Die Erfindung betrifft ferner den
monoklonalen Antikörper
GM-7, der spezifisch erfindungsgemäße Transplantat-Akzeptanz induzierende
Zellen erkennt, die aus dem Menschen abgeleitet sind. Die Erfindung betrifft
außerdem
die Verwendung des Antikörpers
GM-7 zum Nachweis und/oder zur Selektion von Transplantat-Akzeptanz
induzierenden Zellen.
Der Begriff "Transplantation" wird
in der Immunologie für
den Transfer von Zellen, Geweben oder Organen von einem Körper-Bereich in den anderen
verwendet. Der Bedarf für
Transplantationen ergibt sich aus der Erkenntnis, daß zahlreiche
Erkran kungen durch die Übertragung
(Transplantation) von gesunden Organen, Geweben oder Zellen von
einem diesbezüglich
gesunden Individuum – dem
Donor – auf
ein an der jeweiligen Erkrankung leidendes Individuum – den Empfänger oder
Wirt – geheilt
werden können.
Abhängig von dem Verhältnis zwischen
Donor und Empfänger,
unterscheidet man die folgenden Transplantattypen:
- 1. Autologe Transplantate: Hierbei handelt es sich um Gewebe
oder Zellen, die innerhalb ein- und desselben Individuums von einem
Körperbereich
in den anderen transplantiert werden.
- 2. Isologe Transplantate: Hierbei handelt es sich um den Transfer
zwischen genetisch identischen Individuen. Beispiele hierfür sind Inzuchtstämme von
Ratten oder Mäusen.
Bei Menschen kommen isologe (syngene) Transplantate zwischen genetisch
identischen (monozygoten) Zwillingen in Betracht.
- 3. Allogene Transplantate: Dieser Begriff bezeichnet Transplantate
zwischen genetisch unterschiedlichen Mitgliedern der gleichen Spezies,
wie beispielsweise von einem menschlichen Individuum zu einem anderen,
oder bei Versuchstieren von einem Inzuchtstamm zum anderen.
- 4. Xenologe Transplantate: Hierbei handelt es sich um den Transfer
zwischen verschiedenen Spezies, wie beispielsweise die Übertragung
eines Affenherzens in einen Menschen.
In der Regel erzeugen autologe und
isologe Transplantate keine immunologischen Probleme im Sinne einer
Abstoßungsreaktion.
Dies gilt jedoch nicht im Falle von allogenen und xenologen Transplantaten.
Derartige Transplantate werden von dem Immunsystem des Empfängers als
fremd erkannt und nach verhältnismäßig kurzer
Zeit abgestoßen.
Bei der allogenen/xenologen Abstoßungsreaktion spielen die T-Lymphozyten (nachfolgend
als T- Zellen bezeichnet)
eine zentrale Rolle. Diese Zellen erkennen die fremden Zellen anhand von
deren Haupthistokompatibilitäts-Komplexen (MHC =
major histocompatibility complex). Der fremde MHC-Komplex sensibilisiert
die antigen-reaktiven T-Zellen des Empfängers, und anschließend führen die
auf diese Weise aktivierten T-Zellen zur Zerstörung der Donor-Zellen bzw.
des Spendergewebes. Zellen mit unterschiedlichen MHC-Komplexen werden
auch als "MHC-different" bezeichnet.
Die Transplantation von allogenen
oder xenogenen Zellen, Geweben oder Organen führt zwangsläufig zum gemeinsamen Vorhandensein
von Zellen zweier unterschiedlicher Individuen, d.h. von MHC-differenten Zellen
im Blut des Wirtes. Dieses Phänomen
bezeichnet man als "Chimerismus". Man unterscheidet Mikro- und Makrochimerismus.
Als Mikrochimerismus wird ein Zustand bezeichnet, bei dem vom Spender
abgeleitete Zellen beispielsweise nach Blut- oder Knochenmarkstransfusion
oder nach Transplantation Lymphozyten-reicher Organe wie Dünndarm oder
Leber, in dem MHC-fremden Wirt zwar persistierend aber nur vereinzelt
nachweisbar bleiben. Von Makrochimerismus wird dann gesprochen,
wenn mehr als 5% der im Empfänger
gefundenen Zellen vom Spender abstammen, wobei in beiden Fällen zwischen
Blut- und Organ-Chimerismus
mit entsprechendem Nachweis von Spenderzellen im Blut oder in den
Organen des Empfängers
zu unterscheiden ist.
In gewissem Umfang kann Chimerismus
zur Entstehung von Toleranz gegenüber Transplantaten führen. So
wurde bei Personen, die sich beispielsweise infolge einer Leukämie oder
Lymphomerkrankung einer allogenen Knochenmarktransplantation mit
weitgehend übereinstimmendem
MHC-Muster zwischen Spender und Empfänger unterziehen mußten, nach
entsprechender myeloablativer Konditionierung (Zerstörung des
eigenen Knochenmarks und der daraus abgeleiteten Blutzellen) und
nachgeschalteter Stammzell-Transplantation,
ein "Spenderchimerismus" beobachtet wurde. Bei diesen Patienten
stammten mehr als 99% der im Blut nachweisbaren Zellen aus den Stammzellen
des Spenders, und dieser Chimerismus bildete die Grundlage für Toleranz
gegenüber
allen von diesem Spender transplantierten Organen. Diese Beobachtung
wurde in einer Reihe von klinischen Beispielen von nachgeschalteten
Nieren-, Leber- und Lungensegmentspenden bestätigt [Dey B., et al., "Outcomes
of Recipients of both bone marrow and solid organ transplants: A
review." Medicine (Baltimore) 77, 355–369 (1989)]. Für die Toleranzinduktion
ist es in diesem Zusammenhang nicht entscheidend, daß ein kompletter
Spenderchimerismus – definiert
als das Vorhandensein von mehr als 90% Spenderzellen im peripheren
Blut eines allogenen Empfängers – vorliegt,
sondern es hat sich erwiesen, daß eine Fraktion von 5% Spenderzellen – bezeichnet
als "gemischter" Chimerismus – ausreicht,
um Toleranz zu induzieren [vgl. Übersicht
bei Acholonu I.N. und Ildstad S.T., "The role of bone marrow transplantation
and tolerance: Organ-specific and cellular grafts", Curr. Opin.
Organ. Transplant 4, 189–196
(1999)].
Prinzipiell wurde damit zwar belegt,
daß der
mit einer Knochenmarktransplantation (KMTx) einhergehende Spenderchimerismus
Toleranz induziert, dessenungeachtet war es jedoch bisher nicht
möglich,
bei vollständig
MHC-differenten Spender- und Empfänger-Konstellationen eine erfolgreiche
allogene KMTx durchzuführen.
Dies beruht auf der Tatsache, daß die hierfür benötigte Vorbereitung, d.h. die
Konditionierung des Empfängers
(siehe oben), drei wesentliche Gefahren für den Empfänger birgt. Zum einen führt die
Knochenmarktoxizität
der angewendeten Chemotherapeutika, die mit oder ohne zusätzliche
Bestrahlung verabreicht werden, zu einer erheblichen Morbidität; zum anderen
besteht die Gefahr der Abstoßung
des transplantierten Knochenmarks trotz vorheriger Konditionierung;
und schließlich
besteht das Risiko einer Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung, bei
der sich die mit dem Transplantat in den Wirt übertragenen T-Zellen gegen
den Organismus des Wirts wenden (GvHD = graft versus host disease)
[vergl. Wolff S.N., "Hematopoietic cell transplant from volunteer
unrelated or partially matched related donors: Recent developments."
Curr. Opin. Organ. Transplant 5, 372–381 (2000)] . Diese Erkrankung
tritt immer dann ein, wenn das Immunsystem des Empfängers durch
die vorherige Konditionierung so geschwächt ist, daß die mit dem Knochenmark übertragenen
T-Zellen eine letale Abstoßung im
Empfänger
auslösen
können.
Zur Vermeidung der oben aufgezeigten
Probleme herrschen derzeit Bestrebungen, die Konditionierung des
Empfängers
möglichst
schwach zu gestalten. Je größer jedoch
die MHC-Differenz zwischen Spender und Empfänger ist, desto stärker muß die Konditionierung
gewählt
werden, um die Abstoßung
des transplantierten Knochenmarks zu verhindern; damit steigt gleichzeitig
wieder das Risiko der Transplantat-gegen-Wirt Erkrankung (GvHD).
Es ist bisher nicht genau untersucht
worden, für
welche Zeit der induzierte Chimerismus im Empfängerblut nachweisbar bleiben
muß, um
eine stabile Toleranzsituation für
ein Spenderorgan zu gewährleisten. Zuverlässige Daten
aus dem Mausmodell sprechen jedoch dafür, daß bereits ein 2 Wochen lang
nachweisbarer Makrochimerismus zur Toleranzentstehung ausreicht
[Weckerle, T. et al. "Allogenic bone marrow transplantation with
co-stimulatory blockade induces macrochimerism and tolerance without
cytoreductive host treatment." Nat. Med. 6, 464–469 (2000)].
Die Notwendigkeit zur Entwicklung
von Alternativen zu den derzeit verfügbaren Immunsuppressiva zur Erzeugung
von Toleranz ergibt sich unter zwei wesentlichen Gesichtspunkten.
Zum einen sind die bisher klinisch verfügbaren Immunsuppressiva nicht
in der Lage, die chronische Transplantatabstoßung zu verhindern, und zum
anderen gehen mit der permanenten Einnahme von Immunsuppressiva
erhebliche Nebenwirkungen einher, die den Patienten gegenüber viralen,
bakteriellen und mykotischen Infektionen anfällig machen, und die durch
Malignomentstehung und durch Erkrankungen des Herzkreislaufsystems,
insbesondere durch Herzinfarkte und durch Herzinsuffizienz [vgl.
Wheeler, D. C. und Steiger, J. "Evolution and Etiology of Cardiovascular
Diseases in Renal Transplant Recipients" Transplantation 70, 41–45 (2000)]
erhebliche Gefährdungen
erzeugen.
Es wird daher dringend ein klinisch
umsetzbares Konzept zur Induktion Spender-spezifischer Toleranz benötigt, d.h.,
ein Konzept, wonach die Immunantwort des Wirts gegenüber den
Gewe beantigenen, die auf dem von dem Spender übertragenen Organ vorhanden
sind, spezifisch unterdrückt
wird, bei dem jedoch ansonsten die Immunkompetenz des Wirts vollständig erhalten
bleibt.
