidhormonanaloga, wie beispielsweise ¹²³I-vasoaktives intestinales Peptid (VIP), ^99mTc-P829, ¹¹¹In-DTPA-Octreotid und ¹¹¹In-bisMSH-DTPA verwendet, um menschliche Tumore bildgebend darzustellen, die VIP, Somatostatin, Somatostatin- bzw. Melanozyten-stimulierendes Hormon (MSH)-Rezeptoren überexprimieren. Siehe: Virgolini et al. Engl. J. Med. 169:1116 (1994); Virgolini et al. J. Nucl. Med. 36:1732, (1995); Lister-James et al. Nucl. Med., 36, 91P, #370, 1995 Konferenz-Auszug; Pearson et al. J. Med. Chem. 39:1361 (1996); Krenning et al. J. Nucl. Med., 33:652 (1992); und Wraight et al. Brit. J. Radiol. 65:112 (1992).
Viele tyrosinhaltige Peptide können durch wohl bekannte Verfahren mit ¹²⁵I markiert und für Rezeptorbindungsstudien verwendet werden. Zum Beispiel wurde das Auftreten einer Hochregulation des VIP-Rezeptors in einer weiten Bandbreite von Krebsarten unter Verwendung von ¹²⁵I-[Tyr¹⁰]-VIP als Radioligand in vitro untersucht. Siehe Reubi, Nucl. Med. 36:1846 (1995). Der VIP-Rezeptor wurde in einer weiten Vielzahl von Krebsarten nachgewiesen, die Brust-, Prostata-, Eierstock-, Pankreas-, Uterusschleimhaut-, Blasen-, Kolon-, ösophagiale, SCLC-, Astrozytom-, Glioblastom-, Meningiom-, Phäochromozytom-, Lymphom-, Neuroblastom- Adenoma- und GEP-Tumore umfassen. Ein iodiertes VIP-Analogon, ¹²³I-[Tyr¹⁰]-VIP, wurde auch verwendet, um an VIP-Rezeptoren reiche Tumore in Menschen bildgebend darzustellen. Siehe Virgolini et al., oben.
Die Verwendung von radioaktivem Iod für diagnostische und therapeutische Verwendungen in vivo hat jedoch eindeutige Nachteile. ¹²³I, das nützlichste Isotop in vivo, ist sehr teuer ($ 45,30/mCi) und muss in einem Zyklotron hergestellt werden. Dieses Isotop hat weiterhin eine Halbwertszeit von nur 13,2 Stunden und erfordert somit, dass es an einem Ort hergestellt wird; der in geographischer Nähe zu dem Ort liegt, an dem ein jegliches radiiodiertes bildgebendes Agens verwendet werden muss. Andere Radioisotope, wie beispielsweise ^99mTc und ¹⁸⁸Re werden für diagnostische bzw. therapeutische Verwendungen bevorzugt. Zum Beispiel ist ^99mTc nicht teuer ($ 0,50/mCi), leicht erhältlich (in einem Generator aus ⁹⁹Mo, einem Reaktorprodukt, hergestellt) und weist eine für die bildgebende Darstellung mit einer Gammakamera ideale Gamma-Emissionsenergie auf.
Einige Peptide enthalten entweder direkt Reste, die die direkte Bindung von Radiometallen, wie beispielsweise ^99mTc und ¹⁸⁸Re, an das Peptid erlauben, oder sind ihrer Einführung zugänglich. Zum Beispiel enthalt Somatostatin eine Disulfidbindung, die nach einer Reduktion zwei sulfhydrylhaltige Cystein-Seitenketten bereitstellt, die ^99mTc direkt binden können. Siehe US-Patent Nr. 5,225,180 . Siehe auch WO 94/28942 , WO 93/21962 und WO 94/23758 . Jedoch neigen Komplexe dieser Art dazu, heterogen und instabil zu sein, was ihre klinische Nützlichkeit begrenzt. Darüber hinaus begrenzt die Verwendung von freien Sulfliydrylen auf diese Weise die Radiometalle, die verwendet werden können, um das Peptid zu markieren, auf diejenigen, die freie S-H-Gruppen fest binden. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht in dem Problem, dass die direkte Bindung des Metalls an eine Aminosäurenseitenkette die Peptidkonformation stark beeinflussen und dadurch die Rezeptorbindungseigenschaften der Verbindung nachteilig verändern kann.
Die meisten Peptide enthalten entweder kein Metall-bindendes Aminosäuresequenzmotiv oder sind aus verschiedenen Gründen, wie beispielsweise den oben beschriebenen, nicht den geeigneten Sequenzmodifikationen zugänglich, die die Einführung von einem solchen Motiv erlauben würden. Es muss daher irgendein Mittel in das Peptid eingeführt werden, das das Peptid in die Lage versetzt, Radiometalle zu binden. Ein bevorzugter Ansatz besteht darin, einen metallbindenden Liganden an einer spezifizierten Stelle innerhalb des Peptides zu befestigen, so dass ein einzelner, definierter, stabiler Komplex gebildet wird. Die zum Binden von Metallen verwendeten Liganden enthalten oft eine Vielzahl von Heteroatomen, wie beispielsweise Stickstoff, Schwefel, Phosphor und Sauerstoff, die eine hohe Affinität für Metalle aufweisen. Zum Beispiel betrifft US 5,449,761 Metall-bindende targetierte Polypeptidkonstrukte, die ein Kohlenwasserstoffrückgrat enthalten, das mit wenigstens zwei Einheiten verbunden ist, von denen jede einen -N-C(=S)-Teil und ein Peptid umfasst. Darüber hinaus offenbart WO 96/40756 den Radiometall-Bindungsteil PtscGC, wie in den Referenzbeispielen der vorliegenden Anmeldung definiert, der einen Thioharnstoff, ein Glycin- und einen Cystein-Rest umfasst, wobei der Bindungsteil mit LHRH-Peptidanaloga verbunden ist.
Chelate wurden herkömmlich nach einer unabhängigen Synthese des Peptid- und des Chelatteils über kovalente Verbindungen am N-Terminus eines Peptides oder Peptidanalogons befestigt. Zum Beispiel haben Maina et al. die Kopplung eines Tetraamin-Chelators an den N-Terminus eines Somatostatin-Analogons beschrieben, die das Markieren des Peptides mit ^99mTc gestattet. Siehe J. Nucl. Biol. Med. 38:452 (1994). Die Kopplung auf diese Weise ist jedoch nicht wünschenswert, wenn der N-Terminus des Peptides für die Rezeptorbindungseigenschaften des Peptids eine wichtige Rolle spielt. Dementsprechend ist die Anwendung dieses Verfahrens durch das Erfordernis begrenzt, dass der N-Terminus des Peptides die Anwesenheit eines (gewöhnlich sterisch sperrigen) Chelators verträgt, ohne dass dies die Bindungseigenschaften des Peptides nachteilig beeinflusst.
Alternativ wurden chelatbildende Agenzien mittels ortsselektiver Reaktionen, an denen bestimmte Aminosäurereste beteiligt sind, in Peptidseitenketten eingeführt. Zum Beispiel wurde der Lysinrest an der Position 6 von LHRH direkt mit einer chelatbildenden Gruppe acyliert. Siehe Bajusz, S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6313 (1989). Dieses Verfahren ist von Natur aus durch das Fehlen einer verfügbaren chemischen Selektivität beschränkt, wenn mehr als eine Seitenkette potentiell mit dem Chelator reagieren kann, oder wenn die Peptidsequenz keine Aminosäure enthält, die auf diese Weise derivatisiert werden kann. Eine weitere Beschränkung dieses Ansatzes kann entstehen, wenn mehrzähnige Liganden verwendet werden. Ein einzelnes Ligandenmolekül kann mit mehreren Peptidmolekülen reagieren, was zur Bildung von erheblichen Mengen quervernetzter Produkte führt.
Chelatbildende Agenzien wurden an der Seitenkette eines Peptides durch tris-Aminosäuren eingeführt, wie von Dunn T. J. et al. WO 94/26294 beschrieben wurde. Dieses Verfahren stellt kein Verfahren zum Zyklisieren der Peptide bereit. Die Seitenkettenschutzgruppen, die verwendet werden, um den in dieser Arbeit beschriebenen Liganden einzuführen, sind die gleichen wie diejenigen, die typischerweise für eine Peptid-Amid-Zyklisierung verwendet werden. Siehe Felix et al. Int. J. Peptide Protein Res. 32:441 (1988).
Ein vollständig geschütztes chelatbildendes BAT (bis-Aminothiol)-Agens wurde synthetisiert und an die Seitenkette eines Lysinrestes gekoppelt, der anschließend in ein Peptid eingebaut werden konnte. Siehe Dean et al. WO 93/25244 . Diese vollständig geschützten Vorläufer sind sehr zeitaufwändig, teuer und mühsam herzustellen. Die Schwierigkeiten und Kosten beim Herstellen solcher Vorläufer machen dieses Verfahren für das Herstellen einer diversen Reihe von an einer Vielzahl von Linker befestigten Liganden, die benötigt wird, um ein metalltragendes targetierendes Agens zu konzipieren, unbrauchbar.
Eine potentielle Lösung dieses Problems besteht darin, eine Schutzgruppenstrategie zu verwenden, die eine selektive Kopplung eines Chelatorteils an spezifizierte Positionen innerhalb einer Peptidkette erlaubt. Die Diversität der chemischen Reaktivitäten, die innerhalb der Aminosäureseitenketten eines Peptides vorhanden sind, führte jedoch zu Schwierigkeiten beim Erreichen einer ausreichenden Selektivität bei der ortsspezifischen Entschützung von Schutzgruppen. Dieser Mangel an Selektivität hat auch vordem Bemühungen behindert, zwei oder mehr als zwei unterschiedliche funktionelle Gruppen innerhalb eines Peptides selektiv zu entschützen, um die Kopplung dieser Gruppen, beispielsweise in einem zyklischen Peptid, zu erlauben.
Edwards et al. J. Med. Chem. 37:3749 (1994) haben ein Fragmentverfahren zum Zusammensetzen eines zyklischen Disulfides auf einem Harz mit einer nachfolgenden Befestigung eines intakten Liganden (DTPA) offenbart. Dieser Ansatz ergab das bekannte Somatostatin-targetierende Agens DTPA-Octreotid. Dieser Ansatz wurde spezifisch für die Herstellung einer bekannten Verbindung konzipiert. Eine typischere Situation erfordert jedoch, dass eine Vielzahl von markierten Peptiden, um die Bindung an ein bestimmtes Ziel zu optimieren. In einer solchen Situation ist daher ein breiterer Ansatz erforderlich, der das Zusammensetzen zahlreicher Liganden erlaubt, die am besten in Fragmenten zusammengesetzt und an einen jeglichen erwünschten Punkt in einer Sequenz platziert werden, die ebenfalls an einer Vielzahl von Positionen in der Peptidsequenz zyklisiert werden kann.
Zusätzliche Erwägungen bei der Synthese von Peptiden, die selektiv Metalle binden können, umfassen die Wirkung des Chelates auf die Konformation des Peptides. Die meisten Peptide sind hinsichtlich ihrer Konformation hochgradig flexibel, wohingegen eine effiziente Rezeptorbindung gewöhnlich erfordert, dass ein Peptid eine spezifische Konformation einnimmt. Ob das Peptid diese spezifische Konformation annehmen kann oder nicht, wird in einem hohen Ausmaß von der Ladung und von hydrophilen/hydrophoben Wechselwirkungen beeinflusst, die die Wirkungen eines kovalent befestigten Metall-chelatbildenden Teils umfasst. Es ist möglich, die Peptidrezeptoraffinität und -selektivität durch das Begrenzen der Konformationen, die das Peptid annehmen kann, zu verstärken, bevorzugterweise durch das Einschließen des Peptides in eine aktive Konformation. Dies wird oft am einfachsten durch das Herstellen zyklischer Peptide erreicht. Zyklische Peptide haben den zusätzlichen Vorteil einer erhöhten Resistenz gegen Proteasen und zeigen daher häufig eine längere biologische Halbwertszeit als ein entsprechendes lineares Peptid.
Peptide können durch eine Vielzahl von Verfahren zyklisiert werden, wie beispielsweise die Bildung von Disulfiden, Sulfiden und insbesondere durch die Lactambildung zwischen Carboxyl- und Aminofunktionen der N- und C-Termini oder Aminosäureseitenketten. Jedoch bedeutet die Unmenge an Funktionalität innerhalb einer Peptidkette typischerweise, dass bei allen, außer den kürzesten Peptiden, eine selektive Kopplung zwischen zwei erwünschten funktionellen Gruppen innerhalb eines Peptides sehr schwer zu erreichen ist.
Es ist daher offenkundig, dass zyklische Peptide, die Metallionen chelatisieren können, während sie die Fähigkeit beibehalten, mit hoher Affinität spezifisch an einen Rezeptor zu binden, in hohem Maße zu erwünschen sind. Es ist auch wünschenswert, ein Mittel zum Befestigen eines chelatbildenden Teils an einer jeglichen vorbestimmten Position innerhalb eines Peptides und ein Mittel zum selektiven Bilden zyklischer Peptide zwischen jeglichen zwei vorbestimmten Positionen innerhalb einer Peptidkette zu haben. Zusätzlich ist es wünschenswert, Zugang zu einem Verfahren zu haben, das einem chelatbildenden Teil erlauben würde, während einer jeglichen erwünschten Phase während einer Peptidsynthese an ein Peptid gekoppelt zu werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Peptide bereitzustellen, die Radionuklide binden können, während sie die Fähigkeit beibehalten, spezifisch an den Peptidrezeptor zu binden. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, Verfahren zum Herstellen und radioaktiven Markieren von Peptiden bereitzustellen, die Radionuklide binden können, während sie die Fähigkeit beibehalten, spezifisch an den Peptidrezeptor zu binden. Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, die radioaktiv markierten Peptide zur Herstellung von diagnostischen und therapeutischen Zusammensetzungen für die bildgebende Darstellung oder für das Behandeln eines Tumores, einer infektiösen Läsion, einer Myocardinfarzierung, eines Blutgerinnsels, eines atherosklerotischen Plaques oder eines normalen Organs oder Gewebes zu verwenden.
Zum Erreichen der vorerwähnten Ziele der Erfindung wurde gemäß einem Aspekt der derzeitigen Erfindung ein Peptid umfassend einen Radiometall-Bindungsteil bereitgestellt, wobei der Bindungsteil die Struktur I umfasst:
