KR20220095228A - 암의 t 세포 치료를 위한 세포독성 효과기 기억 t 세포를 생산하는 방법 - Google Patents

암의 t 세포 치료를 위한 세포독성 효과기 기억 t 세포를 생산하는 방법 Download PDF

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KR20220095228A
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바나자 콘두리
윌리엄 케이. 데커
매튜 엠. 핼퍼트
미나크시 지. 헥드
나빌 엠. 아메드
수지스 케이. 조셉
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베이롤 칼리지 오브 메드신
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Abstract

본원에서는 CD161+ T 세포를 증식시키는 방법이 제공된다. 또한, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 포함하는 변형된 CD161+ T 세포를 생성하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 구체적인 양태에서, CAR 발현하는 T 세포가 생산되고/거나, 증식되고/거나, 질환 (예로, 암) 치료에 사용된다.

Description

암의 T 세포 치료를 위한 세포독성 효과기 기억 T 세포를 생산하는 방법
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 11월 6일자로 제출된 미국 가특허출원 제 62/931,670호의 우선권을 주장하고, 이의 전문은 본원에 참고문헌으로 통합된다.
국가 연구 지원에 관한 진술
본 발명은 미국 국립보건원이 제공하는 연구기금 제 AI127387호 하의 정부 지원을 받아 수행되었다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
1. 기술분야
본 발명은 일반적으로 의학, 면역학, 세포생물학 및 분자생물학의 분야에 관한 것이다. 특정 양태에서, 본 발명의 분야는 면역요법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이것은 개선된 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포의 생산 및 이러한 세포를 사용하는 치료 방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
췌장관 샘암종 (PDAC)은 공격적인 수술, 방사선 조사 및 고-용량 화학요법에도 불구하고, 9% 미만의 지독하게 나쁜 5년 생존율을 갖는 매우 공격적인 종양이다 (Ansari et al., 2015). 최근 수년 동안, 입양 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 요법은 암의 치료제 양식으로서, 선별된 CD19+ 악성 종양에 대해 특이적으로 큰 잠재력을 보여주었다 (Maude et al., 2018; Neelapu et al., 2017). CAR 구조물은 세포 표면 종양 항원을 표적하는 단일 사슬 단편 가변 영역 (scFv), 막통과 도메인, 힌지 영역, 및 4-1BB 또는 CD28 보조자극성 분자에 전형적으로 융합되는 CD3ξ의 세포내 신호전달 도메인으로 구성된다 (van der Stegen et al., 2015). 파일럿 제 I상 임상 시험에서, 자가유래 메조텔린 특이적 CAR T 세포의 입양 세포요법은 안전하고, 적은 수의 환자에서 화학요법 불응 전이성 인간 PDAC에 대한 경미한 효능을 나타내었지만 (Beatty et al., 2018), 췌장 종양에 대한 CAR T 세포 요법은 여전히 발전이 더디었다. 실제로, 현재까지 고형 종양 설정에서 CAR 기반의 요법은 유의한 효능을 거의 입증하지 못하였다.
바이러스 감염에 대한 세포 매개성 면역의 결정적인 특징은 증식 가속화 및 세포독성 역학을 통한 후속적 접종에 대한 지속가능한 면역을 제공하는 장수 기억 T 세포 집단의 확립이다 (Seaman et al., 2004). 여러 연구진은 이전에 마우스의 천연 세포독성 수용체 NK1.1 또는 인간의 CD161의 발현에 의해 확인될 수 있는 이러한 기억 T 세포의 흥미로운 하위집합을 식별하였다 (Martin et al., 2009; Turtle et al., 2009; Northfield et al., 2008; Takahashi et al., 2006; Assarsson et al., 2000; Billerbeck et al., 2010; Fergusson et al., 2011; Fergusson et al., 2016; Fergusson et al., 2014). TCR 불변체 또는 CD8αα+ CD161+ 세포와 대조적으로, 다중클론 αβ 세포 집단은 줄기 세포와 유사한 자가-재생 및 분화 능력, 그랜자임 슈퍼패밀리로부터의 유전자가 유의하게 상향조절되는 명백한 전사 프로파일 (Fergusson et al., 2011; Fergusson et al., 2014), 특징적인 항-바이러스 특이성 (Fergusson et al., 2008; Billerbeck et al., 2010; Havenith et al., 2012; Neelapu et al., 2005), 및 조직-귀소 성질 (Billerbeck et al., 2010)을 나타낸다. 일반적으로, CD161는 선천적 NK 세포 수용체로서 알려져 있지만, CD4, CD8 및 NKT 세포에서도 발현될 수 있다 (Fergusson et al., 2016). 순환에서도 발견될 수 있지만, CD8+ CD161+ 세포는 만성 바이러스 감염 동안 조직 발병기전, 그리고 조직 잔류 성질 및/또는 혈관외 유출 성향으로 인해 자가면역 병태에 기여한다 (Assarsson et al., 2000; Billerbeck et al., 2010; Annibali et al., 2011). 또한, 종양 잔류 면역 침윤물에서 CD161의 높은 발현 수준은 NSCLC에서 실질적으로 개선된 임상 성과 및 생존과 관련된다 (Braud et al., 2018).
다음의 참고문헌은 구체적으로, 이들이 본원에 제시된 내용을 보충하는 예시적인 절차 또는 기타 세부사항을 제공하는 정도로, 본원에 참고문헌으로 통합된다. 미국 특허 제 US 4,690,915호 미국 특허 제 US 6,225,042호 미국 특허 제 US 6,225,042호 미국 특허 제 US 6,355,479호 미국 특허 제 US 6,355,479호 미국 특허 제 US 6,362,001호 미국 특허 제 US 6,362,001호 미국 특허 제 US 6,410,319호 미국 특허 제 US 6,790,662호 미국 특허 제 US 7,109,304호 미국 특허출원 공개 제 US 2009/0004142호 미국 특허출원 공개 제 US 2009/0017000호 국제특허출원 제 WO2007/103009호
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제 1 구현예에서, (a) CD161+ T 세포를 포함하는 세포 시료를 획득하는 단계; 및 (b) T 세포를 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계를 포함하고, 이로써 비-CD161+ T 세포와 비교하여 CD161+ T 세포의 수에서 확장된 T 세포의 집단을 제공하는 시험관내 또는 생체외 방법이 제공된다. 추가의 양태에서, T 세포는 CD8+ CD161+ T 세포를 포함한다. 추가의 양태에서, T 세포는 CD4+ CD161+ T 세포를 포함한다.
IL-7은 약 5 내지 20 ng/mL로 존재할 수 있고/거나, IL-15는 약 2.5 내지 10 ng/mL로 존재할 수 있고/거나, IL-21은 약 20 내지 40 ng/mL로 존재할 수 있고, 예컨대 10 ng/mL IL-7, 5 ng/mL IL-15 및/또는 30 ng/mL IL-21이다. 본 방법은 단계 (b) 이전에 시료에서 CD8+ CD161+ 세포의 존재에 대해 T 세포를 정제하거나 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 방법은 단계 (b) 이후에 시료에서 CD8+ CD161+ 세포의 존재에 대해 T 세포를 정제하거나 농축하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시료에서 T 세포를 농축하는 단계는 형광 세포 선별, 자성 또는 상자성 비드 분리를 포함할 수 있다. 배양 단계는 최대 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 또는 42일 동안 지속할 수 있다.
일부 양태에서, 세포는 CD3 및/또는 CD28 자극제를 포함하는 배지에서 추가로 배양된다. 일부 양태에서, CD3 및/또는 CD28 자극제는 CD3 및/또는 CD28 결합 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 CD3, CD28 및/또는 CD161 자극제를 포함하는 배지에서 추가로 배양된다. 일부 양태에서, CD3, CD28 및/또는 CD161 자극제는 CD3, CD28 및/또는 CD161 결합 항체를 포함한다. 일부 양태에서, 세포는 CD3 결합 항체, CD28 결합 항체, Clec2d 및/또는 CD161 자극 항체를 포함하는 배지에서 추가로 배양된다. 일부 양태에서, 세포는 약 0.1 내지 5.0 μg/mL, 0.3 내지 3.0 μg/mL 또는 0.5 내지 2.0 μg/mL의 CD3 결합 항체, CD28 결합 항체, Clec2d 및/또는 CD161 자극 항체를 포함하는 배지에서 추가로 배양된다.
일 양태에서, CD8+ CD161+ 세포, CD8+ CD161neg 세포 및 벌크 PBMC는 플레이트 결합된 항-CD3/CD28로 자극되고, 10 ng/mL IL-7, 5 ng/mL IL-15 및 30 ng/mL IL-21 (뉴저지, 록키힐, 펩프로테크사로부터 모두 구입가능함)을 포함하는 사이토카인 칵테일에서 증식시킨다. 일 양태에서, CD8+ CD161+ 세포는 단리되어 각각 1 μg/mL의 항-CD/CD28/CD161로의 자극에 대비하여 배양되고, RPMI-1640, 10% FBS, 및 10 ng/mL IL-7, 5 ng/mL IL-15 및 30 ng/mL IL-21로 구성된 사이토카인 칵테일 중 2 mmol/L 글루타맥스에서 증식시킨다. 세포는 37℃에서 48시간 동안 가습 체임버에 배치한다. 48시간 후에, 세포는 항체 자극이 없는 IL-7/15/21 사이토카인 칵테일을 사용하여 증식시킨다.
본 방법은 대상체로부터 세포를 예컨대 성분채집술 또는 정맥천자에 의해 획득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시료는 동결보존된 시료일 수 있다. 시료는 제대혈로부터 얻을 수 있다. 시료는 대상체로부터의 말초혈액 시료일 수 있다. 시료는 대상체로부터 획득된 비슷한 시료와 비교하여 CD8+ CD161+ 세포의 백분율이 증가된 T 세포의 하위집단을 포함할 수 있다. 시료는 제 3 부분으로부터 획득될 수 있다.
본 방법은 상기 시료의 T 세포 내로 CAR을 인코딩하는 핵산을, 예컨대 바이러스성 벡터를 사용하여 또는 바이러스로 T 세포를 형질도입하는 것이 관여하지 않는 방법을 통해 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. T 세포 내로 CAR 또는 유전자전환 TCR을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계는 단계 (b) 이전에 또는 단계 (b) 이후에 일어날 수 있다. T 세포는 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위해 불활성화될 수 있다.
본 방법은 T 세포 내로 막 결합된 Cγ 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 예컨대 여기서 막 결합된 Cγ 사이토카인은 막 결합된 IL-15이다. 막 결합된 Cγ 사이토카인은 IL-15-IL-15Rα 융합 단백질일 수 있다.
배양 단계는 T 세포를 수지상 세포 또는 인공적인 항원 제시 세포 (aAPC)의 존재 하에 배양하는 것을 포함할 수 있다. aAPC는 aAPC의 표면에 발현된 CAR 결합 항체 또는 유전자전환 TCR 결합 항체 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. aAPC는 T 세포를 활성화하거나 보조자극하는 추가적인 분자를 포함할 수 있다. 추가적인 분자는 막 결합된 Cγ 사이토카인을 포함할 수 있다. T 세포를 aAPC의 존재 하에 배양하는 것은 세포를 약 10 : 1 내지 약 1 : 10 (CAR 세포 대 aAPC)의 비율로 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본 방법은 유전자전환 CAR 또는 유전자전환 TCR 세포 집단의 시료를 동결보존하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. CAR 또는 유전자전환 TCR은 CD19, CD20, ROR1, CD22 암배아 항원, 알파-태아단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피 종양 항원, 전립샘 특이 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메조텔린, GD3, HERV-K, IL-11Rα, κ 사슬, λ 사슬, CSPG4, ERBB2, EGFRvⅢ, VEGFR2, HER2-HER3 조합 또는 HER1-HER2 조합과 같은 암 세포 항원에 표적화될 수 있다. CAR 또는 유전자전환 TCR은 진균성, 바이러스성 또는 세균성 병원균과 같은 병원균 항원에 표적화될 수 있다. 병원균은 플라스모듐, 트리파노좀, 아스퍼질러스, 칸디다, HSV, HIV, RSV, EBV, CMV, JC 바이러스, BK 바이러스 또는 에볼라 병원균일 수 있다.
본 방법은 시료의 CD161+ T 세포의 함량을 단계 (b) 이전에, 단계 (b) 이후에, 또는 단계 (a) 이전 및 이후 모두에서, 예컨대 세포 계수법/유세포 측정법에 의해 평가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물이 제공된다.
추가의 구현예는 질환에 걸린 인간 대상체에서 T 세포 반응을 제공하는 방법으로서, 본원에 기술된 T 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법이 관여한다. 질환은 암일 수 있으며, 여기서 CAR 또는 상기 유전자전환 TCR은 암 세포 항원에 표적화된다. 대상체는 사전 항암 요법을 겪었을 수 있다. 대상체는 암이 진정되고 있거나, 암의 증상은 없을 수 있지만 검출가능한 암 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 다음의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내는 반면, 본 발명의 정신 및 범주 내의 다양한 변경 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게라면 자명해질 것이므로, 단지 설명으로서 주어지는 것으로 이해되어야 한다.
다음의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 양태를 추가로 나타내도록 포함된다. 본 발명은 본원에 제시된 구체적인 구현예의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1. 항원적으로 자극된 T 세포의 마이크로어레이에 의한 유전자 발현 분석은 CD8 + NK1.1 + 세포의 세포독성 및 유사-선천성 특징의 유의한 상향조절을 나타내었다. 15마리 마우스의 코호트는 마우스 췌장관 샘암종에 대한 화학요법과 조합하여 수지상 세포 기반의 백신 접종을 수여받았다. 종양 접종 후 60일째, 비장을 수확하고, 각 5마리의 3가지 실험군으로 풀을 만들고, 종양 항원이 로딩된 수지상 세포를 사용하여 밤새 활성화하였다. 다음으로 항원적으로 자극된 세포는 유세포 측정법에 의해 CD8+ CD69+ 집단에 개방하여 NK1.1neg 및 NK1.1+ 하위집합으로 선별하였다. 볼케이노 플롯은 단일변수 유의성 수준 0.1에서 CD8+ NK1.1neg 및 CD8+ NK1.1+ 세포 사이에 유의하게 조절되는 1,642가지 유전자를 나타낸다. FDA 0.05에서 차별적으로 조절되는 상단 15가지 유전자가 플롯 상에 표기된다.
도 2a 내지 도 2f. CD8 + NK1.1 + 세포는 지속가능한 보호를 제공하고 인플루엔자 감염 및 흑색종 종양에 대항하여 생존을 개선시키는 기억 집단을 정의한다. 인플루엔자 모델에서, 비장세포는 인플루엔자 감염 이후의 회복 시 마우스로부터 수확하고, CD8+ NK1.1neg 및 CD8+ NK1.1+ 세포를 선별하여 후속적으로 인플루엔자가 접종되는 미감작 마우스 내에 입양으로 전달하였다. 흑색종 모델에서, 종양 보유하는 마우스에게 종양 항원이 로딩된 수지상 세포를 백신 접종하였다. 비장세포를 3주 후에 수확하고, CD8+ NK1.1neg 및 CD8+ NK1.1+ 세포를 선별하여 촉진가능한 종양을 갖는 마우스 내에 입양으로 전달하였다. 항원 경험한 CD8+ NK1.1+ 세포의 입양 전달은 인플루엔자 감염 (도 2a 내지 도 2c) 및 흑색종 종양 (도 2d 내지 도 2f)에 대항한 지속가능한 보호를 제공하였다. CD8+ NK1.1+ 세포를 수여받은 마우스는 CD8+ NK1.1neg 및 미감작 CD8+ 세포를 수여받은 마우스와 비교하여, 인플루엔자 감염 시 체중을 회복하였다 (도 2b). CD8+ NK1.1neg 및 미감작 CD8+ 세포를 수여받은 실험군과 비교하여 CD8+ NK1.1+ 세포를 수여받은 마우스에서 100% 생존이 관찰되었다 (도 2c). 감염 이후 2주째, PBMC의 분석은 미감작 및 CD8+ NK1.1neg가 입양으로 전달된 코호트와 비교하여, CD8+ NK1.1+ 세포를 수여받은 마우스에서 순환하는 CD3+ CD8+ IFN-γ+ 세포의 40% 증가를 보여주었다 (p < 0.003) (도 2d 및 도 2e). 흑색종 모델에서, CD8+ NK1.1+ 세포를 수여받은 마우스는 종양 성장의 지연 및 생존의 개선을 나타내었다 (도 2f). 종양 이식 이후 3주째, 말초혈액 림프구의 분석은 CD8+ NK1.1neg 또는 미감작 비장세포가 입양으로 전달된 코호트와 비교하여, CD8+ NK1.1+ 세포가 입양으로 전달된 코호트에서 GP100 사량체 특이적 CD8+ 세포 중 기억 마커 CD62L 및 CCR7의 유의하게 상승된 수준을 나타내었다. 각 실험의 경우, 실험군 당 n = 10마리 마우스. 오차 막대 = +/- SEM, *p < 0.05, 원-웨이 ANOVA.
도 3. 마우스 CD3 + CD8 + NK1.1 + 세포 집단은 인간 CD3 + CD8 + CD161 + 대응물에서 표현형이 보존된다. CD3+ CD8+ CD161+ 및 CD3+ CD8+ CD161neg 세포, 마우스 CD3+ CD8+ NK1.1+ 세포의 인간 동등물 및 CD3+ CD8+ NK1.1neg 세포는 6명의 인간 공여자로부터 자성으로 선별되고, 유전자 발현 프로파일 분석이 마이크로어레이에 의해 수행되었다. CD8+ CD161+ 및 CD8+ CD161neg 세포 사이의 차별적인 유전자 조절을 나타내는 볼케이노 플롯은 난형의 CD161 수용체 상승조절을 강조하고 있다.
도 4. CD8+ CD161+, CD8+ CD161 neg 및 조작되지 않은 벌크 PBMC는 인간 말초혈액 산물로부터 신선하게 단리되었다. 단리된 세포는 즉시 51Cr-표지된 동종이계 293-HEK 표적을 사용하여 4시간 사멸 검정법으로 세포독성 능력에 대해 테스트되었다. 관찰된 바와 같이, CD8+ CD161+ 세포는 25 : 1의 E : T 비율에서 100% 표적 용해를 유도할 수 있는 반면, 벌크 PBMC 및 CD8+ CD161neg 세포는 50 : 1의 최대 E : T 비율에서 각각 22% 및 15%의 용해 능력을 나타내었다 (원-웨이 ANOVA에 의해 50 : 1에서 p < 0.002, 25 : 1에서 p < 0.0007 및 5 : 1에서 p < 0.00002). X-축 - E : T 비율. Y-축 - 사멸 백분율. 오차 막대 = +/- SD.
