CN113913458A - 非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的nk细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了应用非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的自然杀伤(NK)细胞的方法及其应用，所述方法包括：(1)利用转座子***将嵌合受体的编码基因转入自然杀伤细胞，得到初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞；(2)利用人工抗原呈递细胞扩增所述初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞。本发明应用转座子***在NK细胞中引入稳定高表达的嵌合受体，与现有技术相比，本发明的方法操作简便、快速、高效、准确、重复性好、成本效益高、并有较好的安全性，由此制备的嵌合受体修饰的NK细胞具有较强的肿瘤杀伤能力，在体外展现了较好的抗肿瘤效果，在生物医学各个领域、特别是疾病的细胞治疗领域具有广阔的应用前景。

Description

非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的NK细胞
技术领域
本发明属于医学生物工程技术领域，涉及应用非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体修饰的NK细胞的 方法及其应用。
背景技术
自然杀伤(NK)细胞是先天性免疫***的重要组成部分，在外周血淋巴细胞中NK细胞的比例约10％， 是继B细胞和T细胞之后的第三大淋巴细胞群体。NK细胞具有多种生物学功能，是人体对抗感染和肿瘤 的第一道防线。NK细胞的功能通过精密且复杂的激活型和抑制型受体网络进行调节。大部分循环的NK 细胞处于静息期，可以被细胞因子活化并浸润到病原体感染或含有恶性细胞的组织中。当NK细胞的受体 与相应的配体结合后，NK细胞还可以分泌一些细胞因子，例如干扰素(IFN)-γ，发挥免疫调节作用。 NK细胞的主要功能之一是对机体进行免疫监督，研究者已发现NK细胞参与控制多种疾病的发生发展。 对哺乳动物细胞(包括人体细胞)的一些体外研究以及对小鼠和大鼠的体内研究表明，NK细胞可以将肿瘤细胞识别为靶标，并在体内控制肿瘤细胞的生长、转移和扩散。一项为期11年的随访流行病学调查显 示，外周血NK细胞活性降低会增加成人患癌症的风险。不仅如此，体外实验和动物实验还发现，NK细 胞对SARS、H5N1、埃博拉、寨卡、登革热、HIV等多种突发病毒感染疾病具有良好的抑制和消除能力。
与MHC限制的T细胞不同，NK细胞不需要进行HLA配型，因此可以作为异源性的现货细胞药品 对病人进行免疫治疗，在临床上具有重要的应用前景。基于自体或同种异体NK细胞的过继性疗法在临床 上已经应用于抗肿瘤、抗病毒感染，特别是异体NK细胞对于治疗血液***癌症显示出良好的治疗效果。
尽管NK细胞具有强大的免疫效应功能，但是许多癌细胞和病毒会通过抗原逃逸和免疫抑制等机制来 抑制NK细胞的功能。由于这些原因，在过去的十年时间中，科学家们一直在探索通过基因工程的方法来 增强NK细胞的功能活性并避免免疫抑制，例如通过表达内源性细胞因子来增强过继回输后的NK细胞的 增殖能力，抑制免疫抑制信号或增强NK细胞的杀伤功能等。后一种方法目前主要通过修饰嵌合抗原受体 (CARs)使NK细胞重新定向于肿瘤细胞。嵌合抗原受体是将抗体的ScFv与胞内信号转导结构融合在一 起，ScFv用于介导识别和结合肿瘤细胞表面抗原。
然而，原代NK细胞对于基因转染的抵抗力较强，这导致NK细胞对多种载体***的摄取率低，NK 细胞的转基因表达量低，只有病毒载体在原代NK细胞中实现了较高的基因转移效率。目前，对原代NK 细胞进行嵌合受体的修饰一般通过电转嵌合受体编码基因的mRNA或者采用慢病毒/逆转录病毒感染的方 式来实现。mRNA电转只能使嵌合受体编码基因瞬时表达，且体外合成mRNA的成本较高，临床上需要 多次注射，治疗费用较高。慢病毒/逆转录病毒转染则可以制备嵌合受体基因稳定表达的NK细胞，然而 与NK细胞株如NK92比较，原代NK细胞、尤其是外周血NK细胞感染难度极大，迄今为止，只有少数 科研团队成功应用慢病毒/逆转录病毒制备嵌合抗原受体修饰的原代NK细胞，经多次重复感染后，其转 基因在终产品中的表达比例在20％～80％之间，其中逆转录病毒的转染效率高于慢病毒。然而，由于逆转 录病毒和/或慢病毒本身是致病原，具有***突变的潜力，对人类临床试验的实施构成了重大的监管障碍。 不仅如此，在细胞系中大规模制造病毒载体存在成本高、效率低的问题，对嵌合受体修饰的NK细胞的临 床转化构成了障碍，显著提高了生产成本。
为了克服病毒载体***的上述局限性，研究者进一步探索了非病毒载体的可行性。通常，非病毒载体 ***为人工合成***，不依赖于任何病毒成分或哺乳动物细胞进行生产制造，成本低，同时有利于避免使 用病毒载体带来的免疫问题。DNA转座子是一种典型的非病毒载体***，具有基因可持续性表达、免疫 原性低、成本低、效率高等优点。
在自然界中，DNA转座子是包含转座酶基因的离散DNA片段，其两侧是包含转座子结合位点的反向 末端重复序列(ITRs)。转座的过程为转座酶结合到TIRs上，从一个位置“剪切”转座，并“粘贴”到另 一个新的位置。基于转座子的载体***，如睡美人(SB)***、piggyBac(PB)***、Tol转座子***， 是利用转座的方法，将转基因引入到宿主基因组。与逆转录病毒载体类似，稳定的基因组整合到宿主中可 以实现长期高效的转基因表达。SB和PB转座子都已成功用于修饰T细胞，使其表达CD19特异性CAR。 然而目前尚无采用转座子***制备转基因修饰的原代NK细胞的报道。
发明内容
为了克服目前的技术手段对原代NK细胞进行嵌合受体修饰效率低的问题，以及使用逆转录病毒造成 的监管障碍、生产成本高的问题，本发明提供了一种非病毒的制备嵌合受体修饰的NK细胞方法，应用转 座子***在NK细胞中引入稳定高表达的嵌合受体，实现对NK细胞的高效遗传修饰。
