CN107002089B - 化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送 - Google Patents

化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送 Download PDF

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Abstract

本发明描述了一种在细胞膜中引起扰动的微流体***，所述***包括(a)限定管腔并且被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞可从其中通过的微流体通道，和(b)能量场的来源或发射体。所述微流体通道可包括细胞变形缩窄部。所述缩窄部的直径可随细胞直径而变化。还描述了相关装置、***、技术和制品。

Description

化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送
相关申请
此申请依照35 U.S.C.§119(e)要求2015年10月8日提交的美国临时申请号:62,239,241和2014年11月14日提交的美国临时申请号: 62/080,201的优先权权益，这些申请以引用的方式整体并入本文。
关于联邦资助的研究的声明
本发明在国立卫生研究院(the National Institutes of Health)授予的政府资助号R01GM101420-01A1的支持下完成。政府对本发明享有某些权利。
发明领域
本文所述的主题涉及化合物或组合物的细胞内递送。
背景
许多药物主要集中在小分子药物的开发。这些药物之所以如此命名的原因在于它们相对较小的尺寸，这使得它们能够在体内自由扩散以达到其靶标。这些分子还能够横跨基本上不受阻碍的另外不渗透的细胞膜。然而，下一代基于蛋白质、DNA或RNA的疗法不能轻易穿过细胞膜且因此需要细胞修饰以便于递送。确定的方法使用化学或物理手段以突破膜并递送材料到细胞质中。适当的细胞内递送是下一代治疗剂的研究、开发及实施中的重要步骤。
在递送材料到细胞中的电穿孔过程中，DNA分子积聚并且在电脉冲期间与电渗透化的质膜相互作用。然后，那些DNA聚集物内化到细胞质中且随后造成基因表达(Golzio,M.等人,Proc.Natl.Acad.Sci. 99,1292–1297(2002)；Paganin-Gioanni,A.等人Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.108,10443–7(2011)；Rosazza,C.等人,Mol.Ther.21, 2217–2226(2013)；Boukany,P.E.等人Nat.Nanotechnol.6,747–54 (2011)；Teissie,J.等人,Biochim.Biophys.Acta 1724,270–80(2005)； Yarmush,M.L.等人,Annu.Rev.Biomed.Eng.16,295–320(2014)； Geng,T.&Lu,C.,Lab Chip 13,3803–21(2013))。DNA质粒未必能够仅仅经由扩散行进通过粘稠和拥挤的细胞质而到达核(Lechardeur,D. 等人,Adv.Drug Deliv.Rev.57,755–767(2005)；Dowty,M.E.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92,4572–4576(1995))。一些研究显示DNA从质膜向核的转运是经由细胞骨架转运如经由微管和肌动蛋白网的主动的生物过程(Rosazza,C.等人,Mol.Ther.21,2217–2226(2013))。已发现微管和肌动蛋白网在细胞质内的DNA转运中起重要作用，并且所述过程的时间标度可为数小时，这取决于细胞类型。质膜与核之间的DNA转移的不清楚的机制和复杂的性质妨碍了电穿孔性能在难转染的细胞中的增强。此外，用于当前电穿孔技术中的强场可导致显著的损伤或死亡(Yarmush,M.L.等人,Annu.Rev.Biomed.Eng.16, 295–320(2014)；Geng,T.&Lu,C.,Lab Chip 13,3803–21(2013))。需要可直接将有效负载送到细胞和细胞器中的技术。
发明内容
本发明提供对与向胞质和亚细胞细胞器(如细胞核)递送化合物和 /或化合物的混合物的较早方法有关的问题和缺点的解决方法。本发明的方面提供一种用于在细胞膜中引起扰动的微流体***，所述***包括限定管腔并被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞可通过所述管腔的微流体通道。所述***和方法适用于递送货物如大分子如DNA、 RNA、蛋白质、肽、糖聚合物、纳米材料，以及小分子穿过细胞膜并进入细胞中，例如真核生物的或原核细胞。微流体通道包括细胞变形缩窄部。缩窄部的直径可随细胞直径而变并且不大于细胞的直径。微流体通道在缩窄部的下游包括能量场的来源或发射体。在各个实施方案中，微流体***包括一个或多个电极以产生电场、磁体或电磁体以产生磁场、声源以产生声场，和/或光源。在一些实施方案中，能源包括叉指电极。细胞变形缩窄部与细胞对能量场(如上所述的那些)的后续暴露的组合在货物分子向细胞中的递送和/或货物分子在细胞内部向亚细胞结构如核或线粒体的移位中产生协同效应。细胞对至少两种不同力(例如物理紧缩力和电力)的暴露在递送的效率和递送货物的活性(例如，由递送核酸实现的编码蛋白质的表达)上产生了惊人的优点。
在一些实施方案中，至少一个电极、磁体、声学装置或光源接近于细胞变形缩窄部，例如以串联形式，并且产生场。举例来说，一个或多个电极、磁体、声学装置或光源被安置在相对于缩窄部的位置的上游、下游或以便同时向细胞递送电、磁或声信号。例如，细胞在细胞变形缩窄事件之后暴露于电场、磁场、声场或光场。
在某些实施方案中，所述场或场发射体/来源和微流体通道为***的单个装置的一部分。或者，微流体***可具有第一装置和第二装置，其中微流体通道为第一装置的一部分并且发射体/来源在***的第二装置内。场暴露当细胞在第一装置内或初始(第一)装置外时出现。在一些实施方案中，微流体***可具有第一装置和第二装置，其中微流体通道是一种装置(第一装置)的一部分并且来源/发射体在另一装置(第二、第三或另外的装置)内以便能量场从具有来源/发射体的装置中发射通过具有微流体通道的装置。
在某些实施方案中，磁体(如电磁体)、声学装置，或光源/发射体及微流体通道为***的单个装置的一部分。例如，磁体或声学装置可在微流体通道中的细胞变形缩窄部的下游处。在其中微流体***具有第一装置和第二装置的其他实施方案中，微流体通道为第一装置的一部分并且磁体、声学装置或光源/发射体在***的第二装置内。场暴露当细胞在第一装置内或初始(第一)装置外时出现。在一些实施方案中，微流体***可具有第一装置和第二装置，其中微流体通道是一种装置(第一装置)的一部分并且磁体、声学装置或光源/发射体在另一装置(第二、第三或另外的装置)内以便能量场从具有一个或多个电极的装置中发射通过具有微流体通道的装置。
在某些实施方案中，所述一个或多个电极和微流体通道为***的单个装置的一部分。或者，微流体***可具有第一装置和第二装置，其中微流体通道为第一装置的一部分并且所述一个或多个电极在***的第二装置内。场暴露当细胞在***的第一装置内或初始(第一)装置外时出现。在一些实施方案中，微流体***可具有第一装置和第二装置，其中微流体通道是一种装置(第一装置)的一部分并且所述一个或多个电极在另一装置(第二、第三或另外的装置)内以便电场从具有所述一个或多个电极的装置中发射通过具有微流体通道的装置。
在其中至少一个电极、磁体、声学装置或光和微流体通道为单个装置的一部分的一些实施方案中，所述至少一个电极、磁体、声学装置或光可在细胞变形缩窄部的下游处。
在本发明的各种实施方式中，选择所述缩窄部的直径以诱发细胞膜的足够大的临时扰动供有效负载通过，并且细胞以连续流动形式通过缩窄部到场(即，电、磁、声或光场)中。在通过缩窄部之后，细胞可接触或通过场的一部分，尽管有临时扰动，所述场强度仍足以驱动有效负载。在其他实施方案中，细胞在通过缩窄部之后进入并保留在缩窄部下游的装置的区或室内。在此区或室内的细胞随后与场接触。
本发明的方面还涉及用于将化合物或组合物递送到细胞中的方法。方法可例如包括提供在含有效负载的溶液中的细胞；使所述溶液通过包括细胞变形缩窄部的微流体通道；使细胞通过所述缩窄部以便压力被施加于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供有效负载通过；并且使细胞通过或与电场、磁场、声场或光场接触，这些场将有效负载进一步驱动到细胞中和/或将有效负载从细胞内的第一位置(例如细胞膜)移位到另一或第二位置，例如核或其他亚细胞器或结构(如线粒体)。例如，第一位置包括胞质位置或在胞质/质膜界面处或附近的区域且第二位置包括线粒体或核位置。在一些实施方案中，细胞是根据时间顺序进行处理：首先使细胞破裂(例如挤压，变形或压缩)，然后暴露于所施加的能量场，例如电场、磁场或声场。
在一些实施方案中，有效负载可在细胞破裂之后且在细胞与场 (如电场、磁场或声场)的一部分接触或通过场的一部分之前或同时被添加到含有细胞的溶液中，这些场将有效负载进一步驱动到细胞中和 /或将有效负载从细胞内的第一位置(例如细胞膜)移位到另一或第二位置，例如核或其他亚细胞器或结构(如线粒体)。
在与多肽有效负载有关的某些实施方案中，所述多肽可包括定位信号。在一些实施方案中，多肽有效负载是包含定位信号的融合蛋白。例如，所述多肽可包含内质网滞留信号、核定位信号、核仁定位信号、线粒体靶向信号，或过氧物酶体靶向信号。这类信号在本领域中是已知的，并且非限制性实例描述于Kalderon等人,(1984)Cell 39(3Pt 2): 499–509；Makkerh等人,(1996)Curr Biol.6(8):1025–7；Dingwall等人,(1991)Trends inBiochemical Sciences 16(12):478–81；Scott等人, (2011)BMC Bioinformatics 12:317(7页)；Omura T(1998)J Biochem. 123(6):1010-6；Rapaport D(2003)EMBO Rep.4(10):948-52；及Brocard &Hartig(2006)Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-MolecularCell Research 1763(12):1565–1573中，其各自的内容据此以引用的方式并入本文。
在与电场有关的实施方案中，所述电场可由至少一个电极或在微流体通道或区/室的两侧处的一组两个电极产生。在与磁场有关的实施方案中，所述磁场可由至少一个磁体产生。适用于与磁场有关的各种实施方案中的磁体的非限制性实例为暂时磁体、永久磁体，和电磁体。在与声场有关的实施方案中，所述声场可由至少一个声学装置产生。声学装置的一个非限制性实例为扬声器。在与光场有关的实施方案中，所述光场可由任何发光装置产生或可使用环境光。发光装置的非限制性实例包括发光二极管(LED)、激光、白炽灯泡，或可见电磁辐射的其他来源。
在本发明的各种实施方式中，细胞通过第一装置中的微流体通道，然后从所述第一装置处移走并在第二装置中与电场、磁场或声场接触。在其他实施方式中，微流体通道与电场、磁场，和声场在一个装置内。举例来说，细胞可以连续流动形式通过缩窄部到场中，并且在通过所述缩窄部之后，细胞可接触或通过场的一部分，尽管有临时扰动，所述场强度仍足以驱动有效负载。或者，在通过所述缩窄部之后，细胞可流入并保留在其中细胞与场接触的装置的区内。
微流体***可包括多个微流体通道。所述多个微流体通道的每个通道限定一个管腔并且被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞可通过管腔。另外，每个微流体通道包括一个或多个细胞变形缩窄部。在一些实施方案中，缩窄部的直径可随细胞的直径而变化。因此，在本发明的微流体***内可存在许多微流体通道。例如，微流体***可包括多个平行排列的微流体通道，例如2、5、10、20、40、45、50、75、 100、500、1,000或更多个。
具有多个平行微流体通道的微流体***允许有效负载向细胞的高通量递送。许多细胞可一个接一个地通过每个并行通道。细胞可在通过微流体通道期间或之后暴露于电场、磁场或声场。在通过每个微流体通道的多个细胞的情况下，大量细胞可在短时间内被处理。应当理解，取决于上下文，在本文中对“细胞”的提及可指的是一个以上细胞。在优选实施方案中，电场、磁场或声场被施加于细胞变形缩窄部下游处的细胞，即，细胞通过缩窄部，由此变形/使细胞膜不稳定并且允许有效负载进入细胞。在那个事件之后，细胞经历电场、磁场或声场。电场、磁场或声场介导细胞内的有效负载(所述有效负载由于先前的缩窄步骤而已经进入细胞质中)移位到细胞内的亚细胞结构，例如核。
在本发明的优选方面中，选择所述缩窄部的直径以诱发细胞膜的足够大的临时扰动供有效负载通过。应理解，缩窄部的直径可基于细胞类型和有效负载而调整。
关于电极、磁体或声学装置的位置的多个变动是可能的。在优选实施方案中，电极仅位于细胞变形缩窄部的一端。在其他实施方案中，电极位于细胞变形缩窄部的两端，例如细胞进入端和离开端。微流体***可包括两个或更多个电极，所述电极产生电场以驱动或推动核酸进入悬浮于缓冲液中的细胞中，或进入细胞核中。举例来说，电场使核或其他亚细胞细胞器(例如线粒体)的膜不稳定，由此促进货物进入亚细胞结构中。
在一些实施方案中，电场的强度小于电穿孔细胞，例如引入核酸穿过细胞的质膜所需的强度。例如，较低强度的电场可用于DFE中以为特定的细胞类型获得给定的有效负载的相同水平的递送。不同于需要足够强度的场来使细胞膜破裂并将材料向胞质驱动的电穿孔，此表现通过机械变形提供膜的破裂并且利用场的驱动力增加材料向细胞胞质和亚细胞区室中的移位。通过消除使用电能作为供细胞膜破裂的唯一来源和/或通过场驱动力将材料包埋到质膜中，DFE允许使用能够将材料穿过机械破坏的膜而直接递送到胞质和亚细胞区室中的较低场强度。在同一及其他实施方案中，缩窄部与电场的组合提高核酸向细胞核中递送的效率。在一些实施方案中，电场可增强膜的渗透性。例如，电场可增强亚细胞膜的渗透性，所述亚细胞膜不能由机械构件直接破坏。不希望受理论约束，外膜的机械破坏可由于不存在未受损的外膜而将内膜暴露于场效应。在本发明的优选方面中，通过微流体***并接收有效负载的细胞的活力比用电穿孔处理的相应细胞更高。例如，与用标准电穿孔条件单独处理的相应细胞群体相比，有基本上或约1-50％、1-10％，或约5、10、15、20、25、30、35、40、 40、50、60、70或80％更多的通过微流体***的细胞是活的。
微流体***可包括多个电极对，其中电极对之间的电极尺寸不同 (图2)。在非限制性实例中，多个电极对被配置到至少第一和第二列电极对中，并且第一列电极对偏离第二列电极对。在一些实施方案中，微流体***包括配置到至少第一和第二列电极中的多个电极。第一列电极可偏离第二列电极。应当理解，存在不同列的电极或电极对可彼此偏离的多种方式(例如，按多个角度在X、Y和/或Z平面上取向)。例如，第一阵列可在水平、垂直，或对角线平面上以基本上或约1°、 5°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、70°、 80°、90°、1-10°、1-20°、1-30°、1-45°，或1-90°的角度偏离于第二阵列。
细胞对于电场的许多不同暴露时间是可能的。举例来说并在优选实施方案中，暴露时间为基本上或约10-50ms、50-100ms或10-100 ms。本发明的方面包括在两个或更多个电极之间基本上恒定的电场。在一些实施方案中，电场是恒定或脉冲直流电。优选地，电场是脉冲调制的。在一些实施方案中，电场是在约50-200μs下脉冲调制。电场的强度也可变化。在一些实施方案中，电场的强度或脉冲强度可为基本上或约1-3kV/cm或0.1至0.5、0.1至1、0.1至1.5、0.1至2、 0.1至2.5，或0.1至3kV/cm。在一些实施方案中，电场的强度或脉冲强度可为基本上或约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 1、1.5、2，或2.5kV/cm。场强度可在0.1-10kV/cm的范围内或甚至更宽，取决于具体的病例。举例来说，电场的强度或脉冲强度是基本上或约0.1-20kV/cm，或小于1kV/cm。在各个实施方案中，电场的强度或脉冲强度是基本上或约10-20kV/cm，或小于1kV/cm。在本发明的一些实施方式中，电场是以基本上或约0.1、0.1-2，或0.1-2000 ms的持续时间和1-20、0.1-2000，或1-200ms的周期来脉冲调制。在一些情况下，电场的强度或脉冲强度可小于电穿孔细胞所必需的强度。举例来说，电场的强度或脉冲强度可比电穿孔细胞所必需的强度小基本上或约50、1-50、50-99，或1-99％。
在一些实施方案中，使用直流电产生电场。在其他实施方案中，使用交流电产生电场。交流电可均匀地振荡，或可具有不对称振荡以便存在电场力的净调制。不对称振荡可例如通过施加具有非零偏压的交流电来实现。
在一些实施方式中，当前主题合并了以下无病毒载体递送的优点：引起临时扰动的快速机械细胞变形，和有助于以高效率将有效负载如DNA递送通过扰动并进入细胞中的电场。在一些实施方式中，当前主题利用比一些常规电穿孔技术强度更低但比一些传感应用(其例如可感测细胞电阻率)强度更高的电场。示例性感测方法描述于 2009年11月12日公开的美国专利公布号2009/0280518(Adamo等人) 中。因此，对于固定的递送效率，一些实施方案使用较低电场强度的电穿孔。核酸的递送和表达也可更快地完成。核酸的更快递送和表达提供了与电穿孔单独或没有场情况下的细胞挤压相比关于DNA表达的重要优点。还存在使用DFE递送其他带电有效负载(如RNA)的突出优点。例如，与电穿孔或没有场情况下的细胞挤压相比，使用DFE 技术，更多的RNA可被递送到给定的细胞中。
