DE69119399T2

DE69119399T2 - Reagens und verfahren für serum eisenproben

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Publication number: DE69119399T2
Application number: DE69119399T
Authority: DE
Inventors: Jerry Denney
Original assignee: Synermed Inc
Current assignee: Synermed Inc
Priority date: 1990-10-11
Filing date: 1991-10-10
Publication date: 1996-12-05
Anticipated expiration: 2011-10-11
Also published as: JPH05505243A; EP0510190B1; DE69119399D1; US5151370A; WO1992011523A2; CA2071001A1; EP0510190A1; WO1992011523A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft den Assay auf Serum- Eisen im Blutserum oder heparinisiertem Plasma.
Im Blut ist Eisen in seiner Oxidationsstufe Eisen(III) an dem Protein Transferrin gebunden. In der Regel ist das Transferrin lediglich teilweise mit Eisen gesättigt und dient zum Transport von Eisen vom Verdauungstrakt zu den blutbildenden Organen, wo Eisen aus dem Transferrin entfernt und in Hämoglobin eingebaut wird. Die ungesättigte Eisenbindungskapazität (UEBK) ist das Maß für die Transferrin- Menge, die kein Eisen führt, während Serum-Eisen das Maß für die Eisen-Menge ist, die an Transferrin gebunden ist.
Die Assays auf Serum-Eisen und UEBK sind zum Vorhersagen, Differenzieren und Diagnostizieren verschiedener Formen von Anämie verwendbar. Die Messung von Serum-Eisen in Kombination mit der Messung von UEBK ermöglicht dem Arzt die Bestimmung, welcher Teil des Stoffwechselweges des Körpers für die Hämoglobinsynthese defizitär ist, so daß mit einer derartigen Kenntnis die Behandlung der Anämie klar wird.
Anomale Werte für das Serum-Eisen und UEBK lassen sich zur Vorhersage des Auftretens von Anämie bei bestimmten Schwangerschaften verwenden, die auf mangelhafte Absorption von Folsäure aus dem Verdauungstrakt zurückzuführen sind. Die Ursache für das Auftreten dieser Serum-Eisen/UEBK- Änderungen noch vor der Entwicklung von Anämie ist eine Folge der langen Halbwertzeit der Erythrozyten im Blut. Die Hämoglobinkonzentration repräsentiert die ausreichende Bildung von Hämoglobin über mehrere Wochen vor der Hämoglobinmessung, und Serum-Eisen/UEBK-Messungen zeigen den momentanen Status der Hämoglobinbildung. Die Serum-Eisen/UEBK-Messungen ermöglichen daher die Einleitung der Therapie vor der Entwicklung der Anämie und verhindern dadurch eine Schädigung von Mutter oder Fetus.
Traditionell wurde das Eisen-Serum durch Zusetzen einer Serumprobe zu einem im sauren pH-Bereich gepufferten Reagens assayiert, durch das Eisen(III)-Ion von Transferrin dissoziiert. Das Reagens enthielt ein Reduktionsmittel, das den Dissoziationsprozeß fördert und Eisen(III)-Ion zu Eisen(II)- Ion reduziert. Sodann wurde eine chromogenes Reagens zugesetzt und das Chromogen mit Eisen(II)-Ion zur Bildung eines gefärbten Komplexes komplexiert und der Komplex spektrophotometrisch gemessen.
Aus verschiedenen Gründen waren traditionelle Serum- Eisen-Assays jedoch problematisch. Erstens, enthielt das Serum chromatische Komponenten, wie beispielsweise Hämoglobin und Bilirubin, die bei der Absorptionswellenlänge zum Messen des mit Eisen-Chromogen gefärbten Komplexes erheblich Licht absorbieren. Zweitens, werden die spektralen Messungen des Serum-Eisens durch Trübung infolge von Lipidämie gestört. Drittens, sind solche im Assay verwendete Reduktionsmittel, wie beispielsweise Thioglykolsäure und Ascorbinsäure unstabil. Viertens, kann im Serum anzutreffendes Kupfer(II) beim Komplexieren mit dem Chromogen konkurrieren. Fünftens, können einige Serumkomponenten, wie beispielsweise Bilirubin, Citronensäure, Oxalsäure, Phospholipide und Proteine, Serum-Eisen binden und hindern dadurch das Serum- Eisen am Komplexieren mit dem Chromogen.
Gewisse Verbesserungen wurden beim Serum-Eisen-Assay von Garcic, Clin. Chim. Acta, 94, 115-19 (1979) (nachfolgend bezeichnet als "Garcic") vorgenommen. Garcic offenbart die Verwendung der Amoniumsalzes des Chromogens Chromazurol B (auch bekannt als "Eriochromazurol B" und "Mordant Blue 1") (nachfolgend bezeichnet als CAB) und des Tensids Cetyltrimethylammoniumbromid (CTMA), das mit Eisen-(III)-Ion unter Bildung eines farbigen Komplexes reagiert. Der ternäre CAB-CTMA-Eisen-Komplex wird spektrophotometrisch bei 630 Nanometer (nm) gemessen, eine Wellenlänge, bei der die chromatischen Komponenten von Serum nicht mehr länger in störender Weise Licht absorbieren oder dieses nur minimal absorbieren (im Fall getrübter Proben). Außerdem behauptet Garcic, daß die Störung durch Kupfer(II) Vernachlässigbar ist, was von Torelli (US-P-4 810 656, Spalte 1, Zeilen 11-26) widersprochen wird, und es werden Reduktionsmittel vermieden. Allerdings benötigt der Assay auf Serum-Eisen eine Reaktionsdäuer von 20 Minuten, was für eine Automation zu lang ist. Obgleich einige Analyzer ein Assay ausführen können, der eine Reaktionsdauer von mehr als 10 Minuten erfordert, während die überwiegende Mehrzahl der kommerziell verfügbaren automatisierten Analyzers (wie beispielsweise die von Hitachi 704, 707 und 747-Analyzer und der Olympus AU 5000) keinen Assay ausführen können, der eine Reaktionsdauer von mehr als etwa 10 Minuten benötigt, wobei eine Reaktionsdauer von weniger als 10 Minuten besonders bevorzugt wird (siehe Takano et al., U-P-4 588 695, Spalte 3, Zeilen 29-31). Die Automation des Assays auf Serum-Eisen wird deshalb besonders angestrebt, da er in den klinischen Laboratorien einer von zwanzig am häufigsten ausgeführten medizinischen diagnostischen Tests ist.
Ein weiteres Problem bei der Methode nach Garcic besteht darin, daß die Proteininterferenz erheblich ist. Proteininterferenz muß von der Messung einer Testprobe durch Einsatz einer Serum-Blindprobe subtrahiert werden, welche Serum-Blindprobe ein Serum umfaßt, chromogenes Reagens und ein Maskierunsmittel, welches Citronensäure einschließt, die die Bildung des CAB-CTMA-Eisen-Komplexes verhindert.