(1)应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞；
(2)利用人工抗原呈递细胞扩增嵌合受体修饰的NK细胞。
所述NK细胞是人原代NK细胞，可以来自人的外周血、脐带血或诱导多能干细胞(iPSC)等。
所述嵌合受体包括嵌合抗原受体、嵌合转换受体、或其他应用DNA重组技术合成的嵌合受体。
步骤(1)所述转座子***包括piggyBac转座子***、Sleeping Beauty转座子***或Tol2转座子*** 等。
优选地，步骤(1)所述转座子***包括转座子元件和转座酶元件；所述转座子元件包括转座子5’反 向末端重复序列(5’ITR)和3’反向末端重复序列(3’ITR)，在5’ITR和3’ITR之间设有两个绝缘子，在 两个绝缘子之间包括启动子和嵌合受体的编码基因，所述转座子可以是质粒或线性化的核酸片段；所述转 座酶元件可以由质粒或线性化的核酸片段编码，也可以由mRNA编码，也可以是蛋白。
优选地，所述转座酶的核酸序列和转座子的核酸序列可以在一个载体上，也可以在两个不同的载体上。
优选地，所述应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞的方法包括：电穿孔的方法、化学 试剂转染的方法、以及其他非病毒转染的方法等。
更优选地，通过电穿孔的方法将转座子***的相关载体转入原代NK细胞中。
优选地，步骤(1)所述应用转座子***将转基因转入NK细胞前，NK细胞可以预先进行活化，也 可以预先不进行活化。
优选地，若NK细胞预先进行活化，可以采用人工抗原呈递细胞、饲养细胞、细胞因子、抗体或化合 物等进行活化。
优选地，若NK细胞预先进行活化，可以在NK细胞活化后的0～14天，例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13或14天，应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞中。
更优选地，在NK细胞活化后1～7天，应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞中。
更优选地，在NK细胞活化后2天，应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞中。
优选地，若NK细胞未被活化，可以在应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞前，利用 磁分选去除CD3+细胞；也可以在应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞后0～14天，利用 磁分选去除CD3+细胞。
更优选地，可以在应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞后1～8天，例如1、2、3、4、 5、6、7或8天，利用磁分选去除CD3+细胞。
步骤(2)所述人工抗原呈递细胞包括以细胞为基础的、人工合成的或以外泌体为基础的人工抗原呈 递细胞。
所述以细胞为基础的人工抗原呈递细胞选自人髓系白血病K562细胞、人伯基特淋巴瘤Daudi细胞、 EBV转化的B淋巴母细胞样细胞(EBV-LCL)细胞或小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3细胞。
优选地，所述以细胞为基础的人工抗原呈递细胞选自K562细胞。
优选地，所述以细胞为基础的人工抗原呈递细胞为工程化的细胞，所述工程化细胞表达嵌合受体识别 的抗原。
优选地，所述工程化细胞表达NK细胞活化所需的配体分子、细胞因子等，其中，细胞因子可以是分 泌型的，也可以是膜固定的。
更优选地，NK细胞活化所需配体分子包括CD137L和/或OX40L，NK活化所需细胞因子包括人IL-12、 人IL-15、人IL-18或人IL-21中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述以细胞为基础的人工抗原呈递细胞和饲养细胞经γ射线(100Gy)或丝裂霉素C(20μg/mL) 处理。
更优选地，NK细胞活化和CAR-NK细胞扩增都可以使用人工抗原呈递细胞进行。
优选地，步骤(1)所述在应用转座子***将嵌合受体的编码基因转入NK细胞后的0～14天，刺激嵌 合受体修饰的NK细胞增殖。
优选地，步骤(2)所述嵌合受体修饰的NK细胞扩增多次，每一轮扩增周期为3～14天。
优选地，在应用转座子***制备功能嵌合受体修饰的NK细胞过程中，可以添加细胞因子组合物： hrIL-12、hrIL-15、hrIL-18。
优选地，所述细胞因子组合物可以在嵌合受体修饰的NK细胞制备过程中的任意一天添加。
更优选地，所述hrIL-12的终浓度为1～100ng/ml，rIL-15的终浓度为1～100ng/ml，rIL-18的终浓度为 1～100ng/ml，例如可以是1ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、 70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL或100ng/mL。
本发明中，嵌合受体修饰的NK细胞培养采用液体培养基进行，所述液体培养基可以是本领域常用的 细胞培养基，例如可以是AIM VTM(Gibco)、X-VIVOTM 15(Lonza)、SCGMTM(CellGenix)、RPMI、NK MACSTM(Miltenyi)、OpTmizerTM(Gibco)或StemSpanTM(STEMCELL)。
作为优选技术方案，本发明提供了一种应用piggyBac转座子***制备嵌合受体修饰的NK细胞的方 法，所述方法包括：
(1)将分离的外周血单个核细胞(PBMC)与经γ射线处理的工程化K562细胞共培养；
(2)2天后，利用Lonza 4D-Nucleofector device，将编码piggyBac(PB)转座子***的辅助质粒和 编码嵌合受体的供体质粒电转至NK细胞中；
