DE69534943T2 - Technetium-99m markierte peptide zur bildformung - Google Patents

Technetium-99m markierte peptide zur bildformung Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft radiodiagnostische Reagenzien und Peptide sowie Verfahren zur Herstellung von markierten radiodiagnostischen Mitteln. Insbesondere betrifft die Erfindung Peptide, Verfahren und Kits zur Herstellung derartiger Peptide, sowie Verfahren zur Verwendung derartiger Peptide zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres, die mittels einer kovalent an eine Seitenkette eines Aminosäurerestes des spezifisch bindenden Peptids gebundenen, den radioaktiven Marker bindenden Einheit mit Technetium-99m (Tc-99m) markiert sind.
  • 2. Stand der Technik
  • Auf dem Gebiet der Nuklearmedizin lassen sich gewisse pathologische Zustände lokalisieren, bzw. läßt sich ihr Ausmaß abschätzen, indem man die Verteilung kleiner Mengen von intern verabreichten, radioaktiv markierten Tracern (den Radiotracern bzw. Radiopharmaka) nachweist. Die zum Nachweis dieser Radiopharmaka angewandten Methoden sind allgemein als Abbildungsverfahren bzw. Radio-Imaging bekannt.
  • Beim Radio-Imaging handelt es sich bei dem radioaktiven Marker um ein Radionuklid, das Gammastrahlung abgibt, und der Radiotracer wird mittels einer Kamera, die auf Gammastrahlung anspricht, lokalisiert (dieses Verfahren wird häufig als Gammaszintigraphie bezeichnet). Die abgebildete Stelle ist detektierbar, da als Radiotracer entweder eine Substanz gewählt wird, die sich an einem Krankheitsherd anreichert (positiver Kontrast) oder, alternativ dazu, eine Substanz gewählt wird, die sich spezifisch nicht an solchen Krankheitsherden anreichert (negativer Kontrast).
  • Für optimales Radio-Imaging bei Menschen müssen eine Anzahl von Faktoren in Betracht gezogen werden. Um die Nachweiseffizienz zu maximieren, werden Radionuklide bevorzugt, die Gammaenergie im Bereich von 100 bis 200 keV abgeben. Um die vom Patienten absorbierte Strahlungsdosis möglichst gering zu halten, sollte die physikalische Halbwertszeit des Radionuklids so kurz sein, wie es das Abbildungsverfahren erlaubt. Damit Untersuchungen an jedem beliebigen Tag und zu jeder beliebigen Tageszeit durchgeführt werden können, ist es vorteilhaft, in der Klinik stets eine Radionuklidquelle zur Verfügung zu haben.
  • Zum Radio-Imaging eignen sich verschiedene Radionuklide einschließlich 67Ga, 99mTc(Tc-99m), 111In, 123I, 125I und 169Yb. Tc-99m ist ein bevorzugtes Radionuklid, da es Gammastrahlung von 140 keV abgibt, eine physikalische Halbwertszeit von 6 Stunden hat und mit einem Molybdän-99/Technetium-99m-Generator bequem vor Ort verfügbar ist.
  • Die Sensitivität von radioaktiv markierte Peptide verwendenden Bildgebungsverfahren sind viel höher als die anderer im Stand der Technik bekannter Radiopharmaka, da radioaktive Signale aufgrund der spezifischen Bindung des radioaktiven Peptids über dem interessierenden Bereich konzentriert werden. Vorteilhafterweise werden kleine synthetische Peptide, die spezifisch an interessierende Targets binden, als Grundlage für Radiotracer verwendet. Die Gründe dafür: 1. sie können chemisch hergestellt werden (anstatt in biologischen Systemen wie Bakterien oder Säugerzellen hergestellt oder aus biologisch abgeleiteten Substanzen wie ein Proteinfragment isoliert werden zu müssen); 2. sie sind klein, weshalb nicht Target-gebundener Radiotracer rasch aus dem Körper eliminiert wird, wodurch die Hintergrund- (nicht-Target) Radioaktivtät sinkt und eine gute Definition des Targets ermöglicht wird; und 3. kleine Peptide können einfach zur Optimierung deren Affinität zu einer bestimmten Bindungsstelle chemisch bearbeitet werden.
  • Kleine, chemisch leicht herstellbare, markierte Peptidmoleküle sind für die routinemäßige Verwendung in Radiopharmaka bevorzugt. Es besteht ein deutlicher Bedarf an kleinen synthetischen markierten Peptiden, die einem Patienten direkt injiziert werden können und Erkrankungsherde durch Anreicherung an diesen Herden abbilden. Tc-99m-markierte kleine synthetische Peptide bieten wegen der Eigenschaften von Tc-99m als Radionuklid zur Bilddarstellung und die Nutzbarkeit spezifisch bindender, kleiner synthetischer Peptide als Radiotracermoleküle klare Vorteile als Radiotracer für die Gammaszintigraphie.
  • Radioaktiv markierte Peptide sind im Stand der Technik bekannt.
  • Im US-Patent Nr. 4 832 940 lehren Ege et al. radioaktiv markierte Peptide zur Abbildung von lokalisierten T-Lymphozyten.
  • In der europäischen Patentanmeldung Nr. 823017009, 1982, offenbaren Olexa et al. ein pharmazeutisch unbedenkliches radioaktiv markiertes Peptid, das unter Fragment E1, isoliert aus vernetztem Fibrin, Fragment E2, isoliert aus vernetztem Fibrin, und Peptiden mit einer Aminosäuresequenz zwischen Fragment E1 und E2 ausgewählt ist.
  • In PCT/US88/02276, 1988, offenbaren Ranby et al. ein Verfahren zum Nachweis von Fibrinablagerungen in Tieren, bei dem man eine radioaktiv markierte Verbindung kovalent an Fibrin bindet.
  • In PCT/US88/03318, 1988, offenbaren Hadley et al. ein Verfahren zum Nachweis eines Fibrin-Blutplättchen-Gerinnsels in vivo, das die Schritte (a) der Verabreichung eines markierten attenuierten thrombolytischen Proteins, bei dem der Marker selektiv an einen von der Fibrin bindenden Domäne unterschiedlichen Abschnitt des thrombolytischen Proteins bindet; und (b) des Nachweises des Verteilungsmusters des markierten thrombolytischen Proteins in dem Patienten umfaßt.
  • In PCT/US89/01854, 1989, lehren Lees et al. radioaktiv markierte Peptide zur Abbildung von Arterien.
  • In PCT/US89/02656, 1989, offenbart Sobel ein Verfahren zur Lokalisierung eines oder mehrerer Thromben in einem Tier unter Verwendung radioaktiv markierter, enzymatisch inaktiver Gewebeplasminogenaktivatoren.
  • In PCT/GB90/00933, 1990, offenbart Stuttle radioaktiv markierte Peptide mit 3 bis 10 Aminosäuren mit der Sequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD), die in vivo an eine RGD-Bindungsstelle zu binden in der Lage sind.
  • In PCT/US90/04642, 1991, offenbaren Maraganore et al. einen radioaktiv markierten Thromboseinhibitor, der (a) eine Inhibitoreinheit; (b) eine Linkereinheit; und (c) eine Ionen bindende Einheit umfaßt.
  • In PCT/US91/03116, 1991, offenbaren Rodwell et al. Konjugate von „molekularen Erkennungseinheiten" mit „Effektordomänen".
  • In Int. J. Appl. Rad. Isot. 19: 835–840, 1968, beschreiben Tubis et al. das Markieren von Peptiden mit Technetium-99m.
  • In Int. J. Appl. Rad. Isot. 34: 1003, 1983, beschreibt Sundrehagen das Markieren von Peptiden mit Technetium-99m.
  • Die Verwendung von Chelatbildnern zur radioaktiven Markierung von Peptiden und Verfahren zur Markierung von Peptiden mit Tc-99m sind im Stand der Technik bekannt und in den ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/653 012 und 07/807 062 offenbart, auf die hiermit durch Verweis Bezug genommen wird.
  • Wenngleich sich Tc-99m optimal für Radio-Imaging eignet, sind seine chemischen Eigenschaften nicht so eingehend untersucht worden wie jene anderer Elemente, weshalb Verfahren mit radioaktiver Markierung mit Technetium nicht zahlreich vorliegen. Tc-99m wird normalerweise als Tc-99m-Pertechnetat (TcO4 -; Technetium in Oxidationsstufe +7) gewonnen, für gewöhnlich aus einem Molybdän-99/Technetium-99m-Generator. Allerdings bindet Pertechnetat nicht gut an andere Verbindungen. Daher muß Tc-99m zur radioaktiven Markierung eines Peptids in eine andere Form konvertiert werden. Da Technetium in wäßriger Lösung kein stabiles Ion bildet, muß es in derartigen Lösungen in der Form eines Koordinationskomplexes gehalten werden, der über ausreichende kinetische und thermodynamische Stabilität verfügt, um die Zersetzung und folglich stattfindende Konvertierung von Tc-99m in unlösliches Technetiumdioxid oder Rückkonvertierung zu Pertechnetat zu verhindern.
  • Derartige Koordinationskomplexe von Tc-99m (in den Oxidationsstufen +1 bis +6) sind bekannt. Jedoch sind diese Komplexe wegen der molekularen Geometrie des Koordinationskomplexes für die radioaktive Markierung ungeeignet. Zum Zwecke der radioaktiven Markierung ist es besonders vorteilhaft, wenn der Koordinationskomplex als Chelat ausgebildet ist, in dem alle das Technetiumion umgebenden Donorgruppen von einem einzigen chelatbildenden Liganden bereitgestellt werden. Dadurch kann das chelatierte Tc-99m durch einen einzigen Linker zwischen dem Chelatbildner und dem Peptid kovalent an ein Peptid gebunden werden.