Die Methode nach Garcic erfordert die Herstellung des Ammoniumsalzes von CAB. Da die saure Form von CAB in Wasser schlecht löslich ist, wird das Ammoniumsalz von CAB hergestellt, um dem CAB in wäßrigen Lösungen eine ausreichende Löslichkeit zu verleihen. Um die Notwendigkeit der Herstellung des Ammoniumsalze zu vermeiden, wurde von Tabacco et al., US-P-4 407 962, die Methode nach Garcic durch Zusatz von Ethanol zum chromogenen Reagens verbessert, um das CAB in seiner sauren Form zu solubilisieren. Damit ist die Herstellung des Ammoniumsalzes von CAB nicht mehr länger notwendig. Allerdings ist für den Assay noch immer eine zwanzigminutige Reaktionsdauer erforderlich. Außerdem wird zur Kompensation der Proteininterferenz eine Serum- Blindprobe mit Maskierungsmittel benötigt.
Die US-P-4 703 015 (Tabacco et al.) offenbart die Verwendung des Chromogens Chromazurol 5 (auch bekannt als Mordant Blue 29 sowie als Chromeazurol S) (nachfolgend bezeichnet als CAS) als einen Ersatz für CAB in dem chromogenen Reagens für ein Assay auf Serum-Eisen. Obgleich CAS einen geringfügig geringeren molaren Extinktionskoeffizienten hat (molares Absorptionsvermögen) als CAB, ist CAS im wäßrigen Medium besser löslich und kein Zusatz eines organischen Lösemittels zum chromogenen Reagens erforderlich. Allerdings beträgt die Reaktionsdauer des Assays 20 Minuten, weshalb der Assay nicht automatisierbar ist. Darüber hinaus bleibt die Proteininterferenz ein Problem, so daß eine Serum-Blindprobe benötigt wird, die ein Maskierungsreagens enthält, wobei dennoch Interferenz vom Kupfer(III)-Ion signifikant sein kann. Siehe hierzu Torelli, Spalte 1, Zeilen 11-26.
Torelli offenbart ein chromogenes Reagens für den Assay auf Serum-Eisen, bei dem Proteininterferenzen und Kupfer(II)-Interferenzen eliminiert werden. Das Reagens umfaßt CAB, ein oberflächenaktives Mittel (wie beispielsweise CTMA) in einer Konzentration von mindestens 500 mg pro Liter (mg/l), ein Salz (vorzugsweise Natriumchlorid) in einer Konzentration, mit der eine Ionenstärke von mindestens 100 Gramm pro Liter (g/l) geschaffen wird (ausgedrückt in Form der Konzentration des Natriumchlorids), sowie eine Aminosäure, wie beispielsweise Glycin, um die Interferenz von Kupfer(II)-Ion zu eliminieren. Die hohe Salzkonzentration dieses Reagens ist jedoch für die Automation nachteilig, da viele automatische Analyzer Reaktionsbehälter waschen und wiederverwenden. Bei Verwendung von Natriumchlorid erhöht jeder Salzrückstand, der nach dem Waschen des Reaktionsbehälters zurückbleibt, künstlich die nachfolgende Serumanalyse auf Natrium und Chlorid. Außerdem verringert die hohe Konzentration des oberflächenaktiven Mittels das molare Absorptionsvermögen des ternären CAB-CTMA-Eisen-Komplexes.
Die US-P-4 224 034 (Denney et al.) und U-P-4 154 929 (Outcalt et al.) offenbaren die Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) in einem Assay auf Serum-Eisen, um den Assay zu beschleunigen und die Trübung infolge der Ausscheidung von Lipiden und/oder Protein zu verringern (siehe die U-P-4 224 034, Spalte 4, Zeilen 58-61 sowie Spalte 8, Zeilen 33-43; US-P-154 929, Spalte 4, Zeilen 58-61 und Spalte 8, Zeilen 38-47). Die Patentschriften US-P- 4 224 034 und 4 154 929 lehren nicht den Zusatz von DMSO, um nicht auf Trübung zurückzuführende Proteininterferenzen zu eliminieren, da eine Messung einer Serum-Blindprobe für die Assaymethoden erforderlich ist (siehe die US-P-4 224 034, Spalte 8, Zeilen 43-61, 4 154 929, Spalte 8, Zeilen 48-66). Ferner wird bei den Assaymethoden auf Serum-Eisen der US-P-4 224 034 sowie 4 154 929 das unstabile Reduktionsmittel Ascorbinsäure eingesetzt. Außerdem beträgt der Prozentanteil des in dem Assay auf Serum-Eisen eingesetzten DMSO nach US-P-4 224 034 sowie 4 154 929 7 % (Volumen pro Volumen) in der fertigen Reaktionsmischung 10% (Volumen:Volumen) in Acetat-Puffer, der in dem Assay verwendet wird (siehe die US-P-4 224 034, Spalte 8, Zeilen 45-50, 4 154 929, Spalte 8, Zeilen 50-55).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung eines relativ schnellen Assays auf Serum-Eisen, der automatisiert werden kann. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Gewährung eines einfachen, stabilen Reagens zur Verwendung in einem Assay auf Serum-Eisen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Gewährung eines Assays auf Serum-Eisen, der keine Serum-Blindprobe für die Substraktion der Proteininterferenz benötigt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Gewährung eines Assays auf Serum-Eisen, der die Interferenz von Kupfer(II)-Ion vermeidet.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Vermeidung der Einbeziehung unstabiler Reduktionsmittel in das Reagens für den Assay auf Serum-Eisen.
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden dem Fachmann nach dem Lesen der nachfolgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform offensichtlich.
Die Erfindung gewährt eine automatisierbare Methode unter Nutzung eines neuartigen Reagens für den Assay (Bestimmung) auf Serum-Eisen.
Das Reagens für den Assay auf Serum-Eisen ist ein einfaches und stabiles Reagens, welches einschließt: das Chromogen Chromazurol B (CAB), Chromazurol S (CAS) oder ein Alkalimetall, Erdalkalimetall, Rubidium oder ammoniumbasisches Additionssalz von CAB oder CAS, ein Tensid, das einen ternären Komplex mit Eisen und dem Chromogen bildet, einen Puffer und Dimethylsulfoxid. Die Einbeziehung von Dimethylsulfoxid gewährt die mehrfachen Vorteile des Solubilisierens des Chromogens in seiner Säureform, die Eliminierung der Interferenz von Protein im Serum, wodurch die Notwendigkeit einer Serum-Blindprobe mit einem Maskierungsreagenz eliminiert wird, sowie Verkürzung der Assaydauer, wodurch der Assay auf Serum-Eisen automationsfähig ist.