도 5. 항-CD3/CD28/Clec2d로의 플레이트 결합된 자극과 조합하여 IL-7/15/21로의 CD8 + CD161 + 세포의 생체외 증식은 중앙 기억 표현형 (CD45RA - CCR7 + )을 증진하였다. CD8+ CD161+ 세포는 정상 공여자로부터 선별되고, 생체외 자극 조건이 최적화되었다. 세포는 CAR 형질도입되지 않는다. IL-2, IL-2/7/15, IL-2/7/15/21 자극과 비교하여, 항-CD3/CD28/Clec2d의 플레이트 결합된 자극과 IL-7/15/21의 조합은 중앙 기억 (CD45RA- CCR7+)의 유의한 상향조절을 유도하였다.
도 6. 항-CD3/CD28/Clec2d로의 플레이트 결합된 자극과 조합하여 IL-7/15/21로의 CD8 + CD161 + 세포의 생체외 증식은 세포독성 그랜자임 생산을 증진하였다. CD8+ CD161+ 세포는 정상 공여자로부터 선별되고, 생체외 자극 조건이 최적화되었다. 세포는 CAR 형질도입되지 않는다. IL-2, IL-2/7/15, IL-2/7/15/21 자극과 비교하여, 항-CD3/CD28/Clec2d의 플레이트 결합된 자극과 IL-7/15/21의 조합은 세포독성 분자인 그랜자임 및 퍼포린의 유의한 상향조절을 유도하였다.
도 7a 및 도 7b. CD8 + NK1.1 + 세포는 다수의 마우스 질환 모델에서 중요한 순환하는 기억 세포로서 식별된다. CD8+ NK1.1+ 세포의 보호 효과가 모델에 비-의존적임을 입증하기 위하여, CD8+ NK1.1+ 세포의 입양 전달 실험이 인플루엔자 감염 모델 및 흑색종 종양 모델에서 수행되었다 (도 7a). 미감작 마우스는 치사량 이하 용량의 인플루엔자에 노출시키고, 마우스가 감염으로부터 회복하도록 허용하여, 감염 이후 3주째 비장세포는 수확하여 CD8+ NK1.1neg 및 CD8+ NK1.1+ 세포로 자성으로 선별되었다. 5 × 105개 세포/마우스의 각 NK1.1 실험군은 미감작 코호트에게 입양으로 전달하고, 입양 전달 이후 24시간째 동일한 인플루엔자 바이러스를 치사량으로 접종하였다. 미감작 CD8+ 비장세포를 수여받은 마우스는 대조군으로서 작용한다 (도 7b). 미감작 마우스에게 2 × 105개 B16 흑색종 세포를 피하로 접종하고, 접종 이후 7일 및 14일째 B16 항원 로딩된 세포 기반의 백신을 접종하였다. 21일째, 마우스는 희생되고, 비장세포는 수확하여 CD8+ NK1.1neg 및 CD8+ NK1.1+ 세포 집단으로 선별되었다. 촉진가능한 B16 종양이 접종된 미감작 코호트는 다음으로 1.5 × 106개 CD8+ NK1.1neg 및 CD8+ NK1.1+ 세포 각각이 복강내 주사에 의해 입양으로 전달되었다. 미감작 CD8+ 비장세포를 수여받은 마우스는 대조군으로서 작용한다.
도 8. TCR-Vβ 유형분석은 자연에서 다중클론인 CD3 + CD8 + CD161 + 세포를 나타내었다. CD8+ CD161+ 세포의 클론 특성을 검증하기 위하여, TCR-Vβ 유형분석은 공여자 유래한 세포에서 수행되었다. 30가지 TCR Vβ 패밀리의 증폭으로부터 얻은 막대 그래프는 편중되지 않은 CDR3 크기의 가우스 분포를 나타내었고, 이들 세포의 다중클론 특성을 시사한다.
도 9. 종-교차 비교 유전자 분석은 2가지 집단 사이에 차별적으로 조절되는 206가지 유전자의 보존된 유전자 서명을 드러낸다. 206가지 공통적인 유전자는 마우스 (15개 시료 풀) 및 인간 (6개의 시료 쌍) 사이에 명명법을 기반으로 한 마이크로어레이 분석에 의해 확인하였다. 이들 유전자의 발현 양상은 활성화된 CD8+ NK1.1+ 세포 및 휴지 CD8+ CD161+ 세포 사이에 유사하였으며, 매우 보존된 유전자 서명의 특성을 나타낸다.
상기 논의된 바와 같이, CAR T 요법은 전이성 마우스 관 샘암종 (PDAC)과 같은 암의 치료에서 큰 전망을 보여주고 있다. 선행 연구에서, 본 발명자들은 입양으로 전달된, 항원 경험한 CD8+ NK1.1+ 세포가 PDAC 모델에서 지속가능한 보호를 매개할 수 있음을 입증하였다. 흥미롭게도, 이들 세포는 항원에 대한 초기 노출 이후 9개월 동안 존재하고, 부모 PDAC 세포주가 후속적으로 접종되는 미감작 마우스에게 입양으로 전달될 때 높은 보호작용이 있었다 (Konduri et al., 2016). 이러한 결과를 확장하여, 본 발명자들은 PDAC의 치료를 위한 CAR T 세포 요법의 SCID 이종이식 모델을 포함하여 다양한 생체내 모델 시스템에서 이들 세포의 추가적인 생물학적 및 기능적 성질을 특성화하려고 시도하였다. 결과는 단 형질도입 및 증식 과정 동안 출발 세포 집단의 분화를 차단할 수 있도록 적응되면, CD8+ CD161+ T 세포가 CAR T 세포 요법을 위한 우수한 플랫폼을 포함함을 입증하였다. 더욱이, 본 발명자들은 지금 이러한 세포가 생체외에서 증식될 수 있는 개선된 방법을 개발하였으며, 이로써 이를 필요로 하는 대상체에게 CAR T 요법을 제공하는 것이 더욱 용이해질 것이다. 본 발명의 이들 및 기타 특징은 하기에 더욱 자세하게 설명된다.
I. 정의
본원에 사용된 단어 "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 청구항(들)에 사용된 바, 단어 "포함하는"과 연결하여 사용될 때, 단어 a" 또는 "an"은 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구항에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 언급하도록 명시적으로 표시하지 않거나 대안이 상호 배타적이지 않은 한, 본 발명이 대안만 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 뒷받침하지 않더라도 "및/또는"을 의미하는데 사용된다. 본원에 사용된 "또 다른"은 적어도 하나 이상의 제 2 대안을 의미할 수 있다.
본 출원 전체에서, 용어 "약"은 값이 장치에 대한 내재적 오차 변화를 포함하는 것을 의미하고, 방법이 해당 값, 연구 대상체에 존재하는 변동 또는 진술된 값의 10% 이내의 값을 결정하는데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항원 수용체 (CAR)"은 예를 들면 인공적인 T 세포 수용체, 키메라 T 세포 수용체, 유전자전환 T 세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 말하고, 특정한 면역 효과기 세포 상에 인공적인 특이성을 이식하는 조작된 수용체를 포괄할 수 있다. CAR은 T 세포 상에 단일클론 항체의 특이성을 부여하도록 채용될 수 있으며, 이로써 많은 수의 특이적 T 세포를 예를 들면 입양 세포 요법의 용도를 위해 생성시킨다. 상세한 구현예에서, CAR은 예를 들면 종양 관련 항원에게로 세포의 특이성을 유도한다. 일부 구현예에서, CAR은 세포내 활성화 도메인, 막통과 도메인 및 종양 관련 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다. 구체적인 양태에서, CAR은 CD3-제타, 막통과 도메인 및 엔도도메인에 융합되는, 단일클론 항체로부터 유래한 단일 사슬 가변 단편 (scFv)의 융합을 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드 (예로, 펩티드) 또는 덱틴 (Dectin)과 같은 양상 인식 수용체로부터 유래할 수 있다. 특정 경우에, 항원 인식 도메인의 공간 구조는 활성화 유도된 세포 사멸을 감소시키도록 변형될 수 있다. 특정 경우에, CAR은 CD3 제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP10 및/또는 OX40과 같은 추가적인 보조자극성 신호전달을 위한 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CAR와 함께 보조자극성 분자, 영상화 (예로, 양성자 방출 단층촬영술)를 위한 리포터 유전자, 전구약물의 첨가 시 T 세포를 조건적으로 감퇴시키는 유전자 산물, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인 및 사이토카인 수용체를 포함하는 분자가 공동-발현될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "T 세포 수용체 (TCR)"는 알파 (α) 및 베타 (β) 사슬의 이종이량체로 구성되는 T 세포 상의 단백질 수용체를 말하고, 일부 세포에서는 TCR이 감마 및 델타 (γ/δ) 사슬로 구성되기도 한다. 본 발명의 구현예에서, TCR은 예를 들면 헬퍼 T 세포, 세포독성 T 세포, 기억 T 세포, 조절 T 세포, 자연 킬러 T 세포 및 감마 델타 T 세포를 포함하여, TCR을 포함하는 임의의 세포에서 변형될 수 있다.
용어 "종양 관련 항원" 및 "암 세포 항원"은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 각 경우에, 용어는 암 세포에 의해 특이적으로 또는 우선적으로 발현되는 단백질, 당단백질 또는 탄수화물을 말한다.
Ⅱ. 키메라 항원 수용체
본원에 사용된 용어 "항원"은 항체 또는 T 세포 수용체에 의해 결합될 수 있는 분자이다. 항원은 추가적으로 체액성 면역 반응, 및/또는 B 및/또는 T 림프구를 생산하는 세포성 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 발명의 구현예는 세포내 신호전달 도메인, 막통과 도메인 및 하나 이상의 신호전달 모티브를 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 면역원성을 감소시키도록 인간화된 CAR (hCAR)을 포함하여, 항원 특이적 키메라 항원 수용체 (CAR) 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산이 관여한다. 특정 구현예에서, CAR은 하나 이상의 항원 사이에 공유된 공간을 포함하는 에피토프를 인식할 수 있다. 덴틴-1과 같은 양상 인식 수용체는 탄수화물 항원에 대한 특이성을 유도하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 결합 영역은 단일클론 항체의 상보성 결정 영역, 단일클론 항체의 가변 영역 및/또는 이들의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 해당 특이성은 수용체에 결합하는 펩티드 (예로, 사이토카인)로부터 유래한다. 상보성 결정 영역 (CDR)은 항원과 상보적인 항원 수용체 (예로, 면역글로불린 및 T 세포 수용체) 단백질의 가변 도메인에서 발견되는 짧은 아미노산 서열이고, 따라서 해당 특정한 항원에 대해 특이성을 갖는 수용체를 제공한다. 항원 수용체의 각 폴리펩티드 사슬은 3가지 CDR (CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함한다. 항원 수용체는 전형적으로 2가지 폴리펩티드 사슬로 구성되기 때문에, 항원과 접촉할 수 있는 각 항원 수용체를 위한 6가지 CDR이 있으며, 각 중쇄 및 경쇄는 3가지 CDR을 포함한다. 면역글로불린 및 T 세포 수용체와 관련된 대부분의 서열 다양성은 CDR에서 발견되기 때문에, 이들 영역은 때로 과가변 도메인으로 지칭된다. 이둘 중에, CDR3은 VJ (중쇄 및 TCR αβ 사슬의 경우 VDJ)의 재조합에 의해 인코딩되기 때문에 가장 큰 가변성을 나타낸다.
인간 CAR 핵산은 인간 유전자로 인간 환자를 위한 세포성 면역요법을 증진하는 것으로 고려된다. 상세한 구현예에서, 본 발명은 전장의 CAR cDNA 또는 코딩 영역을 포함한다. 항원 결합 영역 또는 도메인은 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 제 US 7,109,304호에 기술된 항체와 같은 특정한 인간 단일클론 항체로부터 유래한 단일 사슬 가변 단편 (scFv)의 VH 및 VL 사슬의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 단편은 인간 항원 특이적 항체의 임의의 수의 상이한 항원 결합 도메인일 수 있다. 보다 상세한 구현예에서, 단편은 인간 세포에서 발현을 위한 인간 코돈 사용도에 최적화된 서열에 의해 인코딩된 항원 특이적 scFv이다.
배열은 다이아체 또는 다량체와 같이 다량체화될 수 있다. 다량체는 경쇄 및 중쇄의 가변 부분의 교차쌍 형성에 의해 윈터스가 다이아체로 지칭하였던 구조으로 형성될 수 있다. 구조물의 힌지 부분은 전부 결실부터, 첫 번째 시스테인의 유지, 세린이 아닌 프롤린 치환, 최대 첫 번째 시스테인의 절단에 이르기까지 다수의 대안을 갖을 수 있다. Fc 부분은 결실될 수 있다. 안정하고/이량체화되는 임의의 단백질은 이러한 목적으로 작용할 수 있다. 인간 면역글로불린으로부터의 Fc 도메인, 예로 CH2 또는 CH3 도메인 중 단 하나를 사용할 수 있다. 또한, 이량화를 개선하도록 변형된 인간 면역글로불린의 힌지, CH2 및 CH3 영역을 사용할 수 있다. 또한, 면역글로불린의 힌지 부분만을 사용할 수 있다. 또한, CD8α의 부분만을 사용할 수 있다.
본 발명의 키메라 수용체의 세포내 신호전달 도메인은 키메라 수용체가 배치된 면역 세포의 적어도 하나의 정상적인 효과기 기능의 활성화를 책임진다. 용어 "효과기 기능"은 분화된 세포의 특수화된 기능을 말한다. 예를 들면, T 세포의 효과기 기능은 사이토카인의 분비를 포함하는 세포독 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있다. 미감작, 기억 또는 기억-유형 T 세포에서 효과기 기능은 항원 의존적 증식을 포함한다. 따라서, 용어 "세포내 신호전달 도메인"은 효과기 기능 신호를 전달하고, 세포를 안내하여 특수화된 기능을 수행하는 단백질 부분을 말한다. 보통 전체 세포내 신호전달 도메인이 채용되는 반면, 많은 경우에 반드시 전체 세포내 폴리펩티드를 사용하지는 않을 것이다. 세포내 신호전달 도메인의 절단된 부분이 사용될 수 있는 정도로, 이러한 절단된 부분은 여전히 효과기 기능 신호를 전달하는 한, 온전한 사슬을 대신하여 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달하기에 충분한 세포내 신호전달 도메인의 임의의 절단된 부분을 포함하는 것을 의미한다. 예는 T 세포 수용체의 제타 사슬 또는 임의의 이의 상동체 (예로, 에타, 델타, 감마 또는 엡실론), MB1 사슬, B29, Fc RⅢ, Fc RI, 및 CD3ξ, CD28, CD27, 4-1BB, DAP-10, OX40 및 이들의 조합과 같은 신호전달 분자의 조합, 뿐만 아니라 다른 유사한 분자 및 단편을 포함한다. FcγⅢ 및 FcεRI과 같은 활성화 단백질 패밀리의 다른 구성원의 세포내 신호전달 부분이 사용될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 인간 CD3ξ 세포내 도메인은 활성화를 위해 채택되었다.
항원 특이적 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 인간 IgG4 Fc 힌지 및 Fc 영역과 같은 막통과 도메인에 의해 연결될 수 있다. 대안은 인간 CD4 막통과 도메인, 인간 CD28 막통과 도메인, 인간 CD3ξ 막통과 도메인 또는 시스테인 돌연변이된 인간 CD3ξ 도메인, 또는 CD16 및 CD8과 같은 다른 인간 막통과 신호전달 단백질 및 에리트로포이에틴 수용체로부터의 다른 막통과 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 핵산은 막통과 도메인 및 변형된 CD28 세포내 신호전달 도메인과 같은 다른 보조자극성 수용체를 인코딩하는 서열을 포함한다. 다른 보조자극성 수용체는 CD28, CD27, OX-40 (CD134), DAP10 및 4-1BB (CD137) 중 하나 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. CD3ξ에 개시되는 일차 신호와 더불어, 인간 CAR에 삽입된 인간 보조자극성 수용체에 의해 제공된 추가적인 신호는 T 세포의 완전한 활성화에 중요하고, 입양 면역요법의 생체내 지속을 개선하고, 치료 성공을 도울 수 있다.
구체적인 구현예에서, 본 발명은 CAR을 인코딩하는 DNA 서열을 도입하는 단리된 핵산 및 발현 카세트에 관한 것이다. 본 발명의 벡터는 주로, 조절된 진핵 프로모터 예를 들면 MNDU3 프로모터, CMV 프로모터, EF1α프로모터 또는 유비퀴틴 프로모터의 조절 하에, 원하는 유전자를 면역 세포 바람직하게 T 세포에 전달하도록 설계된다. 또한, 벡터는 다른 이유가 없는 경우, 시험관내에서 이들의 조작을 용이하게 하는 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, CAR은 DNA 주형으로부터 시험관내 전사된 mRNA로부터 발현될 수 있다.
키메라 항원 수용체 분자는 재조합적이고, 세포질 미단에 존재하는 면역수용체 활성화 모티브 (ITAM)를 통해 항원에 결합하고 활성화 신호를 전달하는 둘 다의 능력에 의해 구별된다. 항원 결합 모이어티 (예를 들면, 단일 사슬 항체 (scFv)로부터 생성됨)를 사용하는 수용체 구조물은 HLA 비의존적 방식으로 표적 세포 표면의 미감작 항원에 결합하는 면에서 "만능 (universal)"이 되는 추가적인 장점을 부여한다. 예를 들면, 여러 연구실은 CD3 복합체의 제타 사슬 (ξ)의 세포내 부분을 코딩하는 서열에 융합된 scFv 구조물에서 Fc 수용체 감마 사슬 및 sky 타이로신 키나제를 보고하였다 (Eshhar et al., 1993; Fitzer-Attas et al., 1998). CTL에 의한 종양 인식 및 용해를 포함하는 재유도된 T 세포 효과기 메커니즘은 다수의 마우스 및 인간 항원 - scFv : ξ 시스템에서 보고되어 왔다 (Eshhar, 1997; Altenschmidt et al., 1997; Brocker et al., 1998).