  • Diese Liganden werden manchmal als bifunktionelle Chelatbildner bezeichnet, die eine chelatbildende Einheit und eine Linker-Einheit aufweisen. Derartige Verbindungen sind im Stand der Technik bekannt.
  • Im US-Patent Nr. 4 434 151 beschreiben Byrne et al. von Homocysteinthiolacton abgeleitete bifunktionelle Chelatbildner, mit denen Radionuklide mit Verbindungen, die terminale Aminogruppen enthalten und die in einem abzubildenden Organ bzw. Gewebe angereichert werden können, gekoppelt werden können.
  • Im US-Patent Nr. 4 444 690 beschreibt Fritzberg eine Reihe von auf 2,3-Bis(mercaptoacetamido)propanoat basierenden Technetium-Chelatbildnern.
  • Im US-Patent Nr. 4 571 430 beschreiben Byrne et al. neue bifunktionelle Homocysteinthiolacton-Chelatbildner zur Chelatisierung von Radionukliden, mit denen die Radionuklide an Verbindungen, die terminale Aminogruppen enthalten und die in einem abzubildenden Organ bzw. Gewebe angereichert werden können, gekoppelt werden können.
  • Im US-Patent Nr. 4 575 556 beschreiben Byrne et al. neue bifunktionelle Homocysteinthiolacton-Chelatbildner zur Chelatisierung von Radionukliden, mit denen die Radionuklide an Verbindungen, die terminale Aminogruppen enthalten und die in einem abzubildenden Organ bzw. Gewebe angereichert werden können, gekoppelt werden können.
  • In US-Patent Nr. 4 673 562 beschreiben Davidson et al. Technetium-Chelatkomplexe von Bisamidobisthiol-Liganden und deren Salze in erster Linie als Mittel zur Kontrolle der Nierenfunktion.
  • Im US-Patent Nr. 4 861 869 beschreiben Nicolotti et al. bifunktionelle Kupplungsmittel, die sich zur Bildung von Konjugaten mit biologischen Molekülen wie Antikörpern eignen.
  • Im US-Patent Nr. 4 965 392 beschreiben Fritzberg et al. verschiedene S-geschützte, auf Mercaptoacetylglycylglycinen basierende Chelatbildner zur Markierung von Proteinen.
  • In der europäischen Patentanmeldung Nr. 86100360.6 beschreiben Fritzberg et al. Dithiol-, Diamino- bzw. Diamidocarbonsäure oder Aminkomplexe, die sich zur Herstellung von mit Technetium markierten Mitteln zur Bilddarstellung eignen.
  • In PCT/US89/02634 beschreiben Dean et al. bifunktionelle Kupplungsmittel zur radioaktiven Markierung von Proteinen und Peptiden.
  • In der europäischen Patentanmeldung Nr. 90306428.5 offenbaren Flanagan et al. die Markierung von synthetischen Peptidfragmenten mit Tc-99m mittels einer Reihe von organischen Chelatbildnermolekülen.
  • In der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 91/01144 offenbaren Albert et al. das Radio-Imaging unter Verwendung von radioaktiv markierten Peptiden, die mit Wachstumsfaktoren, Hormonen, Interferonen und Cytokinen verwandt sind und die ein spezifisch erkennendes Peptid enthalten, das kovalent an eine Radionuklide chelatisierende Gruppe gebunden ist.
  • In der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/653 012 lehrt Dean Reagenzien und Verfahren zur Darstellung von Peptiden mit einer Tc-99m-chelatisierenden Gruppe, die zum Radio-Imaging in vivo kovalent mit einem spezifisch bindenden Peptid verbunden ist, auf die hiermit mit Verweis Bezug genommen wird.
  • In Bioconjugate Chem. 1: 132–137, 1990, beschreiben Baidoo & Lever ein Verfahren zur Markierung von Biomolekülen, bei dem unter Verwendung einer Bisaminbisthiolgruppe ein kationischer Technetiumkomplex erhalten wird.
  • Die radioaktive Markierung eines Peptids ist einfach durch Zusatz einer thiolhaltigen Einheit wie Cystein oder Mercaptoessigsäure durchführbar. Derartige Vorgehensweisen sind im Stand der Technik beschrieben worden.
  • Im US-Patent Nr. 5 061 641 offenbaren Schochat et al. die direkte radioaktive Markierung von Proteinen, die wenigstens eine „hängende" Sulfhydrylgruppe enthalten.
  • In der gleichzeitig anhängigen US-Patentanmeldung 07/807 062 lehren Dean et al. die radioaktive Markierung von Peptiden mittels angefügten, freies Thiol enthaltenden Gruppen, auf die hiermit durch Verweis Bezug genommen wird.
  • In der WO 89/07456 beschreiben Goedemans et al. die radioaktive Markierung von Proteinen mit cyclischen Thiolverbindungen, insbesondere mit 2-Iminothiolan und Derivaten davon.
  • In der EP-Anmeldung Nr. 90402206.8 beschreiben Thombaek et al. die Darstellung und Anwendung von radioaktiv markierten Proteinen bzw. Peptiden unter Verwendung von thiolhaltigen Verbindungen, insbesondere 2-Iminothiolan.
  • In WO 90/15818 beschreibt Stuttle die Markierung von RGD-haltigen Oligopeptiden mit Tc-99m.
  • In der europäischen Patentanmeldung 85104959.3, 1985, beschreiben Burns et al. Bisaminbisthiolverbindungen zur Herstellung kleiner neutraler Tc-99m-Mittel zur Bilddarstellung des Gehirns.
  • In der europäischen Patentanmeldung 86105920.2, 1986, beschreiben Kung et al. Bisaminbisthiolverbindungen zur Herstellung kleiner neutraler Tc-99m-Mittel zur Bilddarstellung des Gehirns.
  • In der europäischen Patentanmeldung 88102252.9, 1988, beschreiben Bergstein et al. Bisaminbisthiolverbindungen zur Herstellung kleiner neutraler Tc-99m-Mittel zur Bilddarstellung des Gehirns.
  • In Inorg. Chem. 27:2154–2161, 1988, beschreiben Bryson et al. neutrale Technetium-99-Komplexe, die in Gegenwart eines Überschusses an Ligand instabil sind,
  • In Tet. Let. 30:1885–1888, 1989, beschreiben Misra et al. Bisaminbisthiolverbindungen für die radioaktive Markierung.
  • In Inorg. Chem. 29:2948–2951, 1990, beschreiben Bryson et al. Chelatbildner, die zwei Amidgruppen, eine Thiolgruppe und ein substituiertes Pyridin enthalten und neutrale Tc-99-Komplexe bilden können.
  • In J. Nucl. Med. 31: 885 (Abst), 1990, beschreiben Taylor et al. einen neutralen Tc-99m-Komplex zur Bilddarstellung des Gehirns.
  • Die Verwendung von Chelatbildnern zur radioaktiven Markierung von Peptiden und Verfahren zur Markierung von Peptiden mit Tc-99m sind im Stand der Technik bekannt und in den ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/653 012, 07/807 062, 07/871 282, 07/886 752, 07/893 981, 07/955 466, 08/1019 864, 08/073 577, 08/210 922, 08/236 402 und 08/241 625 offenbart, und radioaktiv markierte Peptide zur Verwendung als Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung zur Abbildung von Thromben sind im Stand der Technik bekannt und in den ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 07/886 752, 07/893 981 und 08/044 825, sowie in den internationalen Patentanmeldungen PCT/US92/00757, PCT/US92/10716, PCT/US93/02320, PCT/US93/03687, PCT/US93/04794, PCT/US93/05372, PCT/US93/06029, PCT/US93/09387, PCT/U594/01894, PCT/US94/03878 und PCT/US94/05895 offenbart.
  • KURZE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung bereit, bei denen es sich um radioaktiv markierte Peptide handelt. Die erfindungsgemäßen radioaktiv markierten Peptide umfassen Peptide, die in vivo spezifisch an ein Target binden und kovalent mit einer den radioaktiven Marker bindenden Einheit verbunden sind, wobei die Einheit ein Radioisotop bindet. Einen besonderen Vorteil der vorliegenden Erfindung stellt die kovalente Bindung der den radioaktiven Marker bindenden Einheit an eine Seitenkette eines Aminosäurerestes des Peptids dar.
  • Diese Art der kovalenten Bindung ist aus einer Reihe von Gründen von Vorteil. Erstens wird durch die kovalente Bindung an eine Seitenkette einer Aminosäurekomponente des Peptids die Wechselwirkung zwischen der kovalent verbundenen, den radioaktiven Marker bindenden Einheit und den spezifisch bindenden Eigenschaften des spezifisch bindenden Peptids verhindert. Zweitens können durch diese Anordnung cyclische Peptide, die per definitionem keine freien Amino- oder Carboxyltermini umfassen, im Zusammenhang mit den radioaktiven Marker bindenden Einheiten verwendet werden, um als wie hier offenbarte Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung nutzbringend zu sein. Drittens kann aufgrund der kova lenten Bindung an die Seitenkette einer Aminosäurekomponente die erfindungsgemäßen Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung jeweils flexibler zum Erhalt optimaler Zuwächse an Wirksamkeit und Verringerung an Antigenität, etc. ausgelegt werden. Die Konjugierung an eine Aminosäureseitenkette ermöglicht es auch, die den radioaktiven Marker bindende Einheit dem Peptid während der Synthese als Aminosäurekonjugat oder nach erfolgter Synthese des fertigen Peptids zuzusetzen. Und letztlich sind cyclische Peptide bekanntlich gegenüber Exoproteaseverdau resistent, womit in die erfindungsgemäßen Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung die verbesserte Stabilität derartiger Peptide in vivo eingearbeitet wird.
  • Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden radioaktiv markierte Peptide bereitgestellt, die zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres in der Lage sind. Die Peptide umfassen ein spezifisch bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz und einer an das Peptid kovalent gebundenen, den radioaktiven Marker bindenden Einheit. Ferner ist die den radioaktiven Marker bindende Einheit kovalent an eine Seitenkette einer Aminosäure des Peptids gebunden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die den radioaktiven Marker bindende Einheit kovalent an die Seitenkette einer Aminosäure mit einer ein Amin oder ein Thiol enthaltenden Seitenkette gebunden, wobei es sich bei der Aminosäure ganz besonders bevorzugt um Lysin oder Homocystein handelt. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem radioaktiven Marker um Technetium-99m.
  • Einen Aspekt der Erfindung stellt ein Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres bereit, enthaltend ein spezifisch bindendes Peptid, wobei eine den radioaktiven Marker bindende Einheit über eine Aminosäurenseitenkette einer Amino säure des Peptids kovalent an das Peptid gebunden ist und die den radioaktiven Marker bindende Einheit die Formel: C(pgp)s-(aa)-(pgp)s I.aufweist, wobei C(pgp)s für ein geschütztes Cystein steht und (aa) für eine beliebige primäre α- oder β-Aminosäure, die keine Thiolgruppe enthält, steht. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Aminosäure um Glycin.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres bereit, enthaltend ein spezifisch bindendes Peptid, wobei eine den radioaktiven Marker bindende Einheit über eine Aminosäurenseitenkette einer Aminosäure des Peptids kovalent an das Peptid gebunden ist und die den radioaktiven Marker bindende Einheit die Formel: A-CZ(B)-{(C(R1R2)}n-X II.aufweist, worin A für H, HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC oder R4 steht; B für H, SH, -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; Z für H oder R4 steht; X für SH oder -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder niederes geradkettiges oder verzweigtes oder cyclisches Alkyl stehen; n für 0, 1 oder 2 steht; wobei (Peptid) für ein Peptid mit 2 bis etwa 10 Aminosäuren steht; und: (1) wenn B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, X für SH steht und n für 1 oder 2 steht; (2) wenn X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, B für SH steht und n für 1 oder 2 steht; (3) wenn B für H oder R4 steht, A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC steht, X für SH steht und n für 0 oder 1 steht; (4) wenn A für H oder R4 steht, dann, wenn B für SH steht, X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, und, wenn X für SH steht, B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht; (5) wenn X für H oder R4 steht, A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC steht und B für SH steht; (6) wenn Z für Methyl steht, X für Methyl steht, A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC steht, B für SH steht und n für 0 steht; und wobei die Thioleinheit in der reduzierten Form vorliegt und (Aminosäure) für eine beliebige primäre α- oder β-Aminosäure steht, die keine Thiolgruppe enthält.
  • In einer besonderen Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung weist die den radioaktiven Marker bindende Einheit eine Formel:
    • IIa. -(Aminosäure)1-(Aminosäure)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X},
    • IIb. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(Aminosäure)1-(Aminosäure)2,
    • IIc. -(eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure)-(Aminosäure)1-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}, oder
    • IId. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(Aminosäure)1-(eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure)
    wobei (Aminosäure)1 und (Aminosäure)2 jeweils unabhängig für eine beliebige natürliche, modifizierte, substituierte oder abgeänderte α- oder β-Aminosäure, die keine Thiolgruppe enthält, stehen; A für H, HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid) -OOC oder R4 steht; B für H, SH, -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; Z für H oder R4 steht; X für SH oder -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder geradkettiges oder verzweigtes oder cyclisches Niederalkyl stehen; n für eine ganze Zahl steht, bei der es sich entweder um 0, 1 oder 2 handelt; (Peptid) für ein Peptid von 2 bis etwa 10 Aminosäuren steht; und: (1) wenn B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, X für SH steht und n für 1 oder 2 steht; (2) wenn X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, B für SH steht und n für 1 oder 2 steht; (3) wenn B für H oder R4 steht, A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC steht, X für SH steht und n für 0 oder 1 steht; (4) wenn A für H oder R4 steht, dann, wenn B für SH steht, X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, und, wenn X für SH steht, B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht; (5) wenn X für H oder R4 steht, A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC steht und B für SH steht; (6) wenn Z für Methyl steht, X für Methyl steht, A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC steht, B für SH steht und n für 0 steht; und wobei die Thiolgruppe in der reduzierten Form vorliegt.
  • Die Erfindung stellt ebenso ein radioaktiv markiertes Peptid zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres bereit, enthaltend ein spezifisch bindendes Peptid, wobei eine den radioaktiven Marker bindende Einheit über eine Aminosäurenseitenkette einer Aminosäure des Peptids kovalent an das Peptid gebunden ist und die den radioaktiven Marker bindende Einheit die Formel aufweist:
    Figure 00140001
    {im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die den radioaktiven Marker bindenden Einheiten mit dieser Struktur als auf Picolinsäure (Pic) basierende Einheiten bezeichnet}
    oder
    Figure 00150001
    {im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die den radioaktiven Marker bindenden Einheiten mit dieser Struktur als auf Picolylamin (Pica) basierende Einheiten bezeichnet}, wobei X für H oder eine Schutzgruppe steht; (Aminosäure) für eine beliebige Aminosäure steht; die den radioaktiven Marker bindende Einheit kovalent an das Peptid gebunden ist und der Komplex aus der den radioaktiven Marker bindenden Einheit und dem radioaktiven Marker elektrisch neutral ist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Aminosäure um Glycin und bei X um eine Acetamidomethyl-Schutzgruppe. In zusätzlichen bevorzugten Ausführungsformen ist das Peptid kovalent über eine Aminosäure, ganz besonders bevorzugt Glycin, an die den radioaktiven Marker bindende Einheit gebunden, und bei dem radioaktiven Marker handelt es sich um Technetium-99m.
  • Darüber hinaus wird ein radioaktiv markiertes Peptid zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres offenbart, enthaltend ein spezifisch bindendes Peptid und eine mit dem Peptid über eine dessen Aminosäureseitenketten kovalent verbundene, Bisaminobisthiol als radioaktiven Marker bindende Einheit. Die erfindungsgemäße Bisaminobisthiol als radioaktiven Marker bindende Einheit in dieser Ausführungsform der Erfindung weist eine Formel ausgewählt aus der Gruppe besteht aus:
    Figure 00150002
    Figure 00160001
    auf, wobei R jeweils unabhängig für H, CH3 oder C2H5 steht; (pgp)5 jeweils unabhängig für eine Thiolschutzgruppe oder H stehen kann; m, n und p unabhängig für 2 oder 3 stehen; A für lineares oder cyclisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon steht; und X für Peptid steht; und
    Figure 00160002
    wobei R jeweils unabhängig für H, CH3 oder C2H5 steht; m, n und p unabhängig für 2 oder 3 stehen; A für lineares oder cyclisches niederes Alkyl, Aryl, Heterocyclyl, Kombinationen oder substituierte Derivate davon steht; V für H oder CO-Peptid steht; R' für H oder Peptid steht; mit der Maßgabe, daß, wenn V für H steht, R' für ein Peptid steht und wenn R' für H steht, V für ein Peptid steht. {Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden die den radioaktiven Marker bindenden Einheiten mit dieser Struktur als auf "BAT"-Einheiten bezeichnet}. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid kovalent über eine Aminosäure, ganz besonders bevorzugt Glycin, an die den radioaktiven Marker bindende Einheit gebunden, und bei dem radioaktiven Marker handelt es sich um Technetium-99m.
  • In bevorzugten Ausführungsformen der oben erwähnten Aspekte der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der spezifisch bindenden Verbindung um ein Peptid aus zwischen 3 und 100 Aminosäuren. Bei der ganz besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem radioaktiven Marker um Technetium-99m.
  • Durch die Erfindung bereitgestellte spezifisch bindende Peptide umfassen unter anderem die folgenden Sequenzen:
  • Figure 00170001
  • Die erfindungsgemäßen Reagenzien lassen sich darstellen, indem man die spezifisch bindenden Verbindungen oder die den radioaktiven Marker bindenden Einheiten kovalent mit einer polyvalenten verbindenden Einheit verbindet. Erfindungsgemäße polyvalente Verbindungseinheiten umfassen wenigstens zwei identische Gruppen mit Linkerfunktionalität, die dazu in der Lage sind, kovalent an spezifisch bindende Verbindungen oder radioaktive Marker bindende Einheiten zu binden. Bevorzugte Gruppen mit Linkerfunktionalität sind primäre oder sekundäre Amine, Hydroxylgruppen, Carbonsäuregruppen oder Thiol-reaktive Gruppen. Bei bevorzugten Ausführungsformen bestehen die polyvalenten Verbindungseinheiten aus Bis-succinimidylmethylether (BSME), 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure (DMAB), Tris(succinimidylethyl)amin (TSEA), N{2-(N',N'-Bis(2-succinimidoethyl)aminoethyl}-N6,N9-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl)-6,9-diazanonanamid (BAT-BS), Bis(acetamidoethyl)ether, Tris(acetamidoethyl)amin, Bis(acetamidoethyl)ether, Bis(acetamidomethyl)ether, α,ε-Bis-acetyllysin, Lysin und 1,8-Bis-acetamido-3,6-dioxaoctan.