I. Reagens auf Serum-Eisen

Das Reagens auf Serum-Eisen ist ein einfaches, stabiles Reagens, das den folgenden allgemeinen Anforderung genügt: Allgemeine Anforderunaen für eine Stammlösung des Reagens auf Serum-Eisen Bestandteil Menge des Bestandteils pro Liter (1) des wäßrigen Reagens Chromogen (CAB, CAS oder Alkalimetall, Erdalkalimetall, Rubidium oder deren Ammoniumsalze) von etwa 0,01 bis etwa 0,3 Millimol (mMol) ein komplexierendes Tensid (ein Alkylammoniumhalogenid oder Polyhydroxyalkylenether) etwa ein Molverhältnis von komplexierendem Tensid zu Chromogen von 1:1 wird bevorzugt ein Puffer, der mit Eisen nicht komplexiert ausreichend zum Halten eines pH von 4,5 bis etwa 5,5, wenn das Reagens einer Serumprobe zugesetzt wird Dimethylsulfoxid (DMSO) von etwa 100 ml bis etwa 300 ml
Das Chromogen muß eine ausreichende Konzentration haben, um mit dem gesamten Eisen in einer Serumprobe zu reagieren. CAB, CAS und ihre Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Rubidiumund Ammoniumsalze sind hochempfindliche Chromogene (CAB und CAS haben ein höheres molares Absorptionsvermögen). Allerdings werden CAB und seine Salze wegen ihrer etwas größeren Empfindlichkeit (größres molares Absorptionsvermögen) bevorzugt.
Es wird ein komplexierendes Tensid, entweder ein Alkylammoniumhalogenid oder ein Polyhydroxyalkylenether, dem Reagens zur Bildung des ternären Komplexes chromogen/kom plexierendes Tensid/Eisen zugesetzt, der spektrophotometrisch im Assay gemessen wird. Das komplexierende Tensid muß in einer ausreichenden Konzentration geboten werden, so daß es mit der Gesamtheit des binären Komplexes Chromogen/Eisen in der Serumprobe reagiert. Optimal ist ein Molverhältnis von komplexierendem Tensid zu Chromogen von etwa 1:1. Zunehmende Mengen von komplexierendem Tensid oberhalb eines Verhältnisses von 1:1 setzen lediglich das molare Absorptionsvermögen des ternären Komplexes herab. Eine unterhalb des Verhältnisses von 1:1 abfallende Menge an komplexierendem Tensid birgt die Gefahr, daß bezogen auf die Menge des für die Komplexbildung in einer Serumprobe verfügbaren Eisens unzureichendes Tensid zur Bildung der Gesamtheit des ternären Komplexes vorliegt, der gebildet werden kann. Das bevorzugte komplexierende Tensid ist Cetyltrimethylammoniumbromid (CTMA), auch bekannt als Hexadecyltrimethylammoniumbromid, das den ternären Komplex von CAB- CTMA-Eisen bildet. Der Komplex Chromogen-komplexierendes Tensid-Eisen wird in dem Assay bei einer Wellenlänge (λ) von etwa 630 Nanometer (nm) bis etwa 660 Nanometer gemessen, wobei eine Wellenlänge von etwa 640 Nanometer bevorzugt wird.
Die Einbeziehung von DMSO gewährt mehrere Vorteile für das Reagens und den Assay auf Serum-Eisen. DMSO verkürzt die Reaktionsdauer des Assays auf einen Bereich von etwa 3 Minuten bis etwa 10 Minuten, wodurch der Assay auf kommerziell verfügbaren automatisierten Analyzer automationsfähig wird, die Reaktionszeiten für den Assay von etwa 10 Minuten oder weniger benötigen.
DMSA solubilisiert die Säureform von CAB. Daher ist die Herstellung eines Alkalimetall, Erdalkalimetall- oder Ammoniumbase-Additionssalzes von CAB nicht erforderlich. Auf Wunsch kann jedoch ein Base-Additionssalz von CAB verwendet werden. Garcic (auf Seite 116) offenbart die Herstellung des Ammoniumsalzes von CAB. Die Herstellung anderer Base- Additionssalze von CAB wird auch durch Behandlung von CAB mit Alkalimetall- und Erdalkalimetall-Basen mit einbezogen. Beispielsweise kann CAB mit Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid zur Erzeugung eines Base-Additionssalzes behandelt werden.
Darüber hinaus eliminiert DMSO die Interferenz im Assay von Serumprotein. Daher wird keine Serum-Blindprobe mit oder ohne einem Maskierungsmittel benötigt.
Obgleich die Menge von DMSO pro Liter Reagens im Bereich von etwa 100 ml bis 300 ml liegen kann, wird eine Menge von etwa 200 ml bevorzugt. Bei etwa 200 ml pro Liter Reagens sind die Geschwindigkeit des Assays und der Proteininterferenz bei einem Minimum. Bei Zunahme der Konzentration von DMSO oberhalb von etwa 300 ml/l Reagens verbessert sich der Assay, wenn überhaupt, nur geringfügig und die Reagenskosten nehmen infolge der Kosten von DMSO zu.