Durch ein derartiges Konzept würde sich
auch mittelfristig eine deutliche Senkung der Diskrepanz zwischen
Organbedarf und Organangebot ergeben, da auf diese weise weitaus
weniger Organe durch akute und chronische Abstoßungsvorgänge verlorengehen würden. Der
Mangel an verfügbaren
Organen sei anhand einer Statistik aus den USA vom Februar 2001
erläutert:
Tabelle
1:
Aktuelle Daten aus der "UNOS (United Nations Organ Share
Registry) National Patient Waiting List for Organ Transplant (Februar
2001)"
Auf diese weise erklären sich
die immensen nationalen und internationalen Bemühungen, Konzepte für die Induktion
Spenderspezifischer Toleranz zu entwickeln.
Aufgabe der Erfindung ist es daher,
Mittel zur Verfügung
zu stellen, mittels derer die T-Zellen des Empfänger-Organismus auf solche
Weise beeinflußt
werden, daß sie
die jeweiligen fremden Zellen, Gewebe oder Organe langfristig ohne
Abstoßung
tolerieren bzw. akzeptieren. Die Beschaffenheit dieser Mittel sowie
ihre Erzeugung oder Verwendung sollten dabei keine ethischen und/oder
rechtlichen Probleme verursachen, und sie müssen schnell für den geplanten
Therapieeinsatz in den dazu erforderlichen Mengen und zu vertretbaren Herstellungskosten
erzeugt werden können.
Zur Lösung der Aufgabe dienen die
erfindungsgemäßen Transplantat-Akzeptanz
induzierenden Zellen (TAIZ) monozytären Ursprungs aus vertebraten
Lebewesen, insbesondere aus Menschen. Erfindungsgemäß hat es
sich überraschenderweise
gezeigt, daß erfindungsgemäß modifizierte
Monozyten aus dem Blut des Spenders (Organ-Donors) in der Lage sind,
bei prä-
und/oder postoperativer Gabe den Empfängerorganismus vor dessen Körper-eigenen,
durch den fremden MHC-Komplex aktivierten T-Zellen zu schützen und
damit die Abstoßung
des Transplantats zu verhindern. Die modifizierten Zellen lösen bei
bestimmungsgemäßer Verwendung
zur Induktion von Transplantat-Toleranz als "zelluläre Therapeutika"
keine oder keine nennenswerten Nebenwirkungen im Sinne der zellulären Abstoßung, der
Induktion von Tumoren, insbesondere von bösartigen Tumoren, und der Transplantat-gegen-Wirt
Erkrankung in dem jeweiligen Patienten aus.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt,
daß das
erfindungsgemäße Verfahren
zur in vitro Modifikation von Monozyten in solcher Weise führt, daß Zellen
erhalten werden, die die Eigenschaften aufweisen, nach der Injektion
in einen nicht-immunsupprimierten allogenen Empfänger die natürlicherweise
einsetzende Immunantwort gegen Zellen oder Gewebe des Spenders abzuwehren,
und die so in der Lage sind, für
mindestens 3 Wochen im peripheren Blut zu zirkulieren. Nach Gabe
von etwa 105 Zellen/kg Körpergewicht (KG) liegt der resultierende
Chimerismus im Bereich von 5–20%.
Dieser transiente Chimerismus induziert
- a)
Langzeitakzeptanz für
nachgeschaltete Organtransplantationen vom gleichen Spender, vorzugsweise
innerhalb von 10 Tagen nach intravenöser Gabe der Zellen, und
- b) Langzeitakzeptanz in Verbindung mit kurzfristiger immunsuppressiver
Behandlung bei Verwendung der Zellen im Anschluß an die Organtransplantation.
Beschreibung
der Figuren
1:
Durchfluflzytometrische Bestimmung der Bindungsfähigkeit von GM-7 an monozytäre Ursprungszellen
vor (linke Graphik) und nach (rechte Graphik) der erfindungsgemäßen Modifikation
der Zellen. Die x-Achse
gibt die Anzahl der gebundenen Zellen wieder.
2A:
Kaplan-Meier-Überlebenskurven
von Herztransplantaten nach heterotopen Herztransplantationen mit
und ohne prä-operative
Gabe von aus dem Spender abgeleiteten TAIZ im Rattenmodell (n =
10 Tiere pro Gruppe).
2B:
Histologisches Präparat
eines LEW-Allotransplantats am 150. POT (postoperativen Tag) nach heterotoper
Transplantation in das Abdomen einer DA-Empfängerratte,
die am Tag – 7
mit 106 LEW-abgeleiteten TAIZ vorbehandelt
worden war. Vergrößerungsfaktor:
40.
2C:
Histologisches Präparat
aus dem Thymus einer mit 106 LEW-abgeleiteten
TAIZ vorbehandelten DA-Ratte nach Markierung des Präparats mit
dem für
LEW-MHC-Klasse I
spezifischen monoklonalen Antikörper
I 1.69. Vergrößerungsfaktor:
40.
2D:
Durchflußzytometrischer
Nachweis von Spender-abgeleiteten Zellen in vier nicht immunsupprimierte
DA-Empfängerratten
nach Injektion von LEW-abgeleiteten TAIZ (Ratten 1–3: 106 Zellen / kg × KG; Ratte 4: 104 Zellen/kg × KG) .
3:
Kaplan-Meier-Überlebenskurven
von Herztransplantaten nach heterotopen Herztransplantationen mit
und ohne post-operative Gabe von aus dem Spender abgeleiteten TAIZ
in Verbindung mit einer initialen Gabe von 4 Zyklen Cyclosporin
A (CSA; 5mg/kg xKG) im Rattenmodell (n = 6–10 Tiere pro Gruppe).
4A–C:
Kaplan-Meier-Überlebenskurven
von Herz-(A), Leber(B) und Nieren-(C) Transplantaten nach heterotopen
(A und C) bzw. orthotopen (B) Transplantationen mit und ohne prä-operativer
Gabe von aus dem Spender abgeleiteten TAIZ (n = 6 Tiere pro Gruppe).
4D–F:
Histologische Präparate
von DA-Transplantaten der Niere (D), der Leber (E) und der Haut (F)
nach heterotoper Transplantation in eine LEW-Empfängerratte.
5A:
Kaplan-Meier-Überlebenskurven
von Herztransplantaten nach .heterotopen Herztransplantationen verschiedener
Inzuchtstamm-Kombinationen mit und ohne post-operative Gabe von
aus dem Spender abgeleiteten TAIZ in Verbindung mit einer initialen
Gabe von 4 Zyklen CSA (5mg/kg × KG)
im Rattenmodell (n = 6 Tiere pro Gruppe).
5B:
Kaplan-Meier-Überlebenskurven
von Herztransplantaten nach heterotopen Herztransplantationen 7
Tage nach Gabe von unterschiedlich präparierten Blutmonozyten aus
LEW-Spendertieren (n = 6 Tiere pro Gruppe).
6A:
Kaplan-Meier-Überlebenskurven
von Lungentransplantaten nach orthotopen linksseitiger Lungentransplantationen
in Schweinen ("outbred minipigs") unter Verwendung einer Tripleimmunsuppression aus
CSA, Azathioprin (AZA) und Steroiden (STE). (n = 4 Tiere pro Gruppe).
6B:
Röntgenthoraxaufnahmen
(posterior-anterior-Technik) von zwei einseitig links lungentransplantierten
Schweinen ("outbred minipigs") am 41. bzw. 55. POT. Die Tripleimmunsuppression
aus CSA, AZA und Steroiden wurde 28 Tage nach Transplantation abgesetzt.
7A:
Gemischte Lymphozytenkultur aus TAIZ eines Individuums B, Responderzellen
eines MHC-diskordanten Spenders A und bestrahlten Zellen eines Spenders
C. Suppressionswirkung von TAIZ des Individuums B (schwarze Säulen) und
unbehandelter Monozyten des Individuums B (graue Säulen). Weiße Säulen: Medium
ohne Zusatz von inhibitorischen Zellen.
7B:
Gemischte Lymphozytenkultur aus Zellen eines Individuums B (lymphozytäre Zellpopulation, CD20+: graue Säule; monozytäre Zellpopulation,
CD14+: schwarze Säule), Responderzellen eines
MHC-diskordanten Spenders A und bestrahlten Zellen eines Spenders
C zum Vergleich der Suppressoraktivität von CD14+ und
CD20+-Zellen.
7C:
Gemischte Lymphozytenkultur aus CD14+-Monozyten
eines Individuums B (GM-7– : graue Säule; GM-7+: schwarze Säule), Responderzellen eines
MHC-diskordanten Spenders A und bestrahlten Zellen eines Spenders
C zum Vergleich der Suppressoraktivität von CD14+/GM-7+- und CD14+/GM-7+-Zellen.
Die TAIZ gemäß der Erfindung werden zur
Herbeiführung
von Transplantatakzeptanz in der Regel in einer Menge von 104–106 Zellen je Kilogramm Körpergewicht, vorzugsweise 105 Zellen je Kilogramm Körpergewicht, eingesetzt. Die
Gabe der TAIZ kann mehrfach erfolgen, vorzugsweise bei großer MHC-Differenz
dreimal im Abstand von etwa 10 Tagen. Die hierzu erforderliche Gesamtzellzahl
kann innerhalb von 6 bis 8 Tagen nach Blutabnahme kostengünstig bereitgestellt
werden.
Die erfindungsgemäßen Zellen (TAIZ) haben sich
im Tierversuch und in Kultur als risikolos bezüglich der Malignomentstehung
erwiesen, ein Ergebnis, welches aufgrund der Natur der monozytären Ursprungszelle,
von der die erfindungsgemäßen Zellen
abgeleitet sind, auch nicht anders zu erwarten war.
Die wesentlichen Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens
zur Herstellung von TAIZ monozytären Ursprungs
umfassen:
- (a) Isolieren von Monozyten aus Blut,
vorzugsweise aus humanem Blut;
- (b) Vermehren der Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium,
welches ein wachstumsförderndes
Mittel, vorzugsweise den Makrophagenkolonie stimulierenden Faktor
(nachfolgend als M-CSF bezeichnet) enthält; und
- (c) Stimulation der Monozyten mit γ-Interferon (nachfolgend als γ-IFN bezeichnet);
- (d) Gewinnung der in Stufe c) gebildeten Transplantat-Akzeptanz
induzierende Zellen durch Abtrennen der Zellen von dem Kulturmedium.
Es konnte erfindungsgemäß gezeigt
werden, daß die
Stimulierung mit γ-IFN
einen entscheidenen Schritt bei der Herstellung der TAIZ darstellt
(vgl. Beispiel 7B).