  • Die Erfindung umfaßt weiterhin Komplexe der erfindungsgemäßen Peptide mit Tc-99m und Verfahren zur radioaktiven Markierung der erfindungsgemäßen Peptide mit Tc-99m. Die von der Erfindung bereitgestellten, radioaktiv markierten Komplexe werden gebildet, wenn man erfindungsgemäße Peptide in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit Tc-99m reagieren läßt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind das Dithionition, das Zinn(II)-Ion und das Eisen(II)-Ion, wobei diese Aufzählung keine Einschränkung darstellen soll. Erfindungsgemäße Komplexe werden weiterhin gebildet, wenn man die erfindungsgemäßen Peptide durch Ligandenaustausch mit einem vorher reduzierten Tc-99m-Komplex, wie hier bereitgestellt, mit Tc-99m markiert.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Kits zur Herstellung von mit Tc-99m radioaktiv markierten erfindungsgemäßen Peptiden bereit. Kits zur Markierung der erfindungsgemäßen Peptide mit Tc-99m umfassen ein verschlossenes Vial, das eine vorbestimmte Menge eines erfindungsgemäßen Peptids und eine für die Markierung des Peptids mit Tc-99m ausreichende Menge eines Reduktionsmittels enthält.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Darstellung von erfindungsgemäßen Peptiden durch in vitro durchgeführte, chemische Synthese bereit. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide durch Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert.
  • Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Verwendung von mit Tc-99m markierten Peptiden zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres durch Erzeugen von gammaszintigraphischen in-vivo-Abbildungen bereit. Bei diesen Verfahren wird eine diagnostisch wirksame Menge von einem erfindungsgemäßen, mit Tc-99m markierten Peptid verabreicht und die von dem an der Stelle im Körper des Säugetieres angereicherten Tc-99m-Marker abgegebene Gammastrahlung nachgewiesen.
  • Spezielle bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden ausführlicheren Beschreibung bestimmter bevorzugter Ausführungsformen und den Ansprüchen ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt eine Abbildung von mit 99mTc markiertem P587 in einer tumortragenden Ratte.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Erfindung stellt Tc-99m-markierte Peptide zur Abbildung von Target-Stellen im Körper eines Säugetieres bereit, das eine mittels einer Aminosäureseitenkette kovalent an eine einen radioaktiven Marker bindende Einheit gebundene Aminosäuresequenz umfaßt, wobei die den radioaktiven Marker bindende Einheit ein Radioisotop bindet.
  • Bei der Markierung mit Tc-99m handelt es sich um einen Vorteil der vorliegenden Erfindung, da dieses Isotop dank seiner nuklearen und radioaktiven Eigenschaften ein ideales Mittel zur szintigraphischen Bilderzeugung ist. Das Isotop weist eine Einzelphotonenergie von 140 keV und eine radioaktive Halbwertszeit von ungefähr 6 Stunden auf und ist leicht über einen 99Mo-99mTc-Generator verfügbar. Andere aus dem Stand der Technik bekannte Radionuklide haben viel längere effektive Halbwertszeiten (zum Beispiel 111In, das eine Halbwertszeit von 67,4 h aufweist), oder sind toxisch (zum Beispiel 125I).
  • In den von der Erfindung bereitgestellten, den radioaktiven Marker bindenden Einheiten und den an derartige Einheiten kovalent gebundenen Peptiden, die ein kovalent an Thiolschutzgruppen [(pgp)5] gebundenes Thiol enthalten, können die Thioschutzgruppen gleich oder verschieden sein und unter anderem folgende sein:
    -CH2-Aryl (Aryl ist Phenyl oder Alkyl oder Alkyloxy substituiertes Phenyl),
    -CH-(Aryl)2 (Aryl ist Phenyl oder Alkyl oder Alkyloxy substituiertes Phenyl),
    -C-(Aryl)3 (Aryl ist Phenyl oder Alkyl oder Alkyloxy substituiertes Phenyl);
    -CH2-(4-Methoxyphenyl);
    -CH-(4-Pyridyl)(phenyl)2;
    -C(CH3)3,
    -9-Phenylfluroenyl;
    -CH2NHCOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
    -CH2-NHCOOR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
    -CONHR (R steht für unsubstituiertes oder substituiertes Alkyl oder Aryl);
    -CH2-S-CH2-Phenyl
  • Bevorzugte Schutzgruppen weisen die Formel -CH2-NHCOR auf, worin R für ein Niederalkyl mit 1 und 8 Kohlenstoffatomen, Phenyl oder mit Niederalkyl, Hydroxyl, Niederalkoxy, Carboxyl oder Niederalkoxycarbonyl substituiertes Phenyl steht. Bei der am meisten bevorzugten Schutzgruppe handelt es sich um eine Acetamidomethylgruppe.
  • Jede spezifisch bindende Ausführungsform der Erfindung, die Peptide enthält, umfaßt eine Aminosäuresequenz. Mit dem Ausdruck "Aminosäure", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind alle L- und D-Aminosäuren gemeint: natürlich vorkommende und andere.
  • Peptide der vorliegenden Erfindung können chemisch in vitro synthetisiert werden. Peptide der vorliegenden Erfindung lassen sich im allgemeinen vorteilhaft mit einem Aminosäure-Synthesizer darstellen. Die erfindungsgemäßen Peptide lassen sich so darstellen, daß die den radioaktiven Marker bindende Einheit während der chemischen Synthese in vitro kovalent mit dem Peptid verbunden wird, und zwar unter Einsatz von dem Fachmann wohlbekannten Methoden. Solche während der Synthese kovalent mit der den radioaktiven Marker bindenden Einheit verbundene Peptide sind vorteilhaft, da sich die spezifischen Stellen der kovalenten Verbindung bestimmen lassen.
  • Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht in der kovalenten Bindung einer den radioaktiven Marker bindenden Einheit an das Peptid über eine Aminosäureseitenkette des targetspezifisch bindenden Peptids. Dies kann entweder durch Kupplung der den radioaktiven Marker bindenden Einheit an das Peptid durch Ausbildung einer kovalenten Bindung mit einer bestimmten Aminosäureseitenkette oder durch Einbau einer an eine den radioaktiven Marker bindende Einheit konjugierten Aminosäure während der Peptidsynthese erreicht werden.
  • In ersterem Fall beispielsweise wird die den radioaktiven Marker bindende Einheit ClCH2CO.Gly-Gly-Cys-Lys.-Amid (während der Synthese unter anderem durch Tritylierung der Thiolgruppe des Cysteinrestes geschützt) bei einem pH-Wert von 8–10 an das den Somatostatinrezeptor bindende Peptid cyclo.(N-CH3).Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy unter Bildung des Peptids cyclo. (N-CH3). Phe-Tyr-(D-Trp)-Lys-Val-Hcy. (CH2CO). Gly-Gly-Cys-Lys.-Amid (nach der Entschützung) gekoppelt. Es versteht sich, daß in dieser Formel die den radioaktiven Marker bindende Einheit kovalent an das Schwefelatom in der Seitenkette von Homocystein gebunden ist.
  • Alternativ dazu wird die den radioaktiven Marker bindende Einheit BAT (N6,N9-Bis(2-mercapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonansäure) durch Verwendung des dargestellten Lysinderivats Nα(Fmoc)-Nε(N9-(t-Butoxycarbonyl)-N6, N9-Bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanoyl)lysin während der Peptidsynthese in das Leukozyten bindende Peptid Formyl.Met-Leu-Phe-Lys.-Amid eingebaut.
  • Andere erfindungsgemäße, den radioaktiven Marker bindende Einheiten lassen sich während der Peptidsynthese in das Target-spezifische Peptid einführen. Die picolinsäurehaltige, den radioaktiven Marker bindende Einheit kann kovalent an die ε-Aminogruppe von Lysin gebunden sein, wodurch man zum Beispiel αN(Fmoc)-Lys-εN[Pic-Gly-Cys(Schutzgruppe)] erhält, welches in einer beliebigen Position in die Peptidkette eingebaut werden kann. Diese Sequenz ist besonders vorteilhaft, da sie auf einfache Weise den Einbau in das Targetbindende Peptid ermöglicht.
  • Bei der Bildung eines Komplexes von radioaktivem Technetium mit den Peptiden der vorliegenden Erfindung wird der Technetiumkomplex, vorzugsweise ein Salz von Tc-99m-Pertechnetat, in Gegenwart eines Reduktionsmittels mit den erfindungsgemäßen Peptiden umgesetzt. Bevorzugte Reduktionsmittel sind Dithionitionen, Zinn(II)-Ionen und Eisen(II)-Ionen; das am meisten bevorzugte Reduktionsmittel ist Zinn(II)-Chlorid. Bei einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Reduktionsmittel um ein Festphasenreduktionsmittel. Die zur Herstellung solcher Komplexe erforderlichen Komplexe und Mittel werden zweckmäßigerweise in einem Kit zur Verfügung gestellt, wobei das Kit ein verschlossenes Vial umfaßt, das eine vorbestimmte Menge eines zu markierenden, erfindungsgemäßen Peptids und eine ausreichende Menge Reduktionsmittel enthält, um das Peptid mit Tc-99m zu markieren. Alter nativ dazu kann man den Komplex auch durch Umsetzung eines erfindungsgemäßen Peptids mit einem zuvor gebildeten, labilen Komplex von Technetium und einer anderen, als Transferligand bezeichneten Verbindung bilden. Dieses Verfahren wird als Ligandenaustausch bezeichnet und ist dem Fachmann wohlbekannt. Der labile Komplex kann zum Beispiel unter Verwendung von Transferliganden wie Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit gebildet werden. Die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung brauchbaren Tc-99m Pertechnetatsalze schließen die Alkalisalze wie z.B. das Natriumsalz, oder die Ammoniumsalze und kurzkettigen Alkylammoniumsalze ein.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Kit zur Darstellung von mit Technetium markierten Peptiden zur Verfügung gestellt. Die erfindungsgemäßen Peptide können unter Verwendung von dem Fachmann hinreichend bekannten und nachstehend beschriebenen Verfahren und Mitteln chemisch hergestellt werden. Auf diese Weise hergestellte Peptide umfassen zwischen 3 und 100 Aminosäurereste und sind kovalent an eine den radioaktiven Marker bindende Einheit gebunden, wobei die den radioaktiven Marker bindende Einheit ein Radioisotop bindet. Eine geeignete Menge des Peptids wird in ein Vial gegeben, das ein Reduktionsmittel, wie z.B. Zinn(II)-Chlorid oder ein Festphasenreduktionsmittel, in einer Menge enthält, die zur Markierung des Peptids mit Tc-99m ausreichend ist. Dabei kann auch eine geeignete Menge eines der beschriebenen Transferliganden (wie z.B. Tartrat, Citrat, Gluconat oder Mannit) vorliegen. Erfindungsgemäße, mit Technetium markierte Peptide können durch Zugabe einer geeigneten Menge an Tc-99m oder Tc-99m-Komplex in die Vials und Umsetzung unter den nachfolgend in Beispiel 3 beschriebenen Bedingungen hergestellt werden.
  • Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten radioaktiv markierten Peptide weisen eine geeignete Menge Radioaktivität auf. Bei der Darstellung von radioaktiven Tc-99m-Komplexen werden im allgemeinen bevorzugt radioaktive Komplexe in Lösungen gebildet, die Radioaktivität in Konzentrationen von ungefähr 0,01 Millicurie (mCi) bis 100 mCi pro ml enthalten.
  • Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten, mit Technetium markierten Peptide können zur Abbildung von Stellen in Körpern von Säugetieren verwendet werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die mit Technetium markierten Peptide als eine injizierbare Einzeldosis verabreicht. Erfindungsgemäß kann man nach der radioaktiven Markierung zur Herstellung der injizierbaren Lösung zur diagnostischen Abbildung verschiedener Organe, Tumore und dergleichen einen beliebigen der dem Fachmann bekannten herkömmlichen Träger wie sterile Kochsalzlösung oder Plasma verwenden. Im allgemeinen weist die zu verabreichende Einzeldosis eine Radioaktivität von ungefähr 0,01 mCi bis ungefähr 100 mCi, vorzugsweise von 1 mCi bis 20 mCi, auf. Die als Einzeldosis zu injizierende Lösung hat ein Volumen von ungefähr 0,01 ml bis ungefähr 10 ml. Nach der intravenösen Verabreichung kann die Abbildung des Organs bzw. Tumors in vivo innerhalb von wenigen Minuten durchgeführt werden. Falls gewünscht, kann die Abbildung jedoch auch erst nach einigen Stunden oder noch länger nach Injektion des radioaktiv markierten Peptids in einen Patienten durchgeführt werden. In den meisten Fällen wird sich eine zur Aufnahme von Szintiphotos ausreichende Menge der verabreichten Dosis innerhalb von ungefähr 0,1 Stunden in dem abzubildenden Bereich angereichert haben. Erfindungsgemäß kann man jede herkömmliche Methode zur szintigraphischen Abbildung für diagnostische Zwecke einsetzen.
  • Die von der Erfindung bereitgestellten, mit Technetium markierten Peptide und Komplexe können intravenös in einem beliebigen herkömmlichen Medium zur intravenösen Injektion, wie z.B. einem wäßrigen Kochsalzmedium, oder im Blutplasmamedium, verabreicht werden. Ein solches Medium kann weiterhin herkömmliche pharmazeutische Adjuvantien enthalten, wie beispielsweise pharmazeutisch unbedenkliche Salze zum Einstellen des osmotischen Drucks, Puffer, Konservierungsstoffe und dergleichen. Zu den bevorzugten Medien gehören normale Kochsalzlösung und Plasma.
  • Die Verfahren zur Herstellung und Markierung dieser Verbindungen sind ausführlicher in den folgenden Beispielen dargestellt. In diesen Beispielen werden gewisse Aspekte des oben beschriebenen Verfahrens und vorteilhafte Ergebnisse erläutert. Diese Beispiele dienen lediglich zur Erläuterung und stellen keine Einschränkung der Erfindung dar.
  • BEISPIEL 1
  • Festphasen-Peptidsynthese
  • Die Festphasen-Peptidsynthese (FPPS) wurde im 0,25-Millimol(mMol)-Maßstab mit einem Applied Biosystems Model 431A-Peptidsynthesizer durchgeführt, wobei das Amino-Ende mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschützt wurde, die Kupplung mit Dicyclohexylcarbodiimid/Hydroxybenzotriazol oder 2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphat/Hydroxybenzotriazol (HBTU/HOBT) durchgeführt wurde und ein p-Hydroxymethylphenoxy-methylpolystyrol-(HMP)-Harz für Säuren am Carboxylende bzw. ein Rink-Amidharz für Amide am Carboxyl-Ende eingesetzt wurde. Harzgebundene Produkte wurden routinemäßig unter Verwendung einer Lösung aus Trifluoressigsäure, Wasser, Thioanisol, Ethandithiol und Triethylsilan, hergestellt im Verhältnis 100:5:5:2,5:2, über 1,5–3 Stunden bei Raumtemperatur abgespalten.
  • Gegebenenfalls wurden αN-Formylgruppen durch Behandlung des abgespaltenen, entschützten Peptids mit einem Überschuß an Essigsäureanhydrid in 98%iger Ameisensäure und etwa 18-stündiges Rühren und nachfolgender Aufreinigung mittels HPLC eingeführt. Gegebenenfalls wurden N-terminale Acetylgruppen durch 30-minütige Behandlung des harzgebundenen Peptids mit N-terminaler freier Aminogruppe mit 20% v/v Essigsäureanhydrid in NMP (N-Methylpyrrolidinon) eingeführt. 2-Chloracetyl- und 2-Bromacetylgruppen wurden gegebenenfalls eingeführt, indem man entweder während der FPPS als letzten anzukuppelnden Rest die entsprechende 2-Halogenessigsäure verwendete oder das harzgebundene Peptid mit N-terminaler freier Aminogruppe entweder mit 2-Halogenessigsäure/Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP oder mit dem 2-Halogenessigsäureanhydrid/Diisopropylethylamin in NMP behandelte. Die mittels HPLC gereinigten 2-halogenacetylierten Peptide wurden gegebenenfalls durch 1- bis 48stündiges Rühren einer 0,1–1,0 mg/ml Lösung in Bicarbonatpuffer oder Ammoniumpuffer (pH 8) mit oder ohne 0,5–1,0 mM EDTA und anschließende Ansäuerung mit Essigsäure, Lyophilisierung und Aufreinigung durch HPLC cyclisiert. Gegebenenfalls erfolgten Cys-Cys-Disulfidbrücken-Cyclisierungen durch Behandlung des Cystein-freie Thiolgruppen enthaltenden Precursor-Peptids bei 0,1 mg/ml in einem Puffer mit einem pH-Wert von 7 mit Aliquots von 0,006 M K3Fe(CN)6, bis eine stabile gelbe Färbung blieb. Das überschüssige Oxidierungsmittel wurde mit einem Überschuß Cystein reduziert, die Mischung lyophilisiert und anschließend einer Aufreinigung mittels HPLC unterzogen.
  • Die Einführung der "Pica"-Gruppe erfolgte gegebenfalls durch Konjugierung von Picolylamin an ein Precursor-Peptid unter Verwendung von Diisopropylcarbodiimid und N-Hydroxysuccinimid. Die BAT-Liganden wurden gegebenenfalls eingeführt, indem man entweder während der FPPS als letzten anzukuppelnden Rest die entsprechende BAT-Säure verwendete oder das harzgebundene Peptid mit N-terminaler freier Aminogruppe mit BAT- Säure/Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid in NMP behandelte. [BAM] wurde gegebenenfalls zuerst durch Aktivierung des Peptidcarboxylats mit einem Gemisch von Diisopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid oder HBTU/HOBt in DMF, NMP oder CH2Cl2, gefolgt von Kuppeln in Gegenwart von Diisopropylethylamin an das Peptid konjugiert; nach der Kupplung wurde das Konjugat wie zuvor beschrieben entschützt.
  • Die BSME-Addukte wurden durch Umsetzung einzelner thiolhaltiger Peptide (5 bis 50 mg/ml in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 8) mit 0,5 molaren Äquivalenten von zuvor in Acetonitril gelöstem BMME (Bismaleimidomethylether) bei Raumtemperatur über etwa 1–18 Stunden dargestellt. Diese Lösung wurde eingeengt und das Produkt mittels HPLC aufgereinigt.
  • Die TSEA-Addukte wurden durch Umsetzung einzelner thiolhaltiger Peptide (bei Konzentrationen von 10 bis 100 mg/ml Peptid in DMF, oder 5 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,33 molaren Äquivalenten von zuvor in Acetonitril oder DMF gelöstem TMEA (Tris(2-maleimidoethyl)amin, wie in der US-PS mit der Seriennummer 08/044 825, auf die hiermit durch Verweis Bezug genommen wird, offenbart), mit oder ohne 1 molaren Äquivalent Triethanolamin, bei Raumtemperatur über etwa 1–18 Stunden dargestellt. Derartige, Addukte enthaltende Reaktionsgemische wurden eingeengt und die Addukte anschließend mittels HPLC aufgereinigt.