Puffer, wie beispielsweise Dicarbonsäuren, Tricarbonsäuren (z.B. Citronensäure), Ethylendiamintetraessigsäure und Phosphate, die mit dem Eisen einen Komplex bilden, sollten vermieden werden. Es kann jeder beliebige Puffer verwendet werden, der einen pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 5,5 schafft und der mit Eisen keinen Komplex bildet. Dieser pH-Wertbereich wird von einem Essigsäure/Natriumacetat-Puffer erreicht, der mit dem Eisen keinen Komplex bildet und bevorzugt wird, da er billig ist.
Obgleich in dem Assay auf Serum-Eisen auf der Grundlage des vorstehend ausgeführten Reagens keine Interferenz von Kupfer(II)-Ion festgestellt wurde, kann wahlweise Thioharnstoff, das die Interferenz von Kupfer(II)-Ion verhindert, in das Reagens auf Serum-Eisen mit mindestens etwa 0,1 g Thioharnstoff/Liter Reagens auf Serum-Eisen einbezogen werden, um gegen eine Kupfer(II)-Ion-Interferenz in der Serumprobe abzusichern.
Das Serumkomponenten, wie beispielsweise Bilirubin, Citronensäure, Oxalsäure, Phosphlipide und Protein, die Fähigkeit zum Binden von Serum-Eisen haben, wird ein anorganisches Metallsalz oder ein Erdalkalimetallsalz und vorzugsweise ein Magnesiumhalogenid und am meisten bevorzugt Magnesiumchlorid, dem Reagens auf Serum-Eisen zugesetzt, um diesen Serumkomponenten ein anderes kationisches Mittel zum Komplexieren zu bieten, als Eisen. Der Zusatz eines solchen Salzes zum Reagens wird zwar bevorzugt, ist jedoch nicht erforderlich. Ein bevorzugtes Reagens auf Serum-Eisen wird mit Hilfe der folgenden Schritte hergestellt:
1) Zusetzen von etwa 765 mg CAS (verfügbar bei Chemical Dynamics und bei Fluka Chemika-BioChemika; relative Molekülmasse: 605,29) zu etwa 200 ml DMSO und Mischen zur Erzeugung einer ersten Lösung;
2) Zusetzen von eisenfreiem Wasser zur ersten Lösung, um das Gesamtvolumen auf etwa 800 ml aufzufüllen und dadurch eine zweite Lösung zu erzeugen;
3) Zusetzen von etwa 0,33 bis etwa 0,39 Mol Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid und etwa 37 g Eisessig zur zweiten Lösung und Mischen bis zum Auflösen, wodurch eine dritte Lösung erzeugt wird;
4) Zusetzen von etwa 270 mg CTMA zur dritten Lösung und Rühren bis zum Auflösen, wodurch eine vierte Lösung erzeugt wird;
5) Zusetzen von etwa 20 g Magnesiumchlorid-hexahydrat (etwa 98 mMol Magnesiumchlorid) zur vierten Lösung und Rühren bis zum Auflösen, wodurch eine fünfte Lösung erzeugt wird;
6) Zusetzen von eisenfreiem Wasser zur fünften Lösung bis ein Volumen von 1 Liter erreicht ist, wodurch die Reagens für Serum-Eisen erzeugt wird.
Das erfindungsgemäße Reagens kann auch als ein Diagnostiksatz zur Verwendung in automatisierten chemischen Analyzern, insbesondere dem automatisierten Analyzer für die Biochemie, dem Hitachi 705, bereitgestellt werden.
In det Regel besteht der Diagnostiksatz aus der ersten und zweiten Lösung. Die erste Zusammensetzung umfaßt mindestens einen ersten Teil von DMSO und eisenfreiem Wasser. Die zweite Zusammensetzung umfaßt einen zweiten Teil von DMSO, Chromogen, Puffer, komplexierendes Tensid und eisenfreies Wasser. Wenn die erste und die zweite Zusammensetzung vereinigt werden wie in der nachstehend beschriebenen Methode für den Assay auf Serum-Eisen, liegt die Konzentration von DMSO innerhalb des vorstehend angegebenen Konzentrationsbereichs für das erfindungsgemäße Reagens (von etwa 100 ml DMSO bis etwa 300 ml DMSO pro Liter Reagens).
Mehr bevorzugt umfaßt die erste Zusammensetzung Thioharnstoff zur Absicherung gegen Interferenz von Kupfer(II)- Ion sowie ein Polyoxyethylensorbitan-Tensid. Die zweite Zusammensetzung umfaßt mehr bevorzugt Thioharnstoff und ein anorganisches Salz, ausgewählt aus der vorstehend beschriebenen Gruppe. Am meisten bevorzugt ist das Polyoxyethylensorbitan-Tensid Polyoxyethylsorbitanmonooleat (TWEEN 80, verfügbar bei Sigma Chemical Company).
Ein besonders bevorzugter Diagnostiksatz für den Hitachi 705-Analyzer kann folgendermaßen hergestellt werden:

Erste Zusammensetzung (R1)

Schritt 1 - Zusetzen von eisenfreiem Wasser zu etwa 192 g DMSO bis ein Volumen von etwa 500 ml erreicht ist.
Schritt 2 - Zusetzen von etwa 0,1 g Thioharnstoff und etwa 0,5 ml Polyoxyethylensorbitanmonooleat und Mischen bis eine Lösung erzeugt wird.
Schritt 3 - Zusetzen von eisenfreiem Wasser bis ein Volumen von etwa einem Liter erreicht ist.

Zweite Zusammensetzung (R2)

Schritt 1 - Mischen von etwa 436 g DMSO mit etwa 1 mMol CAB (etwa 635 mg von näherungsweise 80%igem CAB, verfügbar bei Sigma Chemical Company) bis eine Lösung gebildet wird.
Schritt 2 - Zusetzen von eisenfreiem Wasser bis ein Gesamtvolumen von etwa 750 ml erzielt wird.
Schritt 3 - Zusetzen von etwa 1,3 bis etwa 1,5 Mol Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid, etwa 147 g Eisessig, etwa 0,1 g Thioharnstoff, etwa 2 Hexadecyltrimethylammoniumbromid, etwa 2 g Magnesiumchlorid und Mischen bis eine Lösung gebildet wird.
Schritt 4 - Zusetzen von eisenfreiem Wasser bis ein Gesamtvolumen von etwa einem Liter erzielt wird.
Ein Austausch einer äquimolaren Menge irgendeines vorstehend genannten Bestandteils gegen einen anderen Bestandteil im Rahmen der unter "Allgemeine Anforderungen an die Stammlösung für das Reagens auf Serum-Eisen" vorgegebenen Kategorie (d.h. irgendeines der Chromagene, komplexierenden Tenside und Puffer, die unter "Allgemeine Anforderungen an die Stammlösung für das Reagens auf Serum-Eisen" aufgezählt sind) liefert einen akzeptablen Diagnostiksatz, der in einem automatisiertbaren Assay verwendet werden kann.

