DE69628154T2

DE69628154T2 - Antigen präsentierendes system und aktivierung von t-zellen

Info

Publication number: DE69628154T2
Application number: DE69628154T
Authority: DE
Inventors: Zeling Cai; Jonathan Sprent; Anders Brunmark; Michael Jackson; A. Per PETTERSON; M. Alain LUXEMBOURG; Jean Didier LETURCQ; M. Ann MORIARTY
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-03-08
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2016-03-09
Also published as: US6255073B1; US20030138946A1; DK0814838T3; ATE240119T1; US6225042B1; EP0814838B1; CA2214649A1; US20050152916A1; US6461867B1; ES2201177T3; US6362001B1; US20030077318A1; WO1996027392A1; PT814838E; EP0814838A4; AU720201B2; US6828150B2; EP0814838A1; US20030077708A1; US20030072796A1

Description

Diese Erfindung wurde mit der Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika gemacht und die Regierung der Vereinigten Staaten von Amerika hat bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft Materialien zur Aktivierung von T-Zellen mit Spezifität für bestimmte antigene Peptide und die Verwendung dieser Materialien, Verfahren für die Herstellung von Medikamenten zur Aktivierung von T-Zellen für die Behandlung einer Reihe von Krankheitszuständen.
Hintergrund
Die Effizienz, mit der das Immunsystem Individuen von einer infektiösen Krankheit heilt oder davor schützt, war schon immer von Interesse für Wissenschaftler, da angenommen wurde, dass es möglich sein könnte, das Immunsystem zu aktivieren, um andere Arten von Erkrankungen zu heilen. Solche Krankheiten umfassen Krebs, Aids, Hepatitis und eine infektiöse Erkrankung in immunsupprimierten Patienten. Während verschiedene Prozeduren in diesen Arten von Erkrankungen angewendet wurden, die die Verwendung von Antikörpern involvieren, wurde von wenigen, wenn überhaupt erfolgreichen Versuchen unter Verwendung von zytotoxischen T-Zellen berichtet. Theoretisch würden zytotoxische T-Zellen die bevorzugten Mittel zur Behandlung der oben genannten Arten von Erkrankungen sein. Jedoch sind keinerlei Verfahren verfügbar, um spezifisch zytotoxische T-Zellen zu aktivieren.
Zytotoxische T-Zellen oder CD8⁺-Zellen (d. h., Zellen, die das Molekül CD8 exprimieren), wie sie derzeit bekannt sind, stellen das hauptsächliche Verteidigungsmittel gegen virale Infektionen dar. CD8⁺-Lymphozyten erkennen und töten spezifisch Zellen, die durch einen Virus infiziert sind. Somit ist das Opfer der Eliminierung einer viralen Infektion der begleitende Verlust der infizierten Zellen. Die T-Zellrezeptoren auf der Oberfläche von CD8⁺-Zellen können Fremdantigene nicht direkt erkennen. Im Vergleich zu Antikörpern muss das Antigen zuerst den Rezeptoren präsentiert werden.
Die Präsentation des Antigens an CD8⁺-T-Zellen wird durch Moleküle des hauptsächlichen Histokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC) der Klasse des Typs I erreicht. Der hauptsächliche Histokompatibilitätskomplex (MHC) bezieht sich auf einen großen genetischen Lokus, der eine umfangreiche Familie von Glykoproteinen kodiert, welche eine wichtige Rolle in der Immunreaktion spielen. Die MHC-Gene, welche auch als der HLA (human leucocyte antigen, menschlicher Leukozyten-Antigen)-Komplex bezeichnet werden, sind in Menschen auf Chromosom 6 lokalisiert. Die durch die MHC-Gene kodierten Moleküle sind auf Zelloberflächen vorhanden und im Großen und Ganzen für die Erkennung von Gewebetransplantaten als „nicht-eigen" verantwortlich. Somit sind membrangebundene MHC-Moleküle eng in die Erkennung von Antigenen durch T-Zellen involviert.
MHC-Produkte werden in drei hauptsächliche Klassen eingruppiert, die als I, II und III bezeichnet werden. T-Zellen, die hauptsächlich als Helferzellen dienen, exprimieren CD4 und Wechselwirken primär mit Molekülen der Klasse II, wo hingegen CD⁸⁺- exprimierende Zellen, welche hauptsächlich zytotoxische Effektorzellen darstellen, mit Molekülen der Klasse I wechselwirken.
Moleküle der Klasse I sind Membranglykoproteine mit der Fähigkeit, Peptide zu binden, die primär aus dem intrazellulären Abbau von endogenen Proteinen abgeleitet sind. Komplexe von MHC-Molekülen mit Peptiden, die aus viralen, bakteriellen oder anderen Fremdproteinen abgeleitet sind, umfassen den Liganden, der die Antigenreaktion der T-Zellen auslöst. Im Gegensatz dazu spielen Komplexe von MHC-Molekülen mit Peptiden, die aus normalen zellulären Produkten abgeleitet sind, eine Rolle in der „Schulung" der T-Zellen in der Thymusdrüse, um eigene Peptide zu tolerieren. Moleküle der Klasse I präsentieren keine ganzen intakten Antigene; sie präsentieren eher Peptidfragmente davon, „geladen" auf ihre „Peptidbindungsfurche".
Viele Jahre haben Immunologen gehofft, spezifische zytotoxische Zellen zu züchten, die auf Viren, Retroviren und Krebszellen gerichtet sind. Während das Zielen gegen virale Erkrankungen im Allgemeinen in vivo durch Vakzinierung mit lebenden oder attenuierten Vakzinen erreicht wurde, gab es keinen ähnlichen Erfolg mit Retroviren oder mit Krebszellen. Zudem hatte der Vakzin-Ansatz nicht die gewünschte Wirkung in immunsupprimierten Patienten. Zumindestens ein Wissenschaftler hat den eher nicht spezifischen Ansatz der „Verstärkung" existierender CD8⁺-Zellen durch Inkubation dieser in vitro mit IL-2, einem Wachstumsfaktoren für T-Zellen, genommen. Jedoch wird dieses Protokoll (bekannt als LAK-Zelltherapie) nur die Expansion solcher CD8⁺-Zellen ermöglichen, welche bereits aktiviert sind. Da das Immunsystem immer aus dem einen oder anderen Grund heraus aktiv ist, werden die meisten der IL-2 stimulierten Zellen für den Zweck der Bekämpfung der Krankheit irrelevant sein. Tatsächlich ist bis jetzt nicht dokumentiert worden, dass diese Art von Therapie irgendwelche Zellen mit der gewünschten Spezifität aktiviert. Somit sind die Vorteile der LAK-Zelltherapie im besten Fall kontrovers und die Nebenwirkungen sind typischerweise so stark, dass viele Studien abgebrochen wurden.
Es wurden vor kurzem eine Reihe neuer Moleküle identifiziert, welche scheinbar in den Peptidbeladungsprozess involviert sind. Es wurde auch festgestellt, dass Moleküle der Klasse I ohne gebundenes Peptid (d. h., „leere" Moleküle) unter bestimmten restriktiven Umständen hergestellt werden können. Diese „leeren" Moleküle sind oft nicht in der Lage, die Zelloberfläche zu erreichen, da Moleküle der Klasse I ohne gebundenes Peptid sehr thermolabil sind. Somit zerlegen sich die „leeren" Moleküle der Klasse I während deren Transport von dem Inneren der Zelle zu der Zelloberfläche.
Die Präsentation von MHC-Molekülen der Klasse I, die allein an Peptid gebunden sind, ist im Allgemeinen in der Aktivierung von CD8⁺-Zellen nicht wirksam. In der Natur werden die CD8⁺-Zellen durch Antigen-präsentierende Zellen aktiviert, die nicht nur ein Peptid-gebundenes MHC-Molekül der Klasse I, sondern auch ein kostimulatorisches Molekül präsentieren. Solche kostimulatorischen Moleküle umfassen B7, von dem nun anerkannt wurde, dass es aus zwei Untergruppen besteht, die als B7.1 und B7.2 bezeichnet werden. Es wurde außerdem herausgefunden, dass Zelladhäsionsmoleküle wie Integrine in diesem Prozess assistieren.
Wenn die CD8⁺-T-Zelle mit einer Antigen-präsentierenden Zelle wechselwirkt, die das Peptid durch ein MHC-Molekül der Klasse I und ein kostimulatorischen Molekül gebunden hat, dann wird die CD8⁺-T-Zelle aktiviert, um zu proliferieren und wird eine bewaff nete Effektor-T-Zelle. Siehe hierzu im Allgemeinen Janeway und Travers, Immunobiology, publiziert durch Current Biology Limited, London (1994), welches hierin durch Referenzieren aufgenommen wird.
Entsprechend ist das, was benötigt wird, ein Mittel zur Aktivierung von T-Zellen, so dass diese proliferieren und zytotoxisch werden. Es wäre nützlich, wenn die Aktivierung in vitro durchgeführt werden könnte und die aktivierten zytotoxischen T-Zellen in den Patienten wieder eingeführt werden könnten. Es wäre auch wünschenswert, wenn die Aktivierung durch eine synthetische Antigen-präsentierende Matrix durchgeführt werden könnte, die aus einem Material wie Zellen besteht, welche nicht nur das ausgewählte Peptid präsentieren, sondern auch andere kostimulatorische Faktoren präsentieren, welche die Wirksamkeit erhöhen.
Es wäre auch vorteilhaft, wenn es möglich wäre, das Peptid so auszuwählen, dass im Wesentlichen nur solche CD8⁺-Zellen aktiviert werden würden, die gegen Zellen zytotoxisch sind, die das Peptid präsentieren.
Der Stand der Technik auf diesem Gebiet umfasst Paul et al., Fundamental Immunology, (1993), 133–135, Chen, L et al., Immunology Today, (1993), 14(10), 483–486, welcher offenbart, dass die effiziente Aktivierung von T-Zellen die Kostimulation des CD28-Rezeptors über das B7-Molekül auf Antigen-präsentierenden Zellen voraussetzt, Mottez, E. et al., Journal of Experimental Medicine, (1995), 181(2), 493–502, welcher offenbart, dass Zellen, die MHC-Moleküle der Klasse I exprimieren, die an ein einzelnes antigenes Peptid gebunden sind, durch T-Zellen erkannt werden, die spezifisch für den jeweiligen MHC-Peptid-Komplex sind und dass die Kokultivierung von naiven Splenozyten mit Zellen, die diese MHC-Peptid-Fusionsproteine und das B7.1-Antigen exprimieren, die Induktion primärer zytotoxischer T-Lymphozyten in vitro ermöglicht, Kishimoto H., et al., Journal of Experimental Medicine, (1996) 184(2), 531–7, welcher die verschiedenen Rollen von B7 und ICAM-I in der negativen Selektion von Thymozyten offenbart, Galvin et al., Journal of Immunology, (1992), 149(12), 3802–3808, welcher die Generierung von CHO-Zelllinien offenbart, die murine MHC-Moleküle der Klasse II entweder allein oder zusammen mit murinen B7-Molekülen exprimieren, Madsen et al., Nature, (1998) 332, 161–164, welcher die Entdeckung offenbart, dass die Kapazität eines bestimmten Donor-MHC-Antigens zur Induktion seiner Nichtreaktivität das Produkt seiner intrinsi schen Imunogenitität und der Antigenbeladung ist, die während der Vorbehandlung zur Verfügung vermittelt wird und Chen et al., Cell (1992), 71, 1093–1102, welcher offenbart, dass die B7-Expression eine CD8⁺-T-Zellreaktion induziert.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein synthetisches Antigen-präsentierendes System zur Präsentation eines MHC-Moleküls, das mit einem Peptid und einem unterstützenden Molekül komplexiert ist, an eine T-Zelle zur Aktivierung der T-Zelle.
In einer Ausführungsform betrifft das System eine synthetische Antigen-präsentierende Matrix mit einem Träger und mindestens dem extrazellulären Anteil eines MHC-Moleküls der Klasse I, der in der Lage ist, an ein ausgewähltes Peptid zu binden, das operativ an den Träger gebunden ist. Die Matrix umfasst auch ein unterstützendes Molekül, das operativ an den Träger gebunden ist. Das unterstützende Molekül wirkt als ein Rezeptor auf der CD8⁺-T-Zelle. Die MHC- und unterstützenden Moleküle sind in ausreichenden Anzahlen vorhanden, um eine Population von T-Zelllymphozyten gegen das Peptid zu aktivieren, wenn das Peptid an den extrazellulären Teil des MHC-Moleküls gebunden ist.
Es wurde herausgefunden, dass eine Antigen-präsentierende Matrix mit sowohl einem MHC-Molekül oder einem Teil eines MHC-Moleküls zusammen mit einem unterstützenden Molekül eine synergistische Reaktion in der Aktivierung von T-Zelllymphozyten gegen das Peptid zur Verfügung stellt. Beispiele von unterstützenden Molekülen sind kostimulatorische Moleküle wie B7.1 und B7.2 oder Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und LFA-3. Der extrazelluläre Anteil von solchen kostimulatorischen Molekülen kann auch verwendet werden. Ein anderer Typ eines kostimulatorischen Moleküls ist einer, der mit dem CD28-Molekül reagiert, wie Anti-CD28-Antikörper oder funktionelle Teile davon, z. B. Fab-Anteile.
Es wurde herausgefunden, dass eine spezifisch wirksame synergistische Reaktion aus einer Antigen-präsentierenden Matrix resultiert, an die MHC-Moleküle mit einem Peptid, einem kostimulatorischen Molekül und einem Adhäsionsmolekül gebunden sind. Insbesondere resultiert eine hochwirksame synergistische Generierung von zytotoxischer T-Zellaktivität aus der Kombination von B7.1 und ICAM-1.
Der für die Matrix verwendete Träger kann verschiedene Formen annehmen. Beispiele für den Träger umfassen einen festen Träger wie Metalle oder Plastiken, poröse Materialien wie Harz oder modifizierte Zellulosesäulen, Mikrokügelchen, Mikrotiterplatten, rote Blutzellen und Liposomen.
Eine andere Art von Träger ist ein Zellfragment, wie ein Zellmembranfragment oder eine ganze Zelle. In dieser Ausführungsform ist die Matrix tatsächlich Zellen, welche transfiziert wurden, um MHC-Moleküle und unterstützende Moleküle auf der Zelloberfläche zu präsentieren, zur Herstellung einer Antigen-präsentierenden Zelle (APC). Dieses wird dadurch durchgeführt, dass eine Zelllinie produziert wird, die mindestens eine exprimierbare MHC-Nucleotidsequenz der Klasse I für die MHC-schwere Kette enthält, vorzugsweise eine cDNA-Sequenz, die operativ mit einem ersten Promotor verbunden ist, und eine exprimierbare β-2-Mikroglobulin-Nucleotidsequenz, die operativ mit einem zweiten Promotor verbunden ist. Die MHC-schwere Kette und das β-2 Mikroglobulin assoziieren zusammen, um das MHC-Molekül auszubilden, das an das Peptid bindet. Das MHC-Protein bindet mit dem antigenen Peptid und präsentiert dieses auf der Oberfläche der Zelle. Die Zelle umfasst auch ein Gen für eine Nucleotidsequenz eines unterstützenden Moleküls, das operativ mit einem dritten Promotor verbunden ist. Das unterstützende Molekül wird auch auf der Oberfläche der Zelle präsentiert. Diese Moleküle werden auf der Oberfläche der Zelle in ausreichenden Anzahlen präsentiert, um eine Population von T-Zelllymphozyten gegen das Peptid zu aktivieren, wenn das Peptid an die Komplexe gebunden ist. Andere Moleküle auf der Oberfläche einer Zelle oder eines Zellfragments, wie Kohlenhydratbereiche, können auch einige Kostimulation für die T-Zellen zur Verfügung stellen.
Die Zelllinie ist dahingehend synthetisch, dass mindestens eines der oben beschriebenen Gene nicht in den Zellen natürliche vorhanden ist, von denen die Zelllinie abgeleitet wird. Es ist bevorzugt, eine poikilotherme Zelllinie zu verwenden, weil MHC-Moleküle thermolabil sind. Eine Reihe von Spezies sind für diesen Zweck nützlich. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,314,813 an Petersen et al., welches verschiedene Spezies für diese Verwendung diskutiert und durch Referenzieren aufgenommen wird. Es wird bevorzugt, eukaryontische Zellen und insbesondere Insektenzellen zu verwenden.
In einer Ausführungsform ist es besonders bevorzugt, mindestens zwei unterstützende Moleküle zu haben, wobei eines ein kostimulatorisches Molekül ist und das andere ein Adhäsionsmolekül ist. Es wurde herausgefunden, dass diese Kombination eine synergistische Wirkung hat, die eine noch größere T-Zellaktivierung zur Verfügung stellt als die einzelnen Moleküle zusammen. Es wurde auch herausgefunden, dass es vorteilhaft und bevorzugt ist, dass mindestens eines der transfizierten Gene unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.
Durch Verwendung der vorliegenden Erfindung ist es möglich, das Peptid in die Zelle einzuführen, während diese MHC-Moleküle produziert und sie ermöglicht dem Peptid, an die MHC-Moleküle zu binden, während diese noch innerhalb der Zelle sind. Alternativ dazu können die MHC-Moleküle als leere Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert werden und das in die Zellen nach den Molekülen eingeführte Peptid wird auf der Zelloberfläche exprimiert. In diesem zuletzt genannten Verfahren ist die Verwendung poikilothermer Zellen besonders vorteilhaft, da leere MHC-Moleküle, die noch nicht komplexiert oder n Peptide gebunden sind, thermolabil sind.
MHC-Moleküle der Klasse I wurden in Insektenzellen wie Drosophila melanogaster (Fruchtfliegen)-Zellen exprimiert. Da Drosophila nicht all die Komponenten eines Säugetierimmunsystems aufweist, sollten die verschiedenen Proteine, die in der Peptidbeladungsmaschinerie involviert sind, in solchen Zellen abwesend sein. Der Mangel an der Peptidbeladungsmaschinerie ermöglicht es, dass Moleküle der Klasse I als leere Moleküle auf der Zelloberfläche exprimiert werden.
Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Insektenzellen wie dem Drosophila-System ist, dass Drosophila-Zellen eine Temperatur von 28°C anstatt 37°C bevorzugen. Diese Tatsache ist sehr wichtig, da leere Moleküle der Klasse I thermolabil sind und bei 37°C zum Zersetzen tendieren. Durch die Inkubation der Klasse I-exprimierenden Drosophila-Zellen mit Peptiden, die an das Klasse I-Molekül binden können, ist es möglich, zu realisieren, dass fast jedes Klasse I-Molekül ein und dasselbe Peptid enthält. Diese Zellen sind dementsprechend sehr unterschiedlich von Säugetierzellen, bei denen die Klasse I-Moleküle viele verschiedene Arten von Peptiden enthalten, wobei die meisten von diesen aus eigenen, ungefährlichen zellulären Proteinen abgeleitet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung aktivierter CD8⁺-Zellen in vitro. Ein Verfahren umfasst das Inkontaktbringen von CD8⁺-Zellen in vitro mit einer der Antigen-präsentierenden Matrixen, die oben beschrieben werden, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, die CD8⁺-Zellen in einer Antigen-spezifischen Weise zu aktivieren. Das Verfahren kann zudem (1) die Abtrennung der aktivierten CD8⁺-Zellen aus der Antigen-präsentierenden Matrix und (2) das Suspendieren der aktivierten CD8⁺-Zellen in einem geeigneten Träger oder Hilfsstoff umfassen. Die Suspension ist für die Verabreichung an ein Individuum, das einer Behandlung bedarf, geeignet. Die Antigene können native oder nicht abgebaute Proteine oder Polypeptide umfassen oder sie können antigene Polypeptide umfassen, die in Peptidfragmente gespalten wurden, die mindestens 8 Aminosäuren vor der Inkubation mit den menschlichen MHC-Molekülen der Klasse I umfassen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Antigen-präsentierenden Matrix der Erfindung in einer geeigneten Suspension für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung eines medizinischen Zustandes. In verschiedenen Ausführungsformen kann der Zustand Krebs, Tumore, Neoplasmen, eine virale oder retrovirale Infektion, autoimmun- oder autoimmunartige Zustände umfassen. In einer Ausführungsform kann das Medikament in einer Form vorliegen, die zur intravenösen Injektion geeignet ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1–3 stellen ein Diagramm der Konstruktion der Expressionsplasmide pRmHa-2 und pRmHa-3 dar. In 1 wird die pRmHa-2-Herstellung gezeigt; in 2 wird die pRmHa-3-Herstellung gezeigt; und in 3 ist der pRmHa-3-Vektor illustriert, und es werden die Schnittstellen-, Polylinker-, Promotor- und Polyadenylierungsstellen sowie eine Stelle, an der eine Nukleotidsequenz zur Expression eingefügt werden kann, gezeigt;
Die 4 und 5 zeigen die Peptid-induzierte Thermostabilisierung von HLA B27 und HLA A2.1 durch HIV-Peptide, die auf der Oberfläche von Drosophila-Zellen exprimiert werden. Die durchschnittliche Fluoressenz von jeder Zellpopulation wird gegen die Inkubationsbedingungen graphisch aufgetragen gezeigt;
6 illustriert Daten aus einem Experiment, das entwickelt wurde, um zu bestimmen, ob Insektenzellen ein Antigen prozessieren können und es auf Klasse I-Moleküle laden können, und, ob die zuletzt genannten entweder endogen oder exogen abgeleitetes Antigen an T-Zellen präsentieren können. Schneider 2-(SC2) oder 3T3-Zellen, die mit K^b/β2 transfiziert waren, wurden mit Ovalbumin-Protein (OvPro) oder Ovalbumin-Peptid OVA 24 (OvPep) in isotonischen (Iso) oder hypertonen (Hyp) Medien inkubiert. (Die murine Zelllinie BALB/3T3 ist von der ATCC unter der Zugangsnummer CCL 163 verfügbar.) Nach der Behandlung wurden die Zellen mit dem T-Zellhybridom B3/CD8 kokultiviert. B3/CD8 ist ein T-Zellhybridom zwischen B3 (Carbone, et al., J. Exp. Med. 169: 603–12 (1989)), einer zytotoxischen T-Zelle, die für Ovalbumin-Peptid 253–276 spezifisch ist, das durch H-2K^b- Klasse I Moleküle präsentiert wird, und einer CD8- tragenden IL-2-sezernierende Zelllinie. Nach antigener Stimulation produziert B3/CD8 IL-2, was durch ³H-Thymidinaufnahme in einer IL-2-abhängigen Zelllinie CTLL (Gillis, et al., J. Immunol. 120: 2027 91978)) gemessen wird. Somit kann man durch Messung der Menge des hergestellten IL-2 die T-Zellerkennung untersuchen. Der Überstand aus den Kokulturen wurde auf IL-2 durch ³H-Thymidinaufnahme durch die IL-2-abhängige Zelllinie CTLL (ATCC Nr. TIB 214) analysiert. Die Menge des ³H-Thymidins, das aufgenommen wurde, wird graphisch gegen die ursprünglichen Zellbehandlungen aufgetragen;
7 illustriert die Expression von B7.1, ICAM-1 und MHC auf der Oberfläche von transfizierten Drosophila (Fliegen)-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung;
8 ist eine Graphik, die die Ergebnisse aus einem Fluoressenz-aktiviertem Zellsortierexperiment unter Verwendung von rekombinantem L^d-Maus-MHC, das an rote Blutzellen gebunden ist, zeigt;
9 ist eine Graphik, die die Ergebnisse aus einem Fluoressenz-aktiviertem Zellsortierexperiment unter Verwendung von rekombinantem K^b-Maus-MHC, das an rote Blutzellen gebunden ist, zeigt;
10 ist eine Graphik, die die Bindung von rekombinantem K^b an Mikrotiterplatten durch Verwendung markierter Antikörper zeigt;
11 ist eine Serie von Graphiken, die die Ergebnisse aus Fluoressenz-aktivierten Zellsortierexperimenten zeigt, die die Expression von CD69 und CD25 auf CD8⁺ 2C-Zellen zeigt, die mit transfizienem Drosophila-Zellen stimuliert waren, zeigen;
12 ist ein Paar von Balkengraphiken, die die IL-2-abhängigen proliferativen Reaktionen von CD8⁺ 2C-Zellen zeigen, die durch Peptide ausgelöst werden, die durch Drosophila-Zellen präsentiert werden, die nur mit L^d transfiziert sind;
13 ist eine Graphik, die den Einfluss der Peptidkonzentration auf die proliferativen Reaktionen der CD8⁺ 2C-Zellen am Tag 3 zeigen, die durch Peptide ausgelöst werden, die auf transfizierten Drosophila-Zellen präsentiert werden;
14 ist ein Paar von Graphiken, die den Einfluss der Dosis von Antigen-präsentierenden Zellen am Tag 3 auf die proliferative Reaktion und IL-2 Produktion von CD8⁺ 2C-Zellen aufzeigen, die durch Peptide ausgelöst wird, die durch transfizierte Drosophila-Zellen präsentiert werden;
15 ist eine Reihe von Graphiken, die den Einfluss der Peptidkonzentration auf die proliferative Reaktion von CD8⁺ 2C-Zellen aufzeigt, die durch Drosophila-Zellen ausgelöst wird, die mit L^d.B7, L^d.ICAM und L^d.B7.ICAM transfiziert sind;
16 ist eine Reihe von Graphiken, die die Kinetiken der proliferativen Reaktion von CD8⁺- und CD8^– 2C-Zellen aufzeigen, die durch Drosophila-Zellen ausgelöst werden, die mit L^d, L^d.B7, L^d.ICAM und L^d.B7.ICAM plus QL9-Peptid transfiziert sind;
17 ist eine Reihe von Graphiken, die die CTL-Aktivität von CD8⁺ 2C-Zellen zeigen, die durch Drosophila-Zellen stimuliert sind, die mit L^d.B7-, L^d.B7.ICAM- oder L^d.ICAM-präsentierenden Zellen plus QL9-Peptid (10 μM) in Abwesenheit von exogenen Zytokinen transfiziert sind;
18 ist eine Paar von Graphiken, die die CTL-Aktivität von CD8⁺ 2C-Zellen zeigen, die durch Drosophila-Zellen stimuliert sind, die mit L^d.ICAM-Antigen-präsentierenden Zellen plus QL9-Peptid (10 μM) in Abwesenheit (links) oder in der Gegenwart (rechts) von exogenem IL-2 (20 u/ml) transfiziert sind;
19 ist ein Paar von Graphiken, die die proliferative Reaktion von normalen (nicht transgenen) CD8⁺T-Zellen auf Peptide zeigen, die durch transfizierte Drosophila-Zellen (linke Spalte) präsentiert werden und die Reaktion, die durch abgestufte Dosen von N B6- und 2C B6 CD8⁺-Zellen ausgelöst wird, die mit 5 × 10⁵ B10.D2 (L^d) Milzzellen (2000 cGy) in Abwesenheit von Peptiden für 3 Tage ohne den Zusatz von exogenen Zytokinen (rechte Spalte) kultiviert werden;
20 ist eine Graphik, die die stimulierte Mitogenese von aufgereinigten CD8+T-Zellen zeigt, die auf Platten (20.000 pro Well) kultiviert wurden, die mit immobilisierten Molekülen mit Peptid QL9 (durchgezogene Linie = L^d und Anti-CD28-Antikörper, gestrichelte Linie = nur L^d) beschichtet sind;
21 ist eine Balkengraphik, die die stimulierte Mitogenese von aufgereinigten 2C⁺-T-Zellen am Tag 5 in Kultur zeigen, mit verschiedenen angezeigten Peptiden, die in Platten mit 96 Wells kultiviert wurden, die mit L^d- und Anti-CD28-Antikörper beschichtet sind (schräg gestrichelter Balken = kein IL-2, schwarzer Balken = IL-2 hinzugefügt);
22 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der zytofluorometrischen Analyse von Zellen, die nach 12 Tagen der Kultur aus Platten, die mit L^d- und Anti-CD28-Antikörper beschichtet waren und Peptid QL9 ausgesetzt wurden, gewonnen und unter Verwendung des 2C T-Zellrezeptor-spezifischen Antikörpers 1B2 gefärbt wurden (M2 = positiv gefärbte Zellen, M1 = negativ gefärbte Zellen);
23 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der zytofluorometrischen Analyse von Zellen, die nach 12 Tagen der Kultur auf Platten, die mit L^d- und Anti-CD28-Antikörper beschichtet waren und Peptid p2Ca ausgesetzt wurden, gewonnen und unter Verwendung des 2C T-Zellrezeptor-spezifischen Antikörpers 1B2 gefärbt wurden (M2 = positiv gefärbte Zellen, M1 = negativ gefärbte Zellen;
24 ist eine graphische Darstellung der Ergebnisse der zytofluorometrischen Analyse von Zellen, die nach 12 Tagen in Kultur auf Platten, die mit L^d und Anti-CD28-Antikörper beschichtet waren und Peptid SL9 ausgesetzt wurden, gewonnen und unter Verwendung des 2C T-Zellrezeptor-spezifischen Antikörpers 1B2 gefärbt wurden (M2 = positiv gefärbte Zellen, M1 = negativ gefärbte Zellen;
25 ist eine Graphik, die die Zytolyse von Zielzellen durch aktivierte T-Zellen zeigt (durchgezogene Linie = Peptid QL9, gestrichelte Linie = Kontrollpeptid LCMV);
26 ist eine graphische Darstellung der zytotoxischen Lyse, die aus der Aktivierung von menschlichen CD8⁺-T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen resultiert, die mit Influenza Matrixpeptid beladen sind;
27 ist eine graphische Darstellung des zytotoxischen Lyse, die aus der Aktivierung von menschlichen CD8⁺-T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen resultiert, die mit HIV-RT-Peptid beladen sind und;
28 ist eine graphische Darstellung der zytotoxischen Lyse, die aus der Aktivierung von menschlichen CD8⁺-T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen resultiert, die mit Tyrosinasepeptid beladen sind.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein synthetisches Antigen-präsentierendes System, welches verwendet werden kann, um T-Zelllymphozyten zu aktivieren. Die aktivierten CD8⁺-T-Zellen proliferieren, produzieren Zytokine, werden zytotoxisch oder es kommt zu einer Kombination dieser Ergebnisse. In einer bevorzugten Ausführungsform aktiviert das System zytotoxische CD8⁺-Zellen, welche dann proliferieren und dann aktiviert werden, um Zielzellen auszuwählen und zu zerstören. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um T-Zellen in vitro zu aktivieren und die aktivierten T-Zellen werden dann in den Patienten zurückgeführt, von dem sie ursprünglich abgeleitet worden waren, oder die Erfindung kann zur Herstellung eines Medikamentes zur in vivo-Aktivierung von T-Zellen verwendet werden.
Das synthetische Antigen-präsentierende System der vorliegenden Erfindung hat zwei hauptsächliche Komponenten. Die erste Komponente ist zumindest der extrazelluläre Anteil des MHC-Moleküls der Klasse I, der in der Lage ist, an ein ausgewähltes Peptid zu binden. Die zweite hauptsächliche Komponente ist ein unterstützendes Molekül, das die Aktivierung der T-Zellen unterstützt. In beiden Fällen kann ein extrazellulärer Anteil eines größeren Moleküls verwendet werden, aber in bestimmten Ausführungsformen werden die ganzen Moleküle verwendet.
Zur Vereinfachung der Beschreibung werden MHC-Moleküle im Allgemeinen mit dem Verständnis diskutiert, dass ein extrazellulärer Anteil des MHC-Moleküls verwendet werden kann. Der Teil des MHC-Moleküls, der für die vorliegende Erfindung benötigt wird, ist der Teil, welcher an das ausgewählte Peptid bindet und das Peptid der T-Zelle präsentiert.
Das Peptid wird ausgewählt, um, abhängig von der durchzuführenden Behandlung, die geeignete T-Zelle zu aktivieren. Zum Beispiel werden in der Behandlung von bestimmten Krebsarten, bestimmte antigene Peptide auf der Oberfläche der Krebszellen präsentiert, welche mit aktivierten T-Zellen reagieren werden. Somit ist es angemessen, ein ausgewähltes Peptid zu verwenden, um die geeigneten T-Zellen zu aktivieren, die dann an die Krebszellen binden und diese zerstören.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht, dass MHC-Moleküle durch Zellen produziert werden, bei denen das Peptid bereits mit dem MHC-Molekül komplexiert ist oder aber leere MHC-Moleküle zu produzieren, die nicht bereits mit einem Peptid komplexiert sind. Diese zuletzt genannte Ausführungsform ist besonders nützlich, da sie es ermöglicht; dass das Peptid ausgewählt wird, nachdem die MHC-Moleküle hergestellt wurden.
Ein MHC-Molekül der Klasse I umfasst eine schwere Kette, die manchmal als eine alpha-Kette bezeichnet wird sowie ein β-Mikroglobulin. Wie hierin diskutiert, besteht der extrazelluläre Teil eines MHC-Moleküls der Klasse I aus einem extrazellulärem Anteil einer MHC-schweren Kette zusammen mit dem β-2-Mikroglobulin.
Bei der Herstellung der extrazellulären Anteile von MHC, die an einen Träger gebunden werden sollen, werden lösliche Moleküle, wie unten diskutiert, hergestellt. Diesen Molekülen fehlt im Allgemeinen die Transmembran- und die zytoplasmatische Domäne in dem MHC-Molekül.
Das unterstützende Molekül unterstützt die Erleichterung der Aktivierung der T-Zelle, wenn es mit einem Peptid/MHC-Molekülkomplex präsentiert wird. Die vorliegende Erfindung umfasst zwei hauptsächliche Kategorien von unterstützenden Molekülen. Die erste Kategorie besteht aus kostimulatorischen Molekülen wie B7.1 (zuvor bekannt als B7 und auch bekannt als CD80) und B7.2 (auch bekannt als CD86), welche an CD28 auf T-Zellen binden. Andere kostimulatorische Moleküle sind Anti-CD28-Antikörper oder die funktionellen Anteile von solchen Antikörpern, z. B. Fab-Teile, die an CD28 binden.