지금까지 비-인간 항원 결합 영역은 전형적으로 키메라 항원 수용체를 제작하는데 사용된다. 마우스 단일클론 항체와 같은 비-인간 항원 결합 영역을 사용하는 것에서 잠재적인 문제는 인간 효과기 기능성의 부족 및 종양 덩어리 내로 침투하지 못하는 무능력이다. 다른 말로 하면, 이러한 항체는 CAR를 발현하는 세포를 파괴하도록 보체 의존적 용해를 매개하거나, 항체 의존적 세포 독성 또는 Fc 수용체 매개성 포식작용을 통해 인간 표적 세포를 용해시킬 수 없을 것 있다. 또한, 비-인간 단일클론 항체는 인간 숙주에 의해 외래 단백질로서 인식될 수 있고, 따라서 이러한 외래 항체의 반복된 주사는 유해한 과민성 반응을 유도하는 면역 반응의 유도를 초래할 수 있다. 마우스 기반의 단일클론 항체의 경우, 이것은 종종 인간 항-마우스 항체 (HAMA)로 지칭된다. 따라서, 인간 항체의 사용은 마우스 항체와 같은 강한 HAMA 반응을 나타내지 않기 때문에 더욱 바람직하다. 유사하게, CAR에서 인간 서열의 사용은 면역 매개성 인식과 이에 따른 수여자에서 잔류하는 내인성 T 세포에 의한 제거를 회피하고, HLA 맥락에서 가공된 항원을 인식할 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 항원 수용체는 (a) 세포내 신호전달 도메인, (b) 막통과 도메인 및 (c) 항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
상세한 구현예에서, CAR의 세포내 수용체 신호전달 도메인은 예를 들면 CD3의 제타 사슬, 및 단독으로 또는 CD3 제타와 일련으로 FcγRⅢ 보조자극성 신호전달 도메인, CD28, CD27, DAP10, CD137, OX40, CD2와 같은 T 세포 항원 수용체 복합체의 도메인을 포함한다. 상세한 구현예에서, 세포내 도메인 (세포질 도메인으로 지칭될 수 있음)은 TCR 제타 사슬, CD28, CD27, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγ, ICOS/CD278, IL-2R 베타/CD122, IL-2Rα/CD132, DAP10, DAP12 및 CD40 중 하나 이상의 일부 또는 전부를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인에서 내인성 T 세포 수용체 복합체의 임의의 부분을 채용한다. 하나 또는 복수의 세포질 도메인은 예를 들면 소위 제 3 세대 CAR이 부가적 또는 상승작용 효과를 위해 다함께 융합된 적어도 2개 또는 3개의 신호전달 도메인을 갖기 때문에, 채용될 수 있다.
키메라 항원 수용체의 특정 구현예에서, 수용체의 항원 특이적 부분 (항원 결합 영역을 포함하는 세포외 도메인으로 지칭될 수 있음)은 덴틴-1과 같은 패턴 인식 수용체에 의해 인식되는 탄수화물 항원을 포함하여 종양 관련 항원 또는 병원균 특이적 항원 결합 도메인을 포함한다. 종양 관련 항원은 종양 세포의 세포 표면에 발현되는 한, 임의의 유형일 수 있다. 종양 관련 항원의 예시적인 구현예는 CD19, CD20, 암배아 항원, α-태아단백질, CA-125, MUC-1, CD56, EGFR, c-Met, AKT, Her2, Her3, 상피 종양 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53 및 돌연변이된 ras 등을 포함한다. 특정 구현예에서, CAR은 막 결합된 사이토카인과 공동-발현되어 적은 양의 종양 관련 항원이 있을 때 지속성을 개선할 수 있다. 예를 들면, CAR은 막 결합된 IL-15과 공동-발현될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포내 종양 관련 항원은 HA-1, 설비빈, WT1 및 p53과 같이 표적화될 수 있다. 이것은 HLA 맥락에서 세포내 종양 관련 항원으로부터 기술된 가공된 펩티드를 인식하는 만능 T 세포에서 발현된 CAR에 의해 달성될 수 있다. 또한, 만능 T 세포는 HLA 맥락에서 세포내 가공된 종량 관련 항원을 인식하는 T 세포 수용체 쌍을 발현하도록 유전적으로 변형될 수 있다.
병원균은 임의의 유형일 수 있지만, 상세한 구현예에서 방원균은 예를 들면 진균, 세균 또는 바이러스이다. 예시적인 바이러스 병원균은 아데노비리대, 엡스타인-바 바이러스 (EBV), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 호흡기 합포체 바이러스 (RSV), JC 바이러스, BK 바이러스, HSV, HHV 패밀리의 바이러스, 피코나비리대, 헤르페스비리대, 헤파드나비리대, 플래비비리대, 레트로비리대, 오르토믹소비리대, 파라믹소비리대, 파포바비리대, 폴리오마바이러스, 랩도비리대 및 토가비리대 패밀리의 병원균을 포함한다. 예시적인 병원성 바이러스는 천연두, 인플루엔자, 유행성 이하선염, 홍역, 수두, 소아마비, 에볼라 및 풍진을 유발한다. 예시적인 병원성 진균은 칸디다 (Candida), 아스퍼질러스 (Aspergillus), 크립토코커스 (Cryptococcus), 히스토플라즈마 (Histoplasma), 뉴모시스티스 (Pneumocystis) 및 스태키보트리스 (Stachybotrys)를 포함한다. 예시적인 병원성 세균은 스트렙토코커스 (Streptococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 쉬겔라 (Shigella), 캄필로박터 (Campylobacter), 스태필로코커스 (Staphylococcus), 헬리코박터 (Helicobacter), 대장균 (E. coli), 리케치아 (Rickettsia), 바실러스 (Bacillus), 보르데텔라 (Bordetella), 클라미디아 (Chlamydia), 스피로케테스 (Spirochetes) 및 살모넬라 (Salmonella)를 포함한다. 일 구현예에서, 병원균 수용체 덱틴-1은 진균의 세포벽상의 탄수화물 구조를 인식하는 CAR을 생성하는데 사용될 수 있다. 덱틴-1의 특이성을 기반으로 하는 CAR을 발현하도록 유전적으로 변형된 T 세포는 아스퍼질러스를 인식하여 균사 성장을 표적할 수 있다. 또 다른 구현예에서, CAR은 바이러스성 결정기 (예로, CMV 및 에볼라로부터의 당단백질)를 인식하는 항체를 기반으로 하여 제조되어 바이러스성 감염 및 병리학에 개입할 수 있다.
일부 구현예에서, 병원성 항원은 CAR의 세포외 도메인이 예컨대 덱틴-1을 통해 진균성 세포벽의 탄수화물 양상을 인식하는 아스퍼질러스 탄수화물 항원이다.
본 발명에 따른 키메라 면역수용체는 바람직하게 재조합 기법을 사용하여 생산되지만, 당해 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 키메라 수용체의 다수 영역을 인코딩하는 핵산 서열은 분자 클로닝의 표준 방법 (게놈 라이브러리 스크리닝, PCR, 프라이머 지원된 라이게이션, 효모 및 세균으로부터의 scFv, 부위 유도된 돌연변이 생성 등)에 의해 제조되고, 완전한 코딩 서열로 조립될 수 있다. 생성된 코딩 영역은 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 발현 숙주 동종이계 T 세포주룰 형질전환하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바, 핵산 구조물, 핵산 서열 또는 폴리뉴클레오티드는 T 세포 내로 형질전환되거나 도입되고, 산물 (예로, 키메라 항원 수용체)를 생산하도록 전사되어 번역될 수 있는 DNA 분자를 의미하도록 의도된다.
본 발명에 채용된 예시적인 핵산 구조물 (폴리뉴클레오티드)에서, 프로모터는 본 발명의 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결되고, 즉 이들은 키메라 수용체를 인코딩하는 DNA로부터 메신저 RNA의 전사를 촉진하도록 위치한다. 프로모터는 게놈 기원을 갖거나, 합성적으로 생성될 수 있다. T 세포에 사용되는 다양한 프로모터는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예로, Marodon et al., 2003에 개시된 CD4 프로모터). 프로모터는 구성발현성 또는 유도성일 수 있으며, 여기서 유도는 예를 들면 특이적 세포 유형 또는 특이적 성숙 수준과 관련된다. 대안적으로, 잘 알려진 많은 바이러스성 프로모터도 적합하다. 관심있는 프로모터는 β-액틴 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터 및 프렌드 비장 초점 형성하는 바이러스 프로모터를 포함한다. 프로모터는 인핸서와 연관되거나 연관되지 않을 수 있으며, 여기서 인핸서는 특정한 프로모터와 자연적으로 연관되거나 상이한 프로모터와 연관될 수 있다.
키메라 수용체를 인코딩하는 개방 번역틀의 서열은 게놈 DNA 출처, cDNA 출처로부터 획득될 수 있거나, 합성되거나 (예로, PCR을 통해) 이의 조합일 수 있다. 게놈 DNA의 크기 및 인트론의 수에 의존하여, cDNA 또는 이의 조합을 사용하는 것은 인트론이 mRNA를 안정화하거나 T 세포 특이적 발현을 제공함이 밝혀져 있기 때문에 바람직할 수 있다 (Barthel and Goldfeld, 2003). 또한, 내인성 또는 외인성 비-코딩 영역을 사용하여 mRNA를 안정화하는 것이 추가로 유리할 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체의 발현을 위해, 키메라 수용체의 N-말단 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열의 자연 발생 또는 내인성 전사 개시 영역은 표적 숙주에서 키메라 수용체를 생성하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 구성발현성 또는 유도성 발현을 허용하는 외인성 전사 개시 영역이 사용될 수 있으며, 여기서 발현은 표적 숙주, 원하는 발현 수준 및 표적 숙주의 특성 등에 의존하여 조절될 수 있다.
마찬가지로, 키메라 수용체를 표면 막으로 유도하는 신호 서열은 키메라 수용체의 N-말단 구성요소의 내인성 신호 서열일 수 있다. 선택적으로, 일부 경우에 이러한 서열을 상이한 신호 서열로 교체하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 선택된 신호 서열은 키메라 수용체가 T 세포의 표면에 제시되도록 T 세포의 분비 경로로서 양립가능하여야 한다.
유사하게, 종결 영역은 키메라 수용체의 N-말단 구성요소를 인코딩하는 핵산 서열의 자연 발생 또는 내인성 전사 종결 영역에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로, 종결 영역은 사이한 출처로부터 유래할 수 있다. 대부분의 경우, 종결 영역의 출처는 일반적으로 재조합 단백질의 발현에 중요하지 않은 것으로 고려되고, 매우 다양한 종결 영역이 발현에 불리한 영향이 없이 채용될 수 있다.
당업자라면 이해할 바와 같이, 일부 경우에 CAR의 항원 결합 도메인의 말단에서 소수의 아미노산, 예를 들면 일반적으로 10개 이하, 더욱 일반적으로 5개 이하의 잔기가 결실될 수 있다. 또한, 경계에서는 적은 수의 아미노산, 일반적으로 10개 이하, 더욱 일반적으로 5개 이하의 잔기를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 아미노산의 결실 또는 삽입은 편리한 제한효소, 조작의 용이성 또는 발현 수준의 개선 등을 제공하는 제작 상 필요의 결과일 수 있다. 또한, 상이한 아미노산으로 하나 이상의 아미노산의 치환은 유사한 이유로 발생할 수 있고, 보통 임의의 하나의 도메인에서 약 5개 이상의 아미노산을 치환하지 않는다.
본 발명에 따른 키메라 수용체를 인코딩하는 키메라 구조물은 통상적인 방식으로 제조될 수 있다. 대부분의 경우 천연 서열이 채용될 수 있기 때문에, 천연 유전자는 분리되고, 적절한 경우 다양한 구성요소의 고유한 연결을 허용하도록 조작될 수 있다. 따라서, 키메라 수용체의 N-말단 및 C-말단 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 유전자의 원치않은 부분의 결실을 생성하는 적절한 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 채용하여 단리될 수 있다. 대안적으로, 클로닝된 유전자의 제한효소 절단물이 키메라 구조물을 생성하는데 사용될 수 있다. 어느 경우든, 서열은 블런트 말단 또는 상보적인 중첩을 갖는 제한효소 부위를 제공하도록 선택될 수 있다.
키메라 구조물을 제조하는 다양한 조작은 시험관내에서 수행될 수 있고, 구체적인 구현예에서 키메라 구조물은 적절한 숙주에서 클로닝 및 발현을 위해 표준 형질전환 또는 형질감염 방법을 사용하여 벡터 내로 도입된다. 따라서, 각 조작 이후에 DNA 서열의 연결로부터 생성된 구조물은 클로닝되고, 벡터가 단리되며, 서열이 원하는 키메라 수용체를 인코딩함을 보장하도록 스크리닝된다. 서열은 제한효소 분석 또는 시퀀싱 등에 의해 스크리닝될 수 있다.
본 발명의 키메라 구조물은 암에 걸리거나 걸린 것으로 의심되는 대상체에서 대상체의 종양의 크기를 감소시키거나, 종양의 성장 또는 재성장을 예방하는것에 의한 적용을 찾는다. 따라서, 본 발명은 추가로 대상체에서 성장을 감소시키거나 종양 형성을 예방하는 방법으로서, 본 발명의 키메라 구조물을 대상체의 단리된 T 세포 내로 도입하고, 형질전환 T 세포를 대상체 내로 재도입함으로써, 항-종양 반응을 수행하여 대상체에서 종양을 감소시키거나 제거하는, 방법에 관한 것이다. 사용될 수 있는 적합한 T 세포는 세포독성 림프구 (CTL) 또는 교란이 필요한 T 세포 수용체를 갖는 임의의 세포를 포함한다. 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 다양한 방법이 대상체로부터 이들 세포를 단리하는데 용이하게 사용가능하다. 예를 들면, 세포 표면 마커 발현을 사용하거나 시판되는 키트 (예로, 일리노이 락포드, 피어스사로부터의 ISOCELLTM)를 사용한다.
키메라 구조물은 맨 (naked) DNA로서 또는 적합한 벡터로 대상체 소유의 T 세포 내에 도입되는 것이 고려된다. T 세포를 맨 DNA를 사용한 전기천공에 의해 안정적으로 형질감염시키는 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예로, 미국 특허 제 US 6,410,319호 참조. 맨 DNA는 일반적으로 발현의 고유한 배향으로 플라스미드 발현 벡터에 포함된 본 발명의 키메라 수용체를 인코딩하는 DNA를 말한다. 유리하게, 맨 DNA의 사용은 본 발명의 키메라 수용체를 발현하는 T 세포를 생산하는데 요구된 시간을 감소시킨다.
대안적으로 바이러스성 벡터 (예로, 레트로바이러스성 벡터, 아데노바이러스성 벡터, 아데노 관련 바이러스성 벡터 또는 렌티바이러스성 벡터)는 키메라 구조물을 T 세포 내로 도입하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 용도에 적합한 벡터는 대상체의 T 세포에서 복제하지 않는다. 바이러스를 기반으로 하는 매우 많은 벡터가 공지되어 있으며, 여기서 세포에서 유지되는 바이러스의 사본수는 세포의 생존도를 유지하기에 충분히 낮다. 예시적인 벡터는 본원에 개시된 pFB-neo 벡터 (스트라타젠®), 뿐만 아니라 HIV, SV40, EBV, HSV 또는 BPV를 기반으로 한 벡터를 포함한다.
일단 형질감염 또는 형질도입된 T 세포가 표면 막 단백질로서 키메라 수용체를 원하는 조절을 하여 원하는 수준으로 발현할 수 있음이 확립되면, 키메라 수용체가 숙주 세포에서 원하는 신호 유도를 제공하도록 기능적인지 여부가 결정될 수 있다. 후속적으로, 형질도입된 T 세포는 대상체에서 항-종양 반응을 활성화하도록 대상체에게 재도입되거나 투여된다. 투여를 용이하게 하도록, 본 발명에 따라 형질도입된 T 세포는 적절한 담체 또는 희석제를 사용하여 약제학적 조성물로 제조되거나, 생체내 투여에 적절한 이식물 내에 형성되고, 이는 추가로 약제학적으로 허용가능할 수 있다. 이러한 조성물 또는 이식물을 제조하는 수단은 당해 기술분야에 기재되어 있다 (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 제 16판, Mack, ed., 1980). 적절한 경우, 형질도입된 T 세포는 개별 투여 경로를 위한 보통의 방식으로, 캡슐, 용액, 주사, 흡입제 또는 에어로졸과 같은 반고체 또는 액체 형태의 제조물로 제형될 수 있다. 당해 기술분야에 공지된 수단은 조성물의 방출 및 흡수를 이것이 표적 조직 또는 장기에 도달할 때까지 방해 또는 최소화하거나, 조성물의 시간 조정된 방출을 보장하는데 사용될 수 있다. 그러나, 바람직하게 키메라 수용체를 발현하는 세포를 무력하게 하지 않는 약제학적으로 허용가능한 형태가 채용된다. 따라서, 바람직하게 형질도입된 T 세포는 평형 염 용액, 바람직하게 행크 평형 염 용액 또는 정상 식염수를 포함하는 약제학적 조성물 내에 제조될 수 있다.
Ⅲ. 구현예와 관련된 방법 및 조성물
특정 양태에서, 본 발명은 항원 특이적 CD8+ CD161+ T 세포를 제조하고/거나 증식시키는 방법으로서, T 세포를 hCAR을 인코딩하는 DNA 구조물을 포함하는 발현 벡터로 형질감염시킨 다음, 선택적으로 세포를 항원 양성 세포, 재조합 항원, 또는 수용체에 대한 항체로 자극하여 세포가 증식하도록 유도하는 단계를 포함하는, 방법을 포함한다. 실시예에 설명된 바와 같이, 인터류킨 IL-7, IL-15 및 IL-21의 특정한 조합은 CD8+ CD161+ T 세포의 실질적으로 개선된 증식을 제공한다.
또 다른 양태에서, 맨 DNA를 사용한 전기천공 또는 다른 비-바이러스성 유전자 전달 (이에 한정되지는 않지만, 예컨대 초음파천공)에 의해 T 세포를 안정적으로 형질감염하거나 재안내하는 방법이 제공된다. 대부분의 연구자들은 T 세포 내로 이종유래 유전자를 운반하는데 바이러스성 벡터를 사용하였다. 맨 DNA를 사용함으로써, 재안내된 T 세포를 생산하는데 요구된 시간이 감소될 수 있다. "맨 DNA"는 발현의 고유한 배향으로 발현 카세트 또는 벡터에 포함된 키메라 T 세포 수용체 (cTCR)를 인코딩하는 DNA를 의미한다. 본 발명의 전기천공 방법은 표면에 키메라 TCR (cTCR)을 발현하고, 보유하는 안정한 형질전환체을 생산한다.