II. Methode des Assays auf Serum-Eisen

Ein Assay auf Serum-Eisen benötigt das Reagens auf Serum-Eisen (vorstehend offenbart) und einen Eisen-Standard, der eine bekannte Menge Eisen enthält. Der Eisen-Standard für ein Eisen-Assay, bei dem die Chromagene CAS und CAB (sowie ihre vorstehend beschriebenen Salze) eingesetzt werden, sollte mindestens Transferrin, Eisen(III)-Ion aus einem Eisen(III)-Salz, wie beispielsweise Eisen(III)-Chlorid, und eisenfreies Wasser enthalten.
Ein bevorzugter Eisen-Standard kann durch Zusetzen von eisenfreiem Wasser zu einer bekannten Mengen von Eisen(III)- Ionen (beispielsweise aus einem Eisen(III)-Chlorid) und einem Additiv zubereitet werden, wie beispielsweise Salzsäure, welches die Reduktion von Eisen(III)-Ion zu Eisen(II)- Ion zu verhindern hilft, wobei so eine eisenhaltige Lösung mit bekanntem Volumen gebildet wird. Die Eisen(III)-Ionen müssen in ausreichender Menge vorliegen, um eine Konzentration an Eisen(III)-Ionen innerhalb des dynamischen Konzentrationsbereichs für Eisen in Serum zu erzielen (der Konzentrationsbereich von Eisen, den man im Serum antrifft). Eine zufriedenstellende eisenenthaltende Lösung enthält 400 Mikrogramm (µg) Eisen pro Deziliter (dl) Lösung. Eine solche Lösung kann zubereitet werden, indem in einen 10 l-Meßkolben 116,2 mg Eisen(III)-Chlorid (wasserfrei) gegeben werden. Sodann werden in den Kolben 10 ml konzentrierte Salzsäure gegeben, gefolgt von einem Zusatz von deionisiertem Wasser, bis ein Volumen von 10 l erhalten wird.
Normalerweise besteht die Assay-Methode aus den folgenden Schritten:
a. Zusetzen einer Serumprobe zu dem Reagens auf Serum-Eisen, gefolgt von einem Mischen zur Erzeugung einer Testprobe;
b. Zusetzen von eisenfreiem Wasser zu dem Reagens auf Serum-Eisen, gefolgt von einem Mischen zur Erzeugung einer Test-Blindprobe;
c. Zusetzen eines Eisen-Standards zu dem Reagens auf Serum-Eisen zur Erzeugung eines Prüfstandards;
d. Inkubieren der Testprobe, der Test-Blindprobe und des Prüfstandards bei etwa 37 ºC von etwa 3 Minuten bis etwa 10 Minuten;
e. spektrophotometrische Bestimmung der dekadischen Absorptionsvermögen (A) der Testprobe, der Test-Blindprobe und des Prüfstandards; sowie
f. Berechnen der Konzentration von Eisen in der Testprobe nach der folgenden Gleichung:
Ats - Atb / At-stand - Atb x bekannte Konzentration von Eisen in dem Prüfstandard = Konzentration von Eisen in der Testprobe ts... Testprobe; tb ... Test-Blindprobe; t-stand ... Teststandard
Die dekadischen Absorptionsvermögen ((Extinktionen)) werden vorzugsweise bei 640 Nanometer (nm) gemessen und können unter Verwendung von Filtern, die einen mittleren Wellenlängenbereich von etwa 630 nm bis etwa 660 nm durchlassen auf einem automatisierten Analyzer der Chemie bestimmt werden.
Entscheidend ist, daß der Assay lediglich etwa eine Inkubationsdauer (Reaktionsdauer) von 3 Minuten erfordert und dadurch die Methode leicht automatisierbar macht. Darüber hinaus erfordert der Assay keine Verwendung einer Serum- Blindprobe mit oder ohne einem Maskierungsreagens für die Substraktion der Proteininterferenz. Das in dem Assay eingesetzte Reagens auf Serum-Eisen eliminiert eine derartige Proteininterferenz, wodurch die Assay-Methode einfacher und genauer wird als andere Assay-Methoden auf Serum-Eisen.
Lipidämie im Serum kann immer noch zu Fehlern im Assay infolge von Trübung führen. Ein derartiger Fehler kann durch automatisierte bichromatische Korrekturen behoben werden, indem spektrophotometrisch die Absorptionsvermögen der Testprobe und der Test-Blindprobe bei einer primären Wellenlänge (1 ºλ) von etwa 630 nm bis etwa 660 nm (vorzugsweise bei etwa 640 nm) bestimmt wird, gefolgt von einer spektrophotometrischen Messung solcher Proben bei einer sekundären Wellenlänge (2 ºλ) von etwa 680 nm bis etwa 850 nm (vorzugsweise bei etwa 700 nm). Die Korrektur der Trübung in lipämischem Serum erfolgt sodann nach der folgenden Berechnung, die an die Stelle der Messungen der Absorptionsvermögen im Zähler der vorstehend genannten Gleichung zur Bestimmung der Konzentration der Probe tritt:
(A-ts 1 ºλ - A-tb 1 ºλ) - (A-ts 2 ºλ - A-tb 2 ºλ)