(3)电转5～9天后，将嵌合受体修饰的NK细胞与经γ射线处理的工程化K562细胞共培养，培养 起始时添加hrIL-12、hrIL-15和hrIL-18；
其中，所述细胞培养液为添加有1～5％人AB血清/人自体血浆的AIM V培养液，在培养过程中存在 hrIL-2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)目前对原代NK细胞进行嵌合受体的修饰主要依赖于慢病毒或逆转录病毒介导的基因整合或 mRNA电穿孔介导的基因瞬时表达，由于病毒载体制备过程复杂、制备和使用过程中存在安全隐患、病 毒质量参差不齐，mRNA瞬时表达、制备成本高，显著阻碍了嵌合受体修饰的NK细胞在实体肿瘤治疗中 的临床探索，本发明提出应用转座子***和人工抗原呈递细胞来制备嵌合受体修饰的原代NK细胞，其中 转座子***和人工抗原呈递细胞的结合是必须的，而且本发明还发现并提出利用转座子***将转基因转入 NK细胞的时间点对于NK细胞的扩增效率、纯度、嵌合受体的阳性率非常重要，本发明通过理论和实验 研究，优化了各个步骤的顺序、时间点、所用试剂的浓度或共培养的比例等，显著提升了嵌合受体在NK 细胞中的阳性率、NK的扩增倍数、纯度和肿瘤杀伤能力等；
(2)目前在制备嵌合受体修饰的NK细胞的过程中，目的基因主要依赖于慢病毒载体或逆转录病毒 载体进行递送，然而慢病毒或逆转录病毒生产过程复杂、成本高，极大地增加了基因修饰的NK细胞的生 产成本，例如诺华的Kymriah(anti-CD19 CAR-T)被定价为47.5万美元，昂贵的价格使得很多肿瘤病人 无法承担，因此嵌合受体修饰的免疫细胞生产成本的需求显得格外迫切，本发明应用转座子***制备嵌合 受体修饰的原代NK细胞，转座子***只需要GMP级别的质粒即可，原材料制备过程简单，大大降低了 生产成本；
(3)慢病毒载体或逆转录病毒载体的使用给操作人员也带来了一定的安全隐患，不仅如此，在使用 慢病毒载体或逆转率病毒载体制备嵌合受体修饰的NK细胞的同时，也存在NK细胞产品被复制型逆转录 病毒(RCR)或复制型慢病毒(RCL)污染的潜在风险，虽然病毒载体设计及生产体系在不断改进，这种 风险已大大降低，但仍不能完全排除，本发明使用的转座子***是一种非病毒的方法，十分安全，不会存 在这些隐患；
(4)应用本发明的方法，嵌合受体的编码基因在NK细胞中的整合效率在40～80％之间，已达到现有 技术采用逆转录病毒修饰原代NK细胞的同等水平。
附图说明
图1A为质粒3的图谱，图1B为质粒4的图谱；
图2A为K562-NK1细胞表面的膜固定人白介素15的表达，图2B为K562-NK1细胞表面的膜固定白 介素21的表达，横坐标为膜固定人白介素IL-15或IL-21的表达强度，纵坐标为细胞计数；
图3为利用piggyBac转座子***制备CAR-NK的流程图；
图4A为不同CAR-NK制备方法在培养第10、17、24天时，NK细胞在细胞群体中的比例，图4B为 不同CAR-NK制备方法在培养第10、17、24天时，CAR在NK细胞中的比例；
图5为不同CAR-NK制备方法在培养第10、17、24天时，总细胞数的扩增倍数；
图6A为不同CAR-NK制备方法在培养第10、17、24、31天时，NK细胞在细胞群体中的比例，图 6B为不同CAR-NK制备方法在培养第10、17、24、31天时，CAR在NK细胞中的比例；
图7为不同CAR-NK制备方法在培养第10、17、24、31天时，总细胞数的扩增倍数；
图8A为第17天的NK、CAR-NK和cCAR-NK细胞对人卵巢癌细胞株SKOV3的实时杀伤图谱，横 坐标为肿瘤细胞铺板后(即实验开始后)的时间，以小时计，纵坐标为细胞指数，图8B为在加入效应细 胞24小时后，进行数据分析，计算肿瘤生长抑制率，横坐标为不同实验组，纵坐标为肿瘤生长抑制率；
图9A为pmax-GFP质粒电转1天后GFP在NK细胞中的表达，使用的NK细胞是扩增第17天的NK 细胞，横坐标为GFP的表达强度，纵坐标为细胞计数，图9B为pmax-GFP质粒电转前和电转1天后NK 细胞的数目，使用的NK细胞是扩增第17天的NK细胞，横坐标分别为电转前和电转1天后，纵坐标为 细胞数目。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。 可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书 进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
除非特别说明，否则细胞培养在37℃、5％CO2、潮化(相对湿度为95％)的条件下。
实施例中采用的实验材料如下：
PBMC提取自实体肿瘤患者或健康捐献者的外周血；
人卵巢癌细胞系SKOV3-luc、野生型K562细胞购自ATCC；
SKOV3-luc的培养基为McCoy 5A(Gibco)+10％FBS(Gibco)，K562的培养基为IMDM(Gibco) +10％FBS(Gibco)；
实施例中采用的K562-NK1细胞为经γ射线处理(用100Gy的γ射线对细胞辐射半小时)的基因工 程改造的编码膜固定的人IL-15(mbIL15)、膜固定的人IL-21(mbIL21)、eGFP和Puromycin的K562细 胞。由于K562细胞自然表达NKG2D配体，因此这里不再额外把NKG2D CAR识别的抗原装入K562-NK1 细胞中。膜固定的人IL-15由GM-CSF信号肽(UniprotKB P15509第1～22位氨基酸)、人IL-15(UniprotKB P40933第30～162位氨基酸)和人CD8的铰链跨膜区(UniprotKB P01732第128～213位氨基酸)融合在 一起；膜固定的人IL-21是由GM-CSF信号肽(UniprotKB P15509第1～22位氨基酸)、人IL-21(UniprotKBQ9HBE4第25～162位氨基酸)、人IGHG4的铰链恒定区(UniprotKB P01861第99～327位氨基酸)、人CD4 的跨膜区(UniprotKB P01730第397～418位氨基酸)融合在一起，eGFP的氨基酸序列如SEQ ID No:3所 示，Puromycin的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示；