电场和磁场特别适用于驱动带电的有效负载到细胞和亚细胞区室(如细胞器)中。有效负载可被修饰以便任选地增加其电荷，从而改善由DFE完成的递送。在一些实施方案中，具有低或无电荷的有效负载被修饰以增强其使用电场或磁场的递送。例如，蛋白质可被缀合到带电化合物上，优选使用共价键。所述缀合可例如在N端或C端处(例如，经由肽键)或在氨基酸侧链处(例如，经由与半胱氨酸的二硫键或与硒代半胱氨酸的键)。此方法不限于蛋白质，并且可应用于本文所公开的各种有效负载。
在一些实施方案中，缀合是经由二硫键或在细胞中容易断裂的另一键。可缀合到有效负载上的带电化合物的实例包括单一带电氨基酸 (即，具有电荷的氨基酸单体)和/或多个带电氨基酸的区段。在一些实施方案中，带电氨基酸的区段包含具有正电荷的不同氨基酸的混合物。在其他实施方案中，带电氨基酸的区段包含具有负电荷的不同氨基酸的混合物。或者，带电氨基酸的区段具有同一氨基酸的重复。氨基酸可为天然的、非天然的，或其组合。区段的长度可根据有待修饰的有效负载的尺寸和有待添加到有效负载中的所需电荷而变化。在各个实施方案中，氨基酸的区段包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、15、20、25、30、35、40、45、50，或1-50个氨基酸。
天然存在的带正电氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。天然存在的带负电氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。非天然存在的氨基酸的实例包括具有正电荷的那些，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸的D立体异构体；以及具有负电荷的那些，如天冬氨酸和谷氨酸的D 立体异构体。因此，有效负载可使用一种或多种以下氨基酸或其任何组合进行修饰以具有增加的正电荷：天然存在的氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；和/或非天然氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸的D立体异构体。或者，有效负载可使用一种或多种以下氨基酸或其任何组合进行修饰以具有增加的负电荷：天然存在的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；和/或非天然氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸的D立体异构体。
在一些实施方案中，调节缓冲液或溶液的pH以增加有效负载的电荷。例如，pH可低于或高于有效负载的等电点(pH(I))。有效负载将具有在低于有效负载的pH(I)的pH下的净正电荷和在高于其pH(I) 的pH下的净负电荷。
本发明的实施方式还可提供一个或多个以下特征。使细胞变形包括使细胞变形持续基本上或约1μs至10ms，例如10μs、50μs、100 μs、500μs，和750μs。培育进行持续0.0001秒至20分钟，例如基本上或约1秒、30秒、90秒、270秒，和900秒。
细胞通过微流体通道的压力和速度也可以变化。在一些实施方案中，基本上或约10-35psi的压力被用于使含有细胞的溶液通过微流体通道。可出于多种原因而调整速度，包括在维持高有效负载递送的同时提高所处理细胞的活力。在优选实施方案中，细胞以基本上或约以下的速度通过微流体通道：300mm/s、100-300mm/s、200-700mm/s、 250-400mm/s、1-1000mm/s、1m/s、2m/s、3m/s、4m/s、5m/s、6m/s、 7m/s、8m/s、9m/s、10m/s、0.01-5m/s、5-10m/s，或0.01-10m/s。在一些实施方案中，细胞以基本上或约100、170、300、100-300、 200-700、250-400、100-1000mm/s，或1-1000mm/s的速度通过电场。当细胞为多个细胞时，基本上或约80、85、90、91、92、93、94、 95、96、97、98、99、90-95，或80-100％的细胞在通过缩窄部和电场之后可为活的。
在一些实施方案中，细胞以0m/s的速度与电场接触。例如，所述场可通过其中细胞与电场接触的装置的区、区域或贮器。所述场可在断电之前打开一段时间。在此情况下，细胞不通过场，但场暴露仍为临时的。
细胞膜中的临时扰动的大小和持续时间可通过调整各种因素来修改，如细胞变形缩窄部的直径和细胞通过缩窄部的速度。关于本文所提供的扰动的大小和持续时间的公开不应解释为限制性的。扰动和恢复的非限制性说明提供于Sharei等人,(2014)Integr.Biol.,6, 470-475中，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，细胞膜的扰动可表征为基本上或约以下最大直径：1-20、1-600、4、5、 6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、 250、300、350、400、450、500，或600nm。在各个实施方案中，具有基本上或约1-20、1-600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、 18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、 500，或600nm的最大直径的细胞膜的扰动在细胞膜上持续至少基本上或约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或1-10分钟或更久(11、 13、15、18、20分钟或更久)。
在一些实施方案中，细胞可主要被流体流压缩。在一些实施方案中，所述直径小于细胞的直径。举例来说，缩窄部的直径可为细胞直径的基本上或约20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95，或20-99％。缩窄部的直径的非限制性实例包括基本上或约4、5、6、7、8、9、10、15、20 4-10μm，或10-20μm。缩窄部的不同长度也是可能的。缩窄部长度的非限制性实例包括基本上或约10、15、20、24、30、40、50、60、10-40、10-50、10-60，或10-40μm。
许多细胞的直径在5-20μm之间，例如，幼稚T细胞的直径为 7-8μm。例如，对于单细胞的处理，缩窄部的直径为4.5、5、5.5、6，或6.5μm。在另一实例中，用于处理人***的压缩部的尺寸/直径在60μm与80μm之间，但较大和较小缩窄部也是可能的(人***的直径为大约100μm)。在又一实例中，使用直径在12μm与17μm 之间的缩窄部处理胚胎(例如，2-3个细胞的簇)。在与幼稚T和B细胞有关的非限制性实例中，所述装置包括具有约10、15、20、25、30，或10-30μm的长度，约3、3.5、4，或3-4μm的宽度，约15、 20、25，或15-25μm的深度，和/或约5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15，或5-15度的角度的缩窄部。适用于将有效负载递送到免疫细胞中的微流体装置的实例描述于2015年10月30日提交的 PCT国际专利公布号PCT/US2015/058489,Delivery of Biomolecules to Immune Cells中，其以引用的方式整体并入本文。
所述装置和方法适用于使用专职抗原呈递细胞如树突细胞的疫苗开发和生产。例如，刺激抗原呈递的方法是通过以下操作来进行：使树突细胞经历受控制的损伤如短暂的缩窄或高剪切的脉冲并且使树突细胞与包含靶抗原的溶液接触。所述方法与先前的刺激方法相比产生高度活化的抗原呈递细胞。疫苗生产是通过以下操作进行：驱使树突细胞或其他抗原呈递细胞通过含有缩窄部的装置(由此使细胞经受快速拉伸事件)，然后在含有有效负载(例如抗原)的溶液中培育细胞。在细胞快速变形之后，将细胞孵育在含有一种或多种抗原(或编码一种或多种抗原的核酸)的细胞培养基中，但细胞可在快速变形事件/过程之前、期间，和/或之后与抗原接触。在一些实施方案中，DFE 被用于递送核酸如mRNA或DNA，其编码抗原或其他基因产物以便在细胞中产生基因产物。DFE还可用于递送DNA到细胞中以便生成 CAR-T细胞。
例如，编码嵌合抗原受体(CAR)的构建体可使用DFE递送给T 细胞。在一些实施方案中，CAR是细胞外识别结构域(例如，抗原结合结构域)、跨膜结构域，和一个或多个细胞内信号传导结构域的融合物。
在一些实施方案中，所述化合物为编码MHC复合体的核酸。在一些实施方案中，所述化合物为编码MHC I类或MHC II类复合体的核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码嵌合抗原受体，如嵌合T细胞受体。在一些实施方案中，所述核酸编码重组T细胞受体。举例来说，编码嵌合抗原受体的核酸以无病毒的方式(即，通过细胞挤压)被引入T细胞中以维持CAR-T的表达。例如，DNA的引入在不使用病毒粒子的情况下完成。然而，核酸构建体(例如质粒)可包括病毒基因组元件，其可有助于作为染色体外核酸的整合或维持。
在与DNA向细胞中的递送有关的一些实施方案中，DNA可包含具有整合元件的构建体，所述整合元件有助于核酸序列***到细胞的基因组中。
示例性核酸包括但不限于重组核酸、DNA、重组DNA、cDNA、基因组DNA、RNA、siRNA、mRNA、saRNA、miRNA、lncRNA、 tRNA，和shRNA。在一些实施方案中，所述核酸与细胞中的核酸同源。在一些实施方案中，所述核酸与细胞中的核酸异源。在一些实施方案中，所述核酸呈质粒形式。在一些实施方案中，所述核酸是治疗性核酸。在一些实施方案中，所述核酸编码治疗性多肽。
在一些实施方案中，核酸编码报道分子或可选择标记。示例性报道分子标记包括但不限于绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、发光蛋白、β-半乳糖苷酶、尿卟啉原(urogen)III甲基转移酶(UMT)，和荧光素酶。示例性可选择标记包括但不限于杀稻瘟菌素、G418/遗传霉素、潮霉素B、嘌呤霉素、吉欧霉素、腺嘌呤转磷酸核糖基酶，和胸苷激酶。
表面活性剂(例如0.1-10％w/w)任选地在流动缓冲液中使用(例如，泊洛沙姆、动物来源的血清、白蛋白)。分子向细胞中的递送不受表面活性剂存在的影响；然而，表面活性剂任选地用于减少手术期间装置的堵塞。
在一些方面中，所述装置是由硅、金属(例如不锈钢)、塑料(例如聚苯乙烯)、陶瓷，或适用于形成一个或多个适当尺寸的通道或导管的任何其他材料制成。在一些方面中，所述装置是由适用于蚀刻微米尺寸的特征的材料形成并且包括一个或多个细胞从其中通过的通道或导管。硅是特别适合的，因为微米图案化方法在用此材料时得到充分确立，因此更容易制造新型装置、改变设计等。另外，硅的刚度可提供与更柔性的衬底像聚二甲硅氧烷(PDMS)相比的优点，例如，更快的递送速率。举例来说，装置包括2、10、20、25、45、50 75、100个或更多个通道。装置是通过蚀刻硅来微制造。细胞通过施加压力移动(例如推动)通过通道或导管。细胞驱动器可施加压力。细胞驱动器可包括例如压力泵、气瓶、压缩机、真空泵、注射器、注射器泵、蠕动泵、手动注射器、移液管、活塞、毛细管作用，和重力。作为通道的替代，细胞可通过呈网状或紧密放置的板形式的缩窄部。在上述任一种情况下，细胞横穿过的缩窄部的宽度为有待在其未缩窄(即悬浮) 状态下处理的细胞的宽度或直径的20-99％。温度可影响组合物的摄取并影响活力。所述方法在室温(例如20℃)、生理温度(例如39℃)、高于生理温度，或低温(例如0.1℃)，或在这些示例性温度之间的温度 (例如0.1至40℃)下进行。
在一些实施方案中，在细胞经历缩窄、拉伸，和/或高剪切率的脉冲的受控制的损伤之后，将细胞在含有化合物或分子(希望将其引入细胞中)的递送溶液中培育。细胞可当在含有化合物或分子的溶液中时与场接触。受控制的损伤可表征为细胞膜中的小(例如直径200 nm)缺损。细胞的恢复期为大约几分钟以闭合由通过缩窄部所引起的损伤。递送期包括1-10分钟或更久，例如15、20、30、60分钟或更久，其中当在室温下操作时2-5分钟为最佳。
本发明的各种实施方式可提供一种或多种以下能力。递送的更大精度和可缩放性可在与先前技术相比时实现。材料向细胞的递送可为自动的。如蛋白质、RNA、siRNA、肽、DNA及不渗透的染料的材料可植入到细胞中，如胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)、原代细胞或永生化细胞系。所述装置和方法可以采用任何细胞类型，并且缩窄部的尺寸适于有待处理的细胞类型。所述装置和方法可提供显著的优点。例如，在当前***中的实验噪声当与先前技术相比时可为减少的。材料的递送量在细胞群体中可为一致的。细胞可单独处理，而非成批处理。本发明还证实了向胞质递送多种纳米颗粒和蛋白质的相当独特的机会。现有方法在执行所述功能时相当不可靠或效率低。
本发明的方法和装置将核酸比其他方法更快和更有效地递送到细胞以及亚细胞结构(例如，核和线粒体)。电穿孔导致DNA积聚并且在电脉冲期间与电渗透化的质膜相互作用，从而造成DNA聚集物内化到细胞质中并且积聚在细胞内的细胞膜附近(图12和图21)。DNA不能轻易仅经由扩散行进通过粘稠和复杂的细胞质而到达核。通过DFE使用电场向胞质和核(以及线粒体)中递送核酸是快速且有效的，同时维持了细胞活力，由此克服了电穿孔单独使用时的长期缺点。
本发明的各种实施方式还可提供一种或多种以下能力。DNA可递送到难以递送的细胞如干细胞、原代细胞、免疫细胞中。可实现极大质粒(甚至整个染色体)的递送。还可容易地实现向细胞中定量递送已知量的基因构建体以便研究所关注的基因的表达水平及其对浓度的敏感性。可实现已知量的DNA序列连同已知量的促进DNA重组的酶的递送以便完成较容易/更有效的稳定递送、同源重组，和位点特异性诱变。本文所述的方法和装置还可适用于定量递送RNA，以用于更有效/确凿的RNA研究。还容易实现小干扰RNA(siRNA)向细胞的胞质中的递送。
本发明的各种实施方式还可提供一种或多种以下能力。RNA可被递送到细胞中用于在不需要脂质体下的RNA沉默。已知量的RNA 分子连同已知量的dicer分子一起可被递送以在不同条件下在多个细胞系中获得标准化、有效的RNA。mRNA可被递送到细胞中以研究在转录后水平下基因表达调控的方面。所述方法还适用于递送一定量的RNA标记以研究RNA的半衰期以及在线粒体DNA的情况下使用基于RNA的干扰，例如miRNA和lncRNA。可实现通用的蛋白质递送。可递送已知量的标记蛋白质以研究其在细胞中的半衰期。可实现标记蛋白质的递送以研究蛋白质定位。可递送已知量的标记的蛋白质以研究在细胞环境中的蛋白质-蛋白质相互作用。可实现标记抗体向活细胞中的递送以用于免疫染色和基于荧光的蛋白质印迹。
本发明的各种实施方式还可提供一种或多种以下临床和研究能力。可实现药物向细胞模型的定量递送以用于提高筛选和剂量研究。所述方法可被部署为筛选胞质中的蛋白质活性的高通量方法以帮助鉴别蛋白质治疗剂或理解疾病机制。所述应用目前受到当前蛋白质递送方法的严重限制，因为它们的低效率。所述装置和技术适用于药物向循环血细胞的特定亚群(例如淋巴细胞)中的细胞内递送、糖向细胞中的高通量递送以改善细胞(特别是***)的低温保存、通过引入蛋白质、mRNA、DNA和/或生长因子进行的靶细胞分化、遗传或蛋白质材料的递送以诱发细胞重编程产生iPS细胞、DNA和/或重组酶向胚胎干细胞中的递送用于开发转基因干细胞系、DNA和/或重组酶向受精卵中的递送用于开发转基因生物体、DC细胞活化、iPSC生成，和干细胞分化、纳米颗粒递送用于诊断和/或机械研究以及量子点的引入。还使用本文所述的装置和方法修饰关于整形外科使用的皮肤细胞。
涉及为DFE使用电场的方法和装置特别适用于递送核酸及其他带电化合物。DFE在递送带电材料方面比细胞单独挤压显著更有效。参见，例如图12B和12C。
在本文所述的装置和方法的一些实施方案中，干细胞或祖细胞如诱导多能干细胞(iPSC)通过缩窄通道不诱导分化，但可靠地诱导组合物向细胞中的摄取。举例来说，分化因子被引入所述细胞中。在摄取引入的因子之后，细胞在由引入因子指定的分化途径上继续进行，而没有与借此一个或多个因子被引入细胞中的方法有关的并发症。
除单细胞之外，甚至极大的细胞，例如***；直径为大约200 μm，细胞簇，例如2-5个细胞簇，如包含2-3个细胞的胚胎，也被处理以吸收靶组合物。孔的尺寸相应地被调整，即，以使得缩窄部的宽度恰巧低于簇的尺寸。举例来说，通道的宽度为细胞簇宽度的 20-99％。
将细胞或细胞簇针对所需细胞类型进行纯化/分离或富集。用于所述方法中的树突细胞或其他细胞，例如免疫细胞，如巨噬细胞、B 细胞、T细胞，或干细胞如胚胎干细胞或iPS，可被纯化或富集。举例来说，细胞是借助于其细胞表面标记物的表达或其他鉴别特征来分离或富集。树突细胞是借助于其β-整合素、CD11c或其他鉴别细胞表面标记物的表达来鉴别和分离。就细胞而言，术语“分离”意指细胞基本上不含其他细胞类型或与其一起天然存在的细胞物质。例如，具体组织类型或表型的细胞样品当是细胞群体的至少60％时为“基本上纯的”。优选地，制剂是至少75％、更优选至少90％、且最优选至少99％或100％的细胞群体。通过任何合适的标准方法，例如通过荧光激活细胞分类术(FACS)测量纯度。
有效负载组合物如多核苷酸、多肽或其他试剂可被纯化和/或分离。具体来说，如本文所用，“分离的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽或蛋白质基本上不含其他细胞物质，或当通过重组技术产生时的培养基，或当以化学方法合成时的化学品前体或其他化学品。纯化的化合物是至少60重量％(干重)所关注的化合物。优选地，制剂是至少75重量％、更优选至少90重量％、且最优选至少99重量％所关注的化合物。例如，纯化的化合物是至少90重量％、91重量％、 92重量％、93重量％、94重量％、95重量％、98重量％、99重量％，或100重量％(w/w)所需化合物。通过任何合适的标准方法，例如通过柱色谱法、薄层色谱法，或高效液相色谱(HPLC)分析测量纯度。纯化的或分离的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))不含在其天然存在状态下侧接的基因或序列。分离的或纯化的核酸分子的实例包括：(a)DNA，其为天然存在的基因组DNA分子的一部分，但不被在其天然存在的生物体基因组中侧接分子的那个部分的两个核酸序列所侧接；(b)以使得所生成的分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不同的方式并入载体或原核生物或真核生物的基因组 DNA中的核酸；(c)单独的分子，如cDNA、基因组片段、通过聚合酶链反应(PCR)产生的片段，或限制片段；以及(d)重组核苷酸序列，其为杂合基因的一部分，即编码融合蛋白的基因。根据本发明的分离的核酸分子还包括合成产生的分子以及已在化学上改性和/或具有修饰的主链的任何核酸。