Mit dieser bichromatischen Messung wird der Fehler infolge Trübung korrigiert, da das Absorptionsvermögen infolge der Trübung von dem 1 ºλ bis zu dem 2 ºλ relativ konstant bleibt, während das Absorptionsvermögen des Komplexes Chromogen-komplexierendes Tensid-Eisen von der 1 ºλ zu der 2 ºλ drastisch abnimmt. Daher liefert die Subtraktion der dekadischen Absorptionsvermögen bei 2 ºλ von den dekadischen Absorptionsvermögen bei 1 ºλ das dekadische Absorptionsvermögen, das auf den Komplex Chromogen-Eisen-Tensid zurückzuführen ist.
Eine weitere Möglichkeit zum Korrigieren lipämischer Serumproben ist die Analyse einer separaten Serum-Blindprobe ohne Maskierungs-Reagens. Die Serum-Blindprobe ohne Maskierungs-Reagens sollte eine zweite Serumprobe umfassen (gleiches Volumen und Serumpool wie die Serumprobe in der Testprobe) sowie eisenfreies Wasser (gleiches Volumen wie das Reagens auf Serum-Eisen) und wird analog zur Testprobe, Test-Blindprobe und Prüfstandard inkubiert und spektrophotometrisch gemessen. Die Konzentration von Eisen in der Testprobe wird dann anhand der folgenden Gleichung berechnet:
Ats - (Atb + Aserum-Blindprobe ohne Maskierungsreagens) / At-stand - Atb x bekannte Konzentration von Eisen im Prüfstandard = Konzentration von Eisen in der Testprobe
Alternativ kann die Inkubation bei Außentemperatur ausgeführt werden. Allerdings ist der Assay schneller und genauer bei 37 ºC (siehe hierzu Tabacco et al., Clin. Chim. Acta, 114, 287, 289 (Tabelle II) (1981)). Es kann auch heparinisiertes Plasma anstelle von Serum für Testprobe und Serum-Blindprobe ohne Maskierungsreagens verwendet werden.
Speziell kann ein Assay mit dem bevorzugten Reagens auf Serum-Eisen durch Einsatz der folgenden Mengen der Bestandteile in der vorstehend beschriebenen Methode ausgeführt werden: 2 ml Reagens auf Serum-Eisen, 0,1 ml eisenfreies Wasser, 0,1 ml Eisen-Standard, 0,1 ml Serumprobe.
Ein weitverbreiteter klinischer Analyzer ist der automatisierte Analyzer für Biochemie "Hitachi 705". Eine Assay- Methode auf Serum-Eisen, bei der das erfindungsgemäße Reagens eingesetzt wird, kann unter Verwendung des Hitachi 705- Analyzers ausgeführt werden. Die Verwendung des Hitachi 705 zur Ausführung eines Assays veranschaulicht die Anwendung sowohl einer bichromatischen Korrektur als auch eine dynamische Serum-Blindprobe zum Korrigieren des Fehlers infolge von Lipidämie. (In einer dynamischen Serum-Blindprobe wird nacheinander die gleiche Serumprobe sowohl für die spektrophotometrische Blindprobenmessung als auch für die Farbmessung verwendet. In einer wahren Serum-Blindprobe wird die Serumprobe entsprechend der vorstehenden Beschreibung in zwei Portionen unterteilt und die eine Portion für die spektrophotometrische Messung der Blindprobe und die andere Portion für die Farbmessung verwendet.)
Zur Ausführung eines Assays auf dem Hitachi 705- Analyzer wird eine Serumprobe mit dem Reagens R1 (siehe hierzu den Abschnitt "Reagens auf Serum-Eisen" zur Erzeugung einer Test-Blindprobe verdünnt. Sodann werden die spektrophotometrischen Ablesungen an der Blindprobe bei 660 nm (1 ºλ) und 700 nm (2 ºλ) gemacht. Nach diesen spektrophotometrischen Messungen wird das Reagens R2 zur Erzeugung einer Testprobe zugesetzt. Die Testprobe umfaßt das erfindungsgemäße Reagens und wird für etwa 5 Minuten inkubiert. Nach der Inkubation werden die spektrophotometrischen Messungen an der Testprobe bei 660 nm (1 ºλ) und 700 nm (2 ºλ) ausgeführt. Die spezifischen Geräteeinstellungen für den Hitachi 705-Analyzer sind folgende: Chemische Parameter für den Hitachi 705 Test: Eisen Assaycode: Endpunkt Probevolumen (µl): R1-Volumen (µl): R2 Volumen (µl): R3 Volumen: Wellenlänge 1: Wellenlänge 2: Reagens-Blindprobe absolut: Reagens-Blindprobe Konzentration: Standardkonzentration: Faktor: Standard-Meßfehler: Normalbereich L: Normalbereich H: abs. Grenze (Geschwindigkeit): Kontroll-Nr.: kennzeichnet anwenderspezifische Einstellungen durch das Gerät festgelegt
Mit den vorstehend gegebenen Parametereinstellungen führt der Analyzer bichromatische spektrophotometrische Messungen an der Test-Blindprobe, Testprobe und einem Prüfstandard mit bekannter Eisenkonzentration aus. Die Eisenkonzentration in der Testprcbe wird mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet:
(Ats1ºλ - Atb1ºλ) -(Ats2ºλ - Atb2ºλ) / At-stand 1ºλ - At-stand 2 ºλ x bekannte Konzentration von Eisen im Prüfstandard (t-stand) = Konzentration von Eisen in der Testprobe (ts)