wobei R¹, R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C₁-C₆-Alkyl, substituiertem C₁-C₆-Alkyl, Cycloalkyl, substituiertem Cycloalkaly, Heterocycloalkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Alkaryl und einer Schutzgruppe, die unter den Bedingungen einer Peptidsynthese entfernt werden kann, mit der Maßgabe, dass wenigstens R¹, R² oder R³H ist. R⁵, R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ sind unabhängig ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, C₁-C₆-Alkyl, substituiertem C₁-C₆-Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl, und R⁴ und R⁶ bilden zusammen eine direkte Bindung aus. R⁸ und R⁹ können zusammen oder R⁷ und R⁹ können zusammen einen Cycloalkyl- oder substituierten Cycloalkylring ausbilden, und NR¹⁰ ist am N-Terminus des Peptids oder an einer Aminosäureseitenkette des Peptides angeordnet.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist R¹H, R³H, R⁴H, oder R⁴ und R⁶ bilden zusammen eine direkte Bindung aus. In anderen bevorzugten Ausführungsformen ist R² ein C₁-C₆-Alkyl oder substituiertes oder ein ursubstituiertes Phenyl oder bevorzugtererweise Methyl oder Phenyl. In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind R⁸ und R⁹ Methyl.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung umfassen die Peptide weiterhin ein gebundenes Metallatom. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Metallatom ^99mTc, ¹⁸⁶Re oder ¹⁸⁸Re.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum, Herstellen einer Metall-chelatbildenden Zusammensetzung bereitgestellt, wobei eine Lösung eines Peptides, das einen Radiometall-Bindungsteil umfasst, mit Zinnionen kontaktiert wird, wobei der Bindungsteil die oben dargestellte Struktur aufweist, gefolgt vom Kontaktieren der Lösung mit einem Radionuklid und dem Aufbereiten des radioaktiv markierten Peptides. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist das Radionuklid ¹⁸⁸Re- oder ¹⁸⁶Re-Perrhenat oder ⁹⁹Tc-Pertechnetat.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung wird die Verwendung von radioaktiv markierten Peptiden zur Herstellung von diagnostischen Zusammensetzungen zur bildgebenden Darstellung eines Tumors, einer infektiösen Läsion, einer Myocardinfarzierung, eines Blutgerinnsels, eines atherosklerotischen Plaques oder eines normalen Organes oder Gewebes bereitgestellt, umfassend das Verabreichen eines radioaktiv markierten Peptides an einen menschlichen Patienten, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, und, nach einer Zeit, die ausreichend ist, dass das radioaktiv markierte Peptid sich lokalisiert und dass der Nicht-Zielhintergrund geklärt wird, werden die Stelle oder die Stellen der Akkretion des radioaktiv markierten Peptides durch eine externe bildgebende Kamera nachgewiesen, wobei das radioaktiv markierte Peptid durch das Kontaktieren einer Lösung von einem Peptid mit Zinnionen hergestellt wird, wobei das Peptid einen Radiometall-Bindungsteil aufweist, der die oben dargestellte Struktur aufweist, und anschließend das Kontaktieren der Lösung mit einem Radionuklid und das Aufbereiten des radioaktiv markierten Peptides.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung werden Peptide bereitgestellt, die eine Struktur aufweisen, die aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus:
wobei (Chel) ein Radiometall-Bindungsteil ist, der die oben dargestellte Struktur aufweist.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung stellt neue chelatbildende Teile bereit, die kovalent mit Peptiden, zyklischen Peptiden und Peptidanaloga verbunden sein können. Die chelatbildenden Teile erlauben es den Peptiden, zyklischen Peptiden und Peptidanaloga, stabil Metalle zu binden, insbesondere Radiometalle. Es werden auch Verfahren zum Herstellen dieser Chelatoren, Peptide und Peptidanaloga bereitgestellt. Die Peptide und Peptidanaloga werden durch das ortsspezifische Einführen der Metall-chelatbildenden Teile in Peptide hergestellt, die durch Festphasen- oder Flüssigphasen-Verfahren synthetisiert werden. Die chelatbildenden Teile können an einer amintragenden Seitenkette einer Aminosäure innerhalb der Peptidkette oder am N-Terminus des Peptides befestigt werden. Peptide gemäß der Erfindung umfassen zyklische Metall-bindende Analoga von LHRH, vasoaktivem intestinalen Peptid (VIP), den Heregulinen (erbB-bindenden Peptide) α, β1, β2, und β3, Melanotropin (α-MSH), Somatostatin, Calciton, epidermalem Wachstumsfaktor, Gonadotropin freisetzendem Hormon, Hereguline-Wachstumsfaktor freisetzendem Hormon, Dynorphin, Calcitonin-Genverwandtes Peptid, Vasotocin, Mesotonin, adrenocorticotropem Hormon, Corticotropin, Gonadotropin, Prolactin, Vasopressin, Oxytocin, Substanz P, Substanz K und Angiotensin.
Die chelatbildenden Teile sind durch die allgemeine Formel I dargestellt:
wobei R¹, R² und R³ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H, C₁-C₆-Alkyl, substituiertem C₁-C₆-Alkyl, Cycloalkyl, substituiertem Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Alkaryl und einer Schutzgruppe besteht, die unter den Bedingungen einer Peptidsynthese entfernt werden kann. Wenigstens R¹, R² oder R³ muss H sein. R⁵, R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ sind unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die aus H, C₁-C₆-Alkyl, substituiertem C₁-C₆-Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl besteht. R⁴ und R⁶ bilden zusammen eine direkte Bindung aus, und R⁸ und R⁹ können zusammen oder R⁷ und R⁹ können zusammen auch einen Cycloalkyl- oder substituierten Cycloalkylring ausbilden. NR¹⁰ ist am N-Terminus des Peptides angeordnet, an dem der Chelator befestigt ist, oder ist an einer Aminosäureseitenkette des Peptides angeordnet. Wenn R¹, R², R⁵ oder R⁶ eine durch ein Heteroatom substituierte Funktion trägt, kann das Heteroatom ebenfalls verwendet werden, um zusätzliche Peptidkopplungsreaktionen auszuführen.
Beispiele für C₁-C₆-Alkylgruppen umfassen ein Methyl, Ethyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl, i-Butyl, s-Butyl, t-Butyl, n-Pentyl, i-Pentyl und n-Hexyl. Cycloalkyl umfasst C₃-C₆-Cycloalkyl wie beispielsweise Cyclohexyl. Heterocycloalkyl umfasst Tetrahydrofuran, Tetrahydropyran, Pyrrolidin und Piperidin. Heteroaryl umfasst Pyrrolyl, Furanyl, Thienyl, Imidazolyl, Oxazolyl, Oxazolylthio, Thiazolyl, Pyrazolyl, Pyrrolidinyl, Pyridinyl, Pyrimidinyl, Morpholinyl und Piperizinyl. Aryl umfasst C₆-C₁₂-Alkyl, wie beispielsweise Phenyl, α-Naphthyl oder β-Naphthyl.
Alkaryl umfasst: C₆-C₁₂ArylC₁-C₆-Alkyl wie beispielsweise PhenylC₁-C₆-Alkyl oder α- oder β-Naphthyl C₁-C₆Alkyl wie beispielsweise Benzyl, Phenylethyl, Phenylpropyl, Phenylbutyl, Phenylpentyl, α- oder β-Naphthylmethyl, Naphthylethyl, Naphthylpropyl, Naphthylbutyl oder Naphthylpentyl.
Beispiele für Substituentengruppen umfassen: C₁-C₆-Alkoxy, zum Beispiel Methoxy, Ethoxy, Propoxy; C₁-C₆-Alkylthio, z. B. Methylthio, Ethylthio, Propylthio; C₆-C₁₂ArylC₁-C₆Alkoxy, z. B. PhenylC₁-C₆-Alkoxy wie beispielsweise Benzyloxy; Aralkylthio, z. B. PhenylC₁-C₆-Alkylthio wie beispielsweise Benzylthio; Amino, substituiertes Amino, z. B. C₁-C₆-Alkylamino wie beispielsweise Methylamino, Ethylamino; C₆-C₁₂ArylC₁-C₆Alkyl wie beispielsweise PhenylC₁-C₆-Alkyl, z. B. Benzyl; C₆-C₁₂Aryl, wie beispielsweise Phenyl; C₃-C₈-Cycloalkyl wie beispielsweise Cyclohexyl; und C₃-C₈-CycloalkylC₁-C₆Alkyl wie beispielsweise Cyclohexylmethyl.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung umfassen Verbindungen, wobei R²H, Methyl oder Phenyl ist, und wobei R⁸ und R⁹ Methyl sind. Andere bevorzugte Ausführungsformen liegen vor, wenn R¹, R³, R⁵, R⁷ und R¹⁰H sind.
Die Peptide können unter Verwendung von differentiell geschützten bis-Aminosäurederivaten synthetisiert werden, bei denen jede Aminofunktion selektiv entschützt sein kann. Diese Derivate werden in eine wachsende Peptidkette während einer Peptidsynthese durch herkömmliche Methodiken der Peptidkopplung eingeführt. Eine der Aminofunktionen wird anschließend selektiv entschützt, was die nachfolgende Kopplung von entweder dem ganzen oder einem Teil eines chelatbildenden Moleküls erlaubt, oder das Hinzufügen von weiteren Aminosäureresten erlaubt, um die Peptidsynthese weiterzuführen. Die Peptidsynthese kann durch die Kopplung an die α-Aminogruppe weitergeführt werden, was zu einem Peptid mit einem herkömmlichen Amid-Rückgrat führt, oder durch die Kopplung an die Seitenketten-Aminogruppe, um ein Peptid herzustellen, dessen Amid-Rückgrat durch die Seitenkettenstruktur unterbrochen ist. Alternativ kann die freie Aminofunktion verwendet werden, um mit einer reaktiven Funktionalität zu zyklisieren, die an einer anderen Stelle im Peptid angeordnet ist, wodurch ein zyklisches Peptid hergestellt wird. Geeignete bis-Aminosäuren werden für den Fachmann auf dem Gebiet leicht offenkundig sein und umfassen Lysin, Ornithin und 2,3-Diaminopropionsäure (Aminoserin). Alternativ kann der chelatbildende Teil am Ende der Peptidsynthese durch die Kopplung des chelatbildenden Teils an den entschützten N-Terminus des an Harz gebundenen Peptides eingeführt werden. Der chelatbildende Teil kann als vollständige Einheit in geschützter oder ungeschützter Form hinzugefügt werden, oder er kann schrittweise synthetisiert werden, um die vollständige chelatbildende Struktur aufzubauen.
Bei der vorliegenden Erfindung verwendete bis-Aminosäuren können allgemein durch die Formel: ZHN-CH(-R-NHY)-CO₂H dargestellt sein, wobei R (CH₂)_n oder (CH₂)-X-(CH₂)_n ist, wobei X ein Heteroatom wie beispielsweise O, S oder N und n = 1 – 20 ist. Alternativ können die Wasserstoffatome der CH₂-Gruppen durch C₁-C₆-Alkyl, substituiertes C₁-C₆-Alkyl oder Alkenylgruppen oder zyklische oder heterozyklische Ringe wie beispielsweise Cyclohexan, Benzol und Piperidin oder andere dem Fachmann wohl bekannte Gruppen ersetzt sein. Die Substituenten Z und Y können unabhängig H, N, C₁-C₆-Alkyl, substituiertes C₁-C₆-Alkyl, Aryl oder substituiertes Aryl sein.
Wenn die Peptidsynthese weitergeführt wird, kann eine selektive Entschützung der zweiten Aminogruppe der bis-Aminosäure an einem jeglichen Punkt während der Peptidsynthese erreicht werden, um den chelatbildenden Teil einzuführen. Der vollständige chelatbildende Teil kann vor der Kopplung an das Peptid synthetisiert werden, oder er kann durch die sequenzielle Kopplung von Segmenten an das Peptid synthetisiert werden. Wenn das Zusammensetzen der gesamten Peptid-/Chelator-Struktur erst einmal vollständig ist, ergeben Abspaltung, Entschützung und Aufreinigung das erwünschte Peptidderivat. Dieses Derivat wird anschließend mit einem Radiometall zur Verwendung bei radiodiagnostischen und radiotherapeutischen Anwendungen markiert.
Wenn alternativ zuerst das ganze oder ein Teil des chelatbildenden Moleküls an die entschützte Aminogruppe gekoppelt wird, besteht der zweite Schritt darin, die andere Aminogruppe zu entschützen und die Peptidsynthese weiterzuführen. Wenn in dieser Phase nur ein Teil des Chelatorteils an das Peptid gekoppelt wird, kann die Synthese des Chelators an einem jeglichem Punkt während oder nach der Synthese der Peptidkette durch geeignete Entschützungs- oder Kopplungsreaktionen vollendet werden. Die letzten Abspaltungs-, Entschützungs- und Aufreinigungsschritte ergeben wiederum das reine Peptidderivat, das dann wie vorher radioaktiv markiert wird.
Die Befestigung des Chelators an dem Peptid vor der Abspaltung von dem Harz führt zu einer verringerten Bildung von quervernetzten Produkten, selbst wenn mehrzähnige aktivierte Chelatoren wie beispielsweise DTPA-Dianhydrid verwendet werden.
Die Herstellung von zyklischen Peptiden wird durch eine selektive Entschützung von zwei kompatiblen funktionellen Teilen an spezifizierten Positionen der Peptidsequenz, gefolgt von der Zyklisierung zwischen den kompatiblen Teilen, erreicht. Die Zyklisierung kann zwischen jeglichen zwei Punkten der Peptidsequenz erreicht werden, einschließlich zwischen dem N- und C-Terminus, zwischen einem Terminus und einer internen funktionellen Gruppe innerhalb der Peptidsequenz oder zwischen zwei internen funktionellen Gruppen. Die Zyklisierung kann unter Verwendung entweder von Flüssigphasen- oder Festphasen-Peptidsynthesen erreicht werden, wird aber bevorzugterweise unter Verwendung von Festphasen-Techniken ausgeführt.