Nach in vitro Kultivierung und Stimulation
der Ursprungszellen (Monozyten) mit γ-Interferon entsteht eine Subpopulation
von Zellen (60–70s
der Gesamtzellen), die den monoklonalen Antikör per GM-7 bindet, der von der
Hybridomzellinie DSM ACC2542 gebildet wird. Bei dem monoklonalen
Antikörper
GM-7 handelt es sich um einen Antikörper vom Immunglobulin Isotyp
IgG2a, dessen leichte Kette den kappa-Isotyp
besitzt. Charakteristisch für
diesen Antikörper
ist seine stringente Bindungsfähigkeit
an die durch die erfindungsgemäßen Kulturbedingungen
modifizierten Monozyten, da die monozytäre Ursprungszelle nicht erkannt
wird, d.h. eine Bindung des Antikörpers an die Ursprungszelle
findet nicht statt. Darüber
hinaus wurde an 20 freiwilligen Probanden gezeigt, daß GM-7 auch
nicht an humane Zellen im peripheren Blut bindet.
Der Antikörper wurde durch Immunisieren
von Mäusen
mit von humanen Monozyten abgeleitetetn TAIZ nach dem Fachmann bekannten
Verfahren hergestellt (Davis, W.C. "Methods in Molecular Biology:
Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press Inc. Totowa,
1995). Durch Fusion einer den Antikörper produzierenden B-Zelle
und einer Myelomzelle aus der Maus wurde im folgenden eine Hybridomazellinie
hergestellt. Verfahren, die der Herstellung solcher Zellinien dienen,
sind im Stand der Technik bekannt (Davis, W.C. "Methods in Molecular
Biology: Monoclonal Antibody Protocols", New York: Humana Press
Inc. Totowa, 1995; Kohler, G., Milstein, C. "Continuous cultures
of fused cells secreting antibody of predefined specifity", Nature
256, 495–497
(1975)). Die den Antikörper
GM-7 produzierende Hybridomazellinie wurde nach den Vorschriften
des Budapester Vertrages bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Deutschland) unter der Nummer
DSM ACC2542 hinterlegt.
1 zeigt
die in der Durchflußzytometrie
ermittelte Bindungsfähigkeit
von GM-7 an monozytäre
Zellen nach erfindungsgemäßer in vitro
Modifikation. Es läßt sich
erkennen, daß die
direkt aus Buffy-coat gewonnenen CD14-positiven Monozyten den Antikörper GM-7
nicht binden (die grau unterlegte Wolke ist deckungsgleich mit der
nicht unterlegten Antikörperkontrolle).
Dagegen exprimieren ein Teil der Monozyten nach Kultivierung in Gegenwart
von M-CSF und Stimulation mit γ-IFN
ein Antigen, welches vom monoklonalen GM-7 Antikörper erkannt wird. Der monoklonale
Antikörper
GM-7 wurde als Isotyp κ-IgG2a charakterisiert. Das erfindungsgemäße Verfahren
führt somit
zur Änderung
des phenotypischen Musters der Antigenexpression auf der Zellmembran
der modifizierten Monozyten (1).
Der monoklonale Antikörper GM-7
bindet spezifisch an diejenige Zellpopulation, die unter denjenigen Zellen,
die durch das erfindungsgemäße Verfahren
erzeugt worden sind, die wirkungsvollste Transplantat-Akzeptanz
induzieren (vgl. Beispiel 9). Der erfindungsgemäße Antikörper GM-7 repräsentiert
somit ein außerordentlich
wirksames und leicht handhabares Mittel zur Selektion und Aufreinigung
der die Transplantat-Akzeptanz induzierenden Zellen (TAIZ). Mit
Hilfe des Antikörpers
läßt sich
erfindungsgemäß eine homogene
und hochwirksame TAIZ-Population generieren.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung selektiert man im Anschluß an die Stufen c) oder d)
des oben erwähnten
Verfahrens die Transplantat-Akzeptanz induzierenden Zellen durch
Bindung an den von der Hybridomzellinie DSM ACC2542 produzierten
Antikörper
GM-7.
Zur Selektion der erfindungsgemäßen TAIZ
wird der Antikörper
mit der Probe unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die eine Bindung
des Antikörpers
an die in der Probe befindlichen Transplantat-Akzeptanz induzierenden
Zellen erlauben. Die aus der Bindung resultierenden Reaktionskomplexe
werden anschließend von
der Probe separiert. Zu diesem Zweck kann der Antikörper vor
dem Kontakt mit der Probe auf einem Trägermaterial immobilisiert werden;
er kann beispielsweise an eine für
chromatographische Zwecke verwendbare Matrix oder an sog. "magnetic
beads" gebunden werden. Dieses Vorgehen ermöglicht, Transplantat-Akzeptanz
induzierende Zellen aus großen
Probenvolumina zu selektieren und anzureichern.
Zur Gewinnung der Transplantat-Akzeptanz
induzierenden Zellen wird nach der Separierung des Reaktionskomplexes
von der Probe die Bindung zwischen Antikörper und Transplantatakzeptanz
induzierenden Zellen gelöst.
Dies kann nach im Stand der Technik bekannten Methoden wie z.B.
durch kompetitive Verdrängung
oder durch waschen mit Salzlösungen
erfolgen.
Der monoklonale Antikörper GM-7
erlaubt ferner den qualitativen und quantitativen Nachweis der erfindungsgemäßen Transplantat-Akzeptanz induzierenden
Zellen monozytären
Ursprungs in Blut- und/oder Gewebeproben
des Patienten in vitro. Bei diesem Patienten kann es sich beispielsweise
um den Empfänger eines
noch zu transplantierenden oder eines bereits transplantierten Organs
handeln. Die Bildung von Reaktionskomplexen in der Probe, die das
Vorhandensein und gegebenenfalls die Menge der Transplantat-Akzeptanz
induzierenden Zellen anzeigen, wird mittels bekannter Verfahren
nachgewiesen.
Zum Nachweis der Reaktionskomplexe
kann vorliegend beispielsweise der Antikörper GM-7 direkt mit einem
nachweisbaren Molekül
gekoppelt ("markiert") werden, das z.B. kovalent an den Antikörper gebunden wird.
Geeignete nachweisbare Moleküle
sind auf dem Gebiet der molekularen Diagnostik in großer Anzahl
beschrieben und umfassen u.a. Fluoreszenzfarbstoffe, wie beispielsweise
Fluarescein-Isothiocyanat oder Tetramethylrhodamin-5-isothiocyanat,
Lumineszenzfarbstoffe, radioaktiv markierte Moleküle und Enzyme,
wie beispielsweise Peroxidasen (vgl. Lottspeich, F., Zorbas, H.
"Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin,
1998).
Der Nachweis des Antikörpers erfolgt
in Abhängigkeit
des Moleküls,
das zu seiner Markierung gewählt wurde.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde der Antikörper GM-7
mit dem fluoreszierenden Molekül Fluorescein-Isothiocyanat
(FITC) gekoppelt, sodaß der
Nachweis des Antikörpers
mittels Durchflußzytometrie und/oder
Fluoreszenzmikroskopie erfolgen konnte. Ver fahren zur Markierung
von Antikörpern
mit FITC sind dem auf dem Gebiet tätigen Fachmann bekannt.
Alternativ kann der Reaktionskomplex
auch in einem zweistufigen Verfahren mit Hilfe von sekundären Antikörpern nachgewiesen
werden. Dabei kann der unmarkierte Antikörper GM-7 im Reaktionskomplex
mit einem weiteren, markierten Antikörper nachgewiesen werden (vgl.
Lottspeich, F., Zorbas, H. "Bioanalytik", Spektrum Akademischer
Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin, 1998). Dieses zweistufige Nachweisverfahren
ist erheblich empfindlicher als der direkte Bindungsnachweis des
erfindungsgemäßen Antikörpers, da
mehrere markierte sekundäre
Antikörper
an einen GM-7-Antikörper
binden können
(Signalverstärkung).
Der Antikörper GM-7 erlaubt demgemäß den Nachweis
von TAIZ im peripheren Blut der mit TAIZ behandelten Patienten,
beispielsweise in Form eines "monitoring", bei dem in definierten
Zeitabständen
die Anzahl der Zellen im peripheren Blut bestimmt wird. Es wurde
erfindungsgemäß gezeigt,
daß die
Gegenwart von TAIZ, die aus Monozyten des Spenders hergestellt wurden,
im peripheren Blut des Transplantatempfängers im Tierversuch mit Toleranz
des transplantierten Organs korreliert. Diese Erkenntnis erlaubt
dem Kliniker daher das Ausschleichen, d.h. die stufenweise Reduktion
der Dosis gegebenenfalls verabreichter Immunsuppressiva. Bisher
war es aus klinischer Sicht nicht möglich, gezielte Aussagen darüber zu treffen,
ob das Immunsystem eines Patienten zu einem gegebenen Zeitpunkt
nach Transplantation Toleranz aufweist.
Wie für den Fachmann ersichtlich,
können
auch monoklonale Antikörper
gegen TAIZ aus Monozyten nicht-humaner Vertebraten, insbesondere
aus erfindungsgemäß modifizierten
Monozyten von Primaten und Schweinen, hergestellt werden. Dabei
erfolgt die Immunisierung der entsprechenden Wirtstiere und die
Generierung der jeweiligen Hybridom-Zellinien wie oben für die TAIZ
humanen Ursprungs beschrieben. Die Generierung von wirkungsvollen
TAIZ- Populationen
aus anderen Spezies leistet einen bedeutenden Beitrag auf dem Gebiet
der xenologen Transplantionsmedizin.
Die erfindungsgemäßen TAIZ sind per se als pharmazeutisches
Präparat
einsetzbar. In Kulturmedium (vgl. Beispiel 2) können diese Zellen mindestens
48 Stunden lang gehalten werden, ohne ihre Toleranz induzierende
Wirkung zu verlieren.
Für
den Einsatz als pharmazeutisches Präparat können die TAIZ suspendiert in
humanem AB-Serum (universal verwendbar) intravenös als Kurztransfusion verabreicht
werden. Zur Induktion von Transplantat-Akzeptanz bei allogener Transplantation
können
die aus Monozyten des Spenders generierten TAIZ dem MHC-differenten
Empfänger
entweder prä-operativ
oder post-operativ injiziert werden. Bei prä-operativer Verabreichung sollten
die TAIZ etwa 1 Woche vor der Operation ein- oder dreimal injiziert
werden. Bei post-operativer Verabreichung sollte der Zeitraum zwischen
Operation und der erstmaligen Verabreichung der Zellen nicht länger als
7 Tage betragen. Die erfindungsgemäßen TAIZ sind dann in der Lage,
die T-Zell-Antwort des Immunsystems des Empfängers gegen das Transplantat
abzuwehren und ausreichend lange im Empfängerblut zu persistieren, um
langfristige Transplantat-Rkzeptanz
zu gewährleisten.