"키메라 TCR"은 T 세포에 의해 발현되고, 세포내 신호전달, 막통과 및 세포외 도메인을 포함하는 수용체를 의미하며, 여기서 세포외 도메인은 MHC 제한되지 않는 방식으로 T 세포 수용체에 의해 해당 방식으로 정상적으로 결합되지 않는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 적절한 조건 하에 항원에 의한 T 세포의 자극은 세포의 증식 (확장) 및/또는 IL-2의 생산을 유도한다. 본 출원의 예시적인 키메라 수용체는 키메라 TCR의 예이다. 그러나, 본 방법은 다른 표적 항원에 특이적인 키메라 TCR, 예컨대 HER2/Neu (Stancovski et al., 1993), ERBB2 (Moritz et al., 1994), 폴레이트 결합 단백질 (Hwu et al., 1995), 신장세포 샘암종 (Weitjens et al., 1996) 및 HIV-1 외피 단백질 gp120 및 gp41 (Roberts et al., 1994)에 특이적인 키메라 TCR로의 형질감염에 적용가능하다. 다른 세포 표면 표적 항원은 CD20, 암배아 항원, 메조텔린, ROR1, c-Met, CD56, GD2, GD3, α-태아단백질, CD23, CD30, CD123, IL-11Rα, κ 사슬, λ 사슬, CD70, CA-125, MUC-1, EGFR 및 변이체, 및 상피 종양 항원 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 양태에서, T 세포는 일차 인간 T 세포, 예컨대 인간 말초혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 유래한 T 세포이고, PBMC는 G-CSF, 골수 또는 제대혈로의 자극 이후에 수집된다. 조건은 mRNA 및 DNA의 사용 및 전기천공을 포함한다. 형질감염에 이어서, 세포는 즉시 주입될 수 있거나, 보관될 수 있다. 특정 양태에서, 형질감염에 이어서 세포는 수일, 수주 또는 수개월 동안 생체외에서, 세포 내로의 유전자 전달에 어어진 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 이상 이내에 대용량 집단으로서 증식될 수 있다. 추가의 특정 양태에서, 형질감염에 이어서 형질전환체가 클로닝되고, 단일 혼입된 또는 에피좀으로 유지된 발현 카세트 또는 플라스미드의 존재 및 키메라 수용체의 발현을 나타낸 클론은 생체외에서 증식된다. 증식을 위해 선택된 클론은 표적 세포를 특이적으로 인식하는 능력을 나타낸다. 재조합 T 세포는 IL-2, 또는 공통 감마 사슬에 결합하는 다른 사이토카인 (예로, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21 및 기타)으로의 자극에 의해 증식될 수 있다. 재조합 T 세포는 인공적인 항원 제시 세포에서 또는 T 세포 표면에서 CD3에 교차 결합하는 OKT3와 같은 항체를 사용하여 증식될 수 있다. 재조합 T 세포의 하위집합은 인공적인 항원 제시 세포에서 또는 T 세포 표면에서 CD52에 결합하는 캠퍼스와 같은 항체를 사용하여 증식될 수 있다.
주입 이후에 T 세포 증식 (생존)은 (i) CAR에 특이적인 프라이머를 사용한 qPCR; (ii) CAR에 특이적인 항체를 사용한 유세포 측정법; 및/또는 (iii) 가용성 TAA에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, CAR 세포는 암 또는 감염에 걸린 개인과 같은 필요로 하는 개인에게 전달된다. 다음으로 세포는 개인의 면역계를 증진하여 개별암 또는 병원성 세포를 공격한다. 일부 경우에, 개인은 1회 이상의 용량의 항원 특이적 CAR T 세포가 제공된다. 개인에게 2회 이상의 용량의 항원 특이적 CAR T 세포가 제공된 경우에, 투여 사이의 지속기간은 개인에서 증식 시간을 허용하기에 충분해야 하고, 상세한 구현예에서 용량 사이의 지속기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 6일 또는 7일 이상이다.
둘 다의 키메라 항원 수용체를 포함하도록 변형되고, 기능적 TCR이 결여된 동종이계 T 세포의 출처는 임의의 유형일 수 있지만, 상세한 구현예에서 세포는 예를 들면 제대혈, 말초혈액, 인간 배아 줄기 세포 또는 유도된 다능성 줄기 세포의 은행으로부터 획득된다. 치료 효과에 적합한 용량은 예를 들면, 바람직하게 일련의 투약 주기에서 용량 당 적어도 105개 또는 약 105개 내지 약 1010개일 수 있다. 예시적인 투약 섭생은 예를 들면 0일째 적어도 약 105개 세포로 시작하여 환자 내 용량 상승 계획을 개시한 수주 이내에 약 1010개 세포의 표적 용량까지 점진적으로 증가하는 용량 상승의 1주 투약 주기의 4회로 구성된다. 적합한 투여 방식은 정맥내, 피하, 공동내 (예를 들면 수조-접근 장치에 의해), 복강내 및 종양 덩어리 내로 직접적 주사를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로 또는 암을 치료하는데 유용한 다른 잘 확립된 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 전달되는지 상관없이, 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 경로를 통해, 포유동물 구체적으로 인간 신체에 전달되어 특정환 효과를 달성할 수 있다. 당업자라면 하나 이상의 경로가 투여에 사용될 수 있더라도 특정한 경로가 또 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들면, 진피내 전달은 유리하게 흑색종의 치료를 위해 흡입을 능가하여 사용될 수 있다. 국소적 또는 전신적 전달은 신체 공동 내로 제형물의 적용 또는 점적, 에어로졸의 흡입 또는 통기를 포함하는 투여에 의해, 또는 근육내, 정맥내, 문맥내, 간내, 복강, 피하 또는 진피내 투여를 포함하는 비경구 도입에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단위 용량 형태로 제공될 수 있으며, 여기서 각 용량 단위, 예로 주사는 선결정된 양의 조성물을 단독으로 또는 다른 활성 제제와 조합하여 포함한다. 본원에 사용된 용어 단위 용량 형태는 인간 및 동물 대상체를 위한 단위 용량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 말하고, 각 단위는 적절한 경우 약제학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 비히클과 관련하여 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양으로 계산된 본 발명의 조성물의 선결정된 양을 단독으로 또는 다른 활성 제제와 조합하여 포함한다. 본 발명의 새로운 단위 용량 형태의 명세는 특정한 대상체에서 약제학적 조성물과 관련된 특정한 약동학에 의존한다.
바람직하게, 단리된 형질도입된 T 세포의 유효량 또는 충분한 수가 조성물에 존재하고, 대상체에 도입되어 장기간 특이적 항-종양 반응이 확립되어 달리 이러한 치료의 부재 하에 유발될 것보다 종양의 크기를 감소시키거나 종양 성장 또는 재성장을 제거한다. 없애도록 확립된다. 바람직하게, 대상체로 재도입된 형질도입된 T 세포의 양은 달리 형질도입된 T 세포가 존재하지 않는 동일한 조건과 비교할 때 종양 크기의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 100% 감소를 유도한다.
따라서, 투여된 형질도입된 T 세포의 양은 투여 경로를 고려해야 하고, 형질도입된 T 세포의 충분한 수가 도입되어 원하는 치료 반응을 달성하도록 해야 한다. 또한, 본원에 기술된 조성물에 포함된 각 활성 제제의 양 (예로, 접촉될 각 세포 당 양 또는 특정 체중 당 양)은 상이한 적용에서 달라질 수 있다. 일반적으로, 형질도입된 T 세포의 농도는 바람직하게 1 × 106개 내지 1 × 109개 형질도입된 T 세포, 더욱 바람직하게 1 × 107개 내지 5 × 108개 형질도입된 T 세포로 치료되고 있는 대상체에서, 임의의 적합한 양이 초과로 예로 5 × 108개 이상의 세포, 또는 미만으로 예로 1 × 107개 이하의 세포로 사용될 수 있더라도 제공되기에 충분해야 한다. 투약 스케쥴은 잘 확립된 세포 기반의 요법 (예로, Topalian and Rosenberg, 1987; 미국 특허 제 US 4,690,915호 참조)을 기반으로 하거나, 대안의 연속적인 주입 전략이 채용될 수 있다.
이러한 값은 본 발명의 방법을 본 발명의 관행에 최적화할 때 의사가 사용할 형질도입된 T 세포의 일반적인 범위 지침을 제공한다. 본원에서 이러한 범위의 재인용은 특정한 적용에서 보장될 수 있는 바, 구성요소의 더 높거나 더 낮은 양의 사용을 배제하지 않는다. 예를 들면, 실제 용량 및 스케쥴은 조성물이 다른 약제학적 조성물과 조합하여 투여되는지 여부에 따라, 또는 약력학, 약물 분해 및 대사의 개인간 차이에 따라 달라질 수 있다. 당업자라면 특정한 응급 상황에 따라 임의의 필요한 조정을 할 수 있다.
Ⅳ. 예시적인 인간 항원 수용체 T 세포
상기 논의된 바와 같이, 본 발명은 CD8+ CD161+ T 세포의 배양 및 용도에 관한 것이다.
CD8 (분화 군집 8)은 T 세포 수용체 (TCR)의 보조-수용체로서 작용하는 막통과 당단백질이다. TCR과 마찬가지로, CD8은 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합하지만 클래스 I MHC 단백질에 특이적이다. 각각 상이한 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 α및 β의 2가지 이소형이 있다. 인간에서, 둘 다의 유전자는 염색체 2번 상의 위치 2p12에 위치한다.
CD8 보조-수용체는 세포독성 T 세포의 표면에 우세하게 발현되지만, 자연 킬러 세포, 피질 흉선세포 및 수지상 세포 상에서도 발견될 수 있다. CD8 분자는 세포독성 T 세포 집단의 마커이다. 이것은 T 세포 림프모구성 림프종 및 탈색된 균상식육종에서 발현된다.
기능하기 위하여, CD8은 한 쌍의 CD8 사슬로 구성된 이량체를 형성한다. CD8의 가장 공통적인 형태는 둘 다가 얇은 줄기 및 세포내 미단에 의해 막에 연결된 면역글로불린 (IgV) 유사 세포외 도메인을 갖는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원인 CD8-α 및 CD8-β 사슬로 구성된다. 덜 보편적인 CD8-α의 동종이량체도 일부 세포 상에서 발현된다. 각 CD8 사슬의 분자량은 약 34 kDa이다. CD8 분자의 구조는 2.6Å 해상도의 X-선 회절로 Leahy, D.J., Axel, R. 및 Hendrickson, W.A.에 의해 결정되었다. 구조는 면역글로불린 유사 베타-샌드위치 폴딩 및 114개 아미노산 잔기를 갖는 것으로 결정되었다. 단백질 중 2%는 α-나선으로, 46%는 β-시트로 감기고, 잔여 52%의 분자는 루프 부분에 남는다.
CD8-α의 세포외 IgV 유사 도메인은 클래스 I MHC 분자의 α3 부분과 상호작용한다. 이러한 친화도는 세포독성 T 세포의 T 세포 수용체와 표적 세포가 함께 항원 특이적 활성화 동안 긴밀하게 결합이 유지되도록 한다. CD8 표면 단백질을 갖는 세포독성 T 세포는 CD8+ T 세포로 불린다. 주요 인식 부위는 MHC 분자의 α3 도메인에 있는 가용성 루프이다. 이것은 돌연변이 분석을 시행하여 발견되었다. 가용성 α3 도메인은 게놈에서 잔기 223번 및 229번 사이에 위치한다. 세포독성 T 세포의 항원 상호작용을 돕는 것과 더불어, CD8 보조-수용체는 또한 T 세포 신호전달에서 역할을 담당한다. CD8 보조-수용체의 세포질 미단은 Lck (림프구 특이적 단백질 타이로신 키나제)와 상호작용한다. 일단 T 세포 수용체가 이의 특이적 항원에 결합하면, Lck는 TCR 복합체의 세포질 CD3 및 ζ-사슬을 인산화하고, 이는 인산화 연쇄반응을 개시하여 궁극적으로 특정 유전자의 발현에 영향을 주는 NFAT, NF-κB 및 AP-1과 같은 전사인자의 활성화를 유도한다.
CD161은 KLRB1 또는 NKR-P1A로도 알려져 있으며, 외부 C-말단을 갖기 때문에 제 Ⅱ형 막 단백질로서 분류된다. CD161은 기능적 리간드로서 렉틴 유사 전사체-1 (LLT1)를 인식한다. 자연 킬러 (NK) 세포는 세포독성을 매개하고, 면역 자극 이후에 사이토카인을 분비하는 림프구이다. 설치류 NKRP1 패밀리의 당단백질을 포함하여 C-유형 렉틴 슈퍼패밀리의 다수 유전자는 NK 세포에 의해 발현되고, NK 세포 기능의 조절에 관여할 수 있다. CD161은 C-유형 렉틴의 여러 모티브 특징을 갖는 세포외 도메인, 막통과 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 구현예의 조성물 및 방법은 키메라 항원 수용체 (또는 CAR) 폴리펩티드를 발현하는 인간 CD8+ CD161+ T 세포에 관한 것이다. CAR은 임의의 항원 결합 특이성을 갖을 수 있지만, CAR 구조물에 존재하는 전형적인 세포내 신호전달 도메인, 막통과 도메인 및 세포외 도메인을 포함할 것이다. 세포외 도메인은 CAR T가 설계된 용도에 의존하여 주어진 결합 영역을 포함할 것이다. 결합 영역은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv 또는 scFv이다. 결합 영역은 야생형 아미노산 서열과 적어도, 많아도 또는 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 일치하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 세포내 도메인은 인간 CD3ξ의 세포내 신호전달 도메인을 포함할 수 있고, 인간 CD28 세포내 분절을 추가로 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 막통과 도메인은 CD28 막통과 도메인이다.
추가의 양태에서, 조성물은 상기에 기술된 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함할 것이다. 특정 양태에서, 핵산 서열은 인간 코돈 사용도에 최적화된다.
추가의 양태에서, 조성물은 상기에 기술된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 포함할 수 있다. T 세포는 CAR 상기에 기술된 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 트랜스포존, 인간 트랜스포존과 같은 비-바이러스성 벡터 또는 이의 재조합 변이체에 포함될 수 있다. 발현 카세트는 바이러스성 벡터 또는 이의 재조합 변이체에 포함될 수 있다. 발현 카세트는 게놈으로 혼입되거나, 에피좀으로 유지되거나, mRNA로부터 발현될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 인간 CAR을 발현하는 T 세포를 제조하는 방법으로서, 발현 카세트를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 발현 카세트는 세포외 결합 도메인, 막통과 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(들)을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는, 방법을 포함한다. 본 방법은 세포를 표적 항원 또는 수용체에 대한 항체로 자극하여 세포가 증식하고/거나, 사멸하고/거나, 사이토카인을 생성하도록 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포는 표적 항원 보유하는 인공적인 항원 제시 세포로 자극되어 증식하거나 확장될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명은 인간 질환 병태를 치료하는 방법으로서, 병태를 치료하기에 충분한 양의 인간 CAR을 발현하는 재조합 세포를 환자에게 주입하는 단계를 포함하고, 여기서 인간 CAR은 세포외 표적 결합 도메인, 막통과 도메인 및 세포외 신호전달 도메인을 포함하는, 방법을 포함한다. 병태는 예를 들면 암, 자가면역 질환 또는 감염성 질환일 수 있다.
hCAR은 CD3-ζ 유래한 활성화 도메인과 같은 하나 이상의 활성화 엔도도메인(들)을 포함하는 키메라 수용체일 수 있다. 추가적인 T 세포 활성화 모티브는 CD28, CD27, OX-40, DAP10 및 4-1BB를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 양태에서, 활성화 도메인은 CD28 막통과 및/또는 활성화 도메인도 포함할 수 있다. 추가의 양태에서, 인간 세포 및 대상체에서 발현에 코돈 최적화된 hCAR 인코딩하는 영역 및 발현 카세트, 예로 일 구현예에서 표적 특이적 인간 항체의 VH 및 VL 서열로부터 획득된 scFv 영역은 hCAR의 결합 분절에 도입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, hCAR 발현 카세트는 에피좀으로 유지되거나, 재조합 세포의 게놈 내로 혼입될 수 있다. 특정 양태에서, 발현 카세트는 인트그라제 메커니즘, 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스성 벡터 또는 트랜스포존 메커니즘과 같은 비-바이러스성 벡터를 사용하여 혼입할 수 있는 핵산에 포함된다. 추가의 구현예에서, 발현 카세트는 트랜스포존 기반의 핵산에 포함된다. 구체적인 구현예에서, 발현 카세트는 비-바이러스성 유전자 전달을 위한 트랜스포존 및 트랜스포제이즈를 사용하는 2가지 구성요소 슬리핑 뷰티 (SB) 또는 피기백 (piggyBac) 시스템의 일부이다.
재조합 hCAR 발현 세포는 임상적으로 의미있는 수로 수적으로 증식될 수 있다. 이러한 증식의 한 가지 예는 인공적인 항원 제시 세포 (aAPC)를 사용한다. 재조합 hCAR 발현 세포는 유세포 측정법 및 웨스턴 블럿 분석에 의해 입증되고 식별될 수 있다. CAR을 발현하는 재조합 hCAR 발현 T 세포는 표적 세포를 인식하여 사멸시킬 수 있다. 추가의 양태에서, hCAR은 이식 장벽을 관통하여 주입되어 면역원성을 방해할 수 있는 만능 세포 내에서 발현될 수 있다. hCAR은 영상화 (예컨대 양전자 방출 단층촬영술, PET에 의함)를 위한 인간 유전자 및 세포독성의 과정에서 T 세포의 조건부 절제와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 재조합 세포는 특이적인 세포 요법에 사용될 수 있다.
Ⅴ. 최소의 잔류 질환을 표적하기 위한 키메라 항원 수용체 또는 유전자전환 TCR T 세포를 공동-발현하는 예시적인 막 결합된 IL-15
성인 및 소아 B 세포 계열의 급성 림프모구성 백혈병 (B-ALL)의 화학요법 치료는 약물 저항성 잔류 질환으로 인해 각각 65% 및 20%의 질환 재발율을 갖는다. B-ALL 재발의 높은 발병율은 특히 예후가 빈약한 실험군에서 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)을 사용한 면역 기반의 요법의 사용을 강조하였다. 이러한 요법은 질환이 없는 생존을 개선하는, 남아있는 백혈병 세포 또는 최소의 잔류 질환의 박멸을 위해 공여자 이식편에 존재하는 동종반응성 세포에 의존적이다. 공여자 림프구 주입은 동종이계 HSCT 이후에 이식된 T 세포가 잔류 B-ALL를 표적하는 능력을 증진하는데 사용되었지만, 이러한 환자를 위한 본 치료 접근법은 10% 미만의 완화율을 달성하고, 이식대숙주병 (GVHD)의 빈도 및 중증도로부터의 높은 유병율 및 사망율과 관련되어 있다. 재발과 함께 이들 난치성 악성 종양에서 공통적인 치사 문제인, HSCT 이후에 말초혈액 단핵구 세포 (PBMC) 유래한 T 세포를 사용한 입양 요법은 공여자 T 세포의 종양 관련 항원 (TAA)에 대한 특이성을 재표적함으로서 항-종양 효과 또는 이식대백혈병 (GVL) 효과를 증가시키는데 사용될 수 있다.
현재, CAR 변형된 T 세포는 종양 항원과 만날 때만 발생하는 CAR를 통한 생존 신호전달을 획득하는데 의지한다. 이들 CAR 변형된 T 세포가 대형 질환에 걸린 환자 내로 주입되는 임상적 상황에서, CAR를 통해 충분한 활성화 및 생존 신호전달을 제공하도록 존재하는 많은 종양 항원이 존재한다. 그러나, 재발된 B-ALL에 걸린 환자는 종종 골수절제 화학요법으로 적응되고, 이어서 HSCT가 진행되고, 최소의 잔류 질환 (MRD)이 존재한다. 이러한 경우에, 환자는 낮은 종양 부하를 갖고, 낮은 TAA 수준은 결과적으로 치료적 잠재력을 저하시키는 주입된 T 세포를 뒷받침하는데 필요한 CAR 매개된 신호전달을 제한시킨다. T 세포 지속성을 개선하는 대안의 CAR 비의존적 수단은 CAR 매개된 T 세포 이식을 개선하기 위하여 기대될 것이다.