Die Entschützung und Zyklisierung kann an einem jeglichen Punkt während der Synthese des Peptides vor den letzten Entschützungsreaktionen durchgeführt werden. Z. B. kann die gesamte geschützte Peptidsequenz vor der Zyklisierung hergestellt werden, oder die Zyklisierung kann mit einem geschützten Peptidzwischenprodukt durchgeführt werden, gefolgt von der Vollendung der Synthese. In ähnlicher Weise kann die Zyklisierung entweder bevor oder nachdem der ganze oder ein Teil des Metall-chelatbildenden Teils an das Peptid gekoppelt wird, ausgeführt werden. Die Verwendung eines photospaltbaren oder eines anderen Harzes, das Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist, mit einem Festphasen-Peptid-Synthesizer erlaubt auch die Freisetzung eines geschützten Peptides von einem festen Träger mit einer nachfolgenden selektiven Entschützung und Zyklisierung in der Flüssigphase. Alternativ können die zu zyklisierenden Seitenketten vor der Abspaltung von dem Harz selektiv entschützt werden, und die Zyklisierung kann in der Flüssigphase ausgeführt werden.
Reaktionen, an denen der C-Terminus des Peptides beteiligt ist, und die Zyklisierungsreaktionen umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, können durch die Freisetzung eines geschützten Peptides von dem Harz auf die oben beschriebene Weise ausgeführt werden. Alternativ kann die wachsende Peptidkette an das Harz über die Seitenkette eines Restes befestigt und die C-terminale Carboxylgruppe in geeigneter Weise geschützt sein. Wenn eine Reaktion mit der C-terminalen Carboxylgruppe erwünscht ist, wird sie selektiv entschützt und der Reaktion gestattet, fortzuschreiten. Im Fall von Zyklisierungsreaktionen kann die Entschützung des C-Terminus vor, während oder nach der selektiven Entschützung der kompatiblen reaktiven Gruppe erreicht werden.
Die Radiometall-chelatbildenden Peptide der vorliegenden Erfindung halten Radionuklid im Blut und in anderen Körperflüssigkeiten und -geweben stabil zurück. Sowohl die Reagenzien als auch die Bedingungen des vorliegenden Verfahrens sind im Vergleich zu denjenigen im Stand der Technik stark vereinfacht, und die markierten Peptide sind für die Herstellung von Zusammensetzungen für radiodiagnostische und Radiotherapie-Anwendungen unter Verwendung von Technetium- oder Rheniummarkieren besonders geeignet.
Der oben umrissene Ansatz erlaubt die Platzierung eines Radiometall-Bindungsteils an einer jeglichen Stelle in einer Peptidsequenz. Das Platzieren des chelatbildenden Teils an einer Aminosäureseitenkette, entweder direkt oder über eine Abstandhalter-Gruppe, und nicht am N-Terminus eines Peptides, hat den zusätzlichen Vorteil des räumlichen Entfernen des Metallkomplexes von dem Peptidrückgrat, wodurch die Wirkung des Metallkomplexes auf die Peptidkonformation minimiert wird. Dies erlaubt auch, dass der N-Terminus des Peptides zum Zyklisieren des Peptides verwendet wird, falls dies notwendig ist.
Es ist bekannt, dass die Peptidkonformation stark durch Ladung und hydrophile/hydrophobe Wechselwirkungen beeinflusst wird, und es ist daher wichtig, diese Variablen zu berücksichtigen, wenn man einen chelatbildenden Liganden konzipiert, der in Peptiden verwendet werden soll. Es wird bevorzugt, dass eine Vielzahl von chelatbildenden Komplexen von unterschiedlicher Ladung und Hydrophilie, die Abstandhalter-Gruppen unterschiedlicher Längen enthält, hergestellt und untersucht wird, um das metallkomplexierte Peptid auszuwählen, das die optimale Kombination von Ziel-Selektivität, Pharmakokinetiken und Chelatstabilität zeigt. Der Fachmann auf dem Gebiet wird anerkennen, dass ein solches Untersuchen auf dem Gebiet Routine darstellt.
Die radioaktiv markierten Peptide der vorliegenden Erfindung binden spezifisch an eine erkrankte Zelle oder ein erkranktes Gewebe, die/das sowohl eine hohe Rezeptordichte als auch eine hohe Affinität zu dem Peptid zeigt. Die Radioaktivität des Radionuklides erlaubt eine Diagnose und/oder Behandlung des Tumors oder des erkrankten Gewebes. Die Erfindung umfasst auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge wenigstens eines der radioaktiv markierten Peptide der Erfindung umfassen, in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen sterilen Vehikel, wie z. B. in Remington's Pharmaceutical Sciences; Drug Receptors and Receptor Theory, 18. Ausg., Mack Publishing Co., Eason, PA (1990) beschrieben ist. Die Erfindung umfasst auch Kits zum Markieren von Peptiden, die in einer klinischen Umgebung bequem und einfach zu verwenden sind.
A. Konzeption und Synthese von linearen Peptiden, die chelatbildende Teile umfassen
(i) Im Allgemeinen
Die Peptide der Erfindung enthalten wie in Anspruch 1 definierte Radiometall-chelatbildende Aminosäurederivate, die durch die Anwesenheit von wenigstens einer Thiol- oder wenigstens einer Thiocarbonylgruppe, und von wenigstens einem Stickstoff, der entweder als tertiäres Amin, als Hydrazon oder als sekundäres Amid oder Hydrazid vorliegt, gekennzeichnet sind. Die Schwefel- und Stickstoffatome sind in geeigneter Weise angeordnet, um einen mehrzähnigen Liganden zu bilden, der in der Lage ist, fest und bevorzugt ein Metallion zu binden. Der mehrzähnige Ligand kann auch eine Abstandhalter-Gruppe enthalten, die dazu dient, das chelatisierte Metall vom Rest des Peptides zu trennen. Das Metallion ist bevorzugterweise ein reduziertes Radionuklid und in einer bevorzugten Ausführungsform ^99mTc, ¹⁸⁶Re oder ¹⁸⁸Re.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Platzieren von Liganden für andere Metalle an einen jeglichen Punkt in einer Peptidsequenz bereit. Diese Liganden können intakt, z. B. DTPA, oder als Fragmente eingeführt werden. Auf diese Weise können Liganden für andere Metalle von medizinischem Interesse in eine peptidtargetierende Sequenz platziert werden, die In, Ga, Y, Cu, Pt, Mn, Gd, Au, Ag, Hg und Lu umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Das Verfahren erlaubt die Einführung eines jeglichen Metall-Chelates oder -Chelatfragmentes, das für eine Peptidsynthese in geeigneter Weise geschützt ist. Das Verfahren stellt auch ein Verfahren für die Einführung von basenempfindlichen Ligandenderivaten bereit, die an einen jeglichen Punkt in der Peptidsequenz platziert werden können, solange sie am Ende der Synthese eingeführt werden. Ein Referenzbeispiel ist die Synthese eines Liganden, der unter Verwendung des folgenden Ligandenfragmentes: Trityl-S-COOH₂N(Boc)CH₂CO₂H an der Seitenkette von Lysin befestigt wird. Der S-Tritylester wird für Base empfindlich sein, so dass es nicht möglich wäre, dieses Ligandenfragment an einem früheren Punkt in der Synthese an dem Peptid zu platzieren.
Jeder der chelatbildenden Teile der Erfindung kann durch Verfahren hergestellt werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der organischen Synthese wohl bekannt sind. Die chelatbildenden Teile werden aus Untereinheiten konstruiert, die durch einfache Kopplungs- oder Kondensationsreaktionen miteinander verbunden werden, wie beispielsweise der Kondensation von einer Amino-, Hydrazinn- oder Hydrazidofunktion mit einer aktivierten Carboxylgruppe, der Kopplung von Hydrazinn mit Aldehyden oder der reduktiven Aminierungsreaktionen zwischen Aminen und Aldehyden. Wie hierin verwendet, soll der Begriff „Kondensation” Reaktionen umfassen, die Untereinheiten des chelatbildenden Teils zusammenkoppeln, und er umfasst daher zusätzlich zu Reaktionen, die im Einklang mit der klassischen Definition einer Kondensierungsreaktion stehen, Reaktionen wie beispielsweise eine reduktive Aminierung.
Nach einer Kondensationsreaktion können zusätzliche funktionelle Gruppen auf der Untereinheit entschützt werden, um zusätzliche Kondensationsreaktionen zu erlauben. Zum Beispiel kann eine zweite Untereinheit, die eine freie Carboxylgruppe und eine geschützte Aminofunktion trägt, mit einer Amino-, Hydrazinn- oder Hydrazido-Funktion auf einer ersten Untereinheit kondensiert werden, um ein größeres, in geeigneter Weise geschütztes Fragment des Metall-bindenden Liganden herzustellen. Die Aminofunktion auf dem zweiten Untereinheitsteil kann anschließend entschützt und weiter an eine dritte Untereinheit gekoppelt werden. Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass der Begriff „Fragment” eine Untereinheit oder eine Zusammensetzung von Untereinheiten umfasst, die den gesamten oder einen Teil des Metall-bindenden Liganden umfasst.
Verfahren zum Aktivieren von Carboxylgruppen für solche Kondensationsreaktionen sind Fachleuten auf dem Gebiet der organischen Synthese und der Peptidsynthese wohl bekannt und umfassen die Verwendung von aktiven Estern und von Carbodiimid- und Phosphorylazid-Kopplungsagenzien. Geeignete Schutzgruppen werden für den Schutz von Funktionen auf den Untereinheiten verwendet, wenn die Reaktivität der Funktionen nicht mit einer Reaktion kompatibel ist, die verwendet wird, um die Untereinheiten zu verbinden, oder mit Reaktionen, die für die Synthese der Peptidkette verwendet werden. Schutzgruppen für Mercapto-, Amino- und Carboxylsäure-Funktionen sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Siehe zum Beispiel Greene, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley Interscience, NY, 1981). Die zum Konstruieren des Chelates verwendeten Untereinheiten werden entweder leicht durch auf dem Gebiet wohl bekannte Verfahren hergestellt oder sind kommerziell von Anbietern, wie beispielsweise Advanced ChemTech (Lexington, KY), Milligen (Burlington, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA) oder Aldrich Chemical Corp. (Milwaukee, WI) erhältlich.
Die Kondensationsreaktionen, die verwendet werden, um die Chelator-Untereinheiten miteinander zu verbinden, können entweder vor der Peptidsynthese oder während der Synthese der Peptidsequenz ausgeführt werden. Wenn das Aminosäurederivat aus seinen Untereinheiten vor der Peptidsynthese zusammengesetzt wird, müssen α-Amino- und α-Carboxylfunktionen in geeigneter Weise auf eine Weise geschützt sein, die nachfolgend mit der selektiven Entschützung und Aktivierung dieser Funktionalitäten für die Peptidsynthese kompatibel ist. Beispiele für solche Schutzgruppen sind auf dem Gebiet wohl bekannt und umfassen die Fluorenmethyloxycarbonyl (Fmoc)-, Benzyloxycarbonyl (Cbz)-, Butoxycarbonyl (Boc)-, Allyloxycarbonyl (Aloc)-, 4-Methoxytrityl (mtt)- und 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethyl (Dde)-Gruppen für den Amino-Schutz. Gruppen für den Carboxyl-Schutz umfassen die Methyl (Me)-, Benzyl (Bn)-, ^tButyl (^tBu)- bzw. Allylester.
Die Amino- und Carboxyl-Schutzgruppen müssen derart ausgewählt werden, dass jede Gruppe in der Anwesenheit der anderen selektiv entschützt werden kann. Solche Schutzteile nennt man orthogonal. Das Erfordernis, dass orthogonale Schutzgruppen verwendet werden, schließt z. B. die Verwendung der Cbz-Gruppe zum Schutz der Aminofunktion in der Anwesenheit einer Carboxylgruppe aus, die als Benzylester geschützt ist. Siehe Greene, oben. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die α-Aminogruppe in der Form einer Fmoc-Gruppe geschützt, und die α-Carboxylgruppe ist ein Methylester. Die in den Verbindungen der Erfindung verwendete Thiol-Schutzgruppe kann eine jegliche organische oder anorganische Gruppe sein, die unter milden Bedingungen leicht entfernt wird, um das freie Sulfhydryl in der Anwesenheit des Peptides zu regenerieren, ohne die Aktivität des Proteins wesentlich zu verändern. Geeignete Schutzgruppen sind in Greene, oben, S. 193–217, aufgeführt. Beispiele für geeignete Schutzgruppen umfassen substituierte und nichtsubstituierte Tritylgruppen, Thiolester, Thiocarbamate und Disulfide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Thiol-Schutzgruppe eine Tritylgruppe oder eine 4-Methoxytrityl-Gruppe. Fachleute auf dem Gebiet sind mit den Vorgehensweisen zum Schützen und Entschützen von Thiolgruppen vertraut. Zum Beispiel können Benzoatthioester unter milden und selektiven Bedingungen unter Verwendung von Hydroxylamin entschützt werden. Wenn das Zusammensetzen des geschützten chelatbildenden Teils erst einmal vollendet ist, wird die α-Carboxyfunktion entschützt und unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren der Peptidsynthese an den N-Terminus der Peptidkette gekoppelt. Siehe Bodanszky et al., THE PRACTICE OF PEPTIDE SYNTHESIS (Springer Verlag, Heidelberg, 1984).
Wenn das Metall-chelatbildende Aminosäurederivat während der Peptidsynthese aus seinen Untereinheiten zusammengesetzt wird, wird die Peptidkette durch herkömmliche Lösungsphasen- oder, bevorzugterweise, Festphasensynthese bis zu dem Punkt zusammengesetzt, an dem das Derivat einzubauen ist. Die differentiell geschützte bis-Aminosäure wird dann an den N-Terminus der Peptidkette gekoppelt. Eine nachfolgende selektive Entschützung einer der Aminogruppen des Derivates erlaubt es, dass entweder die Peptidsynthese oder die Chelatorsynthese weitergeführt wird.