Die prä-operative intravenöse Injektion
kommt im Rahmen von Lebendspenden in Betracht; wenn es sich hingegen
um eine Leichenspende handelt, so ist die post-operative Verabreichung
der erfindungsgemäßen TAIZ
angezeigt. Im Falle einer Leichenspende wird der Körper des
Spenders durch Kanülierung
der Hauptschlagader mit einem Perfusionsmedium zur Organkonservierung
durchspült.
Hierbei wird das venöse Blut
normalerweie über
die Hohlvene abgesaugt und verworfen. Zur Gewinnung der erfindungsgemäß einzusetzenden
TAIZ kann das venöse
Blut gesammelt und wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet werden.
Bei postoperativer Applikation der
erfindungsgemäßen TAIZ
im Rahmen der Leichenspende kann die Zeit zwischen Transplantation und
Applikation der Zellen durch Kombination mit Immunsuppressiva überbrückt werden,
um eine akute Abstoßung
des Organs während
des Intervalls zwischen Transplantation und Bereitstellung der aus
dem Spenderblut gewonnenen TAIZ zu vermeiden. In diesem Zusammenhang
kommt die therapeutische Kombination mit herkömmlichen Immunsuppressiva,
beispielsweise mit Calcineurin-Inhibitoren wie
Cyclosporin A (CSA) oder Tacrolimus oder mit Azathioprin (AZA),
Mykophenolatmophetil, Rapamycin, monoklonalen Antikörpern (ATG,
ALG, Dicliziumab, Basiliximab) oder mit Steroiden (STE) in Betracht.
Die Gegenwart der Immunsuppressiva im Empfängerblut übt keinen negativen Einfluß auf die
Wirksamkeit der Immunsuppressiva einerseits oder der TAIZ andererseits
aus.
In diesem Sinne können die erfindungsgemäß modifizierten
Zellen monozytären
Ursprungs als "Vehikel zum Toleranztransfer" für jedes zelluläre Transplantat
(wie beispielsweise Inselzellen, Hepatozyten, adulte Stammzellen
und für
jeden anderen programmierten Zelltyp bzw. Gewebetyp) und Organ (wie
beispielsweise Niere, Leber, Herz) eingesetzt werden, soweit sie
mit den zu transplantierenden Zellen (Organen) genetisch identisch
sind, d.h., sie müssen
vom Spender selbst oder von dessen identischem Zwilling stammen.
Die TAIZ erfüllen
ihre protektive Funktion, indem sie das Anwachsen der transplantierten
Zellen/Organe erlauben und damit dem Empfänger die Nebenwirkungen einer
längerfristigen
immunsuppressiven Therapie ersparen.
Die Erfindung wird nachfolgend im
einzelnen erläutert:
Ausgangsmaterial
für das
erfindungsgemäße Verfahren
sind Blutmonozyten. Vorzugsweise handelt es sich um Monozyten aus
menschlichem Blut. Zum Zwecke der Induktion von Transplantat-Akzeptanz müssen die
Zellen vom Spender des Transplantats (oder von dessen identischem
Zwilling) stammen. Bei xenologer Transplantation von beispielsweise
Affen- oder Schweineorganen in Menschen, müssen die erfindungsgemäßen TAIZ demgemäß von Monozyten
des jeweiligen Spender-Tieres abgeleitet sein.
Zur Gewinnung der Monozyten kann
das Blut zunächst
nach üblicher
Behandlung mit einem Antikoagulans auf bekannte weise, vorzugsweise
durch Zentrifugation, in Plasma sowie in weiße und rote Blutzellen getrennt
werden. Nach der Zentrifugation findet sich das Plasma im Überstand;
darunter liegt eine Schicht, welche die Gesamtheit der weißen Blutzellen
enthält.
Diese Schicht wird auch als "buffy coat" bezeichnet. Darunter befindet
sich die rote Blutzellen enthaltende Phase (Hämatokrit).
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird zunächst
die "buffy coat"-Schicht isoliert und zur Gewinnung der Monozyten
beispielsweise durch Zentrifugieren nach bekannten Verfahren aufgetrennt.
Gemäß einer
bevorzugten Verfahrensvariante wird die "buffy coat"-Schicht auf
ein Lymphozyten-Separationsmedium (Ficoll-Hypac) geschichtet und
zentrifugiert (vgl. Beispiel 1). Durch weiteres Zentrifugieren und
Spülen wird
die Fraktion der Monozyten aus dem Blut gewonnen (vgl. Beispiel
1).
Beispiele für alternative Verfahren zur
Gewinnung der Monozyten aus dem Vollblut sind das "Fluorescent-Activating
Cell Sorting" (FACS), das "Immuno Magnetic Bead Sorting" und "Magnetic
Activated Cell Sorting" (MACS), oder das sogenannte "Rosetting-Verfahren", vgl.
Gmelig-Meyling F. et al., "Simplified procedure for the Separation
of human T- und non-T-cells", Vox Sang. 33, 5–8 (1977).
Für
die Herstellung einer ausreichenden Menge an TAIZ ist es zunächst erforderlich,
die Monozyten zu vermehren. Zu diesem Zweck können bekannte, für Monozyten
geeignete Wachstumsmedien verwendet werden, das Medium muß jedoch
einen für
Monozyten geeigneten Wachstumsfaktor enthalten; erfindungsgemäß ist M-CSF
(macrophage-colony-stimulating-factor) besonders bevorzugt. M-CSF (auch als CSF-1
bezeichnet) wird von Monozyten, Fibroblasten und endothelialen Zellen
produziert . Die Konzentration von M-CSF in dem Kulturmedium kann
von 2 bis 20 μg/l
Medium, vorzugsweise 4 bis 6 μg/l
und in besonders bevorzugter Weise 5 μg/l betragen.
Anschließend oder gleichzeitig müssen die
Zellen mit γ-2FN
stimuliert werden, d.h., in Gegenwart von γ-IFN kultiviert werden. Die
Stimulierung der Monozyten mit γ-IFN
erfolgt nach einer 3 bis 6 Tage langen initialen Vermehrungsphase
in dem den Wachstumsfaktor enthaltenden Kulturmedium. Vorzugsweise
am 4. Tag nach Beginn der Kultivierung wird mit γ-IFN stimuliert und die Stimulierung
erstreckt sich über
einen Zeitraum von 24 bis 72 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden,.
unter Brutschrankbedingungen, d.h., bei 37°C und 5% CO2 Atmosphäre.
Die Konzentration von γ-IFN in dem
Medium kann von 0,1 bis 20 ng/ml, vorzugsweise 1 bis 10 ng/ml und
in besonders bevorzugter Weise 5 ng/ml betragen.
Die Stimulierung mit γ-IFN kann
gleichzeitig mit der Vermehrung der Monozyten in dem Wachstumsfaktor
enthaltenden Medium beginnen. Die Stimulierung im Anschluß an eine
3 bis 6 Tage lange initiale Vermehrungsphase, wie oben angegeben,
ist jedoch bevorzugt. Vermehrung der Zellen und Stimulierung mit γ-IFN sollten
insgesamt nicht mehr als 8 Tage in Anspruch nehmen. In jedem Falle
sollte die Behandlung mit γ-IFN
im Anschluß an
die Vermehrungsphase über
mindestens 24 Stunden, maximal 72 Stunden, vorzugsweise 48 Stunden
durchgeführt
werden. Der Zeitraum für
die Vermehrung und Stimulierung der Zellen sollte demnach ingesamt
4 bis 8 Tage betragen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird die Vermehrung und die Stimulierung mit γ-Interferon
wie in Beispiel 2 angegeben auf solche Weise durchgeführt, daß die Monozyten
zunächst
in einem den Wachstumsfaktor enthaltenden Kulturmedium vermehrt
werden, und dem Kulturmedium nach 3 bis 6 Tagen γ-IFN in einer solchen Menge
zugesetzt wird, daß eine
Konzentration 0,1 bis 20 ng/ml, vorzugsweise 1 bis 10 ng/ml und
in besonders bevorzugter Weise 5 ng/ml in dem Medium erreicht wird.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren
in Kulturgefäßen durchgeführt, deren
Oberfläche zuvor
mit fötalem
Kälberserum
(FCS) oder alternativ mit humanem AB-Serum beschichtet wurde (vgl.
Beispiel 2). Die Beschichtung mit FCS kann dadurch erfolgen, daß man die
Oberfläche
der Kulturgefäße vor Ingebrauchnahme
mit FCS bedeckt, und nach einer Einwirkungszeit von einigen Stunden,
insbesondere 4 bis 72 Stunden, vorzugsweise 12–48 Stunden, und in besonders
bevorzugter weise 24 Stunden, das nicht an der Oberfläche haftende
FCS auf geeignete Weise entfernt.
Aufgrund ihrer adhäsiven Eigenschaften
haften die Monozyten und die während
des Verfahrensablaufs aus diesen hervorgehenden TAIZ am Boden des
jeweiligen Kulturgefäßes. Die
Ablösung
der adhärenten Zellen
kann auf mechanische Weise, beispielsweise mit einem feinen Zellschaber
oder Spachtel erfolgen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
erfolgt die vollständige
Ablösung
der Zellen jedoch durch Behandlung mit einem geeigneten Enzym, beispielsweise
mit Trypsin (vgl. Beispiel 2). Die Trypsinlösung (0,1 bis 0,025 g/l, vorzugsweise
0,05 g/l, kann 2 bis 10 Minuten lang bei 35°C bis 39°C, vorzugsweise bei 37°C, in Gegenwart
von 5% CO2 auf die Zellen einwirken.
Die Enzymaktivität wird sodann auf übliche Weise
blockiert, und die nun frei flottierenden TAIZ können auf übliche Weise durch Zentrifugieren
gewonnen werden. Sie stehen nunmehr, entweder suspendiert in einem
geeigneten Medium, beispielsweise in PBS, für den sofortigen Einsatz zur
Verfügung.
Sie können
jedoch auch einige Tage lang, insbesondere etwa 2 Tage lang, in
einem Nährmedium
(vgl. Beispiel 2) gehalten werden, wobei dieses Aufbewahrungsmedium
weder den Wachstumsfaktor noch γ-IFN
enthalten sollte. In einem derartigen Nährmedium können die Zellen mindestens
48 Stunden lang als TAIZ aufbewahrt werden.
Für
die längere
Lagerung können
die Zellen tiefgefroren werden. Protokolle zum Tiefgefrieren lebender
Zellen sind im Stand der Technik bekannt, vgl. Griffith M. et al.,
Epithelial Cell Culture, Cornea, in methods of tissue engineering,
Atala A. und Lanza R.P., Academic Press 2002, Kapitel 4, Seiten
131–140.
