DE60028776T2

DE60028776T2 - Verfahren zum vorbehandeln von proben und zum quantifizieren von cholesterin in spezifischen lipoproteinen

Info

Publication number: DE60028776T2
Application number: DE60028776T
Authority: DE
Inventors: Mitsuhiro Ryugasaki-shi NAKAMURA; Yuriko Ryugasaki-shi TANIGUCHI; Mitsuhisa Ryugasaki-shi Manabe; Mitsuaki Ryugasaki-shi YAMAMOTO
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2020-06-15
Also published as: CN1504753A; CN1167809C; KR20020026446A; US20040265939A1; CN100392093C; US6818414B1; ES2263476T3; MXPA02000067A; CA2375894C; DK1197564T3; JP2012191953A; EP1598426B1; JP2010172346A; EP1197564B1; US20090226945A1; TW593682B; MY143667A; AR024422A1; PT1197564E; MY157290A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Diese Erfindung betrifft ein Vorbehandlungsverfahren für die akkurate und effiziente Diskriminierung und Quantifizierung von Cholesterin, das in der spezifischen Lipoproteinfraktion existiert, durch einfache Verfahren unter Verwendung einer geringen Menge einer Probe und ebenfalls ein Verfahren zur Messung von Cholesterin in der spezifischen Lipoproteinfraktion unter Verwendung des Vorbehandlungsverfahrens.
STAND DER TECHNIK
Lipide; wie beispielsweise Cholesterin sind mit Apoproteinen im Blut zur Bildung von Lipoproteinen komplexiert. Abhängig von Unterschieden in physikalischen Eigenschaften werden die Lipoproteine in Chylomicronen, sehr niedrig dichtes Lipoprotein (VLDL), niedrig dichtes Lipoprotein (LDL), hoch dichtes Lipoprotein (HDL) usw. klassifiziert. Unter diesen Lipoproteinen ist von LDL bekannt, dass es eines der auslösenden Substanzen ist, die eine Arteriosklerose induzieren, während von HDL bekannt ist, dass es eine anti-arteriosklerotische Aktivität zeigt.
Epidemiologisch ist bekannt, dass das Niveau von Cholesterin in LDL eine positive Korrelation zu der Frequenz des Ausbruchs von arteriosklerotischen Erkrankungen zeigen kann, während das Niveau von Cholesterin in HDL bekanntlich eine inverse Korrelation zu der Frequenz des Ausbruchs von arteriosklerotischen Erkrankungen zeigt. Gegenwärtig werden daher Messungen von Cholesterin in LDL oder HDL weit verbreitet für eine Verhinderung oder Diagnose ischämischer Herzerkrankungen durchgeführt.
Als Verfahren, die für die Messung von Cholesterin in LDL oder HDL bekannt sind, gibt es beispielsweise ein Verfahren, wobei LDL oder HDL von anderen Lipoproteinen durch eine Ultrazentrifugentrennung getrennt und dann einer Cholesterinmessung unterworfen wird; und ein weiteres Verfahren, worin folgend auf die Abtrennung von LDL oder HDL von anderen Lipoproteinen durch Elektrophorese, das Lipid gefärbt wird, und die Intensität einer entwickelten Phase gemessen wird. Diese Verfahren werden jedoch nicht praktisch verwendet, da sie ein oder mehr Probleme involvie ren, dass nämlich die Prozeduren kompliziert sind und nicht viele Proben verarbeitet werden können.
Ein Messverfahren von Cholesterin in HDL, das gegenwärtig auf dem Gebiet klinischer Tests verwendet wird, ist das Präzipitationsverfahren, worin ein Präzipitationsreagenz einer Probe zugefügt wird, um andere Lipoproteine als HDL zu agglutinieren, wobei das resultierende Agglutinat durch Zentrifugation entfernt und das in dem isolierten Überstand, der nur HDL enthält, enthaltene Cholesterin dann gemessen wird. Dieses Verfahren ist im Vergleich mit der Ultrazentrifugation oder der Elektrophorese einfacher, aufgrund jedoch des Einschlusses der Prozeduren, um das Ausfällungsreagens zuzufügen und die Trennung durchzuführen, muss jede Probe in einer relativ großen Menge vorliegen und dies involviert ein potentielles Problem einen analytischen Fehler auszulösen. Weiterhin können nicht die gesamten Analyseschritte dieses Verfahrens vollständig automatisiert werden.
Andererseits wurden enzymatische Verfahren für die fraktionale Quantifizierung von Cholesterin in HDL untersucht. Die bekannten Verfahren beinhalten beispielsweise das Durchführen einer enzymatischen Reaktion in Gegenwart eines Gallensäuresalzes und eines nicht-ionischen Tensids (JP 63-126498 A). Dieses Verfahren bedient sich der Tatsache, dass eine enzymatische Reaktion in Proportion zu der Konzentration von Cholesterin in LDL in einer anfänglichen Stufe der Reaktion fortschreitet und dass die darauffolgende Reaktionsgeschwindigkeit proportional zu der Konzentration von Cholesterin in HDL ist. Es existiert jedoch ein Problem im Hinblick auf die Genauigkeit, da die Reaktion mit dem Cholesterin in HDL und die Reaktion mit Cholesterin in anderen Lipoproteinen nicht vollständig unterscheidbar ist.
In den bekannten Verfahren ist auch dasjenige beinhaltet, worin Lipoproteine, wobei es sich nicht um HDL handelt im vorhinein agglutiniert werden, damit nur Cholesterin im HDL allein enzymatisch reagiert und das Enzym zu inaktivieren und gleichzeitig das Agglutinat wiederum zu lösen, gefolgt von einer Messung der Absorption (JP 6-242110 A). Dieses Verfahren benötigt jedoch mindestens drei Prozeduren, um Reagenzien zuzufügen, so dass es nur auf bestimmte automatisierte Analysatoren anwendbar ist, was zu einem Problem einer breiten Anwendbarkeit führt. Weiterhin ist dieses Verfahren im Hinblick auf den Standpunkt von Schäden an der analytischen Ausrüstung und einem Verwerfen der Reagenzien nicht zufrieden stellend, da ein Salz bei hoher Konzentration beim neuerlichen Lösen eines Agglutinats vorliegt verwendet wird.
Ein noch weiteres Verfahren ist ebenfalls bekannt (JP 9-299 A), das das in einer ersten Reaktion Einwirkenlassen einer Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase auf andere Lipoproteine als HDL in Gegenwart eines spezifischen Tensids umfasst und dann Cholesterin, das in solchen anderen Lipoproteinen enthalten ist, präferentiell umsetzen lässt und daraufhin Messung des Cholesterins in HDL, während jede Reaktion mit Cholesterin in anderen Lipoproteinen als HDL inhibiert wird. Dieses Verfahren unterscheidet sich jedoch deutlich von der gegenwärtigen Erfindung inter alia darin, dass in der ersten Reaktion das spezifische Tensid, Cholesterinoxidase und Cholesterinesterase gleichzeitig – außerhalb des Reaktionssystems – sowohl freies Cholesterin als auch verestertes Cholesterin in die Lipoproteine außer HDL gegeben werden müssen.