Die andere Hauptkategorie von unterstützenden Molekülen der vorliegenden Erfindung sind Adhäsionsmoleküle. Diese umfassen die verschiedenen ICAM-Moleküle, die ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 und LFA-3 umfassen. Es wurde herausgefunden, dass die Kombination eines Peptids, das an ein MHC-Molekül gebunden ist, und in Verbindung mit einem dieser unterstützenden Moleküle verwendet wird, die T-Zellen in einem Ausmaß aktiviert, das vorher nicht zu sehen war.
Durch Verwendung eines peptidgebundenen MHC-Moleküls in Verbindung mit sowohl einem kostimulatorischen Molekül wie auch einem Adhäsionsmolekül wurde eine noch größere synergistische Reaktion erzielt. Es wurde herausgefunden, dass dieses besonders wirksam in der Herstellung zytotoxischer CD8⁺-Zellen ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden das MHC-Molekül und das unterstützende Molekül operativ an einen Träger gebunden, so dass die MHC- und unterstützenden Moleküle in ausreichenden Mengen vorhanden sind, um eine Population von T-Zelllymphozyten gegen das Peptid zu aktivieren, wenn das Peptid an den extrazellulären Anteil des MHC-Moleküls gebunden ist. Das Peptid kann an das MHC-Molekül vor oder nachdem das MHC-Molekül mit dem Träger verbunden wird gebunden sein.
Der Träger kann verschiedene Formen haben. Er kann eine fester Träger sein, wie ein Plastik- oder Metallmaterial, er kann ein poröses Material sein, wie es typischerweise in Trennsäulen verwendet wird, es kann ein Liposom oder eine rote Blutzelle sein, oder es kann sogar eine Zelle oder ein Zellfragment sein. Wie in mehr Detail unten diskutiert, können in dem Fall, in dem eine Zelle als Träger dient, die MHC- und unterstützenden Moleküle durch die Zelle hergestellt werden. Das MHC-Molekül wird dann an die Zelle durch mindestens die Transmembrandomäne gebunden, wenn nicht sogar auch durch die zytoplasmatische Domäne, welche in einer löslichen Form des MHCs nicht vorhanden sein würde.
Die extrazellulären Anteile des MHC-Moleküls und des unterstützenden Moleküls können an einen Träger durch das zur Verfügungstellen eines Epitops gebunden werden, welches mit einem Antikörper reagiert, der auf dem Träger immobilisiert ist. Zusätzlich. können die MHC- oder unterstützenden Moleküle mit (His)_n produziert werden oder daran gebunden werden, welches mit Nickel dahingehend reagiert, dass es einen Teil des Trägers ausbildet. Andere Mittel zur Immobilisierung oder Verbindung von MHC-Molekülen an einen Träger sind auf dem Gebiet wohl bekannt.
Wie oben diskutiert, kann der Träger eine Zellmembran oder eine ganze Zelle sein. In einem solchen Fall wird eine eukaryontische Zelllinie modifiziert, um eine synthetische Antigen-präsentierende Zelllinie zur Verwendung mit T-Zelllymphozyten zu werden. Zur Vereinfachung der Beschreibung werden Antigen-präsentierende Zellen (APC) auch Stimulatorzellen genannt. Da leere MHC-Moleküle thermolabil sind, ist es bevorzugt, dass die Zellkultur poilkilotherm ist und verschiedene Zelllinien werden unten detailliert diskutiert.
Zuerst wird eine Zellkultur etabliert. Die Kultur wird dann mit einem Gen einer exprimierbaren Klasse I MHC-schweren Kette transfiziert, welches operativ an einen Promotor gebunden ist. Das Gen wird so ausgewählt, dass es in der Lage ist, die Klasse I MHC-schwere Kette zu exprimieren. Die Zelllinie wird dann auch mit einem exprimierbaren β-2-Mikroglobulin-Gen transfiziert, welches operativ mit einem zweiten Promotor verbunden ist. Das Gen wird so ausgewählt, dass es in der Lage ist, β-2-Mikroglobulin zu exprimieren, das MHC-Moleküle mit der MHC-schweren Kette ausbildet. In dem Fall, dass lösliche extrazelluläre Anteile der MHC-Moleküle mit festen Phasen verwendet werden und ähnlichem, wird ein trunkiertes Gen der MHC-schweren Kette, wie unten detaillierter diskutiert, verwendet.
Die Kultur wird auch mit einem exprimierbaren Gen eines unterstützenden Moleküls transfiziert, das mit einem dritten Promotor verbunden ist. Das unterstützende Moleküle ist in der Lage, als ein unterstützendes Molekül exprimiert zu werden, welches mit dem Molekül auf den T-Zelllymphozyten wechselwirkt. Wie unten diskutiert, kann jedes dieser Gene unter Verwendung verschiedener Verfahren transfiziert werden, aber es ist das bevorzugte Verfahren, mehr als ein Plasmid zu verwenden.
Die transfizierte Zelllinie wird ausgewählt, da ihr mindestens eines der einzuführenden Gene fehlt. Es wurde herausgefunden, dass Insektenzellen nicht nur vorteilhaft sind, weil sie poilkilotherm sind, sondern weil es ihnen an diesen Genen fehlt und an dem Mechanismus, welcher ansonsten MHC-Moleküle produzieren würde, an die Peptide gebunden sind. Dieses ermöglicht eine bessere Kontrolle über die Herstellung von Pep tid-gebundenen MHC-Molekülen und über die Herstellung von leeren MHC-Molekülen. Die MHC-schwere Kette ist vorzugsweise von einer unterschiedlichen Spezies, mehr bevorzugt einer homeothermen, wie einem Säugetier, und optimalerweise vom Menschen.
Die bevorzugte Zelllinie ist eine stabile poilkilotherme Zelllinie, die einen ersten Promotor aufweist, der induzierbar ist, um die Expression der MHC-schweren Kette zu kontrollieren. Es ist bevorzugt, dass die Zelle leere MHC-Moleküle zusammenbaut und diese auf der Zelloberfläche so präsentiert, dass die Peptide wie gewünscht ausgewählt werden können.
Die resultierenden MHC-Moleküle binden an das Peptid und sind mit den unterstützenden Molekülen in ausreichenden Anzahlen auf der Oberfläche der Zelle vorhanden, um eine Population von T-Zelllymphozyten gegen das Peptid zu aktivieren, wenn das Peptid an die MHC-Zellen gebunden ist.
In einer weiteren Ausführungsform wird auch ein zweites unterstützendes Molekülen in die Zellkultur transfiziert. In diesem Fall kann das erste unterstützende Molekülgen für ein kostimulatorisches Molekül sein und das zweite unterstützende Molekülengen kann für ein Adhäsionsmolekül sein.
Es ist bevorzugt, dass mindestens eines der Gene, insbesondere das Gen der MHC-schweren Kette an einen induzierbaren Promotor gebunden ist. Dies ermöglicht eine Kontrolle über die Herstellung von MHC-Moleküle, so dass diese nur zu einem Zeitpunkt hergestellt werden, wenn das Peptid von Interesse verfügbar ist und in der Kultur prä sentiert wird, um mit den produzierten MHC-Molekülen zu reagieren. Dieses minimiert unerwünschte MHC-Molekül/Peptid-Komplexe.
Wenn die Zelllinie bereits eines oder mehrere der gewünschten Moleküle produziert, ist es nur notwendig, die Kultur mit einem exprimierbaren Gen für das Gen zu transfizieren, welches in den Zellen fehlt. Zum Beispiel, wenn die MHC-Moleküle bereits auf der Oberfläche der Zellen vorhanden sind, ist es nur notwendig, die Kultur mit einem exprimierbaren Gen für das unterstützende Molekül zu transfizieren.
Das Peptid kann in die Zellkultur zu dem Zeitpunkt eingeführt werden, wenn die Zellen MHC-Moleküle produzieren. Durch Verfahren, wie osmotischer Schock, können die Peptide in die Zelle eingeführt werden und binden an die produzierten MHC-Moleküle. Alternativ dazu, insbesondere im Fall von poilkilothermen Zelllinien, werden die MHC-Moleküle leer auf der Zelloberfläche präsentiert werden. Das Peptid kann dann zu der Kultur hinzugefügt werden und durch die MHC-Moleküle wie gewünscht gebunden werden.
Nachdem die Zellen mit MHC- und unterstützenden Molekülen auf deren Oberflächen hergestellt sind, können sie lyophilisiert werden und die Fragmente der Zellen können zur Aktivierung der Population von T-Zelllymphozyten verwendet werden.
Transfizierte Kulturen von Zellen können verwendet werden, um extrazelluläre Anteile von MHC-Molekülen und unterstützenden Molekülen herzustellen. Die Verwendung von extrazellulären Anteilen in Verbindung mit Trägem, wie festen Trägern, haben bestimmte Vorteile bei der Herstellung. Wenn lebende Zellen verwendet werden, um eine synthetische Antigen-präsentierende Zelle zur Verfügung zu stellen, müssen mindestens drei Gene, zwei zur Herstellung des MHC-Moleküls und eines für das unterstützende Molekül, in die Zelle eingeführt werden. Oft werden auch zusätzliche Gene wie für eine Antibiotikaresistenz eingeführt.
Wo ein festes Trägersystem verwendet wird, kann eine Zelllinie die extrazellulären Anteile der MHC-Moleküle produzieren, während eine andere Zelllinie den extrazellulären Teil des unterstützenden Moleküls herstellt. Die MHC-Molekülanteile und die Anteile des unterstützenden Moleküls können dann aus deren jeweiligen Kulturen geerntet werden.
Die Moleküle werden dann mit einem geeigneten Träger in ausreichenden Mengen verbunden, um eine Population von T-Zelllymphozyten gegen ein Peptid zu aktivieren, wenn das Peptid an den extrazellulären Teil des MHC-Moleküls gebunden ist. Von einem Standpunkt der Herstellung aus, können zwei verschiedene Kulturen verwendet werden, aber es ist auch möglich, die gleiche Kultur zu verwenden, was jedoch voraussetzt, dass die Kultur mit einem zusätzlichen Gen für den extrazellulären Anteil des unterstützenden Moleküls transfiziert wird.
Eine weitere Modifikation dieser Ausführungsform ist es, eine dritte Kultur von Zellen zur Verfügung zu stellen, welche mit einem exprimierbaren Gen eines zweiten unterstützenden Moleküls transfiziert ist. In diesem Beispiel produziert die zweite Zellkultur extrazelluläre Anteile des kostimulatorischen Moleküls, während die dritte Zellkultur einen extrazellulären Anteil eines Adhäsionsmoleküls produziert. Die Adhäsionsmolekülanteile werden geerntet und mit dem Träger verbunden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Aktivierung von CD8⁺- T-Zellen gegen ein ausgewähltes Peptid. Das Verfahren betrifft das zur Verfügungstellen einer Zelllinie, die MHC-Moleküle präsentiert, die ein Peptid und ein unterstützende Moleküle auf deren Oberflächen binden. Naive CD8⁺-T-Zellen können durch Entfernen aus einem zu behandelnden Patienten gewonnen werden. Die kultivierten Zellen werden dann mit den CD8⁺-T-Zellen für einen ausreichenden Zeitraum in Kontakt gebracht, um die CD8⁺-T-Zelllymphozyten zu aktivieren, was in der Proliferation und Transformation der T-Zellen in bewaffnete Effektorzellen resultiert.
Die aktivierten CD8⁺-T-Zellen können dann von der Zelllinie abgetrennt werden und in eine Suspension in einem verträglichen Träger überführt werden und diese ist zur Verabreichung an einen Patienten geeignet. Ein alternatives Verfahren involviert die Verwendung der synthetischen Antigen-präsentierenden Matrix zur Aktivierung der CD8⁺-Zellen in vitro.
Es ist bevorzugt, dass menschliche Gene verwendet werden und daher menschliche Molekülanaloga hergestellt werden. Wie in dem früheren U.S. Patent Nr. 5,314,813 gezeigt, stellen murine Systeme besonders nützliche Modelle zum Testen der Durchfüh rung der Zellaktivierung zur Verfügung und demonstrieren die Anwendbarkeit des Verfahrens auf menschliche Systeme. Siehe auch Sykulev et al., Immunity 1: 15–22 (1994).
1. Menschliche MHC-Moleküle der Klasse I
MHC-Moleküle der Klasse I umfassen eine schwere Kette und ein β-Mikroglobulinprotein. Eine menschliche Klasse I-MHC-schwere Kette der vorliegenden Erfindung ist aus der Gruppe ausgewählt, die HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F und HLA-G umfasst und mehr bevorzugt aus der Gruppe, umfassend HLA-A, HLA-B und HLA-C. Die schweren Ketten sind entweder in der löslichen oder unlöslichen Form verwendbar. In der löslichen ("sol") Form wird ein Stopkodon vor der Transmembranen in die Nucleotidsequenz eingebracht, die das HLA-Molekül der Wahl kodiert,.
Während es möglich ist, Nucleotidsequenzen, die menschliche Klasse I-MHC-schwere Ketten kodieren, aus bekannten etablierten Zelllinien zu isolieren, die die geeigneten Varianten tragen -- z. B., transformierte Zelllinien JY, BM92, WIN, MOC und MG --, ist es praktischer, die Nucleotidsequenz aus einem Teil des Gens mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der geeigneten Primer zu synthetisieren. Dieses Verfahren wurde erfolgreich verwendet, um HLA cDNA in Gesamtlänge zu klonieren; z. B. die Sequenzen für HLA-A25, HLA-A2, HLA-B7, HLA-B57, HLA-B51 und HLA-B37 sind in der GenBank-Datenbasis unter jeweils den Zugangsnummern M32321, M32322, M32317, M32318, M32319 und M32320 hinterlegt. Bekannte teilweise und vermeintliche HLA-Aminosäure- und Nucleotidsequenzen einschließlich der Konsensussequenz sind publiziert (siehe z. B:, Zemmour und Parham, Immunogenetics 33: 310–320 (1991)) und Zelllinien, die HLA-Varianten exprimieren, sind bekannt und im Allgemeinen auch verfügbar, viele von der American Typ Culture Collection ("ATCC"). Daher ist es unter Verwendung einer PCR möglich, Nucleotidsequenzen zu synthetisieren, die menschliches MHC der Klasse I kodieren, welche dann operativ mit einem Vektor verbunden werden können und verwendet werden können, um eine geeignete Zelle zu transformieren und darin exprimiert zu werden.
Besonders bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Klasse I-MHC-schweren Kette, β-2-Mikroglobulin-Proteinen und unterstützenden Molekülen der vorliegenden Erfindung basieren auf der Verwendung vorher ausgewählter Oligonucleotide als Primer in einer Polymerasekettenreaktion (PCR), um PCR-Reaktionsprodukte, wie hierin beschrieben, abzubilden. Die Genherstellung wird typischerweise durch Primerverlängerung erreicht, vorzugsweise durch Primerverlängerung in einem Polymerasekettenreaktions (PCR)-Format.
Wenn die Gene durch (PCR)-Amplifikation hergestellt werden sollen, müssen zwei Primer, d. h., ein PCR-Primerpaar, für jeden kodierenden Strang der Nukleinsäure, die amplifiziert werden soll, verwendet werden. (Für den Zweck der Vereinfachung wird die Synthese einer beispielhaften HLA-schweren Kette-Sequenzvariante diskutiert, aber es ist ausdrücklich zu verstehen, dass das beschriebene PCR-Amplifikationsverfahren gleichwohl auf die Synthese von β-2-Mikroglobulin, kostimulatorische Moleküle, Adhäsionsmoleküle und alle HLA-Varfahren anwendbar ist, einschließlich solcher, deren vollständige Sequenzen derzeit nicht bekannt sind.)
Der erste Primer wird Teil des Antisense- (minus oder komplementären) Stranges und hybridisiert an eine Nucleotidsequenz, die unter HLA (plus oder kodierenden)-Strängen konserviert ist. Um kodierende DNA-Homologe herzustellen, werden erste Primer daher ausgewählt, um (d. h. komplementär dazu) an konservierte Regionen innerhalb der MHC-Gene zu hybridisieren, vorzugsweise an die Konsensussequenz oder ähnlich konservierte Regionen innerhalb jeder HLA-Gruppe -- d. h., Konsensussequenz innerhalb HLA-A, HLA-B, HLA-C und der weniger polymorphen Gruppen HLA-E, -F und -G.
Die zweiten Primer werden Teil des kodierenden (plus)-Stranges und hybridisieren an eine Nucleotidsequenz, die unter den Minussträngen konserviert ist. Um die HLA-kodierende DNA-Homologa herzustellen, werden die zweiten Primer daher ausgewählt, um mit einer konservierten Nucleotidsequenz an dem 5'-Ende des HLA-kodierenden Gens so in der Gegend zu hybridisieren, die für die Leader- oder erste Gerüstregion kodiert. In der Amplifikation der kodierenden DNA-Homologa kann die konservierte 5'-Nucleotidsequenz des zweiten Primers komplementär zu einer Sequenz sein, die exogen unter Verwendung einer terminalen Deoxynucleotidyltransferase, wie durch Loh et al., Science 243: 217–220 (1989) beschrieben, hinzugefügt wurde. Eine oder beide der ersten und zweiten Primer können eine Nucleotidsequenz enthalten, die eine Endonucleaseerkennungsstelle definiert. Die Stelle kann heterolog zu dem Immunglobulingen sein, das amplifiziert wird und kommt typischerweise an oder in der Nähe des 5'-Endes des Primers vor.
Die hohe Umsatzrate der RNA-Polymerase amplifiziert das Anfangspolynucleotid wie durch Chamberlin et al., The Enzymes, Ed. P Boyer, S. 87–108, Academic Press, New York (1982) beschrieben. Ein anderer Vorteil der T7 RNA-Polymerase ist, dass Mutationen in die Polynucleotidsynthese durch das Ersetzen eines Teils der cDNA mit einem oder mehreren mutagenen Oligodeoxynucleotiden (Polynucleotide) und das direkte Transkribieren des teilweise fehlbelegten Templates eingeführt werden können, wie es zuvor durch Joyce et al., Nuc. Acid Res. 17: 711–722 (1989) beschrieben wurde. Amplifikationssysteme, die auf Transkription basieren, wurden durch Gingeras et al., in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, S. 245–252, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990) beschrieben.
PCR-Amplifikationsverfahren werden im Detail in den U.S. Patenten Nr. 4,683,192; 4,683,202, 4,800,159 und 4,965,188 beschrieben und zumindestens in verschiedenen Texten, einschließlich "PCR Technology: Prinicples and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, Ed., Stockton Press, New York (1989); und "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al., Eds., Academic Press San Diego, California (1990). Verschiedene hierin verwendete bevorzugte Verfahren und Primer werden hiernach beschrieben und werden z. B. auch in Nilsson et al., Cell 58: 707 (1989), Ennis et al., PNAS USA 87: 2833–7 (1990) und Zemmour et al., Immunogenetics 33: 310–20 (1991) beschrieben. Insbesondere ist es bevorzugt, Primer aus dem Vergleich der 5'-und 3'–nicht-translatierten Regionen der HLA-Allelen (z. B., -A-, -B-, -C-, -E-, -F- oder - G-Allelen) unter Auswahl von konservierten Sequenzen zu entwickeln. Restriktionsschnittstellen können auch in die 5'- und 3'-Primen eingeführt werden, um es zu ermöglichen, dass die Amplifikationsprodukte in Sequenz- und Expressionsvektoren subkloniert werden können. Es kann auch hilfreich sein, eine 4-Basenabstandssequenz proximal zu der Restriktionsschnittstelle zu platzieren, um die Effizienz des Schneidens der Amplifikationsprodukte mit Enzymen zu verbessern.
Die folgenden Primer sind zur Amplifikation von HLA-A, -B, -C, -E, -F und -G cDNA bevorzugt, vorzugsweise in separaten Reaktionen. Resultierende cDNAs können dann wie hierin beschrieben kloniert und sequenziert werden. Diese Primer sind zur Verwendung in der Amplifikation aller bekannten und derzeit unbekannter Arten von HLA geeignet.
HLA A
HLA B
HLA C
HLA E
HLA F
HLA G
In bevorzugten Ausführungsformen wird nur ein Paar der ersten und zweiten Primen pro Amplifikationsreaktion verwendet. Die Amplifikationsreaktionsprodukte, die aus einer Vielzahl verschiedener Amplifikationen gewonnen wurden, jedes unter Verwendung einer Vielzahl verschiedener Primerpaare, werden dann kombiniert. Allerdings betrifft die vorliegende Erfindung auch eine DNA-Homologenproduktion mittels Ko-Amplifikation (unter Verwendung von zwei Paaren von Primern) und Multiplexamplifikation (unter Verwendung von bis zu ungefähr 8, 9 oder 10 Primerpaaren).
In bevorzugten Ausführungsformen wird das PCR-Verfahren nicht nur verwendet, um eine Reihe von menschlichen Klasse I-kodierenden DNA-Molekülen herzustellen, sondern auch zur Induktion von Mutationen, welche solche immulieren können, die in den hochpolymorphen HLA-Loci zu sehen sind, oder, um eine Diversität aus einem einzelnen parentalen Klon zu kreieren und dadurch eine Klasse 1-MHC-Molekül-kodierende DNA-"Bibliothek" mit größerer Heterogenität zur Verfügung zu stellen. Zusätzlich zu den mutationsinduzierenden Variationen, die in dem oben referenzierten U.S. Patent Nr. 4,683,195 beschrieben werden und solche, wie sie in U.S. Patent Nr. 5,314,813 diskutiert werden.
2. DNA-Expressionsvektoren
Ein Vektor der vorliegenden Erfindung ist ein Nucleinsäure (vorzugsweise DNA)-Molekül, das zur autonomen Replikation in einer Zelle in der Lage ist, und an welche ein DNA-Segment, z. B., Gen oder Polynucleotid, so operativ gebunden werden kann, dass es die Replikation des verbundenen Segments bewirkt. Eines der Nucleotidsegmente, die operativ mit den Vektorsequenzen zu verbinden sind, kodiert mindestens einen Teil der Säugetier-Klasse I-MHC-schweren Kette. Vorzugsweise wird die gesamte Peptid-kodierende Sequenz der MHC-schweren Kette in den Vektor eingefügt und exprimiert; jedoch ist es auch denkbar, einen Vektor zu konstnuieren, welcher auch einige nicht kodierenden MHC-Sequenzen umfasst. Vorzugsweise sind nicht kodierende Sequenzen von MHC ausgeschlossen. Alternativ dazu kann eine Nucleotidsequenz für eine lösliche ("sol") Form einer Klasse I-MHC-schweren Kette verwendet werden; die "sol"-Form unterscheidet sich von der Nicht-sol-Form dahingehend, dass sie ein "Stop"-Kodon enthält, das an dem Ende der Alpha 3-Domäne oder vor der Transmembrandomäne eingefügt ist. Ein weiterer bevorzugter Vektor umfasst eine Nucleotidsequenz, die mindestens einen Teil eines Säugetier-β-2-Mikroglobulinmoleküls kodiert, das operativ mit dem Vektor zur Expression verbunden ist. Ein noch weiterer bevorzugter Vektor umfasst eine Nucleotidsequenz, die mindestens einen Teil eines Säugetier-unterstützenden Moleküls kodiert, das operativ mit dem Vektor zur Expression verbunden ist. Es ist auch möglich, einen Vektor zu konstruieren, der Nucleotidsequenzen umfasst, die eine Klasse I-MHC-schwere Kette und ein -β-2-Mikroglobulin und ein unterstützendes Molekül oder eine Kombination von diesen umfasst.
Ein bevorzugter Vektor umfasst eine Kassette, die eine oder mehrere translatierbare DNA-Sequenzen umfasst, die operativ zur Expression mittels einer Sequenz von Nucleotiden, die zur direktionalen Ligation adaptiert ist, verbunden sind. Die Kassette umfasst vorzugsweise DNA-Expressionskontrollsequenzen zur Exprimierung des Polypeptids oder Proteins, das hergestellt wird, wenn eine translatierbare DNA-Sequenz gerichtet in die Kassette über die Nucleotidsequenz eingeführt wird, die zur gerichteten Ligation adaptiert ist. Die Kassette umfasst vorzugsweise auch eine Promotorsequenz stromaufwärts von der translatierbaren DNA-Sequenz und eine Polyadenylierungssequenz stromabwärts von der Säugetier-MHC-schweren Kettensequenz. Die Kassette kann auch einen Selektionsmarker umfassen, obwohl es bevorzugt ist, dass solch ein Marker in einer Nucleotidsequenz kodiert ist, die operativ an eine andere Expressionsvektorsequenz gebunden ist.
Die Wahl des Vektors, an welchen eine Kassette dieser Erfindung operativ gebunden ist, hängt direkt, wie auf dem Gebiet wohl bekannt ist, von den erwünschten funktionellen Eigenschaften ab, z. B., Vektorreplikation und Proteinexpression und der zu transformierenden Wirtszelle, wobei diese Einschränkungen inhärent auf dem Gebiet der Herstellung rekombinanter DNA-Moleküle sind.
In verschiedenen Ausführungsformen wird ein Vektor zur Herstellung von Polypeptiden verwendet, die in der vorliegenden Erfindung nützlich sind, einschließlich MHC-Varianten und antigener Peptide. Beispielhafte Vektoren umfassen die Plasmide pUC8, pUC9, pUC18, pBR322 und pBR329, die von BioRad Laboratories (Richmond, CA) verfügbar sind, pPL und pKK223 sind von Pharmacia (Piscataway, NJ) verfügbar und pBS und M13mp19 (Stratagene, La Jolla, CA). Andere beispielhafte Vektoren umfassen pCMU (Nilsson et al., Cell 58: 707 (1989)). Andere geeignete Vektoren können auch gemäß bekannten Verfahren synthetisiert werden; z. B. sind die Vektoren pCMU/K^b und pCMU-II, die in verschiedenen Anwendungen hierin verwendet werden, Modifikationen von pCMUIV (Nilsson et al., supra).
Zusätzlich gibt es vorzugsweise eine Sequenz stromaufwärts der translatierbaren Nucleotidsequenz, die eine Promotorsequenz kodiert. Vorzugsweise ist der Promotor konditional (z. B., induzierbar). Ein bevorzugter konditionaler Promotor, der hierin verwendet wird, ist ein Metallothionein-Promotor oder ein Hitzeschock-Promotor.
Vektoren können unter Verwendung jeglicher wohlbekannter Vektorherstellungstechniken hergestellt werden. Solche Techniken sind jedoch in dem Ausmaß modifiziert, dass die einzufügende translatierbare Nucleotidsequenz in das Genom der Wirtszelle "stromaufwärts" der Sequenz durch einen geeigneten Promotor flankiert ist, und in einigen Variationen der vorliegenden Erfindung ist die translatierbare Nucleotidsequenz "stromabwärts" durch eine Polyadenylierungsstelle flankiert. Dieses ist besonders bevorzugt, wenn die "Wirts"-Zelle eine Insektenzelle ist und die Nucleotidsequenz mittels Transfektion übermittelt wird. Die Transfektion kann durch vielfältige Verfahren erreicht werden, einschließlich dem Kalziumphosphatverfahren, dem DEAE-Dextranverfahren, dem stabilen Transferverfahren, der Elektroporation oder mittels des LiposomVermittlungsverfahrens. Es sind zahlreiche Texte verfügbar, die bekannte Transfektionsverfahren und andere Prozeduren zur Einführung von Nucleotiden in Zällen wiedergeben; siehe z. B., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991).
Der Vektor selbst kann von jedem geeigneten Typ sein, wie ein viraler Vektor (RNA oder DNA), nackte geradkettige oder zirkuläre DNA oder ein Vesikel oder eine Hülle, die das Nucleinsäurematerial enthält und jegliche Polypeptide, die in die Zelle einzufügen sind. In Bezug auf Vesikel sind Techniken zur Herstellung von Lipidvesikeln, wie Liposomen, wohl bekannt. Solche Liposomen können auf bestimmte Zellen unter Verwendung anderer konventioneller Techniken gezielt werden, wie das zur Verfügungstellen eines Antikörpers oder eines anderen spezifisch bindenden Moleküls auf der Oberfläche des Liposoms. Siehe z. B., A. Huang et al., J. Biol. Chem. 255: 8015–8018 (1980). Siehe z. B. Kaufman, Meth. Enzymol. 185: 487–511 (1990).
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Vektor zudem einen selektierbaren Marker. Nach der Expression kann das Produkt der translatierbaren Nucleotidsequenz dann unter Verwendung von Antikörpern gegen diese Sequenz aufgereinigt werden. Ein Beispiel eines selektierbaren Markers ist die Neomycinresistenz. Ein Plasmid, das Neomycinresistenz kodiert, wie phshsneo, phsneo oder pcopneo, kann in jeder Transfektion mitumfasst sein, so dass eine Population von Zellen, die das Gene) der Wahl exprimiert, durch das Wachsen der Transfektanten in Selektionsmedium sichergestellt wird.
Ein bevorzugter Vektor zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Plasmid; mehr bevorzugt ist es ein Plasmid in hoher Kopienzahl. Es ist auch wünschenswert, dass der Vektor eine induzierbare Promotorsequenz enthält, da induzierbare Promotoren den Selektionsdruck, gegen die Zellen, in welche solche Vektoren eingeführt werden (welche oft konstruiert werden, um nicht native oder chimäre Nucleotidsequenzen zu tragen) einzuschränken tendieren. Es ist auch bevorzugt, dass der ausgewählte Vektor bestens für die Expression in dem gewählten Wirt ist. Wenn die Wirtszellpopulation eine Drosophila-Zellkultur ist, dann umfasst ein kompatibler Vektor, Vektoren, die funktionell äquivalent zu diesen sind, wie p25-IacZ (siehe Belle und Couble, Nature 346: 480 (1990)) oder pRmHa-1, -2 oder -3 (siehe Bunch et al., Nucl. Acids Res. 16: 1043–1061 (1988)). In der bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor pRmHa-3, welcher in 3 gezeigt wird. Dieser Vektor umfasst einen Metallothionein-Promotor, welcher vorzugsweise stromabwärts von der Position ist, an welcher die MHC-Sequenz eingeführt ist und die Polyadenylierungsstelle ist vorzugsweise stromabwärts von besagter MHC-Sequenz. Insektenzellen und insbesondere Drosophila-Zellen sind bevorzugte Wirtszellen gemäß der vorliegenden Erfindung. Drosophila-Zellen, wie Schneider 2 (S2)-Zellen, haben die notwendigen trans-wirkenden Faktoren, die zur Aktivierung des Promotors notwendig sind, und sind somit sogar noch mehr bevorzugt.
Der Expressionsvektor pRmHa-3 basiert auf dem bakteriellen Plasmid pRmHa-1 ( 2), wobei das letztere auf Plasmid pUC18 basiert und bei der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) mit der Zugangsnummer 37253 hinterlegt ist. Der pRmHa-3-Vektor enthält den Promotor, die 5'-nicht translatierte Leadersequenz des Metallothioneingens (Sequenzen 1–421, SEQ ID NO 13), wobei die R1- und Stu-Stellen entfernt wurden; siehe 3). Er enthält auch den 3'-Anteil des Drosophila-ADH-Gens (Sequenz #6435–7270, SEQ ID NO 14), einschließlich der Polyadenylierungsstelle. Daher wird die klonierte DNA transkriptionell durch den Metallothionein-Promotor reguliert werden und polyadenyliert sein. Die Herstellung des pRmHa-1-Plasmids wird in Bunch et al., Nucl. Acids Res. 16: 1043–1061 (1988) beschrieben. Die Herstellung der pRmHa-3- und pRmHa-2-Plasmide (das letztere von diesen weist eine Metallothioneinpromotorsequenz auf, die als ein Eco RI-Fragment entfernt werden kann), wird in den 1, 2 und 3 illustriert. Bezüglich pRmHa-3, einem bevorzugten Plasmid zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, sind Pst I, Sph I und Hind III in dem Promotorfragment und daher nicht einzigartig. Xba ist in dem ADH-Fragment (4 Basen von seinem 3'-Ende) und ist auch nicht einmalig. Die folgenden Restriktionsschnittstellen sind jedoch in pRmHa-3 einmalig vorhanden: Eco RI, Sac I, Kpn I, Sma I, Bam HI, Sal I, Hinc 2 und Acc I.
Eine Kassette in einem DNA-Expressionsvektor dieser Erfindung liegt in der Region des Vektors, der nach Einfügen einer translatierbaren DNA-Sequenz, eine Sequenz von Nucleotiden ausbildet, die in der Lage ist, in einem geeigneten Wirt ein Fusionsprotein dieser Erfindung zu exprimieren. Die Expressions-kompetente Sequenz von Nucleotiden wird als ein Cistron bezeichnet. Somit umfasst die Kassette vorzugsweise DNA-Expressionskontrollelemente, die operativ mit einer oder mehreren translatierbaren DNA-Sequenzen verbunden sind. Ein Cistron wird ausgebildet, wenn eine translatierbare DNA-Sequenz gerichtet zwischen die Kontrollelemente mittels der Sequenz von Nucleotiden eingeführt wird (gerichtet ligiert wird), die für diesen Zweck adaptiert ist. Die resultierende translatierbare DNA-Sequenz, namentlich die eingefügte Sequenz, ist vorzugsweise operativ in das geeignete Leseraster eingebunden.
DNA-Expressionskontrollsequenzen umfassen einen Satz an DNA-Expressionssignalen zur Exprimierung eines strukturellen Genprodukts und umfassen sowohl 5'- wie auch 3'-Elemente, wie wohl bekannt ist, die operativ mit dem Cistron verbunden sind, so dass das Cistron in der Lage ist, ein strukturelles Genprodukt zu exprimieren. Die 5'-Kontrollsequenzen definieren einen Promotor zur Einleitung der Transkription und eine. Ribosomenbindungsstelle, die operativ mit dem 5'-Terminus der stromaufwärts gelegenen translatierbaren DNA-Sequenz verbunden ist.