공통적인 감마 사슬 수용체 패밀리 (γC)의 사이토카인은 림프 기능, 생존 및 증식에 결정적인 T 세포의 중요한 보조자극성 분자이다. IL-15는 입양 요법에 바람직한 여러 속성을 소유한다. IL-15는 장수 기억 세포독성 T 세포의 생존을 지지하고, 종양 잔류 세포의 기능적 억압을 완화함으로써 확립된 종양의 박멸을 촉진하고, AICD를 억제하는 항상성 사이토카인이다.
IL-15는 조직 제한되고, 생리적 조건 하에서만 혈청에서 또는 전신적으로 임의의 수준으로 관찰된다. 주변 환경으로 분비되는 다른 γC 사이토카인과 달리, IL-15는 IL-15 수용체 알파 (IL-15Rα)의 맥락에서 생산하는 세포에 의해 T 세포에게로 트랜스로 제시된다. T 세포 및 다른 반응 세포에게로 이러한 사이토카인의 독특한 전달 메커니즘은 (i) 높게 표적화되고, 국소화되며; (ii) IL-15의 안정성 및 반감기를 감소시키괴 (iii) 가용성 IL-15에 의해 달성되는 것과 정량적으로 상이한 신호전달을 수득한다.
일 구현예에서, 본 발명은 예를 들면 최소의 잔류 질환 (MRD)을 나타내는 백혈병 환자를 치료할 목적으로 생체내 잠재력이 오래가는 키메라 항원 수용체 (CAR) 변형된 T 세포 또는 유전자전환 TCR T 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 종합하여, 본 방법은 사이토카인과 같은 가용성 분자가 세포 표면에 융합되어 치료적 잠재력을 증강시키는 방식을 설명하고 있다. 본 발명의 핵심은 CAR T 세포 또는 유전자전환 TCR T 세포를 mLI-15로도 지칭되는 인터류킨-15 (IL-15)의 인간 사이토카인 뮤테인으로 공동-변형시키는 것이다. mIL-15 융합 단백질은 가요성 세린-글리신 링커를 통해 전장의 IL-15 수용체 α에 융합된 IL-15의 코돈 최적화된 cDNA 서열을 포함한다. 이러한 IL-15 뮤테인은 (i) CAR+ 또는 유전자전환 TCR+ T 세포의 표면에 mIL-15 발현을 제한하여 비-표적 생체내 환경에 사이토카인의 확산을 억제하고, 이로써 외인성 가용성 사이토카인 투여가 독성을 유도하였을 때 이의 안정성 프로파일을 잠재적으로 개선하며; (ii) IL-15Rα의 맥락에서 IL-15를 제시하여 생리학적으로 적절하고 정량적인 신호전달, 뿐만 아니라 더 긴 사이토카인 반감기를 위한 IL-15/IL-15Ra 복합체의 안정화 및 재순환을 모방하도록 이러한 방식으로 설계되었다. mIL-15를 발현하는 T 세포는 뒷받침하는 사이토카인 신호전달을 계속할 수 있으며, 이는 주입 이후 이들의 생존에 중요하다. 비-바이러스성 슬리핑 뷰티 시스템 유전적 변형 및 후속적으로 임상적으로 적용가능한 플랫폼 상의 생체외 증식에 의해 생성된 mIL15+ CAR+ T 세포 또는 mIL15+ 유전자전환 TCR+ T 세포는 종양 부하가 높거나, 낮거나, 없는 마우스 모델에서 주입 이후에 지속성이 증진된 T 세포 주입 산물을 수득하였다. 더욱이, mIL15+ CAR+ T 세포는 높거나 낮은 종양 부하 모델 둘 다에서 항-종양 효능의 개선도 입증하였다.
높은 종양 부하 모델에서 CAR+ T 세포와 대비하여 mIL15+ CAR+ T 세포의 개선된 지속성 및 항-종양 활성은 mIL15+ CAR+ T 세포가 종양 부하가 우세한 활발한 질환에 걸린 백혈병 환자를 치료하는데 CAR+ T 세포보다 더욱 효능적일 수 있다. 따라서, mIL15+ CAR+ T 세포는 가장 광범위한 적용의 입양 요법에서 CAR+ T 세포를 능가한다. mIL15+ CAR+ T 세포가 CAR를 통한 생존 신호전달과 독립적으로 생존하는 능력은 이들 변형된 T 세포가 종양 항원의 결여에도 불구하고 주입 이후에 지속되도록 한다. 결론적으로, MRD 치료 설정에서, 특히 골수절제 화학요법 및 조혈 줄기 세포 이식을 하였던 환자에서의 치료 효능에 가장 큰 영향을 줄 것으로 기대된다. 이들 환자는 mIL15+ CAR+ T 세포를 사용한 입양 T 세포 전달을 수여받아 이들의 MRD를 치료하고 재발을 예방할 것이다.
mIL-15와 같은 막 결합된 사이토카인은 광범위한 의미를 갖는다. 막 결합된 IL-15와 더불어, 다른 막 결합된 사이토카인이 고려된다. 막 결합된 사이토카인은 또한 인간 적용에 사용된 세포를 활성화하고 증식시키는 것과 관련된 다른 분자의 세포 표면 발현으로 연장될 수 있다. 이들은 사이토카인, 케모카인 및 인간 적용에 사용된 세포의 활성화 및 증식에 기여하는 다른 분자를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
mIL-15와 같은 막 결합된 사이토카인은 생체외에서 인간 용도(들)를 위한 세포를 제조하는데 사용될 수 있고, 인간 적용에 사용된 주입된 세포 (예로, T 세포)에 있을 수 있다. 예를 들면, 막 결합된 IL-15는 K562로부터 유래한 것과 같은 인공적인 항원 제시 세포 (aAPC)에서 발현되어 활성화 및/또는 증식을 위해 T 세포 및 NK 세포 (뿐만 아니라 다른 세포)를 자극할 수 있다. aAPC 상에서 mIL-15에 의해 활성화된/증식된 T 세포 집단은 유전적으로 변형된 림프구, 뿐만 아니라 종양 침윤성 림프구 및 기타 면역 세포를 포함한다. 이들 aAPC는 주입되지 않는다. 대조적으로, mIL-15 (및 다른 막 결합된 분자)는 주입된 T 세포 및 다른 세포에서 발현될 수 있다.
CAR 변형된 T 세포를 사용한 MRD 치료의 치료 효능은 T 세포의 입양 전달 이후에 지속성의 결여로 방해받는다. mIL15+ CAR+ T 세포 또는 mIL15+ 유전자전환 TCR+ T 세포가 종양 항원과 독립적으로 장기간 생체내에서 생존하는 능력은 MRD에 걸린 환자를 치료할 큰 잠재력을 나타낸다. 이러한 경우에, mIL-15 및 이것이 지지하는 지속하는 T 세포는 현재 MRD 환자를 위한 접근법이 불충분하기 때문에 필요가 있을 것이다. MRD에 걸린 환자에게 주입된 T 세포 및 다른 림프구의 지속성은 CAR+ T 세포를 넘어 적용한다. 악성 종양, 감염 또는 자가면역 질환을 치료하고 예방하는데 사용되는 임의의 면역 세포는 치료 효과가 계속 달성되는 경우 장기간에 걸쳐 지속될 수 있어야 한다. 따라서, 내인성 T 세포 수용체 또는 도입된 면역수용체로부터 유래한 신호를 넘어가는 지속성을 위해 T 세포를 활성화하는 것은 많은 입양 면역요법의 양태에서 중요하다. 막 결합된 사이토카인(들)의 발현은 따라서 다양한 병리적 병태를 위해 주입된 T 세포 및 다른 림프구의 치료적 잠재력 및 지속성를 증강시키는데 사용될 수 있다.
본 발명자들은 CAR+ T 세포 또는 유전자전환 TCR+ T 세포에서 IL-15 및 IL-15Rα (mIL-15)의 막 결합된 융합 단백질로서 발현되는 IL-15의 뮤테인을 생성하였다. mIL-15 구조물은 2가지 슬리핑 뷰티 DNA 트랜스포존 플라스미드로서 CD19 특이적 CAR (0일째)를 사용하여 일차 인간 T 세포 내로 전기적으로 공동-전달되었다. 임상적으로 적절한 수의 mIL15+ CAR+ T 세포는 CD19+ 인공적인 항원 제시 세포 및 보충된 IL-21 상의 공동-배양에 의해 생성되었다. 유전적으로 변형된 T 세포에서 IL-15 수용체 복합체를 통한 신호전달은 STAT5 (pSTAT5)의 인산화에 의해 확인되었으며, 이들 T 세포는 CAR+ T 세포와 동등한 CD19+ 종양 표적의 재안내된 특이적 용해를 입증하였다. 또한, 항원 제거 이후에도 mIL-15에 의해 생성된 신호전달은 특이적 세포 표면 마커, 전사 인자 및 IL-2를 분비하는 능력을 포함하는 기억 관련 속성을 보유하는 덜 분화된/ 더 젊은 표현형을 갖는 T 세포의 만연을 증가시켰다. 이러한 특징은 생체외에서 장기간 지속하는 입증된 성능을 갖는 T 세포 하위집합과 상관되기 때문에 입양 전달에 사용된 T 세포에서 바람직한 형질이다. 범발성 CD19+ 백혈병을 보유하는 면역저하된 NSG 마우스에서, mIL15+ CAR+ T 세포는 지속성 및 항-종양 효과를 둘 다 나타내는 반면, 이의 CAR+ T 세포 대응물은 TAA의 존재에도 불구하고 유의한 지속성을 유지할 수 없었다. mIL15+/-CAR+ T 세포가 먼저 6일 동안 이식되고, 이어서 범발성 CD19+ 백혈병의 도입이 진행된 예방적 마우스 (NSG) 모델에서, mIL15+ CAR+ T 세포만이 지속되고 종양 이식을 예방하는 것이 확인되었다. mIL15+ CAR+ T 세포가 TAA로부터의 자극과 독립적으로 지속할 수 있는지 여부를 테스트하기 위하여, mIL15+/-CAR+ T 세포는 종양이 없은 NSG 마우스 내로 입양으로 전달되었다. mIL15+ CAR+ T 세포만이 외인성 사이토카인 지원 또는 CD19 TAA의 존재가 없이도 이러한 생체내 환경에서 지속할 수 있었다. 이들 데이타는 mIL-15가 CAR+ T 세포 또는 유전자전환 TCR+ T 세포에서 공동-발현되어 TAA 또는 외인성 사이토카인 지원이 필요 없이 생체내 지속성을 증진시키는 점을 입증하였다. 요약하면, 이러한 사이토카인 융합 분자는 (i) pSTAT5를 통해 자극성 신호를 제공하여 종양 특이적 기능성을 유지하면서 생체내 T 세포 지속성을 증강시키며, (ii) 기억 유사 표현형을 촉진하는 T 세포 하위집합을 유지시키고, (iii) 시험관내 및 생체내 T 세포 증식 및 지속성을 위한 임상 등급 IL-2의 필요성 및 비용을 없애고; (iv) 임상 등급의 Il-15의 필요성을 경감시킨다.
Ⅵ. 췌장 샘암종
췌장암은 위장 뒤의 샘 장기인 췌장에서 세포가 조절을 벗어나 증식하기 시작하여 덩어리를 형성할 때 발생한다. 이러한 암성 세포는 신체의 다른 부분을 침범하는 능력을 갖는다. 많은 유형의 췌장암이 존재한다. 가장 보편적인 췌장 샘암종은 사례 중 85%를 차지하고, 용어 "췌장암"은 때로 해당 유형만을 말하는데 사용된다. 이들 샘암종은 소화 효소를 만드는 췌장의 일부 내에서 시작한다. 또한, 종합적으로 대부분의 비-샘암종을 나타내는 다수의 다른 유형의 암은 이들 세포로부터 발생할 수 있다. 1% 내지 2%의 췌장암 사례는 췌장의 호르몬 생산하는 세포로부터 발생하는 신경내분비 종양이다. 이들은 일반적으로 췌장 샘암종보다 덜 공격적이다.
췌장암의 가장 공통적인 형태의 징후 및 증상은 황색 피부, 복부 또는 배부 통증, 설명되지 않는 체중 감소, 옅은색 분변, 어두운색 소변 및 식욕`부진을 포함할 수 있다. 보통 질환의 초기 단계에는 증상이 없고, 전형적으로 췌장암을 시사하기에 충분한 특이적인 증상은 질환이 진행된 단계에 도달할 때까지 발생하지 않는다. 진단 시점에, 췌장암은 종종 신체의 다른 부분으로 전파되어 있다.
췌장암은 40세 이전에는 거의 발생하지 않고, 췌장 샘암종 사례의 절반 이상이 70세를 넘은 연령에서 발생한다. 췌장암의 위험인자는 담배 흡연, 비만, 당뇨병 및 특정 희귀한 유전적 병태를 포함한다. 25%의 사례는 흡연과 연관되고, 55 내지 10%는 유전된 유전자와 연관된다. 췌장암은 보통 초음파 또는 컴퓨터 단층촬영술, 혈액 테스트 및 조직 시료의 검사 (생검)과 같은 의학적 영상화 기법의 조합에 의해 진단된다. 질환은 초기 (제 Ⅰ기)부터 후기 (제 Ⅳ기) 단계까지로 나뉜다. 일반 인구 집단을 스크리닝하는 것은 효과적인지 않은 것으로 확인되었다.
췌장암을 발생시킬 위험은 비-흡연자 및 건강한 체중을 유지하고 적색 또는 가공된 고기의 소비를 제한하는 사람 중에서는 더 낮다. 흡연자의 질환을 발생시킬 기회는 흡연을 중단하는 경우 감소하고, 대부분이 20년 후에 나머지 인구 집단 정도로 회복한다. 췌장암은 외고 수술, 방사선요법, 화학요법, 경감 관리 또는 이들의 조합으로 치료될 수 있다. 외과 수술은 췌장 샘암종을 치유할 수 있는 유일한 치료이고, 치유의 가능성이 없이도 삶의 질을 개선하도록 또한 시행될 수 있다. 통증 관리 및 소화를 개선하는 투약이 때로 필요하다. 초기 경감 관리는 심지어 치유를 목표로 한 치료를 받는 경우에도 추천된다.
2015년에, 모든 유형의 췌장암은 전세계적으로 411,600명의 사망의 결과를 가져왔다. 췌장암은 영국에서 암으로 인한 사망의 5번째 가장 보편적인 원인이고, 미국에서 3번째 가장 보편적인 것이다. 이 질환은 선진국에서 가장 자주 발생하고, 2012년에는 약 70%의 새로운 사례가 나왔다. 췌장 샘암종은 전형적으로 매우 빈약한 예후를 갖으며, 진단 이후에 25%의 사람이 1년 생존하고, 5년 동안 5%가 생존한다. 초기에 진단된 암의 경우, 5년 생존율이 약 20%로 상승한다. 신경내분비암은 더 나은 성과를 갖으며, 진단으로부터 5년째, 65%의 진단된 사람이 생존율은 암의 유형에 따라 상당히 달라지더라도 생존한다.
Ⅶ. 면역계 및 면역요법
일부 구현예에서, 의학적 장애는 특이적 면역 반응을 유도하는 재안내된 T 세포의 전달에 의해 치료된다. 본 발명의 구현예에서, B 세포 계열 악성 종양 또는 장애는 특이적 면역 반응을 유도하는 재안내된 T 세포의 전달에 의해 치료된다. 따라서, 면역적 반응의 기본적 이해가 필요하다.
적응성 면역계의 세포는 림프구로 불리는 백혈구 유형이다. B 세포 및 T 세포는 림프구의 주요 유형이다. B 세포 및 T 세포는 동일한 다능성 조혈 줄기 세포로부터 유래하고, 이들이 활성화된 이후까지 서로 구별되지 않는다. B 세포는 체액성 면역 반응에서 큰 역할을 담당하는 반면, T 세포는 세포 매개성 면역 반응에서 친밀하게 관여한다. 이들은 T 세포 수용체 (TCR)로 불리는 세포 표면의 특별한 수용체의 존재에 의해 B 세포 및 NK 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. 다른 척추동물 거의 모두에서, B 세포 및 T 세포는 골수에서 줄기 세포에 의해 생산된다. T 세포는 이들의 명칭이 유래한 흉선으로 이동하여 발생된다. 인간에서, 대략 1% 내지 2%의 림프구 풀은 매시간 재순환하여 항원 특이적 림프구가 제 2의 림프성 조직 내에서 이들의 특이적 항원을 발견하는 기회를 최적화한다.
T 림프구는 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 발생하고, 전형적으로 흉선샘으로 이동하여 성숙된다. T 세포는 단지 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자와 결합하여 항원을 인식할 수 있는, 이들의 막 상에 독특한 항원 결합 수용체 (T 세포 수용체)를 발현한다. T 헬퍼 세포 및 T 세포독성 세포로서 알려진 T 세포의 적어도 2가지 집단이 존재한다. T 헬퍼 세포 및 T 세포독성 세포는 우선적으로 막 결합된 당단백질 CD4 및 CD8을 각각 전시하여 구별된다. T 헬퍼 세포는 B 세포, T 세포독성 세포, 대식구 및 면역계의 다른 세포의 활성화에 중요한 다양한 림포카인을 분비한다. 대조적으로, 항원-MHC 복합체를 인식하는 T 세포독성 세포는 증식하여 세포독성 T 림프구 (CTL)로 불리는 효과기 세포로 분화된다. CTL는 세포 용해를 유도하는 물질을 생산하여, 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포와 같은 항원을 전시하는 신체 세포를 제거한다. 자연 킬러 세포 (또는 NK 세포)는 선천적 면역계의 주요 구성요소를 구성하는 세포독성 림프구의 한 유형이다. NK 세포는 종양 및 바이러스에 감염된 세포의 거부에서 주요한 역할을 담당한다. 세포는 표적 세포를 아폽토시스에 의해 사멸시키는 퍼포린 및 그램자임으로 불리는 단백질의 작은 세포질 과립을 방출함으로써 사멸시킨다.
항원 제시 세포는 대식구, B 림프구 및 수지상 세포를 포함하고, 특정한 MHC 분자의 발현에 의해 구별된다. APC는 항원을 내재화하고, 이들의 외부 세포막 상의 MHC와 함께 해당 항원의 일부를 재발현한다. 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 는 다수의 유전자 좌위를 갖는 큰 유전적 복합체이다. MHC 유전자 좌위는 클래스 I 및 클래스 Ⅱ MHC로 지칭되는 MHC 막 분자의 2가지 주요 클래스를 인코딩한다. T 헬퍼 림프구는 일반적으로 MHC 클래스 Ⅱ 분자와 관련된 항원을 인식하고, T 세포독성 림프구는 일반적으로 MHC 클래스 I 분자와 관련된 항원을 인식한다. 인간에서, MHC는 HLA 복합체로서 지칭되고, 마우스에서는 H-2 복합체로 지칭된다.