Weiterhin offenbart das japanische Patent Nr. 2,600,065 ein Verfahren, das sich einer kombinierten Verwendung eines Ausfällungsreagenzes bedient, das darauf ausgerichtet ist, eine Ausfällung von anderen Lipoproteinen als HDL auszulösen und eines Cholesterinmessungsreagenzes um Cholesterin (HDL-C) in nicht-ausgefälltem HDL zu messen. Dieses Verfahren hat eine praktische Nützlichkeit, wenn ein modifiziertes Enzym als Enzym verwendet wird und α-Cyclodextrinsulfat als Ausfällungsreagenz verwendet wird. Dieses Verfahren involviert jedoch ein Problem im Hinblick auf die Genauigkeit darin, dass die Trübheit, die als Ergebnis der Verwendung des Ausfällungsreagenzes auftritt, mit dem Messsystem interferiert.
Im Hinblick auf die Messung von HDL-C durch ein modifiziertes Enzym offenbart "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)", 19 (5), 305–320, was als veröffentlichter Artikel im Hinblick auf oben beschriebene patentierte Verfahren angesehen wird, dass unter Anerkennung der Unfähigkeit einer Messung von HDL-C in einem Serum eines hyperlipidämischen Patienten durch das modifizierte Enzym aufgrund eines positiven Fehlers (d.h., zu einem höheren Wert im Vergleich mit demjenigen zu führen, der durch das Ausfällungsverfahren erhalten wird), der induziert wird, wenn das modifizierte Enzym einfach in ein Reaktionssystem eingeführt wird, HDL-C unter Verwendung von Cyclodextrinsulfat, einem Polyanion und Magnesiumchlorid als Ausfällungsreagenz zur Vermeidung des positiven Fehlers gemessen wurde.
Um den Einfluss der Trübheit zu reduzieren, der durch ein Ausfällungsreagenz bei dem oben beschriebenen patentierten Verfahren ausgelöst wird, sind auch bestimmte Techniken bekannt, einschließlich derjenigen, dass man ein Tensid gleichzeitig (JP 8-116996 A) existieren lässt, einen Antikörper zu verwenden (JP 9-96637 A) und eine Zuckerverbindung zu verwenden (JP 7-301636 A). Alle diese benötigen jedoch als Voraussetzung den Einschluss eines Reagenzes, der die Bildung eines Agglutinats induziert, so dass es fundamental unerlässlich ist, dass ein Ausfällungsreagens, wie z.B. ein Polyanion verwendet wird.
Die gegenwärtigen Erfinder haben kürzlich festgestellt, dass die Verwendung einer Substanz, die nur auf das spezifische Lipoprotein wirkt es möglich macht, Cholesterin in der spezifischen Lipoproteinfraktion ohne Verwendung eines Ausfällungsreagenzes akkurat zu quantifizierten und haben Patentanmeldungen eingereicht (JP 9-244821). Dieses Verfahren hat eine extrem hohe Korrelation mit dem konventionellen Ausfällungsverfahren, jedoch im Vergleich mit den Messwerten mit dem Ausfällungsverfahren wird anerkannt, dass dieses Verfahren eine ähnliche Tendenz wie das oben beschriebene Verfahren, wie berichtet in "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)" aufweist. Um in medizinischen Instituten und ähnlichem Daten zu erhalten, die zu denjenigen konsistent sind, die durch das konventionelle Ausfällungsverfahren erhalten werden, wird ein Polyanion oder ähnliches zugefügt.
Im Hinblick auf das Problem eines Beschlagens oder ähnlichem an einer Küvette oder einer Streuung von Messwerten wird es jedoch nicht gewünscht, ein Polyanion oder ähnliches zuzufügen und ein Präzipitat in einem Messsystem zu bilden. Es wurde daher sehr gewünscht, das Präzipitat aus dem System zu eliminieren. Weiterhin ist es auch ökonomisch unvernünftig ein Polyanion oder ähnliches zu verwenden, um die resultierenden Daten konsistent zu denjenigen zu machen, die durch das Ausfällungsverfahren erhalten werden, obwohl das Polyanion oder ähnliches im Hinblick auf das Prinzip der Messung nicht benötigt wird. Es besteht also ein nicht erfüllter Wunsch nach einer Lösung.
Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das akkurat und effizient Cholesterin in der spezifischen Lipoproteinfraktion durch einfache Verfahren quantifizieren kann, im wesentlichen ohne einen Bedarf an einem Polyanion oder ähnlichem und das in geeigneter Weise auf verschiedene automatisierte Analysatoren anwendbar ist.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die gegenwärtigen Erfinder fuhren mit einer vollständigen Untersuchung im Hinblick auf einen Grund fort, der für das oben beschriebene Problem verantwortlich sein könnte, wie beschrieben in "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)", d.h., das Problem, dass der Wert von Cholesterin in der spezifischen Lipoproteinfraktion, quantifiziert unter Verwendung einer Substanz, die nur auf ein spezifisches Lipoprotein wirkt, wie z.B. HDL, höher wird als der korrespondierende Wert, bestimmt durch das Ausfällungsverfahren und kamen zu dem Schluss, dass selbst von Nicht-HDL-Lipoproteinen (LDL, VLDL und ähnliche), deren Cholesterin nicht gemessen werden sollte, eine geringe Menge an freiem Cholesterin, das auf ihrer Oberfläche existierte oder auch in der Nachbarschaft ihrer Oberfläche, freigesetzt wird, um zu einem positiven Fehler zu führen. Basierend auf dieser Feststellung wurde herausgefunden, dass ein Cholesterinwert, der durch Verwendung eines Quantifizierungsverfahrens, das sich einer Substanz bediente, erhalten wurde, die nur auf ein spezifisches Lipoprotein wirkt, mit dem durch das Ausfällungsverfahren erhaltenen korrespondierenden Wert konsistent wurde, wenn der Cholesterinwert gemessen wird, nachdem nur freies Cholesterin im vorhinein unter Bedingungen verbraucht wird, das die Lipoproteine im wesentlichen unverändert bleiben, was zu der Vervollständigung der vorliegenden Erfindung führte.