Somit stellt ein DNA-Expressionsvektor dieser Erfindung ein System zur Klonierung translatierbarer DNA-Sequenzen in den Kassettenanteil des Vektors zur Herstellung eines Cistrons zur Verfügung, das in der Lage ist, ein. Fusionsprotein dieser Erfindung zu exprimieren.
3. Zelllinien
Eine bevorzugte Zelllinie der vorliegenden Erfindung ist in der Lage, kontinuierlich in Kultur zu wachsen und in der Lage; Säugetier-Klasse I-MHC-Moleküle und unterstützende Moleküle auf der Oberfläche dieser Zellen zu exprimieren. Jegliche einer Reihe transformierter und nicht-transformierter Zellen oder Zelllinien ist für diesen Zweck geeignet, einschließlich bakterieller, Hefe-, Insekten- und Säugetierzelllinien. (Siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1991), für Zusammen fassungen und Verfahren zur Kultivierung und Verwendung einer Reihe von Zelllinien, z. B., E. coli und S. cerevisiae.)
Vorzugsweise ist die Zelllinie eine eukaryontische Zelllinie. Mehr bevorzugt ist die Zelllinie poikilotherm (d. h., weniger anfällig für eine Temperaturherausforderung als Säugetierzelllinien). Mehr bevorzugt ist es, eine Insektenzelllinie. Verschiedene Insektenzelllinien sind zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung verfügbar, einschließlich Motte (ATCC CCL80), Armeewurm (ATCC CRL 1711), Moskitolarve (ATCC-Linien CCL 125, CCL 126, CRL 1660, CRL 1591, CRL 6585, CRL 6586) und Seidenwurm (ATCC CRL 8851). In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zelllinie eine Drosophila-Zelllinie wie eine Schneider-Zelllinie (siehe Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 27: 353– 364 (1972)); vorzugsweise ist die Zelllinie eine Schneider 2 (S2)-Zelllinie (S2/M3), die zum Wachstum in M3-Medium adaptiert ist (siehe Lindquist et al., Drosophila Informations Service 58: 163 (1982)).
Schneiderzellen können im Wesentlich wie folgt hergestellt werden. Drosophila melanogaster (Oregon-R)-Eier werden über einen 4-Stunden-Intervall gesammelt und in 2,5% wässrigem Natriumhypochlorit dechloriniert und durch Eintauchen in 70% Ethanol für 20 Minuten oberflächensterilisiert, gefolgt durch weitere 20 Minuten in 0,05% HgCl₂ in 70% Ethanol. Nachdem sie ausgiebig in sterilem destillierten Wasser abgespült wurden, werden die Eier auf Petrischalen transferiert, die sterile Metricel schwarze Filter enthalten, die mit Milliporevorfiltern unterstützt werden, die beide zuvor mit Kulturmedium benetzt worden sind. Die Eier werden über Nacht in einen 22°C-Inkubator platziert und zur Kultivierung entfernt, wenn sie 20–24 Stunden alt sind. Die Embryos werden jeweils in Hälften oder Drittel geschnitten, dann in 0,2% Trypsin (1 : 250, Difco) in Rinaldini's Salzlösung (Rinaldini, Nature (London) 173: 1134–1135 (1954)) für 20–45 Minuten bei Raumtemperatur platziert. Um die 100–300 Embryos werden verwendet, um jede Kultur einzuleiten.
Nach dem Zusatz von fötalem Rinderserum (FBS) werden die Fragmente bei 100 × g für 2–3 Minuten zentrifugiert, in 1,25 ml Kulturmedium resuspendiert und in Glas-T-9-Gefäßen ausgesät. Die Kulturen werden dann bei ungefähr 22–27°C ± 0,5°C mit einer Gasphase aus milder Luft aufbewahrt. Schneiders Kulturmedium (Schneider, J. Exp. Zool. 156: 91–104 (1964); Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 15: 271–279 (1966)), enthaltend zusätzliche 500 mg bakterielles Pepton pro 100 ml Medium und mit 15% inaktiviertem FBS supplementiert, wird vorzugsweise verwendet. Der pH (vorzugsweise 6,7–6,8) wird mit 0,01% Phenol rot überwacht. Die Zelllinien werden vorzugsweise durch Unterkultivierung alle 3–7 Tage aufbewahrt. Die Zellen kleben leicht an das Glas, aber nicht so stark, dass sie einer Trypsinbehandlung bedürfen; typischerweise ist einfaches Pipettieren ausreichend, um die meisten der Zellen von dem Boden der Gefäße abzuspülen. Das morphologische Erscheinungsbild der Zellen wird in Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 27: 353–365 (1972) beschrieben. Sie sind im Wesentlichen epithelartig in ihrer Erscheinung und liegen im Bereich von 5–11 μm im Durchmesser und 11–35 μm in Länge. Kleine Taschen, die runde Zellen enthalten, können zufällig unter den anderen Zellen dispergiert sein.
Vorzugsweise werden die Schneider 2 (S2)-Zellen in Schneiders^TM Drosophila-Medium plus 10% FBS, einschließlich Penicillin (100 Einheiten/ml) und Streptomycin (100 mg/ml), aufbewahrt. Es ist bevorzugt, die Zellen bei einer Dichte von mehr als 0,5 × 10⁵/ml zu halten und sie in einem Temperaturbereich von 24–30°C wachsen zu lassen. Die Zellen tendieren dahin, sich in weniger als 24 Stunden zu verdoppeln und zu einer hohen Zelldichte heranzuwachsen, d. h., ungefähr 2 × 10⁷/ml oder mehr. Die Zellen können auch in 90% FBS und 10% DMSO zur späteren Verwendung oder Analyse eingefroren werden. Man kann die Zellen bei –70°C einfrieren und dann in flüssigem Stickstoff aufbewahren.
Zellen der vorliegenden Erfindung werden mit cDNA's transfiziert, die (menschliche) MHC-schwere Ketten, β-2-Mikroglobulin und eines oder mehrere unterstützende Moleküle kodieren, welche jeweils in einen Expressionsvektor eingefügt wurden (d. h., operativ damit verbunden sind). In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst der Vektor das Drosophila-Expressionsplasmid pRmHa-3, in welches exprimierbare Nucleotidsequenzen, die menschliche Klasse I-MHC-schwere Ketten, menschliches (3-2-Mikroglobulin oder menschliche unterstützende Moleküle unter Verwendung der hierin offenbarten Techniken eingeführt wurden. Vorzugsweise sind die cDNAs, die MHC-schwere Ketten kodieren, solche, die β-2-Mikroglobulin kodieren und solche, die unterstützende Moleküle kodieren, operativ mit verschiedenen Expressionsplasmiden verbunden und werden in die kultivierten Zellen ko-transfiziert.
Alternativ dazu können die cDNAs, die MHC-schwere Ketten, β-2-Mikroglobulin und unterstützende Moleküle kodieren, operativ mit dem gleichen Expressionsplasmid verbunden sein und mittels des gleichen Plasmids ko-transfiziert werden. In einer anderen Abwandlung werden cDNAs, die MHC-schwere Ketten, β-2-Mikroglobulin, unterstützende Moleküle und ein Zytokin, wie IL-2 kodieren, operativ an Expressionsplasmide gebunden und in eine Zelllinie der vorliegenden Erfindung ko-transfiziert. Die Auswahl von HLA-Genen, die Herstellung eines geeigneten Vektors und die Primerauswahl wird in mehr Detail oben beschrieben.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h., Zellen, die eine exprimierbare menschliche Nucleotidsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten, können mittels wohl bekannter Techniken identifiziert werden. Zum Beispiel können Zellen, die aus der Einführung einer cDNA oder rDNA der vorliegenden Erfindung resultieren, kloniert werden, um monoklonale Kolonien zu produzieren. Zellen aus diesen Kolonien können geerntet, lysiert und deren DNA-Inhalt auf die Gegenwart der rDNA unter Verwendung eines Verfahrens, wie des durch Southern, J. Mol. Biol. 98: 503 (1975) beschriebenen untersucht werden. Zusätzlich zur direkten Untersuchung auf die Gegenwart von rDNA kann die erfolgreiche Transformation oder Transfektion durch wohl bekannte immunologische Verfahren bestätigt werden, wenn die rDNA in der Lage ist, die Expression eines bestimmten chimären Polypeptids zu dirigieren. Zum Beispiel können Zellen, die erfolgreich mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, Proteine herstellen, die bestimmte antigene Eigenschaften aufzeigen, welche leicht unter Verwendung geeigneter Antikörper zu bestimmen sind. Zusätzlich kann die erfolgreiche Transformation/Transfektion mittels der Verwendung eines zusätzlichen Vektors bestätigt werden, der eine Markersequenz aufweist, wie eine Neomycinresistenz, wie hierin oben beschrieben wurde.
Es ist auch bevorzugt, dass die Kultur stabil ist und in der Lage ist, bei reduzierten Temperaturen dauerhaft zu wachsen. Zum Beispiel ist es bevorzugt, dass die Kultur bei ungefähr Raumtemperatur, d. h., ungefähr 24–27°C, aufbewahrt werden kann. In anderen Ausführungsformen wird die Kultur bei höheren Temperaturen aufbewahrt, insbesondere während des Verfahrens der Aktivierung von CD8⁺-Zellen. Es ist somit bevorzugt, dass eine Kultur gemäß der vorliegenden Erfindung in der Lage ist, einer Temperaturherausforderung von ungefähr 30°C bis ungefähr 37°C zu widerstehen. Die Zuga be von β-2-Mikroglobulin zu einer Kultur stabilisiert das Klasse I-MHC gegen eine Temperaturherausforderung von mindestens 30°C; die Zugabe von β-2-Mikroglobulin und Peptiden resultiert in größerer Thermostabilität bei höheren Temperaturen, d. h., bei 37 °C.
Um die Kultur zur Exprimierung von leeren -- oder mehr bevorzugt, Peptid-beladenen -- MHC-Moleküle herzustellen, kann die Kultur zuerst einer Stimulation bedürfen, z. B., mittels CuSO₄-Induktion für einen vorbestimmten Zeitraum. Nach einer geeigneten Induktionszeit -- z. B., ungefähr 12–48 Stunden, können Peptide bei einer vorgewählten Konzentration (z. B. ungefähr 100 μg/ml) hinzugefügt werden. Die Peptide können, wie unten diskutiert, hergestellt werden. Nach einer weiteren Inkubationszeit -- z. B., für ungefähr 12 Stunden bei 27°C -- ist die Kultur zur Verwendung in der Aktivierung von CD8⁺-Zellen fertig. Während dieser zusätzliche Inkubationszeitraum verkürzt oder gegebenenfalls weggelassen werden kann, tendiert die Kultur dahingehend, erhöht stabil gegen eine Temperaturherausforderung zu werden, wenn wird, für einen Zeitraum vor dem Hinzufügen ruhender oder naiver CD8⁺-Zellen inkubiert zu werden. Zum Beispiel sind die Kulturen gemäß der vorliegenden Erfindung, zu welchen Peptid hinzugefügt wurde, in der Lage, wesentliche Mengen an Peptid-beladenen Klasse I-MHC-Molekülen zu exprimieren, sogar, wenn diese für längere Zeiträume bei 37°C inkubiert werden.
In der Kultivierung transformierter Wirtszellen nützliche Nährmedien sind auf dem Gebiet wohl bekannt und können aus allerlei kommerziellen Quellen erhalten werden. In Ausführungsformen, in denen die Wirtszelle aus Säugetieren ist, wird vorzugsweise "serumfreies" Medium verwendet.
4. Menschliches β-2-Mikroglobulin und unterstützende Moleküle
Um eine Zelllinie zu etablieren, die in der Lage ist, therapeutisch nützliche Mengen an oberflächenexprimierten menschlichen Klasse.I-MHC-Molekülen herzustellen, ist es bevorzugt, eine Zelllinie der vorliegenden Erfindung mit einem Vektor zu ko-transfizieren, der operativ mit einer Nucleotidsequenz verbunden ist, die β-2-Mikroglobulin kodiert, um wirksame Expressionsmengen von menschlichen MHC-Molekülen in der Zelllinie zu bewirken. Während die Nucleotidsequenz, die menschliches β-2-Mikroglobulin kodiert, wie Maus-β-2-Mikroglobulin, die Stabilität der menschlichen Klasse I-MHC-Moleküle erhöht, die in den Zelllinien der vorliegenden Erfindung exprimiert werden, ist es bevorzugt, die Zelllinie mit einem Vektor zu ko-transfizieren, der mit einer exprimierbaren Nucleotidsequenz verbunden ist, die ein menschliches β-2-Mikroglobulin kodiert.
Wie oben diskutiert, umfasst ein bevorzugter Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung eine Nucleotidsequenz, die mindestens einen Teil eines Säugetier-β-2-Mikroglobulinmoleküls kodiert, das operativ mit dem Vektor zur Expression verbunden ist. Das Gen für die unterstützenden Moleküle kann an den gleichen oder an einen anderen Vektor gebunden sein. Es ist auch möglich, einen Vektor herzustellen, der sowohl Nucleotidsequenzen einer Klasse I-MHC-schwere Kette wie auch eines β-2-Mikroglobulins umfasst.
Die Sequenzierung und Primer, die für die unterstützenden Moleküle verwendet werden, werden in größerem Detail unten diskutiert. Jedoch sind die Protokolle ähnlich.
Eine menschliche β-2-Mikroglobulin cDNA-Sequenz wurde publiziert (siehe Suggs et al., PNAS 78: 6613–17, 1981) und die Sequenz wurde als ein Template für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der folgenden Primer verwendet: 5'-Primen:
3'-Primer:
Die Primer werden in einer Standard-PCR-Reaktion verwendet (siehe oben und die hierin zitierten Referenzen). Die Reaktionsprodukte werden mit Phenol extrahiert, unter Verwendung eines Geneclean^TM-Kits (Bio 101, San Diego, CA) aufgereinigt, mit Bam HI verdaut und in die Bam NI-Schnittstelle von pBS kloniert (Stratagene, La Jolla, CA). Nach Verifizierung der Sequenz wird dieses Bam HI-Fragment in die Bam HI-Schnittstelle eines geeigneten Expressionsvektors kloniert. In der bevorzugten Ausführungs form wird menschliche β-2-Mikroglobulin cDNA synthetisiert und operativ mit dem Expressionsvektor pRmHa-3 verbunden.
5. Peptide
Zusätzlich zu viralen Antigenen sind so gut wie alle zellulären Proteine in der Lage, verwendet zu werden, um relevante Peptidfragmente zu generieren, die als potientieller Klasse I-MHC-Ligand dienen. In den meisten Säugetierzellen würde dann jeglicher bestimmter MHC-Peptidkomplex nur einen kleinen Anteil der gesamten MHC-kodierten Moleküle darstellen, die auf der Zelloberfläche zu finden sind. Daher ist es, um oberflächenexprimierte menschliche Klasse I-MHC-Moleküle herzustellen, die eine erhöhte Kapazität zur spezifischen Aktivierung von CD8⁺-Zellen haben, bevorzugt, Peptidfragmente geeigneter Größe und antigener Eigenschaften zu isolieren und auf Klasse I-Moleküle zu laden.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung binden an Klasse I-MHC-Moleküle. Die Bindung findet unter biologischen Bedingungen statt, die sowohl in vivo wie auch in vitro hergestellt werden können. Die genaue Natur der Bindung der Peptide muss zur Durchführung der Erfindung nicht bekannt sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Peptide, die auf die Klasse I-MHC-Moleküle zu laden sind, antigen. Es ist auch bevorzugt, dass die Peptide von einheitlicher Größe sind, vorzugsweise 8-mere oder 9-mere und am meisten bevorzugt 8-mere. Es ist auch bevorzugt, dass die Peptide, die zur Beladung auf die MHC-Moleküle hergestellt werden, von einer einzelnen Spezies stammen, d. h., dass alle Peptide, die auf die MHC geladen werden, in Größe und Sequenz identisch sind. In dieser Weise ist es möglich, monoantigene peptidbeladene MHC-Moleküle herzustellen.
Die Peptide können den Zellen mittels verschiedener Mittel präsentiert werden. Vorzugsweise werden die Peptide in einer Weise präsentiert, welche es ihnen erlaubt, in einen intrazellulären Peptidpool hinein zu kommen. Zum Beispiel können Peptide mittels osmotischer Beladung präsentiert werden. Typischerweise werden Peptide zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Die Peptide können zu der Kultur im Form eines intakten Polypeptids oder Proteins hinzugefügt werden, welches anschließend mittels zellulärer Pro zesse abgebaut wird, z. B., mittels enzymatischem Abbau. Alternativ dazu kann das intakte Polypeptid oder Protein mittels anderer Mittel, wie chemischem Verdau (z. B. Cyanogenbromid) oder Proteasen (z. B. Chymotrypsin) vor seiner Zugabe zu der Zellkultur abgebaut werden. In anderen Ausführungsformen werden die Peptide in kleineren Segmenten präsentiert, welche Epitopeaminosäuresequenzen umfassen können oder auch nicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine ausreichende Menge an Protein(en) oder Peptid(en) zu der Zellkultur hinzugefügt, um es den Klasse I-MHC-Molekülen zu ermöglichen, zu binden und anschließend eine große Dichte des Peptids präsentiert -vorzugsweise, mit der gleichen Art des Peptids, das an jedes MHC gebunden ist -- auf der Oberfläche von menschlichen Klasse I-MHC-exprimierenden Zellen der vorliegenden Erfindung. Es ist auch bevorzugt, es den menschlichen Klasse I-MHC-schweren Ketten und dem menschlichen β-2-Mikroglobulin zu ermöglichen, intrazellulär vor dem Präsentieren des Peptids an die MHC-Molekülen zu binden -- d. h., Heterodimere auszubilden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Peptide zu transfizierten Zellen der vorliegenden Erfindung hinzugefügt, um die Thermostabilität der durch die Zellen exprimierten MHC-Moleküle zu verbessern. Wie oben festgestellt, werden Peptide vorzugsweise zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Antigene Peptide, die die Klasse I-Moleküle binden, dienen zur Thermostabilisierung der MHC-Moleküle und erhöhen auch die Zelloberflächenexpression. Kulturen mit hinzugefügten Peptiden, die die MHC-Moleküle binden, sind somit gegenüber Temperaturangriffen erheblich weniger anfällig als Kulturen ohne hinzugefügtes Peptid.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden antigene Peptide der transformierten/transfizierten Zelllinie in verschiedenen Formen präsentiert. Zum Beispiel kann ein ganzes Protein oder andere antigene Polypeptide können chemisch oder z. B. enzymatisch abgebaut werden, und zu der Zelllinie in dieser Form hinzugefügt werden. Zum Beispiel wird ein Protein von Interesse mit Chymotrypsin abgebaut und die resultierende Mischung von Peptid-"Fragmenten" wird zu einer transformierten oder transfizierten Zellkultur hinzugefügt. Diesen Zellen wird dann ermöglicht, die geeigneten Peptide (welches oft kleinere Peptide sind, vorzugsweise 8-mere oder 9-mere) "auszu wählen", um diese auf die Klasse I-MHC-Moleküle zu laden. Alternativ dazu kann ein ganzes Protein oder eine Polypeptidsequenz in einen geeigneten Vektor kloniert werden und in eine prokaryontische Zelle eingefügt werden, wodurch die Zelle wesentliche Mengen des antigenen Polypeptids generiert, welche dann geerntet, aufgereinigt und in Peptide verdaut werden, welche dann zu der transformierten/transfizierten eukaryontischen Zellkultur hinzugefügt werden. Es würde der Zelle dann wiederum gestattet werden, die Peptide "zu wählen", die auf die exprimierten MHC geladen werden.
6. Isolierung von ruhenden oder Vorläufer-CD8⁺-Zellen
Ruhende (oder naive oder Vorläufer-) CD8⁺-Zellen -- d. h., T-Zellen, die nicht aktiviert wurden, um auf ein spezifisches Antigen zu zielen -- werden vorzugsweise aus dem Patienten vor der Inkubation der CD8⁺-Zellen mit den transformierten Kulturen der vorliegenden Erfindung extrahiert. Es ist auch bevorzugt, dass Vorläuferzellen aus einem Patienten vor der Einleitung einer anderen Behandlung oder Therapie geerntet werden, welche mit der Fähigkeit der CD8⁺-Zellen, spezifisch aktiviert zu werden, interferieren könnt. Zum Beispiel, wenn man vorhat, ein Individuum mit einem Neoplasma oder Tumor zu behandeln, ist es bevorzugt, eine Zellprobe und Kultur vor der Einleitung der Chemotherapie oder der Bestrahlungsbehandlung zu gewinnen.
Verfahren zum Extrahieren und Kultivieren von Lymphozyten sind wohl bekannt. Zum Beispiel beschreibt U.S. Patent Nr. 4,690,915 an Rosenberg ein Verfahren zur Gewinnung großer Anzahlen an Lymphozyten mittels Lymphozytophorese. Geeignete Kulturbedingungen, die verwendet werden, sind für menschliche Zellen, welche typischerweise bei 37°C durchgeführt werden.
Verschiedene Verfahren sind auch zur Abtrennung und/oder Anreicherung von Kulturen von Vorläufer-CD8⁺-Zellen verfügbar. Einige Beispiele von allgemeinen Verfahren zur Zellabtrennung umfassen die indirekte Bindung von Zellen an spezifisch beschichtete Oberflächen. In einem anderen Beispiel werden menschliche periphere Blutlymphozyten (PBL), welche CD8⁺-Zellen umfassen, durch Ficoll-Hypaque^TM-Gradientenzentrifugation (Pharmacia, Piscataway, NJ) isoliert. PBL-Lymphoblasten können direkt danach verwendet werden oder können in Flüssigstickstoff nach Einfrieren in FBS, das 10% DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) enthält, gelagert werden, was die Zellüberlebensfähigkeit und Lymphozytenfunktionen konserviert.
Alternative Verfahren zur Abtrennung und/oder Anreicherung von Kulturen von Vorläuferzellen umfassen sowohl positive wie auch negative Selektionsverfahren. Für eine positive Selektion werden Lymphozyten-angereicherte PBL-Populationen aus Gesamtblut hergestellt, Subpopulationen von CD8⁺-Lymphozyten werden daraus durch Affinitäts-basierende Trenntechniken isoliert, die auf die Gegenwart des CD8-Rezeptorantigens gerichtet sind. Diese affinitätsbasierenden Techniken umfassen die Mikrofluorimetrie, einschließlich der Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS), Zelladhäsion und ähnliche Verfahren. (Siehe z. B., Scher und Mage, in Fundamental Immunology, W. E. Paul, Ed., S. 767–780; River Press, NY (1984).) Affinitätsverfahren können Anti-CD8-Rezeptorantikörper als Quelle für das Affinitätsreagenz verwenden. Alternativ dazu kann der natürliche Ligand oder Ligandenanaloga des CD8-Rezeptors als das Affinitätsreagenz verwendet werden. Verschiedene Anti-T-Zell- und-Anti-CD8-monoklonale Antikörper zur Verwendung in diesen Verfahren sind im Allgemeinen von einer Reihe kommerzieller Quellen verfügbar, einschließlich der American Type Culture Collection (Rockwell, MD) und Pharmingen (San Diego, CA).
Es werden negative Selektionsverfahren verwendet, um das Entfernen von Nicht-CD8 von der CD8⁺-Population zu bewirken. Diese Technik resultiert in der Anreicherung von CD8⁺-Zellen aus der T- und B-Zellpopulation von leukophoresierten Patienten. Abhängig von der Antigenbestimmung können verschiedene Antikörper geeignet sein. (Für eine Diskussion und einen Überblick der Nomenklatur, Antigenbezeichnung und bestimmte Antikörper für menschliche Leukozyten, einschließlich T-Zellen, siehe Knapp et al., Immunology Today 10: 253–258 (1989) und Janeway et al. Immunobiology, supra.) Zum Beispiel werden die monoklonalen Antikörper OKT4 (Anti-CD4, ATCC Nr. CRL 8002), OKT 5 (ATCC Nrs. CRL 8013 und 8016), OKT 8 (Anti-CD8, ATCC Nr. CRL 8014) und OKT 9 (ATCC Nr. CRL 8021) in dem ATCC-Katalog von Zelllinien und Hybridomazellen (ATCC; Rockwell, MD) als mit jeweils menschlichen Lymphozyten, menschlichen T-Zellsubsätzen und aktivierten T-Zellen reaktiv identifiziert. Verschiedene andere Antikörper sind zur Identifizierung und Isolierung von T-Zellspezies verfügbar.
In einer weiteren Ausführungsform können CD8⁺-Zellen durch das Kombinieren von sowohl negativen wie auch positiven Selektionsverfahren (siehe z. B., Cai und Sprent, J. Exp. Med. 179: 2005–2015 (1994)) isoliert werden.
Vorzugsweise werden die PBLs dann aufgereinigt. Zum Beispiel können Ficoll^TM-Gradienten für diesen Zweck verwendet werden. Die aufgereinigten PBLs würden dann mit syngenen Drosophila-Zellen vermischt werden, die mit den geeigneten antigenen Peptiden vorinkubiert sind.
7. In vitro-Aktivierung von CD8⁺-Zellen
Um die in vitro-Bedingungen für die Generierung spezifischer zytotoxischer T-Zellen zu optimieren, wird die Kultur der Antigen-präsentierenden Zellen in einem geeigneten Medium aufbewahrt. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Antigen-präsentierenden Zellen Drosophila-Zellen, welche in serumfreien Medium (z. B., Excell 400) aufbewahrt werden.
Vor der Inkubation der Antigen-präsentierenden Zellen mit den zu aktivierenden Zellen, z. B. Vorläufer CD8⁺-Zellen, wird eine Menge antigenes Peptid von ausreichender Menge zu der Antigen-präsentierenden Zellkultur hinzugefügt, damit sie auf die menschlichen Klasse I-Molekülen geladen werden, die auf der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zellen zu exprimieren sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine ausreichende Peptidmenge eine Menge, die es ermöglicht, dass ungefähr bis ungefähr 500.000 und vorzugsweise ungefähr 200 bis 1.000 oder mehr, menschliche Klasse I- MHC-Moleküle mit dem zu exprimierenden Peptid auf die Oberfläche von jeder Antigen-präsentierenden Zelle geladen werden. Vorzugsweise werden die Antigen-präsentierenden Zellen mit >20 μg/ml-Peptid inkubiert.
Ruhende oder Vorläufer-CD8⁺-Zellen werden dann in Kultur mit den geeigneten Antigen-präsentierenden Zellen für einen Zeitraum inkubiert, der zur Aktivierung und weiteren Anreicherung einer Population von CD8⁺-Zellen ausreicht,. Vorzugsweise sollten die CD8⁺-Zellen somit in einer Antigen-spezifischen Weise aktiviert sein. Das Verhältnis von ruhenden oder Vorläufer CD8⁺ (Effektor)-Zellen zu Antigen-präsentierenden Zellen kann von Individuum zu Individuum variieren und kann des Weiteren von Variablen abhängen, wie der Zugänglichkeit der Lymphozyten eines Individuums auf die Kulturbedingungen und die Natur und Schwere des Krankheitszustandes oder eines anderen Zustandes, für welchen die hierin beschriebene Behandlungsmodalität verwendet wird. Vorzugsweise ist jedoch das Lymphozyten : Antigen-präsentierende Zelle (z. B. Drosophila-Zelle)-Verhältnis vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 30 : 1 bis 300 : 1. Zum Beispiel wurden in einer Ausführungsform 3 × 10⁷ menschliche PBL- und 1 × 10⁶ lebende Drosophila-Zellen vermischt und in 20 ml RPMI 1640 Kulturmedium aufbewahrt.
Die Effektor/Antigen-präsentierende Kultur kann, so lange wie es notwendig ist, aufbewahrt werden, um eine Population von therapeutisch nützlichen oder wirksamen Anzahlen von CD8⁺-Zellen zu aktivieren und anzureichern. Allgemein gefasst liegt die optimale Zeit zwischen ungefähr einem und fünf Tagen mit einem "Plateau" -- d. h. eine "maximale" spezifische CD8⁺-Aktivierungsmenge --, das im Allgemeinen nach fünf Kulturtagen beobachtet wird. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die in vitro-Aktivierung von CD8⁺-Zellen innerhalb eines kurzen Zeitraumes nach Transfektion einer Zelllinie nachgewiesen. In einer Ausführungsform wird die transiente Expression in einer transfizierten Zelllinie, die zur Aktivierung von CD8⁺-Zellen in der Lage ist, innerhalb von 48 Stunden nach Transfektion nachgewiesen. Dieses zeigt deutlich, dass sowohl stabile wie auch transiente Kulturen von transformierten Zellen, die menschliche Klasse I-MHC-Moleküle exprimieren, in der Aktivierung von CD8⁺-Zellen wirksam sind.
Vorzugsweise ist die Anreicherung und übereinstimmende Aktivierung von CD8⁺-Zellen innerhalb einer Woche des Aussetzens zu Antigen-präsentierenden Zellen optimal. Danach werden in einer bevorzugten Ausführungsform die angereicherten und aktivierten CD8⁺-Zellen weiter durch Isolationsverfahren aufgereinigt, einschließlich Positionsrestriktion, "Rosetting" mit Antikörper-roten Blutzellpräparationen, Säulenchromatografie und Ähnlichem. Nach der Aufreinigung wird die resultierende CD8⁺-Zellpräparation weiter durch Aufbewahren in Kultur für einen Zeitraum, um eine Population von 10⁹ aktivierten CD8⁺-Zellen zu erhalten, expandiert. Dieser Zeitraum kann, abhängig von der Replikationszeit der Zellen, variieren, beträgt jedoch im Allgemeinen 14 Tage. Die Aktivierung und Expansion von CD8⁺-Zellen wurde durch Riddell et al., Curr. Opin. Immunol., 5: 484–491 (1993) beschrieben.
8. Abtrennung von CD8⁺-Zellen aus Drosophila-Zellen
Aktivierte CD8⁺-Zellen können wirksam aus den Stimulator (z. B: Drosophila)-Zellen unter Verwendung einer Reihe bekannter Verfahren abgetrennt werden. Zum Beispiel können monoklonale Antikörper, die für die Stimulatorzellen, für die auf die Stimulatorzellen, für die Peptide, die auf die Stimulatorzellen geladen sind oder für die CD8⁺-Zellen (oder ein Segment davon) spezifisch sind, verwendet werden, um deren geeigneten komplementären Liganden zu binden. Antikörper-markierte Zellen können dann aus der Stimulator-Effektorzellmischung mittels geeignetem Mittel extrahiert werden, z. B. mittels wohl bekannter Immunopräzipitations- oder Immunoassayverfahren.
9. Verabreichung von aktivierten CD8⁺-Zellen
Wirksame zytotoxische Mengen der aktivierten CD8⁺-Zellen können zwischen in vitro- und in vivo-Verwendungen variieren, sowie mit der Menge und der Art der Zellen, die das ultimative Ziel dieser Killerzellen sind. Die Menge wird auch abhängig von dem Zustand des Patienten variieren und sollte durch den praktizierenden Arzt unter Berücksichtigung aller geeigneter Faktoren bestimmt werden. Vorzugsweise werden jedoch ungefähr 1 × 10⁶ bis ungefähr 1 × 10¹², mehr bevorzugt ungefähr 1 × 10⁸ bis ungefähr 1 × 10¹¹ und noch mehr bevorzugt ungefähr 1 × 10⁸ bis ungefähr 1 × 10¹⁰ aktivierte CD8⁺-Zellen für erwachsene Menschen, im Vergleich zu ungefähr 5 × 10²–5 × 10⁷ Zellen, die in Mäusen verwendet werden, verwendet.
Vorzugsweise werden, wie oben diskutiert, die aktivierten CD8⁺-Zellen aus der Drosophila-Zellkultur vor der Verabreichung von CD8⁺-Zellen an das zu behandelnde Individuum geerntet. Es ist wichtig, festzustellen, dass, anders als derzeitige und vorgeschlagene Behandlungsmodalitäten, die vorliegende Erfindung ein Zellkultursystem verwendet (d. h., Drosophila-Zellen), das nicht tumorgen ist. Daher, wenn eine vollständige Abtrennung von Drosophila-Zellen und aktivierten CD8⁺-Zellen nicht erreicht wird, gibt es keine inhärente Gefahr, die mit der Verabreichung einer kleinen Anzahl von Drosophila-Zellen assoziiert ist, wohingegen die Verabreichung von Säugetiertumor-unterstützenden Zellen extrem gefährlich sein kann.
Verfahren zur Wiedereinführung zellulärer Komponenten sind auf dem Gebiet bekannt und umfassen Verfahren, wie solche, die in dem US Patent Nr. 4,844,893 an Honsik et al. und U.S. Patent Nr. 4,690,915 an Rosenberg beispielhaft dargestellt sind. Zum Beispiel ist die Verabreichung aktivierter CD8⁺-Zellen mittels intravenöser Infusion geeignet.
10. HLA-Typisierung
Wie zuvor festgestellt, variieren HLA-Haplotypen/Allotypen von Individuum zu Individuum, und obwohl sie nicht essentiell für die Durchführung der vorliegenden Erfindung sind, ist es oft hilfreich, den HLA-Typ eines Individuums zu bestimmen. Der HLA-Typ kann mittels Standardtypisierungsverfahren bestimmt werden und die PBLs können durch Ficoll^TM-Gradienten aufgereinigt werden. Die aufgereinigten PBLs würden dann mit syngenen Drosophila-Zellen vermischt werden, die mit den geeigneten antigenen Peptiden vorinkubiert wurden -- z. B., in therapeutischen Anwendungen, die sich auf virale Infektionen, Krebsarten oder maligne Erkrankungen beziehen, Peptide, die aus viralen- oder Krebs-spezifischen Proteinen abgeleitet sind.