SEQ ID NO:3：
MVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGN ILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQ SALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK；
SEQ ID NO:4：
MTEYKPTVRLATRDDVPRAVRTLAAAFADYPATRHTVDPDRHIERVTELQELFLTRVGLDIGKVWVADDGAAVAVWTTPESVEAGAVFAEIGPRMAELSGSRLAAQQQMEGLLAPHRPKEPAWFLATVGVSPDHQ GKGLGSAVVLPGVEAAERAGVPAFLETSAPRNLPFYERLGFTVTADVEVPEGPRTWCMTRKPGA；
人重组IL-2(hrIL2)购自北京双鹭公司，人重组IL-12(hrIL12)、人重组IL-15(hrIL15)、人重组IL-18 (hrIL18)购自近岸蛋白公司；
NK细胞培养液：AIM培养基(Gibco公司)+5％人类AB血清(Gemini公司)；
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit购自Lonza公司；
PE-结合的抗人CD3抗体、APC-结合的抗人NKG2D抗体购自BD公司，FITC-结合的抗Strep-tag II 抗体购自金斯瑞公司，Biotin结合的抗人IL-15抗体和APC结合的Streptavidin购自Biolegend公司，Biotin 结合的抗人IL-21抗体购自eBioscience公司；
流式细胞仪购自BD公司，型号为C6 Sampler；
实时杀伤检测仪购自ACEA Bio公司，型号为xCELLigence RTCA DP；
PiggyBac转座酶的氨基酸序列来自GenBank：AAA87375.2；
NKG2D CAR为：NKG2D-CD28-4-1BB-CD3ζ，抗原结合结构域来自NKG2D(UniProtKB-P26718) 的第83～216位氨基酸、铰链区来自IgG4(UniProtKB-P01861)的第99～110位氨基酸、跨膜区来自CD28 (UniProtKB-P10747)的第153～179位氨基酸，胞内结构域来自4-1BB(UniProtKB-Q07011)的第209～255 位氨基酸和CD3ζ(UniProtKB-P20963)的第52～164位氨基酸；
pmax-GFP购自Lonza公司。
实施例1载体构建
(1)构建用于制备工程化K562-NK1细胞的载体
DNA片段1：CMV启动子核苷酸序列、puromycin的编码核苷酸序列、EGFP的编码核苷酸序列由外 包的服务公司合成；
DNA片段2：CMV启动子核苷酸序列、bmIL-15的编码核苷酸序列、P2A的编码核苷酸列、mbIL-21 的编码核苷酸序列由外包的服务公司合成；
将DNA片段1和DNA片段2克隆进pFastBac1质粒(购自Thermofisher)，命名为质粒1。
(2)构建CAR载体
为了构建NKG2D CAR载体，将NKG2D的胞外抗原结合结构域(ED)与IgG4铰链区、CD28跨膜 区、4-1BB和CD3ζ信号传导结构域融合，生成二代NKG2D CAR载体；为了便于通过流式细胞术检测 CAR的表达，在CAR的序列中均加入3个Strept-tag II(ST2)的重复；
CAR片段由外包的服务公司合成，序列的5’端和3’端包括限制性酶切位点EcoRI和SalI；
合成的DNA片段通过EcoRI和SalI酶切后，克隆进pFastBac1质粒(购自Thermofisher)，命名为质 粒2。
(3)构建piggyBac转座子载体(供体载体)
将piggyBac转座子的5’反向末端重复序列(SEQ ID NO:1)、鸡β-珠蛋白染色质绝缘子cHS4(GenBank： AY040835.1)、EF1α启动子、EcoRI和SalI酶切位点序列、SV40 polyA序列、反向互补的cHS4序列和3’ 反向末端重复序列(SEQ ID NO:2)融合，并由外包的服务公司合成，通过BsaI克隆进pmaxCloning载 体(购自Lonza公司)，命名为pZTS4，融合基因的表达由EF1α启动子控制；
SEQ ID NO:1：
5’-ccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgtgtaaaattgacgcatg-3’；
SEQ ID NO:2：
5’-catgcgtcaattttacgcagactatctttctaggg-3’；
为了构建含有NKG2D CAR基因的转座子供体载体，将质粒2中的CAR序列通过EcoRI和SalI酶切 后克隆进pZTS4，命名为质粒3，如图1A所示，CAR基因的表达由EF1α启动子控制。
(4)构建piggyBac转座酶载体(辅助载体)
为了构建piggyBac转座酶编码质粒，在piggyBac转座酶基因(GenBank：EF587698.1)的两端分别 添加AgeI和SacI酶切位点，序列由外包的服务公司合成，并通过两个酶切位点克隆进pmaxCloning载体， 命名为质粒4，如图1B所示，pmaxCloning载体中的CMV启动子控制piggyBac转座酶的表达。
实施例2制备工程化K562-NK1细胞
将野生型K562细胞重悬于10mL Opti-MEM中，300×g离心10min，将细胞沉淀重悬于100μL P3 buffer中，加入10μg质粒1，混匀后转移至Lonza电击杯；
将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，电转结束后，将一个 cuvette中的K562细胞悬液缓慢转移至6孔板的一个孔中，孔里预先加入K562培养基(IMDM+10％FBS)；