Spezifisch beschrieben stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vorbehandlung einer Probe bereit, die verschiedene Lipoproteine enthält, bevor Cholesterin gemessen wird, das in einem spezifischen der Lipoproteine in der Probe existiert, was das Einwirkenlassen eines Enzymes, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, auf die Probe, um nur das freie Cholesterin im vorhinein zu verbrauchen, unter Bedingungen, dass die Lipoproteine im wesentlichen unverändert bleiben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Quantifizierungsverfahren für Cholesterin bereit, das in einem spezifischen Lipoprotein in einer Probe vorliegt, das das Einwirkenlassen eines Enzyms, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, umfasst, auf die Probe mit den darin enthaltenem Lipoprotein, um nur das freie Cholesterin unter Bedingungen zu verbrauchen, dass die Lipoproteine im wesentlichen unverändert bleiben und dann Messung des Cholesterins, das in dem spezifischen Lipoprotein vorliegt, unter Verwendung einer Substanz, die nur auf das spezifische Lipoprotein wirkt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das eine Korrelation zwischen der vorliegenden Erfindung gemäß Beispiels 1 und dem Ausfällungsverfahren darstellt;
2 ist ein Diagramm, das eine Korrelation zwischen der gegenwärtigen Erfindung in Beispiel 2 und dem Ausfällungsverfahren darstellt und
3 ist ein Diagramm, das die Wirkungen eines Reaktionsbeschleunigers gemäß Beispiel 5 darstellt.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
In der vorliegenden Erfindung lässt man vor der Messung von Cholesterin, das in einem spezifischen Lipoprotein in einer Probe vorliegt, ein Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, als Vorbehandlung auf die Probe wirken, so dass das freie Cholesterin verbraucht wird.
Als das Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, kann jedes Enzym verwendet werden, sofern es auf freies Cholesterin als Substrat wirkt. Illustrativ sind Cholesterindehydrogenase und Cholesterinoxidase. Sie können von irgendeinem Ursprung abstammen, wie z.B. von Mikroorganismen, Tieren oder Pflanzen und können auch durch genetische Manipulation hergestellt werden. Weiterhin können sie entweder chemisch modifiziert oder nicht-modifiziert sein. Das Enzym wird allgemein mit 0,001 bis 100 U/ml verwendet, wobei 0,1 bis 100 U/ml bevorzugt werden.
Den Bedingungen, unter denen das oben beschriebene Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, auf die Probe einwirken kann, werden keine besonderen Begrenzungen auferlegt und die für das Enzym empfohlenen Bedingungen können verwendet werden. Man sollte jedoch der Tatsache Aufmerksamkeit widmen, dass während der Stufe, in der das Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, auf die Probe einwirken gelassen wird, eine Reaktion, durch die ein verestertes Cholesterin in freies Cholesterin umgewandelt wird, nicht stattfindet. Es ist nicht wichtig, ob oder nicht Cholesterinesterase existiert; was notwendig ist, ist, Bedingungen so zu halten, dass die Cholesterinesterase nicht praktisch wirken kann.
Zusammen mit dem Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, kann je nach Bedarf ein Coenzym verwendet werden. Als Coenzym sind Nicotinamidadenindinucleotid oder ähnliche verwendbar. Solche Coenzyme können entweder allein oder in Kombination verwendet werden. Die verwendete Menge variiert abhängig von dem Coenzym. Das Coenzym kann mit 0,01 bis 100 U/ml, vorzugsweise 0,1 bis 100 U/ml verwendet werden, obwohl hier keine besondere Begrenzung auferlegt wird.
Im Hinblick auf das Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt und das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist wie oben beschrieben seinem Ursprung keine besondere Begrenzung auferlegt. Seine Konzentration und ähnliches können in geeigneter Weise gewählt werden, um die gewünschte Leistung und einfache Verarbeitung zu erreichen. Wenn es dementsprechend notwendig ist, dass die Vorbehandlung in einer bestimmten Zeit vervollständigt wird, ist es beispielsweise nur nötig, das Enzym in größerer Menge zu verwenden und wenn demgegenüber gewünscht wird, Enzym zu sparen, ist es nur nötig die Vorbehandlungszeit länger werden zu lassen.
Im Fall eines diagnostischen Reagenzes für die exklusive Verwendung bei Messungen durch automatisierte Analysatoren ist es jedoch gewünscht, beide Anforderungen gleichzeitig zu erfüllen. Es ist nämlich nötig, die Vorbehandlung in kurzer Zeit unter Verwendung des Enzyms in geringer Menge zu vervollständigen. In einem solchen Fall ermöglicht es die gleichzeitige Existenz eines Reaktionsbeschleunigers, gewählt aus der unten beschriebenen Gruppe bei der Vorbehandlung, wobei ein Enzym, das als freies Cholesterin als Substrat wirkt, verwendet wird, eine gewünschte Leistung mit einer reduzierten Enzymmenge zu erreichen, ohne dass die Vorbehandlungszeit länger wird.
Verwendbare Reaktionsbeschleuniger für den obigen Zweck können beispielsweise Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin und Mevinolin, einschließlich ihrer Salze und Metallderivate (Aluminiumderivate und ähnliches) beinhalten, wo immer solche Salze und Metallderivate existieren. Unter diesen ist von Flufenaminsäure und Mefenaminsäure bekannt, dass sie nicht-steroide anti-entzündliche Arzneimittel sind und von Fusidinsäure und Monensin ist bekannt, dass sie Antibiotika sind.
Bei der Verwendung einer solchen Verbindung als Reaktionsbeschleuniger ist es notwendig, die Konzentration und ähnliches in geeigneter Weise zu wählen, wobei die physikalischen Eigenschaften, der pH und die Ionenstärke des Messsystems mit in die Betrachtung einbezogen werden, wie auch die Arten und Konzentrationen der zusammen existierenden Substanzen.
Die Konzentration des Reaktionsbeschleunigers kann experimentell gemäß den Bedingungen eines Messsystems bestimmt werden. Allgemein kann jedoch Flufenaminsäure mit ungefähr 0,01 bis 100 mM; Fusidinsäure mit ungefähr 0,01 bis 10 mM; Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin und Betamethasonacetat jeweils mit ungefähr 0,01 bis 5 mM; Monensin und Mevinolin jeweils mit ungefähr 0,01 bis 1 mM und Tiglinsäure mit ungefähr 1 bis 500 mM verwendet werden.
Die Verwendung des oben beschriebenen Reaktionsbeschleuniger hat es ermöglicht, die Menge des Enzyms, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, auf einige bis einige Zehntel zu reduzieren. Wenn das Enzym in derselben Menge verwendet wird, kann andererseits der Reaktionsbeschleuniger die Reaktionszeit verkürzen.
Bei der oben beschriebenen Vorbehandlung durch das Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt (und auch durch den Reaktionsbeschleuniger, falls nötig) ist es auch möglich, andere Enzyme zu verwenden (unter Ausschluss derjenigen, die einen substantiellen Einfluss auf Lipoproteine haben) wie auch Salze, Puffer für die pH-Regulierung, Tenside (unter Ausschluss derjenigen, die einen substantiellen Einfluss auf Lipoproteine ausüben), Konservierungsmittel, Proteine, wie z.B. Albumin und Mittel mit einer Affinität zu spezifischen Lipoproteinen, wie z.B. Antikörper, Antibiotika, Saponine, Lectine und Polyanionen in einem Ausmaß, so dass keine Agglutinierung des spezifischen Lipoproteins ausgelöst wird, so dass die Wirkung des Enzyms eingestellt wird, ohne die Spezifität der Messung zu beeinflussen.
In der vorliegenden Erfindung können daher diejenigen, die die folgenden Bestandteile enthalten, als Vorbehandlungsmittel für die Messung von Cholesterin, das in spezifischen Liporoteinen in Proben vorliegt, verwendet werden.