虽然一些应用需要纯度，但在其他应用中，使用本发明的方法和装置的递送使用化合物的非均匀混合物。在一些实施方案中，高纯度并不为有效递送所需。
悬浮液溶液是任何生理或细胞相容的(例如，其中细胞可在经历 DFE的同时存活或其中细胞增殖的缓冲液或溶液)缓冲液或溶液。举例来说，悬浮液溶液是细胞培养基或磷酸盐缓冲盐水。用于例如希拉细胞的合适的缓冲液的一个非限制性实例为25mM KCl、0.3mMKH2PO4、0.85mM K2HPO4、36mM肌醇，pH 7.2，克分子渗透压浓度为约90mOsm/L，和/或导电率在25℃下为约0.1-5mS/cm、0.1-4 mS/cm，例如约3.5mS/cm。此缓冲液可在保持其有效负载递送性能的同时变更或修改。例如，肌醇可以相同浓度的葡萄糖替换，但仍提供相似性能。缓冲液或溶液可基于许多因素和考虑来调整，如场的类型和强度、细胞类型，和所用的缩窄部。克分子渗透压浓度和导电率以及离子如钾和钙的存在或不存在可被调整。在某些实施方案中，溶液或缓冲液具有基本上或约1mS-10mS或0.5mS-15mS的导电率，和/或1-310或10-300mOsm/L的克分子渗透压浓度。在一些实施方案中，缓冲液的pH为基本上或约4-10、5-9、6-8、6.5-7.5，或7。在一些实施方案中，缓冲液为适用于电穿孔所处理的细胞类型的那种缓冲液。电穿孔合适的缓冲液可用于不管电场强度是否足以满足电穿孔的实施方案中。
可选择缩窄部的直径以诱发细胞膜足够大的临时扰动以便当有效负载由电场驱动穿过扰动时供所述有效负载通过。可使用本发明的微流体***递送的有效负载的非限制性实例包括：蛋白质(如抗体及其片段)；小分子；碳水化合物；糖；生物、合成、有机，或无机分子的聚合物；脱氧核糖核酸(DNA)；核糖核酸(RNA)(如短干扰RNA、发夹RNA、重复相关的短干扰RNA、微小RNA、自扩增的RNA及 mRNA分子)；包含增加DNA或RNA体内或体外的稳定性或半衰期的修饰的核苷酸的DNA或RNA；肽核酸(PNA)；甲基化的DNA；天然存在的染色体或其一部分；和/或表达载体，如质粒。在一些实施方案中，有效负载包括不同化合物的混合物，例如，以下一种或多种的混合物：蛋白质、小分子、碳水化合物、糖、聚合物、DNA、RNA、修饰的或甲基化的DNA或RNA、PNA、天然存在的染色体或其部分，和/或表达载体，如质粒。在一些实施方案中，DNA分子为单链、双链、环形、线性，或超螺旋的。在涉及双链线性DNA的实施方案中，DNA可具有例如平末端或一个或多个核酸的或5’或3’突出端。小分子可为例如尺寸小于1kDa的有机化合物。在一些实施方案中，有效负载为带电的，且在其他实施方案中，有效负载为不带电的。不希望受任何科学理论的约束，不带电以及带电分子可使用本文所提供的方法和***来递送，这是因为由电场所引起的流体流作为与场相互作用的盐。
在其中有效负载递送给真核细胞的实施方案中，有效负载可被驱动到细胞的胞质、细胞器(如线粒体)，和/或核中。举例来说，有效负载在细胞通过电场的同时，或在细胞通过电场之后小于基本上或约 0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5，或4小时被驱动到细胞核中。在涉及有效负载向多个细胞中递送的实施方案中，至少基本上或约10、 20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、 95、99、100、0-65，或10-100％的所述多个细胞在所述多个细胞通过电场之后基本上或约0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、0.1-4，或0.1-48小时内表达DNA。
在一些实施方案中，细胞为原核细胞。原核细胞的非限制性实例包括细菌细胞(例如，革兰氏阳性、革兰氏阴性、致病、非致病、共生、球菌、杆菌，和/或螺旋形细菌细胞)和古细菌细胞。在其他实施方案中，细胞为真核细胞。真核细胞的非限制性实例包括原生动物、海藻、真菌、酵母、植物、动物、脊椎动物、无脊椎动物、节肢动物、哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物，和人细胞。细胞可为例如单细胞机体或多细胞机体的细胞。细胞可为例如原代真核细胞或永生化真核细胞。在一些实施方案中，细胞为癌细胞。在某些实施方案中，细胞不为人细胞。在各个实施方案中，细胞可在两种或更多种细胞类型的混合物中或者多个细胞可为两种或更多种细胞类型的混合物。细胞类型的混合物可为多个细胞类型(如两种或更多种本文所公开的那些细胞类型)的共培养物或一起天然存在于如全血中的细胞类型的混合物。
在一些实施方案中，细胞是外周血单核细胞。在各个实施方案中，细胞悬液包含纯化的细胞群。在某些实施方案中，细胞是原代细胞或细胞系细胞。
在一些实施方案中，细胞是血细胞。在一些实施方案中，血细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是淋巴细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞 (DC)、NKT细胞、肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞，或中性粒细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是适应性免疫细胞，如T细胞和B细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是先天性免疫细胞。示例性先天性免疫细胞包括先天性淋巴样细胞 (ILC1、ILC2或ILC3)、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、 NK细胞、中性粒细胞，和单核细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是记忆细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是原代人T细胞。在一些实施方案中，细胞是小鼠、狗、猫、马、大鼠、山羊、猴或兔细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。在一些实施方案中，细胞悬液包含非哺乳动物细胞群。在一些实施方案中，细胞是鸡、蛙、昆虫或线虫细胞。涉及细胞的本发明的方面也适用于血小板。因此，本文对于“细胞”的提及同样可适用于血小板。
在一些实施方案中，微流体通道具有单个细胞变形缩窄部(即，不超过一个)。在其他实施方案中，微流体通道具有多个串联的细胞变形缩窄部。
在各个实施方案中，细胞在离开细胞变形缩窄部之后基本上或约 0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、0.001-0.005、0.0001-10、0.0001-20、0.0001-30秒或更久(例如，约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.1-10、1-15、or 1-15 分钟或更久)，或在离开细胞变形缩窄部之后约0.0001、0.001、0.002、 0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005、 0.0001-10、0.0001-20、0.0001-30秒或约0.5、1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、0.1-10、1-15，或1-15分钟内与电场接触。应当理解，电极与缩窄部之间的距离可根据如细胞行进的速度等因素而变化。
在一些实施方案中，细胞变形缩窄事件诱导足够大的细胞膜的临时扰动供有效负载通过。在一些方面中，至少一个电极接近于细胞变形缩窄部以使得在细胞膜上存在临时扰动的同时细胞暴露于电场。“接近”于细胞变形缩窄部的距离的非限制性实例为基本上或约0.1、 0.5、1、2、3、4、5、0.1-5cm、1-10、1-100，或1-1000cm。
如上所述的任何方法是在体外、离体或体内进行。对于体内应用，装置可被植入血管管腔中，例如管道支架。本发明的这些及其他能力，连同本发明本身一起，将在回顾以下附图、详细说明及权利要求之后得到更充分理解。
本发明的方面提供一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞中的方法。在优选实施方案中，所述方法包括使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以使得压力被施加于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供表达载体通过。细胞可在其离开细胞变形缩窄部之前、期间和/或之后与电场、磁场或声场接触。
在一些实施方案中，转基因在细胞中的表达早于在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中。举例来说，转基因可早于在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小时在细胞中表达。
在各个实施方案中，细胞中的最大限度转基因表达以比在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的最大限度转基因表达更快的速率完成。举例来说，细胞中的最大限度转基因表达可早于在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的最大限度转基因表达0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、 4，或0.1-4小时完成。
在某些实施方案中，转基因在细胞中以与在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的转基因表达相比更大的程度表达。举例来说，细胞中的转基因表达可比在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的转基因表达多至少基本上或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5倍、8倍、10 倍、20倍或更大倍数。
本发明的方面还涉及一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞群体中的方法。在优选实施方案中，所述方法包括使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞扰动供表达载体通过。在离开细胞变形缩窄部之前、期间或之后，细胞可与电场、磁场或声场接触。
在一些实施方案中，在群体中表达转基因的细胞的比例大于在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达转基因的细胞的比例。举例来说，在群体中表达转基因的细胞的比例可比在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达转基因的细胞的比例大至少基本上或约5、10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更大倍数。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后基本上或约0.1、1.5、 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小时内，细胞中的转基因表达可比在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的转基因表达多至少基本上或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或为2 倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更大倍数。
在某些实施方案中，在群体中表达高水平的转基因的细胞的比例大于在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达高水平的转基因的细胞的比例。例如，在群体中表达高水平的转基因的细胞的比例比在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达转基因的细胞比例大至少基本上或约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、 75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20 倍或更大倍数。在一些实施方案中，“高水平”的转基因表达是比通过电场、磁场或声场而不通过细胞变形缩窄部的细胞中的平均转基因表达水平高50％的细胞中的表达水平。用于测定转基因表达水平的方法的非限制性实例包括定量聚合酶链反应(qPCR)测定、RNA印迹、蛋白质印迹，和基于微阵列的测定。
本文所公开的每个实施方案预期可应用于每个其他所公开的实施方案。因此，本文所述的各种要素的所有组合都在本发明的范围内。
还描述了相关装置、***、技术和制品。
本文所述的主题的一个或多个变动的细节在附图及以下描述中阐述。本文所述的主题的其他特征和优点将从描述、附图以及权利要求书中显而易见。
附图简述
图1为用于向细胞递送有效负载如DNA或RNA以用于遗传工程的微流体装置的一个示例性实施方式的图像。
图2为图1中示出的电极的一个替代实施方式。电极中的偏置有利于细胞向电场的暴露，不管当其流过时处于通道中的何处。
图3为示出了例如被驱动通过微流体***以递送有效负载DNA 的细胞的DNA转染率的条形图。DFE 10-6表示DFE装置的缩窄部尺寸，第一数字对应于缩窄部长度，而第二数字对应于宽度(以微米计)。
图4为示出了细胞活力的条形图。
图5为示出了DNA转染和活力的线图。
图6为示出了在处理之前对这种缓冲液的暴露时间是如何影响 DNA递送和细胞活力的条形图。
图7为示出了当细胞速度增加时细胞活力也提高的线图。
图8A为示出了单个缩窄通道的微流体***的一个实施方案的示意图。
图8B为描绘深度、宽度和长度的微流体***的单个缩窄通道的直观图。
图9A-9C为装置结构和工作机制的描绘。(图9A)示出了工作机制的示意图：细胞的机械破坏在当细胞通过缩窄部时在质膜上生成孔洞。以下电脉冲驱动DNA通过孔洞进入胞质和核中。(图9B)一组相同的平行微流体缩窄部被蚀刻到硅晶片上，且一组电极沉积在Pyrex 晶片上。(图9C)由硅晶片和Pyrex层键合的完成的装置的光学图像。装置制造的更多细节可见于图13中。
图10A和10B为示出了取决于电脉冲的转染性能的条形图。处理之后24h的DNA转染效率(图10A)和细胞活力(图10B)，其随所施加的电场振幅而变化。电转染之前机械破坏的引入显著地增强DNA 转染，而对细胞活力造成可忽略的损害。碘化丙啶染色之后，通过流式细胞术测量GFP质粒DNA转染效率和细胞活力。如图10A所示，与电泳相比在每个场强度下实现更多的DNA表达，表明与电泳相比，较低的能量水平为电场DFE所需。所有数据点一式三份收集并且误差线代表2SD。X轴单位为伏特/60um。1V/60um相当于约0.1667 kV/cm。
图11A-11C为示出了来自使用不同方法向希拉细胞进行质粒 DNA转染的比较研究的结果的图。(图11A)GFP表达效率随处理后的时间而变化。效率被定义为在处理之后表达GFP的细胞对比总的活细胞。10-7芯片被用于挤压及破环和场实现的递送(DFE)。如本文所用，装置尺寸是由一系列指示长度和宽度(例如，10-7表示具有长度 10μm和宽度7μm的单个缩窄部的装置)的数字表示。在200Hz频率下的0.1ms/10v脉冲被用于EP和ME(微流体(无缩窄部)+电场)，且 15ms/15000v的单脉冲被用于BEP。(图11B)通过在处理后的不同时间点下测量差异的GFP表达来分析DNA表达的动态。超过80％的转染细胞在显微注射和DFE中处理之后1h内表达GFP。相比之下，在处理之后4至48h，在ME(60％)、BEP(70％)和LP2000(95％)中的大多数转染细胞表达GFP。同样示出了在每种方法的每次处理中的希拉细胞数目，指示了每种技术的通量(图11C)。每个数据点一式三份进行，并且误差线代表2SD。
图12A-12C是显示荧光标记的质粒DNA(LDNA)向希拉细胞递送的目测的图片。在核和质膜染色之后，将细胞在转染之前与Cy3 标记的质粒DNA混合。处理之后，将细胞用OPTIMEM洗涤，用细胞固定试剂盒固定，并且准备好共焦成像。(图12A)在BEP中，当细胞以500mm/s的速度(当细胞通过缩窄部时)流过芯片时在10V下施加0.1ms(200Hz)的电脉冲。DNA积聚见于质膜上。(图12B)仅仅通过细胞挤压，几乎没有或没有LDNA信号见于细胞中，在500mm/s的细胞速度下使用10-7芯片。(图12C)在DFE中，观察到充满胞质和核的显著Cy3荧光。在500mm/s的细胞速度下使用10-7芯片，其中在10V下施加0.1ms(200Hz)的电脉冲。
图13为示例性装置制造工艺的图解。(图13a-d)在Pyrex层上的电极制造包括金属沉积工艺和后续剥离工艺。(图13e-h)在硅晶片上的微通道制造使用两次光刻和DRIE工艺。(i)硅衬底与Pyrex层之间的键合。
图14为示出了取决于细胞速度的递送性能的线图。在处理之后 24小时测量3K Da葡聚糖的递送效率、DNA转染效率，和细胞活力。使用10-8芯片和在10V下0.1ms(200Hz)的电脉冲。DNA转染的收率为接近300mm/s的细胞速度的最大值。