Ein bevorzugtes Suspensionsmedium zum Tiefgefrieren der erfindungsgemäßen Zellen
ist DMSO enthaltendes FCS, vgl. Beispiel 2.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand
von Beispielen erläutert.
Beispiel 1
Abtrennen von
Monozyten aus Gesamtblut
Zur Vermeidung der Blutgerinnung
und zum Füttern
der Zellen wurden 450 ml humanes Vollblut in einem 3-Kammerbeutel-Set
mit 63 ml einer Stabilisator-Lösung
vermischt, die je Liter H2O 3, 27 g Citronensäure, 26,3
g Trinatriumcitrat, 25,5 g Dextrose, und 22,22 g Natriumdihydroxyphosphat
enthielt. Der pH-Wert der Lösung
betrug 5,6–5,8.
Zur Blutkomponententrennung erfolgte
anschließend
eine »scharfe
Zentrifugation« dieses
Gemisches zur Blutkomponententrennung, bei 4000 rpm über 7 min
bei 20°C.
Hieraus resultierte eine 3-Schichtung
der korpuskulären
und nicht-korpuskulären
Bestandteile. Durch Einsetzen des Beutelsets in eine dafür vorgesehene
Preßmaschine
wurden dann die Erythrozyten in den unteren Beutel, das Plasma in
den oberen Beutel gepreßt
und der sogenannte Buffy-coat verblieb im mittleren Beutel und enthielt
ca. 50 ml Volumen.
Die Menge von 50 ml frisch gewonnenem
Buffy-coat wurde nun in jeweils 2 Portionen a 25 ml geteilt und
damit jeweils 25 ml Ficoll-Hypaque Separationsmedium überschichtet,
welches zuvor in zwei 50 ml Falconröhrchen gefüllt worden war.
Dieser Ansatz wurde 30 Min. lang
bei 2500 rpm angebremst zentrifugiert. Im Buffy coat noch vorhandene
Erythrozyten und tote Zellen lagen danach unterhalb der Ficoll-Phase,
während
die weißen
Blutzellen einschließlich
der Monozyten als weiße
Interphase auf dem Ficoll separiert sind.
Anschließend wurde die weiße Interphase
der Monozyten vorsichtig abpipettiert und mit 10 ml Phosphat gepufferter
physiologischer Kochsalzlösung
(PBS) gemischt.
Danach wurde dieser Ansatz dreimal
10 Min. lang bei 1800 rpm gebremst zentrifugiert, wobei der Überstand
nach jeder Zentrifugation abpipettiert und mit frischem PBS aufgefüllt wurde.
Das am Boden des Zentrifugationsgefäßes (Falconröhrchen)
gesammelte Zellpellet enthielt die mononukleäre Zellfraktion, d.h. die Monozyten.
Zur Herstellung der für die Rattenexperimente
benötigten
Monozyten, wurden jeweils aus 4 genetisch-identen Spenderratten
25 ml Vollblut isoliert und damit 25 ml Ficoll-Hypaque Seperationsmedium überschichtet.
Es wurde dann analog wie oben beschrieben fortgefahren.
Beispiel 2
Vermehrung und
Modifikation der Monozyten
Die Kultivierung und Vermehrung der
Monozyten erfolgte in Nährmedium
der folgenden Zusammensetzung:
RPMI
1640 Medium |
440
ml |
Foetales
Kälberserum
(FCS), alternativ AB-Serum |
50
ml |
Penicillin/Streptomycin
Lösung |
5
ml |
Gesamtvolumen |
500
ml |
Das
Nährmedium
enthielt 2,5 μg/00
ml M-CSF |
|
Die in Beispiel 1 isolierten Monozyten
wurden in einer Menge von insgesamt 106 Zellen
in 10 ml des Nährmediums
suspendiert und auf eine Petrischale (100 mm Durchmesser) übertragen.
Die Petrischale war zuvor mit reinem inaktivierten FCS gefüllt und
das FCS nach 24 Stunden abgegossen worden, um auf diese Weise eine
FCS beschichtete Platte zu erhalten.
Die Petrischale wurde mit dem zugehörigen Deckel
abgedeckt und 3 Tage lang in einem Brutschrank bei 37°C gehalten.
Die Zellen setzten sich nach 24 Stunden am Boden der Petrischale
ab. Am zweiten Tag wurde der Überstand
abpipettiert und die Petrischale mit 10 ml frischem Nährmedium
wieder aufgefüllt.
Am 4. Tag wurden 50 ng γ-Interferon
in 10 ml Nährmedium
zugesetzt und die Platte wurde wiederum verschlossen und weitere
48 Stunden lang bei 37°C
im Brutschrank gehalten.
Nachfolgend wurden jeweils 10 ml
einer 1:10 mit PBS verdünnten
Trypsinlösung
in die Petrischale pipettiert. Die geschlossene Petrischale wurde
10 Min. lang bei 37°C
im Brutschrank gehalten. Anschließend erfolgte die Separation
der auf dem Boden der Petrischale haftenden Zellen mit einem Zellschaber,
derart, dass der größte Anteil
(> 90%) der Zellen
im Überstand
flottierten.
Der gesamte Überstand (10 ml Trypsinlösung + 10
ml Medium) wurde abpipettiert, in einem 50 ml Falconröhrchen vereinigt
und 10 Min. lang bei 1800 rpm zentrifugiert. Der Überstand
wurde nachfolgend verworfen und der Niederschlag (das verbliebene
Zellpellet) mit frischem Nährmedium
(s.o.) versetzt, wobei pro 106 Zellen 1
ml des Nährmediums
zugesetzt wurden. Die Bestimmung der Zellzahl für die exakte Dosierung erfolgte
nach bekannten Verfahren, vergl. Hay R.J., Cell Quantification and
Characterisation, in Methods of Tissue Engineering, Academic Press
2002, Kapitel 4, S. 55-84.
Diese Zellsuspension wurde zentrifugiert
(1800 rpm, 10 min, s.o.) und das Zellpellet wurde entweder in PBS
oder zur Anwendung beim Menschen in NaCl (physiol.) aufgenommen.
Danach kann die intravenöse Applikation
direkt oder innerhalb von 48 Stunden erfolgen.
Alternativ wurden die Zellen nach
Zentrifugation und Verwerfen des Trypsin enthaltenden Überstandes mit
FCS/DMSO als Einfriermedium versetzt und in einem Volumen von 10
ml tiefgefroren.
Das Einfriermedium enthielt 95% FCS
und 5% DMSO. Jeweils etwa 106 Zellen wurden
in 1 ml des Mediums aufgenommen und in folgenden Stufen abgekühlt:
30
Min. auf Eis;
2 Stunden bei –20°C im vorgekühlten Styroporkasten;
24
Stunden bei –80°C in Styropor;
Lagerung
in Röhrchen
in Flüssigstickstoff
(N2) bei –180°C.
1 belegt
die mittels Durchflußzytometrie
bestimmten phenotypischen Veränderungen
der Antigenexpression auf den eingesetzten Monozyten nach Kultivierung
und γ-IFN-Stimulation
der monozytären
Ursprungszellen.
Beispiel 3
Anwendung der Transplantat-Akzeptanz
induzierenden Zellen (TAIZ) zur Präkonditionierung des Immunsystems
des Transplantat-Empfängers
Die Anwendung von TAIZ zur Behandlung
eines potentiellen Empfängers
vor der Transplantation bietet sich zum Beispiel für den klinischen
Fall der Lebendspende an, wo bereits im Vorfeld einer Organtransplantation
geklärt
ist, wer spendet und wer das Spenderorgan erhält.
Für
diesen Fall wurde im Rattenmodell die heterotope Herztransplantation
an männlichen
Inzuchtratten der Stammkombination LEW [RT1.1]
(im Rahmen der vorliegenden Erfindung als "LEW" bezeichnet) → DA[RTl.avl] (im Rahmen der vorliegenden Erfindung
als "DA" bezeichnet) in der von Ono und Lindsey beschriebenen Technik
(Ref. Ono, K. & Lindsey,
E.S. Improved technique of heart transplantation in rats. J. Thorac. Cardiovasc.
Surg. 57, 225–229
(1969)) durchgeführt.
DA Empfängerratten
erhielten zunächst
am Tag –7
vor der Transplantation 106 von LEW-Monozyten
abgeleitete TAIZ in 1 ml PBS intravenös verabreicht. Hiernach erfolgte
sieben Tage später
die Transplantation eines vom LEW-Rattenstamm entnommenen Herzens, welches
heterotop in das Abdomen (Leibeshöhle) des DA-Empfängertieres
eingepflanzt wurde. Da es sich bei den verwendeten Rattenstämmen um
Inzuchtstämme
handelt, exprimierten die erfindungsgemäßen TAIZ die identischen Gewebeantigene
wie das transplantierte LEW-Herz.
Zur Kontrolle erfolgte eine sogenannte
Drittstammtransplantation. Hierbei wurden wiederum am Tag –7 (d.h.
7 Tage vor dem operativen Eingriff) vom gleichen LEW-Spendertier
stammende TAIZ (106) intravenös in DA
Tiere injiziert. Sieben Tage danach erfolgte die Transplantation
eines von einem CAP[RTl.c] (im Rahmen der
vorliegenden Erfindung als "CAP" bezeichnet) Ratteninzuchtstamm
entnommenen Herzens. CAP-Ratten exprimieren den Haplotyp RT1.c, sind damit also voll MHC-diskordant (MHC-verschieden)
mit den LEW-Spendertieren. Nachfolgend sind die einzelnen Versuchsgruppen,
in denen eine heterotope Herztransplantation erfolgte (n = 10) dargestellt:
- 1. LEW → DA;
unbehandelt;
- 2. LEW → DR;
106 LEW-abgeleitete TAIZ i.v., Tag –7 vor LEW-Herztransplantation;
- 3. CAP → DA;
106 LEW-abgeleitete TAIZ i.v., Tag –7 vor LEW-Herztransplantation;
- 4. CAP → DA;
unbehandelt;
- 5. LEW → LEW,
unbehandelt;
- 6. LEW → LEW,
106 LEW-abgeleitete TAIZ i.v., Tag –7, vor
LEW-Herztransplant.
Wie aus den Kaplan-Meier-Überlebenskurven
der Herzorgane erkennbar (2A),
wurden 9/10 LEW-Herzen von DA-Empfängertieren langzeit (> 150 Tage) akzeptiert,
wogegen CAP-Drittstammherzen akut, nach 6,7 ± 0,8 Tagen abgestoßen wurden.