(ESSENTIELLE BESTANDTEILE)
Enzyme, die auf freies Cholesterin als Substrat wirken, beispielsweise Cholesterindehydrogenase und Cholesterinoxidase.
(OPTIONALE BESTANDTEILE)
Reaktionsbeschleuniger, beispielsweise Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin und Mevinolin.
(ANDERE BESTANDTEILE)
Coenzyme, wie NAD, andere Enzyme, wie Peroxidase, Catalase, Diaphorase und Ascorbatoxidase, Säuren, wie Brenztraubensäure, Salze, Puffer für die pH-Regulierung, Tenside, die keinen substantiellen Einfluss auf die Lipoproteine ausüben, Konservierungsmittel, Proteine, wie Albumin, Antikörper, Antibiotika, Saponine, Lectine, Polyanionen und Kuppler, wie z.B. 4-Aminoantipyrin, oxidative Farbentwickler, wie z.B. Wasserstoffdonatoren, z.B. Trinder's-Reagenz, Elektronenakzeptoren, wie z.B. Phenazinmethosulfat und reduktive Farbentwickler, wie z.B. Nitroblue-Tetrazolium.
In der vorliegenden Erfindung wird Cholesterin, das in einem spezifischen Lipoprotein in einer Probe existiert, gemessen, nachdem das freie Cholesterin in den Lipoproteinen durch die oben beschriebene Vorbehandlung verbraucht wurde.
Jedes Verfahren kann für die Messung des in dem spezifischen Lipoprotein in der Probe existierenden Cholesterin verwendet werden, solange das Verfahren das Cholesterin messen kann, das in dem spezifischen Lipoprotein vorliegt, indem eine Substanz verwendet wird, die nur auf das spezifische Lipoprotein wirkt.
Ein illustratives Beispiel für das Verfahren kann die Bereitstellung eines Tensids, gewählt aus Polyoxyethylenalkylenphenylethern oder Polyoxyethylenalkylentribenzylphenylethern, wie offenbart in JP 11-56395 A, als Substanz, die auf das spezifische Lipoprotein wirkt, umfassen; die Zugabe eines Cholesterin-Messenzymreagenzes in Gegenwart der Substanz und dann Messung der Cholesterinmenge, die in einer Zeit umgesetzt wurde, während derer Cholesterin in einem hoch dichten Lipoprotein aus den Lipoproteinen vorrangig mit dem Cholesterin-Mess-Enzymreagenz reagiert.
Beispiele für kommerzielle Produkte der ersteren Tenside, Polyoxyethylenalkylenphenylether können "Emulgen A-60" (Handelsname, Produkt von Kao Corporation) beinhalten, während Beispiele für kommerzielle Produkte der letzteren Tenside, Polyoxyethylenalkylentribenzylphenylether "Emulgen B66" (Handelsname, Produkt von Kao Corporation) beinhalten können.
Als alternatives Verfahren gibt es ein Verfahren, das sich der modifizierten Enzyme bedient, die auf den Seiten 305–320 von "SEIBUTSU SHIRYO BUNSEKI (ANALYSIS OF BIOLOGICAL SAMPLES)" 19 (5) offenbart sind, als Substanzen, die nur auf spezifische Lipoproteine wirken. Obwohl α-Cyclodextrinsulfat und Magnesiumchlorid bei dem Verfahren dieses Artikels verwendet werden, um Reaktionen mit Lipoproteinfraktion, wobei es sich nicht um HDL handelt, zu inhibieren, macht die Verwendung des oben beschriebenen Vorbehandlungsverfahrens dieser Erfindung die Verwendung solcher Substanzen überflüssig.
Außer der Verwendung der Substanz, die auf das spezifische Cholesterin wirkt, kann das Verfahren für die Messung von Cholesterin, das in dem spezifischen Lipoprotein vorliegt, unter Verwendung von Reagenzien durchgeführt werden, die in konventionellen Cholesterinmessverfahren verwendet werden. Beispiele für Bestandteile, die in den zu verwendenden Reagenzien enthalten sein können, können Enzyme beinhalten, wie z.B. Cholesterinesterase, Cholesterinoxidase, Cholesterindehydrogenase, Isocitratdehydrogenase, Diaphorase und Peroxidase, Farbentwickler, Coenzyme, Elektronenakzeptoren, Proteine (Albumin, usw.), Konservierungsmittel, Tenside, Salze, Säuren und Puffer für die pH-Regulierung.
Als Tenside unter den oben beschriebenen Bestandteilen sind sowohl ionische als auch nicht-ionische Tenside verwendbar. Illustrativ sind Polyoxyethylenalkylenether, Polyoxyethylenalkylphenylether, Polyoxyethylen-Polyoxypropylenkondensat, Polyoxyethylenalkylethersulfate, Alkylbenzolsulfonatsalze und Gallensäurensalze. Die Menge des Tensids, das verwendet werden kann, variiert abhängig von der Verbindung. Das Tensid kann jedoch mit 0,0001 bis 5%, vorzugsweise 0,001 bis 5% verwendet werden, obwohl hier keine besondere Begrenzung besteht.
Den Puffern ist keine besondere Begrenzung auferlegt. Konventionelle Puffer, wie Good's-Puffer, Phosphatpuffer, Trispuffer und Phthalatpuffer sind verwendbar. Der Puffer kann mit 0,005 bis 2 M, vorzugsweise 0,01 bis 1 M verwendet werden, obwohl diesem keine besondere Begrenzung auferlegt ist.
Das Verfahren zum Quantifizieren von Cholesterin in einer spezifischen Lipoproteinfraktion durch die vorliegende Erfindung umfasst typischerweise zunächst die Zugabe eines Vorbehandlungsmittels, das nur auf freies Cholesterin wirkt, in eine Messprobe und das Einwirkenlassen des Vorbehandlungsmittels auf die Probe und dann Zugabe und Vermischen eines Cholesterinmessreagenzes (hiernach als "Quantifizierungsreagenz" bezeichnet), das eine Substanz enthält, die auf das spezifische Lipoprotein wirken kann und eines Reagenzes, das für ein konventionelles Cholesterinmessverfahren verwendet wird, um die Cholesterinmenge in der spezifischen Lipoproteinfraktion zu messen.
Spezifische Beispiele können ein Verfahren beinhalten, das das Vermischen von Cholesterindehydrogenase und einem Coenzym (NAD) mit einer Probe und dann mit Zugabe eines Cholesterinmessreagenzes umfasst, das Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase umfasst; ein Verfahren, das das Vermischen von Cholesterindehydrogenase und NAD mit einer Probe und dann die Zugabe eines Cholesterinmessreagenzes umfasst, das Cholesterinesterase umfasst; ein Verfahren, das das Vermischen einer Probe mit Cholesterinoxidase zusammen mit Peroxidase, 4-Aminoantipyrin oder Catalase und dann Zugabe eines Cholesterinmessreagenzes, das Cholesterinesterase umfasst, umfasst und ein Verfahren, das das Vermischen einer Probe und Cholesterinoxidase mit einer Peroxidase, 4-Aminoantipyrin usw. und dann Zugabe eines Cholesterinmessreagenzes umfasst, das Cholesterinesterase, Choloesterindehydrogenase und NAD umfasst.