图15A和15B示出了希拉细胞的荧光图像。(图15A)通过DFE、 BEP和LP2000的GFP质粒DNA的表达的比较。细胞的荧光显微镜图像显示GFP表达在DFE中比BEP和LP2000更快的出现。(图15B) 示出了包括8小时时间点的DFE与BEP的比较。
图16为示出了在使用DFE和NEON(BEP)处理后的不同时间下的GFP荧光强度分布的直方图。在处理后的不同时间点下通过流式细胞术测量的希拉细胞的GFP荧光强度分布示于直方图中。结果表明在DFE中，DNA转录在递送后立即出现，而在BEP中，DNA的细胞内转运需要几个小时。细胞在DFE处理之后立即开始表达GFP，而在电穿孔中，处理之后需要花费超过4小时来转录DNA。DFE的平均荧光强度似乎高于BEP的。表达细胞的直方图对于DFE比对于NEON更多地右移，这表明甚至在24小时处的更多蛋白质表达。
图17示出了24h之后的mESC的GFP DNA表达。荧光显微镜图像示出了在GFP DNA质粒的DFE递送之后24小时小鼠胚胎干细胞(mESC)中的GFP表达。
图18为示出了向细胞中共递送DNA、mRNA及蛋白质(IgG2)的线图。此图示出了当共递送时在不同振幅下每种材料的递送效率。y 轴为表达/递送％。因此对于mRNA和DNA，其为表达％，而对于IgG2，其为递送％。
图19示出了本发明的示例性装置。
图20为采用装置参数的非限制性实例的草图。
图21A-21C为示出了使用(A)电穿孔、(B)单独的细胞挤压，和(C) DFE递送的DNA的分布的草图。也参见图12A-12C。如图12A中所示且如图21A中所描绘，通过电穿孔递送的DNA积聚在质膜上。图 12B(图21B中所示)示出了单独用细胞挤压的低或无DNA递送。然而，图12C(图21C 中所描绘)显示了使用DFE时遍及细胞的DNA递送的快速和显著增加。
在各附图中，相同的参考符号代表相同的部件。
发明详述
大分子如DNA和RNA的细胞内递送为许多治疗和研究应用中的关键步骤。基因递送可通过病毒介导的、化学、电及机械转染完成。基于病毒载体的方法对于某些应用可有效，但其常常具有染色体整合的风险并且具有体内使用的安全风险。靶分子的化学修饰还可促进膜穿孔或胞内递送，但这些方法常受到靶分子的结构和靶细胞类型的限制。显微注射具有低通量。电穿孔显示出对于先前难以转染的细胞来说在DNA和RNA递送应用中的效力。然而，此方法可引起细胞死亡和敏感材料如量子点的损伤，这归因于高强度电场。缩窄部微流体平台可产生暂时的细胞膜破环，这促进了大多数材料向几乎任何细胞类型的胞质中的被动扩散。所述递送平台具有高通量、不依赖于外源性材料或场、以及高细胞活力的优点。示例性膜破坏递送平台描述于 2014年9月25日公开的美国专利公布号2014/0287509中，其内容以引用的方式明确地整体并入本文。然而，与电场的耦合实现了响应于质粒DNA的递送对基因表达的诱导。本主题包括可向任何细胞类型中递送任何功能性靶分子的细胞内递送技术和平台。
当前主题包括高通量、无载体的微流体装置以供使用机械临时细胞膜破环和电场细胞内递送DNA。
图1为用于向细胞递送有效负载如DNA或RNA(以用于基因工程)的微流体装置100的示例性实施方式的图像。微流体装置100包括一个或多个缩窄通道105和至少一个电极110用于产生电场。所述至少一个电极110可包括一对具有不同尺寸的电极。缩窄通道105在左边示出，并且被调整尺寸以便在细胞通过通道105的缩窄点107处时压缩细胞。当细胞通过具有小于细胞直径的最小尺寸的缩窄点107 时，所述细胞经历快速的机械变形，这造成了孔洞的暂时膜破环。
来自周围介质的分子可随后通过这些孔洞扩散到细胞胞质中。在通过缩窄点107之后，细胞进入由安置在缩窄点107下游的电极110 产生的电场，其中有效负载如DNA通过由电场产生的电泳效应被驱动到细胞中。如果有效负载带电，那么有效负载可直接被驱动，而如果有效负载不带电，那么有效负载可例如通过将有效负载悬浮在具有带电组分(例如盐)的缓冲液中被间接驱动，所述带电组分可当在由电场产生的电泳效应下时用于驱动有效负载。电极110示于图1的右侧。
图2为图1中示出的电极110的替代实施方式。电极的宽度和电极之间的间隔都是50μm。电极的长度为8mm。在一个实施方式中，取决于具体的设计和应用，这种尺寸的范围可在100nm至10cm内。图2中电极的移位设计帮助每个细胞通过有待暴露于电场的通道，从而得到更高的DNA转染效力。在其当前的实施方式中，金电极在平面中的玻璃侧(顶部)。然而，电极可在硅层(底部)或这两层(顶部和底部)上实施。电流电极配置(图2)是由一系列直电极组成，所述直电极更改了通道半途中的位置以确保在以下流体通道中通过的任何细胞暴露于场，即，如果细胞直接在电极下行进，那么在移位之后，其现将安置在两个电极之间且因此暴露于场。此考虑之所以重要是因为其确保了大多数(至少20、50、75、80、85、90、95、99％或更多)或所有细胞暴露于电场。位差角可在1-90度的范围内，其可在沿电极长度的任一点处，例如，在中间点处(如图2所示)或在介于电极之间距离的5、10、20、25、35、50、60、75、80、85、90、95％或更长的点处。还可垂直于细胞流在对角线角度(在1-90度的范围内)上实施电极。
微流体平台可通过使用深反应离子蚀刻将微流体通道蚀刻到硅晶片中制成。可使用光刻法和剥离将电极沉积在Pyrex晶片上。然后，那两个晶片可键合在一起以密封微流体通道，例如通过阳极或另一键合手段。在一些实例中，电极位于顶(例如玻璃)板/晶片(即，不存在于底部(硅晶片)上；或者，电极位于底板(不存在于顶板/晶片)上。在一些实施方案中，电极位于装置的两侧，例如在顶和底板或晶片上或中。图2中的水平线描绘了连接到负垫片或正垫片(图中的矩形)上的电极。在此配置中，细胞在位于玻璃晶片中的电极下面从左流到右。为了确保每个细胞都暴露于电场，电极在电极配置中的一点(例如，电极的灰色部分)处偏置。例如，如图2所示，偏置是在约1-90°，例如20-80°，例如约45°的角度处。以此方式，沿直线流过微流体装置的细胞将在其横穿微流体通道长度的至少一部分期间遇到电场。
电场可为例如0.1kV/m-2000kV/m、10-2000kV/m或0.1 kV/m-100MV/m、优选在50-500kV/m下。另外，细胞可暴露于电场持续已知的时间。脉冲宽度1ns-1s和周期100ns–10s是一个实例。优选地，在0.05-0.5ms脉冲宽度和1-20ms周期下。递送所需的电场强度可低于常规的电穿孔。因此，对于固定的递送效率，当前主题可需要比电穿孔低的电场强度。如图3所示，使用本发明方法的DNA 转染效率优于在不同场强度下的电穿孔，表明与电穿孔单独相比，较低的场强度可用于获得相同类似或更大的转染效率。
电穿孔涉及脉冲强度和脉冲宽度的组合。举例来说，在
Figure BDA0001293450560000301
转染***中，脉冲通常为0.3-1kV.cm，其中脉冲宽度为5ms-50ms。在包括电场的一些实施方案中，电场强度类似于用于电穿孔的强度，但脉冲宽度比用于电穿孔的低得多。较低脉冲宽度的使用造成细胞对能量的较低暴露，和更高活力。另外且尽管有较低能量暴露，DNA 仍被递送到核(及细胞的其他区域)且与电穿孔单独相比更快速地表达。
在示例性操作中，细胞可在恒压(5psi-100psi)下被驱动通过缩窄部通道105。然后细胞与由函数发生器驱动的脉冲电场接触。在一个实例中，集成电路用于提供电信号以驱动电极。Cascade Blue标记的 3-kDa葡聚糖分子的递送效率和表达绿色荧光蛋白(GFP)的质粒DNA 的表达是通过流式细胞术来表征以评估性能。结果显示对于3K葡聚糖70％的递送效率和对于DNA转染63％，而细胞活力保持在90％。小分子和大分子两者的这种同时递送对于其他技术是难题。
本文所述的主题可提供许多优点。例如，基因表达可被极大地增加。在一个实施方式中，在仅有缩窄部的装置中的基因表达小于5％并且可通过包括电场而增至63％。在一些实施方案中，在仅有缩窄部的装置中的基因表达小于约1、2、3、4，或5％并且通过将挤压的细胞暴露于电场而增至60-100或65、70、75、80、85、90、95，或100％。包括细胞变形缩窄部和电极两者的装置对于不同类型的有效负载递送是有利的。例如，所述装置借助于暴露于缩窄部然后是电场将相对较大和较小的分子在穿过装置的过程或通道中都有效地递送到细胞中。例如，所述***特别适用于递送编码基因产物的核酸(例如质粒 DNA)到细胞中并到核中以实现递送基因的表达。例如，在通过细胞变形缩窄部之后细胞对电场的暴露促进质粒进入核中。此方法也可实现各种材料(如蛋白质和核酸)的同时递送。细胞变形要素将促进外膜的破环以便于胞质蛋白质递送，而电场促进潜在的核破坏并且实现材料向细胞中的电泳流。
图3为示出了例如被驱动通过微流体***100以递送有效负载 DNA并在培育24小时之后的细胞的DNA转染率的条形图300。每个细胞通过电场所花费的时间为36mS并且脉冲电信号在5mS的周期下具有0.1mS的持续时间。在处理之前将细胞悬浮于hypoosmolar 缓冲液中，然后注射穿过微流体芯片以便挤压和通过电场。然后收集细胞并等待3分钟，之后添加到培养基中。在24小时培育之后使用荧光激活细胞分类术(FACS)分析DNA转染。图3中所示的结果显示细胞挤压显著地增强通过电场期间的DNA转染。
图4为示出了细胞活力的条形图400。每个细胞通过电场所花费的时间为36mS；脉冲电信号在5mS的周期下具有0.1mS的持续时间；在处理之前将细胞悬浮于hypoosmolar缓冲液中，然后注射穿过微流体芯片以便挤压和通过电场。然后收集细胞并等待3分钟，之后添加到培养基中。在24小时培育之后使用FACS分析DNA转染。结果显示细胞挤压显著地增强通过电场期间的DNA转染。
图5为示出了DNA转染和活力的线图500。每个细胞通过电场所花费的时间为24mS；脉冲电信号在5mS的周期下具有0.1mS的持续时间；使用10-8X芯片。在处理之前将细胞悬浮于低渗透的缓冲液中并且与GFP-DNA质粒和3K Da葡聚糖混合，然后注射穿过微流体芯片以便挤压和通过电场。然后收集细胞并且(虚线)等待3分钟，之后或立即(实线)添加到培养基中。在24小时培育之后使用FACS 分析DNA转染。
图6是示出了在处理之前对这种缓冲液的暴露时间是如何影响 DNA递送和细胞活力的条形图600。每个细胞通过电场所花费的时间为24mS；脉冲电信号在5mS的周期下具有0.1mS的持续时间；使用10-8X芯片。将细胞悬浮于低渗透的缓冲液中并且与gfpDNA质粒和3K Da葡聚糖混合。确定了至多40分钟的暴露时间，如图6中所示。然后收集细胞并立即(实线)添加到培养基中。在24小时培育之后使用FACS分析DNA转染。
图7为示出了当细胞速度增加时细胞活力也提高的线图700，这意味着电场主要用于细胞活力的减小。每个细胞通过电场所花费的时间为24mS；脉冲电信号在10mS的周期下具有0.1mS的持续时间；使用10-7X芯片。递送性能取决于细胞速度，细胞速度受到所施加压力的控制。将细胞悬浮于低渗透的缓冲液中并且与gfpDNA质粒混合；处理之后，细胞被立即添加到培养基中。在更高的速度下，膜的破环更严重，但场暴露可减少。
图8A为示出了单个缩窄部通道105的微流体***的一个实施方案的示意图。图8B为描绘深度、宽度和长度的微流体***的单个缩窄部通道105的直观图。细胞通过缩窄点107，该缩窄点在细胞膜中引入暂时的膜破环(例如孔洞)。细胞行进穿过由两个电极110产生胞质电场并且将有效负载如DNA递送到细胞胞质。
一般定义和一般技术
除非另外明确定义，本文所用的所有技术和科学术语将具有与本领域(例如，在细胞培养、分子遗传学及生物化学中)普通技术人员通常所理解的相同含义。
虽然上面已经详细描述了几个变化形式，但其他修改或添加也是可能的。例如，本主题不限于DNA和RNA，但可以高通量递送广泛多种材料(包括纳米颗粒、蛋白质、量子点及DNA)到几乎任何种类的细胞类型中。在某些实施方案中，DNA或RNA可合并修饰的核苷酸，如具有对核糖主链中的2′-OH基团的化学修饰的那些核苷酸，如2′-O- 甲基(2′OMe)、2′-氟(2′F)取代；以及含有2′OMe，或2′F，或2′-脱氧，或“锁定核酸”(LNA)修饰的那些核苷酸。
在本文的描述和权利要求书中，短语如“至少一种”或“一种或多种”可在要素或特征的联合列表之后出现。术语“和/或”也可在两种或更多种要素或特征的列表中出现。除非另外隐含地或明确地与使用其的上下文相矛盾，所述短语意图指的是单独的任何所列要素或特征或以与任何其他所述要素或特征组合的任何所述要素或特征。例如，短语“A和B中的至少一个”；“一个或多个A和B”；“A 和/或B”各自意图指的是“A单独、B单独，或A和B一起”。类似的说明也意图是包括三个或更多个物品的列表。举例来说，短语“A、B和C中的至少一个”；“一个或多个A、B和C”；以及“A、 B和/或C”各自意图指的是“A单独、B单独、C单独、A和B一起、 A和C一起、B和C一起，或A和B和C一起”。另外，在本文和权利要求书中术语“基于”的使用意图指的是“至少部分基于”，以便未提及的特征或要素也是允许的。
除非上下文需要更有限的范围，如本文所用的术语“约”和“基本上”在数值或范围的上下文中意指所述或所要求的数值或范围的± 10％。
如本文所用，“占空比”意指脉冲持续时间在脉冲周期内的比率。
在其广义上来说，“破坏和场实现的递送”或“DFE”意指挤压和与能量场接触的组合以便将有效负载递送到细胞中。
术语“质膜”与“细胞膜”在本文中可互换使用，并且是指将细胞内部与细胞外的环境分隔开的半透膜。
如本文所用，“表达载体”是能够实现一个或多个多核苷酸的表达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体还能够在宿主细胞内复制。表达载体可为原核细胞或真核生物的，且通常是质粒。本发明的表达载体包括在本发明的宿主细胞中发挥作用(即，指导基因表达)的任何载体，包括在本文所述的原核细胞或真核细胞的一个中的例如革兰氏阳性、革兰氏阴性、致病、非致病、共生、球菌、杆菌或螺旋形细菌细胞；古细菌细胞；或原生动物、海藻、真菌、酵母、植物、动物、脊椎动物、无脊椎动物、节肢动物、哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物或人类细胞。本发明的表达载体含有调控序列，如转录控制序列、翻译控制序列、复制起点，和与宿主细胞相容并且控制多核苷酸表达的其他调控序列。具体说来，本发明的表达载体包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录的起始、延伸，和终止的序列。特别重要的转录控制序列是控制转录起始的那些序列，如启动子、增强子、操纵子和阻抑子序列。合适的转录控制序列包括可在本发明的至少一个细胞中发挥作用的任何转录控制序列。多种这类转录控制序列为本领域技术人员所知。在优选实施方案中，所述方法不包括病毒载体如腺病毒递送核酸分子或构建体的使用。
应理解当提供参数范围时，本发明还提供在那个范围内的全部整数及其十分位。举例来说，“0.2-5mg”是0.2mg、0.3mg、0.4mg、 0.5mg、0.6mg等至5.0mg的公开。
本发明的实施方案提供以下技术：向细胞施加受控制的变形持续预定量的时间以便在细胞膜中引起扰动，从而可将材料递送到细胞内部。所述变形可由例如压力引起，该压力是由机械应力或剪切力诱导。在一个实例中，微流体***包括通过将流体在几何上限制在小规模 (例如，亚毫升体积，如微升、纳升，或皮升)来控制和/或操纵流体的结构。微流体***能够将实际上任何有效负载细胞内递送到细胞中。所述***是由一个或多个微流体通道组成，所述微流体通道具有细胞从其中通过的缩窄部。优选地，细胞流过悬浮于液体介质中的微流体通道，所述液体介质被压力驱动通过***。当细胞通过缩窄部时，其膜受到扰动，从而在膜中引起临时破环并且造成存在于周围介质中的有效负载的摄取。缩窄部随靶细胞的大小而变化，但优选与细胞直径处于相同数量级或小于细胞直径。多个缩窄部可平行和/或串联放置。细胞中的扰动是在细胞中的突破，从而允许材料从细胞外部移动到细胞中(例如，经由孔洞、破口、腔洞、孔口、孔隙、裂口、间隙、穿孔)。由本文所述的方法制造的扰动(例如间隙或孔洞)不是由于蛋白质亚基的装配以形成多聚孔结构(如由补体或细菌溶血素所生成的结构) 而形成。其他实施方案在所描述主题的范围内。
除非另外隐含地或明确地与使用其的上下文相矛盾，对细胞“挤压(squeeze)”、“挤压(squeezing)”、“变形”等的提及是指用于以极低细胞毒性将大分子直接递送到细胞胞质中的过程。此方法的基本原理是通过靶细胞的快速机械变形或挤压造成的临时膜破环，这允许经由扩散摄取在流体介质中的大分子，且随后进行细胞膜修复(参见，例如2014年9月25日公开的美国专利公布号2014/0287509，和2015 年10月30日提交的PCT国际专利公布号PCT/US2015/058489，其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
线粒体疾病
线粒体疾病是由功能障碍的线粒体造成。线粒体疾病可例如由在线粒体DNA(mtDNA)或编码线粒体组分的核基因中的获得性或遗传性突变引起。疾病也可以是获得性线粒体功能障碍的结果，这归因于药物的副作用、感染，或其他环境原因。线粒体疾病的实例包括线粒体肌病；糖尿病肾病；一些形式的糖尿病和耳聋(DAD)；Leber遗传性视神经病变(LHON)；Leigh综合征；神经病、共济失调、色素性视网膜炎，和上睑下垂(NARP)；肌神经源性胃肠脑病(MNGIE)；具有破碎红纤维的肌阵挛性癫痫(MERRF)；线粒体肌病、脑肌病、乳酸性酸中毒、中风样症状(MELAS)；以及线粒体神经消化道脑肌病 (MNGIE)。
向线粒体中递送化合物是特别困难且无法预见的。线粒体存在于细胞内并且还具有其自己的外(和内)膜。对于线粒体疾病的治疗选择以及用于在活细胞中改变线粒体功能或标记线粒体的工具是有限的 (Marriage等人,J Am Diet Assoc(2003)103(8):1029–38；Kolesnikova 等人,Hum.Mol.Genet.(2004)13(20):2519-2534)。