T 세포 수용체 또는 TCR은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합된 항원의 인식을 책임지는 T 림프구 (또는 T 세포)의 표면에서 발견되는 분자이다. 이것은 95%의 T 세포에서 α 및 β 사슬로 구성되는 반면, 5%의 T 세포는 감마 및 델타 사슬로 구성된 TCR을 갖는다. 항원 및 MHC을 사용한 TCR의 개입은 관련 효소, 공동-수용체 및 특수화된 보조 분자에 의해 매개되는 일련의 생화학적 과정을 통해 이의 T 림프구의 활성화를 유도한다. 면역학에서, CD3 항원 (분화 군집의 CD 가닥)은 포유동물에서 T 세포 수용체 (TCR) 및 ζ 사슬로 알려진 분자와 결합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성하는, 4가지 구분된 사슬 (CD3γ, CD3δ 및 2개의 CD3ε)로 구성된 단백질 복합체이다. TCR, ζ 사슬 및 CD3 분자는 함께 TCR 복합체를 포함한다. CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 사슬은 단일 세포외 면역글로불린 도메인을 포함하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 매우 관련된 세포 표면 단백질이다. CD3 사슬의 막통과 영역은 이들이 사슬이 양으로 하전된 TCR 사슬 (TCRα 및 TCRβ)과 결합하도록 허용하는 특징으로 음으로 하전된다. CD3 분자의 세포내 미단은 면역수용체 타이로신 기반의 활성화 모티브 또는 간단하게 ITAM으로 알려진 단일 보존된 모티브를 포함하고, 이는 TCR의 신호전달 능력에 필수적이다.
CD28은 T 세포 활성화에 요구되는, 보조자극성 신호를 제공하는 T 세포 상에 발현된 분자 중 하나이다. CD28는 B7.1 (CD80) 및 B7.2 (CD86)의 수용체이다. 통 유사 수용체 리간드에 의해 활성화될 때, B7.1 발현은 항원 제시 세포 (APC)에서 상향조절된다. 항원 제시 세포 상의 B7.2 발현은 구성발현성이다. CD28은 미감작 T 세포 상에서 구성적으로 발현된 유일한 B7 수용체이다. TCR과 더불어 CD28을 통한 자극은 다양한 인터류킨 (구체적으로, IL-2 및 IL-6)의 생산을 위해 T 세포에 강력한 보조자극성 신호를 제공할 수 있다.
인간 질환을 위한 치료 개입으로서 항원 특이적 T 세포를 단리하고 증식하는 전략은 임상 시험으로 입증되었다 (Riddell et al., 1992; Walter et al., 1995; Heslop et al., 1996).
자가면역 질환 또는 자가면역은 유기체가 자신의 성분 일부 (분자 수준 이하까지)를 "자신"으로서 인식하지 못하는 것이고, 이는 자신의 세포 및 조직에 대한 면역 반응을 유도한다. 이러한 비정상 면역 반응으로부터 유발된 임의의 질환은 자가면역 질환으로 명명된다. 유명한 예는 복강병, 당뇨병 제 1형 (IDDM), 전신성 홍반 루푸스 (SLE), 스조렌 증후군, 다발성 경화증 (MS), 하시모토 갑상샘염, 그레이브병, 특발성 자반 혈소판감소증 및 류마티스 관절염 (RA)을 포함한다.
또한, 자가면역 질환을 포함한 염증성 질환은 B 세포 장애와 연관된 질환의 부류이다. 자가면역 질환의 예는 급성 특발성 자반 혈소판감소증, 만성 특발성 자반 혈소판감소증, 피부근염, 사이든햄 무도병, 중증 근무력증, 전신성 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 류마티스열, 다발샘 증후군, 수포성 천포창, 당뇨병, 헤노크-숀레인 자반증, 후-스트렙토코커스 신염, 결절 홍반, 타카야수 동맥염, 에디슨명, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 사르코이드증, 궤양성 장염, 다발성 홍반증, IgA 신병증, 결결 다발동맥염, 강직 척추염, 굳파스처 증후군, 폐쇄성 혈전혈관염, 스조렌 증후군, 일차 담즙 간경화, 하시모토 갑상샘염, 갑상샘 중독증, 공피증, 만성 활성 간염, 다발근염/피부근염, 다발연골염, 보통 천포창, 웨그너 육아종증, 막 신병증, 근위측 측삭 경화증, 척수매독, 거대세포 동맥염/다발성 근육통, 악성 빈혈, 신속 진행성 사구체신염, 건선 및 섬유화 폐포염을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 보편적인 치료는 독성이 클 수 있는 코르티코스테로이드 및 세포독성 약물이다. 또한, 이들 약물은 전체 면역계를 억압하고, 심각한 감염을 유발할 수 있으며, 골수, 간 및 신장에 대해 부작용을 갖는다. 클래스 Ⅲ 자가면역 질환을 지금까지 치료하는데 사용되었던 다른 치료제는 T 세포 및 대식구에게로 유도되었다. 자가면역 질환, 구체적으로 클래스 Ⅲ 자가면역 질환을 치료하는 더욱 효과적인 방법에 대한 필요성이 있다.
Ⅷ. 인공적인 항원 제시 세포
일부 경우에, aAPC는 구현예의 치료적 조성물 및 세포 요법 산물을 제조하는데 유용하다. 항원 제시 시스템의 제조 및 사용에 관한 일반적인 지침을 위해, 예로 미국 특허 제 US 6,225,042호, 제 US 6,355,479호, 제 US 6,362,001호 및 제 US 6,790,662호; 미국 특허출원 공개 제 US 2009/0017000호 및 제 US 2009/0004142호; 국제특허출원 제 WO 2007/103009호 참조.
aAPC는 전형적으로 추가적인 가공이 없이 MHC 분자에 대한 펩티드의 직접적 결합을 허용하는 최적의 길이의 펩티드와 함께 배양된다. 대안적으로, 세포는 관심있는 항원을 발현할 수 있다 (즉, MHC 비-의존성 항원 인식의 경우). 펩티드-MHC 분자 또는 관심있는 항원과 더불어, aAPC 시스템은 적어도 하나의 외인성 보조 분자도 포함할 수 있다. 임의의 적합한 수 및 조합의 보조 분자가 채용될 수 있다. 보조 분자는 보조자극성 분자 및 부착 분자와 같은 보조 분자로부터 선택될 수 있다. 예시적인 보조자극성 분자는 CD70 및 B7.1을 포함하고 (B7.1은 이전에 B7로 알려지고, CD80로도 알려짐), 이는 특히 T 세포의 표면에서 CD28 및/또는 CTLA-4 분자에 결합하고, 이로써 예를 들면 T 세포 증식, Th1 분화, 단기간 T 세포 생존 및 인터류킨 (IL)-2와 같은 사이토카인 분비에 영향을 준다 (Kim et al., 2004 참조). 부착 분자는 셀렉틴과 같은 탄수화물 결합 당단백질, 인테그린과 같은 막통과 결합 당단백질, 캐드헤린과 같은 칼슘 의존성 단백질, 및 예를 들면 세포 대 세포. 세포 대 기질 접촉을 촉진하는 세포간 부착 분자 (ICAM)와 같은 단일-투과 막통과 면역글로불린 (Ig) 슈퍼패밀리 단백질을 포함할 수 있다. 보조자극성 분자 및 부착 분자를 포함하여 예시적인 보조 분자의 선별, 클로닝, 제조 및 발현에 유용한 기법, 방법 및 시약은 예로 미국 특허 제 US 6,225,042호, 제 US 6,355,479호 및 제 US 6,362,001호에 예시되어 있다.
aAPC가 되도록 선택된 세포는 바람직하게 세포내 항원 가공, 세포내 펩티드 운반 (trafficking) 및/또는 세포내 MHC 클래스 Ⅰ 또는 클래스 Ⅱ 분자-펩티드 로딩에서 결핍을 갖거나, 변온성이거나 (즉, 포유동물 세포주보다 온도 문제에 덜 민감함), 결핍 및 변온성 성질을 둘 다 보유한다. 바람직하게, aAPC가 되도록 선택된 세포는 또한 외인성 MHC 클래스 Ⅰ 또는 클래스 Ⅱ 분자 및 세포 내로 도입되는 보조 분자 구성요소에 대한 적어도 하나의 내인성 대응물 (예로, 상기에 기술된 바와 같은 내인성 MHC 클래스 Ⅰ 또는 클래스 Ⅱ 분자 및/또는 내인성 보조 분자)을 발현하는 능력이 결여된다. 또한, aAPC는 바람직하게 aAPC를 생성하는 변형 이전에 세포가 소유하는 결핍 및 변온성 성질을 보유한다. 예시적인 aAPC는 곤충 세포주와 같은 항원 가공 (TAP) 결핍 세포와 관련된 운반체를 구성하거나, 이로부터 유래한다. 예시적인 변온성 곤충 세포주는 쉬나이더 2 세포주와 같은 초파리 (Drosophila) 세포주이다 (예로, Schneider, 1972 참조). 쉬나이더 2 세포의 예시적인 제조, 성장 및 배양 방법은 미국 특허 제 US 6,225,042호, 제 US 6,355,479호 및 제 US 6,362,001에 제공된다.
일 구현예에서, aAPC는 또한 냉동-해동 주기가 시행된다. 예시적인 냉동-해동 주기에서, aAPC는 aAPC를 포함하는 적합한 저장소를 냉동이 신속하게 일어나도록 적절한 양의 액체 질소, 고체 이산화탄소 (즉, 드라이아이스) 또는 유사한 저온 물질과 접촉시킴으로써 냉동될 수 있다. 다음으로 냉동된 aAPC는 저온 물질로부터 aAPC의 제거 및 주변의 실온 조건에 노출에 의해, 또는 미온 수조 또는 더운 핸드가 해동 시간을 단축하는데 채용되는 촉진된 해동 공정에 의해 해동된다. 추가적으로, aAPC는 냉동되어 해동 이전에 연장된 기간 동안 보관될 수 있다. 또한, 냉동된 aAPC는 해동된 다음 추가 사용 이전에 동결건조될 수 있다. 바람직하게, 냉동-해동 절차에 유해한 영향을 줄 수 있는 보존제, 예컨대 디메틸 설포옥사이드 (DMSO), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 기타 보존제는 냉동-해동 주기를 거치는 aAPC를 포함하는 배지로부터 부재하거나, 예컨대 이러한 보존제가 필수적으로 결여된 aAPC의 전달에 의해 필수적으로 제거된다.
다른 바람직한 구현예에서, 이종이계 핵산 및 aAPC에 대해 내인성인 핵산은 교차결합에 의해 불활성화될 수 있어, 불활성화 이후에 세포 성장, 핵산의 복제 또는 발현은 필수적으로 일어나지 않는다. 일 구현예에서, aAPC는 외인성 MHC 분자 및 보조 분자의 발현, 이러한 분자의 aAPC 표면 상의 제시, 및 선택된 펩티드 또는 펩티드들을 갖는 제시된 MHC 분자의 로딩 이후의 지점에서 불활성화된다. 따라서, 이러한 불활성화되고 선택된 펩티드 로딩된 aAPC는 필수적으로 증식하거나 복제할 수 없게 되면서, 선택된 펩티드 제시 기능을 유지한다. 바람직하게, 교차결합은 또한 aAPC의 항원 제시 세포 기능을 실질적으로 감소시키지 않고도, 세균 및 바이러스와 같은 미생물을 필수적으로 오염시키지 않는 aAPC를 수득한다. 따라서, 교차결합은 aAPC의 중요한 APC 기능을 유지하면서, aAPC를 사용하여 생성된 세포 요법 산물의 안전성에 대한 문제를 경감하도록 돕는다. 교차결합 및 aAPC에 관한 방법을 위해, 예를 들면 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허출원 공개 제 US 20090017000호 참조.
Ⅸ. 본 발명의 키트
본원에 기술된 임의의 조성물은 키트에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 동종이계 CAR T 세포는 키트로 제공되고, 이는 세포를 증식하는데 적합한 시약, 예컨대 배지, aAPC, 성장인자, 항체 (예로, CAR T 세포를 선별하거나 특성화함) 및/또는 CAR 또는 트랜스포제이즈를 인코딩를 하는 플라스미드를 또한 포함할 수 있다.
비-제한적인 예에서, 키메라 수용체 발현 구조물, 키메라 수용체 발현 구조물을 생성하는 하나 이상의 시약, 발현 구조물의 형질감염을 위한 세포 및/또는 발현 구조물의 형질감염을 위한 동종이계 세포를 획득하는 하나 이상의 기구 (예컨대 기구는 주사기, 피펫, 핀셋 및/또는 임의의 이러한 의학적으로 승인된 장치일 수 있음)이다.
일부 구현예에서, 내인성 TCR α/β 발현을 제거하기 위한 발현 구조물, 구조물을 생성하는 하나 이상의 시약 및/또는 CAR+ T 세포가 키트로 제공된다. 일부 구현예에서, 아연 핑거 뉴클레아제(들)을 인코딩하는 발현 구조물을 포함한다.
일부 양태에서, 키트는 세포의 전기천공을 위한 시약 및 장치를 포함한다.
키트는 하나 이상의 적합하게 분량된 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 조성물을 생성하는 시약을 포함할 수 있다. 키트의 구성요소는 수성 매질에 또는 동결건조된 형태로 포장될 수 있다. 키트의 용기 수단은 적어도 하나의 바이알, 테스트 튜브, 플라스크, 병, 주사기 또는 기타 용기 수단을 포함할 수 있으며, 여기에 구성성분이 배치되고, 바람직하게는 적합하게 분량될 수 있다. 키트에 하나 이상의 구성요소가 존재할 때, 키트는 일반적으로 추가적인 구성요소가 별도로 배치될 수 있는 제 2 또는 제 3 등의 추가적인 용기도 포함할 것이다. 그러나, 다양한 구성요소의 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 본 발명의 키트는 또한 전형적으로 시판용 밀봉된 구조로 키메라 수용체 구조물 및 임의의 다른 시약 용기를 포함하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기를 예를 들면 원하는 바이알이 보유될 수 있는 주사 또는 블로우 성형된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.
Ⅹ. 실시예
다음의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시예를 입증하도록 포함된다. 다음의 실시예에 개시된 기법은 본 발명자에 의해 본 발명의 실행에서 잘 기능하도록 발견된 기법을 나타내는 것으로 당업자에 의해 이해되어야 하고, 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 고려될 수 있다. 그러나, 본 발명에 비추어 많은 변경이 개시된 상세한 구현예에 만들어질 수 있고, 여전히 같은 또는 유사한 결과를 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 획득할 수 있는 것으로 당업자라면 이해해야 한다.
실시예 1 - 재료 및 방법
마우스 마이크로어레이 분석.
CD8+ NK1.1+ 세포 및 CD8+ NK1.1neg 세포는 이전에 췌장 종양을 수여받고 젬시타빈 화학요법과 조합하여 세포 기반의 백신으로 치료적으로 처리된 마우스로부터 단리하였다 (Konduri et al., 2016). 단리된 세포는 PDAC 항원 로딩된 자가유래 DC로 활성화하고, 총 RNA는 RNeasy 미니키트 (퀴아젠사)를 제조사의 지침에 따라 사용하여 단리하였다. CD8+ NK1.1+ 및 CD8+NK1.1neg 세포의 유전자 발현 프로파일화는 애피매트릭스 마우스 트랜스크립톰 어레이 1.0 칩 (미국 CA. 산타클라라, 애피매트릭스사)를 사용하여 시퀸싱 및 텍사스 대학, MD 앤더슨 암 센터 (휴스톤, TX)의 마이크로어레이 시설에 의해 수행하였다.
인플루엔자 모델.
입양 전달을 위한 T 세포를 생성하기 위하여, C57/BL6 마우스를 브라이언 길버트 박사로부터 기증받은 H3N2 인플루엔자 A 바이러스의 인플루엔자A/홍콩/8/68 (H3N2) 스위스 마우스 폐-적응된 균주로 기술된 바와 같이 접종하였다 (Liang et al., 2017). 감염은 아리다인 2000 압축기로부터 생성된 10 L/분의 실내 공기를 넣은 에어로테크 Ⅱ 분무기를 사용하여 MEM 배지 + 0.05% 젤라틴으로 희석된 인플루엔자 바이러스의 20분 분무화된 에어로졸 노출로 수행하였다. 임의의 주어진 실험에서 감염된 마우스 모두는 단일 노출 체임버에서 동시에 감염시켰다. 감염 이후 2주째, 마우스를 희생시키고, 비장을 수확하고, CD8+ 세포를 음성적으로 선별하였다 (밀테니 바이오테크사). 단리된 CD8+ 세포를 자성으로 NK1.1+ 및 NK1.1neg 집단으로 추가로 선별하였다 (밀테니 바이오테크사). 후속적으로 500,000개의 CD8+ NK1.1+ 및 CD8+ NK1.1neg 세포를 다음으로 인플루엔자 바이러스가 접종될 미감작 마우스에 입양으로 전달하였다.
흑색종 모델.
입양 전달을 위한 T 세포를 생성하기 위하여, C57/BL6 마우스를 100 μL PBS에 현탁시킨 250,000개 B16F10 흑색종 종양 세포 (미국 타입 배양 수집기관, 마나사, VA)로 피하 접종하였다. DC는 기술된 바와 같이 흑색종 종양 항원으로 로딩하였다 (Konduri et al., 2016). 종양 접종 이후 1주째, 50 μL PBS에 현탁된 200,000개 항원 로딩된 DC를 수일 후에 주어진 추가 백신접종과 함께 발바닥에 주사하였다. 추가 접종 이후 10일째, 백신 접종된 마우스를 희생시키고, CD8+ 비장세포를 음성 선별에 의해 단리하였다 (밀테니 바이오테크사). 단리된 CD8+ 세포를 자성으로 NK1.1+ 및 NK1.1neg 집단으로 추가로 선별하였다 (밀테니 바이오테크사). 8마리 미감작 마우스의 3가지 실험군 각각은 250,000개의 B16F10 종양 세포의 피하 주사가 주어졌다. 종양 크기를 기록하고, 동물을 무작위화하여 각 실험군은 유사한 평균 종양 크기 및 표준 오차를 소유하였다. 종양 접종 이후 수일째, 처리군의 마우스는 복강내 입양 전달에 의해 각각 1.5백만 개의 CD8+ NK1.1+ 세포 또는 CD8+ NK1.1- 세포를 수여받았다. 미감작 마우스는 미처리된 대조군으로서작용하였다. 종양 크기는 외부 칼리퍼 측정에 의해 결정하고, 공식 (길이 × 너비2) × π/6에 의해 계산하였다. 마우스는 일단 대조군에서 종양 부하가 비교의학 센터 (CCM)에 의해 설정된 허용가능한 한계를 초과하면 종양 접종 이후 22일째 안락사시켰다.