Unter Weiterführung der Verwendung viraler oder maligner Zustände als ein Beispiel, wird in solchen Fällen, in denen spezifische Peptide eines bestimmten viralen oder krebsspezifischen Antigens charakterisiert wurden, die synthetisierten Peptide, die diese Epitope kodieren, vorzugsweise verwendet werden. In Fällen, in welchen die bevorzugten antigenen peptide nicht genau bestimmt wurden, können Proteaseverdaue von viralen und krebsspezifischen Proteinen verwendet werden. Als eine Quelle für ein solches Antigen wird cDNA, die die viralen oder krebsspezifischen Proteine kodiert, in ein bakterielles Expressionsplasmid einkloniert und verwendet, um Bakterien zu transformieren, z. B., mittels der hierin offenbarten Verfahren.
Nach HLA-Typisierung können, wenn Drosophila-Zellen, die die bevorzugten HLA exprimieren, nicht verfügbar sind, cDNAs, die das bevorzugte HLA kodieren, durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion kloniert werden. Die in Abschnitt B.1 oben offenbarten Primer (SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 12) können verwendet werden, um die geeigneten HLA-A, -B, -C, -E, -F oder -G cDNAs in separaten Reaktionen zu amplifizieren, welche dann, wie in den Verfahren beschrieben, die für HLA-A.2 unten offenbart sind, kloniert und sequenziert werden können. Stabile Zelllinien, die das klonierte HLA exprimieren, können dann in Drosophila-Zellen etabliert werden. Alternativ dazu kann eine Population von Insektenzellen, die transient eine Stammpopulation klonierten re kombinanter Moleküle aus der PCR-Reaktion exprimieren, für eine in vitro CD8⁺-Aktivierung verwendet werden.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Illustration, sind aber nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung vorgesehen.
Beispiel 1
Expression von menschlichen Klasse I-MHC-Molekülen
A. Herstellung des pRmHa-3-Expressionsvektors
Der pRmHa-3-Expressionsvektor zur Verwendung in der Expression von MHC-Proteinen in Drosophila-Schneider 2 (S2)-Zellen, wie in dieser Erfindung beschrieben, wurde durch Ligierung eines Sph I-linearisierten pRmHa-1 DNA-Expressionsvektor mit einem DNA-Fragment hergestellt, das aus einem Sph I-Restriktionsverdau eines pRmHa-2-Expressionsvektor, wie unten beschrieben, resultiert. Das Ligieren von pRmHa-1 mit dem pRmHa-2-Fragment wurde in dieser Weise durchgeführt, um eine von zwei Eco RI-Restriktionsendonucleaseklonierungsstellen zu entfernen, die in pRmHa-1 vorhanden sind. Somit enthielt der resultierende pRmHa-3-Expressionsvektor nur eine Eco RI-Restriktionsschnittstelle in der multiplen Klonierungsstelle (Polylinker), in welche verschiedene MHC-kodierende DNA-Fragmente, wie in den Beispielen beschrieben, eingeführt wurden.
1. Herstellung eines pRmHa-1-Expressionsvektors
Der pRmHa-1-Expressionsvektor, der einen Metallothioneinpromotor, Metallreaktionskonsensussequenzen (als MT bezeichnet) und ein Alkoholdehydrogenase (ADH)-Gen, enthaltend ein Polyadenylierungssignal, das aus Drosophila melanogaster isoliert wurde, wurde, wie durch Bunch et al., Nucl. Acids Res. 16: 1043–61 (1988) beschrieben, hergestellt. Ein Schema des endgültigen pRmHa-1-Konstrukts wird in 2 gezeigt. Der Plasmidexpressionsvektor pUC18 mit der ATCC-Zugangsnummer 37253 wurde als Ursprungsvektor verwendet, von dem aus die anschließenden Vektoren, die hierin be schrieben sind, abgeleitet wurden. Das pUC18-Plasmid enthält die folgenden Reaktionsschnittstellen von 5' zu 3' in der multiplen Klonierungsstelle, wovon nicht alle in den schematischen Darstellungen der pUC18-abgeleiteten Vektoren in 1 gezeigt werden: Eco RI; Sac I; Kpn I; Sma I und Sma I, das an der gleichen Position lokalisiert ist; Bam HI; Xba I; Sal I, Acc I und Hinc II, das an der gleichen Position lokalisiert ist; Pst I; Sph I und Hind III. Der pUC18-Vektor wurde zuerst mit Hind III verdaut, um ein linearisiertes pUC18 auszubilden. Stumpfe Enden wurden dann durch Auffüllen in den Hind III-Enden mit einem DNA-Polymerase I – großen Fragment, wie beschrieben durch Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) hergestellt.
Der resultierende linearisierte stumpfendende pUC18-Vektor wurde mit einem 740-Basenpaar (bp) Hinf I-Fragment aus dem Drosophila melanogaster-ADH-Gen, das ein Polyadenylierungssignal enthält, ligiert. Das ligierte ADH-Allel wurde zuerst aus dem Plasmid pSACI, das durch Goldberg et al., PNAS USA 77: 5794–5798 (1980) beschrieben wurde, isoliert, durch Verdau mit Hinf I, gefolgt von stumpfen Enden mit Klenow, was in der Nucleotidsequenz resultiert, die in SEQ ID NO 14 aufgelistet ist. Der pSACI-Vektor, der das ADH-Allel enthält, wurde durch das Subklonieren eines 4,7 Kilobasen (kb) Eco RI-Fragment von Drosophila-DNA in pBR322 (ATCC-Zugangsnummer 31344) hergestellt, die aus einer Bakteriophagen-Lamdabibliothek ausgewählt wurde, die zufällige hochmolekulargewichtige (mehr als 15 kb) enthält. Die 5' Hinf I-Restriktionsschnittstelle kam in natürlicher Weise in dem ADH-Gen in Position 1770, wie durch Kreitman, Nature 304: 412–417 (1983) beschrieben, vor. Die 3'-Hinf I-Stelle wurde aus dem pUC18-Vektor abgeleitet, in welchen das ADH-Gen kloniert worden war. Diese Position war vier Basen 3' zu der Xba I-Stelle an Position 2500 des ADH-Gens. Das ADH-Segment reichte von den 35 bp stromaufwärts der Polyadenylierungs/Spaltungssequenz in dem 3' nicht translatiertem Anteil der ADH-mRNA bis zu 700 bp stromabwärts von dem Polyadenylierungssignals. Der resultierende pUC18-abgeleitete Vektor, der das ADH-Genfragment enthält, wurde, wie in 1 gezeigt, pHA-1 bezeichnet.
Das 421 bp Eco RI/Stu I MT-Genfragment wurde aus einem Klon erhalten, der DNA von ungefähr 15,3 kb aus einer Drosophila melanogaster genomischen DNA-Bibliothek enthält. Die Bibliothek, die mit einem Mbo I-Teilverdau von imaginärer DNA hergestellt wurde, wurde in das Lamdaderivat EMBL4 kloniert. Das Fragment enthielt den MT- Promotor und Metall-Reaktionskonsensuselemente des Drosophila-MT-Gens (Maroni et al., Genetics 112: 493–504 (1986)). Diese Region, die den Promotor und die Transkriptionsstartstelle bei Nucleotid 1+ enthält, korrespondiert zu der Position –370 bis zur Nucleotidposition +54 des MT-Gens (SEQ ID NO 13). Das resultierende Fragment wurde dann in den pHA-1-Expressionsvektor ligiert, der oben hergestellt wurde, der zuvor mit Eco RI und Sma I-linearisiert worden war. Das 3'-stumpfe Ende in MT, das durch Stu I-Verdau hergestellt wurde, war mit dem stumpfen Ende in pHA-1 kompatibel, das durch Sma I-Verdau hergestellt worden war. Der resultierende pUC18-abgeleitete Vektor, der ein 5'-Drosophila-MT-Genfragment und ein 3'-ADH-Genfragment enthält, wurde pRmHa-1 genannt. Der in 2 gezeigte pRmHa-1-Expressionsvektor enthielt den Replikationsursprung (ori) und das Beta-Lactamasegen von pUC18, das Resistenz gegen Ampicillin (Amp') vermittelt, wie in 1 auf dem pNA-1-Vektor gezeigt. Das Diagramm von pRmHa-1 zeigt auch die 5' bis 3' aufeinanderfolgende Positionen des MT-Genfragments, der multiplen Klonierungsstelle und des ADH-Genfragments. Der pRmHa-1-Vektor wurde wie oben in c. beschrieben in der Herstellung des pRmHa-3-Expressionsvektors verwendet.
2. Herstellung des pRmHa-2-Expressionsvektors
Die Herstellung des pRmHa-2 wird in 1 gezeigt. Zur Herstellung des pRmHa-2-Expressionsvektors wurde das oben hergestellte MT-Fragment in den pUC18-abgeleiteten Vektor pHA-1, wie für die Herstellung von pRmHa-1 oben beschrieben, mit einigen Modifikationen eingefügt. Es wurde ein Eco RI-Linker zur Stu I-Stelle des Eco RI/Stu I-isolierten MT-Genfragments, das oben hergestellt wurde, hinzugefügt, um ein Metallothioneinfragment mit Eco RI-Restriktionsschnittstellen an beiden Enden herzustellen. Das resultierende Fragment wurde dann in den ADH-Fragment-enthaltenden pUC18-Expressionsvektor ligiert, der zuvor mit Eco RI linearisiert worden war. Der resultierende pUC18-abgeleitete Vektor, der ein 5'-Drosophila-MT-Genfragment und 3'-ADH-Genfragment mit zwei Eco RI-Restriktionsschnittstellen 5' zu der multiplen Klonierungsstelle enthält, wurde pRmHa-2 bezeichnet. Der pRmHa-2-Expressionsvektor, der in 2 gezeigt wird, enthielt den Replikationsursprung (ori) und das Beta-Lactamasegen aus pUC18, das Resistenz gegen Amplicillin (Amp') vermittelt. Das Diagramm von pRmHa-2 zeigt auch die 5' zu 3' aufeinanderfolgenden Positionen des MT-Genfragments, der multiplen Klonierungsstelle und des ADH-Genfragments. Der pRmHa-2-Vektor wurde zusammen mit pRmHa-1 wie unten in c. beschrieben in der Herstellung des pRmHa-3-Expressionsvektors verwendet.
3. Herstellung des pRmHa-3-Expressionsvektors
Zur Herstellung des pRmHa-3-Expressionsvektors, der nur eine Eco RI-Restriktionsschnittstelle aufwies, wurde ein Fragment aus pRmHa-2 in pRmHa-1 ligiert. Für diese Konstruktion wurde oben in b. hergestelltes pRmHa-2 zuerst mit Sph I verdaut. Das resultierende Sph I-Fragment, das in der Mitte des MT-Gens anfängt und sich zur Sph I-Schnittstelle in der multiplen Klonierungsstelle verlängert, wurde zunächst aus dem pRmHa-2-Vektor isoliert und dann in pRmHa-1 legiert, der oben in A.1. hergestellt worden war. Der pRmHa-1-Vektor wurde zuvor modifiziert, um die Eco RI-Restriktionsschnittstelle 5' zu dem MT-Genfragment zu entfernen und dann mit Sph I linearisiert. Dieser Prozess wird schematisch in 2 illustriert. Um die Eco RI-Schnittstelle in pRmHa-1 zu entfernen, wurde der Vektor mit Eco RI verdaut, um einen linearisierten Vektor auszubilden, dann mit Mung Bean Nuklease stumpf geschnitten und religiert.
Der pRmHa-1-Vektor, dem eine Eco RI-Schnittstelle fehlt, wurde dann mit Sph I verdaut, um die Region zu entfernen, die zu dem Sph I-Fragmentinsert aus pRmHa-1 korrespondiert, um einen linearisierten pRmHa-1-Vektor auszubilden. Das Sph I-Fragment aus pRmHa-2 wurde dann in den Sph I-linearisierten pRmHa-1 ligiert, um den pRmHa-3-Expressionsvektor auszubilden. Ein Schema des pRmHa-3-Vektors wird in 3 gezeigt. Die relativen Positionen der verschiedenen Restriktionsschnittstellen aus dem pUC18-Vektor, aus dem pRmHa-3 abgeleitet wurde, sind auf der Figur angezeigt. Zusätzlich werden die relativen Positionen und Längen der MT- und ADH-Genfragmente, die durch die multiple Klonierungsstelle (Polylinker) getrennt sind, in welche das MHC-Gen von Interesse kloniert wird, auf der Figur gezeigt. Der pRmHa-3-Vektor, der aus pUC18 abgeleitet ist, enthält den pUC18 Replikationsursprung und das beta-Lactamasegen, das Ampicillin Resistenz vermittelt. Somit wurden die MHC-kodierenden DNA-Fragmente, wie sie in dieser Erfindung hergestellt und in die multiple Klonierungsstelle des pRmHa-3 kloniert wurden, transkriptionell durch den MT-Promoter reguliert und über das ADH-Gen polyadenyliert.
B. cDNA-Synthese
Detaillierte Beschreibungen der cDNA von Klasse I-MHC-Molekülen von verschiedenen HLA-Gruppen können in dem U.S.-Patent Nr. 5,314,813 an Peterson et al. gefunden werden, welches durch Referenzieren aufgenommen wurde.
cDNAs, die jegliches bevorzugtes HLA kodieren, können mittels Verwendung der Polymerasekettenreaktion kloniert werden. Die in Abschnitt B.1. oben offenbarten Primer (SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 12) können verwendet werden, um die geeigneten NLA-A, -b, -C, -E, -F oder -G cDNAs in separaten Reaktionen zu amplifizieren, welche dann wie in den für HLA A2.1 oben offenbarten Verfahren kloniert und sequenziert werden. Die Herstellung von cDNA aus menschlichen Zellen wird, wie in Ennis, et al., PNAS USA 87: 2833–2837 (1990) beschrieben, durchgeführt. In Kürze, es wird eine Blutprobe aus dem Individuum gewonnen und Zellen werden nach Zentrifugation gesammelt und verwendet, um Gesamt-RNA herzustellen. Der erste Strang der cDNA wird unter Verwendung von Oligo (dT) und Vogelmyeloblastosevirus-Reversertranskriptase synthetisiert. Die resultierende cDNA wird in einer PCR-Amplifikationsreaktion unter Verwendung des(r) geeigneten Primer(s), wie oben in Abschnitt B.1. festgestellt, und eines GeneAmpTM-Kits und eines thermischen Zyklusapparates (Perkin-Elmer/ Cetus) verwendet. Die Reaktionsbedingungen sind vorzugsweise wie folgt. Es werden 100 ng cDNA-Template und 50 Picomol von jedem Oligonukleotidprimer verwendet. Es werden dreißig Zyklen wie folgt laufen gelassen: (a) eine Minute bei 94°C; (b) eine Minute bei 60°C; und (c) eine Minute, 30 Sekunden bei 72°C. Die PCR-Reaktion wird dann auf 100°C für 10 Minuten erhitzt, um die Taq-Polymerase zu abzutöten und die Enden der DNA werden durch T4-Polymerase stumpf gemacht (Stratagene, San Diego, CA).
Zur Synthetisierung von HLA A2.2 wird cDNA, die ein vollständiges A2.2 (siehe Holmes, et al., J. Immunol. 139: 936–41 (1987), für die publizierte Sequenz) kodiert, in ein M13mp19 Plasmid, einem kommerziell verfügbaren bakteriophagen Vektor (Stratagene, La Jolla, CA), kloniert. Die cDNA wird durch PCR unter Verwendung von Primern synthetisiert, die aus der publizierten Sequenz von A2 abgeleitet sind. Die cDNA wird aus einem M13mp19-Klon als ein Not I (Überhang mit Klenow gefüllt)/Eco RI-Fragment freigesetzt. (Klenow-Fragmente sind Teil des E. coli-DNA-Polyermase I Moleküls, das durch die Behandlung von E. coli-DNA-pol I mit Subtilisin hergestellt wird. Sie werden verwendet, um 5'- oder 3'-Überhänge an den Enden von DNA-Molekülen "aufzufüllen", die durch Restriktionsnukleasen hergestellt werden.) Das Not I/Eco RI-Fragment wird in pSP64T eingefügt, das mit Bg III (Enden mit Klenow gefüllt) und Eco RI verdaut wurde. pSP64T ist ein SP6-Klonierungsvektor, der entwickelt wurde, um 5'- und 3'-flankierende Regionen von einer mRNA zur Verfügung zu stellen, welche effizient zu jeglicher cDNA (β-Globin) translatiert wird, welche ihr eigenes Initiierungskodon enthält. Dieser Translations-SP6-Vektor wurde durch Verdau von pSP64-Xβm mit Bal I und Bst Ell hergestellt, wobei die ungleichen Enden mit T4 DNA Polymerase aufgefüllt wurden und ein Bgl II-Linker durch Ligation hinzugefügt wurde. Bal I schneidet die β-Globin cDNA zwei Basen stromaufwärts des ATG (Startkodon) und Bst Ell schneidet acht Basen stromaufwärts des TAA (Stopkodons). Es gibt nur eine Bgl II-Schnittstelle in pSP64T, so dass die Restriktionsenzyme, die in dem Polylinkerfragment von Pst I bis Eco RI schneiden, weiterhin verwendet werden können, um das Plasmid zur Transkription zu linealisieren. (Siehe Kreig und Melton, Nucleic Acid Res. 12: 7057–7070, (1984), welche auch die Herstellung des Plasmids pSP64-Xβm beschreiben.) Das resultierende Plasmid wird mit Eco RI (Enden mit Klenow gefüllt) und Hind III gespalten, welches in den pCMUII-Polylinker zwischen Hind III (5') und Stu I (3') kloniert wird. (Siehe Paabo et al., EMBO J. 5: 1921– 1927 (1986).) Die gesamte cDNA wird als ein Hind III (Enden mit Klenow gefüllt) – Bam HI-Fragment entfernt, welches in pRmHa-3 kloniert wird, das mit Sma I und Bam HI gespalten wurde.
Die HLA A2.2 lösliche Form wurde durch das Herstellen eines Stopkodons in der oben beschriebenen A2.2 cDNA direkt vor der Transmembrandomäne hergestellt. Die Modifikation wird durch das Spalten der A2.2. cDNA erreicht, die in den eukaryontischen Expressionsvektor pCMUII zwischen Hind III 5' und Stu I 3' (siehe oben) mit Mbo II und Bam HI unter Einfügen der folgenden Oligonucleotide kloniert wurde:
Das resultierende rekombinante Plasmid wird mit Hind III geschnitten, das überhängende Ende mit Klenow aufgefüllt, dann mit Bam HI geschnitten, was ein Restriktionsfrag ment freisetzt, welches in pRmHa-3 in der gleichen Art wie A2.2. in gesamter Länge kloniert wird.
1. Herstellung eines murinen ICAM-1 Expressionsvektor
Milzzellen werden aus Balb/c-Mäusen isoliert. Die Milzzellen wurden mit conA stimuliert; mRNA wurde unter Verwendung des FastTrack^TM-Kits (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers isoliert. cDNA wurde aus der mRNA unter Verwendung des AMV reverse Transkriptasekits (Promega, Madison, WI) gemäß den Instruktionen des Herstellers synthetisiert. Basierend auf der publizierten cDNA-Nukleotidsequenz (Siu, G. et al., J. Immunol. 143, 3813–3820 (1989) wurden die folgenden Nukleotide als PCR-Primen synthetisiert:
Die synthetisierte cDNA wurde der PCR unter Verwendung dieser Primer ausgesetzt. Das Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I geschnitten und in pRmHa-3 ligiert, welches mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I verdaut worden war.
2. Herstellung eines murinen B7.1 Expressionsvektors
Milzzellen wurden aus Balb/c-Mäusen isoliert und mit conA stimuliert. Boten-RNA wurde unter Verwendung des FastTrack^TM-Kits (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers isoliert. Die cDNA wurde aus der mRNA unter Verwendung des AMV reverse Transkriptasekits (Promega, Madison, WI) gemäß den Instruktionen des Herstellers synthetisiert.
Basierend auf der publizierten cDNA-Nukleotidsequenz (Freeman et al., J. Exp. Med. 174: 625–631 (1991)) wurden die folgenden Oligonukleotide als PCR-Primen synthetisiert:
Die cDNA wurde einer PCR unter Verwendung dieser Primer ausgesetzt. Das Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I gespalten und in pRmHa-3 ligiert, welches zuvor mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I verdaut worden war:
3. Herstellung eines murinen B7.2 Expressionsvektors
IC-21-Zellen (von ATCC erhalten) wurden in RPMI 1640 Medium, das 10% fetales Kälberserum enthält, propagiert. mRNA wurde aus diesen Zellen unter Verwendung des FastTrack^TM-Kits (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Instruktionen des Herstellers isoliert. Die cDNA wurde aus der mRNA unter Verwendung des AMV^TM reverse Transkriptasekits (Promega, Madison, WI) gemäß den Instruktionen des Herstellers synthetisiert.
Basierend auf der publizierten cDNA-Nukleotidsequenz (Freeman et al., J. Exp: Med. 178: 2185–2912 (1993)) wurden die folgenden Oligonukleotide als PCR-Primer synthetisiert:
Die synthetisierte cDNA wurde einer PCR unter Verwendung dieser Primer ausgesetzt. Das Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I gespalten und in pRmHa-3 ligiert, welches zuvor mit den Restriktionsenzymen Eco RI und Sal I verdaut worden war.
Die oben genannten Expressionskonstrukte wurden in Drosophila S2-Zellen unter Verwendung des Kalziumphosphat-Verfahrens wie in Tabelle 1 aufgelistet transfiziert. Stabile Zelllinien wurden durch das Einbringen von 500 μg/ml Geneticin^TM in das Zellkulturmedium selektiert.
Tabelle 1
Menschliche akzessorische und kostimulatorische Moleküle wurden aus menschlichen Zelllinien kloniert, von denen durch FACS-Analyse mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für die bestimmten spezifischen Proteine sind, nachgewiesen wurde, dass sie diese Proteine exprimieren. Adhäsionsmoleküle, die zur Integrin-Familie, ICAM-I (CD54) und LFA-3 (CD58) gehören, wurden jeweils aus den menschlichen Zelllinien K562 und HL60 kloniert. Die K562-Zellen entstammen ursprünglich aus menschlicher chronischer myelogener Leukämie und wurden von der ATCC (CCL-243) erhalten und unter den empfohlenen Bedingungen kultiviert (d. h., RPMI mit 10% fetalem Kälberserum bei 37 °C mit 5% CO₂). HL60-Zellen, die ursprünglich aus einer menschlichen promyelozytischen Leukämie stammen, wurden von der ATCC (CCL-240) erhalten und gemäß den Empfehlungen der ATCC kultiviert. Die kostimulatorischen Moleküle B7.1 und B7.2 wurden auch jeweils aus K562 und HL60-Zellen kloniert.
4. cDNA
Boten-RNA-Proben wurden aus jeder Zelllinie aus RNA hergestellt, die durch das modifizierte Guanidiniumthiocyanatverfahren isoliert worden war (Chromczynski et al., Anal. Biochem. 162: 156–159, 1987), gefolgt durch Poly A+ RNA Selektion auf Oligo(dt)-Zellulosesäulen (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, 6.22–6.34, Cold Spring Harbor laboratory, CSH, NY), die Induktion von HL60-Zellen mit Vitamin D3 (normalerweise zur Exprimierung einiger Zelloberflächenmoleküle notwendig) war nicht notwendig, um die B7.2- und LFA-3-Moleküle zu erhalten. Die Proteine wurden in der Abwesenheit einer Induktion exprimiert. cDNA wurde unter Verwendung des AMV Reversetranskriptasekits gemäß den Instruktionen des Herstellers (Promega, Madison WI) hergestellt.
5. PCR-Primer
Es wurden PCR-Primer nach dem Erhalten von Kopien bekannter Sequenzen aus der GENEWORKS^TM-Datenbasis (Intelligenetics) und unter Berücksichtigung der Enden, die zur Klonierung in die geeigneten Vektoren notwendig sind, entwickelt und synthetisiert. Sie sind wie folgt, mit der oberen Sequenz von jedem Protein, dem 5'-Prmer und der unteren des 3'-Primers:
6. Expression eines DNA-Fragments
Die cDNA-Präparationen aus jeder der Zelllinien wurden verwendet, um die gewünschten Proteine zu klonieren. Die Polymerasekettenreaktion wurde verwendet, um cDNA-Fragmente unter Verwendung des geeigneten PCR-Primers (siehe oben) zu generieren. Die geeigneten DNA-Fragmente wurden in den Drosophila-Fliegenvektor pRMHA-3 kloniert. Plasmidpräparationen wurden aus allen Präparationen hergestellt und sind nun zur Transfektion die Fliegenzellen fertiggestellt.
Menschliche β-2-Mikroglobulin-cDNA wird unter Verwendung einer publizierten Teil-cDNA-Sequenz (siehe Suggs et al., PNAS 78: 6613–17, 1981) hergestellt und wird als Template für eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit den folgenden Primern verwendet:
Die Primer werden in einer Standard-PCR-Reaktion (siehe Nilsson et al., Cell 58: 707 (1989)) verwendet. Die Reaktionsprodukte werden mit Phenol extrahiert, unter Verwendung eines Geneclean^TM-Kits (Bio 101, San Diego, CA) aufgereinigt, mit Bam HI verdaut und in die Bam HI-Stelle von pBS (Strategene, La Jolla, CA) kloniert. Nach Verifizierung der Sequenz wird dieses Bam HI-Fragment in die Bam HI-Schnittstelle von pRmHa-3 kloniert.
Wie in den Beispielen festgestellt, wurde murine Klasse I-cDNA in einigen Fällen verwendet. Murine Klasse I-cDNA wurde wie folgt hergestellt.
H-2K^b: cDNA, die ein vollständiges K^b-Molekül kodiert, wird aus einem Expressionsplasmid pCMU/K^b erhalten, das wie folgt hergestellt wurde. Eine teilweise H-2K^b-cDNA, der die Leader-Sequenz und der größte Teil der Alpha I-Domäne fehlt, wurde gemäß dem Verfahren von Reyes et al., PNAS 79: 3270–74 (1982) hergestellt und pH202 hergestellt. Diese cDNA wird verwendet, um ein Molekül von voller Länge herzustellen. Die fehlende Sequenz wird unter Verwendung eines genomischen Klons zur Verfügung gestellt, der H-2K^h kodiert (Caligan et al., Nature 291: 35–39, 1981), als ein Template in einer PCR-Reaktion unter Verwendung eines 5'-Primers, der durch eine Not I-Schnittstelle flankiert wird, gefolgt durch 21 Nucleotide, die die letzten sieben Aminosäuren der Leadersequenz kodieren und 18 Nucleotide komplementär zu dem Anfang der Alpha I-Domäne und ein 3'-Primen, der komplementär zu der Region ist, die die Sty I-Schnittstelle umfasst. Das resultierende Fragment wird mit pH202 an der Sty I-Schnittstelle ligiert. Die 5'-Sequenz, die den Rest der Signalsequenz kodiert, wird aus der D^b-cDNA (siehe unten) als ein Bam HI/Not I-Fragment gewonnen. Die gesamte kodierende Sequenz wird aus dem Expressionsplasmid als ein Bam HI-Fragment abgespalten und in pRmHa-3 kloniert, das mit Bam HI gespalten wurde.
H-2L^d: cDNA, die das vollständige L^d-Molekül kodiert, wird aus einem Expressionsplasmid pCMUIV/L^d (siehe Joly und Oldstone, Gene 97: 213, 1991) gewonnen. Die vollständige cDNA wird aus einem eukaryotischen Expressionsvektor pCMUIV/L^d als ein Bam HI-Fragment gespalten und in pRmHa-3 als K^b kloniert.
Wie zuvor festgestellt, wird der pCMU-Vektor (pCMUIV) aus dem eukaryotischen Expressionsvektor pC81G, wie in Nilsson et al., supra beschrieben, abgeleitet. Vektor pC81G ist wiederum von pA81G (Paabo et al., Cell 33: 445–453 (1983)) gemäß dem in Paabo et al., EMBO J. 5: 1921–7 (1986) offenbarten Verfahren abgeleitet.
H-2D^b: cDNA, die ein vollständiges D^b-Molekül kodiert, wird aus dem Expressionsplasmid pCMUIV/D^b (siehe Joly und Oldstone, Science 253: 1283–85, 1991) erhalten. Die vollständige cDNA wird aus einem eukaryotischen Expressionsvektor pCMUIV/D^b als ein Bam HI-Fragment abgespalten und in pRmHa-3 als K^b kloniert.
Murines β-2-Mikroglobulin: cDNA von murinem β-2-Mikroglobulin in voller Länge wird als Hind III (5') (mit Klenow gefüllt)/Bgl II (3')-Fragment aus pSV2neo (ATCC NR. 37149) Maus β-2-Mikroglobulin cDNA gewonnen und in pRmHa-3 kloniert; der mit Sma I und Bam HI gespalten wurde.
Der Vektor phshsneo vermittelt Neomycin (G418) Resistenz und ist ein Derivat von phsneo (pUChsneo) mit einer zusätzlichen Hitzeschock-Promotor (hs)-Sequenz, welche aus einem kommerziell verfügbaren pUC8, wie in Steller et al., EMBO J. 4: 167 (1985) beschrieben, synthetisiert werden kann. Der in diesen Vektoren enthaltene Hitzeschockpromotor ist der hsp70-Promotor. Andere nützliche Promotoren, die Neomycin-Resistenz (G418 Resistenz) vermitteln umfassen den Cosmid vector smart2 (ATCC 37588), der unter der Kontrolle des Drosophila hsp70-Promotors exprimiert wird und Plasmidvektor pcopneo (ATCC 37409).
C. Einfügung von Genen in Expressionsvektoren
Die Restriktionsprodukte werden einer Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) ausgesetzt. Die Restriktionsfragmente, die die cDNAs kodieren, werden aus dem Gel ausgeschnitten und aus dem Gel unter Verwendung von "Geneclean^TM" gemäß den Vorgaben des Herstellers (Bio 101, San Diego, CA) aufgereinigt. Das Expressionsplasmid pRmHa-3 (3) wird mit den geeigneten Restriktionsenzymen in einem "One Phor All^TM-Puffer gemäß den Weisungen des Herstellers gespalten (Pharmacia, Piscataway, NJ) und mit alkalischer Phosphatase, wie in der Literatur des Herstellers beschrieben (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), behandelt. Einhundert ng von gespaltenem und phosphatiertem pRmHa-3-Vektor wird mit 300 ng Agarosegel-aufgereinigter Klasse I-MHC-schwere Ketten-cDNA oder β-2-Mikroglobulin-cDNA vermischt und unter Verwendung der T4 DNA-Ligase und dem "One Phor All^TM-Puffer, wie in der Literatur des Herstellers beschrieben, ligiert. Nach Inkubation bei 16°C für fünf Stunden wird die Ligationsmischung verwendet, um kompetente E. coli JM83 (Maniatis et al., supra (1982)) zu transformieren.
Die in Maniatis et al., supra offenbarten Verfahren werden verwendet, um die benötigte cDNA herzustellen. Die Anwesenheit der MHC-schwere Ketten-cDNA und ihre Orientierung in dem Vektor wird durch Restriktionskartierung bestimmt. Bakterien, die den Vektor mit der cDNA in der korrekten Orientierung relativ zu dem Metallothioneinpromotor enthalten, werden zur Großherstellung von DNA unter Verwendung des Alkalilyseverfahrens und der Cäsiumchloridgradientenaufreinigung verwendet. Die erhaltene DNA-Menge wird spektrofotometrisch bestimmt.
D. Transfektion und Markierung von S2-Zellen
S2-Zellen werden in Schneider^TM-Medium (Gibco/BRL, Grand Island, NY), supplementiert mit 10% fetalem Kälberserum (für eine Stunde bei 55°C hitzebehandelt), 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin und 1 mM Glutamin wachsen gelassen. (Zur Vereinfachung wird dieses supplementierte Medium hiernach als Schneider^TM-Medium bezeichnet.) Zellen werden bei 27°C wachsen gelassen und typischerweise alle sieben Tage durch 1 : 17 Verdünnung in frischem Medium passagiert. Die Zellen werden zum Wachstum in serumfreiem Medium gewechselt (Excell^TM 400 oder 401, supplementiert mit 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 mg/ml Streptomycin, 1 mM Glutamin und 500 μg/ml G418 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) durch eine einleitende Verdünnung bei 50% Schneider^TM/50% Excell^TM 401. Eine Woche später können die Zellen in 10% Schneider^TM-Medium/90% Excell^TM 401 passagiert werden und eine Woche später in 100% Excell 401^TM. Die Zellen werden in diesem Medium aufbewahrt und alle sieben Tage durch Verdünnen von 2 : 17 in frischem Medium passagiert.
15 × 10⁴ S2-Zellen werden bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen pro ml in 85 mm Petrischalen ausplattiert. Zwölf Stunden später werden Kalziumphosphat/DNA-Präzipitate, die wie unten beschrieben hergestellt wurden, (1 ml) tropfenweise zu den Zellen hinzugefügt. Nach 48 Stunden wird der Überstand vorsichtig entfernt und die Zellen in ein 175 cm²-Gefäß in einem Gesamtvolumen von 50 ml in Schneider^TM-Medium, enthaltend 500 μg/ml Geneticin (G418) (Gibco/BRL, Grand Island, NY) transferiert. Nach 21 Tagen werden 20 ml der Kultur zu einem frischen Gefäß entfernt, das 30 ml Schneider^TM-Medium enthält, das 500 μg/ml G418 enthält. Zehn Tage später wird eine stabile Population von Zellen, die schwach an dem Gefäß kleben und mit einer Verdopplungszeit von ungefähr 24 Stunden wuchsen, gewonnen und diese Zellen werden anschließend kultiviert und Selektionsmedien wie oben beschrieben passagiert. Gefrorene Proben von diesen Zellen werden durch Sammeln von 5–20 × 10⁶ Zellen durch Zentrifugation und Resuspendieren dieser in 1 ml Zellgefriermedium (93% fötales Kälberserum/7% Dimethylsulfoxid) hergestellt. Proben werden dann bei –70°C für eine Woche aufbewahrt und anschließend zur flüssigen Stickstofflagerung transferiert.