本发明的方面涉及用于预防或治疗线粒体疾病的方法，所述方法包括向线粒体递送化合物(如核酸)。在一些实施方案中，使用本文所述的装置和/或方法将核酸构建体递送到含有功能障碍线粒体的受精或未受精的卵中。在其他实施方案中，核酸构建体被递送到从受试者血液获得并含有功能障碍线粒体的循环细胞(如免疫细胞)。递送给具有功能障碍线粒体的细胞的构建体可例如含有表达线粒体蛋白的重组基因，所述线粒体蛋白在功能障碍的线粒体中不产生、在缺乏的水平下产生，或有缺陷。如图21所示，使用DFE递送的核酸到达核和线粒体两者。在优选实施方案中，核酸被直接递送到细胞中的功能障碍的线粒体。
本发明的方面还涉及递送化合物用于研究线粒体疾病和/或功能。举例来说，可使用本文所述的装置和方法将抗体、有机分子，或调节线粒体功能和/或标记线粒体的其他化合物递送到细胞。
电场
本发明的方面涉及，与标准或先前描述的电穿孔参数相比，较低电场强度的使用或对于电场的较短暴露。已经报告了针对众多细胞类型的电穿孔参数。参见，例如在www.thermofisher.com/us/en/home/lif e-science/cell-culture/transfection/transfection---selection-misc/neon-tran sfection-system/neon-protocols-cell-line-data.html处关于
Figure BDA0001293450560000361
转染***获得的信息。也参见Kim等人,(2008)BiosensBioelectron,23(9): 1353-1360，其内容以引用的方式整体并入本文。举例来说，
Figure BDA0001293450560000362
转染***可使用0.3-1kv/cm的电场，其中脉冲持续时间为5ms-50 ms。
Figure BDA0001293450560000371
转染***的示例性电穿孔参数也提供于下表中。
人细胞类型的电穿孔参数
Figure BDA0001293450560000372
Figure BDA0001293450560000381
用于驱动化合物和组合物到细胞中的场
与标准或先前公开的电穿孔***相比，DFE产生了更有效且更快速的核酸递送(及后续功能，例如，编码基因产物的表达)，伴有增强的细胞活力。本发明提供了方法、***和装置，其中能量场如电场驱动有效负载通过由细胞变形缩窄部所引起的细胞膜中的扰动或驱动有效负载从细胞中的一个位置到另一位置，例如从接近细胞膜处到一个或多个细胞器。虽然一些示例性实施方式使用电场，但其他驱动机构也是适用的。举例来说，一个或多个电场、磁场和声场可充当驱动机构。
如本文所用，电极是指可被配置为具有电荷并产生电场的任何电导体。一些实施方式可包括产生电场和/或磁场的交替方法和/或结构。
在本发明的一些实施方案中，电场被用于驱动有效负载到细胞中。应当理解，电力工程领域的技术人员将通晓多种产生电场的方式。电场的实例在发明概述的通篇提供；然而，这些描述都不应视为限制性的。例如，电场可由电极或除电极以外的手段产生。恒定或脉冲电场预期在本发明的实施方案中使用。电场可为恒定或脉冲直流电。
在本发明的其他实施方案中，磁场被用于驱动有效负载到细胞中。可产生磁场以便当细胞移动通过磁场时向细胞的有效负载施加力。磁场可例如由电磁体产生，电磁体可包括缠绕在铁芯周围的绝缘电线线圈。磁场还可由永久磁体(例如来自铁磁材料)产生。
在磁转染中，磁场可将磁性粒子集中在细胞表面上以增强胞吞样过程以供细胞内递送。在优选实施方案中，磁场的强度低于磁转染所必需的。在涉及磁场的一些实施方案中，磁场强度为0.01T至10T。磁场的强度可基于许多因素而变化，包括有效负载的磁学特性。在一个非限制性实例中，可生成介于1与1000T/m-1之间的场梯度。
在本发明的额外实施方案中，声场被用于驱动有效负载到细胞中。例如，细胞可在离开本发明的细胞变形缩窄部之后与声场接触。声场可例如由扬声器、换能器或其他类似装置生成。扬声器为将电磁波转换成声波的换能器。扬声器可接收来自如计算机或音频接收器的装置的音频输入。此输入可呈模拟或数字形式。模拟扬声器可只是将模拟电磁波放大为声波。因为声波是以模拟形式产生，所以数字扬声器必须首先将数字输入转换成模拟信号，然后生成声波。声波可在不同的频率和振幅下生成。在一些实施方式中，在缓冲液或其他液体中的交替低压和高压波造成小真空泡的形成和塌陷，这可称为空化。空化引起高速碰撞液体射流和强流体动力剪切力，这可用于操纵有效负载和细胞。在一些实施方案中，超声处理用于产生声场。
在与声场有关的一些实施方案中，声能强度可为例如1-1000 J/cm2。然而，所用的能量可低于或高于此范围，这取决于如暴露时间、细胞类型、所用的溶液或缓冲液、空化尺寸等因素。频率的非限制性实例包括10KHz-10MHz。
在本发明的其他实施方案中，光场被用于驱动有效负载到细胞中。举例来说，可见的电磁辐射可用于在细胞离开本发明的细胞变形缩窄部之后驱动材料到细胞中。可见的电磁辐射来源的实例包括发光二极管(LED)、激光，和白炽灯泡。
CAR T细胞
通过修饰T细胞以表达识别癌症特异性抗原的嵌合抗原受体 (CAR)，可引发细胞识别并杀死肿瘤细胞，否则这些肿瘤细胞将逃脱免疫检测。该过程涉及提取患者的T细胞，用CAR的基因转染它们，然后将转染的细胞重新输注到患者中。
这些人工T细胞受体(又名嵌合T细胞受体、嵌合免疫受体或 CAR)是工程化的的受体，其将任意的特异性移植到免疫效应细胞上。通常，这些受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上。在本发明之前，核酸编码序列的转移通常由逆转录病毒载体促成。本文所述的方法不利用或包括病毒载体。使用在所述装置下的细胞挤压(而无需病毒载体)将编码序列或蛋白质CAR递送到免疫细胞(如T细胞)的胞质。
对于治疗性应用，患者的T细胞是从外周血获得(并任选富集或纯化)并且被修饰以表达对特定的癌症相关抗原有特异性的人工(嵌合) 受体。修饰之后，T细胞识别并杀死癌症。例如，示例性CAR识别 CD19，一种在B细胞血液恶性肿瘤中表达的抗原。在T细胞被修饰以表达CAR之后，修饰的T细胞被重新输注给患者。工程化的细胞识别并杀死癌细胞。这类疗法已用于ALL、非何杰金氏淋巴瘤，和慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，并且适于任何类型癌症的治疗，包括血液传播癌，如白血病、B细胞恶性肿瘤(例如，急性淋巴母细胞性白血病(ALL)和慢性淋巴细胞性白血病)以及实体癌。本文所述的细胞处理方法代表了一种用于产生CAR T细胞的优良工艺。
在一些实施方案中，患者为人。在其他实施方案中，患者不是人。
示例性实施方案
本发明的方面提供一种用于在细胞膜中引起扰动的微流体***，所述***包括：限定管腔并被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞可从其中通过的微流体通道，其中所述微流体通道包括细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随细胞的直径而变化；和(a)能量场；或(b)安置在所述缩窄部的下游、上游，或上游和下游的能量场的来源或发射体。
本发明的方面还提供一种用于将有效负载递送至细胞的微流体***，所述***包括：限定管腔并被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞可从其中通过的微流体通道，其中所述微流体通道包括细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随细胞的直径而变化；和(a)能量场；或 (b)安置在所述缩窄部的下游的能量场的来源或发射体。
在一些实施方案中，所述能量场包括电场且所述来源发射体包括电极。在某些实施方案中，所述能量场包括磁场且所述来源或发射体包括磁体或电磁体。在各个实施方案中，所述能量场包括(a)声场且所述来源或发射体包括扬声器，或(b)光场且所述来源或发射体包括发光二极管(LED)、激光，或白炽灯泡。
在各个实施方案中，(a)选择所述缩窄部的直径以诱发细胞膜的足够大的临时扰动供有效负载通过，且细胞以连续流动通过所述缩窄部到场中，其中通过所述缩窄部之后，细胞接触或通过场的一部分，尽管有临时扰动，所述场的强度仍足以驱动有效负载；或(b)在通过所述缩窄部之后，细胞进入并保留在所述缩窄部下游的所述装置的区内，其中所述区内的细胞与场接触。
在某些实施方案中，所述微流体通道是微流体***中的多个平行微流体通道中的一个，所述多个平行微流体通道的每个微流体通道限定管腔并且被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞从其中通过，其中每个微流体通道包括细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随细胞的直径而变化。
在一些实施方案中，所述多个平行微流体通道包含至少约2、5、 10、20、25、30、40、45、50、75、100、500、1,000，或2-1,000个微流体通道。
在各个实施方案中，选择所述缩窄部的直径以诱发细胞膜的足够大的临时扰动供有效负载通过。
在某些实施方案中，所述电极包括产生电场的两个电极以驱动有效负载到悬浮于缓冲液中的细胞中。
在一些实施方案中，所述有效负载包括以下一种或多种：(a)脱氧核糖核酸(DNA)；(b)核糖核酸(RNA)；(c)包含一个或多个增加DNA 或RNA的体内或体外稳定性或半衰期的修饰的核苷酸的DNA或 RNA；(d)肽核酸(PNA)；(e)甲基化的DNA；(f)天然存在的染色体或其一部分；(g)表达载体；(h)蛋白质；(i)小分子；(j)糖；(k)生物、合成、有机，或无机分子的聚合物；(l)带电分子或包含带电分子的组合物；或(m)不带电分子。例如，(a)至(m)的任一种或任何混合物都可递送给细胞。在某些实施方案中，所述有效负载是包含定位信号的多肽。
在各个实施方案中，本发明的微流体***可进一步包括多个电极对，其中电极对之间的电极尺寸不同。
在一些实施方案中，微流体***包括(a)被配置到至少第一列和第二列电极中的多个电极，其中所述第一列电极偏离所述第二列电极，或(b)被配置到至少第一列和第二列电极对中的多个电极对，其中所述第一列电极对偏离所述第二列电极对。在各个实施方案中，第一列与第二列在水平、垂直或对角线平面上以如下角度偏离：约1、5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、1-10、1-20、 1-30、1-45，或1-90°。
在某些实施方案中，本发明的微流体***进一步包括函数发生器，其耦合到至少一个电极并且驱动至少一个电极产生电场以便在细胞被细胞变形缩窄部收缩之后驱动有效负载到悬浮于缓冲液中的细胞中；或函数发生器，其经由感应驱动至少一个电极产生电场以便在细胞被细胞变形缩窄部收缩之后驱动有效负载到悬浮于缓冲液中的细胞中。
在一些实施方案中，所述函数发生器被配置来驱动至少一个电极产生具有以下强度的电场：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-1.5、0.1-2、0.1-2.5、 0.1-3kV/cm、1-3kV/cm、0.1-10kV/cm、10-200kV/m，或10-2000 kV/m。
在各个实施方案中，本发明的微流体***包括细胞驱动器以便驱动细胞在压力下通过细胞变形缩窄部。
在某些实施方案中，悬浮于缓冲液中的细胞的流体流被引导到所述缩窄部中以便细胞主要被所述流体流压缩。
在一些实施方案中，缩窄部的直径为从其中通过的细胞直径的约 20-99％。
在某些实施方案中，缩窄部的直径为约4、5、6、7、8、9、10、 15、20 4-10μm，或10-20μm和/或缩窄部的长度为约10、15、20、 24、30、40、50、60、10-40、10-50、10-60，或10-40μm。
在各个实施方案中，所述微流体通道包括单个细胞变形缩窄部或多个串联的细胞变形缩窄部。
在一些实施方案中，细胞在离开细胞变形缩窄部之后约0.0001、 0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、0.001-0.005，或0.0001-10秒或在离开细胞变形缩窄部之后约 0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.01、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、0.001-0.005，或0.0001-10秒内与电场接触。
在某些实施方案中，电场具有以下强度：约0.1-0.5、0.1-1、0.1-1.5、 0.1-2、0.1-2.5、0.1-3kV/cm、1-3kV/cm、0.1-10kV/cm、10-200kV/m，或10-2000kV/m。
本发明的方面提供一种用于将化合物或组合物递送到细胞中的方法，所述方法包括：提供在含有效负载的溶液中的细胞；使所述溶液通过包括细胞变形缩窄部的微流体通道；使细胞通过所述缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供有效负载通过细胞膜并进入细胞的胞质中；使细胞与电场、磁场、声场，或光场接触，这些场将有效负载从细胞中的第一位置移位到细胞内的第二位置。
本发明的方面还提供一种用于将化合物或组合物递送到细胞中的方法，所述方法包括：提供在含有效负载的溶液中的细胞；使所述溶液通过包括细胞变形缩窄部的微流体通道；使细胞通过所述缩窄部以便所述通过引起足够大的细胞膜扰动供有效负载通过细胞膜并进入细胞的胞质中；使细胞与电场、磁场、声场，或光场接触，这些场将有效负载从细胞中的第一位置移位到细胞内的第二位置。
本发明的方面提供一种用于将化合物或组合物递送到细胞中的方法，所述方法包括：提供在含有效负载的溶液中的细胞；使所述溶液通过包括细胞变形缩窄部的微流体通道；使细胞通过所述缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供有效负载通过细胞膜并进入细胞的胞质中；使细胞与电场、磁场、声场或光场接触，这些场驱动有效负载到细胞中。
在一些实施方案中，细胞与磁场接触，且所述磁场是由至少一个电磁体产生。在各个实施方案中，细胞与电场接触，且所述电场是由一个或多个电极产生。
在某些实施方案中，细胞在第一装置中通过微流体通道，然后从所述第一装置处移走并在第二装置中与电场、磁场或声场接触。
在各个实施方案中，所述微流体通道与所述电场、磁场及声场在一个装置内。
在一些实施方案中，(a)细胞以连续流动形式通过所述缩窄部到场中，其中在通过所述缩窄部之后，细胞接触或通过所述场的一部分，尽管有临时扰动，所述场的强度仍足以驱动有效负载；或(b)在通过所述缩窄部之后，细胞流入并保留在其中细胞与场接触的装置的区内。
在某些实施方案中，所述细胞是多个细胞，并且每个细胞通过多个平行微流体通道中的一个，其中所述多个平行微流体通道的每个微流体通道包括细胞变形缩窄部，且其中所述多个细胞通过所述电场。
在各个实施方案中，选择所述缩窄部的直径以诱发细胞膜足够大的临时扰动供所述有效负载当由电场驱动时通过。
在一些实施方案中，所述有效负载包括以下一种或多种：(a)脱氧核糖核酸(DNA)；(b)核糖核酸(RNA)；(c)包含一个或多个增加DNA 或RNA的体内或体外稳定性或半衰期的修饰的核苷酸的DNA或 RNA；(d)肽核酸(PNA)；(e)甲基化的DNA；(f)天然存在的染色体或其一部分；(g)表达载体；(h)蛋白质；(i)小分子；(j)糖；(k)生物、合成、有机，或无机分子的聚合物；(l)带电分子或包含带电分子的组合物；或(m)不带电分子。例如，(a)至(m)的任一种或任何混合物都可递送给细胞。在某些实施方案中，所述有效负载是包含定位信号的多肽。
在某些实施方案中，所述细胞与电场接触，且所述有效负载被驱动到以下一个或多个中：(a)所述细胞的核；(b)所述细胞的线粒体；或(c)除所述细胞的核或线粒体以外的所述细胞的细胞器。
在各个实施方案中，所述细胞与电场接触，且所述有效负载在所述细胞通过所述电场时或在所述细胞通过所述电场之后小于0.1、0.5、 1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-48小时被驱动到所述细胞的核中。
在一些实施方案中，所述细胞是多个细胞且所述有效负载是在细胞核中时表达的DNA，且其中至少约10、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100、0-65，或10-100％所述多个细胞在所述多个细胞通过所述电场之后约0.1、0.5、1、1.5、 2、2.5、3、3.5、4、0.1-4，或0.1-48小时内表达所述DNA。
在某些实施方案中，电场是由两个电极产生以驱动有效负载到悬浮于缓冲液中的细胞中。
在各个实施方案中，电场是由多个电极对产生，其中电极对之间的电极尺寸不同。
在一些实施方案中，至少一个电极是由耦合到所述电极上的函数发生器驱动，所述函数发生器驱动所述电极产生电场用于在所述细胞被所述细胞变形缩窄部收缩之后驱动所述有效负载到悬浮于缓冲液中的细胞中。
在某些实施方案中，悬浮于缓冲液中的细胞的流体流被引导到所述缩窄部中以便细胞主要被所述流体流压缩。