Wenn zuerst die α-Aminofunktion entschützt wird, werden alle oder wird ein Teil der verbleibenden Aminosäurereste anschließend auf die herkömmliche Weise an die Peptidkette gekoppelt. Die Seitenkettenaminofunktion des Derivates wird anschließend entschützt, und der chelatbildende Teil wird wie oben beschrieben zusammengesetzt. Das vollständige Peptid kann anschließend entschützt und durch Standardverfahren aufgereinigt werden.
Wenn zuerst die Seitenkettenaminofunktion entschützt wird, wird der gesamte oder ein Teil des chelatbildenden Teils anschließend wie oben beschrieben zusammengebaut, gefolgt von der Entschützung der α-Aminogruppe. Die Peptidsynthese wird wie oben beschrieben auf die herkömmliche Weise vollendet.
Wenn die Peptidsynthese erst einmal abgeschlossen ist, wird das vollständig geschützte Peptid entschützt und aufgereinigt. Verfahren zur Entschützung und Aufreinigung synthetischer Peptide sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Siehe z. B. Bodanszky, oben. Wenn das Peptid durch Festphasentechniken synthetisiert wurde, muss das Peptid auch von dem als fester Träger für die Synthese verwendeten Harz abgespaltet werden. Verfahren zum Erreichen dieser Abspaltung sind auf dem Gebiet ebenfalls wohl bekannt. Verfahren zum Aufreinigen synthetischer Peptide, wie beispielsweise denjenigen der vorliegenden Erfindung, sind den Fachleuten auf dem Gebiet ebenfalls wohl bekannt. Solche Verfahren umfassen z. B. Innenaustausch-, Gelfiltrationschromatographie und Reversed-Phase-Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC). In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Peptid durch RP-HPLC unter Verwendung einer Octadecylsilan (C18)-Silica-Säulenpackung im präparativen Maßstab aufgereinigt, und in einem Gradienten von Acetonitril in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) eluiert. Die Reinheit des Peptides kann durch Standardverfahren, wie beispielsweise analytische RP-HPLC oder Kapillarelektrophorese, bestätigt werden. Die Identität des Peptides kann durch NMR-Spektroskopie oder, in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, durch Massenspektrometrie bestätigt werden.
Wie oben bemerkt wurde, ist es wichtig, dass der chelatbildende Teil nicht die Bindung des Peptides an den geeigneten Rezeptor stört. Das Bestimmen der Reste innerhalb des Peptides, die ohne das schädliche Beeinflussen der Rezeptorbindung ersetzt werden können, kann in einer systematischen und unkomplizierten Weise durch das Herstellen einer Reihe von Peptiden durchgeführt werden, in denen jeder aufeinanderfolgende Rest z. B. durch Alanin ersetzt ist (ein „Alanin-Scan”). Die alaninsubstituierten Peptide werden anschließend auf biologische Aktivität gescreent. Moderne Peptidsynthesizer machen die Synthese von Peptiden auf diese Weise ziemlich unkompliziert, und das Screenen einer großen Anzahl von Peptiden ist für den Fachmann Routine. Das Beibehalten einer hohen Rezeptorbindungsaffinität bei einem Peptid, das eine derartige Alaninsubstitution enthält, zeigt, dass die substituierte Aminosäure für die Rezeptorbindung weniger wichtig ist, und zeigt eine Position an, an die der Metall-bindende Rest platziert werden kann. Die Synthese von Peptiden, wobei ein Chelator an jeder dieser Positionen platziert wird, ist anschließend unkompliziert, und ein routinemäßiges Screenen stellt die optimale Position für den Chelator fest.
(ii) Herstellung von chelatbildenden Teilen
Der Chelator enthält eine Thiolgruppe zusammen mit einer Thiosemicarbazon-Gruppe und kann durch die allgemeine Formel I:
dargestellt werden, wobei R¹, R² und R³ unabhängig aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus H, C₁-C₆-Alkyl, substituiertem C₁-C₆-Alkyl, Cycloalkyl, substituiertem Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Alkaryl und einer Schutzgruppe besteht, die unter den Bedingungen einer Peptidsynthese entfernt werden kann. Wenigstens R¹, R² oder R³ muss ein H sein. R⁵, R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ sind unabhängig aus der Gruppe ausgewählt, die aus H, C₁-C₆-Alkyl, substituiertem C₁-C₆-Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl besteht. R⁴ und R⁶ bilden zusammen eine direkte Bindung aus, und R⁸ und R⁹ können zusammen oder R⁷ und R⁹ können zusammen ebenfalls einen Cycloalkyl- oder einen substituierten Cycloalkylring ausbilden. NR¹⁰ ist am N-Terminus des Peptides angeordnet, an dem der Chelator befestigt ist, oder ist an einer Aminosäureseitenkette des Peptides angeordnet. Wenn R¹, R², R⁵ oder R⁶ eine durch ein Heteroatom substituierte Funktion trägt, kann das Heteroatom auch verwendet werden, um zusätzliche Peptidkopplungsreaktionen durchzuführen.
Obwohl ein Verständnis des Mechanismus der Metallbindung durch die chelatbildenden Teile für das Ausführen der Erfindung nicht erforderlich ist, und ohne an eine jegliche Theorie gebunden sein zu wollen, glaubt man, dass das Metall an den Chelator über die zwei Schwefelatome plus die zwei Stickstoffatome gebunden ist. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass der α-Stickstoff der β-Thiol-haltigen Aminosäure und der zur Thiocarbonylgruppe distale Thiocarbazon-Stickstoff die Metall-bindenden Stickstoffe sind. Wenn das Metall reduziertes Radioperrhenat oder reduziertes Radiopertechnetat ist, stellen die zwei Schwefel- und zwei Stickstoffatome vier Koordinationspositionen auf dem Metall bereit.
Diese Verbindungen können durch Verfahren hergestellt werden, die auf dem Gebiet der organischen Synthese wohl bekannt sind. Somit können z. B. Verbindungen, die die Formel I aufweisen, durch Amidkopplung zwischen einem α-Carboxyl-geschützten Aminosäureteil, der eine geschützte oder ungeschützte β-Thiol-haltige Seitenkette (eine „Cystein-artige Aminosäure”) aufweist, und einem Carboxyl-haltigen Thiosemicarbazonteil hergestellt werden. Diese Kopplung kann unter Verwendung von wohl bekannten Verfahren, wie beispielsweise der Carbodiimid-vermittelten Kopplung, durchgeführt werden. Das Entschützen der α-Carboxylgruppe der Aminosäure erlaubt die Amidkopplung des chelatbildenden Teils an eine Aminoseitenkette oder den N-Terminus des Peptides. Alternativ kann zuerst eine N- und S-geschützte Cystein-artige Aminosäuregruppe, die eine β-Thiol-haltige Seitenkette aufweist, an das Peptid gekoppelt werden, gefolgt von N-Entschützung und Amidkopplung an einen Carboxyl-haltigen Thiosemicarbazonteil.
Cystein-artige Aminosäuren können durch Standardverfahren der Aminosäuresynthese hergestellt werden. Die Konfiguration am α-Kohlenstoff kann (R) oder (S) sein, oder die Aminosäure kann razemisch sein. In ähnlicher Weise kann die Konfiguration am β-Kohlenstoff, wenn dieses asymmetrisch substituiert ist, (R), (S) oder (R/S) sein. Die Aminosäure wird für nachfolgende Kopplungsreaktionen unter Verwendung von Standardverfahren geschützt.
Thiosemicarbazone können durch die Kondensation von Semicarbaziden mit Carbonylverbindungen hergestellt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Thiosemicarbazid mit Glyoxylsäure umgesetzt, um das entsprechende Thiosemicarbazon zu bilden.
(iii) Lineare, den VIP-Rezeptor targetierende Agenzien
Das natürlich vorkommende VIP weist die Sequenz:
auf.
Ein Alanin-Scan zeigte mehrere Reste, deren Ersatz durch Alanin die Rezeptorbindung nicht stark beeinflusst. Diese Reste umfassen Lys-15, Gln-16, Val-19, Lys-21, Asn-24, Ser-25 und den N- und C-Terminus. Diese Orte sind mögliche Stellen für die Befestigung eines Metall-bindenden Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung.
Chelatbildende Derivate auf der Grundlage der Befestigung des Metall-bindenden Liganden an diesen Positionen umfassen diejenigen, bei denen ein Metall-bindender Teil, entweder direkt oder über eine Abstandhalter-Gruppe, an der pharmakologischen Wirkgruppe über das Seitenkettenamin eines Lysin- oder eines anderen bis-Aminosäurerestes befestigt ist. Spezifische chelatbildende Derivate dieser allgemeinen Struktur umfassen
wobei Ma Mercaptoessigsäure ist,
PtscG 2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure oder PhNHCSNHNHCH₂CO₂H ist,
γAbu γ-Aminobutansäure ist, und
die runden Klammern in K(PtscGC) zeigen, dass eingeschlossene Aminosäuren am ε-Amin von Lysin befestigt sind und die erste befestigte Aminosäure C, gefolgt von PtscG, ist.
Bei jeder der oben beschriebenen Verbindungen soll der chelatbildende Teil für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durch einen Chelator der allgemeinen Formel I, wie oben beschrieben ist, ersetzt sein.
(iv) Lineare, den LHRH-Rezeptor targetierende Agenzien
Das natürlich vorkommende LHRH weist die Sequenz:
auf, wobei <G Pyroglutaminsäure ist. Es ist weiterhin bekannt, dass das bizyklische Peptid AcNal_dCpa_dW_d(cyclo4-10)D(cyclo5-8)ER_dLKPDap-NH₂ (wobei W_d anzeigt, dass das D-Isomer der Aminosäure verwendet wurde, Nal 2-Naphthylalanin ist, Cpa 4-Chlorphenylalanin und Dap 2,3-Diaminopropionsäure ist) an den LHRH-Rezeptor bindet. Siehe Bienstock et al. J. Med. Chem. 36:3265 (1993). Es ist ebenfalls bekannt, dass die Seitenkette von Position 6 von qLHRH hinsichtlich des Volumens sehr tolerant ist. Siehe Barbacci et al. J. Biol. Chem. 36:3265 (1993). Dieser Ort ist eine mögliche Stelle für die Befestigung eines Metall-bindenden Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung.
Lineare chelatbildende Derivate auf der Grundlage der Befestigung des Metall-bindenden Liganden an dieser Position umfassen diejenigen, bei denen ein Metall-bindender Teil, entweder direkt oder über eine Abstandhalter-Gruppe, an der pharmakologischen Wirkgruppe über das Seitenkettenamin eines Lysin- oder eines anderen bis-Aminosäurerestes befestigt ist. Spezifische lineare chelatbildende Derivate dieser allgemeinen Strukturen umfassen
wobei:
<G Pyroglutaminsäure ist,
Ma Mercaptoessigsäure ist,
azaG Azaglycin oder H₂NNHCH₂CO₂H ist,
PtscG 2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure oder PhNHCSNHNHCH₂CO₂H ist,
Dap 2,3-Diaminpropionsäure ist,
iD eine Asparaginsäure, gekoppelt über die Seitenkettencarboxylgruppe, ist,
iE eine Glutaminsäure, gekoppelt über die Seitenkettensäuregruppe, ist,
DiGly HOOCCH₂NHCH₂COO- ist,
Mta(hqss) S-(2,5-Dihydroxyphenyl-S-methyl)sulfoniumacetyl ist,
C_a ein Acm-geschütztes Cystein ist,
Mta der Methylthioether von Mercaptoessigsäure ist,
Nal 2-Naphthylalanin ist,
Cpa 4-Chlorphenylalanin ist,
bei K_d das tiefgestellte d anzeigt, dass das D-Isomer verwendet wurde, und
die runden Klammern in K(MaGC) anzeigen, dass eingeschlossene Aminosäuren am ε-Amin von Lysin befestigt sind und die erste befestigte Aminosäure C, gefolgt von G und endend mit Ma, ist.
Zusätzlich können Komplexe dieser Peptide mit nichtradioaktiven Metallen hergestellt werden. Solche Komplexe umfassen:
Bei jeder der oben beschriebenen Verbindungen soll der chelatbildende Teil für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durch einen Chelator der allgemeinen Formel I, wie oben beschrieben, ersetzt sein.
(v) Lineare, den α-MSH-Rezeptor targetierende Agenzien
Das natürlich vorkommende α-MSH weist die Sequenz:
auf. Es war zuvor gezeigt worden, dass das zyklische Peptid Nle
-NH₂ (wobei Nle Norleucin ist und F_d D-Phe anzeigt) eine hohe Affinität für den α-MSH-Rezeptor aufweist und von ihm bekannt ist, dass es in vivo vergleichsweise stabil ist. Siehe Al-Obeidi et al. J. Amer. Chem. Soc. 111:3413 (1989); Haskell-Luevano et al. J. Med. Chem. 39:432 (1996). Der unterstrichene Teil zeigt diejenigen Reste innerhalb des zyklisierten Teils des Peptides an und auch die Termini der zyklischen Struktur, d. h. das Peptid ist durch eine Amidbindung zwischen den Seitenketten von Asparaginsäure und Lysin zyklisiert.
Lineare chelatbildende Derivate auf der Grundlage der Strukturen dieser bekannten α-MSH-Rezeptor-bindenden Peptide umfassen diejenigen, bei denen ein chelatbildendes Derivat, entweder direkt oder über eine Abstandhalter-Gruppe, wie beispielsweise γ-Aminobutansäure (γ-Abu), am N-Terminus des Peptides befestigt ist. Spezifische lineare chelatbildende Derivate mit dieser allgemeinen Struktur umfassen:
wobei γ-Abu γ-Aminobutansäure und R_n ein nitrierter Argininrest ist.
Bei jeder der oben beschriebenen Verbindungen soll der chelatbildende Teil für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durch einen Chelator der allgemeinen Formel I, wie oben beschrieben, ersetzt sein.
B. Konzeption und Synthese von zyklischen Peptiden, die chelatbildende Aminosäurederivate umfassen
(i) Im Allgemeinen