Erfolgte keine vorherige Gabe von TAIZ, so wurden auch die LEW-Herzen
akut nach 7,2 ± 1,0
Tagen abgestoßen.
Die Abstoßung
von CAP Herzen durch die im DA-Tier stimulierte Immunantwort nach
6,7 ± 0,8
Tagen erfolgte im gleichen Zeitintervall wie in der unbehandelten
Kontrollgruppe, in der CAP-Herzen von DA-Ratten nach 6,9 ± 1,0 Tagen
abgestoßen
wurden siehe Gruppe 3, respektive Gruppe 4. Alle syngen im LEw → LEW-Ansatz
transplantierten Herzen überlebten
langzeit (> 150 Tage),
unabhängig
davon, ob TAIZ-Vorbehandlungen erfogt waren oder nicht. Hieraus
lässt sich
der Schluß ziehen,
dass TAIZ den Empfängerorganismus
nicht im Sinne einer graft-versus-host disease (Transplantat gegen Wirt
Erkrankung) gefährden.
Ferner lässt
sich aus diesem Ergebnis ableiten, dass die i.v.-Gabe von 106 TAIZ 1 Woche vor Transplantation, die Möglichkeit
zur Induktion von Langzeit-Organakzeptanz eröffnet. Die induzierte Toleranz
ist dabei spenderspezifisch, da eine entsprechende Vorbehandlung
von DA Ratten mit LEW-abgeleiteten TAIZ keine Toleranz für CAP-Drittstamm-Herztransplantate
induziert. Im syngenen LEW > LEw-Ansatz
beeinflusst die zusätzliche
TAIZ-Gabe weder das Überleben
der Empfängertiere
noch der Transplantate.
2B zeigt
die histologische Beurteilung eines LEW-All1otransplantats am 150.
postoperativen Tag (POT) nach heterotoper Transplantation in das
Abdomen einer DA-Empfängerratte.
Die Empfängerratte
war am Tag –7
vor der Transplantation mit 106 LEW-abgeleiteten
TAIZ vorbehandelt worden. Das Transplantat wies bis zurn Zeitpunkt
seiner Entnahme aus der Empfängerratte
(150. POT) eine gute Funktion (kräftiger Herzschlag) auf. Das
histologische Präparat
(× 40)
zeigt eine intakte Herzmuskelmorphologie, normale Gefäßendothelien
und nur minimale Infiltra tion mit mononuclearen Zellen ohne Hinweise
für akute
und chronische Abstoßungsvorgänge.
Bemerkenswert in diesem Zusammenhang
ist auch die Tatsache, daß sich
spenderabgeleitete Zellen (detektiert durch immunhistochemischen
Nachweis mittels dem LEW-MHC-Klasse I-spezifischen Antikörper I1.69)
langzeit, über
ein Jahr, im Thymus der DA-Empfängerratten
nachweisen lassen. 2C zeigt
ein histologisches Präparat
eines am 150. POT entnommenen Thymus einer mit 106 LEW-abgeleiteten
TAIZ vorbehandelten DA-Ratte. Das Präparat wurde mit dem für LEW-MHC-Klasse
I spezifischen monoklonalen Antikörper I 1.69 markiert. Wie der
Figur zu entnehmen ist, führt
die Gabe von TAIZ zur Besiedlung der Thymusdrüse, wo die Präsentation
von Spender-abgeleiteten MHC-Antigenen an die heranreifenden T-Zellen
erfolgt; deutlich zu erkennen sind kleine Nester von Zellen, die
sich mit dem Antikörper
markieren lassen.
Beispiel 4
Nachweis von Spender-abgeleiteten
modifizierten Monozyten im Empfänger
Als mögliche Ursache der erfindungsgemäß induzierten
Toleranz kommt die Induktion eines gemischten Chimerismus in dem
jeweiligen DA-Tier durch die intravenöse Injektion der LEW-abgeleiteten
TAIZ in Betracht. Es wurde daher geprüft, ob sich nach Injektion
von LEW-abgeleiteten TAIZ mittels Durchflußzytometrie langfristig (> 45 Tage) mehr als
5% Zellen im Blut des Empfängertiers
nachweisen lassen. Die Durchflußzytometrie
wurde wie im Stand der Technik beschrieben durchgeführt (Ref.
Preffer FI, Flow cytometry In: Diagnostic Immunopathology, Colvin
RB, Bhan AK, McCluskey, RT (eds.), Raven Press New York, pp. 725–449 (1994)).
Der Nachweis der LEW-Spenderzellen im DA-Empfängerblut erfolgte durch den
monoklonalen Antikörper
I1.69, der LEW-MHC-Klasse
I Antigene spezifisch detektiert (siehe Fändrich F, et al. Nature Med.
8, 171–178,
2002). Die Chimerismusdaten, welche für 4 in Beispiel 3 beschriebenen
LEW → DA
Transplantationen nach Gabe von 106, respektive
104 TAIZ / kg × KG im peripheren Blut der
Empfängertiere
bestimmt wurden, sind in 2D wiedergegeben.
Nach Injektion von LEW-abgeleiteten
TAIZ in vier nicht immunsupprimierte DA Empfängerratten (106. Zellen
/ kg × KG
in Ratten 1–3
und 104 Zellen / kg × KG in Ratte 4) zeigen die
Ratten 1-3 –inen
längerfristigen Chimerismus
(60––80 Tage)
im DA-Empfängerblut,
der sich auf Spender-abgeleitete Zellen zurückführen ließ. Der Nachweis von Spender-abgeleiteten
Zellen erfolgte durch durchflußzytometrische
Bestimmung unter Verwendung des LEW-MHC-Klasse I spezifischen Antikörper I1.69
(ein monoklonaler Antikörper,
der nur an MHC-Klasse I positive Zellen vom LEW-Rattenstamm bindet
und nicht mit Zellen vom DA-Rattenstamm kreuzreagiert. Da quasi
alle Zellen des peripheren Bluts MHC-Klasse I Antigen auf der Zelloberfläche exprimieren, läßt sich
der Anteil an Spenderzellen im peripheren Blut der DA Ratte mit
I1.69 sehr genau bestimmen. Wie die Graphik zeigt, exprimieren 3
von 4 Tieren innerhalb der ersten 6 Wochen nach intravenöser Injektion
der TAIZ mehr als 10% der Zellen das durch I1.69 markierte Spenderantigen.
Ab Tag 60 nach Injektion fällt
dieser Chimerismusanteil im peripheren Blut dieser DA-Ratten deutlich
ab und verschindet mit Tag 100 komplett. Dieser transiente Chimerismus
korreliert aber streng mit dem Transplantatüberleben zweizeitig (d.h. 7
Tage nach TAIZ-Injektion) transplantierter LEW-Herzen, die trotz
fehlendem Spenderchimerismus (ab Tag 100) nicht mehr abgestoßen werden
(im Beispiel Ratte 1-3). Hingegen kann die kurzfristige Chimerismusinduktion
nach Gabe von 104 Zellen / kg × KG (Ratte
4; < 20 Tage) keine
langfristige Transplantatakzeptanz des übertragenen Herzens gewährleisten.
Beispiel 5
Gabe von Spender-abgeleiteten Zellen
post transplantationem Für
den klinischen Fall der Leichenspende sollte nun evaluiert werden,
inwieweit die postoperative Gabe von TAIZ in der Lage war, entsprechende Langzeitakzeptanz
für das
transplantierte Organ im Empfänger
zu induzieren. Hierzu wurden im LEW → DA Ratteninzuchtstammmodell
heterotope Herztransplantationen durchgeführt. Die DA Empfängerratten
erhielten 4 Zyklen Cyclosporin A (CSA) an den Tagen 0, 1, 2 und
3 nach der Transplantation, intravenös, in der Dosierung 5 mg CSA
/ kg × KG.
Am Tag 7 erfolgte dann die intravenöse Gabe von 106 LEW-abgeleiteten
TAIZ, intravenös,
in die Schwanzvene der DA-Empfängerratten.
Als Kontrolle dienten folgende Versuchsgruppen (n = 6–10).
- 1. LEW → DR;
unbehandelt
- 2. LEW → DA;
CSA, 5 mg / kg × KG,
i.v., Tag 0, 1, 2 und 3
- 3. LEW → DA;
CSA, 5 mg / kg × KG,
i.v., Tag 0, 1, 2 und 3 plus 106 LEW-abgeleitete
TAIZ, i.v., Tag 7
- 4. LEW → DA;
106 LEW-abgeleitete TAIZ, i.v., Tag 7
- 5. CAP → DA;
CSA, 5 mg / kg × KG,
i.v., Tag 0, 1, 2 und 3 plus 106 LEW-abgeleitete
TAIZ, i.v., Tag 7
Die postoperative Behandlung der
DA-Empfängerratten
mit 106 LEWabgeleiteten TAIZ, intravenös, am 7.
POT führt
zur Langzeittoleranz, wenn eine initiale Gabe von 4 Zyklen CSA (5mg/kg × KG, i.v.)
von Tag 0–3 erfolgt
ist. Die initiale Gabe von CSR ist notwendig, da die alleinige Behandlung
mit einer einmaligen Gabe von 106 TAIZ am
7. POT (postoperativen Tag) die akute Abstoflung nur in 1/6 Fällen verhinderte.
Die gewählte CSA-Dosis
wirkt hierbei nur subtherapeutisch, da zwar das Transplantatüberleben
verlängert
wird, aber keine Langzeitakzeptanz durch alleinige CSA-Gabe induziert
werden kann. Die induzierte Transplantatakzeptanz ist spenderspezifisch,
da eine entsprechende Behandlung von DA Ratten mit LEW-abgeleiteten
TAIZ keine Toleranz für
CAP-Drittstamm-Herztransplantate induziert.
Wie in 3 ersichtlich
wurden Herzen der Versuchsgruppe 1 akut nach 7,0 ± 0,8 Tagen
abgestoßen. Herzen
der Gruppe 2 wurden verzögert
nach 14,4 ± 7,0
Tagen abgestoßen.
Herzen der Gruppe 3 wurden in 5/6 Fällen länger als 150 Tage akzeptiert.
Im Rattensystem gilt die Akzeptanz von Organen für mehr als 100 Tage bereits
als Langzeitakzeptanz, da die mittlere Lebenserwartung einer Inuchtratte
nur ca. 2 Jahre beträgt. Die
alleinige postoperative Gabe von TAIZ (106 Zellen)
konnte die akute Abstoßung
nur in 1/6 Fällen
verhindern, da die Herzorgane nach 22,6 ± 31,6 Tagen zu schlagen aufhörten (Gruppe
4). Die Drittstammkontrolle mit CAP-Herzen zeigte die Spezifität der induzierten
Transplantatakzeptanz, da Drittstammherzen wiederum akut nach 7,4 ± 2,2 Tagen
abgestoßen
wurden. Diese Ergebnisse belegen auch, dass die zusätzliche
Anwendung von TAIZ keine generelle Immunsuppression erzeugt, da
die akute Abstoßung
der CAP-Herzen nicht verhinderte.