电穿孔后的第5天，在200μg/mL浓度下进行为期1个月的puromycin筛选，培养基每2天更换一次；
1个月后，使用细胞分选仪BD FACSAria(BD Biosciences公司)将单细胞分选到96孔板，对扩增的 单细胞克隆进行流式细胞术分析，检测融合基因的表达情况，检测抗体分别为APC-结合的Streptavidin、 biotin-结合的抗人IL-15抗体和biotin-结合的抗人IL-21抗体，筛选到的单细胞克隆命名为K562-NK1。
如图2A和图2B所示，K562-NK1细胞表面表达了高水平的人IL-15和人-IL21，其阳性率分别为100％ 和79％。
实施例3利用piggyBac转座子***制备CAR-NK
制备流程图如图3所示：
第0天，将5×106个PBMC和5×106K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL NK细胞培养基， 接种于T25细胞培养瓶中，加入hrIL-2使其终浓度为100IU/mL；
第2天，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min；用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g 离心10min；将细胞沉淀重悬于100μL P3 buffer中，加入5μg质粒4和10μg质粒3，混匀后转移至电 Lonza电击杯；将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，电转结束 后，将一个cuvette中的NK细胞悬液缓慢转移至一个新的T25细胞培养瓶中，加入含有终浓度为100IU/mL 的hrIL-2的10mL NK细胞培养液，轻轻混匀，将T25细胞培养瓶置于37℃细胞培养箱培养；
第3天至第10天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第10天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)；将2×106个细胞与2×106个K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL培 养基中，加入hrIL-2使其终浓度100IU/mL；
第10天至第17天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第17天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)；将2×106个细胞与2×106个K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL培 养基中，加入hrIL-2使其终浓度100IU/mL；
第17天至第24天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第24天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)；将2×106个细胞与2×106个K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL培 养基中，加入hrIL-2使其终浓度100IU/mL；
第24天至第31天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第31天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)。
实施例4利用piggyBac转座子***制备cCAR-NK
第0天，将5×106个PBMC和5×106K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL NK细胞培养基， 接种于T25细胞培养瓶中，加入hrIL-2使其终浓度为100IU/mL；
第2天，取出悬浮的细胞进行计数，300×g离心10min；用10mL Opti-MEM重悬细胞沉淀，300×g 离心10min；将细胞沉淀重悬于100μL P3 buffer中，加入5μg质粒4和10μg质粒3，混匀后转移至电 Lonza电击杯；将电击杯置于Lonza 4D-NucleofectorTM X Unit(单电击杯模块中)，进行电转，电转结束 后，将一个cuvette中的NK细胞悬液缓慢转移至一个新的T25细胞培养瓶中，加入含有终浓度为100IU/mL 的hrIL-2的10mL NK细胞培养液，轻轻混匀，将T25细胞培养瓶置于37℃细胞培养箱培养；
第3天至第10天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第10天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)；将2×106个细胞与2×106个K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL培 养基中，加入hrIL-2、hrIL-15、hrIL-18使其终浓度分别为10ng/mL、50ng/mL和50ng/mL；
第11天，收集全部细胞收集300×g离心10min，用20mL新鲜的NK细胞培养基重悬，添加hrIL-2 使其终浓度100IU/mL；
第12天至第17天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第17天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)；将2×106个细胞与2×106个K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL培 养基中，加入hrIL-2使其终浓度为100IU/mL；