Das Verfahren des Herstellens eines zyklischen Metall-Chelator/Peptid-Komplexes ist zu dem oben für lineare Peptide beschriebenen analog, abgesehen davon, dass an irgendeinem Punkt während oder nach der Synthese der Peptidkette eine Zyklisierung rausgeführt wird. Die Zyklisierung kann zwischen jeglichen zwei funktionellen Gruppen an dem Peptid ausgeführt werden, wie beispielsweise den Peptidtemini oder Aminosäureseitenketten. Die Zyklisierung kann durch Disulfid- oder Sulfidbildung oder bevorzugterweise durch Lactambildung erreicht werden. Eine ortsselektive Zyklisierung erfordert eine selektive Entschützung von zwei funktionellen Gruppen an dem Peptid. Für die Lactambildung erfordert dies das Verwenden einer Amino- und einer Carboxyl-Schutzgruppe, die in Gegenwart anderer Amino- und Carboxyl-Schutzgruppen entschützt werden kann. Diese Aufgabe wird erschwert, wenn die Peptidsynthese auch erfordert, dass zwischen diesen anderen Schutzgruppen eine selektive Entschützung erreicht wird. Dementsprechend hat sich eine derartige hoch entwickelte Schutzgruppenstrategie in der Praxis vordem als schwierig umzusetzen erwiesen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung erlauben, dass sowohl die Zyklisierung als auch die Kopplung des Chelatorteils an das Peptid an einem jeglichen Punkt während der Peptidsynthese erreicht werden können. Die Verwendung von geeigneten Schutzgruppen erlaubt es, die Synthese des Peptides, das Zusammensetzen des Liganden und die Zyklisierung des Peptides in einer jeglichen erwünschten Reihenfolge zu erreichen. Dieser Ansatz ist effizienter als entweder Festphasenverfahren, die Peptide losgelöst vom Harz zyklisieren, oder Verfahren, die Liganden in Lösung nach der Synthese des zyklischen Peptides befestigen.
Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können in der Flüssigphase verwendet werden, werden aber bevorzugterweise unter Verwendung eines automatisierten Festphasen-Peptidsynthesizers ausgeführt. Die Verwendung eines automatisierten Multi-Reaktionsnapf-Synthesizers erlaubt es, dass man eine große Anzahl an Peptiden gleichzeitig herstellt, die sich durch den Punkt der Befestigung des Chelatorteils oder die Stelle der Zyklisierung unterscheiden. Diese sogenannten „kombinatorischen Bibliotheken”, bei denen die Ligand enthaltenden Peptide entschützt werden, während sie noch am festen Träger befestigt sind, können mit dem geeigneten Metall umgesetzt werden, um Komplexe zu bilden, und können dann in einem geeigneten Bioaktivitätstest gescreent werden, um die Verbindung zu selektieren, die die optimal erwünschten Charakteristika hinsichtlich der Rezeptorbindung und der Stabilität aufweist.
Eine kombinatorische Synthese kann in „getrennten” Synthesen oder durch „parallele” Synthesen ausgeführt werden. Bei einer getrennten Synthese werden die synthetischen, an Kügelchen gebundenen Peptidzwischenprodukte bei jedem aufeinanderfolgenden Schritt zum Hinzufügen der nächsten Aminosäure in verschiedene Gruppen unterteilt. Nach jedem Schritt werden die Kügelchen für die nächste Reaktion in verschiedene Gruppen aufgeteilt. Bei einer parallelen Synthese werden verschiedene Verbindungen in verschiedenen Reaktionsgefäßen wie beispielsweise den Reaktionsnäpfen eines Peptidsynthesizers, synthetisiert. Die getrennte Synthese stellt kleine Mengen größerer Anzahlen von Verbindungen bereit, wohingegen die parallele Synthese größere Mengen einer kleineren Anzahl von Verbindungen bereitstellt.
Die kombinatorische Synthese erfordert auch, dass jede individuelle Verbindung auf irgendeine Weise markiert wird, damit sie beim Screeningschritt identifiziert werden könnte. Auf dem Gebiet sind verschiedene Mittel zum Markieren von Verbindungen zu diesem Zweck bekannt. Zum Beispiel werden inerte halogenierte aromatische Verbindungen als Markierungen verwendet, die durch Gaschromatographie identifiziert werden können. Siehe Borman, Chem. Eng. News 74:29 – (1996).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Zyklisierung durch Lactambildung erreicht. Am bevorzugtesten wird die Aminofunktion unter Verwendung einer Aloc-Gruppe geschützt, und die Carboxylfunktion wird in der Form eines Allylesters geschützt. Dies erlaubt die gleichzeitige Entschützung der Amino- und der Carboxyfunktionen unter Verwendung von Pd(PPh₃)₄ in Gegenwart eines Nukleophils für die Allylgruppe. Das typischerweise verwendete Nukleophil ist tri-n-Butyl-Zinnhydrid (ⁿBU₃SnH).
Vor der vorliegenden Erfindung war bekannt, dass Amine unter Pd⁰-Katalyse mit Allylionen reagieren würden. Siehe z. B. Roos et al., J. Org. Chem. 60:1733 (1995) und Heck, PALLADIUM REAGENTS IN ORGANIC SYNTHESES, Academic Press, 1995, S. 122–131. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass dies bei der gleichzeitigen Entschützung von Allyl-geschützten Amino- und Carboxylfunktionen aufgrund der Nebenreaktion, bei der die gerade entschützte Aminofunktion mit der Allylgruppe alkyliert wurde, ein Problem verursachte. Es wurde jedoch festgestellt, dass die Zugabe von Piperidin als Allylfänger während der Pd-katalysierten Aloc-Abspaltungsreaktion diese unerwünschte Nebenreaktion inhibierte. Dies erlaubte die Entschützung z. B. von Asparginsäure- und Lysin-Seitenketten selektiv und gleichzeitig, während es die Bildung des unerwünschten N^ε-Allyl-Lysins stark verringerte. Fachleute auf dem Gebiet werden anerkennen, dass andere primäre und sekundäre Amine ebenfalls geeignete Allylfänger darstellen werden.
Dieses Verfahren ist nützlich und vorteilhaft, weil es mit der Peptidsynthese auf der Grundlage von Fmoc kompatibel ist. Es erlaubt die Herstellung von zyklischen Peptiden auf HMP- und PAM-Harzen, wobei sowohl der Boc- als auch Fmoc-Seitenkettenschutz zusätzlich zum Aloc-Seitenkettenschutz verwendet werden kann. Diese Technik erlaubt weiterhin die Synthese von zyklischen Peptiden, die einen Metall-bindenden Liganden enthalten, der an der Seitenkette einer Aminosäure an einem jeglichen Punkt in einer Peptidkette befestigt ist. Somit werden drei orthogonale Stickstoff-Schutzgruppen verwendet: eine zum Aufbauen der Peptidkette, wie beispielsweise Fmoc oder Boc; eine zweite zum Befestigen eines Metall-bindenden Liganden an einer Seitenkette einer bis-Aminosäure, wie beispielsweise 4-Methyltrityl(mtt) oder 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-yliden)ethyl (Dde); und eine dritte, wie beispielsweise Aloc, zum Erreichen der Seitenketten-Seitenketten-Zyklisierung. Andere Schutzgruppen, wie beispielsweise Boc-, Cbz-, ^tBu- und Benzylgruppen, können zum Schutz von anderen Seitenkettenamino- und -carboxyfunktionen verwendet werden, die nicht entschützt sind, bis die Peptidsynthese zu Ende ist. Kombinationen dieser Schutzgruppen erlauben die Verwendung von Rink-, Wang-, Merrifield-, PAM- und HMP-Typ-Harzen für die Festphasenpeptidsynthese. Die Abspaltung der Peptide von dem Harz kann mit Trifluoressigsäure (bei Synthesen auf der Grundlage von Fmoc) oder HF oder Trimethylsilyltrifluoromethansulfonat (für Synthesen auf der Grundlage von Boc) erreicht werden.
Die zyklischen Peptide der Erfindung weisen eine Länge von 4 bis 100 Resten und bis zu 5 Metall-chelatbildende Gruppen auf. Die Peptide können zyklisierte Regionen enthalten, die eine Länge von zwischen 2 und 60 Aminosäuren aufweisen, und sie können mehr als einen zyklischen Teil aufweisen.
Die Zyklisierung findet bevorzugterweise zwischen Amino- und Carboxy-Aminosäureseitenketten statt, um Lactambrücken zu bilden, kann aber auch zwischen einem Seitenkettenamin und dem C-Terminus stattfinden, um eine Lactambrücke zu bilden, zwischen einer Seitenkettensäure und dem N-terminalen Amin, um Lactam zu bilden, zwischen Thiolen, um Disulfidbrücken zu bilden, zwischen Hydrazinn und Ester, um Hydrazide zu bilden, zwischen Hydrazinn und Aldehyden, um Hydrazone zu bilden, zwischen einem Thiol und einer geeigneten Abgangsgruppe, um ein Sulfid zu bilden, oder zwischen einer Hydroxylgruppe und einer anderen geeigneten Abgangsgruppe, um einen Ether zu bilden. Wenn mehr als eine zyklische Region in der Verbindung vorhanden ist, können die Brücken in den zyklischen Regionen dem gleichen Typ oder verschiedenen Typen angehören.
Wenn ein zyklisches Disulfid gebildet werden soll, wird das interessierende Peptid bevorzugterweise unter Verwendung von Acm-Schutz auf Thiolen und Aloc-Schutz auf Aminoseitenketten synthetisiert. Das Aloc wird abgespaltet, und der chelatbildende Ligand wird an das Peptid gekoppelt. Die Acm-Gruppe wird anschließend abgespaltet und das Disulfid unter Verwendung von Thalliumtrifluoroacetat zyklisiert. Alternativ können die Thiole unter Verwendung von S-Tritylgruppen geschützt werden, und die Zyklisierung kann in Lösung nach der Abspaltung von dem Harz ausgeführt werden.
Die Herstellung eines zyklischen Sulfides kann z. B. durch Zyklisierung eines Thiols an einer α-Haloamidofunktion erreicht werden, die an einer Aminseitenkette vorhanden ist. Somit kann das Peptid z. B. mit Fmoc-Schutz am N-Terminus und S-Trityl-Schutz an dem Thiol synthetisiert werden. Eine Aloc-geschützte Lysinseitenkette wird anschließend entschützt, und der Chelator wird wie oben beschrieben an das Lysin gekoppelt. Das Fmoc wird abgespaltet und mit Chloracetylchlorid oder einem äquivalenten Reagens umgesetzt. Wenn ein säurestabiles Harz, wie beispielsweise das photospaltbare BromoWang-Harz, Wang, J. Org. Chem. 41:3258 (1976), verwendet wird, wird die Thiol-Schutzgruppe entfernt und das Peptid auf dem Harz zyklisiert.
Zyklische Sulfide zwischen Seitenkettenresten werden unter Verwendung einer geeigneten Schutzgruppe am N-Terminus des Peptides hergestellt, die eine selektive Entschützung an zwei differentiell geschützten Aminoketten erlaubt. Z. B. kann der N-Terminus als Acetyl- oder Boc-Gruppe geschützt sein, und die Seitenketten können als Fmoc- und Aloc-Gruppen geschützt sein. Nach der Peptidsynthese wird eine Aminosäureseitenkette (z. B. Fmoc) selektiv entschützt und mit dem Chelatteil wie oben beschrieben gekoppelt. Eine andere Aminoseitenkette (z. B. Aloc oder Dde) wird anschließend entschützt und an ein Sulfidelektrophil, wie beispielsweise Haloacetyl oder Maleimid, gekoppelt. Die Schutzgruppe an dem interessierenden Schwefel wird abgespaltet, und die Zyklisierung wird auf dem Harz unter Verwendung eines Basenkatalysators ausgeführt. Alternativ kann das Peptid abgespaltet und die Zyklisierung in Lösung ausgeführt werden.
(ii) Zyklische, den α-MSH-Rezeptor targetierende Agenzien
Das natürlich vorkommende α-MSH weist die Sequenz Ac-SYSMEHFRWGKPV-NH₂ auf. Es war zuvor gezeigt worden, dass das zyklische Peptid Nle
-NH₂ (wobei Nle Norleucin ist und F_d D-Phe anzeigt) eine hohe Affinität zu dem α-MSH-Rezeptor aufweist und von ihm ist bekannt, dass es in vivo vergleichsweise stabil ist. Siehe Al-Obeidi et al. J. Amer. Chem. Soc. 111:3413 (1989); Haskell-Luevano et al. J. Med. Chem. 39:432 (1996). Der unterstrichene Teil zeigt diejenigen Reste innerhalb des zyklisierten Teils des Peptides an und auch die Termini der zyklischen Struktur, d. h. das Peptid ist durch eine Amidbindung zwischen den Seitenketten von Asparaginsäure und Lysin zyklisiert. Diese zyklische Struktur wird als Grundlage für das Konstruieren markierter Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet.
Zyklische chelatbildende Derivate auf der Grundlage der Struktur des bekannten den α-MSH-Rezeptor bindenden Liganden umfassen diejenigen, bei denen ein chelatbildendes Derivat, entweder direkt oder über eine Abstandhalter-Gruppe, wie beispielsweise γ-Aminobutansäure (γ-Abu), am N-Terminus des Peptides befestigt ist. Spezifische chelatbildende Derivate dieser allgemeinen Struktur umfassen:
wobei
Ma Mercaptoessigsäure ist,
γAbu γ-Aminobutansäure ist,
PtscG 2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure ist, und
DTPA Diethylentriaminpentaessigsäure ist.
Bei jeder der oben beschriebenen Verbindungen soll der chelatbildende Teil für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durch einen Chelator der allgemeinen Formel I, wie oben beschrieben, ersetzt sein.
(iii) Zyklische, den VIP-Rezeptor targetierende Agenzien
Das natürlich vorkommende VIP weist die Sequenz:
auf. Von nativem VIP glaubt man, dass es in Lösung eine helikale Struktur ausbildet. Siehe Musso et al. Biochemistry 27:8174 (1988). Die mutmaßliche Helixstruktur kann durch intramolekulare Zyklisierung über die Seitenketten von Resten stabilisiert werden, die durch die helikale Struktur in räumlicher Nähe platziert sind. Beispiele umfassen:
(wobei Nie Norleucin ist). Siehe O'Donnell et al. J. Pharm. Exp. Ther. 270:1282; US-Patent 4,822,890 ; Bolin, Europ. Patentanmeldung 0 536 741 A2 . Der unterstrichene Teil zeigt die Reste innerhalb des zyklisierten Teils des Peptides an und auch die Termini des zyklisierten Teils, d. h. das Peptid ist über die Ausbildung einer Amidbindung zwischen den Seitenketten der Asparaginsäure und des Lysins zyklisiert. Diese zyklischen Strukturen werden als Grundlage für das Konstruieren markierter Peptide gemäß der vorliegenden Verbindung verwendet.
Zyklische chelatbildende Derivate auf der Grundlage dieser Strukturen umfassen diejenigen, bei denen ein Metall-bindender Teil, entweder direkt oder über eine Abstandhalter-Gruppe, an der pharmakologischen Wirkgruppe über das Seitenkettenamin eines Lysin- oder eines anderen bis-Aminosäurerestes befestigt ist. Spezifische chelatbildende Derivate dieser allgemeinen Struktur umfassen
(wobei PtscG = 2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure ist); und
(wobei DTPA = Diethylentriaminpentaessigsäure ist).
Bei jeder der oben beschriebenen Verbindungen soll der chelatbildende Teil für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durch einen Chelator der allgemeinen Formel I, wie oben beschrieben, ersetzt sein.
Referenzbeispiele
Referenzbeispiel 1: Synthese von N^αAlloc-N^ε-Fmoc-L-Lysin
N^ε-Fmoc-L-Lysin (10,00 g, 27,1 mMol, 100 Mol%, Bachem Biosciences, Inc.) wurde in Dioxan (100 ml) und Na₂CO₃ (1 M, 33 ml) suspendiert, um eine milchige Suspension zu bilden. Allylchlorformiat (3,2 ml, 30,2 mMol, 111 Mol%) wurde zu Dioxan (10 ml) hinzugegeben, und diese Lösung wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 10 Min. zu der Suspension von N^ε-Fmoc-L-Lysin hinzugegeben. Natriumcarbonat (1 M, 20 ml) wurde in zwei Teilen hinzugegeben, und eine zusätzliche Menge Allylchlorformiat (0,3 ml) wurde hinzugegeben. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden lang gerührt. Die flüchtigen Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck entfernt, und der Rest wurde mit Diethylether (50 ml) gewaschen. Die restliche Flüssigkeit wurde dann mit HCl (1 M) angesäuert und mit Ethylacetat (2 × 150 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit gesättigter NaCl (50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, unter verringertem Druck abgedampft, um ein öliges Rohprodukt (16 g) zu erhalten. Das Rohprodukt wurde in Ether (100 ml) aufgelöst, und ein weißer Feststoff bildete sich und wurde durch Filtration entfernt. Das Lösungsmittel aus dem Filtrat wurde unter verringertem Druck entfernt, um ein viskoses, hellgelbes Öl (8,34 g, 68% Ausbeute) zu ergeben, das schließlich einen glasigen Feststoff bildete.
Referenzbeispiel 2: Synthese von 2-(Triphenylmethylmercapto)acetylhydrazid
2-(Triphenylmethylmercapto)essigsäure (20,35 g, 60,9 mMol, 100 Mol%) wurde in wasserfreier THF (150 ml) aufgelöst und in einem Eiswasserbad abgekühlt. t-Butylcarbazat (8,61 g, 65,1 mMol, 107 Mol%) wurde zu der Reaktionslösung hinzugegeben, gefolgt von Diisopropylcarbodiimid (10,0 ml, 63,9 mMol, 105 Mol%). Der Reaktion wurde gestattet, sich langsam auf Raumtemperatur aufzuwärmen, und sie wurde 28 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, um das weiße Präzipitat zu entfernen, das sich gebildet hatte, und das Filtrat wurde durch das Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck zu einem weißen Schaum konzentriert. Dieses Material wurde in Chloroform (75 ml) aufgelöst. Anschließend wurde Essigsäure (75 ml) hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von Borontrifluoridetherat (10,0 ml, 81 mMol, 134 Mol%). Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 6 Stunden lang gerührt und dann durch das Gießen der Reaktionsmischung in Wasser (200 ml), einschließlich Natriumacetat (30 g), gequencht. Diese Mischung wurde mit Chloroform (2 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit gesättigter NaCl-Lösung (150 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, um ein hellgoldenes Öl zu erhalten, das sich beim Stehenlassen verfestigte. Der Feststoff wurde in 1:1 Diethylether/Hexanen (200 ml) suspendiert und durch Filtration gewonnen. Der Feststoff wurde mit einer zusätzlichen Menge 1:1 Diethylether/Hexanen (100 ml) gewaschen und getrocknet, um das erwünschte Produkt (15,44 g, 73% Ausbeute) zu ergeben, das eine berechnete ESMS MH⁺ von 349 und eine beobachtete von 349 aufwies.
Referenzbeispiel 3: Synthese von N^β-[2-(triphenylmethylthio)acetyl]azaglycin
Glyoxylsäuremonohydrat (0,59 g, 6,41 mMol, 110 Mol%) wurde in Methanol (20 ml) aufgelöst, und 2-(Triphenylmethylmercapto)acetylhydrazid (2,03 g, 5,82 mMol, 100 Mol%) wurden hinzugegeben. Dioxan (20 ml) wurde zu der trüben Reaktionsmischung hinzugegeben, und die Reaktion wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Natriumborhydrid (1,76 g) wurde zur Reaktionsmischung hinzugegeben, und nach 30 Minuten wurde eine weitere Menge Natriumborhydrid (0,60 g) hinzugegeben. Die Reaktion wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, dann durch das Gießen der Reaktionsmischung in HCl (1 M, 60 ml) gequencht. Die Mischung wurde mit Ethylacetat (2 × 50 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit gesättigter NaCl-Lösung (40 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck mit dem Rotationsabdampfer konzentriert, um einen Feststoff (2,5 g) zu ergeben, der eine berechnete ESMS MH⁺ von 407 und eine festgestellte von 407 aufwies.
Referenzbeispiel 4: Synthese von N^α-Boc-N^β-[2-(triphenylmethylthio)acetyl]azaglycin
N^α-[2-(triphenylmethylthio)acetyl]azaglycin (2,39 g, 5,89 mMol, 100 Mol%) wurde in Dioxan (50 ml) aufgelöst. Di-t-butyldicarbonat (BOC)₂O (2,07 g, 9,48 mMol, 161 Mol%) wurde zu der Reaktionslösung hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von Na₂CO₃ (1 M, 15 ml). Diese Mischung wurde bei Raumtemperatur 15 Minuten lang gerührt, dann wurden zusätzliche Mengen Na₂CO₃ (1 M, 10 ml) und (BOC)₂O (1,41 g) hinzugegeben. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 18 Stunden lang gerührt, dann mit NaOH (6 M, 3 ml) und (BOC)₂O (1,4 g) 1 Stunde lang umgesetzt. Die rohe Reaktionsmischung wurde dann mit Zitronensäure (1 M) auf pH 3 angesäuert und mit Ethylacetat (200 ml) extrahiert. Die organische Schicht wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung (60 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert, um das Rohprodukt zu enthalten. Das Rohprodukt wurde in Ether aufgelöst und verdünnt, um eine 1:1-Mischung mit Hexanen zu erhalten, was bewirkte, dass sich weißes Präzipitat bildete. Der weiße Feststoff wurde durch Filtration gewonnen, um das erwünschte Produkt (1,48 g, 50% Ausbeute) zu erhalten, das eine berechnete ESMS MH⁺ von 507 und eine festgestellte von 507 aufwies.
Referenzbeispiel 5: Synthese von 2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure
4-Phenyl-3-thiosemicarbazid (6,02 g, 36 mMol, 100 Mol%) wurde in Methanol (40 ml) suspendiert. Glyoxylsäuremonohydrat (3,32 g, 36,1 mMol, 100 Mol%) wurde hinzugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur zwei Stunden lang gerührt. Natriumborhydrid (1,50 g) wurde vorsichtig hinzugegeben, und in der Reaktionsmischung bildeten sich sehr lebhaft Blasen. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt, dann wurde NaBH₄ (0,66 g) hinzugegeben, gefolgt von der Zugabe von Eisessigsäure (6 ml). Nach 15 Minuten wurde NaBH₄ (1,08 g) hinzugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 15 Stunden lang gerührt. Eine zusätzliche Menge NaBH₄ (1,66 g) wurde anschließend hinzugegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt, bevor sie mit HCl (1 M, 200 ml) gequencht wurde. Die Mischung wurde anschließend mit Ethylacetat (2 × 150 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit gesättigter NaCl-Lösung (100 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, um einen gelben Feststoff (9,03 g) zu ergeben, der im negativen Innenmodus eine berechnete ESMS M-H⁺ von 224 und eine festgestellte von 224 aufwies.
Referenzbeispiel 6: Synthese von N^β-Boc-2-(4-phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure
2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure (8,93 g, 37,9 mMol, 100 Mol%) und (BOC)₂O (9,10 g) wurden in Dioxan (100 ml) aufgelöst. Es wurden Natriumcarbonat (1 M, 50 ml) und Wasser (50 ml) hinzugegeben, und die Mischung wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden lang gerührt. Es wurden Natriumhydroxid (1 M, 40 ml) und eine zusätzliche Menge (BOC)₂O (6:21 g) hinzugegeben, und die Reaktion wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit Zitronensäure (1 M) gequencht und mit Ethylacetat (2 × 100 ml) extrahiert. Die organischen Schichten wurden vereinigt, mit gesättigter NaCl (50 ml) gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert, um einen gummiartigen Feststoff (19 g) zu ergeben. Der rohe Feststoff wurde in Ether suspendiert, und ein weißer Feststoff wurde durch Filtration gewonnen. Der Feststoff wurde mit Ether (100 ml) gewaschen, um das erwünschte Produkt (3,17 g) zu ergeben, das eine berechnete ESMS MH⁺ von 326 und eine festgestellte von 326 aufwies.
Referenzbeispiel 7: Synthese von N^α-(triphenylmethylsulfenyl)-N^β-(Boc)azaglyin
^t-Butylcarbazat wurde mit Glyoxylsäuremonohydrat in Methanol kondensiert. Dieses rohe Hydrazon wurde anschließend durch katalytische Hydrierung über 10% Pd/C reduziert. Dieses Produkt wurde anschließend mit Dioxan und Base gemischt, und es wurde eine Dioxan-Lösung von Triphenylmethansulfenylchlorid tropfenweise hinzugegeben. Das erwünschte N^α-(triphenylmethylsulfenyl)-N^β-(Boc)azaglyin (25 g) wurde bei der Aufbereitung erhalten.
Referenzbeispiel 8: Festphasenpeptidsynthese von Peptiden unter Verwendung von Alloc- und Fmoc-Schutzgruppen
Es wurde eine Festphasenpeptidsynthese in einem 0,050 mmol-Maßstab unter Verwendung eines Advanced ChemTech Modell 348-Peptidsynthesizers durchgeführt, der modifiziert war, um unter Stickstoffdruck auf die gleiche Weise betrieben zu werden wie das Modell 396. Die Allyloxycarbonyl (Aloc)- und 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Gruppen wurden für den Stickstoffschutz verwendet, und Diisopropylcarbodiimid (DIC)/Hydroxybenzotriazol (HOBT) wurden verwendet, um die Carboxylgruppen für die Kopplung zu aktivieren. Eine Vielzahl von Harzen wurde verwendet, wie beispielsweise Rink, Pal und TentaGel S RAM für C-terminale Amide, und Wang, 2-Chlortrityl oder TentaGel S PHB für C-terminale Säuren.
Um entweder die Einführung des Metall-bindenden Chelatteils und/oder die Zyklisierung über selektiv entschützte Aminosäureseitenketten zu erlauben, wurde eine differentiell geschützte bis-Aminosäure für die Peptidsynthese verwendet. Die ausgewählten differentiell geschützten bis-Aminosäurederivate waren α-Aloc-Lys(ε-Fmoc)OH und α-Fmoc-Lys(ε-Aloc)OH. Das α-Aloc-Lys(ε-Fmoc)OH-Derivat erlaubte, dass die Ligandenstücke unter Verwendung einer routinemäßigen Fmoc-Vorgehensweise an der Seitenkette eingeführt wurden.
Die Aloc-Gruppen wurden auf der Maschine im manuellen Modus durch das Waschen des an das Harz gebundenen Peptides mit Dichlormethan (3 × 2 ml Portionen) und das anschließende Mischen des Harzes mit einer Lösung (2 ml) abgespaltet, die Tetrakistriphenylphosphinpalladium [0] (10 mg) und Essigsäure (0,1 ml) enthielt. Es wurde anschließend Tributylzinnhydrid (0,3 ml) hinzugegeben, und die Mischung wurde eine Stunde lang verwirbelt. Die Reaktionszelle wurde anschließend geleert, das Harz wurde mit Dichlormethan (3 × 2 ml) gewaschen und die Standard-Fmoc-Synthese wurde wieder aufgenommen. Die Peptide wurden von dem Harz mit einer Lösung von Trifluoressigsäure (TFA), Anisol und Ethandithiol im Verhältnis 23:3:1 eine bis drei Stunden lang abgespaltet. Die rohe Abspaltungsmischung wurde anschließend in Ether gegossen, um das Rohpeptid zu präzipitieren, das dann durch Reverse-Phase-HPLC unter Verwendung eines Waters Delta Pak, Prep Pak C-18-Patronensystems aufgereinigt und mit einem geeigneten Gradienten von TFA (0,1%) in Wasser und/oder TFA (0,1%) in Acetonitril (90%) und Wasser (10%) eluiert wurde. Die die erwünschten aufgereinigten Peptide enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt, und die flüchtigen Lösungsmittel wurden unter verringertem Druck entfernt, um die wässrigen Lösungen der Peptide zu erhalten, die dann lyophilisiert wurden. Proben der lyophilisierten Produkte wurden anschließend zur Elektrospray (ESMS)- oder schnellen Atombombardierung (FABMS) geschickt, um zu bestätigen, dass die festgestellte Masse der Produkte gleich der berechneten Masse des erwünschten Peptides war.
Die Tabelle unten zeigt einige der Referenzpeptidsequenzen, die durch die oben beschriebenen Verfahren synthetisiert wurden.