Beispiele für das Verfahren zum Messen von Cholesterin in einer spezifischen Lipoproteinfraktion können ein Verfahren beinhalten, das sich einer kombinierten Verwendung von Cholesterinesterase und Cholesterinoxidase als Enzymreagenz bedient und ein Verfahren, das sich der kombinierten Verwendung von Cholesterinesterase und Cholesterindehydrogenase bedient, obwohl bekannte Enzym-Assays alle verwendbar sind.
In der vorliegenden Erfindung können das Enzym zur Verwendung in der ersten Reaktion als Vorbehandlungsreaktion und das Enzym zur Verwendung bei der Messung von Cholesterin als Quantifizierungsverfahren durch die zweite Reaktion dasselbe oder unterschiedlich sein. Weiterhin kann das Enzym in überschüssiger Menge in der ersten Reaktion verwendet werden und kann auch in der zweiten Reaktion verwendet werden. Zusammengefasst ist es nur notwendig, das freie Cholesterin zu verbrauchen, das in einer geringen Menge auf Lipoproteinoberflächen existiert, (erste Reaktion/Vorbehandlungsreaktion) und dann das Reaktionssystem in einen Zustand zu versetzen, worin das Enzym nur auf das spezifische zu messende Lipoprotein wirkt, so dass das meiste Cholesterin (freies Cholesterin + verestertes Cholesterin), das das Lipoprotein bildet, quantifiziert werden kann.
Weiterhin ist dem Verfahren zum schließlichen Nachweis des Cholesterins nach der Zugabe eines solchen Cholesterin-Messungsenzymreagenzes keine besondere Begrenzung auferlegt. Es ist beispielsweise möglich, eine Absorptiometrie zu verwenden, worin der Nachweis durch eine Kombination von Peroxidase mit einem Chromogen oder Diaphorase durchgeführt wird, oder einem Elektronenakzeptor mit einem reduktiven farbentwickelnden Reagenz oder ein Verfahren, worin ein Coenzym oder Wasserstoffperoxid direkt nachgewiesen wird. Das Coenzym kann durch ein Coenzymzyklussystem amplifiziert werden.
Um das Verfahren der vorliegenden Erfindung einfach durchzuführen wird es bevorzugt, einen Quantifizierungskit zu verwenden, der für die Messung von Cholesterin in dem spezifischen Lipoprotein geeignet ist.
Obwohl solche Kits einfach, basierend auf der obigen Erklärung entworfen werden können, werden als nächstes Beispiele hierfür beschrieben, indem sie in diejenigen unterteilt werden, die sich einer Cholesterinoxidase bedienen und diejenigen, die sich einer Cholesterindehydrogenase bedienen, als typische Beispiele für Enzyme, die auf freies Cholesterin als Substrat wirken.
[KITS, DIE SICH DER CHOLESTERINOXIDASE BEDIENEN]

(a) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterinoxidase und eine Wasserstoffperoxid verbrauchende Substanz (unter weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger); und
(2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.
(b) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase und eine Wasserstoffperoxid-verbrauchende Substanz und weiterhin umfassend einen Reaktionsbeschleuniger; und
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf das spezifische Lipoprotein wirkt und einen Farbentwickler.
(c) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1), (2) und (3):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterinoxidase und eine Wasserstoffperoxid-verbrauchende Substanz (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger);
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf das spezifische Lipoprotein wirkt; und
(3) ein drittes Reagenz, umfassend Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.

In den oben beschriebenen Kits bedeutet die Bezeichnung "Wasserstoffperoxid-verbrauchende Substanz" eine Substanz, die Wasserstoffperoxid verbraucht und eliminiert, erzeugt durch die Reaktion zwischen Cholesterinoxidase und Cholesterin. Illustrativ sind Catalase, Kuppler, wie z.B. 4-Aminoantipyrin und oxidative-reduktive Farbentwickler, einschließlich Wasserstoffdonatoren, wie z.B. Trinder's Reagenz.
Unter diesen entwickeln ein Kuppler, wie z.B. 4-Aminoantipyrin und ein Wasserstoffdonor, wie z.B. Trinder's-Reagenz, eine Farbe, wenn sie in Kombination mit Wasserstoffperoxid umgesetzt werden und sind als Farbent wickler in dem oben beschriebenen Reagenz (2) oder (3) verwendbar. Als Reagenz (1) zur Verwendung in dem Vorbehandlungsschritt gemäß der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt nur einen eines Kupplers und eines Wasserstoffdonors zu verwenden und das Wasserstoffperoxid durch eine nicht-farbentwickelnde Reaktion verbrauchen zu lassen. Es muss nicht erwähnt werden, dass es auch möglich ist Wasserstoffperoxid einer Farbentwicklungsreaktion zu unterwerfen und dann eine Einstellung auf einen gemessenen Wert zu machen (diese Einstellung kann durchgeführt werden, indem die Intensität einer Farbe, die durch das Reagenz (1) entwickelt wird, von der Intensität einer Farbe, die von dem Reagenz (2) oder (3) entwickelt wird, abgezogen wird).
[Kits, die sich der Cholesterindehydrogenase bedienen]

(d) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger); und
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur das spezifische Lipoprotein wirkt und Cholesterinesterase.
(e) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger; und
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz die nur auf das spezifische Lipoprotein wirkt, Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, Peroxidase und einen Farbentwickler.
(f) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase, ein Coenzym und Cholesterinesterase und weiterhin umfassend einen Reaktionsbeschleuniger; und
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf spezifische Lipoprotein wirkt.
(g) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase, ein Coenzym und Cholesterinesterase (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger); und
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf spezifische Lipoprotein wirkt, Cholesterinoxidase, Cholesterinperoxidase und einen Farbentwickler.
(h) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1), (2) und (3):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger);
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf spezifische Lipoprotein wirkt und
(3) ein drittes Reagenz, umfassend Cholesterinesterase.
(i) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1), (2) und (3):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger);
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf spezifische Lipoprotein wirkt und
(3) ein drittes Reagenz, umfassend Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, Peroxidase und einen Farbentwickler.
(j) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase, ein Coenzym und eine Coenzymreaktionsprodukt-verbrauchende Substanz (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger);
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf spezifische Lipoprotein wirkt und Cholesterinesterase.