第17天至第24天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第24天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)；将2×106个细胞与2×106个K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL培 养基中，加入hrIL-2使其终浓度为100IU/mL；
第24天至第31天，根据细胞生长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；
第31天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56 抗体、抗Strep-tag II抗体)。
实施例5不同电转条件对CAR-NK细胞的扩增倍数和细胞表型的影响
本实施例比较了在NK细胞活化前进行电转或在NK细胞活化后的第2或第4天进行电转，获得的 CAR-NK中的NK细胞比例、CAR在NK细胞中的表达比例以及总细胞的扩增倍数。
在NK细胞活化后的第2天进行电转即为实施例3的方法；在NK细胞活化前进行电转的方法与实施 例3的不同之处在于将5×106个PBMC按照实施例3的方法电转，电转完成后立刻与5×106个K562-NK1 (100Gyγ射线辐照)共培养；在NK细胞活化后的第4天进行电转与实施例3的不同之处在于将5×106 PBMC和5×106K562-NK1(100Gyγ射线辐照)共培养4天后，再将悬浮细胞去除进行电转。
采用以上三种方法从1个正常捐献者样本中制备CAR-NK细胞，对获得的NK细胞纯度(CD3-CD56+) 进行比较，结果如图4A所示，实施例3制备的CAR-NK细胞中NK细胞的比例在培养第10、17、24天 时分别为68％、77％、85％，而在NK细胞活化前进行电转制备的CAR-NK细胞中NK细胞的比例在培养 第10、17天分别为11％和13％，在NK细胞活化后4天进行电转制备的CAR-NK细胞中NK细胞的比例 在培养第10、17、24天分别为46％、81％、88％。说明NK细胞活化后进行电转比NK活化前进行电转 制备的CAR-NK细胞中，NK细胞的比例更高。
进一步地，对获得的NK细胞中CAR的比例进行比较，结果如图4B所示，实施例3制备的CAR-NK 细胞中CAR在NK细胞中的比例在培养第10、17、24天时分别为14％、30％、45％，而在NK细胞活化 前进行电转制备的CAR-NK细胞中CAR在NK细胞中的比例在培养第10、17天分别为14％和27％，在 NK细胞活化后4天进行电转制备的CAR-NK细胞中CAR在NK细胞中的比例在培养第10、17、24天分 别为2％、15％、19％。说明越早进行电转，NK细胞中CAR的比例越高。
本实施例还对获得的细胞总数扩增倍数进行了比较，结果如图5所示，实施例3的方法扩增24天得 到的细胞总数扩增倍数为3022倍；在NK细胞活化前电转、共扩增17天，细胞总数扩增倍数为133倍； 在NK细胞活化后4天电转、共扩增24天，细胞总数扩增倍数为736倍。说明在NK细胞活化后第2天 进行电转所得细胞的扩增倍数最高。
综合这三面的参数比较，实施例3的方法，即在NK细胞活化后2天进行电转，所制备的CAR-NK 细胞，其NK细胞比例、CAR在NK细胞中的比例以及总细胞数的扩增倍数相对最好。
实施例6不同细胞因子组合物对CAR-NK细胞的扩增倍数和细胞表型的影响
本实施例比较了在CAR-NK制备第10天、与K562-NK1第二次共培养时，是否添加细胞因子组合物 (IL-12、IL-15、IL-18)对CAR-NK细胞生长的影响。
CAR-NK组，即CAR-NK制备第10天与K562-NK1第二次共培养时，只添加hrIL-2(实施例3)；
cCAR-NK组，即CAR-NK制备第10天与K562-NK1第二次共培养时，添加细胞因子组合物IL-12、 IL-15、IL-18(实施例4)。
采用以上两种方法从1个正常捐献者样本中制备CAR-NK细胞，对获得的NK细胞纯度(CD3-CD56+) 进行比较，结果如图6A所示，实施例3制备的CAR-NK细胞中NK细胞的比例在培养第10、17、24、 31天时分别为79％、81％、90％、93％，而实施例4制备的cCAR-NK细胞中NK细胞的比例在培养第10、 17、24、31天时分别为79％、87％、93％、93％。说明在CAR-NK制备第10天与K562-NK1第二次共培 养时，添加细胞因子组合物IL-12、IL-15、IL-18可以略微提高NK细胞的比例。
进一步地，对获得的NK细胞中CAR的比例进行比较，结果如图6B所示，实施例3制备的CAR-NK 细胞中CAR在NK细胞中的比例在培养第10、17、24、31天时分别为34％、47％、49％、74％，而实施 例4制备的cCAR-NK细胞中CAR在NK细胞中的比例在培养第10、17、24、31天时分别为34％、57％、 58％、85％。说明在CAR-NK制备第10天与K562-NK1第二次共培养时，添加细胞因子组合物IL-12、IL-15、 IL-18可以显著提高CAR在NK细胞中的比例。
本实施例还对获得的细胞总数扩增倍数进行比较，结果如图7所示，实施例3制备的CAR-NK细胞， 其总数扩增倍数在第0-10天、10-17天、17-24天和24-31天分别为27、21、9、8倍；而实施例4制备的 cCAR-NK细胞，其总数扩增倍数在第0-10天、10-17天、17-24天和24-31天分别为27、27、9、7倍。 说明在CAR-NK制备第10天与K562-NK1第二次共培养时，添加细胞因子组合物IL-12、IL-15、IL-18 可略微提高NK细胞的扩增倍数。
综合这三面的参数比较，实施例4的方法，即在CAR-NK制备第10天与K562-NK1第二次共培养时， 添加细胞因子组合物IL-12、IL-15、IL-18，有助于CAR+的CAR-NK细胞的扩增。
实施例7CAR-NK制备第10天添加细胞因子组合物，对人卵巢癌细胞株SKOV3生长情况的影响 (RTCA)
本实施例比较了在NKG2D CAR-NK制备第10天、与K562-NK1第二次共培养时，是否添加细胞因 子组合物(IL-12、IL-15、IL-18)对CAR-NK体外杀伤能力的影响。