^a HPLC-Verfahren [Retentionszeit in Minuten] Lösungsmittel A ist 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser, Lösungsmittel B ist 0,1% Trifluoressigsäure in 90:10 Acetonitril/Wasser. Die Lösungsmittelfließgeschwindigkeit beträgt 10 Min. lang 3 ml/Min., anschließend 5 Min. lang 5 ml/Min. Der Gradient beträgt 0 bis 100% B über 10 Min, anschließend 5 Min. lang 100% B
^b Werte des Elektrospray-Massenspektrums (MH⁺)
^c Die unterstrichene Sequenz ist wegen des zyklischen Amides, das die funktionellen Seitenkettengruppen verbindet, zyklisiert.

In der Tabelle verwendete Abkürzungen:

<G:

Pyroglutaminsäure

PtscG:

2-(4-Phenyl-3-thiosemicarbazidyl)essigsäure oder PhNHCSNHNHCH₂CO₂H

Ma:

Mercaptoessigsäure

azaG:

Azaglycin oder H₂NNHCH₂CO₂H

Dap:

2,3-Diaminpropionsäure

γAbu:

γ-Aminobutansäure

Nal:

2-Naphthylalanin

Cpa:

4-Chlorphenylalanin

K_d:

das tiefgestellte d zeigt, dass das D-Isomer verwendet wurde

K(MaGC):

die runden Klammern zeigen, dass eingeschlossene Aminosäuren am ε-Amin des Lysins befestigt sind und die erste befestigte Aminosäure C, gefolgt von G und endend mit Ma, ist

iD:

Isoasparaginsäure

iE:

Isoglutaminsäure

Andere Referenzpeptide und Peptide, die unter den Umfang von Anspruch 1 fallen, die als Radiometall-Bindungsteil TscGC oder MtscgGC aufweisen und durch diese Verfahren synthetisiert wurden, umfassen:
Der unterstrichene Teil der Sequenz ist zyklisch.

TscG ist 3-Thiosemicarbazonylglyoxyl, d. h. H₂NCSNHNCHCO-
MtscG ist 4-Methyl-3-thiosemicarbazonylglyoxyl, d. h. CH₃NHCSNHCHCO-
Ma ist Mercaptoacetyl: HSCH₂CO-

Innerhalb von runden Klammern aufgeführte Gruppen sind an der Seitenkette der Aminosäure befestigt, die links von den Klammern steht.
Referenzbeispiel 9: Herstellung eines zyklischen MSH-Analogons, das einen chelatbildenden Teil enthält
Das Verfahren zum Synthetisieren zyklischer Peptide wurde durch das Herstellen des zyklischen α-Melanozyten-stimulierendes Hormon (αMSH)-Analogons MaGCγ-AbuNle
-NH₂ demonstriert, wobei die Unterstreichung anzeigt, dass die Peptidsequenz durch die Asparaginsäure- und Lysin-Seitenketten als Lactam zyklisiert ist. Die für die Zyklisierung zu verwendenden Reste waren als die Aloc-Gruppe (für Lysin) und als der Allylester (für Aspartat) seitenkettengeschützt. Das Peptid wurde unter Verwendung von Fmoc-Chemie wie oben beschrieben auf einem Rink-Amidharz auf der Grundlage von Polystyrol zusammengesetzt.
Die Allyl- und Aloc-Entschützung wurde zuerst unter Verwendung von Pd(PPh₃)₄, Essigsäure und Bu₃SnH in der Abwesenheit von Piperidin als Allylfänger durchgeführt. Nach dem Abspalten der Seitenketten-Schutzgruppen wurde das Harz gewaschen, und das teilweise geschützte Peptid wurde unter Verwendung des von Felix et al. Int. J. Peptide Protein Res. 32:441 (1988) beschriebenen Verfahrens zyklisiert. Das Peptid wurde anschließend von dem Harz abgespaltet und aufgereinigt, um das N-Allyl-substituierte zyklische Amid als das einzige reine Peptid aus der Produktmischung zu isolieren.
Die Aloc-Abspaltungsreaktion wurde dann durch die Zugabe von Piperidin als Allylfänger modifiziert.
Wenn die Aloc- und Allyl-Gruppen unter Verwendung einer Mischung, die 0,5 ml Eisessigsäure, 10 ml Dichlormethan, 0,0563 g Tetrakis(triphenylphosphin)palladium (0), plus 1,0 ml Piperidin als Allylfänger enthielt, abgespaltet wurden. Jeder Reaktionsnapf auf dem Peptidsynthesizer enthielt 0,05 mMol Peptid auf Rink-Harz und wurde mit 0,3 ml/Reaktionsnapf Tributylzinnhydrid bei Raumtemperatur eine Stunde lang mit Verwirbelungsmischen behandelt. Das Harz wurde nach dem Abspalten der Seitenkettenschutzgruppen mit 2 × 2 ml/Reaktionsnapf Dichlormethan, 2 × 1 ml/Reaktionsnapf Methanol, 2 × 1 ml/Reaktionsnapf Diisopropylethylamin und 3 × 1 ml/Reaktionsnapf NMP gewaschen. Die Peptidseitenketten wurden anschließend durch das Verfahren von Felix oben (15 Std. unter Verwendung von BOP und DIEA) gekoppelt. Das Peptid wurde abgespaltet und wie oben beschrieben aufgereinigt, um ein reines Peptid mit der erwünschten ESMS MH⁺ von 1302 zu ergeben. Das N-allylierte Nebenprodukt wurde nur in Spurenmengen beobachtet.
Referenzbeispiel 10: Radioaktives Markieren mit ^99mTc
Ein Glucoscan (DuPont)-Röhrchen wurde mit 2,18 mCi von NaTcO₄ in 1 ml Saline verdünnt, um den ^99mTc-Gluceptatkomplex zu bilden. <GHWSYK(MaGC)LRPG-Amid (IMP3) wurde wie oben hergestellt. ^99mTc-IMP3 wurde durch das Mischen von 360 μl (874 uCi) ^99mTc-Gluceptat mit 640 μl Peptid in Saline hergestellt. Das anfänglich gebildete Präzipitat verschwand nach dem 15 Minuten langen Erhitzen auf 75 °C. Ein Instant-TLC (ITLC)-Streifen, der in einer H₂O:EtOH:NH₄OH-Mischung (5:2:1) entwickelt wurde, zeigte 6,2% der Aktivität am Anfang wie Kolloide. HPLC zeigte, dass 100% der Aktivität an das Peptid mit einer RT von 6,95 Min. band, wohingegen das urmarkierte Peptid unter den gleichen HPLC-Bedingungen (Reversed-Phase C-18-Säule, Gradient von 0–100% B in 10 Min. bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min., wobei A 0,1% TFA in H₂O und B 90% CH₃CN, 0,1% TFA ist) bei 6,4 Min. eluierte. Die Wiedergewinnung aus der HPLC-Säule betrug 85% der injizierten Aktivität.
IMP3 wurde zum ^99mTc-Markieren in den unten gezeigten Mengen formuliert und lyophilisiert:

IMP3 (μg) Sn (μg) αDG/Sn

1. 250 23 14

2. 100 23 14

3. 250 15 14

wobei αDG α-D-Glucoheptonat ist. Die lyophilisierten Röhrchen wurden mit ~900 μuCi NaTcO₄ in Saline verdünnt. In allen Röhrchen wurde eine Trübung beobachtet. Die Röhrchen wurden 15 Min. lang auf 75°C erhitzt, aber die Trübung hielt an. Eine ITLC-Analyse auf Kolloide zeigte für die Röhrchen 1, 2 bzw. 3 am Anfang 14, 21 und 9% Kolloide.

Um die Präzipitation während des ^99mTc-Markieren zu verhindern, wurden die α-D-Glucoheptonat (αDG)- und Tartrat-Verhältnisse zu Sn(II) in den lyophilisierten Röhrchen variiert. Die folgenden Röhrchen wurden mit den wie unten gezeigten Tartrat- und αDG-Verhältnissen formuliert und lyophilisiert (250 μg IMP3 mit 25 μg Sn(II)). Die Röhrchen wurden mit ~500 μCi NaTcO₄ in 1 ml Saline verdünnt. Die Beobachtungen sind in der Beoachtungsspalte angegeben. Die ITLC-Streifen wurden nach 15 Min. bei Raumtemperatur nach dem 15 Minuten langen Erhitzen auf 75°C entwickelt.