Kalziumphosphatpräzipitate werden, wie durch Paabo et al., (EMBO J. 5: 1921–27 (1986)) beschrieben, hergestellt, außer dass 25 μg DNA pro Transfektion verwendet wird. Die folgenden Kombinationen von DNA werden verwendet, um das angezeigte Transfektionsmittel herzustellen:

(a) MHC-Klasse I-schwere Kette allein: 23 μg schwere Ketten-Expressionsvektor-DNA + 2 μg phshsneo-DNA.
(b) MHC-Klasse I-schwere Kette + β-2-Mikroglobulin: 11,5 μg schwere Ketten-Expressionsvektor-DNA + 11,5 μg β-2-Mikroglobulin (Mensch oder Maus)-Expressionsvektor-DNA + 2 μg phshsneo-DNA.

Andere Kombinationen von Mausgenen werden in Tabelle 1 dargestellt.
Vierundzwanzig Stunden vor der metabolischen Markierung werden Zellen bei einer Dichte von 3–5 × 10⁶ Zellen/ml (10 ml/85 mm Petrischale) in Schneider^TM-Medium, das 1 mM CuSO₄ enthält, ausplattiert. Dreißig Minuten vor der Markierung wird das Medium aus den Schalen abgesaugt und die Zellen werden mit 2 × 10 ml PBS gewaschen und dann in Graces^TM Insektenmedium ohne Methionin und Cystein (besondere Lieferung von Gibco/BRL, Grand Island, NY) für 20 Minuten inkubiert und dann in 1 ml dieses Mediums, das 0,1 mCi ³⁵S Trans-Macker (New England Nuclear; duPont, Boston, MA) enthält. Nach der Markierungsphase wird die markierte Lösung abgesaugt und die Zellen werden entweder sofort auf Eis mit eiskaltem PBS/1% Triton^TM X100 (1 ml) oder nach einem Folgezeitraum in der Gegenwart von Methionin enthaltendem Schneider^TM- oder Excell^TM 400-Medium (5 ml) (JRH Biosciences) lysiert. Das Folgemedium wird gesammelt, wenn lösliche Klasse I-MHC-Moleküle analysiert werden.
Die folgenden Operationen werden alle mit kalt gehaltenen (weniger als 8°C) Lysaten durchgeführt. Die Lysate wurden in Eppendorfröhrchen gesammelt, in einem Mikrofugenröhrchen für 15 Minuten bei 13.000 × g zentrifugiert, in ein frisches Röhrchen, das 100 μl einer Aufschlämmung von 10% Protein A-Sepharose enthält, transferiert und auf einen Über-Kopf-Rotor für zwei Stunden platziert. Nach einer weiteren Zentrifugation in der Mikrofuge für 15 Minuten sind die Zelllysate zur Analyse fertig.
In Experimenten, die murine MHC verwenden, wurden S2-Zellen mit den murinen MHC-Rekombinanten, die oben beschrieben wurden, unter Verwendung des CaPO₄-Präzipitationsverfahrens transfiziert; jede schwere Kette wird entweder allein oder als eine 50 : 50-Mischung mit dem Vektor, der β-2-Mikroglobulin kodiert, transfiziert. Ein Plasmid, das Neomycinresistenz kodiert, phshsneo-DNA, wird in jede Transfektion mitumfasst, so dass eine Population von Zellen, die MHC-Klasse I stabil exprimieren, durch Wachsenlassen der Transfektanten in Selektionsmedium (Geneticin^TM G41-8-Sulfat, Gibco/BRL; Grand Island, NY) erhalten werden konnte.
E. Peptidherstellung
Antigene Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung können aus natürlich vorkommenden Quellen gewonnen werden oder unter Verwendung bekannter Verfahren synthetisiert werden. In verschiedenen hierin offenbarten Beispielen werden Peptide auf einem Applied Biosystems Synthetisiergerät, ABI 431A (Foster City, CA) synthetisiert und anschließend durch HPLC aufgereinigt.
Eine Isolierung oder Synthese von "zufälligen" Peptiden kann auch geeignet sein; insbesondere, wenn man versucht, ein bestimmtes Epitop zu bestätigen, um ein leeres MHC-Molekül mit einem Peptid zu beladen, das am wahrscheinlichsten Vorläufer-CD8⁺-Zellen stimuliert. Man kann eine Mischung von "zufälligen" Peptiden mittels der Verwendung von Proteasomen (siehe z. B. Beispiel 2.B.6) oder durch das Aussetzen eines Proteins oder Polypeptids zu einem abbauenden Prozess -- z. B., Verdau mit Chymotrypsin -- herstellen oder Peptide können synthetisiert werden. Während wir festgestellt haben, dass die Zelllinien der vorliegenden Erfindung in der Lage sind; Proteine und Polypeptide in kleinere Peptide abzubauen, die in der Lage sind, auf menschliche Klasse I-MHC-Moleküle geladen zu werden, ist es bevorzugt, kleinere Peptide -- z. B., 8-mere und 9-mere -- direkt in die Zellkultur einzuführen, um einen schnelleren Beladungs- und Exprimierungsprozess zu erleichtern.
Wenn man Peptide synthetisiert, z. B., zufällige 8-, 9- und 18-Aminosäurepeptide, werden alle Variationen von Aminosäuren vorzugsweise in jeden Zyklus der Synthese mit eingebracht. Es sollte jedoch festgestellt werden, dass verschiedene Parameter -- z. B., Lösungsmittelinkompatibilität bestimmter Aminosäuren -- in einer Mischung resultieren können, welche Peptide enthält, denen bestimmte Aminosäuren fehlen. Das Verfahren sollte dann wenn es als notwendig erachtet wird, angepasst werden -- d. h., durch Änderung des Lösungsmittels und der Reaktionsbedingungen --, um die größte Variation von Peptiden herzustellen.
Wie hierin oben festgestellt wurde, waren murine schwere Ketten, die mit menschlichem β-2-Mikroglobulin komplexiert waren, bei Temperaturen stabil, die 6–8 Grad höher lagen, als wenn diese mit murinem β-2 komplexiert worden wären. Es wurde auch beobachtet, dass die Stabilitäten, die durch ein Peptid und xenogenes β-2-Mikroglobulin vermittelt werden, additiv sind. Eine große Erhöhung in der Thermostabilität der Klasse I-Moleküle kommt vor, wenn 8–9-mere im Vergleich zu 12–25-meren verwendet wer den; tatsächlich kann der Unterschied zwischen der Stabilisierung, die durch 8–9-mere vermittelt wird, im Vergleich mit den größeren Peptiden sogar noch größer sein als das, was zuvor beobachtet wurde, da sogar, obwohl die Peptide durch HPLC aufgereinigt wurden, es wahrscheinlich ist, dass es einige Kontamination der größeren Peptide durch 8–9-mere gibt.
Die Thermostabilität eines Klasse I-Moleküls hängt offensichtlich von: (1) dem Ursprung des β-2-Mikroglobulins; (2) der Gegenwart eines Peptids; und (3) der Länge und Sequenz dieses Peptids ab.
Eine frühere Arbeit (U.S. Patent Nr. 5,314,813 an Peterson et al.; Jackson et al., PNAS USA 89: 12117–12121 (1992)) zeigte, dass Klasse I-MHC-schwere Ketten Peptid entweder allein binden können, oder wenn sie mit β-2-Mikroglobulin assoziiert sind. Die Oberflächenexpression von peptidbeladenem menschlichen Klasse I-MHC scheint jedoch am besten durch das Beladen der Moleküle mit Peptid, nachdem die schweren Ketten mit β-2-Mikroglobulin komplexiert worden sind, erleichtert zu werden.
1. Expression von menschlichem MHC
Sobald wir festgestellt hatten, dass die Thermostabilität von Klasse I-Molekülen von dem Ursprung des β-2-Mikroglobulins, der Gegenwart von Peptids und der Länge und Sequenz dieses Peptids abhängt, verwendeten wir diese in Information in der Herstellung von Zelllinien, die in der Lage sind, spezifisch CD8⁺-Zellen über die Expression von peptidbeladenen menschlichen Klasse I-MHC-Molekülen zu aktivieren.
Thermolabilität scheint eine inhärente Eigenschaft von Klasse I-Molekülen zu sein; es wird angenommen, dass diese sich entwickelte, um sicherzustellen, dass Klasse I-Moleküle, die entweder kein Peptid oder ein Peptid mit schwachen Bindungseigenschaften (das eine geringe Thermostabilität vermittelt) enthalten, sich selbst zerstören. Auf diese Art minimiert die Zelle die Zahl der leeren Klasse I-Moleküle auf ihrer Oberfläche, da eine solche Situation wahrscheinlich dahingehend gefährlich wäre, dass exogen abzuleitende Peptide gebunden und präsentiert werden könnten. Menschliche Klasse I-Moleküle, die in Insektenzellen mit menschlichem β-2 exprimiert werden, sind gegen eine verlängerte Inkubation bei 37°C nicht stabil; das Gleiche gilt für menschliche Klas se I-Moleküle, die in der mutierten Zelllinie T2 exprimiert werden, von der gezeigt wurde, dass sie in der Peptidbeladung auf die Klasse I-Moleküle defizitär ist (Hasken und Bevan, Science 248: 367–70 (1990); Cerundolo et al., Nature 345: 449–452 (1990)). Somit scheint es, dass die Affinität zwischen der schweren Kette und β-2-Mikroglobulin vorsichtig durch Koevolution der Moleküle konserviert wurde, so dass leere Klasse I-Moleküle oder solche, die schwach bindende Peptide tragen, sich selbst bei der Körpertemperatur des "Wirts"-Organismus zerstören.
Menschliche Klasse I-MHC-Moleküle wurden in S2-Zellen exprimiert. Es wurden Zelllinien, die menschliches β-2-Mikroglobulin und HLA A2.2Y HLA A2.1, HLA B7 oder NLA B27 koexprimieren, unter Verwendung der zuvor beschriebenen Verfahren etabliert. In Kürze, es wurden cDNAs, die die oben genannten Proteine kodieren, in den Drosophila-Expressionsvektor pRmHa-3 kloniert und mit einem menschliches β-2-Mikroglobulin enthaltendem Plasmid und dem phshsneo-Plasmid in S2-Zellen mittels der hierin offenbarten Verfahren kotransfiziert. Drei bis vier Wochen später wurde die Population von G418-resistenten T-Zellen 1 : 5 mit frischem Selektionsmedium verdünnt. Sobald eine gesunde wachsende Zellpopulation erhalten wurde, wurde CuSO₄ zu einer Probe der Zellen hinzugefügt und 24 Stunden später wurden die Zellen mittels Flusszytometrie unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers W6/32 (ATCC HB95, Bethesda, MD) analysiert, welcher eine monomorphe Determinante von menschlichen Klasse I-schweren Ketten erkennt, wenn diese mit β-2-Mikroglobulin assoziiert sind. (Siehe Barnstable et al., Cell 14: 9 (1978).) Große Mengen an Oberflächenexpression von jedem der menschlichen Klasse I-Moleküle wurden durch den Zusatz von CuSO₄ (Daten nicht gezeigt) induziert. Diese stabilen Populationen wurden auf hochexprimierende Zellen, wie unten beschrieben, unter Verwendung einer Zytofluorimetrie sortiert. Es sind diese sortierten Populationen von Zellen, die für alle nachfolgenden Experimente verwendet wurden.
Vierundzwanzig Stunden vor der FACS-Analyse wird CuSO₄ zu den stabil transfizierten S2-Zellen (3–4 × 10⁶ Zellen/ml) auf eine Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt, wodurch die Expression aus den transfizierten Genen "angeschaltet" wird. Die Zellen werden in Cluster-Platten mit 24 Wells (2 ml pro Vertiefung) ausplattiert. Acht Stunden vor der FACS-Analyse wird das CuSO₄-Medium mit frischem Medium (1 ml), mit oder ohne Peptid, bei einer Konzentration von 50 μg/ml ersetzt. 37°C-Temperaturher ausforderungen wurden durch das Transferieren der Platten auf eine flache Oberfläche in einem 37°C-Raum zu verschiedenen Zeitintervallen vor der Ernte der Zellen zur Analyse durchgeführt.
Um die Oberflächenexpression von Klasse I-MHC auf den S2-Zellen zu analysieren, werden Proben von Zellen (5 × 10⁵) in Röhrchen auf Eis transferiert, durch Zentrifugation (1.000 × g für 4 Minuten) gesammelt, in 3 ml PBS/1% BSA, 0,02% Natriumazid resuspendiert, durch Zentrifugation gesammelt und in PBS/BSA (0,5 ml), enthaltend den geeigneten primären Antikörper (Aszitesflüssigkeiten Y3, 28:14:8S, 30.5.7, W6/32, 1 : 200 verdünnt) resuspendiert. Kaninchenantiseren werden 1 : 500 verdünnt und B22.293-Hybridomüberstand wird direkt verwendet. Nach einer Stunde Inkubation auf Eis werden die Zellen zweimal in 3 ml PBS/BSA gewaschen und in 0,5 ml PBS/BSA, enthaltend den FITC-markierten sekundären Antikörper (Cappell, Durham, NC) und 1 ng/ml Propidiumiodid, resuspendiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf Eis werden die Zellen einmal mit PBS/BSA gewaschen und in diesem Puffer bei einer Konzentration von 1 × 10⁶/ml resuspendiert. Proben werden dann durch FACS 440 (Becton Dickinson) analysiert. Mit Propidiumiodid gefärbte tote Zellen werden durch die Verwendung einer Lebendschranke in der Analyse ausgeschlossen.
Zur Zellsortierung wird die gleiche oben kurz dargestellte Prozedur verwendet, außer dass alle Färbeoperationen in einem sterilen Abzug durchgeführt werden. Lösungen, einschließlich Antikörper, werden Filter-sterilisiert und Schneider^TM-Medien oder Excell^TM 400 werden anstelle von PBS/BSA verwendet. Zellen, die spezifisch den primären Antikörper gebunden haben, werden unter Verwendung eines Becton Dickinson-Zellsortierers aussortiert. Sortierte Zellen (2–8 × 10⁵) werden ein Mal in Medium gewaschen, bevor sie bei einer Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml ausplattiert werden.
F. Beladung von Membran-gebundenen leeren MHC-Molekülen durch in vitro-Inkubation mit Peptiden
Um zu demonstrieren, dass die menschlichen Klasse I-Moleküle, die auf der Oberfläche der Drosophila-Zellen exprimiert werden, leer waren, wurden die Zellen bei 37°C für zwei Stunden inkubiert und die Zelloberflächenexpression wurde durch Zytofluorimetrie analysiert. Die Oberflächenexpression von sowohl HLA B27 wie auch A2.1 ist stark ver ringert, wenn Zellen bei 37°C für 2 Stunden inkubiert werden; jedoch vermittelt die Vorinkubation der Zellen in HIV-Peptiden, von denen bekannt ist, dass sie an Klasse 1-Moleküle binden, eine deutliche thermische Stabilität für die Klasse I, während Peptide, die nicht binden, wenig Auswirkungen (siehe 4) haben. (Ein 9-Aminosäurepeptid IL-KEPVHGV (SEQ ID NO 42) aus dem POL-Protein von HIV bindet und stabilisiert NLA A2.1. Ein 9-Aminosäurepeptid aus dem Vpr-Protein von HIV bindet und stabilisiert B27 (FRIGCRHSR; SEQ ID NO 41). Diese Daten zeigen, dass die menschlichen Klasse I-Moleküle, die auf der Oberfläche von Drosophila-Zellen exprimiert werden, leer sind und durch Bindung spezifischer HIV-Peptide stabilisiert werden können.
4 und 5 zeigen die Peptid-induzierte Thermostabilisierung von HLA B27 und NLA A2.1, die auf der Oberfläche von Drosophila-Zellen durch HIV-Peptide exprimiert werden. Drosophila-Zellen, die entweder HLA B27 oder A2.1 exprimieren, wurden mit Peptiden inkubiert, wo dieses angezeigt wird, und dann entweder bei 28°C aufbewahrt oder bei 37°C für 2 Stunden vor der Analyse der Oberflächenexpression der Klasse I-Moleküle durch Verwendung der Antikörpers W6132 (von der ATCC HB95) und Zytofluorimetrie inkubiert. Die durchschnittliche Fluoreszenz von jeder Population wird grafisch aufgetragen gegen die Inkubationsbedingungen gezeigt. Das HIV-POL-Peptid (ILKEPVHGV, SEQ ID NO 42) stabilisiert A2.1, aber nicht B27 (4), während das HIV Vpr-Peptid (FRIGCRHSR, SEQ ID NO 41) B27 stabilisiert, aber nicht A2.1 (5).
Beispiel 2
Herstellung von synthetischen Antigen-präsentierenden Zellen
A. Osmotische Beladung
Die osmotische Beladung von SC2- und 3T3-Zellen mit Ovalbuminprotein wurde wie von Moore et al., Gell 54: 777–785 (1988) beschrieben durchgeführt. Das Assayverfahren ist wie folgt. In einer Platte mit 96 Wells wurden 1 × 10⁵ Drophilia-Zellen (mit oder ohne Peptid/Proteinbeladung) oder 3T3-Zellen mit 1 × 10⁵ B3/CD8-T-Zell-Hyridomzellen in 200 μl RPMI-Medium, das mit 10% fetalem Rinderserum supplementiert ist, kokultiviert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden 100 μl des Überstandes dieser Kulturen zu 100 μl RPMI hinzugefügt, das 5.000 CTLL-Zellen enthält. Die Zellen wurden für 24 Stunden bei 37°C kokultiviert, bevor 1 μ Ci ³H-Thymidin (Amersham) hinzugefügt wurde. Nach einer weiteren Inkubation von 15 Stunden bei 37°C wurde die Aufnahme des Radiomarkers in die CTLL-Zellen durch Szintillationszählen bestimmt.
Die mit murinem MHC durchgeführten Assays bestätigten auch, dass Insektenzellen in der Lage sind, Peptid auf die Klasse I-Moleküle zu laden. Zellen, die so wenige wie 200 –500 MHC-Moleküle exprimieren, die ein bestimmtes Antigen enthalten, können durch eine T-Zelle nachgewiesen werden. Da die Drosophila-Zellen Chrom nicht akkumulieren, wurde ein auf B3/CD8 basierender Antigen-Präsentationsassay, ein T-Zellhybridom, verwendet. B3/CD8 ist ein Hybridom zwischen B3, einer zytotoxischen T-Zell, die für das Ovalbuminpeptid 253–276 spezifisch ist , das durch H-2K^b-Klasse I-Moleküle präsentiert wird und einer CD8-tragenden IL-2-sezernierende Zelllinie (siehe Carbone et al., supra, 1989). Nach antigener Stimulation produziert B3/CD8 IL-2, wie durch ³H-Thymidinaufnahme in der IL-2-abhängigen T-Zelllinie CTLL (Gillis et al., J. Immunol 270: 2027 91978)) gemessen wurde. Somit kann man durch Messung der Menge an hergestelltem IL-2 die T-Zellerkennung messen.
Um einen intrazellulären Pool an Ovalbuminprotein zur Verfügung zu stellen, von dem OVA-Peptide abgeleitet werden können, wurde Ovalbumin (Sigma Chem. Co., MO) osmotisch, wie durch Moore et al., supra (1988) beschrieben, in die Zellen geladen. Direkt nach der Beladung wurden die Zellen mit dem T-Zellhybridom vermischt. Nach zwei Tagen Inkubation wurde das Medium entfernt und auf IL-2 untersucht. Die Menge an IL-2 wurde durch die Fähigkeit des Mediums bestimmt, das Wachstum der IL-2-abhängigen T-Zelllinie CTLL (Gillis et al., supra, 1978) zu unterstützen und das Wachstum wurde durch die Menge des radioaktiven Thymidins quantifiziert, das in die Zellen aufgenommen wurde.
Mit K^b/β-2 transfizierte S2- oder 3T3-Zellen wurden Ovalbuminprotein (OvPro) oder Ovalbuminpeptid, OVA24 (OvPep) in isotonischem (Iso) oder hypertonischem (Hyp) Medium transfiziert. (Die murine Zelllinie BALG/3T3 ist von der ATCC unter der Zugangsnummer CCL 163 verfügbar.) Nach der Behandlung wurden die Zellen mit dem T-Zellhybridom B3/CD8 kokultiviert. B3/CD8 ist ein T-Zellhybridom zwischen B3 (Carbone et al., J. Exp. Med. 169: 603–12 (1989)), einer zytotoxischen T-Zelle, die spezifisch für Ovalbuminpeptid 253–276 ist, das durch H-2K^b-Klasse I-Moleküle präsentiert wird, und einer CD8-tragenden IL-2-sezernierenden Zelllinie. Nach antigener Stimulation produziert B3/CD8 IL-2, wie durch ³N-Thymidinaufnahme in der IL-2-abhängigen Zelllinie CTLL (Gillis et al., J. Immunol. 120: 2027 91978)) gemessen. Somit kann man durch Messen der Menge an produziertem IL-2 die T-Zellerkennung bestimmen. Der Überstand aus den Kokulturen wurde auf IL-2 durch ³N-Thymidinaufnahme durch die IL-2-abhängige Zelllinie CTLL (ATCC Nr. TIB 214) analysiert. Die Menge von aufgenommenen ³N-Thymidin wird gegen die ursprünglichen Zellbehandlungen grafisch dargestellt.
In 6 ist zu sehen, dass die T-Zellen gut mit den Drosophila-Zellen reagierten, wenn das Ovalbuminpeptid zu dem Kulturmedium hinzugegeben wurde, aber es kam zu keiner Erkennung, wenn die Zellen mit dem Ovalbuminprotein beladen waren. Die auf der Zelloberfläche der Insektenzelle exprimierten MHC-Klasse I-Moleküle sind dahingehend vollkommen funktional, dass sie Peptid binden, wenn dieses zu dem Kulturmedium hinzugegeben wird und sie können es in dem korrekten Kontext dafür präsentieren, damit es durch eine T-Zelle erkannt wird.
B. Optimierung von in vitro-Bedingungen
Für die Optimierung von in vitro-Bedingungen für die Generierung von spezifischen zytotoxischen T-Zellen wird die Kultur von Drosophila-Zellen-Stimulatorzellen vorzugsweise in serumfreiem Medium (z. B. Excell 400) aufbewahrt. Drosophila-Zellen-Stimulatorzellen werden vorzugsweise mit >20 μg/ml Peptid inkubiert. Das Effektor : Stimulator-Verhältnis (Lymphozyt: Drosophila-Zelle-Verhältnis) liegt vorzugsweise in dem Bereich von ungefähr 30 : 1 bis 300 : 1. Das maximale spezifische CD8⁺ wird im Allgemeinen nach fünf Tagen Kultur beobachtet. Die Kultur für die Zielzellen für den "Killing"-Assay wird vorzugsweise in einem serumfreien Medium aufbewahrt.
Beispiel 3
Stimulation der Proliferation und Differenzierung von bewaffneten Effektor-T-Zellen
Wir haben herausgefunden, dass Drosophila S2-Zellen, die mit MHC-Klasse I-Molekülen und spezifischen unterstützenden Molekülen transfiziert sind, in der Lage sind, primäre Reaktionen aus T-Zellen in vitro zu stimulieren. Wir zeigen unten in diesem Beispiel Daten aus einem Maus-Modell-System. In diesem Beispiel wurden Konstrukte, die für MHC-Klasse I (L^d), β-2-Mikroglobulin, spezifische unterstützende Moleküle kodieren, verwendet und mit CD8⁺-Zellen aus Lymphknoten von T-Zellrezeptor-transgenen Mäusen untersucht.
Die Daten in 7 beweisen, dass die transfizierten Drosophila S2-Zellen die Proteinprodukte der transfizierten murinen Gene exprimieren. Flusszytometrie unter Verwendung eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS) und Fluoreszenz-markierte Antikörper wurden verwendet, um die Expression von L^d (MHC-Molekül, welches die schwere Kette und β-2 umfasst) und den spezifischen unterstützenden Moleküle B7.1 (CD80)- und ICAM-1 (CD54)-Molekülen durch transfizierte Drosophila-S2-Zellen zu zeigen. Transfizierte Zellen mit einem FACS abgetrennt, um Zellen zu erhalten, die L^d-Moleküle exprimieren und wurden in vitro aufbewahrt.
Die Transfektion von Drosophila S2-Zellen wird in Tabelle 2 zusammengefasst. Die Daten zeigen eine L^d-, B7.1- und ICAM-1-Expression, die durch Flusszytometrie mit den Zelllinien nach Induktion mit CuSO₄ gemessen wurde. Es ist offensichtlich, dass alle Transfektanten relativ zu dem Kontrollantikörper (ctr Ab) L^d-Moleküle auf der Zelloberfläche exprimieren. Genauso exprimieren Zellen, die mit L^d und B7.1 (L^d.B7) kotransfiziert waren, B7.1, aber nicht ICAM-1, wohingegen Zellen, die mit L^d und ICAM-1 (L^d.ICAM) kotransfiziert waren, ICAM-1, aber nicht B7.1 exrimieren; Dreifachtransfektion mit L^d, B7.1 und ICAM-1 (L^d.B7.ICAM) führte zur Expression aller drei Moleküle.
Unter Verwendung eines Standardgewebekultursystems (Cai, Z. und Prent, J. (1994) J. Exp. Med. 179: 2005–2015) wurden Dosen von 5 × 10⁴ aufgereinigten CD8⁺ 2C-Lymphknoten (LN)-Zellen bei 37°C mit Dosen von 3 × 10⁵ transfizierten Fliegenzellen ± Peptide (10 μm Endkonzentration) kultiviert. Peptide wurden durch das R. W. Johnson Pharmaceutical Research Institute (Sykulev et al., (1994) Immunity: 15–22) synthetisiert. Die proliferativen Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von ³HTdR (1 μCi/Well) 8 Stunden vor der Ernte gemessen. Die IL-2-Produktion wurde durch das Entfernen von Überständen aus den Kulturen bei 48 Stunden und das Hinzufügen von 50 μl Überstand zu einer IL-2-reaktiven Indikatorzelllinie (CTLL) gemessen; die Proliferation der Indikatorzelle wurde durch Zugabe von ³HTdR gemessen.
Die in Tabelle 2 gezeigten Daten sind die Mittelwerte von Dreifachkulturen. Die transfizierten Drosophila S2-Zellen sterben schnell bei 37°C und versagen bei der Aufnahme von ³HTdR bei dieser Temperatur.
Die Daten von Tabelle 2 demonstrieren, dass die Transfektanten in der Lage sind, primäre Reaktionen von Maus-T-Zellen zu stimulieren.
Tabelle 2. Kapazität von transfizierten Fliegenzellen, primäre proliferative Reaktionen und die IL-2-Produktion durch CD8⁺-Lymphknotenzellen aus 2C T-Zellrezeptortransgenen Mäusen zu stimulieren. TABELLE 2 3HTdR-Aufnahme (cpm × 10³) mit transfizierten Fliegenzellen, die die folgenden Proteine exprimieren:
Der 2C T-Zellrezeptor (TCR) ist stark reaktiv gegenüber L^d-Molekülen, die mit bestimmten Peptiden komplexiert sind, z. B. p2Ca (SEQ ID NO 46) oder QL9 (SEQ ID NO 47). Diese zwei Peptide haben eine moderate bis hohe Affinität für lösliche L^d-Moleküle, 4 × 10⁴ M^–1 für p2Ca und 4 × 10⁴ M^–1 für QL9 (Sykulev et al.). Wenn an lösliche L^d-Moleküle komplexiert, haben die zwei Peptide auch eine hohe Bindungsaffinität für lösliche 2C TCR-Moleküle. Jedoch hat in beiden, der TCR-Bindung und der L^d-Bindung, das QL9-Peptid eindeutig eine höhere Affinität als das p2Ca-Peptid.
Tabelle 2 zeigt, dass proliferative Reaktionen und die IL-2-Produktion durch die Responder-2C-Zellen auf das schwächere Peptid, p2Ca, voraussetzt, dass die Stimulator-L^d-transfizierten Zellen sowohl B7.1 wie auch ICAM-1 koexprimieren; eine Mischung von Zellen, die entweder L^d + B7.1 oder L^d + ICAM-1 exprimieren, ist nicht stimulatorisch. Im Gegensatz dazu zeigt das stärkere Peptid, QL9, L^d.Fliegenzellen, die entweder B7 oder ICAM exprimieren, deutlich signifikante Reaktionen, obwohl die kombinierte Expression von B7 und ICAM wesentlich höhere Reaktionen generiert. Im Gegensatz zu diesen Erkenntnissen der T-Zellproliferation, setzt die IL-2-Produktion in Reaktion auf das QL9-Peptid eine gemeinsame Expression von B7 und ICAM voraus; die Expression dieser Moleküle auf getrennten Zellen ist unwirksam.
Die Ergebnisse zeigen, dass Drosophila-Zellen, die mit murinen Klasse I-Molekülen und kostimulatorischen Moleküle transfiziert sind, murine T-Zellen dahingehend induzieren, primäre proliferative Reaktionen zu zeigen und eine Lymphokin (IL-2)-Produktion in Reaktion auf Peptidantigene zu zeigen. Das System ist auch auf menschliche T-Zellen anwendbar und könnte verwendet werden, um nicht vorbehandelte (oder vorbehandelte) T-Zellen zu stimulieren, die spezifisch für Tumor-spezifische Antigene in vitro sind; eine in vivo-Infusion von klonal expandierten T-Zellen, die spezifisch für Tumor-spezifische Antigene sind, könnte für Krebspatienten therapeutisch therapeutisch sein. Die Infusion von T-Zellen, die für virale Antigene spezifisch sind, würde in Patienten mit viralen Infektionen, z. B. HIV, nützlich sein.
Beispiel 4
Immobilisierung von biotinylierten MHC-Molekülen auf Avidin-beschichten roten Blutzellen
NHS-LC-Biotin, Neutravidin und Biotin-BMCC wurden von Pierce (Rockford, IL) gekauft. Schafs-rote Blutzellen wurden von der Colorado Serum Company (Denver, CO) erworben. Drosophila S2-Zellen, die L^d und rekombinantes L^d exprimieren, wurden, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben, hergestellt. Monoklonale Antikörper 30.5.7 (Anti-L^d) und 1B2 (Anti-klontypischer Antikörper gegen den 2C T-Zellrezeptor) wurden als Hybridom-Zellkulturüberstände verwendet.
Das verwendete Protokoll wird durch Muzykantov und Taylor (Anal. Biochem. (1994) 223, 142–148) beschrieben. In Kürze, SRBC wurden 4-mal in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, unter Verwendung von NHS-LC-Biotin biotinyliert, wiederum 4 mal in PBS gewaschen, mit Neutravidin inkubiert und letztendlich 4 mal gewaschen und bei 4°C in PBS aufbewahrt, das 3% fetales Kälberserum und 0,02% Natriumazid enthält.
Rekombinantes L^d wurde unter Verwendung von Biotin-BMCC biotinyliert, einem Maleimid-gekoppeltem Biotin, welches mit Thiolgruppen reagiert. L^d zeigt eine freie Thiolgruppe, die Seitenkette von Cystein 121, welche nicht in der Peptidbindungsstelle liegt. Die Biotinylierung wurde wie durch den Hersteller empfohlen durchgeführt. Nicht reagiertes Biotin wurde unter Verwendung einer Centricon 10 entfernt.
Biotinyliertes L^d wurde durch Inkubation bei einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml mit Avidin-beschichtetem SRBC für 30 Minuten immobilisiert, gefolgt durch Waschen in DMEM, das 10% fetales Kälberserum enthält. SRBC mit daran befestigtem L^d wurde direkt verwendet.
T-Zellen, die das 2C TCR-Transgen aus den Lymphknoten von Mäusen exprimieren, wurden durch magnetische Verarmung aufgereinigt. Aufgereinigte T-Zellen waren konsistent 97–98% positiv für die Färbung in der Flusszytofluormetrie unter Verwendung des anti-klontypischen Antikörpers 1B2.
Die Immobilisierung von biotinyliertem L^d auf Avidin-beschichteten SRBC wurde wie oben angezeigt durchgeführt. Die Anheftung wurde unter Verwendung einer Flusszytofluormetrie unter Verwendung des Anti-L^d-Antikörpers 30.5.7 untersucht.
Ein typisches Experiment wird in 8 gezeigt. Die negative Kontrolle (Zelle ohne Antikörper) wird in gestrichelten Linien gezeigt. Die gefüllte Spitze umfasst Zellen, die mit Fluoreszenzantikörper markiert sind. 99,78% der Zellen waren markiert. Die Fluoreszenzintensität lag in dem gleichen Bereich wie die größte Intensitätsmenge, die für L^d auf synthetischen Antigen-präsentierenden Zellen beobachtet wurde.
K^b (MHC-Molekül, das die schwere Kette und β2 umfasst) wurde auch unter Verwendung des gleichen Verfahrens biotinyliert. Wir konnten biotinyliertes K^b auf Avidin-beschichtetem SRBC, wie durch Flusszytoflourmetrie (9) untersucht, immobilisieren. 99,88% der Zellen waren markiert.
Die "Rosetting"-Experimente verifizierten, dass die befestigten MHC-Moleküle funktionell mit den T-Zellen wechselwirkten. Drosophila S2-Zellen, die L^d, L^d-beschichtete SRBC exprimieren, wurden mit QL9-Peptid (0,02 mM) oder einem irrelevantem Protein (MCMV, 0,02 mM) für 30 Minuten auf Eis inkubiert; 2C+ T-Zellen wurden dann hinzugefügt, mit einem Anteil von 10 2C+ T-Zellen für eine Drosophila S2-Zelle, oder 10 SRBC für 1 2C+ T-Zelle; die Mischung wurde pelletiert und auf Eis für mindestens 30 Minuten gehalten. Die Zellen wurden dann vorsichtig resuspendiert und die Rosetten gezählt, wobei eine Rosette eine Drosophila S2-Zelle ist, die an mindestens 3 C+ T-Zellen gebunden ist oder eine 2 C+ T-Zelle, die an mindestens 3 SRBC gebunden ist. Rosetten wurden in allen Fällen beobachtet. Typischerweise wurden 30–40% der Lymphozyten in Rosetten umfasst, wenn QL9-Peptid hinzugefügt wurde. Keine Rosette wurde in der Gegenwart des irrelevanten Peptids beobachtet, obwohl eine zufällige Anheftung einiger einzelnen Zellen beobachtet wurde.