(k) Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien (1) und (2):
(1) ein erstes Reagenz, umfassend Cholesterindehydrogenase, ein Coenzym und eine Coenzymreaktionsprodukt-verbrauchende Substanz (und weiterhin umfassend in einigen Fällen einen Reaktionsbeschleuniger);
(2) ein zweites Reagenz, umfassend eine Substanz, die nur auf spezifische Lipoprotein wirkt, Cholesterinesterase und einen Farbentwickler

In den oben beschriebenen Kits unter Verwendung von Cholesterindehydrogenase bedeutet die Bezeichnung "Coenzymreaktionsprodukt-verbrauchende Substanz" eine Substanz, die ein reduziertes Coenzym (beispielsweise NADH) umwandelt, die durch die Reaktion zwischen Cholesterin, Cholesterindehydrogenase und einem Coenzym auftritt (beispielsweise NAD) und zwar zurück zum ursprünglichen Coenzym. Illustrativ ist eine Kombination der Lactatdehydrogenase und Brenztraubensäure (Substrat). In jedem der oben beschriebenen Kits wird das Reaktionsprodukt des Coenzyms durch Zugabe des Reagenzes (1) erzeugt. In jedem der Kits (d), (f), (h) und (j) von den oben beschriebenen Kits kann Licht derselben Wellenlänge wie die durch die Zugabe des Reagenz (1) entwickelte Farbe in der Messstufe ohne vorherigen Verbrauch des Reaktionsprodukts gemessen werden. In diesem Fall ist es jedoch notwendig, das Cholesterin in dem spezifischen Lipoprotein durch Subtraktion der Intensität einer Farbe zu quantifizieren, die in der Vorbehandlungsstufe entwickelt wurde, worin das Reagenz (1) zugefügt wurde, von der Intensität einer Farbe, die durch das Reagenz (2) oder (3) entwickelt wurde. Alternativ kann es auch möglich sein, vorher die Substanz hinzuzufügen, die das Reaktionsprodukt verbraucht und zwar zu dem Reagenz (1) und darauffolgend auf den Verbrauch des Reaktionsprodukts das Reagenz (2) oder (3) zuzufügen, um eine Farbe zu entwickeln. In diesem Fall wird die Zugabe einer Substanz, die die Wirkung der Substanz, die das Reaktionsprodukt verbraucht, reduziert, zum Reagenz (2) oder (3) bevorzugt. In jedem der Kits (e), (g), (i) und (k) ist es andererseits nicht absolut notwendig die Intensität der Farbe, die in der Vorbehandlungsstufe entwickelt wurde, von der Farbintensität, die in der Messstufe gemessen wurde, abzuziehen, da in der Messstufe eine entwickelte Farbe einer anderen Wellenlänge als der Farbe, die in der Vorbehandlungsstufe entwickelt wurde, gemessen wird.
Es sollte festgehalten werden, dass die Anwendung der oben erwähnten Reaktionsbeschleuniger, wie z.B. Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin und Mevinolin weder auf das Vorbehandlungsverfahren begrenzt ist oder das Mittel der vorliegenden Erfindung noch das Quantifizierungsverfahren oder den Kit der vorliegenden Erfindung für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, wobei sich das Quantifizierungsverfahren oder der Kit des Vorbehandlungsverfahrens oder -mittels bedient.
Wenn ein Reaktionsbeschleuniger, wie z.B. Flufenaminsäure, gleichzeitig mit der Durchführung eines Cholesterin-Quantifizierungsverfahrens unter Verwendung eines Enzyms, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, beispielsweise ein freies Cholesterin-Quantifizierungsverfahren, das sich der kombinierten Verwendung von Cholesterinoxidase, Peroxidase, eines Farbentwicklers und ähnlichem bedient oder ein Gesamt-Cholesterin-Quantifizierungsverfahren, das sich der kombinierten Verwendung von Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, Peroxidase, eines Farbentwicklers und ähnlichem bedient existieren darf ist es natürlich möglich, vorteilhafte Wirkungen hervorzurufen, so dass die Menge des zu verwendenden Enzyms, wobei das Enzym dazu in der Lage ist, auf freies Cholesterin als Substrat zu wirken und in dem oben beispielhaft genannten Verfahren Cholesterinoxidase ist, reduziert werden kann und die Zeit für die enzymatische Reaktion verkürzt werden kann.
Weiterhin macht es die Bezugnahme auf die Offenbarung dieser Beschreibung im Hinblick auf das Cholesterin-Quantifizierungsverfahren (beispielsweise die Selektion eines Tensids, um ein Ziel eines spezifischen zu messenden Lipoproteins zu begrenzen) möglich, ein Quantifizierungsverfahren je nach Wunsch spezifisch zu entwerfen.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Die vorliegende Erfindung hat es ermöglicht, Cholesterin in einer spezifischen Fraktion durch einfache Verfahren ohne Verwendung eines Polyanions oder ähnlichem effizient zu quantifizieren, wobei man nichts im Hinblick auf eine mechanische Vorbehandlung, wie z.B. eine Zentrifugation erwähnen muss. Da die Verfahren der vorliegenden Erfindung kein Präzipitat bilden, was andererseits durch Zugabe des Polyanions oder ähnlichem auftreten würde, verbleiben Messapparat (insbesondere Küvetten) und ähnliches frei von Beschlägen und weiterhin bleiben Messwerte ebenfalls frei von Streuungen. Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind daher den konventionellen Cholesterin-Messverfahren überlegen.
Wie weiterhin in den folgenden Beispielen demonstriert werden wird, können Messwerte, die eine hohe Korrelation zu denjenigen zeigen, die durch das konventionelle Ausfällungsverfahren erhalten werden, selbst im Hinblick auf Proben mit hohen Triglyceridniveaus erhalten werden. Daher sind die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung auch darin ausgezeichnet, dass sie ohne Begrenzung auf verschiedene Proben anwendbar sind.
Zusätzlich ermöglicht es die Verwendung des Reaktionsbeschleunigers das Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt, in einer geringeren Menge in der Vorbehandlungsstufe zu verwenden.
Wie oben beschrieben wurde, ermöglichen die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung akkurate und spezifische Messungen einer Vielzahl von Proben durch einfache Verfahren, während die Proben in geringen Mengen verwendet werden. Dementsprechend können sie auf verschiedene automatisierte Analysatoren angewandt werden und sind auch auf dem Gebiet klinischer Tests extrem nützlich.
Als nächstes wird die vorliegende Erfindung im weiteren Detail durch die Beispiele beschrieben. Man sollte jedoch im Gedächtnis behalten, dass die vorliegende Erfindung auf keine Weise auf die Beispiele begrenzt ist.
BEISPIEL 1
Im Hinblick auf jede von 30 Serumproben, die Lipoproteine enthalten, wurde das Cholesterin in HDL durch das unten beschriebene Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung und das Ausfällungsverfahren quantifiziert und die Messwerte wurden verglichen.
(ERFINDUNGSGEMÄSSES VERFAHREN)
10 mM Phosphatpuffer (erstes Reagenz; pH 8,5) (300 μl), der 0,1 U/ml Cholesterindehydrogenase (Produkt von Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) enthielt, 2,5 mM NAD und 0,03 o 4-Aminoantipyrin wurden zu jeder Probe (3 μl) (Vorbehandlung) zugefügt. Ungefähr 5 Minuten später wurde ein Cholesterin-Quantifizierungsreagenz (zweites Reagenz) (100 μl), das aus 100 mM MES-Puffer (pH 6) bestand, enthaltend 1% "Emulgen B-66", 1,3 U/ml Cholesterinesterase (Produkt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), 2 U/ml Cholesterinoxidase (Produkt von Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), 5 U/ml Peroxidase (Produkt von Toyobo Co., Ltd.) und 0,04% Disulfobutylmetatoluidin zugefügt.