Beispiel 6
Untersuchungen zur Organspezifität der durch
TAIZ induzierten Langzeitakzeptanz
Um auszuschließen, dass TAIZ lediglich für Herztransplantate
einen protektiven Schutz gegen die allospezifische, vom Empfänger gegen
die Spenderantigene-gerichtete Immunantwort vermitteln kann, wurden im
stark abstoßenden
DA → LEW
Ratteninzuchtsystem folgende Organe in folgenden Versuchsgruppen
(n = 6) transplantiert:
- 1. DA (Niere) → LEW; unbehandelt
- 2. DA (Niere) → LEW;
106 DA-abgeleitete TAIZ, i.v., Tag –7 und –1 vor Transplantation
- 3. LEW (Niere) → LEW;
unbehandelt
- 4. DA (Leber) → LEW;
unbehandelt
- 5. DA (Leber) → LEW;
106 DA-abgeleitete TAIZ, i.v., Tag –7 und -1
vor Transplantation
- 6. LEW (Leber) → LEW;
unbehandelt
- 7. DA (Haut) → LEW;
unbehandelt
- 8. DA (Haut) → LEW;
106 DA-abgeleitete TAIZ, i.v., Tag –7 und –1 Transplantation
- 9. LEW (Haut) → LEW;
unbehandelt
Wie aus den in 4A–C dargestellten
Kaplan-Meier-Plots ersichtlich wurden 6/6 Nierenorgane, 5/6 Leberorgane
und 5/6 Hauttransplantate langfristig (> 150). Tage von LEW-Empfängerratten
akzeptiert. Alle syngenen Organtransplantationen dienten zur Kontrolle
der technisch komplikationslosen Durchführung und wurden uneingeschränkt vom
Empfängertier
angenommen (nicht in den Überlebenskurven
gezeigt). Es zeigt sich demnach auch in diesen Versuchsansätzen, daß die intravenöse Vorabinjektion
von 10 × 106 TAIZ Langzeitorganakzeptanz für mehr als
80% der transplantierten Organe induziert.
Die o.a. Nieren-, Leber-, und Hauttransplantate,
die mit und ohne vorheriger Gabe von TAIZ transplantiert worden
waren, wurden im folgenden histologisch untersucht. In 4D erkennt man, daß durch
die zweimalige intavenöse
Inj ektion von 106 TAIZ pro kg Körpergewicht
an den Tagen –7
und –1
vor Transplantation, die Morphologie der Transplantatniere als intakt
(vgl. Kontrollniere und syngenes Transplantat LEW → LEW) zur
Darstellung kommt, wogegen in der nicht-behandelten allogenen Kontrollgruppe
DA → LEw
eine deutliche Inflitration des Transplantates im Interstitium zu
erkennen ist (postoperativer Tag 14). Analog dazu verhält sich das
allogene Lebertransplantat (4E),
welches ohne TAIZ-Vorbehandlung am 12. POT komplett abgestoßen ist
(DA → LEW
ohne TAIZ), wogegen die Vorabgabe von TAIZ das Parenchym der Lebertransplantate
im Vergleich zum syngenen Transplantat völlig homogen und intakt erscheinen
läßt. Auch
das allogene Hauttransplantat (DA) heilt komplikationslos ein (s.
Vergleich zum syngenen LEW-Transplantat) wogegen das simultan mit-transplantierte
CAP-Drittstammtransplantat am 12. Postoperativen Tag bereits akut
abgestoßen wurde.
Dieses Beispiel beweist die Spezifität der durch TAIZ induzierten
Toleranz, da die Vorbehandlung des LEW-Empfängertieres mit DA-abgeleiteten
TAIZ an den Tagen –7
und –1
zur Akzeptanz des DA-Transplantates führt, wogegen das am Tag 0 simultan
mittransplantierte CAP-Hauttransplantat akut abgestoßen wird
( 4F).
Beispiel 7A
Untersuchungen zur Haplotypspezifität der durch
TAIZ induzierten Langzeitorganakzeptanz
Um auszuschließen, dass TAIZ lediglich in
der gewählten
Ratteninzuchtstamm-Kombination LEw → DA Langzeitorganakzeptanz
induziert, wurden folgende weitere Inzuchtstammkombinationen im
heterotopen Herztransplantationsmodell überprüft (n = 6). Dabei wurde u.a.
auch der Inzuchtstamm BN[RT1.n] (im Rahmen der
vorliegenden Erfindung als "BN" bezeichnet) verwendet.
- 1. DA → LEW;
unbehandelt
- 2 . DA → LEW;
CSA, 5 mg / kg × KG,
i.v., Tag 0 , 1, 2 , 3 plus 106 DR-abgeleitete
TAIZ / kg × KG,
i.v., Tag 7 und 10 postoperativ
- 3. CAP → LEW;
unbehandelt
- 4. CAP → LEW;
CSA, 5 mg / kg × KG,
i.v., Tag 0, 1, 2, 3 plus 106 CAP-abgeleitete
TAIZ / kg × KG,
i.v., Tag 7 und 10
- 5. BN → LEW;
unbehandelt
- 6. BN → LEW;
CSA, 5 mg / kg × KG,
i.v., Tag 0, 1, 2, 3 plus 106 BN-abgeleitete
TAIZ / kg × KG,
i.v., Tag 7 und 10
Aus Vorversuchen war bereits bekannt,
dass in der sogennanten "high-responder"-Kombination (DA → LEW), die
mit der stärksten
im Ratteninzuchtmodell bekannten Abstoßungsreaktion einhergeht, die
einmalige postoperative i.v.-Gabe von 106 TAIZ
keine Langzeitakzeptanz erzielen kann. Es wurde daher mit einer zweimaligen
Gabe versucht, die Präsenz
von TAIZ im Empfängertier
zu erhöhen.
Wie aus den zugehörigen
in 5A dargestellten Überlebenskurven
hervorgeht, erreichte die zweimalige Gabe von TAIZ, an den postoperativen
Tagen 7 und 10 verabreicht, eine Langzeitorganakzeptanz in 4/6 Fällen in
Gruppe 2 und in 5/6 Fällen in
den Versuchsgruppen 4. In der BN → LEW-Stammkombination überlebten
alle transplantierten Organe langzeit ohne Hinweise für eine akute
Abstoßung.
In allen Fällen,
in denen die transplantierten Herzen langzeit (> 150 Tage) akzeptiert worden waren, konnte
in den Empfängertieren
ein gemischter Chimerismus während
der ersten 20–45
Tage nach TAIZ-Gabe nachgewiesen werden. Ein frühzeitiges Organversagen dagegen
ging immer mit fehlenden Spenderzellen im peripheren Blut des Empfängers einher.
Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass die i.v.-Gabe von
TAIZ nur dann zur Langzeitorganakzeptanz führt, wenn die Zellen einen gemischten
Spenderchimerismus induzieren, der zumindest für 21 Tage nachweisbar ist.
Damit werden auch die 2D gezeigten
Versuchsergebnisse bestätigt.
Durch die postoperative Gabe von
106 pro kg Körpergewicht, die jeweils an
den Tagen 7 und 10 intravenös
den Empfängertieren
verabreicht wurden, konnte demnach in allen 3 Inzuchtstammkombinationen
in über
80% Langzeittoleranz induziert werden, wenn zusätzlich initial 4 Zyklen CSA
verabreicht wurden.
Beispiel 7B
Untersuchungen zur Bedeutung
der γ-2FN
Stimulation M-CSF-behandelter Monozyten zur in vivo Toleranzinduktion
Um die Effizienz der zusätzlichen
Stimulation M-CSF-behandelter Blutmonzyten mit γ-Interferon auf die Toleranzentstehung
in vivo näher
charakterisieren zu können,
wurden im LEW → DA
Ratteninzuchtmodell für
die heterotope Herztransplantation folgende Versuchsgruppen untersucht
(n = 6 Tiere pro Gruppe):
- 1. LEW → DA, 106 / kg × KG
LEW-abgeleitete Blutmonozyten (unkultivierte Monozyten), i.v., Tag –7 vor Herztransplantation
- 2. LEW → DA,
106 / kg × KG LEW-abgeleitete Blutmonozyten
(M-CSF behandelt),
i.v., Tag –7
vor Herztransplantation
- 3. LEW → DA,
106 / kg × KG LEW-abgeleitete Blutmonozyten
(γ-IFN stimuliert),
i.v., Tag –7
vor Herztransplantation
- 4. LEW → DA,
106 / kg × KG LEW-abgeleitete Blutmonozyten
(M-CSF behandelt
plus γ-IFN
stimuliert), i.v., Tag –7
vor Herztransplantation
Wie aus den Kaplan-Meier Überlebenskurven
der 5B hervorgeht, konnte
die intravenöse
Gabe von frischen, nichtkultivierten LEW-abgeleiteten Blutmonozyten,
7 Tage vor Herztransplantation, die akute Allotransplantatabstoßung der
LEW-Herzen im DA-Empfängertier
nicht verhindern. Die Transplantate dieser Versuchsgruppe wurden
im Mittel (± SD)
nach 7,8 ± 0,8
Tagen abgestoßen.
Hingegen führte
die Vorabgabe von Monozyten, die über 6 Tage mit M-CSF kultiviert
worden waren, zur signifikanten Organüberlebenszeitverlängerung,
da in dieser Versuchsgruppe eine Abstoßung im Mittel erst nach 35,0 ± 51,5
Tagen zu beobachten war. Die alleinige Stimulation frischer Blutmonozyten
mit γ-IFN über 48 Stunden
in RPMI-Medium, welches kein M-CSF
erhielt, konnte die akute Abstoßung
der Herztransplantate, die im Mittel nach 7,8 ± 1,2 Tagen zu schlagen aufhörten, nicht
verhindern. Allein die M-CSF-Behandlung frischer Blutmonozyten über 6 Tage
und die zusätzliche
Stimulation dieser Zellen mit γ-IFN über 48 Std.
(an Tag 5 und 6) führte
zur Langzeitorgantoleranz (> 150
Tagen) in 4 von 6 Transplantaten. Die Ergebnisse zeigen die entscheidende
Bedeutung der zusätzlichen
Stimulation der M-CSF-behandelten Monozyten mit γ-IFN für die Entstehung einer in vivo
Toleranz.