Diese Beispiele beschreiben ein neues Verfahren zur Immobilisierung großer Mengen an MHC-Klasse I-Molekülen auf verschiedenen Oberflächen (Fliegenzellen, roten Blutzellen, Latexkügelchen) in nativer Konformation, wie durch monoklonale Antikörperbindungs- und Rosettenexperimente (T-Zellrezeptorbindung) zu beurteilen ist. Dieses Verfahren kann auf andere synthetische Oberflächen angewendet werden, einschließlich künstlicher Phospholipidmembranen. Phosphatidylethanolamin sowie Avidin-gekoppelte Phospholipide sind für unsere Studien besonders relevant. Diese Phospholipide sind kommerziell von Lipex Biomembrane Inc., Vancouver, BC, Kanada, verfügbar.
Beispiel 5
Immobilisierung von biotinylierten MHC-Molekülen auf Avidin-beschichteten Latexkügelchen
Latex-Sulfat-Kügelchen mit einem Durchmesser von sechs Mikron wurden von der Interfacial Dynamics Corporation (Portland, OR) käuflich erworben und gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Protokoll biotinyliert.
Avidin-beschichtete Latexkügelchen wurden unter Verwendung einer 1% Suspension der Latexkügelchen hergestellt, die für eine Stunde bei Raumtemperatur in PBS inkubiert sind, das 1 mg/ml Neutravidin enthält. Dann wurde ein gleiches Volumen an PBS, das 10% fetales Kälberserum enthält, hinzugefügt. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Kügelchen 3 mal gewaschen und zur Bindung an rekombinantes biotinyliertes L^d verwendet.
Rekombinantes biotinyliertes L^d wurde durch Inkubation bei einer Endkonzentration von 0,2 mg/ml mit Avidin-beschichteten Latexkügelchen für 30 Minuten immobilisiert, gefolgt durch Waschen in DMEM, das 10% fetales Kälberserum enthält. SRBC mit daran haftenden L^d wurden direkt verwendet.
"Rosetting"-Experimente verifizierten, dass die auf den Latexkügelchen befestigten MHC-Moleküle funktionell mit T-Zellen wechselwirkten. Drosophila S2-Zellen, die rekombinantes L^d exprimieren, und L^d-beschichtete Latexkügelchen wurden mit QL9-Peptid (0,02 mM) oder einem irrelevantem Peptid (MCMV, 0,02 mM) für 30 Minuten auf Eis inkubiert; 2C+ T-Zellen wurden dann hinzugefügt, wobei der Anteil bei 10 2C+ T-Zellen für 1 Drosophila S2-Zelle oder L^d-beschichteten Latexkügelchen für 1 2C+ T-Zelle lag; die Mischung wurde pelletiert und für mindestens 30 Minuten auf Eis gehalten. Die Zellen wurden dann vorsichtig resuspendiert und es wurden Rosetten gezählt, wobei eine Rosette eine Drosophila S2-Zelle ist, die an mindestens 3 2C+ T-Zellen gebunden ist oder eine 2C+ T-Zelle, die an mindestens 3 Latexkügelchen gebunden ist. Rosetten wurden in allen Fällen beobachtet. Typischerweise waren 30–40% der Lymphozyten in Rosetten umfasst, wenn QL9-Peptid hinzugefügt wurde. Keine Rosette wurde in Gegenwart des relevanten Peptids beobachtet, obwohl eine gelegentliche Anheftung von einigen wenigen Zellen beobachtet wurde.
Beispiel 6
Immobilisierung und Nachweis von rekombinantem Protein, das auf verschiedenen festen Trägern, wie Plastik-Mikrowell-Platten gebunden ist
Die MHC-Moleküle wurden durch direkte Bindung auf Mikrotiterplatten (Corning) immobilisiert und wie folgt nachgewiesen:
MHC-K^b-Moleküle wurden auf die gewünschte Konzentration in PBS verdünnt, z. B. 0,001 mg/ml für 100 ng/Well. 100 μl des verdünnten K^b wurde zu jeder Well auf der Plastikmikrotiterplatte hinzugefügt. Die Platte wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Platte einmal mit PBS gewaschen und 200 μl 2 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS + (.05%) und Tween^TM (PBST) wurden hinzugefügt und für eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dreimal mit PBST gewaschen und biotinylierter Anti-K^b mAb wurde in 2% BSA in PBS (1 : 2500) hinzugefügt. Die Platte wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und drei mal mit PBST gewaschen. Avidin-konjugiertes HRP wurde in 2% BSA in PBS (1 : 2500) hinzugefügt. Nach einer weiteren Stunde der Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte drei mal mit PBST gewaschen und H₂O₂ oder Thophenyldiamin wurde hinzugefügt. Die Reaktion wurde mit H₂SO₄ gestoppt. Das Reaktionsprodukt wurde kolorimetrisch bei 490 nm nachgewiesen.
10 zeigt die Ergebnisse des Nachweises der Gegenwart von MHC-K^b-Molekülen unter Verwendung von drei unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern.
Rekombinante MHC-K^b-Moleküle können alternativ dazu durch Biotin-Avidin-verbindende Wechselwirkungen mit dem Substrat gebunden werden. In dieser Ausführungsform waren die Mikrowell-Platten mit 100 μl Avidin beschichtet, das in PBS auf eine Konzentration von 0,001 mg/ml verdünnt worden war. Überschüssiges Avidin wurde durch eine PBS-Waschung entfernt. Das oben genannte Verfahren zur Präsentation und zum Nachweis der K^b-Bindung folgte.
Rekombinante MHC-Moleküle können alternativ dazu durch eine Verbindung immobilisiert werden, die auf einem Poly-Histin-Tag basiert, das zu dem MHC hinzugefügt wird, welches mit dem Nickel wechselwirkt, das an das Substrat gebunden ist.
Das oben genannte Verfahren zur Bindung und zum Nachweis wird unter Verwendung von Nickel-Chelat-beschichteten Mikrowell-Platten (Xenopore) und rekombinanten MHC-Molekülen mit einem Poly-Histidin-Tag durchgeführt, das unter Verwendung des oben beschriebenen Vektors pRmHa-His₆ exprimiert wird.
Beispiel 7
Direkte Bindung von Peptid an lösliche, leere Klasse I-MHC-Moleküle in vitro
A. Verfahren
H-2K^b: wie oben in Beispiel 1.B beschrieben hergestellt.
H-2K^b Sol: K^b sol-cDNA ist ein Derivat von K^b, das den extrazellulären Teil des Klasse I-MHC-Moleküls kodiert. K^b sol-cDNA kann durch PCR gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden, wie solchen, die in Ennis et al., PNAS USA 87: 2833–7 (1990) und Zemmour et al., Immunogenetics 33: 310–20 (1991) beschrieben werden. Spezifisch wird cDNA, die ein trunkiertes K^b-Molekül mit einem Stopkodon, das an dem Ende der Alpha 3-Domäne an der Aminosäureposition +275 eingefügt ist, kodiert, aus dem pCMU Expessionsplasmid als ein Bam HI-Fragment ausgeschnitten und in pRmHa-3 als K^b-cDNA einkloniert. Die K^b sol-cDNA ist ein Derivat der gesamten. K^b-cDNA (siehe oben), welche als Template in einer PCR-Reaktion unter Verwendung eines 5'-Oligonucleotids, das die Sty I-Sschnittstelle umfasst verwendet wird und das folgende 3'-Oligonucleotid:
Das resultierende PCR-Fragment wird stumpfendig in die Sma I-Schnittstelle von pBS (Stratagene, La Jolla, CA) einkloniert, sequenziert und die verbleibende 5'-Sequenz von K^b in die Sty I-Schnittstelle kloniert. Eine cDNA, die das gesamte K^b sol-Protein kodiert, könnte als ein Bam HI-Restriktionsfragment erhalten werden.
H-2D^b und H-2L^d werden, wie oben in Beispiel 1.B. diskutiert, hergestellt.
Die cDNAs, die die K^b α1α2α3-Domänen (274 Reste) und murines β-2-Mikroglobulin (99 Reste) kodieren, wurden jeweils in die enmalig vorhandene Bam HI-Schnittstelle eines Expressionsvektors kloniert, der den Metallothioneinpromotor pRMHa-3 enthält (Bunch et al., Nucleic Acid Res. 16: 1043–1061 (1988)). Drosophila S2/M3-Zellen wurden mit diesen rekombinanten Plasmiden zusätzlich zu dem Plasmid phshsneo (enthaltend ein Neomycin-Resistenzgen) durch das Kalzumphosphat-Präzipitationsverfahren, das zuvor beschrieben wurde, transformiert. Die transformierten Zellen, die gegen das Neomycin-Analogonantibiotikum G418 selektiert wurden, wurden bei 27°C in serumfreiem Medium wachsen gelassen und lösliches schwere Ketten K^b und β-2-Mikroglobulin wurden durch die Zugabe von 0,7 mM CuSO₄ koexprimiert.
Der lösliche, zusammengesetzte Heterodimer von K^b wurde aus den Kulturüberständen durch Affinitätschromatografie unter Verwendung des Anti-K^b-monoklonalen Antikörpers Y3 aufgereinigt, gefolgt durch eine Ionenaustauschchromatografie auf einer Pharmacia Mono Q^TM-FPLC-Säule gemäß den Instruktionen des Herstellers (Pharmacia, Piscataway, NJ). Die SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) der K^b-Herstellung, gefolgt durch Färbung mit Coomassie-Blau, zeigte ohne nachweisbare Verunreinigungen nur eine Bande von einer relativen Molekularmasse (Mr) bei ungefähr 32.000 und eine Bande bei ungefähr 12.000. Das hochaufgereinigte K^b wurde gegen phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert, filtersterilisiert und für eine weitere Untersuchung verwendet.
Der Extinktionskoeffizient des löslichen K^b ("K^bsol")-Proteins (43.2 kDa) beträgt 69.200 M^–1cm^–1 bei 280 nm.
Das aufgereinigte K^b sol (0,3 μM) in PBS mit und ohne 1% TX-100 wurde für eine Stunde verschiedenen Temperaturen (d. h., 4°C, 23°C, 32°C, 37°C, 42°C und 47°C) ausgesetzt. Die Proteine wurden dann durch Inkubation mit dem monoklonalen Antikörper Y3 und Protein A-Sepharosekügelchen (Pharmacia, Piscataway, NJ) bei 4°C für jeweils zwei Stunden inkubiert. Die Proben wurden durch 12,5% SDS-PAGE analysiert, gefolgt durch Färben mit Coomassie-Blau. Die zwei dicken Banden auf dem Gel sind die schweren und leichten Ketten des Antikörpers Y3. In einem anderen Verfahren wurde K^b sol (0,3 μM) mit 50 μM Peptiden in PBS bei 23°C für zwei Stunden inkubiert, um die K^b-sol-Peptid-Komplexausbildung zu ermöglichen. Nach der Zugabe von 1% TX-100 wurden die Proben für eine Stunde 12°C-, 37°C- oder 47°C-Temperaturen ausgesetzt. Die Komplexe wurden immunopräzipitiert und durch SDS-PAGE wie oben beschrieben analysiert. In einem dritten Verfahren wurde K^b sol (2,7 μM) mit 50 μM OVA-8-, VSV-8- oder SEV-9-Peptiden jeweils bei 23°C für zwei Stunden inkubiert. Die Proben wurden auf ein 1% Polyacrylamid-IEF-Gel aufgetragen. Das IEF wurde bei einem pH 5–7 laufen gelassen und das Gel wurde mit Silber gefärbt.
Danach wurde das VSV-8-Peptid unter Verwendung des Chloramin-T-Verfahrens (Hunter et al., Nature 194: 495–6 (1962)) radioiodiert und freies ¹²⁵I wurde durch eine C₁₈-Säulen (QPC-Kassette, Applied Biosystems, Foster City, CA) entfernt. Das markierte Peptid wurde weiter durch C₁₈-Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Nach Elution wurde das markierte Peptid lyophilisiert und in PBS resuspendiert.
Die spezifische Aktivität von [¹²⁵I]VSV-8 (ungefähr 250 Ci/mmol) wurde spektrofotometrisch unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten von Tyrosin bei 274 nm (1420 M^–1 cm^–1) bestimmt. Zuerst wurde K^bsol (0,5 μM) mit [¹²⁵I]VSV-8 (1,5 nM) und nicht markiertem VSV-8 (50 nM) bei 23°C für 16 Stunden vermischt, um eine Komplexausbildung zu ermöglichen. Ein Teil der Probe wurde durch Gelfiltration (Superose 12, Pharmacia, Piscataway, NJ) in PBS analysiert. Nach Elution wurde die in jeder Fraktion (0,05 ml) enthaltene Radioaktivität gemessen. Protein wurde durch Absorption bei 280 nm beobachtet.
In einem zweiten Verfahren wurde [¹²⁵I]VSV-8 (0,39 nM) mit verschiedenen Konzentrationen K^bsol in PBS vermischt, das 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthält. Nach Inkubation bei 23°C für 2–16 Stunden, wurden die K^bsol-Peptidkomplexe von freiem Peptid durch eine kleine Gelfiltration (Bio-Gel^TM P30, BioRad, Richmond, CA) in PBS abgetrennt. Die P30-Gelfiltration ermöglichte eine über 95%-ige Abtrennung von gebundenem und freiem Peptid innerhalb von ungefähr 5 Minuten. Die Radioaktivität von gebundenen und freien Peptiden wurde gemessen und die Daten durch lineare Regression analysiert. Bei maximalen Mengen an angebotenem K^bsol wurden 65% der gesamten markierten Peptide gebunden. Diese maximale Bindungskapazität von markiertem Peptid an K^bsol-Protein verfiel über die Zeit, wahrscheinlich bedingt durch die Strahlung des an VSV-8 gebundenen ¹²⁵I.
In einem dritten Verfahren enthielt jede Probe 0,39 nM [¹²⁵I]VSV-8 (ungefähr 18.000 cpm), nichtmarkierte Peptide in der angezeigten Konzentration und 30 nM K^b sol, das über 50% der [¹²⁵I]VSV-8-Bindung in der Abwesenheit von nicht-markiertem Peptid bei einem Endvolumen von 72 μl ergibt. Alle Komponenten wurden aufgelöst und in PBS, das 1% BSA enthält, verdünnt. Nach Inkubation für 2–16 Stunden bei 23°C wurden 50 μl-Proben durch P30-Gelfiltration wie oben beschrieben analysiert. Die Dissoziationskonstanten für nicht-markierte Peptide wurden aus den molaren Konzentrationen von [¹²⁵I]VSV-8 und den nicht-markierten Peptiden bestimmt, was eine 50%-ige Inhibierung der [¹²⁵I]VSV-8-Bindung an K^bsol, wie beschrieben, ergab. (Siehe Muller et al., Meth Enzymol. 92: 589–601 (1983).)
K^bsol (0,3 μM) und [¹²⁵I]VSV-8 (0,39 nM) wurden dann bei 4°C, 23°C und 37°C inkubiert und die Assoziation zu verschiedenen Zeiten durch P30-Gelfiltration bestimmt. Murines β-2-Mikroglobulin wurde, wenn nötig, vor der Inkubation in der angezeigten Konzentration hinzugefügt. Das murine β-2-Mikroglobulin wurde durch Affinitätschromatografie unter Verwendung des anti-β-2-Mikroglobulin – polyklonalen Antikörpers K355 aus den Kulturüberständen von rekombinanten Drosophila-Zellen hergestellt. (Siehe auch Logdberg et al., Molec. Immun. 14: 577–587 (1979).) In einem weiteren Experiment wurden K^bsol (0,3 μM oder 1,8 μM) und [¹²⁵I]VSV-8 (2.4 nM) bei 23°C für zwei Stunden inkubiert und die Peptid-K^bsol-Komplexe wurden durch P30-Gelfiltration isoliert. Die Proben enthielten sehr kleine Mengen an [¹²⁵I]VSV-8- und K^bsol-Komplexen (bei einem Maximum von 2,4 nM) und leeres K^bsol bei einer Endkonzentration von ungefähr 50 bis 300 nM. Zu einigen Proben wurden 3 μM β-2-Mikroglobulin, 3 μM β-2-Mikroglobulin plus 20 μM nicht-markiertes VSV-8, 20 μM nicht-markiertes VSV-8 oder 1 TX-100 hinzugefügt. Die Proben wurden für verschiedene Zeiten bei 37°C inkubiert und der Grad der Dissoziierung wurde durch Passagieren über P30-Kolonnen bestimmt.
B. Diskussion
Klasse I-MHC-Moleküle präsentieren antigene Peptide an zytotoxische T-Lymphozyten. Die direkte Bindung von Peptid an Klasse I-Molekülen in vitro wurde entweder durch die Gegenwart von zuvor gebundenen Peptide an der Bindungsstelle (Chen und Perham, Nature 337: 743–5 (1989)) oder das Fehlen einer Bindungsspezifität gestört. (Siehe, z.
B. Frelinger et al., J. Exp. Med. 172: 827–34 (1990); Choppin et al., J. Exp. Med. 172: 889–99 (1990); Chen et al., J. Exp. Med. 172: 931–6 (1990).) Die in vitro Analyse der Peptidbindung an lösliche, leere Klasse I-Moleküle, die aus Drosophila-Zellen aufgereinigt wurden, die mit trunkierten H-2K^bsol- und murinen β-2-Mikroglobulingenen transformiert worden waren, wird hierin offenbart. Die Ergebnisse demonstrieren, dass die Peptidbindung sehr schnell ist und natürlich prozessierte Peptide (Octapeptide; siehe, z. B., Van Bleek et al., Nature 348: 213–6 (1990); Falk et al., Nature 351: 290–6 (1991)) haben die höchsten Affinitäten für K^bsol in dem nanomolaren Bereich und zeigen an, dass mit Octapeptiden komplexiertes K^bsol stabil ist, wohingegen solche, die mit leicht kürzer oder längeren Peptiden komplexiert sind, weniger haltbar sind. Die Wechselwirkungen zwischen der freien schweren Kette und der β-2-Mikroglobulin sind im Wesentlichen in der Abwesenheit eines Reagenz reversibel. Peptide binden spontan an leere Klasse I-Moleküle ohne Ablösen des β-2-Mikroglobulins. Jedoch fördert ein Überschuss β-2-Mikroglobulin scheinbar die Bindung des Peptids an leere Klasse I als Konsequenz der Reassoziation der freien schweren Kette mit β-2-Mikroglobulin unter Bedingungen, unter denen Heterodimere instabil sind.
Lösliche H-2K^b-Moleküle (aus der α1α2α3-Domäne der schweren Kette zusammengesetzt) und murines β-2-Mikroglobulin wurden aus den Kulturbeständen von Drosophila-Zellen aufgereinigt, welche gleichzeitig mit der trunkierten schweren Kette und β-2-Mikroglobulin Genen transformiert worden waren. Erste Untersuchungen deuteten an, dass Drosophila-Zellen Klasse I-MHC-Moleküle exprimieren, denen endogene Peptide auf der Zelloberfläche fehlen. Einige der Eigenschaften der leeren Klasse I-Moleküle umfassen die Beobachtung, dass diese bei 37°C weniger stabil sind und deren Struktur durch die Bindung eines Peptides stabilisiert wird. (Siehe, z. B., Schumacher et al., Cell 62: 563–7 (1990); Ljunggren et al., Nature 346: 476–80 (1990).) Um zu bestätigen, dass aufgereinigte lösliche K^b leer sind, wurde deren thermale Stabilität in tensidfreier Lösung untersucht. Überraschenderweise wurden bei 47°C für eine Stunde erhitzte Proteine schnell durch Immunpräzipitation unter Verwendung des konformellen Antikörpers Y3 schnell wiedergewonnen. Dieses unerwartete Ergebnis führte uns dazu, ein Detergens, 1% Triton^TM X-100 (TX-100; Polyoxyethylen (9) octylphenylether) zu der Proteinlösung hinzuzufügen, da ähnliche Experimente zur Untersuchung der Stabilität von Klasse I-Molekülen immer in Deterenz-haltigen lysaten durchgeführt wurden (siehe Schumacher et al., supra zitiert). Die in der Gegenwart von Detergens erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass aufgereinigtes K^bsol nun bei 37°C instabil ist. Diese und andere Beweislinien schlagen vor, dass das K^bsol-Heterodimer sich in die schwere Kette und β-2-Mikroglobulin bei erhöhten Temperaturen zerlegt, und dass das Detergens β-2-Mikroglobulin von der Reassoziierung mit einer dissoziierten freien schweren Kette (siehe unten) abhalten kann. Zweitens wurde die Möglichkeit der Stabilisierung von aufgereinigtem K^bsol mit Peptiden untersucht. Die Ergebnisse der zuerst beschriebenen Untersuchung zeigten, dass Proteine nur stabilisiert werden können, wenn sie mit einem Octapeptid (vesikuläres Stomatitis-Virusnucleocapsidprotein [VSV-8], siehe Tabelle 3 unten) vermischt werden, von dem gezeigt wurde, dass es ein natürlich prozessiertes Peptid ist (siehe Van Bleek et al., supra zitiert). Diese Beobachtungen sind mit den Eigenschaften der oben genannten leeren Klasse I-Moleküle konsistent.
Unabhängige Unterstützung dafür, dass die aufgereinigten K^bsol-Moleküle leer sind, wird durch isoelektrische Fokussierung (IEF) unter nativen Bedingungen (Daten nicht gezeigt) zur Verfügung gestellt. Das aus Drosophila-Zellen aufgereinigte lösliche K^b zeigte ein wesentlich einfacheres Muster als HLA-A2-Moleküle, die aus menschlichen lymphobplastoiden Zelllinien aufgereinigt wurden (siehe 3 in Silver et al., Nature 350: 619–22 (1991)). Von dem komplizierten Muster von HLA-A2 auf IEF wird angenommen, dass es das Ergebnis des Vorhandenseins von heterogenen Peptiden ist, die an die Moleküle gebunden sind. Das einfache Band von aufgereinigtem K^bsol zeigt die Abwesenheit von endogenen Peptiden an. Zusätzlich bewirkte die Inkubation von K^bsol mit antigenen Peptiden die deutlichen Shifts der Bande auf dem IEF-Gel, was die Änderung in dem isoelektrischen Punkt von K^bsol, bedingt durch die Peptidbindung, reflektiert. Es soll hier festgestellt werden, dass so ein Bandshift nicht in HLA-A2-Molekülen beobachtet wurde, wenn diese einfach mit Peptiden vermischt wurden, es sei denn, dass NLA-A2 mit Peptiden unter "rekonstituierenden Bedingungen" nach Entfernen zuvor gebundener endogener Peptide inkubiert wird. Zusammengenommen zeigen diese Beobachtungen auf nativem IEF auch an, dass von Drosophila-Zellen aufgereinigtes lösliches K^b leer sind.
Die Assoziation von ¹²⁵I-markiertem VSV-8 mit K^bsol wurde durch Gelfiltration (nicht gezeigt) nachgewiesen. Die Radioaktivität der hoch molekulargewichtigen Materialien korrespondiert mit den Peptid-K^bsol-Komplexen, während die der gering molekulargewich tigen Materialien freie Peptide darstellen. Nicht-markierte VSV- und Ovalbumin (OVA)-Peptide könnten mit den markierten VSV-8 (siehe unten) kompetetieren, was darlegen könnte, dass [¹²⁵I]VSV-8 spezifisch an K^bsol-Moleküle gebunden ist. Umkehrphasen-HPLC offenbarte, dass K^b-gebundenes [¹²⁵I]VSV-8 die identische Retentionszeit wie das eingebrachte Peptid hat. Die Bindung an K^bsol an markiertes VSV-8 war zu sättigen, und zeigte eine Dissoziationskonstante (Kp) von ungefähr 33 nM (nicht gezeigt). Aus der x-Achse des Scatchard-Plots wurde festgestellt, dass ungefähr 65% des markierten VSV-8 in der Lage ist, an K^b zu binden.
Um die Affinitäten von verschiedenen Peptiden an K^b zu bestimmen, wurden kompetitive Radioimmunoassays (RIA) unter Verwendung von [¹²⁵I]VSV-8 durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Die für den RIA verwendeten inhibitorischen Peptide sind in Tabelle 3 aufgelistet. Auch die Kp wird in Tabelle 3 für jedes Peptid zusammengefasst. TABELLE 3 Verschiedene antigene Peptide^*, die in den vorliegenden Studien verwendet wurden
Die Peptide von natürlich prozessierter Größe (8-mere für VSV und OVA und 9-mere für das Sendaivirusnucleoprotein [SEV]) hatten die höchsten und bemerkenswert ähnliche Affinitäten in dem Bereich von 2,7 bis 4,1 nM. Diese außergewöhnlich hohe Affinität der natürlichen Peptide ist mit kürzlich gemachten Beobachtungen konsistent. (Siehe z. B., Schumacher et al., Nature 350: 703–6 (1991); Christnick et al., Nature 352: 67–70 (1991).) Jedoch verringerten Peptide, die nur ein oder zwei Reste kürzer oder länger waren, die Affinität um einen Faktor von 2 bis 100. Diese Verringerung der Affinität ist für deutlich längere Peptide sogar noch drastischer; d. h., die Affinität eines 24-mer Peptids (OVA-24) ist mehr als 10.000-fach geringer als die von OVA-8. Diese Ergebnisse helfen zu erklären, warum frühere Berichte, die längere Peptide verwenden, die Affinität eines mikromolaren Bereiches beanspruchen (siehe z. B. Frelinger et al. und Choppin et al., beide supra zitiert.) Es ist von besonderem Interesse, dass die Verlängerung von Peptiden an dem Carboxylterminus deutlich wesentlicher destruktiv auf die Affinität als die Verlängerung an dem Aminoterminus wirkt. Gemäß der dreidimensionalen Struktur von HLA-A2 wird die Peptidbindungsfurche durch zwei lange α-Helices auf den antiparallelen β-Strängen ausgebildet und die Spalte ist ungefähr 25 Angström lang, von der angenommen wird, dass sie eine längere Peptidkette von ungefähr 8 Resten aufnehmen kann (siehe z. B. Bjorkman et al., Nature 329: 506–12 (1987)). An einem Ende der Spalte kommen die α1- und α2-Helices eng zusammen, während die Spalte am anderen Ende relativ offen ist. Es wird nun spekuliert, dass sowohl VSV- wie auch OVA-Peptid an die Spalte in der gleichen Orientierung binden ^*und dass der Carboxylterminus der Peptide mit dem relativ offenen Ende der Spalte so wechselwirken könnte, dass die Verlängerung des Peptids an dem Carboxylterminus keine starke sterische Hinderung bewirkt.
Es wurden dann Untersuchungen durchgeführt, um die Geschwindigkeit der Peptidbindung an K^b bei jeweils 4°C und 23°C zu bestimmen (nicht gezeigt). Die Bindung war, insbesondere bei 23°C, sogar in extrem geringen Konzentrationen von markierten Peptiden (ungefähr 0,4 nM), mit einer Halbwertszeit von ungefähr 5 Minuten sehr schnell. Dieses steht im Gegensatz zu kürzlich gemachten Beobachtungen, welche zeigen, dass die Halbwertszeit der Assoziation bei ungefähr zwei Stunden liegt. (Siehe z. B. Choppin et al., supra zitiert.) Wiederum waren nur 65% des gesamten markierten Peptids in der Lage zu binden. Der Zusatz von überschüssigem β-2-Mikroglobulin hatte keinen Einfluss auf die Peptidbindungskinetiken bei solch geringen Temperaturen, bei denen das K^b-Heterodimer stabil ist (verblieb, um zusammengesetzt zu werden). Dieses impliziert, dass ein Austausch von β-2-Mikroglobulin keine Voraussetzung für eine Peptidbindung ist; d. h., Peptide können spontan an Klasse I-Moleküle ohne Dissoziation von β-2-Mikroglobulin binden. Im Gegensatz dazu fördert freies β-2-Mikroglobulin scheinbar die Peptidbindung bei 37°C (Daten nicht gezeigt). Wenn die Konzentration von hinzugefügtem β-2-Mikroglobulin erhöht wurde, banden mehr Peptide an K^b-Moleküle. Da leere K^b bei 37°C instabil sind, muss eine Fraktion von Heterodimeren zur schweren Kette und β-2-Mikroglobulin dissoziiert sein und daher muss das Heterodimer im Gleichgewicht mit der freien schweren Kette und freiem β-2-Mikroglobulin sein. Dann sollte die Zugabe von β-2-Mikroglobulin das Gleichgewicht zur Bildung des Heterodimers, das Peptide binden kann, verschieben. Diese Ansicht wird durch kürzlich gemachte Beobachtungen unterstützt, dass es wesentliche Anzahlen von Klasse I-freien schweren Ketten auf der normalen Zelloberfläche gibt und dass exogen hinzugefügtes β-2-Mikroglobulin die Peptidbindung an leere Klasse I-Moleküle auf Zellen als Konsequenz der Reassoziierung von β-2-Mikroglobulin mit einer freien schweren Kette erleichtert. (Siehe z. B. Rock et al., Cell 65: 611–620 (1991); Kozlowski et al., Nature 349: 74–77 (1991); Vitiello et al., Science 250: 1423–6 (1990).)
Dann wurden die Dissoziationskinetiken des Peptids bei 37°C beobachtet. Direkt nach der Isolierung von [¹²⁵I]VSV-8- und K^b-Komplexen durch Gelfiltration wurden die Proben, die entweder 50 oder 300 nM K^b enthalten, Temperaturen von 37°C ausgesetzt. Einige Proben wurden mit 3 μM β-2-Mikroglobulin und/oder 20 μM nicht-markiertem VSV-8 oder 1% TX-100 supplementiert. Die Dissoziation von markierten Peptiden von K^b wurde zu verschiedenen Zeiten gemessen (nicht gezeigt). In der Gegenwart eines großen Ü berschusses von nicht-markierten Peptiden folgte die Dissoziationsgeschwindigkeit des Peptids Kinetiken erster Ordnung mit einer Halbwertszeitdissoziation von ungefähr 36 Minuten (eine Dissoziationsgeschwindigkeitskonstante von ungefähr 3,2 × 10^–4 s^–1). Diese unerwartete, relativ schnelle Dissoziation von markiertem Peptid stimmt nicht mit einigen derzeitigen Ansichten über stabile Peptid-Klasse I-Komplexe überein. Tatsächlich demonstrierten die überprüften Ergebnisse (nicht gezeigt), dass K^b- und VSV-8-Komplexe stabil sind. Diese Diskrepanz muss von der 10-fach geringeren Affinität von radiomarkiertem VSV-8 (33 nM) im Vergleich zu der von nicht-markiertem VSV-8 (3,7 nM) aufkommen.
Kinetiken erster Ordnung wurden auch beobachtet, wenn das Detergens anstatt nichtmarkierten Peptids hinzugefügt wurde, was anzeigt, dass das Detergens den Peptiddissoziierungsprozess irreversibel macht. Im Gegensatz dazu folgte das Peptiddissoziationsprofil in der Abwesenheit von nicht markiertem Peptid oder dem Detergens nicht Kinetiken erster Ordnung. Dieses zeigt an, dass die Assoziation/Dissoziation des Peptids reversibel ist, und dass die Bindung des Peptids von der Konzentration des Heterodimers abhängig ist (vergleiche die Kinetiken 50 nM und 300 nM von K^b). Dies wurde um so offensichtlicher, wenn überschüssiges β-2-Mikroglobulin hinzugefügt wurde. Diese Ergebnisse unterstützen das zuvor gemachte Argument, dass eine Wechselwirkung zwischen der schweren Kette, β-2-Mikroglobulin und Peptid grundsätzlich in der Abwesenheit von Detergens bei 37°C, wenn nicht sogar vollständig, reversibel ist. Es ist wahrscheinlich, dass ein Detergens wie TX-100 β-2-Mikroglobulin von der Reassoziierung mit einer freien schweren Kette bei 37°C abhalten kann. Dieses könnte begründeterweise erklären, warum K^b, sobald auf erhöhte Temperaturen in der Abwesenheit von Detergens erhitzt, wirksam durch konformgelle Antikörper (nicht gezeigt) immunpräzipitiert werden kann. Interessanterweise unterdrückte die Zugabe von β-2-Mikroglobulin nicht die Peptiddissoziierung in der Gegenwart eines Überschusses von nichtmarkierten Peptiden, was anzeigt, dass markierte Peptide aus den Komplexen ohne Dissoziation von β-2-Mikroglobulin freigesetzt werden. Es soll jedoch daran erinnert werden, dass die Affinität von [¹²⁵I]VSV-8 ungefähr 10-fach geringer als die der natürlichen Peptide ist. Daher ist dies nicht notwendigerweise der Fall für die natürlichen Peptide.
Die Studie unter Verwendung der in vitro-Peptidbindungsassaysysteme suggeriert, dass die Peptidbindung an Klasse I-Moleküle eine einfache Massenwirkungs- und eine Liganden-Rezeptorwechselwirkung ist. Der hierin verwendete Ansatz ermöglicht die Charakterisierung der Peptidbindungsspezifität an Klasse I-Moleküle und der Wechselwirkung der Peptid-Klasse I-Komplexe mit dem T-Zellrezeptor.