  • Die BAT-BS-Addukte wurden durch Umsetzung einzelner thiolhaltiger Peptide (bei Konzentrationen von 2 bis 50 mg/ml Peptid in 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 8)/Acetonitril oder THF) mit 0,5 molaren Äquivalenten von zuvor in Acetonitril oder THF gelöstem BAT-BM (N[2-(N',N'-Bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl)]-N9-(t-butoxycarbonyl)-N6,N9-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid, wie in der US-PS mit der Seriennummer 08/044 825, auf die hiermit durch Verweis Bezug genommen wird, offenbart) bei Raumtemperatur über etwa 1–18 Stunden dargestellt. Die Lösung wurde anschließend zur Trockne eingedampft und [BAT-BS]-Peptid-Konjugate durch Behandlung mit 10 ml TFA und 0,2 ml Triethylsilan über 1 Stunde entschützt. Die Lösung wurde eingeengt, und die erhaltenen Addukte mit Ether ausgefällt und anschließend mittels HPLC aufgereinigt.
  • Die rohen Peptide wurden durch präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Waters Delta-Pak C18-Säule und Gradientenelution mit 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, modifiziert mit Acetonitril, gereinigt. Das Acetonitril wurde aus den eluierten Fraktionen abgedampft, und die Fraktionen wurden dann lyophilisiert. Die Identität des jeweiligen Produktes wurde durch Fast Atom Bombardment-Massenspektroskopie (FABMS) bestätigt.
  • BEISPIEL 3
  • Allgemeines Verfahren zur radioaktiven Markierung mit Tc-99m
  • 0,1 mg eines wie in Beispiel 2 hergestellten Peptids wurden in 0,1 ml Wasser oder 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 5,6 oder 7,4) gelöst. Tc-99m-Gluceptat wurde durch Rekonstitution eines Glucoscan-Vials (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) mit 1,0 ml Tc-99m-Natriumpertechnetat, enthaltend bis zu 200 mCi, und anschließendes Stehenlassen bei Raumtemperatur für 15 Minuten dargestellt. 25 μl Tc-99m-Gluceptat wurden dann zum Peptid gegeben, und nach 15- bis 30 minütiger Reaktion bei Raumtemperatur oder 100°C wurde die Mischung durch einen 0,2-μm-Filter filtriert.
  • Die Reinheit des mit Tc-99m markierten Peptids wurde durch HPLC unter Anwendung der folgenden Bedingungen bestimmt: jedes radioaktiv markierte Peptid wurde auf eine analytische Waters Delta-Pak RP-18-Säule, 5 μ, 150 mm × 3,9 mm aufgetragen und dann mit einer Lösungsmittelfließgeschwindigkeit von 1 ml/min eluiert. Es wurde eine 20minütige Gradientenelution durchgeführt, wobei ein Gradient zur Anwendung kam, der mit 10% Lösungsmittel A (0,1% CF3OOOH/H2O) begann und mit 40% Lösungsmittel B90 (0,1% CF3COOH/90% CH3CN/H2O) endete.
  • Radioaktive Komponenten wurden durch einen radiometrischen in-line-Detektor, der mit einem integrierenden Rekorder verbunden war, nachgewiesen. Unter diesen Bedingungen eluieren Tc-99m-Gluceptat und Tc-99m-Natriumpertechnetat zwischen 1 und 4 Minuten, während das mit Tc-99m markierte Peptid erst sehr viel später eluiert.
  • Die folgende Tabelle veranschaulicht gelungene Tc-99m-Markierungen von nach Beispiel 2 dargestellten Peptiden unter Verwendung des hier beschriebenen Verfahrens.
    Figure 00300001
    Figure 00310001
    • * Die folgenden Bedingungen fanden bei der Markierung der entsprechenden Peptide Anwendung:
    • 1. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
    • 2. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4) gelöst und bei 100°C markiert.
    • 3. Das Peptid wird in Wasser gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
    • 4. Das Peptid wird in Wasser gelöst und bei 100°C markiert.
    • 5. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0) gelöst und bei 100°C markiert.
    • 6. Das Peptid wird in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 5,0) gelöst und bei Raumtemperatur markiert.
    • ** HPLC-Verfahren:
    • Allgemein: Lösungsmittel A = 0,1% CF3COOH/H2O
    • Lösungsmittel B70 = 0,1% CF3COOH/70% CH3CN/H2O
    • Lösungsmittel B90 = 0,1% CF3COOH/90% CH3CN/H2O
    • Lösungsmittelflußgeschwindigkeit = 1 ml/min
    • Vydak-Säule = analytische Vydak 218TP54 RP-18-Säule, 5 μ × 220 mm × 4,6 mm mit Vorsäule
    • Brownlee-Säule = Brownlee Spheri-5 RP-18-Säule, 5 μ × 220 mm × 4,6 mm
    • Waters-Säule = Waters Delta-Pak C18, 5 μm, 39 × 150 mm
    • Verfahren 1: Brownlee-Säule 100% A bis 100% B70 in 10 min
    • Verfahren 2: Vydak-Säule 100% A bis 100% B90 in 10 min
    • Verfahren 3: Vydak-Säule 100% A bis 100% B70 in 10 min
    • Verfahren 4: Brownlee-Säule 100% A bis 100 B90 in 10 min
    • Verfahren 5: Waters-Säule 100% A bis 100% B90 in 10 min
  • Die Einzelbuchstabenabkürzungen für Aminosäuren finden sich in G. Zubay, Biochemistry (2. Auflage), 1988 (MacMillen Publishing: New York) S. 33; Ac = Acetyl; Pic = Picolinyl (Pyridin-2-carbonyl) = 6-Aminocaproesäure; Hly = Homolysin; Acm = Acetamidomethyl; pGlu = pyro-Glutaminsäure; Mob = 4-Methoxybenzyl; Pica = Picolylamin (2-(Aminomethyl)pyridin); Apc = L-[S-(3-Aminopropyl)cystein; FD = D-Phenylalanin; WD = D-Tryptophan; YD = D-Tyrosin; Cpa = L-(4-Chlorphenyl)alanin; Thp = 4-Aminotetrahydrothiopyran-4-carbonsäure; ma = Mercaptoessigsäure; D-Nal = D-2-Naphthylalanin; Dpg = Dipropylglycin; Nle = Norleucin; BAT = N6,N9-Bis(2-mercapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonansäure; BAT-Säure (geschützt) = N9-(t-Butoxycarbonyl)-N6,N9-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonansäure; BAM = N1,N4-Bis(2-mercapto-2-methylpropyl)-1,4,10-triazadecan; BAM (geschützt) = N1-(t-Butoxycarbonyl)-N1,N4-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-1,4,10-triazadecan; [BAT-BM] = N-[2-(N',N'-Bis(2-maleimidoethyl)aminoethyl]-N9-(t-butoxycarbonyl)-N6,N9-bis(2-methyl-2-triphenylmethylthiopropyl)-6,9-diazanonanamid; [BAT-BS] = N-[2-(N',N'-Bis(2-succinimidoethyl)aminoethyl]-N6,N9-bis(2-mercapto-2-methylpropyl)-6,9-diazanonanamid; [BMME] = Bis-maleimidomethylether; [BSME] = Bis-succinimidomethylether; [DTPA] = Diethylentriaminpentaessigsäure; Amp = 4-Amidinophenylalanin.
  • BEISPIEL 3
  • Lokalisierung und in-vivo-Abbildung von atherosklerotischen Plaques unter Anwendung der mit Tc-99m-markierten Verbindung P215 in Kaninchen mit Hypercholesterinämie
  • Zweiundzwanzig New Zealand White- (NZW-)Kaninchen beiderlei Geschlechts mit einem Gewicht von 2–3 kg werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Kontrollgruppe der Kaninchen wird untergebracht und mit im Handel erhältlichem Kaninchenfutter (Purina) gefüttert. Die HC-Gruppe wird von einem Alter von sieben Wochen bis zu einem Alter von 28 Wochen mit standardisierter cholesterinreicher Nahrung (Kaninchenfutter, das so gemischt wurde, daß sich eine 1 gew.-%ige Konzentration an Cholesterin ergab) gefüttert. Alle Tiere erhalten Wasser ad libitum.
  • Mit Tc-99m markiertes P215 ({BAT}.RALVDTLKFVTQAEGAK.Amid) wird wie oben in Beispiel 1 beschrieben dargestellt. Ungefähr 250–400 μg Peptid werden mit 140–160 mCi Tc-99m markiert und als Einzeldosen von 7–8 mCi (12,5–20,0 μg/Kaninchen; 6–7 μg/kg) in Dosen mit einem Volumen von 0,2 ml zubereitet. Den erwachsenen Kaninchen wird das mit Tc-99m markierte Peptid intravenös als langsame Bolusinfusion (ungefähr 0,1 ml/min) in eine laterale Ohrvene verabreicht. Eine Gammakamera ausgestattet mit einem stecknadelkopfgroßen Kollimator (Apertur 5 mm) und einem auf Tc-99m eingestellten Energiefenster und so programmiert, daß über 500.000 Counts akkumuliert werden bzw. über einen gewünschten Zeitraum gescannt wird, wird zum Erhalt von Bildern eingesetzt. Kurz vor der Aufnahme werden die Tiere mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin (5:1, 1 ml/kg intramuskulär) betäubt.