在一些实施方案中，缩窄部的直径为从其中通过的细胞直径的约 20-99％。在一些实施方案中，所述缩窄部的直径为约4、5、6、7、8、 9、10、15、20 4-10μm，或10-20μm。在一些实施方案中，所述缩窄部的长度为约10、15、20、24、30、40、50、60、10-40、10-50、 10-60，或10-40μm。在一些实施方案中，细胞在离开细胞变形缩窄部之后约0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、0.001-0.005，或0.0001-10秒或在离开细胞变形缩窄部之后约0.0001、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、0.001-0.005，或0.0001-10秒内与电场接触。在一些实施方案中，细胞对所述电场的暴露时间为约10-50ms、50-100ms或10-100ms。在一些实施方案中，所述电场是恒定的。在一些实施方案中，电场是恒定或脉冲直流电。在一些实施方案中，所述电场是脉冲调制的。在一些实施方案中，所述电场是在约50-200μs 下脉冲调制。在一些实施方案中，所述电场的强度或脉冲强度为约 1-3kV/cm或0.1-10kV/cm，或0.1至0.5、0.1至1、0.1至1.5、0.1 至2、0.1至2.5，或0.1至3kV/cm。在一些实施方案中，所述电场的强度或脉冲强度小于电穿孔所述细胞所必需的强度。在一些实施方案中，所述脉冲宽度小于递送相同量的有效负载到相应细胞所必需的脉冲宽度。在一些实施方案中，所述电场的强度或脉冲强度比电穿孔所述细胞所必需的强度小约50、1-50、50-99，或1-99％。在一些实施方案中，约10-35psi的压力被用于使溶液通过所述微流体通道。在一些实施方案中，所述细胞以约300、100-300、200-700、250-400、 100-1000mm/s，或1-1000mm/s的速度通过所述微流体通道。在一些实施方案中，所述微流体通道包括多个串联的细胞变形缩窄部。在一些实施方案中，所述微流体通道包括单个细胞变形缩窄部。在一些实施方案中，所述细胞是多个细胞，并且约80、85、90、91、92、93、 94、95、96、97、98、99、90-95，或80-100％的所述细胞在通过所述电场之后是活的。在一些实施方案中，所述电场的强度或脉冲强度为约10-2000kV/m，或小于100kV/m。在一些实施方案中，所述电场是以约0.1、0.1-2，或0.1-2000ms的持续时间，1-20、0.1-2000，或1-200ms的周期脉冲调制。在一些实施方案中，所述细胞以约100、 170、300、100-300、200-700、250-400、100-1000mm/s，或1-1000mm/s 的速度通过电场。在一些实施方案中，所述细胞膜的扰动包括约1-20、 1-600、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、25、50、75、 100、150、200、250、300、350、400、450、500，或600nm的最大直径。在一些实施方案中，具有约1-20、1-600、4、5、6、7、8、9、 10、12、14、16、18、20、25、50、75、100、150、200、250、300、 350、400、450、500，或600nm的最大直径的所述细胞膜的扰动在所述细胞膜上持续至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，或1-10 分钟。
在各个实施方案中，所述细胞是原核细胞或真核细胞。在某些实施方案中，所述细胞为红细胞、T细胞、B细胞、中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、ILC，或其任何组合。
本发明的方面提供一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞中的方法，所述方法包括：使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供表达载体通过；使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到细胞中，其中所述转基因在细胞中以比在通过电场而不通过细胞变形缩窄部的细胞中的转基因表达更快的速率表达。
在一些实施方案中，所述转基因在细胞中早于在与电场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、 4，或0.1-4小时表达。
本发明的方面还提供一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞中的方法，所述方法包括：使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供表达载体通过；使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到细胞中，其中所述转基因在细胞中的最大限度表达以比在通过电场而不通过细胞变形缩窄部的细胞中的所述表达更快的速率完成或检测到。
在一些实施方案中，所述转基因在细胞中的表达早于在与电场、磁场或声场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的所述表达约0.1、1.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小时完成。
本发明的方面还提供一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞中的方法，所述方法包括：使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供表达载体通过；使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到细胞中，其中所述转基因在细胞中以与在通过电场而不通过细胞变形缩窄部的细胞中的转基因表达相比更大的程度表达。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部并且与场接触之后，转基因的表达水平大于通过电场而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的表达水平。
在各个实施方案中，在所述细胞中的转基因表达比在与电场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的转基因表达多至少约5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、 90、95，或100％，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约0.1、1.5、1、1.5、 2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小时内，在所述细胞中的转基因表达比在与电场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的转基因表达多至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、 70、75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5倍、8倍、10倍、 20倍或更多。
本发明的方面提供一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞群体中的方法，所述方法包括：使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞扰动供表达载体通过；使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到细胞中，其中在群体中表达转基因的细胞的比例大于在通过电场而不通过细胞变形缩窄部的细胞群体中表达转基因的细胞的比例。
在一些实施方案中，在群体中表达转基因的细胞比例比在与电场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达转基因的细胞比例大至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5倍、8倍、10 倍、20倍或更多。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约0.1、1.5、1、1.5、 2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小时内，在群体中表达转基因的细胞比例比在与电场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达转基因的细胞比例大至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5 倍、8倍、10倍、20倍或更多。
本发明的方面还提供一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞群体中的方法，所述方法包括：使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞扰动供表达载体通过；使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到细胞中，其中在群体中表达高水平的转基因的细胞的比例大于在通过电场而不通过细胞变形缩窄部的细胞群体中表达高水平的转基因的细胞的比例。
在某些实施方案中，在群体中表达高水平的转基因的细胞的比例比在与电场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达转基因的细胞的比例大至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、 50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5 倍、8倍、10倍、20倍或更多。
在一些实施方案中，在细胞通过缩窄部之后约0.1、1.5、1、1.5、 2、2.5、3、3.5、4，或0.1-4小时内，在群体中表达高水平的转基因的细胞的比例比在与电场接触而不通过细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达转基因的细胞的比例大至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100％，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
本发明的方面提供一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞中的方法，所述方法包括：使包含细胞和表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于细胞上，从而引起足够大的细胞膜扰动供表达载体通过；使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到细胞中，其中所述转基因在细胞中的表达早于在通过电场而不通过细胞变形缩窄部的细胞中的转基因表达。
在各个实施方案中，所述转基因在所述细胞中比在与电场接触但不通过细胞变形缩窄部的相应细胞中的表达早约0.1、1.5、1、1.5、2、 2.5、3、3.5、4，或0.1-4小时。
实施例
实施例1：用于DNA递送的微流体平台
已为DNA转染开发了许多技术。基于载体的方法如脂质转染非常依赖载体与细胞膜之间的相互作用以及DNA的细胞内转运(一个生物活性过程)。显微注射已用于直接递送DNA到核中以供转录，然而，其受到通量的限制。电穿孔已广泛用于DNA转染，然而，其机制仍有争议并且还受到电脉冲之后其对从质膜到核的主动DNA转运的依赖的限制。在此，描述了一个细胞内递送的概念，其被称为破环和场实现的递送(DFE；此术语不限于本实施例的实施方案)。在DFE 中，首先通过破环打开质膜中的扰动，然后通过那些间隙实现DNA 向胞质和核中的递送。此策略涉及将机械破坏与电场组合，其中货物分子或其混合物如GFP质粒DNA被直接递送到核中并在处理之后1 小时内表达，其比如电穿孔的其他方法更快速。此新型策略适用于难以转染细胞的细胞内基因递送，和广泛范围材料的共递送。
细胞转染对于在生物学和医学中的许多研究是必需的。已经开发了多种技术用于细胞转染，包括生物、化学和物理方法。生物/化学方法通常依赖于载体，如病毒、囊泡、肽或纳米颗粒(Nayak等人,Gene Ther.17,295–304(2010)；Wu等人,Biotechnol.Progr.18,617–622 (2002)；Schmid等人,Gut 41,549–556(1997)；Lee等人,Nat. Nanotechnol.7,389–393(2012))。物理方法主要使用膜破环技术，如微量注射、电穿孔、激光穿孔，和粒子轰击用于基因递送(O’Brien& Lummis,Nature Protoc.1,977–981(2006)；Wells,D.J.GeneTher.11, 1363–1369(2004)；Meacham等人,J.Lab.Autom.19,1–18(2014)； Capecchi,Cell22,479–488(1980)；Nagy等人,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual(Cold Spring Laboratory,2003))。裸核酸向细胞中的递送对于细胞转染而言可能是最安全且最牢靠的方法 (Wolff&Budker,Advances in Genetics,54,3–20(2005))。在可递送裸遗传物质的物理方法之中，电穿孔是迄今为止最流行的，这归因于其简易性、相当良好的效率，和其处理某些激发的原代细胞的能力 (Neumann等人,EMBO J.1,841–845(1982))。自从其首次在20世纪 80年代初期报道以来，电穿孔，又名电渗透，已广泛用于生物和医学应用中许多不同细胞的核酸的细胞内递送。虽然电穿孔已显示出它的优点并且广泛用于DNA转染，但其递送的基本原理仍未得到充分理解(Escoffre等人,Mol.Biotechnol.41,286–95(2009)；Vasilkoski等人,Phys.Rev.E 74,021904(2006)；Klenchin等人,Electricallyinduced DNA uptake by cells is a fast process involving DNAelectrophoresis.60, (1991)；Weaver等人,Bioelectrochemistry 87,236–43(2012)；Jordan 等人(编著)(2013)Electroporation and electrofusion in cell biology.Springer Science&Business Media)。已经普遍接受的是，在电穿孔过程中，DNA分子积聚并在电脉冲期间与电渗透化的质膜相互作用。之后，那些DNA聚集物则内化到胞质中且随后造成基因表达(Golzio 等人,Proc.Natl.Acad.Sci.99,1292–1297(2002)；Paganin-Gioanni等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108,10443–7(2011)；Rosazza等人Mol.Ther.21,2217–2226(2013)；Boukany等人,Nat.Nanotechnol.6, 747–54(2011)；Teissie等人,Biochim.Biophys.Acta 1724,270–80 (2005)；Yarmush等人,Annu.Rev.Biomed.Eng.16,295–320(2014)； Geng&Lu,Lab Chip 13,3803–21(2013))。DNA质粒未必能够仅仅经由扩散行进通过粘稠和拥挤的细胞质而到达核(Lechardeur等人,Adv. Drug Deliv.Rev.57,755–767(2005)；Dowty等人,Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.92,4572–4576(1995))。一些研究显示DNA从质膜向核的转运是经由细胞骨架转运如经由微管和肌动蛋白网的主动的生物过程 (Rosazza等人Mol.Ther.21,2217–2226(2013))。已发现微管和肌动蛋白网在细胞质内的DNA转运中起重要作用，并且所述过程的时间标度可为数小时，这取决于细胞类型。质膜与核之间的DNA转移的不清楚的机制和复杂的性质妨碍了电穿孔在难转染的细胞中的进一步应用和改善。此外，用于当前电穿孔技术中的强场可导致显著的损伤或死亡(Yarmush等人,Annu.Rev.Biomed.Eng.16,295–320(2014)； Geng&Lu,Lab Chip 13,3803–21(2013))，一个由本文所述的DFE避免的问题。就此而言，对于创造可将裸DNA直接送到核中而不依赖不明确的运输途径的技术有相当大的兴趣。较早的方法或手段在技术上常常较为复杂，具有相对较低的通量并且与某些原代细胞不相容。
DNA向核中的高通量、有效递送
本文公开了破坏和场实现的递送(DFE)概念的部署。在此方法中，首先通过机械过程破坏细胞膜，之后将细胞暴露于场以驱动材料到靶细胞中。已开发一种微流体装置，其可将DNA以高通量直接递送到细胞核中。DFE概念的一个实施方式涉及使用细胞挤压来暂时破坏细胞膜，之后使细胞暴露于电场，该电场驱动带负电的DNA通过膜破环，例如核膜或线粒体膜，并且在货物递送到细胞的胞质中之后进入到细胞核中。CellSqueeze技术已显示出在递送多种材料穿过细胞类型上的稳固能力，但在分离中在促进DNA的核递送方面是无效的(Shalek等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107,1870–5(2010))。不同于其中DNA分子电泳式地向质膜迁移并在质膜上聚集的电穿孔，在 DFE过程中，DNA分子通过由机械破坏在细胞膜中产生的扰动或间隙迁移到细胞中和/或细胞内。参见，例如图9A。此组合过程(DFE) 在货物(例如带电化合物，例如DNA)向胞质和亚细胞结构的递送上产生了协同效应。协同作用是通过测量所递送货物的功能，例如所递送的DNA的基因表达来证明。
此实施例描述了一种独特的微流体装置，其可通过将机械破坏与对电场的暴露组合以高通量直接递送DNA到核中。细胞挤压技术已被证明是用于机械地破坏质膜的有效技术。当细胞流过具有小于细胞直径的最小尺寸的缩窄通道时，短暂的变形导致在质膜中形成孔洞，周围材料可通过这些孔洞直接扩散到细胞胞质中。