Beispiel 8
Untersuchungen zur Speziesspezifität der durch
TAIZ induzierten Langzeitorganakzeptanz
Um auszuschließen, dass TAIZ lediglich in
der gewählten
Tierspezies Ratte wirksam eine Langzeitorganakzeptanz induzierte, wurden
analog der in Beispiel 2 angegebenen Methodik Zellen monozytären Ursprungs
aus dem Spenderschwein isoliert, wobei die Stimulation mit γ-IFN durch
Zugabe von 1000 U/10 ml Nährmedium
für 24
Std. erfolgte. Anschließend
erfolgte die Prüfung
auf Effektivität
von TAIZ zur Unterdrückung der
akuten Abstoßung
im Modell der linksseitigen Lungentransplantation an "outbred minipigs",
die eine dem Menschen vergleichbare Potenz zum Abstoßen ihrer
Organe aufweisen. Hierbei wird der linksseitige Lungenflügel eines
Spenderschweins entnommen und in ein genetisch differentes Empfängerschwein
orthotop transplantiert (also in die linke Brusthöhle, nachdem
dem Empfängerschwein
zuvor die linke Lunge entfernt worden war). Zum Zeitpunkt der Lungenentnahme
erfolgte simultan die Entnahme von 500 ml Spenderblut, das zur Aufbereitung
der TAIZ aus Monozyten dieses Schweines diente.
Die Empfängertiere wiesen alle ein Gewicht
von 30–35
kg auf. Folgende Versuchsguppen wurden im Schwein (n = 4) etabliert:
- 1. CSA, 5 g / Tag, 50 mg Azathioprin / Tag,
25 mg Methylprednisolon / Tag, für
insgesamt 28 Tage
- 2. wie Gruppe 1, plus 108 Knochenmarkzellen
(KM) des Spenderschweins / kg × KG
Empfängerschwein plus
4,5 Gy Ganzkörperbestrahlung
GKB des Empfängerschweins
- 3. wie Gruppe 1, plus 106 vom Spenderschwein
abgeleitete TAIZ / kg × KG
an den postoperativen Tagen 7 und 10 nach Lungentransplantation
Wie in 6A ersichtlich
erfolgte die Abstoßung
der Lungentransplantation in Gruppe 1 durchschnittlich nach 50,3 ± 9,9 Tage
nach Absetzen der Immunsuppression. Dagegen stießen Tiere der Gruppe 2 ihre Organe
nach 102,3 ± 81,0
Tagen ab. Triple-Immunsuppression
in Verbindung mit zweimaliger TAIZ-Behand1ung verlängerte das
Organüberleben
auf 292 ± 135,5
Tage, wobei 3/4 Tiere Langzeitorganakzeptanz (> 350 Tage) ihrer Organe zeigten. In allen
Fällen
der Gruppe 3 war ein gemischter Spenderchime rismus im Empfängerblut
von > 21 Tagen zu
beobachten, wogegen Tiere der Gruppe 1 und 2 nur kurzfristigen gemischten
Chimerismus für
6–8 Tage
zeigten. 6B zeigt die
Lungentransplantate eines Schweins der Versuchsgruppe 1 (POT 41)
und eines mit TAIZ behandelten Schweins der Versuchsgruppe 3 (55
Tage nach Transplantation; B). Während
in Projektion auf die linksseitige Thoraxwand um die Herzsillouhette
eine sichtbare Transparenzminderung (Verschattung) als Ausdruck
des abgestoßenen
Lungentransplantation bei dem Schwein der Versuchsgruppe 1 zu erkennen
ist, zeigt die Röntgenthoraxaufnahme
des mit TAIZ behandelten Tieres einen röntgenologisch unauffälligen Lungen-,
respektive Transplantatbefund mit guter Abgrenzbarkeit zur Herzsilouette.
Beispiel 9
In vitro Untersuchungen
zur Wirksamkeit humaner TAIZ in der gemischten Lymphozytenkultur
Zur Untersuchung der immunsuppressiven
Wirkung der TAIZ erfolgte eine gemischte zweiseitige Lymphozytenkultur
(MLC = mixed lymphozyte culture), wobei die eingesetzten humanen
TAIZ wie in Beispiel 2 beschrieben generiert wurden. Die MLC wurde
wie bei James T. Kurnick, Cellular assays, In: Diagnostic Immunopathology,
Colvin RB, Bhan AK, McCluskey, RT (eds.), Raven Press, New York,
pp 751–771
(1994) beschrieben, durchgeführt.
7A zeigt,
dass 105 von einem Individuum B abgeleitete
TAIZ in der Lage sind, die Proliferationsaktivität von T-Zellen (gemessen als
Einbau [3H]-radioaktiv-markierten Thymidins
in counts per minute, cpm) eines Individuums A nach deren Stimulation
mit bestrahlten Lymphoblasten von einem Spender C (alle 3 Individuen
waren entsprechend der HLA-Typisierung vollständig MHC-diskordant untereinander)
von 39.200 (Medium ohne Zellen; weiße Säule) auf 5.400 cpm (TAIZ B
50.000) zu supprimieren. Normale, unbehandelte Monozyten von Individuum
B, die nicht in M-CSF kultiviert und nicht mit γ-IFN stimuliert wurden, supprimieren dagegen
die Proliferation der von einem Individuum A isolierten T-Zellen
nur auf 19.500 cpm (MO B 50.000). Ferner ist der Suppressionseffekt
der TAIZ dosisabhängig,
da die Inhibition der T-Zell-proliferation von der Menge der eingesetzten
TAIZ abhängt.
Im Beispiel war die eingesetzte Menge von 10.000 TAIZ nicht in der
Lage, die Proliferation gegenüber
nicht-TAIZ-behandelten T-Zellen signifikant zu reduzieren, 29.800
cpm (TAIZ B 10.000) versus 31.900 cpm (MO B 10.000).
Zur Klärung, warum im Tierversuch
ein Teil der Zellen abgestoßen
wird und kein transienter Chimerismus (> 21 Tage) entsteht, wurde die nach 6 tägiger Zellkultivierung
(mit M-CSF und γ-IFN
stimulierte Zellen) in der Durchflußzytometrie untersucht. Es
zeigt sich hierbei eine Zellpopulation großer monozytärer Zellen und eine Entität lymphozytärer Zellen.
Die monozytären
Zellen exprimieren zum größten Teil
(> 95%) das typische monozyten-spezifische
Antigen CD14, wogegen sich die lymphozytären Zellen weitestgehend aus
B-Zellen (CD20+) rekrutieren. Die Trennung
beider Zellpopulationen erfolgte in einem nächsten Schritt mit Anti-CD14-, respektive
Anti-CD20-Antikörpern
gekoppelten magnetic beads, um dann den Einfluß der jeweiligen Zellentitität auf die
T-Zellproliferation in der MLC getrennt zu untersuchen. Wie in 7B gezeigt, konnte die lymphozytäre Zellpopulation
eines Spenders B, die nach 6 tägiger
Kultivierung mit M-CSF und anschließender 2-tägiger Stimulation mit γ-IFN als nicht adhärente Zellfraktion
noch persistiert, die T-Zellpopulation
eines nicht-verwandten Responders A gegen Stimulatorzellen von C
nicht unterdrücken.
Auch die von A selbst generierten Lymphozyten können dies nicht. Dagegen können die
von B generierten Monozyten (nach Kultivierung mit M-CSF und Stimulation
mit γ-IFN)
die T-Zellproliferation eines Responders A signifikant inhibieren. Auch
die von A selbst generierten TAIZ können diese Suppression in Kultur
einleiten und damit autologe T-Zellen inhibieren (Daten nicht gezeigt).
In einem weiteren Versuch wurde dann
durch Immunisierung von Mäusen
mit humanen TAIZ, die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt
wurden, ein Antikörper
(GM-7) generiert, der spezifisch an ein Antigen bindet, das nur
auf CD14-Zellen exprimiert wird, die der 6-tägigen ex-situ Modifikation
mit M-CSF und 2-tägiger γ-IFN Stimulation
unterworfen wurden.
1 zeigt
die in der Durchflußzytometrie
ermittelte Bindungsfähigkeit
von GM-7 an monozytäre
Zellen nach in vitro Modifikation. Es läßt sich erkennen, daß die direkt
aus Buffycoat gewonnenen CD14-positiven Monozyten den Antikörper GM-7
nicht binden (die grau unterlegte Wolke ist Deckungsgleich mit der
Antikörperkontrolle).
Dagegen exprimieren ein Teil der Monozyten nach Kultivierung in
M-CSF und Stimulation mit γ-2FN
ein Antigen, welches vom monoklonalen GM-7 Antikörper erkannt wird.
Es konnte gezeigt werden, daß die nach
M-CSF-Behandlung und γ-IFN-Stimulation generierte
CD14+ Zellpopulation in Abhängigkeit
vom eingesetzten Medium unterschiedliche Mengen an Monozyten enthält, die den
monoklonalen Antikörper
GM-7 bindet (siehe Tabelle 2).
Tabelle
2: Bei der Präparation
der Monoryten aus dem Buffy-coat wurde entweder FCS eingesetzt,
wie im Beispiel 2 beschrieben, oder analog 50 ml AMI-Serum, 50 ml
X-vivo Serum, oder ganz auf Serum verzichtet
Aufgrund dieser Daten wurde dann
in einem weiteren Ansatz die Suppressoraktivität der CD14+/GM-7+ Zellen mit denen der CD14+/GM-7
-Zellen in der MLC verglichen. Wie 7C zeigt,
findet sich ein signifikanter Unterschied zwischen den GM-7-positiven und nicht
positiven Zellen. Nur die GM-7-positive Fraktion innerhalb der CD14-positiven
Monozyten (nach 6-tägiger M-CSF-Behandlung
und 2-tägiger γ-IFN-Stimulation) übt einen signifikanten
Inhibitionseffekt auf die T-Zellproliferationsaktivität von Responderzellen
A nach Stimulation mit Zellen von C aus. Im Beispiel sind die präparierten
Monozyten von einem Individuum B. Die autologen Monozyten von A
verhalten sich analog, da nur GM-7+ Zellen
von A die Inhibition autologer T-Zellen
verursachen (Daten nicht gezeigt).
Diese Daten sprechen dafür, daß für klinische
Zwecke durch die Verfügbarkeit
des monoklonalen Antikörpers
GM-7 eine homogene Zellpopulation mit optimaler Suppressorfunktion
aus den Ursprungsmonozyten nach Kultivierung mit M-CSF und γ-IFN-Stimulation
isoliert werden kann.