Direkt vor der Zugabe des zweiten Reagenzes und nach dem 5 Minuten nach der Zugabe verstrichen waren, wurde die Absorption bei 600 nm gemessen. Aus einem Unterschied in der Absorption wurde die Konzentration von HDL-Cholesterin in der Serumprobe bestimmt. (2-Punkt-Verfahren). Als Kalibrierungssubstanz wurde eine Kontrollserumprobe mit einer bekannten Konzentration von HDL-Cholesterin verwendet. Die obigen Prozeduren wurden unter Verwendung des "Hitachi 7150 automatisierten Analysators" durchgeführt.
(AUSFÄLLUNGSVERFAHREN)
"HDLC 2 'Daiichi' Precipitant" (Produkt von Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) (200 μl) wurden mit der Probe (200 μl) vermischt, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3.000 Upm für 10 Minuten. Der Überstand (50 μl) wurde gesammelt, gefolgt von einem Mischen mit einem Cholesterin-Quantifizierungsreagenz (3 ml), bestehend aus 100 mM MES-Puffer (pH 6,5), enthaltend 1% Triton X-100, 1 U/ml Cholesterinesterase, 1 U/ml Cholesterinoxidase, 5 U/ml Peroxidase, 0,04% Disulfobutylmetatoluidin und 0,04% 4-Aminoantipyrin. Nachdem die resultierende Mischung bei 37°C 10 Minuten inkubiert worden war, wurde ihre Absorption bei 600 nm gemessen, um die Konzentration von Cholesterin in HDL zu bestimmen.
(ERGEBNISSE)
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 1 dargestellt.
Wie aus den Ergebnissen klar ablesbar ist, zeigte das erfinderische Verfahren trotz des Weglassens eines Polyanions oder ähnlichen eine extrem gute Korrelation zu dem konventionellen Ausfällungsverfahren.
BEISPIEL 2
Die Messungen wurden durch ein anderes Verfahren der vorliegenden Erfindung durchgeführt, das zu dem in Beispiel 1 durchgeführten erfinderischen Verfahren ähnlich war, außer dass in dem ersten Reagenz Cholesterindehydrogenase, NAD und der Phosphatpuffer durch 5 U/ml Cholesterinoxidase (Produkt von Toyobo Co., Ltd.), 5 U/ml Peroxidase (Produkt von Toyobo Co., Ltd.) und 100 mM MES-Puffer (pH 6) ersetzt wurden. Die Messwerte wurden mit denjenigen verglichen, die durch das Ausfällungsverfahren in Beispiel 1 erhalten wurden.
(ERGEBNISSE)
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 und 2 dargestellt.
Wie aus den Ergebnissen klar ablesbar ist, zeigte das erfinderische Verfahren trotz des Weglassens eines Polyanions oder ähnlichen eine extrem gute Korrelation zu dem konventionellen Ausfällungsverfahren.
BEISPIEL 3
Unter Verwendung der Reagenzien gemäß den Beispielen 1 und 2 wurden fünf Serumproben mit unterschiedlichen Triglyceridniveaus gemessen. Die Messwerte wurden dann mit denjenigen verglichen, die durch das Ausfällungsverfahren erhalten wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
Wie in Tabelle 3 dargestellt, wurden Messwerte mit vergleichbaren Niveaus wie denjenigen, die durch das konventionelle Verfahren erhalten wurden, ebenfalls durch die vorliegende Erfindung im Hinblick auf die Proben mit den hohen Triglyceridniveaus erhalten.
BEISPIEL 4
Die Messungen wurden auf ähnliche Weise wie in Beispiel 2 durchgeführt, außer dass in dem ersten Reagenz 5 U/ml Cholesterinoxidase verändert wurde, um Reagenzzusammensetzungen mit Bestandteilskonzentrationen und Kombinationen zu ergeben, die unten in Tabelle 4 dargestellt sind. Die Messwerte wurde mit denjenigen verglichen, die durch das Ausfällungsverfahren erhalten wurden und auch mit denjenigen, die durch das erfinderische Verfahren gemäß Beispiel 2 erhalten wurden (Standardtestsystem). Nebenbei gesagt wurde als zweites Reagenz dasselbe Reagenz wie das zweite Reagenz verwendet, das in Beispiel 1 verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
(ZUSAMMENSETZUNGEN DER TESTREAGENZIEN) Tabelle 4
(ERGEBNISSE)
Wenn die Menge der Cholesterinoxidase auf ein Fünftel reduziert wurde (Testsystem A), verglichen mit dem Standardtestsystem (Beispiel 2), nahm der Korrelationskoeffizient etwas ab und der Wert des Achsenabschnitts stieg leicht. Wenn ein Reaktionsbeschleuniger verwendet wurde, wurden jedoch im wesentlichen vergleichbare Ergebnisse mit denjenigen des Standardtestsystems erhalten, selbst wenn die Menge der Cholesterinoxidase ein Fünftel war. Es wurde so aus diesen Ergebnissen deutlich, dass es ist die Verwendung eines Reaktionsbeschleunigers ermöglicht, die Menge der zu verwendenden Cholesterinoxidase zu reduzieren.
BEISPIEL 5
Die unten in Tabelle 6 dargestellten Reagenzien J bis L wurden hergestellt, die allgemein 1,25 U/ml Peroxidase (Produkt von Toyobo Co., Ltd.), 0,01% 4-Aminoantipyrin, 0,02% Disulfobutyl-m-toluidin und 50 mM NaCl enthielten und sich voneinander in der Art und im pH des Puffers und den Konzentrationen der Cholesterinoxidase (Produkt von Toyobo Co., Ltd.) und Flufenaminsäure (Produkt von Sigma Chemical Co.) unterschieden.
Tabelle 6
Die Reagenzien J bis L (300 μl) wurden separat zu Aliquots (3 μl) jeder Serumprobe zugefügt. Nachdem die resultierenden Mischungen bei 37°C 5 Minuten inkubiert worden waren, wurden ihre Absorptionen bei 600 nm gemessen. Die obigen Prozeduren wurden unter Verwendung des Hitachi 7150 automatisierten Analysators durchgeführt.
Vier Serumproben wurden mit den Reagenzien J bis L gemessen.
Im Hinblick auf jedes der Reagenzien J bis L wurden die relativen Absorptionen für die individuellen Konzentrationen der Cholesterinoxidase und für Flufenaminsäure unter der Annahme berechnet, dass die mit einem Reagenz, enthaltend 5,0 U/ml Cholesterinoxidase und 0 mM Flufenaminsäure erhaltene Absorption 100 betrug.
(ERGEBNISSE)
Die Ergebnisse, die durch Mitteln der relativen Absorptionen der vier Proben erhalten wurden, sind in 3 dargestellt, worin "COD" für Cholesterinoxidase steht.