RTCA实验开始第0小时，将SKOV3铺于16孔电极板(ACEA Bio公司)中，5000个细胞/孔；约 24小时后，将第17天的NKG2D CAR-NK细胞、NKG2D cCAR-NK细胞和NK细胞(效应细胞)分别按 效应细胞:靶细胞＝1:1或2:1的比例接种于电极板中，总体积200μL，每组实验重复2次；其中NK细胞 采用实施例2的方法制备，但是无需进行电转；用xCELLigence RTCA检测NKG2D CAR-NK细胞对SKOV3 生长的影响。
如图8A和图8B所示，未加入效应细胞组(图中显示为“SKOV3”)，肿瘤细胞持续生长至70个小时； 当效应细胞:肿瘤细胞＝1:1时，加入NK细胞(图中显示为“SKOV3:NK 1:1”)或CAR-NK细胞(图中显 示为“SKOV3:CAR-NK 1:1”)后，可显著抑制肿瘤细胞的生长，其中CAR-NK细胞的抑瘤作用显著优于 NK细胞，这表明了NKG2D CAR-NK细胞中CAR的作用；而加入cCAR-NK细胞(图中显示为 “SKOV3:cCAR-NK 1:1”)(E:T 1:1)或CAR-NK细胞(图中显示为“SKOV3:CAR-NK 1:2”)(E:T 2:1) 后，肿瘤细胞几乎完全被杀死。
对加入效应细胞后24h的数据进行分析(图8A竖虚线所示处)，根据以下公式计算肿瘤生长抑制率：
100％×(SKOV3 cell index-实验组cell index)/SKOV3 cell index
可以发现加入cCAR-NK细胞组(图中显示为“SKOV3:cCAR-NK 1:1”)与加入CAR-NK细胞组(图 中显示为“SKOV3:CAR-NK 1:2”)，其肿瘤抑制率都在80％左右，这表明在NKG2DCAR-NK制备第10 天，与K562-NK1第二次共培养时，添加细胞因子组合物(IL-12、IL-15、IL-18)可以显著提高CAR-NK 细胞对肿瘤细胞的生长抑制作用，原因既可能是NK细胞中CAR比例的提升，也可能是细胞因子组合物 (IL-12、IL-15、IL-18)增强了NK细胞的本身杀伤作用。
实施例8直接对NK细胞进行电转，转基因的表达效率及NK细胞存活率
本实施例以绿色荧光蛋白GFP基因为报告基因，直接用pmax-GFP质粒对扩增17天的NK细胞进行 电转，测试电转后1天NK细胞中GFP的表达比例及NK细胞的存活率。NK细胞扩增流程如下：第0天， 将2×106个PBMC和2×106K562-NK1(100Gyγ射线辐照)重悬于10mL NK细胞培养基，接种于T75 细胞培养瓶中(竖着养)，加入hrIL-2使其终浓度为100IU/mL；第2天至第10天，根据细胞生长情况， 加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；第10天，收集全部细胞进行计数，取2×106个细胞进行 流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56抗体)；将2×106个细胞与2×106个K562-NK1(100Gyγ 射线辐照)重悬于10mL培养基中，加入hrIL-2使其终浓度100IU/mL；第10天至第17天，根据细胞生 长情况，加入适量新鲜的含有hrIL-2的NK细胞培养液；第17天，收集全部细胞进行计数，取2×106个 细胞进行流式细胞表型分析(抗人CD3抗体、抗人CD56抗体)。取扩增第17天的NK细胞，采用实施 例3中电转的方法，电转的NK细胞数为2×106，并将质粒替换为pmax-GFP质粒。电转后第二天，进行 细胞计数和流式细胞术检测NK细胞中GFP的比例。如图9A和图9B所示，电转第二天，虽然GFP的表达比例有17.99％，NK细胞的存活率仅有3.2％。
上述结果表明，如果单纯只是对NK细胞进行电转，不用人工抗原呈递细胞富集扩增，NK细胞的活 率和转基因的表达率都很低。因此转座子***和人工抗原呈递细胞的结合是必须的，可以显著提高NK细 胞的存活及扩增倍数，并且显著提高嵌合受体修饰的NK细胞的比例。
综上所述，本发明采用非病毒的方法，利用转座子***在NK细胞中引入稳定高表达的转基因，实现 对NK细胞的高效遗传修饰，生产周期短、生产成本低，制备的转基因修饰NK细胞纯度高、安全性好， 对肿瘤细胞具有显著的杀伤和/或抑制作用。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法， 即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何 改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围 和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州优凯瑞医药科技有限公司
<120> 非病毒方法制备稳定高表达嵌合受体的NK细胞
<130> 20200707
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgtgta aaattgacgc 60
atg 63
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc taggg 35
<210> 3
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
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210 215 220
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<211> 199
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
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1 5 10 15
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Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val