	Tartrat/Sn	pH	Beobachtung	Kolloid, RTKolloid, 75 C
1.	50	5,3	ppt
2.	100	5,3	ppt
3.	500	5,3	ppt klärt sich nach Mischen	17% 2,4%
	αDG/Sn	pH	Beobachtung	Kolloid, RTKolloid, 75 C
4.	25	5,3	ppt
5.	50	5,3	ppt
6.	100	5,3	trüb
7.	500	5,3	leichte Trübung	25% 3,5%
8.	1000	5,3	klar	3,3% 3,t%

Das obige Protokoll wurde mit den Röhrchen 3, 7 und 8 wiederholt, und es wurde bestimmt, dass die Kolloide nach dem 15 Minuten langen Erhitzen auf 75°C 5,3, 3,8 bzw. 4,6% betrugen. Ein einzelner breiter Peak wurde auf einer reversed HPLC-Säule bei einer RT von 7 Min. beobachtet.
Die Löslichkeit von Peptiden, die in Saline alleine schwach löslich sind, wird durch die Zugabe eines solubilisierenden Agens, wie beispielsweise Ethanol oder 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, erhöht.
Die Ergebnisse des Markieren anderer Referenzpeptide mit Technetium-99 sind in der Tabelle unten gezeigt:
Die in der Tabelle verwendeten Abkürzungen sind die gleichen wie in Beispiel 8 oben. Eine Veränderung der HPLC-Retentionszeit des durch das Markieren bei Raumtemperatur gebildeten Komplexes und des durch Erhitzen gebildeten zeigt eine Veränderung bei der Bindung des Metalls an.

^a Raumtemperatur-Reaktion 15 Min. [Retentionszeit in Minuten]
^b nach dem Erhitzen in kochendem Wasser 15 Mm.
^c erhebliche Veränderung der Peakform und Retention nach Erhitzen
^d keine Veränderung der Peakform und Differenz der Retentionszeit ist nicht erheblich
^e viele Peaks

Bei einem alternativen Markierungsverfahren wurden verdünnte Lösungen (30 μg/ml) des Peptides vor der Zugabe von Pertechnetat zu Markierungskits formuliert. Die Lösung am Ende enthielt das Peptid, 10% Hydroxypropyl-βcyclodextrin (HPCD), 200 mM Glucoheptonat 21 mM Acetatpuffer bei pH 5,3, 2 mg Ascorbinsäure und 100 μg Zinnchlorid in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml. In anderen Formulierungen wurden relativ zum Peptid zwei Äquivalente Zinnonen in einem Puffer hinzugegeben, der 15% HPCD, 200 mM Glucoheptonat und 21 mM Acetatpuffer bei pH 5,6 enthielt.
Referenzbeispiel 11: Radioaktives Markieren von IMP-3 ¹⁸⁸Re
IMP3, (<GHWSYK(MaGC)LRPG-Amid) wurde wie oben synthetisiert. IMP3 weist auf einer Reversed Phase C-18-Säule unter Verwendung eines Gradienten von 0–100% B in 10 Min. bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Mm., wobei A 0,1% TFA in H₂O und B 90% CH₃CN, 0,1% TFA ist, eine Retentionszeit von 6,4 Min. auf.
IMP3 wurde in 1 mg- und 250 μg-Mengen mit 450 μg Sn(II) und α-D-Glucoheptonat in einem Verhältnis von 1:17,5 formuliert und lyophilisiert. Die lyophilisierten Röhrchen von IMP3 (1 mg und 250 μg) wurden mit 617 und 578 μCi NaReO₄ in Saline verdünnt. Die Röhrchen wurden 15 Min. lang auf 75 C erhitzt. Eine HPLC-Analyse unter den oben beschriebenen Bedingungen zeigte für beide Röhrchen bei einer RT von 7,0 Min. einzelne Peaks. Der Ausfluss wurde gesammelt und mit einem γ-Zähler gezählt. Bei dem 1 mg-Röhrchen betrug die Wiedergewinnung an Aktivität 88%, wohingegen die Wiedergewinnung bei dem 250 μg-Röhrchen 77% betrug. Kolloidanalysen mit einem ITLC-Streifen, der in H₂O:EtOH:NH₄OH (5:2:1) entwickelt wurde, zeigten für die 1 mg- bzw. 250 μg-Röhrchen 1,4 bzw. 1,2% der Aktivität am Anfang.
Das Markieren mit ¹⁸⁸Re schritt bei Raumtemperatur nicht so gut voran wie bei 75°C. Bei Raumtemperatur wurden nur einige Prozent der Aktivität (< 5%) in das Peptid eingebaut, und der Rest der Aktivität eluierte im Ruheinhalt (1,2 Min.).
Referenzbeispiel 12: In vitro-Rezeptorbindungstests
Die menschlichen Brust-Adenokarzinoma-Zelllinien MCF-7, SK-BR-3 und MDA-MB-231 wurden zum Untersuchen von Radiometall-markierten LHRH-Analoga verwendet. Es wurden HT29-Zellen zum Untersuchen markierter VIP-Analoga verwendet. Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, erworben. Die Zellen wurden in DMEM, supplementiert mit 5% fötalem Rinderserum, 5% definiertem Pferdeserum, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und L-Glutamin (2 mM), wachsen gelassen. Die Zellen wurden nach der Ablösung mit Trypsin und 0,2% EDTA routinemäßig ablaufen gelassen.
Die Spezifität der urmarkierten LHRH-Analogonpeptide wird durch kompetitiven Zellbindungstest bestimmt. Die Zielzellen werden mit frischem Medium gewaschen und auf 5 × 10⁵ Zellen/ml eingestellt. 100 μl der Zellsuspension (100 μl) werden pro Reaktionsnapf zu einer Mikrotiterplatte mit 96 Reaktionsnäpfen hinzugegeben. Den Zellen wird gestattet, sich anzuheften, und sie werden anschließend mit verschiedenen Konzentrationen der Peptide in der Anwesenheit von ¹²⁵I-LHRH (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL, 2.000 Ci/mmol) behandelt. Nach einer zwei Stunden langen Inkubation bei Raumtemperatur mit Schütteln werden die Zellen zweimal gewaschen, und die mit den Zellen verbundene Radioaktivität wird gezählt, und die Konzentration der Peptide, die eine 50%-ige Inhibition der Bindung des markierten LH-RH verursachen, wird verglichen.
Um Rezeptorbindungskonstanten zu bestimmen, werden Serien von Verdünnungen von radioaktiv markiertem LHRH mit 5 × 10⁵ Zellen in einer 96-Reaktionsnapf-Platte inkubiert. Alle Tests werden in dreifacher Ausführung sowohl mit als auch ohne eine hohe Konzentration von unmarkiertem LHRH ausgeführt, um die Bestimmung von spezifisch gebundenem Peptid zu ermöglichen. Nach einer 2 Stunden langen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Zellen gewaschen und gezählt. Die Gleichgewichtsassoziationskonstante, K_a, und die gesamte Anzahl der Rezeptorstellen pro Zelle werden durch Scatchard-Analyse bestimmt.
Zum Untersuchen von VIP-Analoga und ihren Metallkomplexen wird das in Virgolini et al. (Cancer Res. 54:690 (1994)) beschriebene Protokoll verwendet. Kurz gesagt wird ¹²⁵I-VIP mit zunehmenden Konzentrationen des Testpeptides in einer Lösung von Bindungspuffer vermischt, und danach wird jede Lösung zu HT29-Zellen in einer Kulturplatte mit 48 Reaktionsnäpfen gegeben. Jede Konzentration wird in dreifacher Ausführung untersucht. Die Zellen werden zwei Stunden lang bei 4°C inkubiert, gefolgt von drei Waschschritten mit eiskaltem Bindungspuffer. Die Zellen werden anschließend 5 Min. lang mit 2 M NaOH lysiert, und die Flüssigkeit im Reaktionsnapf wird mit einem Baumwolltuch entfernt. Die Aktivität auf dem Baumwolltuch wird unter Verwendung eines Gammazählers gezählt.

Claims

Peptid umfassend einen Radiometall-Bindungsteil, wobei der Bindungsteil die Struktur umfasst:
wobei R¹, R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C1-C6-Alkyl, substituiertem C1-C6-Alkyl, Cycloalkyl, substituiertem Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Alkaryl und einer Schutzgruppe, die unter den Bedingungen einer Peptidsynthese entfernt werden kann, mit der Maßgabe, dass wenigstens R¹, R² oder R³H ist, R⁵, R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C1-C6-Alkyl, substituiertem C1-C6-Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl, und R⁴ und R⁶ zusammen eine direkte Bindung ausbilden, und R⁸ und R⁹ zusammen oder R⁷ und R⁹ zusammen einen Cycloalkyl- oder substituierten Cycloalkylring ausbilden können, und wobei NR¹⁰ am N-Terminus des Peptids oder an einer Aminosäureseitenkette des Peptides angeordnet ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei R¹H ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei R⁵H ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei NR¹⁰ am N-Terminus des Peptids angeordnet ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei NR¹⁰ an einer Aminosäureseitenkette des Peptids angeordnet ist.
Peptid nach Anspruch 2, wobei R² C1-C6-Alkyl oder substituiertes oder ursubstituiertes Phenyl ist.
Peptid nach Anspruch 2, wobei R²H ist.
Peptid nach Anspruch 8, wobei R³H ist.
Peptid nach Anspruch 9, wobei R⁵H ist.
Peptid nach Anspruch 10, wobei R⁷, R⁸ und R⁹ jeweils H sind.
Peptid nach Anspruch 11, wobei R² Phenyl ist.
Peptid nach Anspruch 11, wobei R² Methyl ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei R⁸ und R⁹ Methyl sind.
Peptid nach Anspruch 1, weiter umfassend ein gebundenes Metallatom.
Peptid nach Anspruch 15 wobei das Metallatom ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ^99mTc, ¹⁸⁶Re und ¹⁸⁸Re.
Verfahren zum Herstellen einer Metall-chelatbildenden Zusammensetzung, umfassend Kontaktieren einer Lösung eines Peptids umfassend einen Radiometall-Bindungsteil mit Zinnionen, wobei der Radiometall-Bindungsteil die Struktur umfasst:
wobei R¹, R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C1-C6-Alkyl, substituiertem C1-C6-Alkyl, Cycloalkyl, substituiertem Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Alkaryl und einer Schutzgruppe, die unter den Bedingungen einer Peptidsynthese entfernt werden kann, mit der Maßgabe, dass wenigstens R¹, R² oder R³H sind, R⁵, R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C1-C6-Alkyl, substituiertem C1-C6-Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl, und R⁴ und R⁶ zusammen eine direkte Bindung ausbilden, und R⁸ und R⁹ zusammen oder R⁷ und R⁹ zusammen einen Cycloalkyl- oder substituierten Cycloalkylring ausbilden können, und wobei NR¹⁰ am N-Terminus des Peptids oder an einer Aminosäureseitenkette des Peptides angeordnet ist, und dann Kontaktieren der Lösung mit einem Radionuklid und Aufbereiten des radioaktiv markierten Peptids.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Radionuklid ausgewählt ist aus ¹⁸⁸Re- oder ¹⁸⁶Re-Perrhenat und ^99mTc-Pertechnetat.
Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids, hergestellt durch Kontaktieren einer Lösung des Peptids mit Zinnionen, wobei das Peptid einen Radiometall-Bindungsteil umfasst, der die Struktur umfasst:
wobei R¹, R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C1-C6-Alkyl, substituiertem C1–C6-Alkyl, Cycloalkyl, substituiertem Cycloalkyl, Heterocycloalkyl, Aryl, substituiertem Aryl, Heteroaryl, substituiertem Heteroaryl, Alkaryl und einer Schutzgruppe, die unter den Bedingungen einer Peptidsynthese entfernt werden kann, mit der Maßgabe, dass wenigstens R¹, R² oder R³H sind, R⁵, R⁷, R⁸, R⁹ und R¹⁰ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, C1-C6-Alkyl, substituiertem C1–C6-Alkyl, Aryl und substituiertem Aryl, und R⁴ und R⁶ zusammen eine direkte Bindung ausbilden, und R⁸ und R⁹ zusammen oder R⁷ und R⁹ zusammen einen Cycloalkyl- oder substituierten Cycloalkylring ausbilden können, und wobei NR¹⁰ am N-Terminus des Peptids oder an einer Aminosäureseitenkette des Peptides angeordnet ist, und dann Kontaktieren der Lösung mit einem Radionuklid und Aufbereiten des radioaktiv markierten Peptids, bei der Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zur bildgebenden Darstellung eines Tumores, einer infektiösen Läsion, einer Myocardinfarzierung, eines Blutgerinnsels, artherosklerotischen Plaques, umfassend die Verabreichung des radioaktiv markierten Peptids an einen menschlichen Patienten, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, und, nach einer Zeit, die ausreichend ist, dass das radioaktiv markierte Peptid sich lokalisiert und dass der Nicht-Zielhintergrund geklärt wird, werden die Stelle oder die Stellen der Akkretion des radioaktiv markierten Peptids durch eine externe bildgebende Kamera nachgewiesen.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

wobei (Chel) der Radiometall-bindende Teil von Anspruch 1 ist.