마우스 PBMC의 분석.
인플루엔자 감염 이후 2주째 또는 종양 이식 이후 3주째, 입양으로 전달받은 마우스로부터 안구후방 채혈에 의해 수집하였다. 적혈구 세포를 제조사의 지침에 따라 염화알루미늄 (시스마-알드리치사)의 처리에 의해 용해하였다. 백혈구 펠렛을 PBS로 한 번 세척하고, 10% 마우스 혈청이 있는 AIM-V 배지에 재현탁하였다. 세포를 유세포 측정법에 의한 분석을 위해 항-CD3, CD4, CD8, CD25, IFN-γ로 염색하였다. 모든 유세포 측정 분석은 LSR Ⅱ 유세포 분석기 (BD 바오사이언스사)를 사용하여 수행하고, OS-X에 대해 플로우조 버전 10.0.00003 (트리스타사, 애쉬랜드, OR)로 분석하였다.
인간 마이크로어레이 분석.
CD8+ CD161+ 및 CD8+ CD161neg 세포는 3명의 건강한 공여자 및 3명의 PDAC 환자로부터 유래한 말초혈액으로부터 자성으로 분리하였다. 세포로부터의 총 RNA는 RNeasy 미니키트 (퀴아젠사)에 의해 제조사의 지침에 따라 단리하였다. CD8+ CD161+ 및 CD8+ CD161neg 세포의 유전자 발현 프로파일화는 애피매트릭스 인간 트랜스크립톰 어레이 1.0 칩 (미국 CA. 산타클라라, 애피매트릭스사)를 사용하여 시퀸싱 및 텍사스 대학, MD 앤더슨 암 센터 (휴스톤, TX)의 마이크로어레이 시설에 의해 수행하였다. 시료 요건 및 데이타 사전-분석의 자세한 설명은 시설 웹사이트에서 입수가능하다 (월드와이드 웹 mdanderson.org/research/research-resources/core-facilities/sequencing-and-microarray-facility-smf/services-and-fees/microarray-services-overview.html). 데이타는 분석되고, 트랜스크립톰 분석 콘솔 v3.0 (애피매트릭스사)로 영상화되었다.
TCR Vβ 유형분석.
정상 공여자의 말초혈액으로부터 단리된 CD8+ CD161+ 세포는 메이요 병원에 의해 유형분석되었다. 결과로 얻은 영상은 단일 염기쌍 분리 및 상이한 형광 세기를 갖는 형광 피크의 군집이고, 대략적으로 공여자의 고유한 DNA에 나타나는 해당 크기의 단편 수에 상응한다. 피크 양상을 구성 (피크의 수, 피크를 가로지른 상대 세기 및 크기 분포에 대해 검토하였다.
세포독성 검정.
CD8+ CD161neg 세포 및 벌크 PBMC의 세포독성 능력에 대비한 CD8+ CD161+ 세포의 세포독성 능력을 평가하기 위하여, 크롬 기반의 단기 세포독성 검정법을 시험관내에서 수행하였다. CD8+ CD161+, CD8+ CD161neg 및 조작되지 않은 벌크 PBMC을 인간 말초혈액 산물로부터 신선하게 단리하였다. 단리된 세포는 51Cr 표지된 동종이계 293-HEK 표적을 5 : 1, 25 : 1 및 50 : 1의 T 세포 : 표적 세포 비율로 사용한 4시간 사멸 검정법으로 세포독성 능력에 대해 바로 테스트하였다. 세포 용해는 배지 내로 방출된 크롬에 의해 결정되고, 위저드2 감마 계수기 (퍼킨엘머사)를 사용하 판독하였다.
CD8 + CD161 + 세포 생체외 배양 조건.
정상 공여자의 성분채집 산물로부터 단리된 CD8+ CD161+ 세포, CD8+CD161neg 세포 및 벌크 PBMC는 플레이트 결합된 항-CD3/CD28로 자극하고, 10 ng/mL IL-7, 5 ng/mL IL-15 및 30 ng/mL IL-21 (펩프로테크사, 록키힐, NJ로부터 모두 구입함)를 포함하는 사이토카인 칵테일에서 증식시킨다. CD8+ CD161+ 세포는 정상 공여자의 성분채집 산물로부터 단리하고, 각각 1 μg/mL의 항-CD3/CD28/Clec2d (항-인간 CD3, eBioscience 제품번호 #16-0037-8; 항-인간 CD28, BD 바이오사이언스사 제품번호 #555725; 재조합 인간 Clec2d, 노부스 바이오케미칼사 제품번호 # NBP2-22966)로의 자극에 대항하여 배양하고, 10 ng/mL IL-7, 5 ng/mL IL-15 및 30 ng/mL IL-21 (펩프로테크사, 록키힐, NJ로부터 모두 구입함)를 포함하는 사이토카인 칵테일에 있는 RPMI-1640, 10% FBS 및 2 mmol/L 글루타맥스 (인비트로겐사)에서 증식시켰다. 세포를 보습 체임버에 37℃로 48시간 동안 배치하였다. 48시간 이후에, 세포를 항체 자극이 없이 IL-7/15/21 사이토카인 칵테일을 사용하여 증식시켰다.
통계학적 분석.
차이의 유의성은 달리 표시되지 않는 한 다수 비교에 대한 본페로니 포스트 혹 테스트를 사용한 투-웨이 분산 분석 (ANOVA) 또는 원-웨이 ANOVA에 의해 결정하였다. 카프란-마이어 생존 유의성은 로그 순위 (멘텔-콕스) 테스트에 의해 결정하였다. 모든 데이타는 평균 ± SEM으로서 표기되고, 모든 분석은 달리 표시되지 않는 한 프리즘 소프트웨어 (그래프패드 소프트웨어)를 사용하여 수행하였다. 통계학적 유의성은 p ≤ 0.05로서 정의하였다.
실시예 2 - 결과
PDAC의 화학-면역요법 이후의 T 세포 발현 프로파일화는 CD3 + CD8 + NK1.1 + 세포의 유사-선천성 및 세포독성 특징을 확인한다.
이전의 연구는 동소적 (orthotopic) PDAC의 치료를 위한 화학-면역요법 이후 9개월째 단리된 비장 매우 적은 수 (마우스 당 < 1,500개)의 CD8+ NK1.1+ 세포가 전이성 질환 모델에서 부모 PDAC 세포주에 대한 신속하고 강건한 항-종양 보호작용을 여전히 제공하는 것을 입증하였다 (Konduri et al., 2016). 이러한 NK1.1+ CD3+ CD8+ T 세포 하위집합의 핵심 기능적 특징에 대한 정보를 얻기 위하여, 본 발명자들은 마우스 코호트에게 KrasG12D/p53-/- PDAC 종양을 동소적으로 이식하고, 후속적으로 이들을 이전에 발표된 (Konduri et al., 2016) 면역 기반의 치료 프로토콜에 의해 치유하였다. 치료 및 치유 이후 2개월째, CD8+ 비장세포를 음성적으로 선별하고, NK1.1+ 및 NK1.1neg 분획으로 소분하였다. 이들 분획은 다음으로 별도로 PDAC 로딩된 성숙한 DC와 함께 밤새 공동-배양하고, PDAC 항원 특이적 세포를 식별하여 상향조절된 CD69 발현에 의해 단리하였다. 마이크로어레이는 1642개 유전자가 항원 자극 시 CD8+ NK1.1+ 및 CD8+ NK1.1neg 세포 사이에 단일변수 유의성 수준 0.1에서 차별적으로 조절되는 것을 나타내었다 (도 1). 많은 상이한 경로가 잠재적으로 영향을 받는 한편 (표 1), 가장 현저한 차이는 세포용해성 그랜자임 세린 프로테아제, 구체적으로 비정규의 그랜자임 이소형 F, D, G 및 C에서, 뿐만 아니라 유사-선천성 세포독성 수용체 중에서 발견되었다 (표 2). 이들 결과는 CD8+ NK1.1+ 세포가 유의하게 증진된 세포용해 능력을 갖는 CD8+ T 세포의 집단임을 시사하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
NK1.1은 다수의 마우스 질환 모델에서 중요한 순환하는 기억 T 세포 집단을 식별한다.
NK1.1가 모델 비의존적 방식으로 세포용해성 기억 세포의 유사한 중요한 집단을 식별하는 것을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 제 2 종양 모델에서 및 감염성 질환 모델에서 입양 전달 실험을 수행하였다. 먼저, 6주 내지 8주령 마우스의 공여자 코호트에게 치사 용량 이하의 H2N3 마우스 적응된 인플루엔자 바이러스를 접종하였다. 접종 및 체중 감소로부터 회복 이후 3주째, 비장세포를 수확하고, CD8+ 부착되지 않은 세포를 음성 선별에 의해 단리하였다. 양성 선별에 의해 NK1.1+ 및 NK1.1neg 분획으로 분리한 이후, 각 NK1.1 실험군의 5 × 105개 세포/마우스를 미감작 코호트 에게 입양으로 전달하고, 입양 전달 이후 24시간째 동일한 인플루엔자 바이러스를 치사량으로 접종하였다 (도 7a). 회복의 지표로서 체중을 기록하고, 생존은 카프란-마이어 분석에 의해 결정하였다. 공여자 CD8+ NK1.1+ 세포로 입양으로 전달된 코호트는 전체 체중을 회복하고, 감염에서 생존한 반면, CD8+ NK1.1neg 세포로 입양으로 전달된 코호트는 모두 체중이 감소하여 미감작 CD8+ 비장세포로 입양으로 전달된 대조군과 동일한 비율로 죽었다 (도 2a 및 도 2b). 감염 이후 7일째, PBMC 분석은 미감작 및 CD8+ NK1.1neg 입양으로 전달된 코호트와 비교하여 CD8+ NK1.1+ 세포를 수여받은 마우스 중에 순환하는 CD3+ CD8+ IFN-g+ 세포의 40% 증가 (p < 0.003)를 나타내었다 (도 2c).
제 2 모델 시스템에서, 공여자 마우스의 코호트에게 2 × 105개의 B16 흑색종 세포를 피하로 접종하고, 접종 이후 7일 및 14일째 B16 세포 기반의 백신을 접종하였다. 21일째, 마우스를 희생시키고, 비장세포를 다시 수확하고, CD8+ NK1.1+ 및 CD8+NK1.1neg 세포 집단으로 선별하였다. 다음으로 촉진가능한 B16 종양이 접종된 미감작 코호트는 1.5 × 106개의 CD8+ NK1.1+ 또는 CD8+ NK1.1neg 세포를 입양으로 전달하였다 (도 7b). CD8+ NK1.1+ 세포를 수여받은 마우스는 생존 이익이 동반된 종양 성장의 유의한 지연을 나타낸 반면, CD8+ NK1.1neg 세포를 수여받은 코호트는 미감작 비장세포가 입양으로 전달된 대조군 코호트와 동일하게 생존하였다 (도 2d 및 도 2e). 말초혈액 림프구의 분석은 CD8+ NK1.1neg 또는 미감작 비장세포가 입양으로 전달된 코호트와 비교하여, CD8+ NK1.1+ 세포가 입양으로 전달된 코호트에서 GP100 사량체 특이적 CD8+ 세포 중에 기억 마커 CD62L 및 CCR7의 유의하게 상승된 수준을 나타내었다 (도 2f). 종합하면, 이들 결과는 CD161 상동체 NK1.1가 단일 병원성 공격을 시행한 어린 마우스 중의 단순 질환 모델에서 주요한 CD8+ 기억 세포 집단을 정의하는 것을 시사한다.
CD3 + CD8 + NK1.1 + 세포 집단은 인간 CD3 + CD8 + CD161 + 대응물 중에 표현형으로 보존된다.
다양한 시스템에서 CD8+ NK1.1+ 세포에 의해 제공된 보호적 기억 반응에 고무되어, 본 발명자들은 다음으로 NK1.1 발현에 의해 정의된 기억 CD8+ T 세포의 하위집합이 말초 순환에서 유사한 CD3+ CD8+ CD161+ 세포 집단 중의 인간 집단에서 표현형으로 및 전사적으로 보존되는지 여부가 궁금하였다. 이러한 분석을 위해, CD8+ CD161+ 및 CD8+ CD161neg 세포를 6명의 상이한 인간 공여자로부터 차별적으로 단리하였다. CD161+ 세포가 TCR-Vb 유형분석에 의해 다중클론인 점을 확인한 이후에 (도 8), 각 집단의 전사적 프로파일화를 마이크로어레이 분석에 의해 수행하였다. 이들 세포가 분석 이전에 및 항상성 휴지 상태에서 활성화되지 않은 점에도 불구하고, 상향조절된 그랜자임 및 천연 세포독성 수용체의 프로파일을 이들 세포에서 단일변수 유의성 수준 0.1에서 반복하였다 (도 3, 표 3). 활성화된 마우스 및 활성화되지 않은 인간 세포 사이에 유전자의 종-교차 비교 분석은 2가지 집단 중에 차별적으로 조절되는 공통적인 명명법을 갖는 보존된 서명의 206개 유전자를 식별하였다 (도 9). 상향조절된 인간 유전자의 리액톰 경로 분석은 HDAC 탈아세틸화, DNA 및 히스톤 메틸화, 뉴클레오좀 조립, RNA 중합효소 I 프로모터 회피, 작은 RNA에 의한 전사 조절 및 RNA에 의한 유전자 침묵화를 포함하여 < 5 × 104의 FDR의 분화 및 조절과 관련된 서명을 확인하였다.
Figure pct00005
PDAC의 CAR T 세포 요법을 위한 모델 시스템의 개발
이의 새로운 생물학의 가능성을 기반으로 하여, 본 발명자들은 인간 CD8+ CD161+ 하위집합이 고형 종양 CAR T 세포 요법의 맥락에서 통상적인 벌크 PBMC보다 더윽 기능적이고 지속가능한 항-종양 효능을 제공할 수 있음을 가설로 내세웠다.
항-CD3/CD28/Clec2d로의 플레이트 결합된 자극과 조합한 CD8 + CD161 + 세포의 IL-7/15/21를 사용한 생체외 증식은 중앙 기억 표현형 (CD45RA - CCR7 + )을 증진시켰다.
CD8+ CD161+ 세포는 정상 공여자로부터 선별하고, 생체외 자극 조건을 최적화하였다. IL-2, IL-2/7/15, IL-2/7/15/21 자극과 비교하여, 항-CD3/CD28/Clec2d 의 플레이트 결합된 자극과 IL-7/15/21의 조합은 중앙 기억 (CD45RA- CCR7+)의 유의한 상향조절을 유도하였다 (도 5).
항-CD3/CD28/Clec2d로의 플레이트 결합된 자극과 조합한 CD8 + CD161 + 세포의 IL-7/15/21를 사용한 생체외 증식은 세포독성 그랜자임 생산을 증진시켰다.
CD8+ CD161+ 세포는 정상 공여자로부터 선별하고, 생체외 자극 조건을 최적화하였다. IL-2, IL-2/7/15, IL-2/7/15/21 자극과 비교하여, 항-CD3/CD28/Clec2d 의 플레이트 결합된 자극과 IL-7/15/21의 조합은 세포독성 분자인 그랜자임 및 퍼포린의 유의한 상향조절을 유도하였다 (도 6).
CD8 + CD161 + 세포는 시험관내에서 내재적 사멸 장점을 나타내었다.
CD8+ CD161neg 세포 및 벌크 PBMC의 세포독성 능력에 대비한 CD8+ CD161+ 세포의 세포독성 능력을 평가하기 위하여, 크롬 기반의 단기 세포독성 검정법을 시험관내에서 수행하였다. CD8+ CD161+, CD8+ CD161neg 및 조작되지 않은 벌크 PBMC을 인간 말초혈액 산물로부터 신선하게 단리하였다. 단리된 세포는 51Cr 표지된 동종이계 293-HEK 표적을 사용한 4시간 사멸 검정법으로 세포독성 능력에 대해 즉시 테스트하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, CD8+ CD161+ 세포는 25 : 1의 E : T 비율에서 100% 표적 용해를 유도한 반면, 벌크 PBMC 및 CD8+ CD161neg 세포는 50 : 1의 최대 E : T 비율에서 각각 22% 및 15%의 용해 능력을 나타내었다 (원-웨이 ANOVA에 의해 50 : 1에서 p < 0.002, 25 : 1에서 p < 0.0007 및 5 : 1에서 p < 0.00002). 이들 데이타는 CD8+ CD161+ T 세포가 CD8+ CD161neg 또는 벌크 PBMC 대응물 중에 증폭되지 않는 세포독성을 증진시키는 것을 나타내었다.
실시예 3 - 논의
표면 분자의 발현 및 분비된 사이토카인을 기반으로 하여, 림프구를 상이한 하위집합 및 계열로 분류한다. 그러나, 분류는 때로 이전에 식별된 세포 하위집합 및 계열로부터 마커를 발현하는 새로운 세포 하위집합의 식별로 변경된다. 이러한 하나의 표면 분자는 NK 세포, NKT 세포 및 다른 T 세포 계열에서 발현되는 것으로 알려진 CD161이다 (Fergusson et al., 2011). CD161은 마우스 대응물 NK1.1과 47% 상동성을 공유하고, 최대 1/4의 말초 T 세포에 의해 발현된다 (Neelapu et al., 1994). NK-T 세포는 1% 미만의 말초 T 세포를 포함하기 때문에, CD3+ CD161+ 세포는 5% 이상의 순환하는 T 세포를 포함하는 경우 T 세포의 뚜렷한 계열을 나타낸다 (Takahashi et al., 2006). CD8+ T 세포 상에서, CD161 발현은 중간 또는 높음으로서 정의되는 반면, 이러한 구별이 CD161을 발현하는 CD4+ T 세포 중에서는 만들어지지 않는다 (Takahashi et al., 2006). CD8+ CD161high 세포는 이전에 MAIT 세포 (Martin et al., 2009; Goldfinch et al., 2010), Tc 17 세포 (Northfield et al., 2008; Billerbeck et al., 2010) 또는 기억 줄기 세포 (Turtle et al., 2009)로서 정의되었다. 상이한 CD161 발현하는 세포의 전사 프로파일 분석은 CD4+ CD161+ 및 TCRgd+ CD161+ T 세포로 확장될 수 있는 CD8+ CD161+ T 세포에 풍부한 보존된 CD161++/MAIT 세포 전사 서명을 확인하였다 (Fergusson et al., 2014). 또한, CD161 T 세포 발현하는 집단은 인터류킨 (IL)-12와 IL-18에 대한 유사-선천성 TCR 비의존적 반응을 공유한다. 이러한 반응은 CD161에 의한 조절과 독립적이고, 이는 T 세포 수용체 자극의 맥락에서 보조자극성 분자로서 작용한다. 따라서 CD161의 발현은 전사적 및 기능적 표현형을 확인하고, 인간 T 림프구에 걸쳐 공유되고, T 세포 수용체 (TCR) 발현 및 세포 계열 모두에 비-의존적이다. CD8+ CD161+ 및 CD4+ CD161+ 세포의 역할은 바이러스 감염 (Northfield et al., 2008; Billerbeck et al., 2010; Rowan et al., 2008) 및 자가면역 질환 (Annibali et al., 2011; Cosmi et al., 2008; Kleinschek et al., 2009) 동안 정의되어 왔지만, 지금까지 암 생물학에서 CD8+ CD161+ 세포의 역할은 명백하게 정의되지 않았다. 본 연구에서, 본 발명자들은 CD8+ CD161+ 세포의 생물학 및 기능적 특징을 이해하도록 시도하였다.