Beispiel 8
Therapeutische Anwendungen
A. Klasse I-Molekülbank
Es können ein Reservoir oder eine "Bank" von Insektenzelllinien etabliert und aufrechterhalten werden, wobei jede Zelllinie eine der 50 bis 100 am häufigsten vorkommenden Klasse I-MHC-schwere Ketten, ein β-Mikroglobulinmolekül sowie mindestens ein unterstützendes Molekül exprimiert. cDNAs, die diese Proteine kodieren, können auf HLA-Varianten basierend, die aus Zelllinien erhalten werden, die diese enthalten, kloniert werden -- z. B. mittels der Polymerasekettenreaktion (siehe Ennis et al., PNAS USA 87: 2833–7 (1990)) -- und in den geeigneten Vektor, wie einen Insektenexpressionsvektor, eingefügt werden, um Zelllinien zu generieren, die jede HLA-Variante exprimieren.
Z. B., kann ein Test gemäß dem folgenden Protokoll verwendet werden, um zu bestimmen, welche Peptide, die aus dem Virus der Wahl abgeleitet sind, am besten an die verschiedenen Klasse I-MHC-Moleküle binden. Die verschiedenen Kulturen können geeigneterweise markiert oder katalogisiert werden, um anzuzeigen, welche Klasse I-MHC-Moleküle am besten zur Verwendung mit bestimmten Peptiden sind. Alternativ dazu können transiente Kulturen bei Bedarf etabliert werden. Wie hierin diskutiert, ist nach ungefähr 48 Stunden Inkubation einer Kultur von Insektenzellen mit einem Vektor die Kultur scheinbar in der Lage, leere MHC-Moleküle zu exprimieren, welche mit dem Peptid(en) der Wahl zum Zwecke der Aktivierung von CD8⁺-Zellen beladen werden können.
B. Herstellung von "speziellen" Zelllinien
Nach HLA-Typisierung, wenn Insektenzellen, die das bevorzugte HLA exprimieren, nicht verfügbar sind, können cDNAs, die das bevorzugte HLA und unterstützende Moleküle kodieren, mittels der Verwendung der Polymerasekettenreaktion kloniert werden. Die in Abschnitt B.1 oben (SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 12) offenbarten Primen können verwendet werden, um die geeigneten HLA-A, -B, -C, -E, -F oder -G cDNAs in getrennten Reaktionen zu amplifizieren, welche dann wie in den in Beispiel 1 offenbarten Verfahren beschrieben, kloniert und sequenziert werden. Die DNA wird dann aus der PCR-Reaktion unter Verwendung eines Geneclean^TM-Kits (Bio 101, San Diego, CA) aufgereinigt und direkt in die Sma I-Schnittstelle von pRmHa-3 ligiert. Es werden einzelne Klone isoliert, die Sequenzen verifiziert und stabile Drosophila-Zelllinien etabliert, die das HLA exprimieren. Alternativ dazu kann eine Massenpopulation rekombinanter Plasmide in großem Maßstab wachsen gelassen werden und DNA durch Cäsiumchloridgradienten aufgereinigt werden. Die aufgereinigte DNA wird dann verwendet, um S2-Zellen unter Verwendung der Kalziumphosphat-Präzipitationstechniken zu transfizieren. Nach 24 Stunden wird das Präzipitat von den Zellen abgewaschen und mit frischem Schneidermedium ersetzt, das 1 mM CuSO₄ enthält. Achtundvierzig Stunden später wird die Massenpopulation von transient transfizierten Zellen für eine in vitro-Aktivierung von CD8⁺ nach Inkubation mit syngenen Peptiden oder Proteaseverdau von spezifischen Proteinen verwendet.
Dann können stabile Zelllinien, die das klonierte NLA exprimieren, etabliert werden. Alternativ dazu kann eine Population von Insektenzellen, die transient eine Massenpopulation klonierter rekombinanter Moleküle aus der PCR-Reaktion exprimieren, für eine in vitro-CD8⁺-Aktivierung verwendet werden.
Es ist auch möglich, Naplotyp-spezifische CD8 in vitro unter Verwendung von Insektenzellen, die Klasse I-MHC exprimieren, die mit Peptiden inkubiert sind, zu aktivieren, wenn das Zelllinien-exprimierte MHC nicht das exprimierte Element in vivo ist. Dieses stellt eine einzigartige Möglichkeit zur Proliferierung von CD8⁺-Zellen dar, welche ein spezifisches Antigen erkennen, das mit einem bestimmten MHC assoziiert ist, was in vivo durch allele Restriktion bedingt nicht möglich sein würde. Zum Beispiel ist ein Peptid (NP) aus dem nuklearen Protein des Influenzavirus normalerweise auf das D^b-Molekül eingeschränkt; wir haben jedoch herausgefunden, dass solch ein Peptid an K^b binden kann (jedoch schwächer als an D^b) und einen Grad an thermischer Stabilität für das K^b (siehe 3) generieren kann. Des Weiteren resultieren K^b-exprimierende Drosophila-Zellen, die mit NP-Peptid vorinkubiert worden waren und mit Splenozyten aus einer B6-Maus kokultiviert worden waren, in der in vitro-Aktivierung von CD8⁺, welche spezifisch das K^b-Molekül erkennen, das mit dem NP-Peptid assoziiert ist. Zudem resultiert das umgekehrte Experiment unter Verwendung eines K^b-beschränkten Peptids (OVA), das aus Ovalbumin abgeleitet ist, und D^b-exprimierenden Drosophila-Zellen in der Proliferation von CD8⁺, welche spezifisch D^b erkennen, die das OVA-Peptid enthalten. Solche CD8 sind in der Lage, Zellen (EL4 OVA) zu töten, die mit cDNA transfiziert sind, die das Ovalbuminprotein kodieren, was zeigt, dass einige D^b-Moleküle in vivo mit den OVA-Peptid beladen werden.
Dieses System stellt somit eine einzigartige Möglichkeit zur Verfügung, CD8⁺ gegen spezifische Antigene zu proliferieren, die durch ein Klasse I-Molekül präsentiert werden, welches in vivo nicht das Beschränkungselement für das Peptid ist. Obwohl genug Antigen in vivo durch besagte Klasse I für die Zelle präsentiert wird, damit die Zelle durch CD8⁺ erkannt und getötet wird, ist es nicht genug, um solche CD8s in vivo zu proliferieren. Durch die Beladung leerer Klasse I-Moleküle mit Peptid, die durch Drosophila-Zellen exprimiert werden, waren wir in der Lage, die in vivo-Beschränkung durch das Zurverfügungstellen eines Überschusses antigenen Peptids an das Klasse I-Molekül in einer nicht kompetitiven Umgebung zu überwinden, so dass genügend Antigen der Klasse I präsentiert wird, um die spezifische CD8⁺-Erkennung dieses Komplexes zu aktivieren.
C. AIDS-Behandlung
In vitro-aktivierte Zellen können in der Herstellung eines Medikaments zur in vivo-Therapie verwendet werden. Vorzugsweise wird zuerst der Klasse I-MHC-Genotyp (Haplotyp) des Individuums bestimmt. Konventionelle Gewebetypisierung ist für diesen Zweck geeignet und kann an dem Behandlungszentrum oder durch eine geeignete kommerzielle Operation durchgeführt werden. Sobald der individuelle HLA-Typ(en) bestimmt ist (sind), wird die beste Kombination von Peptiden und Klasse I-MHC-Molekülen, die für den individuellen Patienten geeignet sind, sichergestellt, und wie oben beschrieben hergestellt und es werden die geeigneten Insektenzelllinien und Peptide zur Verfügung gestellt. Ruhende oder Vorläufer CD8⁺-T-Zellen aus dem Blut des Patienten werden dann mit dem geeigneten Peptid beladenen MHC, das durch die Insektenzellenkultur hergestellt wurde, stimuliert. Nach Aktivierung werden die CD8⁺-Zellen in den Blutstrom des Patienten wieder eingeführt und der Krankheitsprozess in dem Patienten wird weiterhin beobachtet. Verfahren zur Entfernung und zur Wiedereinführung zellulärer Komponenten sind auf dem Gebiet bekannt und umfassen Verfahren, wie solche, die in dem U.S. Patent Nr. 4,844,893 an Honsik et al. und U.S. Patent Nr. 4,690,915 an Rosenberg beispielhaft dargestellt sind.
Zusätzliche Behandlungen können, falls notwendig, verabreicht werden, bis die Krankheit ausreichend rückläufig ist. Ähnliche Behandlungsprotokolle sind zur Verwendung mit anderen immunsupprimierten Individuen, einschließlich Transplantationspatienten, älteren Patienten und ähnlichen geeignet.
D. Krebsbehandlung
In Krebspatienten wird eine Behandlungsprozedur, die der oben beschriebenen ähnlich ist, verwendet. Jedoch sollte in solchen Patienten berücksichtigt werden, dass eine konventionelle zur Verringerung der Tumormasse der hierin beschriebenen Immuntherapie vorausgehen kann. Daher ist es bevorzugt, dass Blutproben aus dem vermeintlichen Patienten vor dem Beginn der konventionellen Therapie wie Bestrahlung oder Chemotherapie gewonnen und gelagert (z. B. mittels Einfrieren) werden, welche dahingehend tendieren, Immunzellen zu zerstören. Da wenige, falls überhaupt irgendwelche Formen von Krebs als direkte Reaktion auf eine virale Infektion zustande kommen, sind Zielpeptide für eine Immunbehandlung weniger leicht zu beobachten. Jedoch zeigen kürzliche gemachte Studien an, dass Mutationen in den Onkugenen ras, neu und p53 zum Krebs in bis zu 50% aller Krebsfälle beiträgen. Somit sind Peptide, die aus diesen mutierten Regionen der Moleküle abgeleitet sind, primäre Kandidaten als Ziele für die vorliegende Therapie. Nachfolgend zu den hierin offenbarten Protokollen kann die beste Kombination von Peptiden und Klasse I-Molekülen für den einzelnen Patienten bestimmt und verabreicht werden.
Zum Beispiel exprimieren viele Tumore Antigene, die in vitro durch CD8⁺-Zellen erkannt werden, die aus dem betroffenem Individuum abgeleitet sind. Solche Antigene, die nicht auf normalen Zellen exprimiert werden, können somit identifiziert werden, sowie auch der HLA-Typ, der diese den CD8⁺-Zellen präsentiert, zur genau gezielten Immuntherapie unter Verwendung der Verfahren der vorliegenden Erfindung. Zum Beispiel beschrieben van der Bruggen et al. ein Antigen, dessen Expression durch ein spezifisches Gen dirigiert wird, und welches Antigen scheinbar durch HLA A1 präsentiert wird. (Science 254: 1643–1647 (1991)). Während verschiedene menschliche Tumorantigene isoliert und beschrieben wurden, werden diese gute Kandidaten für immunotherapeutische Anwendungen wie die hierin beschriebenen sein.
In einem alternativen therapeutischen Modus kann es möglich sein, die in vitro-aktivierten CD8⁺-Zellen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit anderen Immunogenen zu verabreichen. Zum Beispiel kann das große multivalente Immunogen (Large Multivalent Immunogen), das in dem U.S. Patent Nr. 5,045,320 offenbart wird, zusammen mit aktivierten CD8⁺-Zellen verabreicht werden.
Es ist auch möglich, das Zytokine wie IL-2 und IL-4, welche die Differenzierung und Aktivierung von T-Zellen vermitteln, auch verabreicht werden, da Zytokine in der Lage sind, die T-Zellreaktion gegen Tumorzellen in vivo zu stimulieren. Es wird angenommen, dass IL-2 eine Hauptrolle in dem Wachstum und der Differenzierung von CD8⁺-Vorläufern und in der CD8⁺-Proliferation spielt. Die Verabreichung von IL-2 an Krebspatienten wird häufig mit einer verbesserten Anti-Tumorreaktion assoziiert, welche wahrscheinlich mit der Induktion von tumorspezifischen T-Zellen in Verbindung steht. Jedoch könnten die besten therapeutischen Wirkungen von IL-2 eher durch kontinuierliche lokale als systemische Verabreichung von IL-2 erzielt werden, wodurch die IL-2-Toxizität minimiert und seine biologische Aktivität verlängert wird. Man kann eine lokale Abgabe mittels der Transfektion von Tumorzellen mit einem IL-2-Genkonstrukt erreichen.
IL-2 cDNA wird wie durch Karasuyama und Melchers in Eur. J. Immunol. 18: 97–104 (1988) beschrieben, hergestellt werden. Die vollständige cDNA-Sequenz von IL-2 wird als ein Xho I-Fragment aus dem Plasmid pBMGneo IL-2 erhalten (siehe Karasuyama und Melchers, supra) und direkt in die Sal I-Schnittstelle in pRmHa-3 ligiert. Rekombinantes pRmHa-3-Plasmid mit der Einfügung in der korrekten Orientierung (mittels Restriktionskartierung mit Hind III bestimmt wird durch Cäsiumgradienten aufgereinigt und verwendet, um S2-Zellen unter Verwendung der Kalziumphosphattechnik zu kotransfizieren. (Eine Mischung von Plasmid-DNA wurde für diesen Zweck hergestellt: 10 μg pRmHa-3, enthaltend IL-2 cDNA, 6 μg von jedem pRmHa-3-Plasmid, das eine MHC-Klasse I-schwere Kette oder β-2 Mikroglobulin enthält und 2 μg phshsneo DNA.) Stabile Zelllinien, die mittels CuSO₄ induzierbar sind, um eine schwere Kette, β-2 Mikroglobulin und IL-2 zu exprimieren, wurden durch Wachsen der Transfektanden in G418-Medium erhalten. Diese stabilen Zelllinien wurden mit Peptid beschichtet und in dem in vitro-Assay wie oben beschrieben verwendet. Von Tumorzellen, die mit IL-2 transfiziert worden waren, wurde beobachtet, das sie die CTL (CD8)-Aktivität gegen die parentalen Tumorzellen und die Bypass-CD4- und T-Helfertunktion in der Induktion einer Antitumor oder zytotoxischen Reaktion in vivo verstärken. Daher wird hierin die Erhöhung des Potentials des Drosophila-Systems mittels der Kotransfektion mit dem IL-2-Gen vorgeschlagen.
Beispiel 9
Dosisabhängigkeit der Herstellung von aktivierten T-Zellen unter Verwendung des Antigen-präsentierenden Systems.
Antigen-präsentierende Zellen (APC) wurden durch Transfizieren von Drosophila-Zellen wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und dann auf deren Fähigkeit getestet, Antigen an T-Zellen aus der 2C-Linie von transgenen Mäusen zu präsentieren. Mit Mauszellen als Antigen-präsentierende Zellen zeigt diese Linie eine starke Alloreaktivität für Ld-Moleküle, die mit einem endogenen 9-ner Peptid, p2Ca (Leu-Ser-Pro-Phe-Pro-Phe-Asp-Leu, SEQ ID NO 46) komplexiert sind, das aus einem Krebszyklusenzym, 2-Oxoglutaratdehydrogenase (OGDH) abgleitet ist. Das p2Ca-Peptid wird an L^d natürlich gebunden auf der Oberfläche von H-2^d-Zellen wie B10.D2-Zellen ausgesetzt. Das p2Ca-Peptid hat eine mittlere Bindungsaffinität für lösliche L^d-Moleküle (4 × 106 M^–1) und eine hohe Affinität für 2C TCR-Moleküle (2 × 10⁶ M^–1 bis 2 × 10⁷ M^–1).
Ein nahe verwandtes 9-ner Peptid, QL9 (Gln-Leu-Ser-Pro-Phe-Pro-Phe-Asp-Leu, SEQ ID NO 47) hat eine noch höhere Affinität für diese Moleküle (2 × 10⁸ M^–1 für L^d und 2 × 10⁷ M^–1 für 2C TCR). Außer einer zusätzlichen Aminosäure (Glutamin) an dem N-Terminus hat QL9 eine zu p2Ca identische Sequenz und bildet wie p2Ca ein Teil der nativen Sequenz von OGDH.
Mit p2Ca- und QL9-Peptiden (in synthetischer Form hergestellt) wurden Antigen-präsentierende Zellvoraussetzungen für Reife, nicht vorbehandelte 2C CD8⁺-Zellen in vitro untersucht. Die Responder CD8⁺-Zellen wurden aus gesammelten Lymphknoten (LN) von 2C-Mäusen aus einem C57BU6 (B6, H-2^b)-Hintergrund durch erstes Entfernen von CD4⁺-Zellen, Klasse II-positive Zellen und B-Zellen durch mAb + Komplementbehandlung, gefolgt von positiver Selektion aufgereinigt.
Zellsuspensionen wurden aus gesammelten Gebärmutterhals-, Axel-, Leisten- und mesenterischen LN von jungen adulten Mäusen unter Verwendung eines Gewebefleischwolfes hergestellt. Zur Zellaufreinigung wurden die LN-Zellen zuerst mit einem Cocktail aus mAbs (Anti-CD4, Anti-HSA, Anti-I-A^b) plus Komplement für 45 Minuten bei 37°C behandelt. Die überlebenden Zellen wurden dann weiter in CD8⁺- und CD8^– (CD4^–)-Zellen durch Waschen bei 4°C für 60–90 Minuten auf Petrischalen getrennt, die mit Anti-CD8 mAb beschichtet waren. Die angehefteten CD8⁺-Zellen wurden durch Inkubation bei 37°C für 5 Minuten, gefolgt von heftigem Pipettieren, wiedergewonnen. Nicht angeheftete Zellen wurden eluiert und mit Anti-CD8 mAb und Komplement behandelt, um CD8^– 1B2⁺ 2C-Zellen zu erhalten. Mehr als 95% der CD8⁺-Zellen, die erhalten wurden, waren Klontyp-positiv (IB2⁺) und 98% von diesen Zellen zeigten einen naiven (CD44^lo)-Phenotyp.
Die TCR-Stimulation bewirkte ein komplexes Muster von intrazellulären Vorgängen, welche zu einer frühen Hochregulierung von CD69 und CD25 (IL-2-Rezeptor oder IL-2R) auf der Zelloberfläche) führten. Dieser Änderungen sind innerhalb weniger Stunden nach der Stimulation zu erkennen und werden durch Zytokinsynthese und Zellproliferation gefolgt. Drosophila-Zellen wurden mit Genen für L^d, L^d und B7.1 (L^d.B7), L^d und I-CAM-1 (L^d.ICAM) oder L^d, B7.1 und ICAM-1 (L^d.B7.ICAM) transfiziert. 11 zeigt eine CD69- und CD25-Expression auf aufgereinigten naiven CD8⁺2C – Zellen, die für 12 Stunden mit transfizierten Drosophila-Zellen stimuliert worden waren, und p2Ca- versus QL9-Peptid bei einer Konzentration von 10 μM. Aufgereinigte CD8⁺ 2C-Zellen wurden mit verschiedenen Drosophila-Zellen plus ein Peptid (entweder p2Ca oder QL9, 10 μM) in Massen (2 ml)-Kultur für 12 Stunden inkubiert und auf dann auf CD69 oder CD25 gefärbt. Sowohl p2Ca wie auch QL9, die durch Drosophila-Zellen präsentiert wurden, die mit L^d.B7, L^d.ICAM oder L^d.B7.ICAM transfiziert worden waren, waren in der Stimulation der Hochregulierung von CD69 und CD25 wirksam. Jedoch zeigten nicht kultivierte 2C- Zellen entweder ohne das Peptid oder ohne Drosophila-Zellen nicht die Hochregulation von CD69 und CD25 (oberer Abschnitt).
In der Gegenwart von Drosophila-Zellen, die L^d allein exprimieren, war die Induktion von CD69 und CD25-Expression auf CD8⁺ 2C-Zellen gering aber mit dem starken QL9-Peptid signifikant, aber kaum nachweisbar mit dem schwächeren p2Ca-Peptid. Mit L^d.B7- oder L^d.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen zeigten beide Peptide eine deutliche Hochregulierung von CD69 und CD25. Jedoch induzierten L^d.B7.ICAM Antigen präsentierende Zellen eine sogar noch höhere Expression dieser Moleküle.
Mit L^d allein transfizierte Drosophila-Zellen versagten in der Bewirkung einer Proliferation von 2C CD8⁺-Zellen auf entweder p2Ca- oder QL9-Peptid in der Abwesenheit exogener Lymphokine, was konsistent mit der minimalen Kapazität dieser Zellen als Antigen-präsentierende Zellen zur Induktion der CD69- und CD25-Expression ist. Die Ergebnisse werden in 12 gezeigt. Reaktionen auf p2Ca (oben) und QL9 (unten) wurden durch Kultivierung von 5 × 10⁴ aufgereinigten CD8⁺ 2C-Zellen mit 2 × 10⁵ Drosophila-Zellen in der Gegenwart oder Abwesenheit der angezeigten Konzentrationen von Peptiden für 3 Tage gemessen. [³N] TdR wurde während der letzten 8 Stunden der Kultur hinzugefügt; rIL-2 wurde bei einer Endkonzentration von 20 Einheiten/ml hinzugefügt. Die Daten sind Mittelwerte von Dreifachkulturen. Wenn mit exogenem IL-2 supplementiert, stimulierten beide Peptide jedoch deutliche proliferative Reaktionen bei hohen Dosen (10 μM). Die proliferativen Reaktionen, die durch QL9 ausgelöst wurden, waren erheblich stärker als die für p2Ca (es wird auf die große Differenz zwischen den Skalen der x-Achsen des oberen und des unteren Abschnitts hingewiesen).
Dosis-Reaktionsverhältnisse für die Proliferation an Tag 3, die durch Drosophila-Zellen ausgeübt werden, die mit L^d.B7.ICAM und präsentiertem p2Ca-Peptid transfiziert worden waren, wurden mit denen verglichen, die durch Drosophila-Zellen ausgeübt wurden, die mit L^d.B7, L^d.ICAM oder L^d.B7.ICAM, die QL9-Peptid präsentieren, transfiziert worden waren. Die Ergebnisse werden (Mittelwerte von Dreifachkulturen) in 13 gezeigt. Drosophila-APC (2 × 10⁵-Zellen) wurden mit 5 × 10⁴ CD8⁺ 2C-Zellen für 3 Tage in der Gegenwart oder Abwesenheit von Peptiden kultiviert. [³H] TdR wurde während der letzten 8 Stunden der Kultur hinzugefügt; es wurde kein IL-2 zu den Kulturen hinzugefügt.
Optimale proliferative Reaktionen, die durch L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierende Zellen an Tag 3 ausgeübt wurden, benötigten hohe Konzentrationen an p2Ca-Peptid, z. B. 10 μM (10^–5 M), (13). Die Ergebnisse für QL9-Peptid waren unterschiedlich. Die Dosis-Reaktionskurven für L^d.B7 Antigen-präsentierende Zellen plus QL9 und L^d.ICAM Antigen-präsentierende Zellen plus QL9 entsprachen ungefähr den Ergebnissen von L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierende Zellen plus p2Ca (13) ab. Jedoch waren mit L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen die proliferativen Reaktionen auf QL9 an Tag 3 mit 100 nM (10^–7 M) maximal und waren mit Dosen, die so gering waren wie 10 pM (10^–11 M) (13) eindeutig nachweisbar. Bei hohen Dosierungen, z. B. 10 μM (10^–5 M) inhibierte QL9 die proliferative Reaktion an Tag 3 (13, siehe die logarithmische Skala).
Die Inhibierung der Proliferation durch L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierende Zellen und QL9-Peptid ließ sich nicht auf die IL-2-Herstellung anwenden (14, rechts) und wurde nur mit hohen Dosen von Antigen-präsentierenden Zellen (14, links) beobachtet. Es wurde wiederum herausgefunden, dass L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierende Zellen plus QL9-Peptid in dem Auslösen der IL-2-Herstellung wirksamer sind als L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierende Zellen plus p2Ca-Peptid (14, rechts). Die Daten zeigen an, dass Antigen-präsentierende Zellen ohne Peptide in der Ausübung einer Reaktion über den 100-fachen Bereich von Antigen-präsentierenden Zellen unwirksam ist, die Dichte getestet wurden, sind (14, „pep", offene Quadrate).
Änderungen in den Dosis-Reaktionsverhältnissen der Reaktionen von CD8⁺ 2C-Zellen an Tag 3, Tag 4 und Tag 5 wurden unter Verwendung des QL9-Peptids mit L^d.B7, L^d.ICAM oder L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen untersucht. Die Ergebnisse werden in 15 gezeigt. Die Reaktionen wurden mit 5 × 10⁴ CD8⁺2C-Zellen und 3 × 10⁵ Antigen-präsentierenden Zellen bei den angezeigten Peptidkonzentrationen gemessen. Die Daten sind die durchschnittlichen Ergebnisse von Dreifachkulturen.
Mit einer mittleren Dosis von 100 nM (10^–7 M) QL9-Peptid waren die proliferativen Reaktionen auf L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierende Zellen an Tag 3 hoch (15, links), erreichten an Tag 4 ein Maximum (15, Mitte) und fielen auf niedrigere Level an Tag 5 (15, rechts). Mit einer hohen Dosis von 10 μM (10^–5 M) QL9-Peptid war jedoch die Reaktion an Tag 3 gering (15, links), aber erhöhte sich dann deutlich, um ein hohes Maximum an Tag 5 zu erreichen (15, rechts).
Die durch QL9 an Tag 3 induzierte transiente Inhibierung der Proliferation wurde nur gesehen, wenn die Stärke der T-Zell/APC-Wechselwirkung sehr hoch war. Die Verringerung der Stärke der T-Zell/APC-Wechselwirkung durch Verwendung geringerer Dosen an APC (14, links) oder geringerer Dosen an QL9-Peptid (15, links) erhöhte die proliferative Reaktion an Tag 3. Die Reduzierung der Stärke der T-Zell/APC-Wechselwirkung verstärkte die frühe (Tag 3) proliferative Reaktion, verringerte jedoch die späte (Tag 5) Reaktion und reduzierte auch die IL-2-Produktion (16, rechts). In 16 werden die unter Verwendung von CD8⁺2C- und CD8^– 2C-Zellen an den Tagen 2, 3, 4 und 5 erhaltenen Ergebnisse verglichen.
Die Beobachtungen lassen sich auf die hochimmunogenen L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen anwenden. Jedoch benötigten proliferative Reaktionen auf QL9-Peptid mit den weniger immunogenen L^d.B7 oder L^d.ICAM Antigen-präsentierende Zellen höhere Dosen des Peptids (13, 15) und waren kritisch abhängig von der CD8-Expression durch die Responderzellen (16). Diese Reaktionen mit L^d.B7 und L^d.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen erreichten einen Maximum an Tag 3 oder 4 (anstatt an Tag 5) und waren deutlich geringer als mit L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen. Mit geringen Dosen von QL9, z. B. 1 nM (10^–9 M) waren proliferative Reaktionen mit L^d.B7 und L^d.ICAM Antigen-präsentierende Zellen vollkommen unnachweisbar (<100 cpm) (13). Dieses stand in krassem Gegensatz zu den Ergebnissen, die unter Verwendung von L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen zu sehen waren, bei denen 1 nM QL9 zu starken Reaktionen (>10.000 cpm) (13) führten. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit hohen Dosen an QL9-Peptid (10 μM, Tabelle 2) wurde die synergistische Wechselwirkung zwischen B7 und ICAM für proliferative Reaktionen bei geringen Peptiddosen deutlich.
Wie zu sehen ist, wirken L^d.B7.ICAM-Zellen als extrem potente Antigen-präsentierende Zellen für native 2C-Zellen. Die Erhöhung der Stärke der T-Zell/APC-Wechselwirkung auf einen hohen Level inhibiert die frühe proliferative Reaktion, potenziert aber die späte Reaktion und die IL-2-Produktion wird erhöht. Für die hochaffinen Peptide wie QL9 ist der Synergismus zwischen B7 und ICAM bei geringen Dosen des Antigens deutlich.
Beispiel 10
Herstellung von zytotoxischen T-Zellen unter Verwendung des Antigen-präsentierenden Systems
Antigen-präsentierende Zellen (APC) wurden durch Transfizieren von Drosophila-Zellen wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und dann auf deren Fähigkeit getestet, CTL-Aktivität zu induzieren. Die CTL-Aktivität wurde auf ⁵¹Cr-markierten RMA.S-L^d-Zielen getestet, die mit QL9-Peptid, keinem Peptid oder einem irrelevanten Peptid (MCMV) sensibilisiert worden waren. CD8⁺ 2C-Zellen (5 × 10⁵) wurden mit 2 × 10⁶ transfizierten Drosophila-Zellen in einem Volumen von 2 ml in einer Kulturplatte mit 24 Wells kultiviert. Cai, Z. und J. Sprent (1994). Die Peptide waren während der Kultur bei einer Konzentration von 10 mM vorhanden. Nach 4 Tagen wurden die Zellen zusammengeführt und auf die benötigte Anzahl angepasst. Um Ziele herzustellen, wurden RMA-S.-L^d-Zellen mit ⁵¹Cr (100 mCi/1–2 × 10⁶ Zellen) bei 37°C für 90 Minuten in der Gegenwart oder Abwesenheit von Peptiden markiert. Nach der Markierung wurden die Zellen ausgiebig gewaschen und in Medium mit und ohne Peptide resuspendiert. Die spezifische ⁵¹Cr-Freisetzung wurde gemäß einem etablierten Verfahren berechnet. Id.
Die Kapazität von L^d.B7, L^d.B7.ICAM und L^d.ICAM Antigen-präsentierenden Zellen zur Induktion einer CTL-Aktivität auf 10 μM QL9-Peptid in Massenkulturen wird in 17 gezeigt. Stark immunogene L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierende Zellen waren effizient in der Generierung von QL9-spezifischer CTL (17, Mitte). Bedeutenderweise waren L^d.B7 Antigen-präsentierende Zellen auch wirksam in der Generierung von CTL gegen QL9 (17, links). Der Überraschungsfund war jedoch, dass L^d.ICAM Antigen-präsentierende Zellen vollständig unfähig waren, eine CTL-Generierung zu stimulieren (17, rechts). Dieses Ergebnis war (repräsentativ für 3 verschiedene Experimente) unerwartet, da L^d.ICAM Antigen-präsentierende Zellen nicht weniger effizient als L^d.B7 Antigen-präsentierende Zellen bei der Induktion proliferativer Reaktionen auf QL9 waren (13 und 15). Die L^d.ICAM-stimulierten Kulturen in 17 enthielten große Anzahlen an Blast-Zellen, und die Gesamtzellausbeute war ungefähr dreifach höher als die Ausgangszahl.
Der Überraschungsfund, dass L^d.ICAM Antigen-präsentierende Zellen vollständig unfähig waren, eine CTL-Generierung zu stimulieren, ließ sich auf Kulturen anwenden, die nicht mit exogenen Lymphokinen supplementiert worden waren. Wenn jedoch exogenes IL-2 zu den Kulturen hinzugefügt wurde, induzierten L^d.ICAM Antigen-präsentierende Zellen eine starke CTL-Aktivität auf QL9 (18, rechts; 10 u/ml exogenes IL-2).
Beispiel 11
Proliferation normaler T-Zellen, die durch das Antigen-präsentierende System induziert ist.
Antigen-präsentierende Zellen (APC) wurden durch Transfizieren von Drosophila-Zellen wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt und dann auf deren Fähigkeit untersucht, eine Proliferation in normalen (nicht transgenen) murinen T-Zellen zu induzieren.
Die Fähigkeit von L^d.B7.ICAM, Drosophila-Zellen zur Induktion einer starken primären Reaktion auf 2C TCR-transgene CD8⁺-Zellen ergab die Frage, ob Drosophila-Zellen als Antigen-präsentierende Zellen für normale (nicht transgene) CD8^–-Zellen wirken könnten. Da die 2C-Mäuse von einem B6 (H-2^b)-Hintergrund waren, wurde die Reaktion von normalen B6 CD8⁺-Zellen getestet. Abgestufte Dosen von CD8^–-Zellen von normalen B6-Mäusen wurden mit 10 μM QL9-Peptid, das durch L^d.B7.ICAM Drosophila-Antigen-präsentierende Zellen präsentiert wurde, kultiviert, d. h. eine Situation, in der ein diverses Repertoire von T-Zellen nur einem einzigen Alloantigen (L^d + QL9) ausgesetzt war, aber bei einer hohen Konzentration. Wie in 19 (links) gezeigt, war die Präsentation von QL9 durch L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierender Zellen tatsächlich immunogen für normale B6 CD8⁺-Zellen und führte zu anerkennenswerten proliferativen Reaktionen an Tag 3 (80.000 cpm) mit großen Dosen an Responderzellen (1 × 10⁶) in der Abwesenheit zugeführter Zytokine; Reaktionen auf ein nicht verwandtes Peptid, MCMV, waren deutlich geringer, aber dennoch signifikant) und es kam zu keiner Reaktion in der Abwesenheit des Peptids. Wie erwartet war die Reaktion von normalen B6 CD8⁺-Zellen auf QL9 plus L^d.B7.ICAM Antigen-präsentierender Zellen wesentlich geringer als mit normalen B10.D2-Milzzellen als Antigen-präsentierende Zellen (bei denen der Allostimulus durch eine Vielzahl von eigenen Peptiden, die an L^d, K^d und D^d gebunden waren, zur Verfü gung gestellt wurde, aber bei einer geringeren Konzentration) (19, rechts). Es wird auf die Differenz in den Y-Achsenskalen hingewiesen).
Beispiel 12
Aktivierung von zytotoxischen T-Zellen unter Verwendung von immobilisierten aufgereinigten rekombinanten MHC-Klasse I-Molekülen und unterstützenden Molekülen.
Außer wenn darauf hingewiesen, wurden Zellen, Materialien und Reagenzien wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Biotinylierter Anti-Maus CD28 monoklonaler Antikörper (Klon37.51) wurde von Pharmingen (San Diego, CA) käuflich erworben. Dieser Antikörper ist auch von Caltag (South San Francisco, CA) verfügbar. Dieser Antikörper, welcher an den CD28 kostimulatorischen Rezeptor auf der Oberfläche von T-Zellen bindet, einen Liganden von B7.1 und B7.2, verstärkt die Proliferation von T-Zellen (Gross et al. J. Immunol. 149, 380–388, 1992). IL-2 wurde als ein Concanavalin A-Überstand (10% Endkonzentration) verwendet.