50 55 60
Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu
65 70 75 80
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Met Thr Arg Lys Pro Gly Ala
195

Claims (23)

1.一种利用非病毒转座子***和人工抗原呈递细胞制备嵌合受体修饰的自然杀伤细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)利用转座子***将嵌合受体的编码基因转入自然杀伤细胞，得到初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞；
(2)利用人工抗原呈递细胞扩增所述初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞包括人原代自然杀伤细胞；
所述人原代自然杀伤细胞来源于外周血、脐带血或诱导性多能干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合受体包括嵌合抗原受体和/或嵌合转换受体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子***包括piggyBac转座子***、Sleeping Beauty转座子***或Tol2转座子***。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子***包括转座子元件和转座酶元件。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件包括转座子5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列；
所述5’反向末端重复序列和3’反向末端重复序列之间含有两个绝缘子；
所述两个绝缘子之间含有启动子和嵌合受体的编码基因；
所述转座子元件为质粒或线性化核酸片段。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座酶元件包括转座酶蛋白或编码转座酶的核酸分子；
所述编码转座酶的核酸分子包括质粒、线性化核酸片段或mRNA。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件和转座酶元件连接在同一表达载体上。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转座子元件和转座酶元件在不同的表达载体上。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述转座子***通过电穿孔和/或化学试剂转入自然杀伤细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括活化自然杀伤细胞的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述活化自然杀伤细胞采用人工抗原呈递细胞、饲养细胞、细胞因子、抗体或化合物进行。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述自然杀伤细胞活化0～14天后，将所述转座子***转入自然杀伤细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之前还包括利用磁分选去除CD3+细胞的步骤。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)之后还包括将初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞培养0～14天后，利用磁分选去除CD3+细胞的步骤。
16.根据权利要求1或12所述的方法，其特征在于，所述人工抗原呈递细胞包括以细胞为基础的人工抗原呈递细胞、人工合成的人工抗原呈递细胞或以外泌体为基础的人工抗原呈递细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述以细胞为基础的人工抗原呈递细胞包括人髓系白血病K562细胞、人伯基特淋巴瘤Daudi细胞、EBV转化的B淋巴母细胞样细胞或小鼠胚胎成纤维细胞系NIH/3T3细胞。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述以细胞为基础的人工抗原呈递细胞为工程化细胞；
所述工程化细胞表达嵌合受体识别的抗原；
所述工程化细胞表达用于活化自然杀伤细胞的配体分子和/或细胞因子；
所述配体分子包括CD137L和/或OX40L；
所述细胞因子包括人IL-21、人IL-15或人IL-18中的任意一种或至少两种的组合；
所述细胞因子包括分泌型细胞因子和/或膜固定细胞因子；
所述工程化细胞经γ射线或丝裂霉素C处理。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将嵌合受体的编码基因转入自然杀伤细胞0～14天后，扩增所述初始的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增进行多次，每一轮扩增周期为3～14天。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合受体修饰的自然杀伤细胞的制备过程中，培养基中添加有细胞因子组合物hrIL-12、hrIL-15和hrIL-18。
22.嵌合受体修饰的自然杀伤细胞，其特征在于，采用权利要求1-21任一项所述的方法制备得到。
23.权利要求22所述的嵌合受体修饰的自然杀伤细胞在制备肿瘤治疗药物和/或肿瘤预防药物中的应用。
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