每个装置是由一组平行、相同的缩窄通道和一组电极集成，如图 9A-C所示。在此实施例中描述的实验中，使用DRIE(深反应离子蚀刻)将75个平行通道蚀刻到硅晶片中并且通过用电极图案化的Pyrex 的阳极键合来密封(对于更多的制造细节，参见图13)。缩窄部的宽度和长度分别在4-10um和10-30um范围内。每个电极的长度、宽度，和电极之间的间隙距离分别为8mm、60um，和40um。施加于装置的电脉冲的持续时间和占空比在50-200us和1％-5％范围内。本发明的方法可在极高的通量下操作。举例来说，细胞可在以下通量下处理：至少约10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、100,000、200,000、 300,000、400,000、500,000、1百万，或1至1百万个细胞/s。细胞和所需材料的混合物通过由调节器控制的气体压力(例如氮气压力)被驱动到入口中。当样品被置于装置中时将电脉冲施加于装置上，以便细胞在挤压之后恰好经历电场。细胞在电场中的暴露时间通常在10-50 ms范围内，这取决于流速。
为了探究DNA递送的工作机制，进行了许多实验来表征使用模型细胞和模型货物的此DFE技术的性能，如图10A和10B中所示。使用不同的脉冲振幅，用DFE装置处理希拉细胞和GFP质粒DNA 的混合物。然后在37C下培育细胞24小时。通过使用流式细胞术测量GFP荧光来表征DNA表达。将DFE 10-6装置用于此实验中。DFE 10-6表示DFE装置的缩窄部尺寸，第一数字对应于缩窄部长度，而第二数字对应于宽度(以微米计)。影响机械破坏性能的两个控制参数包括细胞速度和缩窄部尺寸，并且控制电场性能的三个参数是电脉冲分布、强度，和脉冲数量(取决于通道中的细胞速度)。首先研究脉冲强度如何影响DNA转染。在DFE 10-6处理中，当所施加的振幅分别增至8V和10V时，细胞转染达到60％和90％以上，如图10A中的红色柱所示。作为对照组，使用具有相同电场和细胞速度但没有缩窄部结构的装置(在此实验中，速度而非压力是受控制的)处理细胞。在其中细胞仅经历电场但没有机械破坏的这种设计中，DNA转染效力在所施加的振幅增至14V之后达到60％。两个情况具有类似的细胞活力，如图10B中所示，表明机械破坏在较低场强度下显著地提高 DNA递送，同时对细胞产生可忽略的损害。质膜的机械破坏促进以下电转染过程。
还研究了细胞速度对转染的影响。例如，如图14所示，在10V 的所施加脉冲下，当细胞速度提高时，DNA表达减少，这归因于细胞在行进穿过电场时所接受的脉冲数目的减少。细胞活力与DNA表达之间的所需平衡在接近300mm/s的细胞速度下实现。这些示例性条件平衡了在低速下潜在严重的电损伤与在高速下的机械损伤的影响。不透膜的、CascadeBlue标记的3-kDa葡聚糖分子向活的希拉细胞的递送效率首先下降，然后随着细胞速度的提高而提高，表明对于此分子的递送的潜在主要作用从机械破坏转换到电场，然后回到机械破坏。在3kDa葡聚糖与DNA情况之间的性能差异进一步突显了电场效应对于DNA的重要性。
为了进一步研究DFE递送的机制，对使用DFE及其他四种广泛使用的DNA转染技术用GFP质粒DNA转染希拉细胞的能力进行比较研究：显微注射、lipofectormine 2000、ME(微流体(无挤压)+电场) 和BEP(批量电穿孔，使用NEON电穿孔***，一种常用的市售电穿孔工具)。在用每种技术处理之后，使用流式细胞术分析GFP表达，如图11所示。BEP和ME显示，与GFP类似的表达动力学在处理之后首个24小时内逐渐表达。70％的转染细胞在4-48小时之间表达 GFP。然而，在显微注射和DFE中，超过80％的表达GFP的细胞(在 48小时之后表达GFP荧光的细胞)在处理后的第一个小时内具有可测量的表达，表明在处理不久以后出现DNA转录/翻译。剩余的20％最终表达GFP的细胞(在48小时之后表达GFP的细胞)在处理后1至4 小时具有可检测的表达。显微注射被广泛接受为促进材料向核中直接注射的手段。显微注射和DFE具有相似的DNA表达动力学的事实是以下强有力的证据：由DFE递送的DNA对于核中的转录是立即可得的。相反，在脂质转染(Lipofectamine 2000)情况中，极少的GFP荧光见于处理后的首个4小时内，并且超过95％的转染细胞在处理之后 4-48h之间表达GFP。通过DFE、BEP和脂质转染的表达GFP的细胞的荧光图像示于图15中。为了更好地理解DFE的机制，在统计上比较希拉细胞中表达的GFP的荧光强度，如图16所示。在BEP中，向核的迁移及后续转录需要许多小时，并且GFP荧光在整个24小时内都是增加的。大部分转染细胞的荧光强度在处理后马上开始增加并且在6小时内变得饱和，表明当DNA被送到核中时DNA转录从相似的起始时点开始出现。
为了进一步探究DNA转移的工作机制，使用CY3标记的质粒 DNA在单细胞水平下直接目测DNA的分布。将细胞首先用DAPI和 Cell Mask绿色质膜染色剂培育以用于核和膜染色，然后在DFE、BEP 及机械破坏处理之前马上与标记的DNA混合。处理之后，将细胞在培养基中培育2分钟，然后使用细胞固定试剂盒进行固定。使用Nikon A1R共焦显微镜进行光学测量。当施加15ms/1200V的电脉冲(已知用于渗透细胞)时，强烈的CY3荧光在质膜水平下出现，表明DNA 在膜上的吸收和积聚。此结果与先前论证DNA不对称埋入质膜中的研究一致。在机械破坏中，用共焦显微镜几乎没有或没有在胞质中检测到标记DNA的荧光，但基于流式细胞术的早先研究已论证了标记 DNA的一些递送。在DFE中，发现标记的DNA荧光分布在胞质、核和质膜中。有趣的是，质膜中的DNA以相对于BEP的单极分布的双极方式分布，潜在地指示标记的DNA在其暴露于电场期间进入和离开细胞的途径。DNA在胞质和核中的直接目测进一步指示DFE能够直接更有效的递送DNA到核中。所述结果证明DFE提供促进功能性材料向细胞内部的胞质、核及其他亚细胞器中的有效递送的更有力手段。
细胞内递送是在多种应用中起重要作用的有挑战性的过程。基于脂质体和纳米颗粒的方法难以转用于原代细胞或非核酸，电穿孔具有毒性问题并且对于不高度带电的大分子可能无效，且机械破坏方法可努力提供足够的核递送。DFE将机械膜破环的效力与场的驱动力组合，因此保持机械破坏的稳固递送能力，同时提高带电货物如核酸(例如质粒)的核递送。
DNA从质膜到核的转运及后续转录是复杂的、很可能主动的过程，其可能耗费数小时，并且在不同的细胞类型中可显著不同。此过程在电穿孔和基于载体的方法如脂质转染中是重要的，并且被认为妨碍难以转移的细胞如免疫细胞和干细胞的DNA转染。本文所述的数据证明DFE通过联合机械破坏和电场将DNA直接递送到胞质和核中。细胞首先通过具有缩窄部的微通道以在质膜上产生扰动。不希望受任何科学理论的约束，结果显示在暴露于电场之后，驱动周围DNA 到胞质和核中。希拉细胞、GFP质粒DNA，和Cy3荧光标记的质粒 DNA被用于研究和探讨DFE在单细胞水平和统计水平下的工作机制。这是裸DNA质粒在高通量设置下的最快表达，表明无载体辅助。比较使用不同技术的DNA转移的可视化过程。图10中的脂质转染的 DNA表达动态显示DNA向核的转移及后续转录在希拉细胞中可能需要4小时有余。用常规电穿孔的DNA表达略快一些。关于DNA 在电穿孔过程期间如何迁移到核中一直有争议。一些人相信电脉冲渗透细胞膜并且电泳驱动DNA直接到核中，而其他人观察到DNA首先在质膜的电渗透化区域处形成聚集物，然后经由生物活性过程向核迁移。在此实施例中描述的BEP结果中，在第一个小时内20％的转染细胞表达GFP且在接下来的20小时期间80％表达。这可能是上述机制都在BEP中出现的迹象。在处理之后立即表达GFP的小部分细胞可直接电泳DNA到核中，而在4小时之后表达GFP(像脂质转染) 的大部分细胞必须转运DNA到核中用于表达。
DFE递送模式将膜破环与场效应合并以实现与任何单独技术相比的更大效力，例如协同效应。电穿孔可解决许多细胞类型的DNA 转染，但在递送一些材料如蛋白质上具有限制，并且可有毒性。机械破坏技术(如挤压)在以极小毒性递送多种材料(包括蛋白质和纳米材料)到多种细胞类型显示出了重大成功。然而，其在DNA上具有有限的成功，这大概是因为无效的核递送。通过将机械破坏与电场效应组合，DFE显示出了对于DNA表达的更佳(例如协同)结果并且能够递送蛋白质，这是用任何上述方法单独难以实现的里程碑。
装置制造和实验设置
硅晶片键合到Pyrex晶片上以形成DFE微流体装置。制造包括两个主要步骤：(1)在硅晶片上制造微流体通道，和(2)在Pyrex晶片上制造微流体电极。将装置安装到具有入口和出口贮器的保持件上。电脉冲是由函数发生器(Agilent E4422B)产生并且经由放大器增益以通过使用导电环氧树脂键合到电极垫片上的电线驱动装置。将与所需递送材料(货物化合物或组合物)混合的细胞溶液置于入口贮器中。然后将此贮器连接到由调节器控制的压缩空气管线上。压力(0-20psi)被用于驱动流体通过该装置，当细胞通过的同时施加电脉冲于装置上。从出口贮器处收集细胞，以便经历进一步处理。
如上所指出，微流体装置的制造中涉及两个主要步骤(图13)：(1) 在Pyrex晶片上制造电极，和(2)在硅晶片上制造微流体通道。图13(a-d) 示出了电极的过程。将一层光刻胶(SPR3012,MicroChem,Newton, MA)旋涂在6英寸的Pyrex晶片上，用UV光源图案化，并且在光刻胶显影剂(MF CD-26,Microposit)中显影。随后使用电子束蒸发器 (SemicoreCorp)将双层金属(Ti/Pt，
Figure BDA0001293450560000581
)沉积在晶片上，然后进行剥离工艺以除去光刻胶并形成电极和垫片。涉及光刻法的两个步骤来制造硅微流体通道，如图13(e-h)所示。硅晶片首先由光刻胶(Shipley 1827,MicroChem,Newton,MA)来图案化并且通过深反应离子蚀刻(DRIE,Adixen,Hingham,MA)进行蚀刻。施用第二光刻法和DRIE来经由硅晶片蚀刻以形成微流体装置的入口和出口。
最终，使用在300和800V下的阳极键合，用Pyrex层密封硅层，并且切割成具有6×23mm2尺寸的单独芯片。最终装置示于图9B中。设置中所用的电极指状物的宽度和装置的空间间隙分别为40μm和 60μm。硅衬底中微流体通道的高度为20μm。
细胞培养：将希拉细胞在含有补充有10％胎牛血清(FBS, Invitrogen 16000)的20mL DMEM培养基的75T烧瓶中培养。在含有 5％CO2的湿润气氛中，在37C下将细胞接种于T烧瓶中。
递送材料：将包括葡聚糖和质粒DNA的荧光标记分子以0.1 mg/mL的浓度与细胞溶液混合。GFP DNA质粒被用于测量DNA转染。
脂质转染：Lipofectamine 2000 DNA转染试剂盒被用于代表脂质转染技术。通过将2uL的Lipofection 2000试剂与1ug的DNA质粒在100uL的Opti-MEM培养基中合并来制备DNA-脂质复合体。
显微注射：在麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology) 由经验丰富和训练有素的人员操作DNA质粒向希拉细胞中的显微注射。每轮注射30个细胞。在缓冲液中的DNA浓缩物用于注射。
其他实施方案
本文所述的主题可以***、装置、方法和/或制品实施，取决于所需配置。在以上说明中列举的实施方式不代表符合本文所述主题的所有实施方式。其仅仅是符合与所述主题有关的方面的一些实施例。虽然上面已经详细描述了几个变化形式，但其他修改或添加也是可能的。具体说来，除了本文列举的那些之外，也可提供进一步的特征和 /或变化形式。例如，如上所述的实施方式可涉及所公开特征的各种组合和子组合和/或以上所公开的若干进一步特征的组合和子组合。另外，附图中所描绘和/或本文所述的逻辑流程不一定需要所示的特别次序，或相继次序，以实现所需结果。其他实施方式可在以下权利要求范围内。
本文涉及的专利和科学文献确立本领域技术人员能够获得的知识。本文引用的所有美国专利及公开或未公开的美国专利申请都以引用的方式并入。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请据此以引用的方式并入。由本文引用的登录号表示的Genbank和NCBI递交据此以引用的方式并入。本文引用的所有其他公开的参考文献、文件、手稿及科学文献据此以引用的方式并入。

Claims (55)

1.一种用于将有效负载递送至细胞的微流体***，所述***包括：
限定管腔并且被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞可从其中通过的微流体通道，其中所述微流体通道包括细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述细胞的直径而变化，并且被选择以诱导所述细胞的足够大的临时扰动供所述有效负载通过；和
(a) 电场；或
(b) 安置在所述缩窄部的下游、上游，或上游和下游的电场的来源或发射体；
其中所述***设置成使得所述电场的强度或脉冲强度为0.1-10 kV/cm并且脉冲持续时间为50-200微秒。
2.如权利要求1所述的微流体***，其中所述电场的来源或发射体被安置在所述缩窄部的下游。
3.如权利要求1所述的微流体***，其中所述来源或发射体包括至少一个电极。
4.如权利要求1所述的微流体***，其中所述***还包括磁场或者所述***还包括磁体或电磁体。
5.如权利要求1所述的微流体***，其中所述***还包括(a)声场或包括扬声器的发射体，或(b)光场或包括发光二极管(LED)、激光，或白炽灯泡的发射体。
6.如权利要求1-5中任一项所述的微流体***，其中
(a) 选择所述缩窄部的直径以诱发所述细胞的足够大的临时扰动供所述有效负载通过，且所述细胞以连续流动形式通过所述缩窄部到所述电场中，其中通过所述缩窄部之后，所述细胞接触或通过所述电场的一部分，所述电场的强度通过临时扰动足以驱动所述有效负载；或
(b) 在通过所述缩窄部之后，所述细胞进入并保留在所述缩窄部下游的所述装置的区内，其中所述区内的细胞与所述电场接触。
7.如权利要求1-5中任一项所述的微流体***，其中所述微流体通道是所述微流体***中的多个平行微流体通道中的一个，所述多个平行微流体通道的每个微流体通道限定管腔并且被配置为使得悬浮于缓冲液中的细胞从其中通过，其中每个微流体通道包括细胞变形缩窄部，其中所述缩窄部的直径随所述细胞的直径而变化。
8.如权利要求7所述的微流体***，其中所述多个平行微流体通道包含至少2、5、10、20、25、30、40、45、50、75、100、500、1,000，或2-1,000个微流体通道。
9.如权利要求3所述的微流体***，其中所述至少一个电极包括产生电场的两个电极以驱动所述有效负载到悬浮于所述缓冲液中的细胞中。
10.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其中所述有效负载包括以下一种或多种：
(a) 脱氧核糖核酸(DNA)；
(b) 核糖核酸(RNA)；
(c) 包含一个或多个增加DNA或RNA的体内或体外稳定性或半衰期的修饰的核苷酸的DNA或RNA；
(d) 肽核酸(PNA)；
(e) 甲基化的DNA；
(f)天然存在的染色体或其一部分；
(g) 表达载体；
(h) 蛋白质；
(i) 小分子；
(j) 糖；
(k) 生物、合成、有机，或无机分子的聚合物；
(l) 带电分子或包含带电分子的组合物；或
(m) 不带电分子。
11.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其中所述有效负载是包含定位信号的多肽。
12.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其进一步包括多个电极对，其中电极对之间的电极尺寸不同。
13.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其包括
(a) 被配置到至少第一列和第二列电极中的多个电极，其中所述第一列电极偏离所述第二列电极，或
(b) 被配置到至少第一列和第二列电极对中的多个电极对，其中所述第一列电极对偏离所述第二列电极对。
14.如权利要求13所述的微流体***，其中第一列与第二列在水平、垂直或对角线平面上以如下角度偏离：1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、1-10、1-20、1-30、1-45，或1-90度。
15.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其进一步包括
(a) 函数发生器，其耦合到所述至少一个电极并且驱动所述至少一个电极产生电场以便在细胞与所述细胞变形缩窄部接触之后驱动所述有效负载到悬浮于所述缓冲液中的细胞中；或
(b) 函数发生器，其经由感应驱动所述至少一个电极产生电场用于在所述细胞与所述细胞变形缩窄部接触之后驱动所述有效负载到悬浮于缓冲液中的所述细胞中。
16.如权利要求15所述的微流体***，其中所述函数发生器被配置来驱动至少一个电极产生具有以下强度的电场：0.1 kV/cm - 0.5 kV/cm、0.1 kV/cm - 1 kV/cm、0.1 kV/cm- 1.5 kV/cm、0.1 kV/cm - 2 kV/cm、0.1 kV/cm - 2.5 kV/cm、0.1 kV/cm - 3 kV/cm、1kV/cm - 3 kV/cm。
17.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其进一步包括细胞驱动器以便驱动所述细胞在压力下通过所述细胞变形缩窄部。
18.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其中所述缩窄部的直径为从其中通过的所述细胞直径的20-99%。
19.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其中所述缩窄部的直径为4 µm、5µm、6 µm、7 µm、8 µm、9 µm、10 µm、15 µm、20 µm、4 µm - 10 µm，或10 µm -20 µm，和/或所述缩窄部的长度为10 µm、15 µm、20 µm、24 µm、30 µm、40 µm、50 µm、60 µm、10 µm - 40 µm、10 µm - 50 µm、10 µm - 60 µm，或10 µm - 40 µm。
20.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其中所述微流体通道包括单个细胞变形缩窄部或多个串联的细胞变形缩窄部。