Wie aus den Ergebnissen klar erkannt werden wird, stieg die relative Absorption abhängig von der Konzentration der Flufenaminsäure unabhängig vom pH. Es wurde so bestätigt, dass die Verwendung des Reaktionsbeschleunigers es möglich macht, die Menge an Cholesterinoxidase, die verwendet werden muss, zu reduzieren.
Es wurde auch deutlich, dass der Reaktionsbeschleuniger ebenfalls in einem Verfahren zur Messung von freiem Cholesterin oder gesamtem Cholesterin verwendbar ist, das sich eines Enzyms bedient, das auf freies Cholesterin als Substrat wirkt.

Claims

Verfahren zur Vorbehandlung einer Probe, die verschiedene Lipoproteine enthält, vor der Messung von Cholesterin, das spezifisch in einem der Lipoproteine der Probe existiert, das umfaßt: Einwirken eines Enzyms, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, auf die Probe zum Verbrauch von lediglich freiem Cholesterin im voraus, unter Bedingungen, daß die Lipoproteine im wesentlichen unverändert bleiben.
Verfahren zur Vorbehandlung einer Probe, die verschiedene Lipoproteine enthält, vor der Messung von Cholesterin, das spezifisch in einem der Lipoproteine der Probe existiert, das umfaßt: Einwirkenlassen eines Enzyms, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, und eines Reaktionsbeschleunigers, der ausgewählt ist aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, auf die Probe zum Verbrauch von lediglich freiem Cholesterin im voraus, unter Bedingungen, daß die Lipoproteine im wesentlichen unverändert bleiben.
Vorbehandlungsverfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, worin das Enzym Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase ist.
Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin, das in einem spezifischen Lipoprotein einer Probe vorhanden ist, umfassend: Einwirkenlassen eines Enzyms, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, auf die Probe, mit dem darin enthaltenen Lipoprotein zum Verbrauch von lediglich freiem Cholesterin unter Bedingungen, daß die Lipoproteine im wesentlichen unverändert bleiben; und dann Messen des Cholesterins, das in dem spezifischen Lipoprotein vorhanden ist, unter Verwendung einer Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt.
Verfahren zur Quantifizierung von Cholesterin, das in einem spezifischen Lipoprotein einer Probe vorhanden ist, umfassend: Einwirkenlassen eines Enzyms, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, und eines Reaktionsbeschleunigers, der ausgewählt ist aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, auf die Probe, mit dem darin enthaltenen Lipoprotein zum Verbrauch von lediglich freiem Cholesterin unter Bedingungen, daß die Lipoproteine im wesentlichen unverändert bleiben; und dann Messen des Cholesterins, das in dem spezifischen Lipoprotein vorhanden ist, unter Verwendung einer Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt.
Quantifizierungsverfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, worin das Enzym Cholesterinoxidase und/oder Cholesterindehydrogenase ist.
Quantifizierungsverfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, worin das spezifische Lipoprotein ein Lipoprotein hoher Dichte ist.
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, und im wesentlichen keine Substanz, die auf Lipoprotein einwirkt, als Vorbehandlungsmittel für eine auf Cholesterin zu messende Probe.
Vorbehandlungsmittel für eine auf Cholesterin zu messende Probe, umfassend ein Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, einen Reaktionsbeschleuniger, der ausgewählt ist aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und im wesentlichen keine Substanz, die auf ein Lipoprotein einwirkt.
Verwendung einer Zusammensetzung umfassend ein Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, und im wesentlichen keine Cholesterinesterase als Vorbehandlungsmittel für eine auf Cholesterin zu messende Probe.
Vorbehandlungsmittel für eine auf Cholesterin zu messende Probe, umfassend ein Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirkt, einen Reaktionsbeschleuniger, der ausgewählt ist aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und im wesentlichen keine Cholesterinesterase.
Vorbehandlungsmittel gemäß Anspruch 9, worin das Enzym Cholesterindehydrogenase oder Cholesterinoxidase ist.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterinoxidase und eine Wasserstoffperoxid verbrauchende Substanz und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, und Cholesterinesterase.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, Peroxidase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterindehydrogenase, ein Coenzym und Cholesterinesterase und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinoxidase, Peroxidase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterinoxidase und eine Wasserstoffperoxid verbrauchende Substanz, (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, und (3) ein drittes Reagens umfassend Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym, (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, und (3) ein drittes Reagens umfassend Cholesterinesterase.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterindehydrogenase und ein Coenzym, (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, und (3) ein drittes Reagens umfassend Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, Peroxidase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterindehydrogenase, ein Coenzym und eine ein Coenzym-Reaktionsprodukt verbrauchende Substanz und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, und Cholesterinesterase.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend Cholesterindehydrogenase, ein Coenzym und eine ein Coenzym-Reaktionsprodukt verbrauchende Substanz und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterinoxidase, (b) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (c) eine Wasserstoffperoxid verbrauchende Substanz und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterindehydrogenase, (b) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (c) ein Coenzym und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, und Cholesterinesterase.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterinoxidase, (b) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, (c) Cholesterinesterase und (d) eine Wasserstoffperoxid verbrauchende Substanz und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterindehydrogenase, (b) ein Coenzym, (c) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (d) Cholesterinesterase und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterindehydrogenase, (b) ein Coenzym, (c) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (d) Cholesterinesterase und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinoxidase, Peroxidase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterinoxidase, (b) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (c) eine Wasserstoffperoxid verbrauchende Substanz, (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt und (3) ein drittes Reagens umfassend Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterindehydrogenase, (b) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (c) ein Coenzym, (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt und (3) ein drittes Reagens umfassend Cholesterinesterase.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterindehydrogenase, (b) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (c) ein Coenzym, (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt und (3) ein drittes Reagens umfassend Cholesterinoxidase, Cholesterinesterase, Peroxidase und einen Farbentwickler.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterindehydrogenase, (b) ein Coenzym, (c) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (d) eine ein Coenzym-Reaktionsprodukt verbrauchende Substanz und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt und Cholesterinesterase.
Quantifizierungskit für Cholesterin in einem spezifischen Lipoprotein, umfassend die folgenden Reagenzien: (1) ein erstes Reagens umfassend (a) Cholesterindehydrogenase, (b) ein Coenzym, (c) einen Reaktionsbeschleuniger, ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin, und (d) eine ein Coenzym-Reaktionsprodukt verbrauchende Substanz und (2) ein zweites Reagens umfassend eine Substanz, die lediglich auf das spezifische Lipoprotein einwirkt, Cholesterinesterase und einen Farbentwickler.
Verwendung einer Substanz ausgewählt aus Flufenaminsäure, Mefenaminsäure, 2,2',6',2''-Terpyridin, Tiglinsäure, Fusidinsäure, Betamethasonacetat, Monensin oder Mevinolin als Reaktionsbeschleuniger für ein Enzym, das auf freies Cholesterin als Substrat einwirken kann.
Verwendung gemäß Anspruch 32, worin das Enzym Cholesterinoxidase oder Cholesterindehydrogenase ist.
Verwendung gemäß Anspruch 8 oder 10, worin das Enzym Cholesterindehydrogenase oder Cholesterinoxidase ist.