본 발명자들은 CD161+ 세포의 마우스 대응물, CD8+ NK1.1+의 기능적 유의성을 이전에 보고하였으며, 많은 이들 세포를 바이러스 감염을 모방하는 조건 하에 관찰하였다 (Konduri et al., 2016).
마우스 CD8+ NK1.1+ 세포의 마이크로어레이 분석은 CD8+ NK1.1neg 대응물과 비교하여 항원 자극 시 이들 세포에 의해 그랜자인 생산의 유의한 상향조절을 나타내었다. 세포독성 기능에 역할을 담당하는 선천적 유전자 및 경로의 차별적인 발현이 존재한다. CD161+ 인간 동등물이 세포독성 매개인자 그랜자임 B 및 퍼포린을 구성적으로 발현하는 것도 이전에 보고되어 왔다. 대조적으로, CD161 발현이 결여된 1/4의 세포는 미감작 CD8+ T 세포이고, 심지어 기억 집단 내에서도 더 낮은 수준의 그랜자임 B 및 퍼포린을 발현한다 (Neelapu et al., 2018). CD8+ CD161+ 세포 상의 CCR4 및 CCR6의 발현을 조직 잔류를 유지하는 능력 및 상이한 장기에 대한 홈을 나타낸다. 유사한 발현 양상은 MS 환자의 순환 혈액에 있는 CD161high 세포에서 관찰하였으며, CNS 내로 이들의 진입을 강화하고, 발병기전에 기여한다 (Annibali et al., 2011). 본 발명자들은 휴지 CD8+ CD161neg 세포도 제한된 기억 잠재력을 갖는 수명이 짧은 효과기로 CD8+ T 세포 분화를 유도하는 효과기 기억 마커인 CXCR3의 더 높은 수준을 발현하는 것을 확인하였다 (Kurachi et al., 2011).
CD19+ 혈액학적 악성 종양에 대해 효과적이더라도, CAR T 세포 요법은 고형 종양을 표적하는데 효과적이지 않았다 (Neelapu et al., 2016; Abken, 2015). 한가지 기본적인 문제는 Treg에 의한 억압성 신호전달을 극복하고 효과기 및 기억 기능을 증진하는 것이었다 (Klebanoff et al., 2012). 효과기 및 기억 T 세포의 지속성을 증진하는 것은 효율적인 CAR T 세포 요법을 생성할 수 있다. 전임상 모델에서, CD8+ 및 CD4+ 하위집합 둘 다는 상승효과 항-종양 CAR T 활성을 발현하였다 (Sommermeyer et al., 2016). 유사한 결과는 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조합이 강력한 종양 거부를 유도하는 전임상 마우스 실험에서 관찰하였다 (Moeller et al., 2005; Shedlock and Shen, 2003). 비-호지킨 림프종 및 만성 림프구성 백혈병에 걸린 환자에 관한 최근의 임상 시험 데이타는 시험관내에서 별도로 증식되고, 1 : 1 비율로 주입된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 하위집합의 조성으로부터 생성된 CD19-CAR T 세포의 높은 항암 활성을 입증하였다 (Turtle et al., 2016a). 동일한 결과를 B 세포 급성 림프모구성 백혈병에 걸린 환자에 관한 임상 시험에도 획득하였다 (Turtle et al., 2016b). 단리된 CD8+ TCM 하위집합을 사용한 제 1 세대 CD19-CAR T 또는 CD8+ 및 CD4+ TCM 하위집합 둘 다를 사용한 제 2 세대 CD19-CAR T 둘 중 하나로 치료된 고-위험 중간 등급 B 계열 비-호지킴 림프종에 걸린 환자에 관한 또 다른 임상 시험은, CD8+ 및 CD4+ TCM을 사용한 CAR T 실험군 및 제 2 세대 CAR T 세포가 더 나은 지속성을 나타내더라고, 둘 다의 접근법의 실행가능성 및 안전성을 보여주었다 (Turtle et al., 2016c). 이들 연구는 CAR T 세포 요법에서 상이한 하위집합의 T 세포 및 림프구를 평가할 필요성을 강조하고 있다. NK, NKT 및 γδT 세포와 같은 내재적 사멸 잠재력을 갖는 림프구 하위집합은 CAR 잠재력에 대해 평가되어 왔다 (Ngai et al., 2018; Liu et al., 2018; Zoon et al., 2015). CD8+ CD161+ 세포는 중앙 기억 마커 CD62L+ CCR7+를 발현하는 CD161high CD8+ CD45RAneg 세포를 1% 미만 갖는 효과기 기억 표현형으로서 초기에 정의되었다 (Takahashi et al., 2006). 이전의 보고에 따르면, CD161 음성 세포는 항-CD2, CD3 또는 CD28 자극으로 CD161 발현을 변경시키지 않고, 인플루엔자 특이적 세포는 심지어 사이토카인의 존재 하에도 재자극 이후에 CD161를 발현하지 않았으며, CD161가 단순한 활성화의 마커가 아니고, 뚜렷한 계열을 정의하는 것을 시사한다.
CAR T 세포 생산에 전형적으로 사용되는 벌크 PBMC 제조는 매우 분화된 항원 경험한 하위집합도 포함하는 이종유래 세포군을 나타낸다. CAR 조작을 위한 미감작 (Tn), 줄기 세포 기억 (Tscm) 및 중앙 기억 (Tcm) 하위집합은 더욱 강력한 항-종양 반응을 유도하는 것으로 이전에 보고되었다 (Wang et al., 2011; Berger et al., 2008; Gattinoni et al., 2011; Gattinoni et al., 2005). 덜 분화된 세포는 더욱 유익할 수 있지만, 생체외 배양 방법 (사이토카인 조성물 및 배양 지속)은 T 세포 분화를 촉진할 수 있다 (Alizadeh et al., 2019). IL-7 및 IL-15의 포함은 T 세포의 생체외 증식 동안 림프구 발생, 분화 및 항상성에 유익한 것으로 관찰되었으며, IL-2 증식된 CAR T 세포와 비교하여 더 높은 생존을 유도한다 (Xu et al., 2014; Rochman et al., 2009). 일부 연구는 IL-7 및 IL-15 모두의 사용은 Tscm 표현형을 보존하고, CAR T 세포의 효능을 증진할 수 있음을 보여주었다 (Rochman et al., 2009; Cieri et al., 2013). IL-7 및 IL-15의 존재 하에 CD3/CD28-CAR T의 생체외 증식은 효과기 활성을, GD2 종양 항원에 대한 줄기/기억 잠재력을 유지하면서 증진하였다 (Gargett et al., 2015). 또한, IL-15와 함께 증식된 CAR T 세포는 줄기 세포 기억 표현형 (CD62L+ CD45RA+ CCR7+)을 보존하는 것으로 입증되었다. 또한, IL-15는 소모 마커의 발현을 감소시키고, 항원 접종 시 증식을 증가시켰다 (Alizadeh et al., 2019). 또한, IL-21는 CD2+ CD28+ CD8+ T 세포의 증식을 촉진하고 (Santegoets et al., 2013), CD19-CAR T 효능을 증진하는 것이 확인되었다 (Rosenberg, 2014). IL-15 및 IL-21의 첨가가 NKT 세포의 기억 잠재력을 증진하고 유지하는 것이 이전에 보고되었다 (Ngai et al., 2018). IL-7, IL-15 및 IL-21 조합 기반의 림프구의 생체외 증식은 기억 세포를 증진하고, 전이를 감소시키고, 마우스 흑색종에 대한 생존을 개선하는 것으로 보고되었다 (Zoon et al., 2015). 본 연구에서, 본 발명자들은 IL-7, IL-15 및 IL-21의 칵테일을 사용한 벌크 T 세포의 생체외 배양 및 증식이, IL-21이 없이 또는 심지어 IL-21 단독으로 성장시킨 벌크 PBMC 또는 CD8+ CD161neg 세포의 표현형을 유의하게 변경하지 않고 주로 CD8+ CD161+ 세포 집단을 유익하게 하는 것을 확인하였다.
요약하면, 본 발명자들은 CD8+ CD161+ 세포 및 이들의 마우스 동등물 CD8+ NK1.1+ 세포가 예외적으로 높은 세포독성 잠재력을 나타내는 것을 보고하고 있다. 마이크로어레이에 의한 유전자 발현 프로파일 분석은 NK1.1neg 및 CD161neg 대응물과 비교하여 활성화될 때 이들 세포에 의한 그랜자임, 퍼포린 및 유사-선천성 수용체의 발현 증진을 나타내었다. 시험관내에서, CD8+ CD161+ T 세포는 벌크 PBMC 또는 CD8+ CD161neg 집단보다 더 높은 효율로 사멸시켰다. T 세포 기반의 요법에 이러한 하위집합의 사용은 PDAC를 포함한 고형 종양의 효과적인 치료를 위한 흥미로운 새로운 기회를 제공한다.
본원에 기술되고 청구된 모든 방법은 본 발명에 비추어 부당한 실험이 없이도 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 구현예의 견지에서 설명되는 반면, 본 발명의 개념, 정신 및 범주를 벗어나지 않고도 본원에 기술된 방법에 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에서 변경이 적용될 수 있음이 당업자에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 제제가 동일한 또는 유사한 결과가 달성되면서 본원에서 기술된 제제로 치환될 수 있음은 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 이러한 유사한 치환물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 정신, 범주 및 개념 내에 속할 것으로 간주된다.

Claims (55)

  1. (a) CD161+ T 세포를 포함하는 세포 시료를 획득하는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계
    를 포함하고, 이로써 비-CD161+ T 세포와 비교하여 CD161+ T 세포의 수에서 확장된 T 세포의 집단을 제공하는 시험관내 또는 생체외 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    (a) CD8+ CD161+ T 세포를 포함하는 세포 시료를 획득하는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계
    를 포함하고, 이로써 비-CD8+ CD161+ T 세포와 비교하여 CD8+ CD161+ T 세포의 수에서 확장된 T 세포의 집단을 제공하는, 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    (a) CD4+ CD161+ T 세포를 포함하는 세포 시료를 획득하는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계
    를 포함하고, 이로써 비-CD4+ CD161+ T 세포와 비교하여 CD4+ CD161+ T 세포의 수에서 확장된 T 세포의 집단을 제공하는, 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 CD3 및/또는 CD28 자극제를 포함하는 배지에서 추가로 배양되는, 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 CD3 및/또는 CD28 자극제는 CD3 및/또는 CD28 결합 항체를 포함하는, 방법.
  6. 제 4항에 있어서,
    상기 세포는 CD3 결합 항체, CD28 결합 항체, Clec2d 및/또는 CD161 결합 항체를 포함하는 배지에서 추가로 배양되는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 세포는 약 0.1 내지 5.0 μg/mL, 0.3 내지 3.0 μg/mL 또는 0.5 내지 2.0 μg/mL의 CD3 결합 항체, CD28 결합 항체, Clec2d 및/또는 CD161 결합 항체를 포함하는 배지에서 추가로 배양되는, 방법.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a1) CD161+ T 세포를 포함하는 세포 시료를 획득하는 단계;
    (a2) 상기 T 세포를 CD3 및/또는 CD28 자극제의 존재 하에 및 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a1) CD161+ T 세포를 포함하는 세포 시료를 획득하는 단계;
    (a2) 상기 T 세포를 CD3 결합 항체, CD28 결합 항체, CD161 결합 항체 및/또는 Clec2d의 존재 하에, 및 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 T 세포를 IL-7, IL-15 및 IL-21의 존재 하에 배양하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 배양 단계 (b)는 필수적으로 CD3 결합 항체, CD28 결합 항체, Clec2d 및/또는 CD161 결합 항체가 없는, 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 배양 단계 (a2)는 약 12시간 내지 72시간, 24시간 내지 58시간 또는 24시간 내지 36시간 동안 시행되는, 방법.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 배양 단계 (b)는 적어도 약 12시간 동안 시행되는, 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 배양 단계 (b)는 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 동안 시행되는, 방법.
  14. 제 9항에 있어서,
    상기 배양 단계 (b)는 필수적으로 CD3 결합 항체 및 CD28 결합 항체가 없는, 방법.
  15. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    IL-7은 약 5 내지 20 ng/mL로 존재하고/거나, IL-15는 약 2.5 내지 10 ng/mL로 존재하고/거나, IL-21은 약 20 내지 40 ng/mL로 존재하고, 예컨대 10 ng/mL IL-7, 5 ng/mL IL-15 및/또는 30 ng/mL IL-21인, 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b) 이전에 상기 시료에서 CD8+ CD161+ 세포의 존재를 위해 T 세포를 정제하거나 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b) 이후에 상기 시료에서 CD8+ CD161+ 세포의 존재를 위해 T 세포를 정제하거나 농축하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  18. 제 16항 또는 제 17항에 있어서,
    상기 시료에서 T 세포를 농축하는 단계는 형광 세포 선별, 자성 비드 분리 또는 상자성 비드 분리를 포함하는, 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 단계는 최대 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 또는 42일 동안 지속하는, 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 단계는 혈청 포함 배지에서 시행되는, 방법.
  21. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양 단계는 무-혈청 배지에서 시행되는, 방법.
  22. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포를 대상체로부터 획득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 시료는 성분채집술에 의해 획득되는, 방법.
  24. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 동결보존된 시료인, 방법.
  25. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 제대혈로부터 얻는, 방법.
  26. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 상기 대상체로부터 얻은 말초혈액 시료인, 방법.
  27. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 성분채집술에 의해 획득되는, 방법.
  28. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 정맥천자에 의해 획득되는, 방법.
  29. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료는 상기 대상체로부터 획득된 비슷한 시료와 비교하여 CD8+ CD161+ 세포의 백분율이 증가된 T 세포의 하위집단을 포함하는, 방법.
  30. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료의 획득하는 것은 상기 시료를 제 3 부분으로부터 획득하는 것을 포함하는, 방법.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료의 T 세포 내로 키메라 항원 수용체 (CAR) 또는 유전자전환 T 세포 수용체 (TCR)를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 도입은 상기 T 세포를 바이러스로 감염시키거나, 형질도입하는 것이 관여하지 않는, 방법.
  33. 제 31항 또는 제 32항에 있어서,
    상기 T 세포 내로 CAR 또는 유전자전환 TCR을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계는 단계 (b) 이전에 일어나는, 방법.
  34. 제 31항 또는 제 32항에 있어서,
    상기 T 세포 내로 CAR 또는 유전자전환 TCR을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계는 단계 (b) 이후에 일어나는, 방법.
  35. 제 31항에 있어서,
    상기 T 세포는 내인성 T 세포 수용체 및/또는 내인성 HLA의 발현을 위해 불활성화되는, 방법.
  36. 제 31항에 있어서,
    상기 T 세포 내로 막 결합된 Cγ 사이토카인을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 막 결합된 Cγ 사이토카인은 막 결합된 IL-15인, 방법.
  38. 제 36항에 있어서,
    상기 막 결합된 Cγ 사이토카인은 IL-15-IL-15Rα 융합 단백질인, 방법.
  39. 제 31항에 있어서,
    상기 배양 단계는 상기 T 세포를 수지상 세포 또는 인공적인 항원 제시 세포 (aAPC)의 존재 하에 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  40. 제 39항에 있어서,
    상기 aAPC는 상기 aAPC의 표면에 발현된 CAR 결합 항체 또는 이의 단편을 포함하는, 방법.
  41. 제 39항에 있어서,
    상기 aAPC는 T 세포를 활성화하거나, 보조자극하는 추가적인 분자를 포함하는, 방법.
  42. 제 40항에 있어서,
    상기 추가적인 분자는 막 결합된 Cγ 사이토카인을 포함하는, 방법.
  43. 제 39항에 있어서,
    상기 T 세포를 aAPC의 존재 하에 배양하는 것은 상기 세포를 약 10 : 1 내지 약 1 : 10 (CAR 세포 대 aAPC)의 비율로 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  44. 제 31항에 있어서,
    유전자전환 CAR 또는 유전자전환 TCR 세포 집단의 시료를 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 제 31항에 있어서,
    상기 CAR 또는 상기 유전자전환 TCR은 암 세포 항원에 표적화되는, 방법.
  46. 제 45항에 있어서,
    상기 암 세포 항원은 CD19, CD20, ROR1, CD22 암배아 항원, 알파-태아단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피 종양 항원, 전립샘 특이 항원, 흑색종 관련 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, 폴레이트 결합 단백질, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메조텔린, GD3, HERV-K, IL-11Rα, κ 사슬, λ 사슬, CSPG4, ERBB2, EGFRvⅢ, VEGFR2, HER2-HER3 조합 또는 HER1-HER2 조합인, 방법.
  47. 제 31항에 있어서,
    상기 CAR 또는 상기 유전자전환 TCR은 병원균 항원에 표적화되는, 방법.
  48. 제 47항에 있어서,
    상기 병원균은 진균성, 바이러스성 또는 세균성 병원균인, 방법.
  49. 제 47항에 있어서,
    상기 병원균은 플라스모듐, 트리파노좀, 아스퍼질러스, 칸디다, HSV, HIV, RSV, EBV, CMV, JC 바이러스, BK 바이러스 또는 에볼라 병원균인, 방법.
  50. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료의 CD161+ T 세포의 함량을 단계 (b) 이전에, 단계 (b) 이후에, 또는 단계 (a) 이전 및 이후 모두에서, 예컨대 세포 계수법/유세포 측정법에 의해 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제 1항 내지 제 50항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 T 세포 조성물.
  52. 질환에 걸린 인간 대상체에서 T 세포 반응을 제공하는 방법으로서, 제 31항 또는 제 32항에 따른 T 세포의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  53. 제 52항에 있어서,
    상기 질환은 암이고, 상기 CAR 또는 상기 유전자전환 TCR은 암 세포 항원에 표적화되는, 방법.
  54. 제 53항에 있어서,
    상기 대상체는 사전 항암 요법을 겪었던, 방법.
  55. 제 54항에 있어서,
    상기 대상체는 암이 진정되고 있거나, 이의 증상은 없지만, 검출가능한 암 세포를 포함하는, 방법.
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