21.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其中所述***设置成使得所述细胞在离开所述细胞变形缩窄部之后0.0001 s、0.001 s、0.002 s、0.003 s、0.004 s、0.005s、1 s、2 s、3 s、4 s、5 s、6 s、7 s、8 s、9 s、10 s、0.001 s - 0.005 s，或0.0001 s - 10s或在离开所述细胞变形缩窄部之后0.0001 s、0.001 s、0.002 s、0.003 s、0.004 s、0.005s、0.01 s、1 s、2 s、3 s、4 s、5 s、6 s、7 s、8 s、9 s、10 s、0.001 s - 0.005 s，或0.0001s - 10 s内与电场接触。
22.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，其中所述电场具有以下强度：0.1kV/cm - 0.5 kV/cm、0.1 kV/cm - 1 kV/cm、0.1 kV/cm - 1.5 kV/cm、0.1 kV/cm - 2 kV/cm、0.1 kV/cm - 2.5 kV/cm、0.1 kV/cm - 3 kV/cm、1 kV/cm - 3 kV/cm。
23.一种用于将有效负载递送到细胞中的方法，所述方法包括：
提供在含有效负载的溶液中的细胞；
使所述溶液通过包括细胞变形缩窄部的微流体通道；
使所述细胞通过所述缩窄部以便施加压力于所述细胞上，从而引起足够大的所述细胞扰动供所述有效负载通过并进入所述细胞的胞质中；和
使所述细胞与电场接触；
其中所述电场的强度或脉冲强度为0.1-10 kV/cm并且脉冲持续时间为50-200微秒。
24.如权利要求23所述的方法，其中使所述细胞与电场接触（a）驱动所述有效负载到细胞中；和/或（b）将所述有效负载从所述细胞中的第一位置移位到所述细胞内的第二位置。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述细胞还与磁场接触，并且所述磁场是由至少一个电磁体产生。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述电场是由一个或多个电极产生。
27.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述细胞在第一装置中通过所述微流体通道，然后从所述第一装置处移走并在第二装置中与所述电场接触。
28.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述微流体通道与所述电场在一个装置内。
29.如权利要求28所述的方法，其中
(a) 所述细胞以连续流动形式通过所述缩窄部到所述电场中，其中在通过所述缩窄部之后，所述细胞接触或通过所述电场的一部分，尽管有临时扰动，所述电场的强度仍足以驱动有效负载；或
(b) 在通过所述缩窄部之后，所述细胞流入并保留在其中所述细胞与所述电场接触的所述装置的区内。
30.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述细胞是多个细胞，并且每个细胞通过多个平行微流体通道中的一个，其中所述多个平行微流体通道的每个微流体通道包括细胞变形缩窄部，且其中所述多个细胞通过所述电场。
31.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中选择所述缩窄部的直径以诱发所述细胞足够大的临时扰动供所述有效负载当由所述电场驱动时通过。
32.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述有效负载包括以下一种或多种：
(a) 脱氧核糖核酸(DNA)；
(b) 核糖核酸(RNA)；
(c) 包含一个或多个增加DNA或RNA的体内或体外稳定性或半衰期的修饰的核苷酸的DNA或RNA；
(d) 肽核酸(PNA)；
(e) 甲基化的DNA；
(f)天然存在的染色体或其一部分；
(g) 表达载体；
(h) 蛋白质；
(i) 小分子；
(j) 糖；
(k) 生物、合成、有机，或无机分子的聚合物；
(l) 带电分子或包含带电分子的组合物；或
(m) 不带电分子。
33.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述有效负载被驱动到以下一个或多个中
(a) 所述细胞的核；
(b) 所述细胞的线粒体；或
(c) 除所述细胞的核或线粒体以外的所述细胞的细胞器。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述有效负载在所述细胞通过所述电场时或在所述细胞通过所述电场之后小于0.1 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，或0.1h - 48 h被驱动到所述细胞的核中。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞是多个细胞且所述有效负载是在细胞核中时表达的DNA，且其中至少10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、100、0-65，或10-100%所述多个细胞在所述多个细胞通过所述电场之后0.1 h、0.5 h、1h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、0.1 h - 4 h，或0.1 h - 48 h内表达所述DNA。
36.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述电场是由两个电极产生以驱动所述有效负载到悬浮于缓冲液中的所述细胞中。
37.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述电场是由多个电极对产生，其中电极对之间的电极尺寸不同。
38.如权利要求23或24所述的方法，其中所述电场由一个或多个电极产生，并且其中一个或多个电极中的至少一个是由耦合到所述电极上的函数发生器驱动，所述函数发生器驱动所述电极产生所述电场用于在所述细胞与所述细胞变形缩窄部接触之后驱动所述有效负载到所述细胞中。
39.如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中
(a) 所述缩窄部的直径为从其中通过的所述细胞直径的20-99%；
(b) 所述缩窄部的直径为4 µm、5 µm、6 µm、7 µm、8 µm、9 µm、10 µm、15 µm、20 µm、4 µm - 10 µm，或10 µm - 20 µm；
(c) 所述缩窄部的长度为10 µm、15 µm、20 µm、24 µm、30 µm、40 µm、50 µm、60 µm、10µm - 40 µm、10 µm - 50 µm，或10 µm - 60 µm；
(d) 所述细胞在离开所述细胞变形缩窄部之后0.0001 s、0.001 s、0.002 s、0.003 s、0.004 s、0.005 s、1 s、2 s、3 s、4 s、5 s、6 s、7 s、8 s、9 s、10 s、0.001 s - 0.005 s，或0.0001 s - 10 s或在离开所述细胞变形缩窄部之后0.0001 s、0.001 s、0.002 s、0.003s、0.004 s、0.005 s、1 s、2 s、3 s、4 s、5 s、6 s、7 s、8 s、9 s、10 s、0.001 s - 0.005 s，或0.0001 s - 10 s内与电场接触；
(e) 所述细胞对所述电场的所述暴露时间为10ms - 50ms、50ms - 100ms或10ms -100ms；
(f) 所述电场是脉冲直流电；
(g) 所述电场是脉冲调制的；
(h) 所述电场是在50µs - 200µs下脉冲调制；
(i) 所述电场的强度或脉冲强度为1 kV/cm - 3 kV/cm、0.1 kV/cm - 0.5 kV/cm、0.1kV/cm - 1 kV/cm、0.1 kV/cm - 1.5 kV/cm、0.1 kV/cm - 2 kV/cm、0.1 kV/cm - 2.5 kV/cm，或0.1 kV/cm - 3 kV/cm；
(j) 10 psi - 100 psi的压力被用于使溶液通过所述微流体通道；
(k) 所述细胞以300 mm/s、100 mm/s - 300 mm/s、200 mm/s - 700 mm/s、250 mm/s -400 mm/s、100 mm/s - 1000 mm/s，或1 mm/s - 1000 mm/s的速度通过所述微流体通道；
(l) 所述微流体通道包括单个细胞变形缩窄部或者所述微流体通道包括多个串联的细胞变形缩窄部；
(m) 所述细胞是多个细胞，并且80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、90-95，或80-100%的所述细胞在通过所述电场之后是活的；
(n) 所述电场是以0.1 ms的持续时间，或者1 ms - 20 ms、0.1 ms - 2000 ms，或1 ms- 200 ms的周期脉冲调制；
(o) 所述细胞以100 mm/s、170 mm/s、300 mm/s、100 mm/s - 300 mm/s、200 mm/s -700 mm/s、250 mm/s - 400 mm/s、100 mm/s - 1000 mm/s，或1 mm/s - 1000 mm/s的速度通过所述电场；
(p) 所述细胞的扰动包括1 nm - 20 nm、1 nm - 600 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8nm、9 nm、10 nm、12 nm、14 nm、16 nm、18 nm、20 nm、25 nm、50 nm、75 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300 nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm，或600 nm的最大直径；和/或
(q) 具有1 nm - 20 nm、1 nm - 600 nm、4 nm、5 nm、6 nm、7 nm、8 nm、9 nm、10 nm、12nm、14 nm、16 nm、18 nm、20 nm、25 nm、50 nm、75 nm、100 nm、150 nm、200 nm、250 nm、300nm、350 nm、400 nm、450 nm、500 nm，或600 nm的最大直径的所述细胞的扰动在所述细胞上持续至少1 min、2 min、3 min、4 min、5 min、6 min、7 min、8 min、9 min、10 min，或1 min- 10 min。
40.如权利要求1-5和9中任一项所述的微流体***，或如权利要求23-26中任一项所述的方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
41.一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞中的方法，所述方法包括：
使包含所述细胞和所述表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于所述细胞上，从而引起足够大的所述细胞扰动供所述表达载体通过；和
使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到所述细胞中；
其中所述电场的强度或脉冲强度为0.1-10 kV/cm并且脉冲持续时间为50-200微秒。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述转基因在所述细胞中以比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的细胞中的转基因表达更快的速率表达。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述转基因在所述细胞中早于在通过电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞中0.1 h、1.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5h、4 h，或0.1 h - 4 h表达。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述转基因在所述细胞中的最大限度表达以比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的细胞中的所述表达更快的速率完成。
45.如权利要求41或44所述的方法，其中所述转基因在所述细胞中的最大限度表达早于在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞中的所述表达0.1 h、1.5 h、1h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，或0.1 h - 4 h完成。
46.如权利要求41所述的方法，其中所述转基因在所述细胞中以与在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的细胞中的转基因表达相比更大的程度表达。
47.如权利要求41或46所述的方法，其中在所述细胞中的转基因表达比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞中的所述转基因表达多至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100%，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
48.如权利要求41或46所述的方法，其中在所述细胞通过所述缩窄部之后0.1 h、1.5h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，或0.1 h - 4 h内，在所述细胞中的转基因表达比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞中的所述转基因表达多至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100%，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
49.一种用于将编码转基因的表达载体递送到细胞群体中的方法，所述方法包括：
使包含所述细胞和所述表达载体的溶液通过细胞变形缩窄部以便施加压力于所述细胞上，从而引起足够大的所述细胞扰动供所述表达载体通过；和
使所述溶液通过由至少一个电极生成的电场以便驱动所述表达载体到所述细胞中；
其中所述电场的强度或脉冲强度为0.1-10 kV/cm并且脉冲持续时间为50-200微秒。
50.如权利要求49所述的方法，其中在所述群体中表达转基因的细胞的比例大于在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的所述细胞群体中表达转基因的细胞的比例。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中在所述群体中表达所述转基因的所述细胞比例比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达所述转基因的所述细胞比例大至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100%，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
52.如权利要求49或50所述的方法，其中在所述细胞通过所述缩窄部之后0.1 h、1.5h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，或0.1 h - 4 h内，在所述群体中表达所述转基因的所述细胞比例比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达所述转基因的所述细胞比例大至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100%，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
53.如权利要求49所述的方法，其中在所述群体中表达高水平的所述转基因的所述细胞比例大于在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的细胞群体中表达高水平的所述转基因的所述细胞比例。
54.如权利要求49或53所述的方法，其中在所述群体中表达高水平的所述转基因的所述细胞比例比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达所述转基因的所述细胞比例大至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100%，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
55.如权利要求49或53所述的方法，其中在所述细胞通过所述缩窄部之后0.1 h、1.5h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、3.5 h、4 h，或0.1 h - 4 h内，在所述群体中表达高水平的所述转基因的所述细胞比例比在通过所述电场而不通过所述细胞变形缩窄部的相应细胞群体中表达所述转基因的所述细胞比例大至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100%，或为2倍、5倍、8倍、10倍、20倍或更多。
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