Substrate wurden wie folgt hergestellt: 50 μl von PBS, enthaltend 1 μg/ml Neutravidin, wurden zu jedem Well einer Zellkulturplatte mit 96 Wells (Coming Kat. #25860) hinzugefügt. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Wells dreimal mit PBS vor der Inkubation mit den biotinylierten Molekülen gewaschen. Avidin-beschichtete Maus-rote Blutzellen wurden wie für Avidin-beschichtete Schafs-rote Blutzellen in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Avidin-beschichtete Latexkügelchen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt.
Die Biotinylierung von rekombinantem L^d wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Biotinyliertes rekombinantes L^d wurde auf dem Substrat zusammen mit dem biotinylierten Anti-CD28-Antikörper immobilisiert. Avidin-beschichtete rote Blutzellen oder Latexkügelchen wurden mit 0,2 mg/ml biotinyliertem L^d, 0,025 mg/ml biotinyliertem Anti-CD28 oder einer Mischung davon für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann dreimal in DMEM gewaschen, das 10% FCS enthält, und direkt verwendet. Avidin-beschichtete Platten mit 96 Wells wurden mit 50 Mikroliter pro Well 2 μg/ml biotinyliertem L^d, 0,25 μg/ml Anti-CD28 oder Mischungen davon für 30 Minuten bei Raumtempe ratur inkubiert, dann drei Mal unter Verwendung von DMEM gewaschen, das 10% FCS enthält, und direkt verwendet.
2C+ T-Zellen wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. CD8⁺-Zellen aus C57/BU6-Mäusen wurden aus den Lymphknoten dieser Mäuse durch magnetische Verarmung hergestellt. Aufgereinigte Zellen waren, wie durch Flusszytofluorometrie bestimmt, konsistent 90–92% positiv auf CD8-Expression.
Eine T-Zellaktivierung wurde in Kulturplatten durchgeführt, die mit aufgereinigten L^d-Molekülen und Anti-CD28-Antikörper beschichtet worden waren. Die T-Zellen und Peptid (0,02 mM Konzentration) wurden zu Platten mit 96 Wells hinzugefügt, die mit L^d und/oder Anti-CD28 in einem Endvolumen von 0,2 ml/pro Well beschichtet worden waren und für eine geeignete Zeit bei 37°C in feuchter Atmosphäre, die 5% CO₂ enthält, kultiviert.
Die T-Zellaktivierung unter Verwendung roter Blutzellen oder Latexkügelchen, die mit aufgereinigten L^d-Molekülen und Anti-CD28-Antikörper beschichtet waren, wurde in nicht beschichteten Kulturplatten durchgeführt. Die T-Zellen und Peptid (0,02 mM) wurden zu jedem Well zusammen mit 100.000 roten Blutzellen oder Latexkügelchen hinzugefügt. Endvolumen war 0,2 ml. Die Kulturbedingungen waren wie oben beschrieben.
Die T-Zell-Mitogenese wurde durch Aufnahme eines Pulses von 1 μCi tritiertem Thymidin pro Well durch Dreifachzellkulturen untersucht. Die Zellen wurden 8 Stunden später geerntet, und die Thymidinaufnahme wurde durch Zählen der Filter in einem Scintillationszähler bestimmt.
RMA.S-Zellen (Zielzellen), die L^d exprimieren, wurden mit radiomarkiertem Chrom für 90 Minuten bei 37°C inkubiert, drei Mal gewaschen und in Platten mit U-Boden und 96 Wells (Costar Kat #3799) (5000–10.000 Zellen pro Well) in der Gegenwart des geeigneten Peptids bei 0,01 mM verteilt. Verschiedene Mengen an aktivierten T-Zellen (Effektorzellen) wurden hinzugefügt, um Effektor/Ziel-Verhältnisse (E/T-Verhältnisse) im Bereich zwischen 150 und 1 zu erzielen. Nach 5 Stunden Inkubation bei 37°C wurde 0,1 ml Überstand aus jeder Vertiefung gesammelt und in einem Gammazähler gezählt. Die Prozentlyse wurde durch ein Standardverfahren (Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Abschnitt 3.11, Wiley, New York (1991)) bestimmt.
Immobilisierte aufgereinigte L^d und Anti-CD28-Antikörper waren für 2C+ T-Zellen mitogen. Wenn QL9-Peptid verwendet wurde, wurde eine Thymidinaufnahme von über 100.000 cpm pro Well konsistent an Tag 3 bis 5 der Kultur gemessen (20). Die maximale Thymidinaufnahme in dem gleichen Bereich wurde unter Verwendung einer der drei Aktivierungsverfahren erhalten (auf Plastik, auf roten Blutzellen oder auf Latexkügelchen immobilisierte Moleküle). Wenn Aktivierungsmoleküle auf Plastik immobilisiert worden waren, induzierte allein auf Plastik immobilisiertes L^d eine transiente Mitogenese (20, gestrichelte Linie), wohingegen L^d plus Anti-CD28-Antikörper eine höhere und dauerhaftere Mitogenese induzierte (20, durchgezogene Linie). Anti-CD28-Antikörper zusätzlich zu L^d war für die Induktion jeglicher Mitogenese in dem Modell unter Verwendung roter Blutzellen notwendig. Allerdings induzierte Anti-CD28-Antikörper allein keinerlei Mitogenese.
QL9-L^d-Komplexe werden durch den C2 T-Zellrezeptor mit einer hohen Affinität erkannt. Komplexe von anderen Peptiden und L^d, die durch diesen Rezeptor mit einer geringeren Affinität erkannt werden, waren in der Lage, 2C+ T-Zellen zu aktivieren; diese umfassen die Peptide p2Ca und SL9 (21 ). Jedoch war IL-2, das an Tag 2 zur Kultur hinzugefügt worden war, notwendig, um eine Mitogenese unter Verwendung dieser Peptide zu beobachten. Die Aktivierung war Peptid-spezifisch, da das LCMV-Peptid, ein Kontrollpeptid, das nicht durch den 2C T-Zellrezeptor erkannt wird, eine Aktivierung nicht induzierte. Die Mitogenese war mit so wenig wie anfänglich 700 T-Zellen pro Well (Platte mit 96 Wells) messbar, was zeigt, dass das Verfahren eine sehr kleine Anzahl an T-Zellen in einer Peptid-spezifischen Weise aktiviert.
2C+ T-Zellen wurden mit Gesamt CD8^–-Zellen aus C57BL/6-Mäusen in einem 1/99-Verhältnis vermischt und die Zellen wurden mit immobilisiertem L^d und Anti-CD28-Antikörper in der Gegenwart des Peptids QL9 kultiviert. IL-2 wurde an Tag 2 der Kultur hinzugefügt und anschließend jeden anderen Tag. Eine Zellaktivierung und Proliferation wurde, wie durch die Ausbildung von Klumpen nachgewiesen festgestellt, der Gegenwart vergrößerter Zellen, die sich progressiv in dem Well verbreiten. An Tag 12 der Kultur wurden die Zellen geerntet und die Prozentzahl der Zellen, die den 2C T-Zellrezeptor exprimieren durch Färben mit dem antiklon-typischen Antikörper 1B2 und Analyse durch Flusszytofluorometrie untersucht: 43% der in der Gegenwart von Peptid QL9 kultivierten Zellen waren 2C+, (22), wohingegen 49% der Zellen 2C nach Stimulation mit Peptid p2Ca (23) exprimierten und 22% mit Peptid SL9 (24). Dieses zeigt eine bemerkenswerte Anreichung (43-, 49- und 22-fach) in spezifischen T-Zellen nach 12 Tagen Kultur. Die Anreicherung wurde sogar mit SL9 beobachtet, einem Peptid, das einen Komplex geringer Affinität mit dem 2C T-Zellrezeptor ausbildet. Dieses Verfahren kann somit eine kleine Subpopulation von Antigen-spezifischen T-Zellen aus einer heterogenen Mischung von T-Zellen aktivieren und anreichern.
2C+ T-Zellen, die unter Verwendung von L^d und Anti-CD28-Antikörper in der Gegenwart von QL9-Peptid aktiviert worden waren, wurden für 5 Tage kultiviert, dann deren zytotoxische Kapazität untersucht. Die in 25 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass immobilisierte Aktivierungsmoleküle die Zellen dahingehend induzierten, in Effektor-zytotoxische T-Zellen zu differenzieren. Die Lyse war spezifisch, da sie in der Gegenwart des QL9-Peptids beobachtet wurde, aber nicht in der Gegenwart eines Kontrollpeptids (LCMV). Ruhende T-Zellen wurden somit unter Verwendung immobilisierter Moleküle aktiviert, um in zytotoxische T-Zellen zu differenzieren, die spezifisch Ziele töten.
Wie zu sehen ist, können immobilisierte aufgereinigte MHC-Klasse I- und unterstützende Moleküle verwendet werden, um spezifisch naive ruhende T-Zellen in zytotoxische T-Zellen zu aktivieren. MHC-Klasse I- und unterstützende Moleküle sind zur Aktivierung ausreichend; kein weiteres Signal, das aus Antigen-präsentierenden Zellen entspringt, ist notwendig. MHC-Klasse I- und unterstützende Moleküle, die auf Substraten, wie Zellkulturplatten, immobilisiert sind, stellen ein geeignetes Mittel zur T-Zellaktivierung dar. Verschiedene Vorteile werden durch solche beschichteten Substrate angeboten. Sie sind leicht herzustellen und zu manipulieren, sie können mit gut kontrollierten Mengen an Molekülen beschichtet werden, was reproduzierbare Aktivierungsbedingungen sicher stellt.
Beispiel 13
Aktivierung von menschlichen zytotoxischen T-Zellen
Eine Einheit menschlichen Blutes (450 ml), die in Heparin (10 μ/ml) gesammelt wurde, wurde durch das General Clinical Research Center (GCRC) an der Scripps Clinic, La Jolla, CA gewonnen. Das Blut wurde zuerst in einem Ficoll-Hypaque^TM-Dichtegradienten in einer 50 cc konischen Zentrifuge (Histopaque^TM 1077, Sigma) gemäß den Spezifikationen des Herstellers prozessiert. Sobald ein Leukozytenfilm erhalten wurde, wurde die Probe in Puffer 1 (D-PBS ohne Ca⁺⁺ oder Mg⁺⁺), dann in Puffer 2 (RPMI mit 4% fetalem Kälberserum (FCS)) gewaschen und in einem letzten Waschschritt in Puffer 3 (D-PBS + 1% menschliches Serumalbumin (HSA, 25% Buminat/Baxter-Hyland) und 0,2% Natriumcitrat (Gew.-/Vol.-%) gewaschen.
Die gesamte periphere Blut-mononukleare Zell (PBMCs)-Präparation wurde aus den gewaschenen Zellen gezählt. Diese Präparation wurde einem MaxSep^TM-Isolierungsverfahren (Baxter) unterzogen, bei dem CD8⁺-Zellen durch negative Selektion selektiert wurden. Ein Cocktail aus mAbs, der auf die Entfernung von Zellen gerichtet ist (CD19-PharMingen, CD4-Ortho-mune, CD15-PharMingen, CD56-PharMingen CD14-PRI), wurde bei 2 μg/ml-Zellen hergestellt. Die Gesamt-PBMC-Zellzahl wurde auf 20 × 10⁸/ml in Puffer 3 verdünnt und die Antikörper wurden hinzugefügt.
Die Mischung (ungefähr 40 ml) wurde auf einem Rotationsschüttler bei 4°C (4 Upm) so rotiert, dass das Röhrchen die Probe über Kopf für eine Gesamtzeit von 30 Minuten vermischte. Nach der Sensibilisierungsphase wurden die Zellen mit Puffer 3 gewaschen und in dem gleichen Puffer mit magnetischen Dynal^TM-Kügelchen resuspendiert, die mit Schaf-Anti-Maus IgG (SAM) (Dynabeads^TM M450 #110.02) beschichtet waren. Der Stamm an Kügelchen beträgt normalerweise × 10⁸ Kügelchen/ml. Das endgültige Kügelchen : Zielzellverhältnis beträgt 10 : 1.
Zur Bestimmung des Endvolumens der zu verwendenden Kügelchen wurden die unten genannten Formeln eingesetzt:
(Gesamtzahl sensibilisierter Zellen) × (% der Population von Zielzellen) = gesamte theoretische Zielzellenzahl.
Gesamte theoretische Zielzellenzahl × 10 = benötigte Gesamtzahl an Kügelchen.
Gesamtzahl an benötigten Kügelchen/Kügelchenkonzentration der Stammlösung = Volumen der benötigten Kügelchen.
Das Volumen der endgültigen sensibilisierten Zellen: die Kügelchen-Mischung betrug ungefähr 50 ml. Die Mischung wurde in ein 150 ml Fenwal^TM Transfer Pack (#4R2001) gestellt, Luft mit einer Nadel hinzugefügt und die Mischung unter ähnlichen Bedingungen wie oben rotiert (30 Minuten, 4°C, 4 Upm, über Kopf bewegt. An dem Ende des Inkubationszeitraumes wurden die Zielzellen mit einer MaxSep^TM-Trennvorrichtung gemäß den Spezifikationen des Herstellers entfernt.
Die abgetrennten Zellen wurden dann aus der Tüte transferiert und gezählt, um die Ausbeute zu bestimmen. Eine FACS-Analyse wurde durchgeführt, um die Reinheit der Probe zu bestimmen.
Die resultierenden abgetrennten menschlichen CD8⁺-Zellen wurden mit Drosophila (Fliege) Antigen-präsentierenden Zellen stimuliert, welche transfiziert worden waren und von denen gezeigt wurde, dass sie menschliches HLA A2.1, B7.1 und/oder LFA-3 exprimieren. Die Fliegenzellen wurden auf 10⁶/ml in Schneider's Medium mit 10% FCS-Serum verdünnt. Am folgenden Tag wurde CuSO₄ zu den kultivierten Zellen hinzugefügt, welche für 24 Stunden bei 27°C inkubiert und geerntet wurden. Die geernteten Zellen wurden gewaschen und in Insekten X-Press-Medium mit einer Peptidendkonzentration von 100 μg/ml suspendiert und 3 Stunden bei 27°C inkubiert.
Die verwendeten Peptide waren HIV-RT (ILKEPHG) (SEQ ID NR 48), Tyrosinase (YMNGTMSQV) (SEQ ID NR 49) und Influenza Matrix (GILGFVFTL (SEQ ID NR 50).
Das Kontrollpeptid wurde aus dem Kern des Hepatitisvirus abgeleitet und hatte die Sequenz FLPSDFFPSV (SEQ ID NR 51).
Die Fliegen-Antigen-präsentierenden Zellen wurden zu den CD8⁺-Zellen in einem Verhältnis von 1 : 10 (APC : CD8⁺-T-Zelle) hinzugefügt. Die Zellen wurden in Wells mit flachem Boden (48 Wells) für vier Tage bei 37°C inkubiert. An Tag 5 wurden IL-2 (10 μ/ml) und IL-7 (10 μ/ml) (Genzyme) mit einem Mediumwechsel hinzugefügt. An Tag 11 wurde ein CTL-Assay durchgeführt.
JY eine EBV-transformierte menschliche B-Zelllinie, die HLA 2.1, B7 exprimiert, wurde als Zielzelle im Chrom-Freisetzungs-Assay verwendet. Vissereu, M. J. W. et al., J. Immunol., 154:3991–3998 (1995). Die JY-Zellen wurden bei 3 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI mit 10 FCS 24 Stunden vor dem Assay ausgesät. Die JY-Zellen wurden gezählt und einmal in RPMI-Waschlösung (4% Rehautin FCS, 1% HEPES, 0,025% Gentamycin in RPMI) gewaschen, um 5 × 10⁶ Zellen pro Probe zur Verfügung zu stellen. Das Zellpellet wurde vorsichtig in 100 μl ⁵¹-Chrom-Stammlösung (0,1 mCi, NEN) resuspendiert und in ein 37 °C Wasserbad für 1 Stunde unter Bewegung alle fünfzehn Minuten gestellt. Markierte JY-Zellen wurden viermal für 6 Minuten jeweils bei 1400 Upm in 10 ml RPMI-Waschlösung gewaschen. Die Zellen wurden auf 1 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI/10% Hyclone angepasst. Die Effizienz der Zielzellmarkierung wird durch Standard-Gammazähltechniken bestätigt.
Zur Peptidbeladung von Zielzellen wurden zwei ml markierte JY-Zellen (2 × 10⁵-Zellen) mit 10 μg/ml Peptid für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Peptidstammlösungen (1 mg/ml) wurden bei –70°C aufbewahrt. In einer Platte mit Rundboden und 96 Wells wurden 100 μl Effektorzellen und 100 μl Peptid-beladene Zielzellen in Verhältnissen von 84 : 1, 17 : 1 und 3,4 : 1 (Effektor: Ziel) kombiniert. Kontrollen zur Messung spontaner Freisetzung und maximaler Freisetzung von ⁵¹Cr wurden in Duplikaten mitumfasst. Die Proben wurden bei 37°C für 6 Stunden inkubiert.
K562-Zellen bei einer Konzentration von 10⁷/ml in RPMI mit 10% FCS wurden in einem Verhältnis von 20 : 1 (nicht markiertes K562: markierte JY) hinzugefügt. Diese erythroleukämische Zelllinie wurde verwendet, um die NK-Hintergrundzelllyse in dem Chrom-Freisetzungs-Assay zu verringern. Die Platten wurden bei 1000 Upm für 5 Minuten zentrifugiert und 100 μl Überstand aus jeder Probe wurde auf Sammelröhrchen von 96 Röhrchen transferiert. Die Analyse der Zelllyse wird durch Standard-Gammazähltechniken bestimmt (Gammacell^TM 1000, Nordion).
Die CTL-Aktivität, die durch die Aktivierung menschlicher CD8^– T-Zellen, die mit Antigen-präsentierenden Zellen, die mit Influenza Matrixpeptid (SEQ ID NO: 50) beladen sind, produziert wird, wird in 26 gezeigt. Das vorherige Aussetzen gegenüber dem Influenzavirus zeigt, dass diese CTL-Aktivität eine sekundäre Reaktion war. Datenpunkte sind die Mittelwerte aus Dreifachkulturen. Antigen-präsentierende Zellen, die A2.1, B7.1 und ICAM-1 exprimieren, waren wirksamer als Antigen-präsentierende Zellen, die A2.1 und B7.1 exprimieren oder Antigen-präsentierende Zellen, die A.2.1., B7.1 und LFA-3 exprimieren.
Die Ergebnisse der Aktivierung menschlicher CD8- T-Zellen mit Antigen-präsentierenden Zellen, die mit dem HIV-RT-Peptid ((SEQ ID NO: 48) beladen sind, werden in 27 dargestellt. Da eine Untersuchung des Bluts dieses Patienten zeigte, dass kein vorheriges Aussetzen gegenüber HIV vorhanden war, zeigen diese Ergebnisse an, dass die CTL-Aktivität auf einer primären Reaktion basiert. In diesem Fall produzierten nur Antigen-präsentierende Zellen, die A2.1, B7.1 und ICAM-1 exprimieren, eine CTL-Aktivität, die signifikant größer als die Kontrollmengen war.
28 zeigt die CTL-Aktivität von menschlichen CD8⁺ T-Zellen, die durch Antigen-präsentierenden Zellen aktiviert sind, die mit Tyrosinasepeptid (SEQ ID NO: 49) beladen sind. Typrosinase ist ein normal vorkommendes Enzym, das in Melanomtumorzellen exprimiert wird. Wiederum waren die Antigen-präsentierenden Zellen, die alle drei Moleküle, ICAM-1 sowie A2.1 und B7.1 exprimieren, die wirksamsten, insbesondere bei dem geringsten untersuchten Effektor : Ziel-Verhältnis.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Antigen-präsentierende System in der Lage ist, eine wirksame CLT-Aktivität in menschlichen CD8⁺ T-Zellen zu produzieren, die gegen ein Peptid gerichtet ist, das aus einem endogenen Protein abgeleitet wird, das in Tumorzellen überexprimiert wird. Dieses zeigt auch, dass diese in vitro-Stimulation von CD8^– T-Zellen unter Verwendung von sowohl B7 wie auch ICAM zytotoxische CD8⁺ T-Zellen sogar gegen Peptide generiert, die ansonsten als eigen erkannt werden würden. Dieses steht im Gegensatz zu dem derzeitigen Wissen, das solche "Eigen"-Peptide" nicht verwendet werden könnten, um zytotoxische T-Zellen herzustellen. Dieses Verfahren expandiert deutlich die Menge an möglichen tumorspezifischen Antigenen, die verwendet werden können, um CD8⁺ T-Zellen gegen den Tumor zu aktivieren.
Das Vorhergehende ist lediglich zur Illustration und nicht zur Einschränkung der vorliegenden Erfindung gedacht.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Fragmente von Zellen aus einer synthetischen Antigen-präsentierenden Zelllinie zur Verwendung mit T-Zell-Lymphozyten, umfassend: a) ein Gen der Klasse I-MHC-schweren Kette, das operativ mit einem ersten Promotor verbunden ist und in der Lage ist, eine Klasse I-MHC-schwere Kette zu exprimieren; b) ein β-2-Mikroglobulin-Gen, das operativ mit einem zweiten Promotor verbunden ist und in der Lage ist, ein β-2-Mikroglobulin zu exprimieren, das mit der MHC-schweren Kette MHC-Moleküle ausbildet; und c) ein Gen für ein unterstützendes Molekül, das operativ mit einem dritten Promotor verbunden ist und in der Lage ist, ein unterstützendes Molekül zu exprimieren, das mit einem Molekül auf den T-Zell-Lymphozyten wechselwirkt, wobei das unterstützende Molekül B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 oder LFA-3 ist; wobei mindestens eines der folgenden Gene, das MHC-Gen, das β-2-Mikroglobulin-Gen oder Gene von unterstützenden Molekülen nicht in den Zellen vorhanden ist, von welchen die Zelllinie abgeleitet ist, so dass die MHC-Moleküle an ein Peptid binden und die MHC-Moleküle und unterstützenden Moleküle auf der Oberfläche der Zelle präsentiert werden und besagte Fragmente mit MHC-Molekülen und unterstützenden Molekülen derart operativ assoziiert sind, dass sie die Population von T-Zellymphozyten aktivieren.
Fragmente von Zellen aus einer stabilen poikilothermen Zelllinie, die zur Stimulation menschlicher T-Zelllymphozyten verwendet wird, umfassend: a) ein Klasse I-MHC-Gen, das operativ mit einem ersten Promotor verbunden ist und in der Lage ist, eine Klasse I-MHC-schwere Kette zu exprimieren; b) ein β-2-Mikroglobulin-Gen, das operativ mit einem zweiten Promotor verbunden ist und in der Lage ist, ein β-2-Mikroglobulin zu exprimieren, das MHC-Moleküle mit der MHC-schweren Kette ausbildet; c) ein Gen für ein co-stimulatorisches Molekül, das operativ mit einem dritten Promotor verbunden ist und in der Lage ist, ein co-stimulatorisches Molekül zu exprimieren, das mit einem Molekül auf den T-Zell-Lymphozyten wechselwirkt, wobei das co-stimulatorische Molekül B7.1 oder B7.2 ist; und d) ein Gen für ein Adhäsionsmolekül, das operativ mit einem vierten Promotor verbunden ist und in der Lage ist, ein Adhäsionsmolekül zu exprimieren, das mit einem kooperativen Adhäsionsmolekül auf den T-Zell-Lymphozyten wechselwirkt, wobei das Adhäsionsmolekül ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 oder LFA-3 ist; wodurch die Zelle in der Lage ist, die MHC-schwere Kette und das β-2-Mikroglobulin in MHC-Moleküle zusammen zu fügen, die an ein Peptid binden und MHC-Moleküle, co-stimulatorische Moleküle und Adhäsionsmoleküle auf die Oberfläche der Zelle zu transportieren und die besagten Fragmente mit MHC-Molekülen, co-stimulatorischen Molekülen und Adhäsionsmolekülen so operativ assoziieren, dass diese die Population von T-Zelllymphozyten aktivieren.
Fragmente der Zellen aus Anspruch 1 oder Anspruch 3, worin mindestens einer der Promotoren induzierbar ist.
Fragmente von Zellen aus Anspruch 1 oder Anspruch 3, worin das Peptid an die MHC-Moleküle innerhalb der Zelle gebunden ist.
Das Zellfragmente von Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die MHC-Moleküle leer sind.
Das Zellfragmente von Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Peptid an die MHC-Moleküle gebunden ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von Zellen aus einer synthetischen Antigen-präsentierenden Zelllinie, umfassend: a) Etablieren einer Zellkultur; b) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen der Klasse I-MHC-schweren Kette, das operativ mit einem ersten Promotor verbunden ist; c) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren β-2-Mikroglobulin-Gen, das operativ mit einen zweiten Promotor verbunden ist; d) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen eines unterstützenden Moleküls, das operativ mit einen dritten Promotor verbunden ist, wobei das unterstützende Molekül B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 oder LFA-3 ist und e) Fragmentieren der Zellen nachdem sie MHC- und unterstützende Moleküle auf der Oberfläche der Zelle präsentieren.
Das Verfahren von Anspruch 7, worin die Zelllinie aus einer ersten Spezies abgeleitet ist und das Gen der MHC-schweren Kette von einer zweiten Spezies ist.
Das Verfahren von Anspruch 8, worin die erste Spezies poikilotherm ist und die zweite Spezies homeotherm ist.
Das Verfahren von Anspruch 7, einschließlich des Schrittes des Transfizierens der Kultur mit einem Gen für ein zweites unterstützendes Molekül.
Das Verfahren von Anspruch 10, worin das erste unterstützende Molekül ein co-stimulatorisches Molekül und das zweite unterstützende Molekül ein Adhäsionsmolekül ist.
Das Verfahren von Anspruch 7, worin mindestens einer der Promotoren induzierbar ist.
Ein Verfahren zur Herstellung von Fragmenten von Zellen aus einer synthetischen Antigen-präsentierenden Zelllinie, umfassend: (a) Etablieren einer Zellkultur, die mindestens eines der folgenden Gene nicht aufweist: Klasse I-MHC-schwere Kette, β-2-Mikroglobulin und unterstützendes Molekül, wobei das unterstützende Molekül B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 oder LFA-3 ist; und (b) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen für jedes der Gene aus (a), die in der Zellkultur fehlen, wobei das Gen operativ mit einem Promotor verbunden ist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer synthetischen Antigen-präsentierenden Zelllinie, die spezifisch eine T-Zelle für ein Peptid aktivieren wird, umfassend: a) Etablieren einer Zellkultur; b) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen der Klasse I-MHC-schweren Kette, das operativ mit einem Promotor verbunden ist; c) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren β-2-Mikroglobulin-Gen, das operativ mit einem zweiten Promotor verbunden ist; d) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen eines unterstützenden Moleküls, das operativ mit einem dritten Promotor verbunden ist, wobei das. unterstützende Molekül ausgewählt ist aus B7.1, ICAM-1 und einer Kombination davon; und wobei das Peptid eine Bindungsaffinität für lösliche L^d-Moleküle von mindestens 4 × 10⁹ M^–1 aufweist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer synthetischen Antigen-präsentierenden Zelllinie, das eine T-Zelle spezifisch für ein Peptid aktiviert, umfassend: a) Etablieren einer Zellkultur, der mindestens eines der Gene für: die Klasse I-MHC-schwere Kette, β-2-Mikroglobulin und ein co-stimulatorisches Molekül fehlt; b) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen für jedes der Gene von (a), die in der Zellkultur fehlen, wobei das Gen mit einem ersten operativen Promotor verbunden ist; und c) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen für ein Adhäsionsmolekül, wobei das Gen mit einem zweiten operativen Promotor verbunden ist; wobei das co-stimulatorische Molekül B7.1 ist und das Adhäsionsmolekül ICAM-1 ist, und worin das Peptid eine Bindungsaffinität für lösliche L^d-Moleküle von mindestens 4 × 10⁶ M^–1 aufweist.
Ein Verfahren zur Aktivierung von CD8 + T-Zellen gegen ein ausgewähltes Peptid in vitro, wobei das Verfahren: a) das Zurverfügungstellen einer Zelllinie von einem der Ansprüche 14 oder 15; b) das Kultivieren der Zelllinie unter Bedingungen, bei denen MHC-Moleküle auf der Oberfläche der Zelllinie hergestellt werden, die an das ausgewählte Peptid gebunden sind; und c) Inkontaktbringen der kultivierten Zellen mit den CD8 + T-Zellen gegen das ausgewählte Peptid; umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 16, wobei die Zelllinie eine poikilotherme ist.
Das Verfahren von Anspruch 16, das zusätzlich den Schritt der Abtrennung der aktivierten CD8 + T-Zellen von der Zelllinie umfasst.
Das Verfahren von Anspruch 18, das zusätzlich den Schritt des Hinzufügens der aktivierten CD8 + T-Zellen zu einem verträglichen Träger oder Hilfsstoff zur Ausbildung einer Suspension umfasst.
Eine synthetische Antigen-präsentierende Matrix, umfassend: (a) einen nicht-zellulären Träger; (b) einen extrazellulären Anteil eines MHC-Moleküls, das in der Lage ist, an ein ausgewähltes Peptid zu binden und operativ an den Träger gebunden ist; und (c) ein unterstützendes Molekül, das operativ derart an den Träger gebunden ist, dass die extrazellulären Anteile der MHC- und unterstützenden Moleküle in ausreichender Anzahl vorhanden sind, um eine T-Zell-Lymphozytenpopulation gegen das Peptid zu aktivieren, wenn das Peptid an den extrazellulären Teil der MHC-Moleküle gebunden ist, wobei das unterstützende Molekül B7.1, B7.2, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3 oder LFA-3 ist.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei der Träger ein Zellfragment ist.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei der extrazelluläre Anteil des MHC-Moleküls ein Teil eines vollständigen MHC-Moleküls ist.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei der Träger ein Liposom ist.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei der Träger eine feste Oberfläche ist.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei der extrazelluläre Anteil des MHC-Moleküls an ein Epitop gebunden ist, welches mit einem Antikörper reagiert, um den Teil mit dem Träger zu verbinden.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei der extrazelluläre Anteil des MHC-Moleküls an (His)6 gebunden ist, welches mit Nickel reagiert, um den Teil an den Träger zu binden.
Die Matrix von Anspruch 20, worin der Träger ein poröses Material ist.
Die Matrix von Anspruch 20, worin das unterstützende Molekül ein co-stimulierendes Molekül ist.
Die Matrix von Anspruch 28, wobei das co-stimulatorische Molekül mindestens ein Teil eines Anti-CD80-Antikörpers ist.
Die Matrix von Anspruch 20, die zwei unterstützende Moleküle aufweist, wobei das erste unterstützende Molekül ein co-stimulatorisches Molekül und das zweite unterstützende Molekül ein Adhäsionsmolekül ist.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei der extrazelluläre Anteil des MHC-Moleküls leer ist.
Die Matrix von Anspruch 20, wobei das Peptid an den extrazellulären Anteil des MHC-Moleküls gebunden ist.
Eine synthetische Antigen-präsentierende Matrix, umfassend: (a) einen Träger; (b) einen extrazellulären Teil von MHC-Molekülen, die in der Lage sind, an ein ausgewähltes Peptid zu binden und operativ mit dem Träger verbunden sind; (c) B-7.1- oder B-7.2-Moleküle oder eine Kombination davon, die operativ mit dem Träger verbunden ist; und (d) ICAM-1-Moleküle, die operativ mit dem Träger derart verbunden sind, so dass die Moleküle in einer ausreichenden Menge vorhanden sind, um eine Population von T-Zell-Lymphozyten gegen das Peptid zu aktivieren, wenn das Peptid an den extrazellulären Anteil des MHC-Moleküls gebunden ist.
Ein Verfahren zur Herstellung einer synthetischen T-Zell-Lymphozyten-Antigen-aktivierenden Matrix, umfassend: a) Etablieren einer ersten Zellkultur; b) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren Gen der Klasse 1-MHC-schweren Kette für zumindestens den extrazellulären Anteil der schweren Kette, das operativ mit einem Promotor verbunden ist; c) Transfizieren der Kultur mit einem exprimierbaren β-2-Mikroglobulin-Gen, das operativ mit einem zweiten Promotor verbunden ist; d) Ernten der hergestellten MHC-Molekülanteile; e) Etablieren einer zweiten Zellkultur; f) Transfizieren der zweiten Kultur mit einem exprimierbaren Gen eines unterstützenden Moleküls für mindestens den extrazellulären Anteil des unterstützenden Moleküls, das operativ mit einem dritten Promotor verbunden ist; (g) Ernten der Anteile des unterstützenden Moleküls; und (h) Binden der Anteile des MHC-Moleküls und der Anteile des unterstützenden Moleküls an einen Träger in ausreichenden Zahlen zur Aktivierung einer Population von T-Zell-Lymphozyten gegen ein Peptid, wenn das Peptid an den extrazellulären Anteil des MHC-Moleküls gebunden ist.
Ein In-vitro-Verfahren zur Aktivierung von CD8+ T-Zellen gegen ein ausgewähltes Peptid, wobei das Verfahren: (a) das Zurvertügungstellen der Matrix von Anspruch 28; (b) das Inkontaktbringen der Matrixzellen mit den CD8+ T-Zellen, umfasst.
Verwendung der Matrix von Anspruch 28 für die Herstellung eines Medikaments zur Aktivierung von CD8+ T-Zellen gegen ein ausgewähltes Peptid durch Inkontaktbringen der Matrixzellen mit den vorgenannte CD8+ T-Zellen.
Ein Verfahren zur Herstellung zytotoxischer CD8+ T-Zellen gegen ein ausgewähltes Peptid, wobei das Verfahren: (a) das Zurverfügungstellen der Matrix von Anspruch 28, worin das Peptid an den extrazellulären Anteil des MHC-Moleküls gebunden ist; (b) das Inkontaktbringen naiver CD8+ T-Zellen mit der Matrix in vitro umfasst.
Die Matrix von Anspruch 31, worin der Träger eine Zelle ist.