  • Die Bilder mit der Gammakamera werden 40°–45° unmittelbar über dem Herzen (Ansicht schräg von links vorne [left anterior oblique, LAO]) aufgenommen, so daß der Aortenbogen auszumachen und die absteigende Aorta zu sehen ist. Die Bilder werden 1 und 2 h und gelegentlich 3 und 5 h nach der Injektion aufgenommen. Vor der Aufnahme der einzelnen Bilder wird je nach Bedarf zusätzliches Betäubungsmittel verabreicht.
  • Nach 2,5 h (nach einem 2 h-Scan) werden die Tiere durch eine intravenöse Dosis von Natrium-Pentobarbital getötet. Bei der Autopsie wird die Aorta entnommen und die abzweigenden Gefäße werden von der Aortenklappe bis zur Mittelbauchregion freipräpariert. Mit einem Pa rallellochkollimator wird die Aorta ex corpora abgebildet. Anschließend werden die Aorten in Längsrichtung geöffnet und mit Sudan IV angefärbt, wodurch atherosklerotische Plaques intensiv ziegelrot gefärbt werden. Unter diesen Bedingungen behält das lipidfreie und nicht verletzte Aortenendothel sein normales glänzend-weißrosa Aussehen.
  • Positive Korrelationen zwischen den in-vivo- und excorpora-Aufnahmen mit Tc-99m P215 und den Anreicherungsmustern von Sudan IV in den Aorten der mit HC behandelten Kaninchen zeigen, daß das erfindungsgemäße Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung in der Lage ist, atherosklerotische Plaques abzubilden.
  • BEISPIEL 4
  • In-vivo-Abbildung einer tiefen Venenthrombose unter Verwendung eines mit Tc-99m markierten Peptids im Hundemodell
  • Mischlingshunde (Gewicht 11–16 kg, über Nacht nüchtern gehalten) werden mit einer Kombination von Ketamin und Aceprozamin i.m. ruhiggestellt und dann mit Natrium-Pentobarbital i.v. narkotisiert. Jedem Tier wird ein 18er Angiographiekatheter in die distale Hälfte der rechten V. femoralis und eine 8 mm Embolisationsspule aus Edelstahl, umwickelt mit Dacron® (Cook Co., Bloomington IN), ungefähr in der Mitte des Oberschenkels in die V. femoralis eingepflanzt. Der Katheter wird wieder entfernt, die Wunde zugenäht und die Plazierung der Spule durch eine Röntgenaufnahme dokumentiert. Die Tiere dürfen sich dann über Nacht wieder erholen.
  • Einen Tag nach der Plazierung der Spule werden die Tiere jeweils wieder narkotisiert, in jeden Vorderlauf wird ein intravenöser Dauertropf mit Kochsalzlösung gelegt, und zur Entnahme von Urin wird ein Harnblasen katheter eingeführt. Das Tier wird auf dem Rücken unter eine Gammakamera gelegt, die mit einem Niedrigenergie-Allzweckkollimator versehen und auf den Photopeak von Tc-99m eingestellt wird. Die Bilder werden durch ein NucLear Mac-Computersystem erhalten.
  • Das mit Tc-99m markierte P357 {(CH2CO-YD.Apc.GDCGGCAcmGCAcmGGC.Amid)2-[BAT-BS]} {185–370 mBq (5–10 mCi) Tc-99m und 0,2–0,4 mg P357} wird sequenziell am Einstichpunkt einer der intravenösen Leitungen in den Vorderläufen injiziert. Die zweite Leitung dient zur Blutentnahme. Vorderaufnahmen der Läufe werden über 500.000 Counts bzw. 20 min (je nachdem, was kürzer ist) aufgenommen, jeweils bei ungefähr 10–20 min, und ungefähr 1, 2, 3 und 4 h nach der Injektion erhalten. Nach der Aufnahme der letzten Abbildung werden die Tiere jeweils tief mit Pentobarbital narkotisiert. Zwei Blutproben werden mittels einer Herzpunktur unter Verwendung einer heparinisierten Spritze entnommen, gefolgt von einer tödlichen Dosis einer gesättigten Kaliumchloridlösung, die über intrakardiale Injektion oder eine intravenöse Bolusinjektion verabreicht wird. Die den Thrombus enthaltende V. femoralis und Proben des Oberschenkelmuskels werden dann vorsichtig herauspräpariert. Der Thrombus wird dann aus dem Gefäß herauspräpariert und in ein vorher ausgewogenes Reagenzglas gelegt. Die Thrombusproben werden dann gewogen und in einem Gammazähler zusammen mit bekannten Fraktionen der injizierten Dosen im Tc-99m-Kanal ausgezählt.
  • Das Gewicht des frischen Thrombus, die injizierte Dosis in Prozent (%ID)/g im Thrombus und im unmittelbar vor der Tötung der Tiere erhaltenen Blut sowie das Thrombus/Blut- und Thrombus/Muskel-Verhältnis werden bestimmt. Aus den im Computer gespeicherten Abbildungen wird das Thrombus/Hintergrund-Verhältnis durch Analyse der in den Regions-of-interest (ROI) über Thrombus und angrenzendem Muskel gemessenen Counts/Pixel bestimmt.
  • Diese Ergebnisse dienen als Nachweis dafür, daß tiefe Venenthromben in vitro rasch und effizient lokalisiert werden können.
  • BEISPIEL 5
  • Szintigraphische Abbildung und biologische Verteilung von mit Tc-99m markierten Peptiden
  • Zum Nachweis der Effizienz von wie oben bereitgestellten Tc-99m-markierten Peptidreagenzien wurden New Zealand White-Kaninchen in der linken Wade intramuskulär mit einem hochwirksamen E, coli-Stamm inokuliert. Nach 24 Stunden wurden die Tiere durch intramuskuläre Injektion von Ketamin und Xylazin sediert und dann mit mit Tc-99m markiertem Peptid (≤ 150 μg, 2–10 mCi) injiziert. Die Tiere wurden dann für die Abbildung im Gesichtfeld der Gammakamera (LEAP-Kollimator, auf den Photopeak von Tc-99m eingestellt) auf den Rücken gelegt, über die erste Stunde nach der Injektion aufgenommen, und anschließend im Abstand von jeweils ungefähr 1 Stunde über die nächsten 3 Stunden nach der Injektion. Zwischen den Aufnahmen der Bilder konnten sich die Tiere erholen, und weiteres Betäubungsmittel wurde je nach Bedarf verabreicht.
  • Nach Ende der letzten Aufnahme wurden die Tiere jeweils durch eine intravenöse Überdosis an Phenobarbital getötet und dann zum Erhalt von Blutproben und Proben von infiziertem Muskelgewebe und Kontrollmuskelgewebe seziert. Die Gewebeproben wurden gewogen und, gemeinsam mit einer Standardmenge der injizierten Dosis, mit einem Gammastrahlungzähler ausgezählt, und die in den Geweben verbliebene prozentuale Menge an injizierter Dosis (pro Gramm Gewebe) bestimmt. Für jedes Peptid wurden die Prozentverhältnisse von injizierter Dosis pro Gramm infiziertem versus nicht infiziertem Muskelgewebe und von infiziertem Muskelgewebe versus Blut berechnet. Diese Resultate werden in der nachstehenden Tabelle für das erfindungsgemäße Tc-99m-markierte Reagenz mit der Formel FormylMLFK(BAT).Amid dargestellt. TABELLE III
    Figure 00380001
    • A = %ID/Gramm infizierter Muskel
    • B = %ID/Gramm als Kontrolle dienender Muskel
    • C = Verhältnis infizierter Muskel : Kontroll-Muskel
    • D = %ID/Gramm Blut
    • E = Verhältnis infizierter Muskel : Blut
  • BEISPIEL 6
  • Lokalisierung und in-vivo-Abbildung von Somatostatinrezeptor- (SSTR-)exprimierenden Tumoren in Ratten
  • Die in-vivo-Abbildung von von Ratten-Tumorzellen exprimierten Somatostatinrezeptoren erfolgte im wesentlichen wie von Bakker et al. (1991, Life Sciences 49: 1593–1601) beschrieben.
  • Aufgetaute CA20948-Pankreastumorzellen von Ratten aus einem gefrorenen geernteten Tumorbrei wurden in einer Suspension von 0,05 bis 0,1 ml/Tier intramuskulär in den rechten hinteren Oberschenkel 6-Wochen-alter Lewis-Ratten eingepflanzt. Die Tumore wurden bis zu einer Größe von ungefähr 0,5 bis 2 g wachsen gelassen und geerntet, und der Tumorbrei wurde in eine zweite naive Gruppe von Lewis-Ratten eingepflanzt. Das Passagieren wurde auf diese Weise wiederholt, wodurch man Folgegenerationen an tumortragenden Tieren erhielt. Die für die in-vivo-Studien verwendeten tumortragenden Tiere stammten gewöhnlich aus der dritten bis fünften Passage und trugen Tumore mit einem Gewicht von 0,2 bis 2 g.
  • Für Untersuchungen zur Spezifität der Anreicherung des Radiotracers in den Tumoren wurde ausgewählten Tieren 30 Minuten vor der Injektion des Radiotracers subkutan eine SSTR-blockierende Dosis (4 mg/kg) an Octreotid verabreicht. (Bakker et al. haben gezeigt, daß diese Vorgehensweise zu einer um 40% geringeren Aufnahme von 111In-[DTPA]-Octreotid in den Tumor führt.)
  • Lewis-Ratten mit CA20948-Tumoren der dritten bis fünften Passage wurden festgehalten und intravenös über die Rückenschwanzvene mit einer Dosis von 0,15–0,20 mCi mit 99mTc markiertem Peptid (entspricht 3 bis 8 μg Peptid in 0,2 bis 0,4 ml) injiziert.
  • Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Tiere durch Halsumdrehen getötet und eine ausgewählte Autopsie durchgeführt. Die geernteten Gewebeproben wurden gewogen und zusammen mit einem Aliquot der injizierten Dosis in einem Gamma-Zähler mit Vertiefungen ausgezählt.
  • Die Ergebnisse der biologischen Verteilung ausgewählter radioaktiv markierter Peptide nach 90 Minuten sind in Tabelle I aufgeführt. Insbesondere 99mTc-P587, 99mTc-P617, 99mTc-P726 und 99mTc-P736 zeigten eine sehr hohe Aufnahme in den Tumor, und die Tumor/Blut-Verhältnisse zeigen ihre hochspezifische Aufnahme in das Target(Tumor-)Gewebe.
  • In 1 ist ein Bild von 99mTc-P587 in einer Ratte mit Tumor gezeigt. Die hohe Aufnahme in den Tumor im unteren Bein (Pfeil) ist deutlich zu sehen.
  • Es wurden die Aufnahme von 99mTc-P587 in Tumoren von Ratten mit und ohne Behandlung mit Octreotid, einen bekanntlich den Somatostatin-Rezeptor in vivo bindenden Somatostatinanalogon, vor der Injektion verglichen. Bei diesen Experimenten wurde die spezifische Aufnahme von radioaktiv markiertem Peptid in Tumoren durch Rezeptorblockierung infolge der Verabreichung von Octreotid vor der 99mTc-P587-Gabe um 76% reduziert. Diese Ergebnisse bestätigten, daß die in vivo-Bindung von 99mTc-P587 SSTR-spezifisch war.
  • Figure 00410001
  • Es versteht sich, daß in der obigen Offenbarung bestimmte spezifische Ausführungsformen der Erfindung hervorgehoben werden und daß alle dazu äquivalenten Modifikationen bzw. Alternativen mit zum Geist und Schutzbereich der Erfindung (wie in den beigefügten Ansprüchen ausgeführt) gehören.

Claims (16)

  1. Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres, enthaltend ein spezifisch bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz von 3 bis 100 Aminosäuren und einer damit kovalent verbundenen Technetium-99m-bindenden Einheit, wobei die Technetium-99m-bindende Einheit kovalent an die Seitenkette eines Aminosäurerests des spezifisch bindenden Peptids gebunden ist, und wobei die Technetium-99m-bindende Einheit die Formel: Cp(aa)Cp aufweist, wobei Cp für ein geschütztes Cystein steht und (aa) für eine beliebige primäre α- oder β-Aminosäure, die keine Thiolgruppe enthält, steht.
  2. Reagenz nach Anspruch 1, wobei das geschützte Cystein der Technetium-99m-bindenden Einheit mit der Formel I eine Schutzgruppe der Formel -CH2-NH-CO-R aufweist, wobei R für Niederalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, 2-, 3-, 4-Pyridyl, Phenyl oder durch Niederalkyl, Hydroxy, Niederalkoxy, Carboxy oder Niederalkoxycarbonyl substituiertes Phenyl steht.
  3. Reagenz nach Anspruch 1, wobei die Technetium-99m-bindende Einheit die Formel
    Figure 00440001
    aufweist.
  4. Reagenz zur Herstellung eines Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung zur Abbildung von Stellen im Körper eines Säugetieres, enthaltend ein spezifisch bindendes Peptid mit einer Aminosäuresequenz mit 3 bis 100 Aminosäuren und eine damit kovalent verbundene Technetium-99m-bindende Einheit, wobei die Technetium-99m-bindende Einheit kovalent an die Seitenkette eines Aminosäurerestes des spezifisch bindenden Peptids gebunden ist, und wobei die Technetium-99m-bindende Einheit eine einzelne thiolhaltige Einheit der Formel: A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X umfaßt, worin A für H, HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC oder R4 steht; B für H, SH, -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; X für H, SH, -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; Z für H oder R4 steht; R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder niederes geradkettiges oder verzweigtes oder cyclisches Alkyl stehen; n für 0, 1 oder 2 steht; (Peptid) für ein Peptid mit 2 bis etwa 10 Aminosäuren steht; und, wenn B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, steht X für SH und n für 1 oder 2; wenn X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, steht X für SH und n für 1 oder 2; wenn B für H oder R4 steht, steht A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, X für SH und n für 0 oder 1 steht; wenn A für H oder R4 steht, und wenn B für SH steht, steht X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid), und, wenn X für SH steht, steht B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid); wenn X für H oder R4 steht, steht A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC und B für SH; wenn Z für Methyl steht, X für Methyl steht, steht A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, B für SH und n für 0; und wobei die Thioleinheit in der reduzierten Form vorliegt und (Aminosäure) für eine beliebige primäre α- oder β-Aminosäure steht, die keine Thiolgruppe enthält.
  5. Reagenz nach Anspruch 4, wobei die Technetium-99m-bindende Einheit aus Einheiten der folgenden Formeln ausgewählt ist: IIa. -(Aminosäure)1-(Aminosäure)2-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}, IIb. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(Aminosäure)1-(Aminosäure)2, IIc. -(eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure)-(Amiosäure)1-{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}, oder IId. -{A-CZ(B)-{C(R1R2)}n-X}-(Amiosäure)1-(eine primäre α,ω- oder β,ω-Diaminosäure) wobei (Aminosäure)1 und (Aminosäure)2 jeweils unabhängig für eine beliebige natürliche, modifizierte, substituierte oder abgeänderte α- oder β-Aminosäure, die keine Thiolgruppe enthält, stehen; A für H, HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC oder R4 steht; B für H, SH, -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; X für SH oder -NHR3, -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) oder R4 steht; Z für H oder R4 steht; R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander für H oder geradkettiges oder verzweigtes oder cyclisches Niederalkyl stehen; (Peptid) für ein Peptid von 2 bis etwa 10 Aminosäuren steht; n für eine ganze Zahl steht, bei der es sich entweder um 0, 1 oder 2 handelt; und, wenn B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, steht X für SH und n für 1 oder 2; wenn X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid) steht, steht X für SH und n für 1 oder 2; wenn B für H oder R4 steht, steht A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, X für SH und n für 0 oder 1; wenn A für H oder R4 steht, und wenn B für SH steht, steht X für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid), und, wenn X für SH steht, steht B für -NHR3 oder -N(R3)-(Aminosäure oder Peptid); wenn X für H oder R4 steht, steht A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC und B für SH; wenn Z für Methyl steht, X für Methyl steht, steht A für HOOC, H2NOC, (Aminosäure oder Peptid)-NHOC, (Aminosäure oder Peptid)-OOC, B für SH und n für 0; und wobei die Thioleinheit in der reduzierten Form vorliegt.
  6. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das spezifisch bindende Peptid aus Peptiden mit den folgenden Aminosäurensequenzen ausgewählt ist:
    Figure 00470001
  7. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich bei dem spezifisch bindenden Peptid um ein cyclisches Peptid handelt.
  8. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das spezifisch bindende Peptid und die Technetium-99m-bindende Einheit kovalent über einen Lysinrest oder einen Homocysteinrest verbunden sind.
  9. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Reagenz weiterhin eine polyvalente Verbindungseinheit umfaßt, die kovalent an eine Vielzahl spezifisch bindender Verbindungen gebunden ist und/oder kovalent an eine Vielzahl von radioaktive Marker bindenden Einheiten gebunden ist, so daß es ein Reagenz zur Herstellung eines multimeren, polyvalenten Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung enthält, wobei das Molekulargewicht des multimeren, polyvalenten Mittels zur szintigraphischen Bilddarstellung weniger als etwa 20.000 Daltons beträgt, wobei es sich bei der polyvalenten Verbindungseinheit gegebenenfalls um Bis-succinimidylmethylether, 4-(2,2-Dimethylacetyl)benzoesäure, N-{2-(N',N'-Bis(2-succinimidoethyl)aminoethyl)}-N6,N9-bis(2-methyl-2-mercaptopropyl)-6,9-diazanonanamid, Tris(succinimidylethyl)amin, Tris(acetamidoethyl)amin, Bis(acetamidoethyl)ether, Bis(acetamidomethyl)ether, α,ε-Bisacetyllysin, Lysin und 1,8-Bisacetamido-3,6-dioxaoctan oder ein Derivat davon handelt.
  10. Mittel zur szintigraphischen Bilddarstellung, enthaltend ein Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Technetium-99m-bindende Einheit an Technetium-99m gebunden ist.
  11. Komplex, gebildet durch Umsetzung eines Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 mit Technetium-99m in Gegenwart eines Reduktionsmittels, z.B. Dithionitionen, Zinn(II)-Ionen oder Eisen(II)-Ionen, oder durch Markieren des Reagenz mit Technetium-99m durch Ligandenaustausch mit einem vorreduzierten Technetium-99m-Komplex.
  12. Kit zur Herstellung einer radiopharmazeutischen Zubereitung, wobei das Kit aus einem verschlossenen Vial besteht, das eine vorbestimmte Menge eines Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und ein Reduktionsmittel in einer Menge enthält, die ausreicht, um das Reagenz mit Technetium-99m zu markieren.
  13. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung als Pharmazeutikum zur Abbildung einer Stelle im Körper eines Säugetiers, wenn das Reagenz mit Technetium-99m markiert ist.
  14. Verfahren zur Herstellung eines Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Kit chemisch in vitro synthetisiert wird, gegebenenfalls durch Festphasenpeptidsynthese.
  15. Technetium-99m-Komplex eines Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
  16. Verwendung eines Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 9 bei der Herstellung eines Medikaments zur Abbildung einer Stelle im Körper eines Säugetiers.
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