Claims

1. Automatisierbare Methode für den Assay auf Eisen in Serum oder heparinisiertem Plasma, umfassend die Schritte:

(a) Schaffen eines Reagens für den Assay auf Eisen, wobei das Reagens aufweist: ein Chromogen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chromazurol B, Chromazurol S und Alkalimetall-, Erdalkali-, Rubidium- oder Ammoniumsalzen davon; ein komplexierendes Tensid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylammoniumhalogeniden und Polyhydroxyalkylethern; einen Puffer, der Eisen nicht komplexiert und einen pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 5,5 gewährt; sowie Dimethylsulfoxid in einer ausreichenden Menge, um das Chromogen zu solubilisieren, Proteininterferenz im Serum oder heparinisiertem Plasma zu eliminieren und eine Inkubationszeit in dem Assay von etwa 3 Minuten bis etwa 10 Minuten zu erzielen;

(b) Herstellen einer Probe, indem dem Reagens eine Serumprobe oder heparinisierte Plasmaprobe zugesetzt wird;

(c) Herstellen einer Blindprobe, indem dem Reagens eisenfreies Wasser zugesetzt wird;

(d) Herstellen eines Prüfstandards, indem dem Reagens ein Eisenstandard bekannter Eisenkonzentration zugesetzt wird;

(e) Inkubieren der Probe, der Blindprobe und des Prüfstandards bei etwa 37 ºC für mindestens etwa drei Minuten;

(f) spektrophotometrisches Messen der Werte des dekadischen Absorptionsvermögens (A) der Probe, der Blindprobe und des Prüfstandards; sowie

(g) Berechnen der Eisenkonzentration in der Probe nach der Gleichung:

AProbe - ABlindprobe / APrüfstandard - ABlindprobe x [Fe]Prüfst = [Fe]Probe

darin sind [Fe]Prüfst bzw. [Fe]Probe die bekannte Eisenkonzentration im Prüfstandard bzw. Eisenkonzentration in der Probe.

2. Automatisierbare Methode nach Anspruch 1, bei welcher die Menge von Dimethylsulfoxid in dem Reagens etwa 100 ml/Liter Reagens bis etwa 300 ml/Liter Reagens beträgt.

3. Automatisierbare Methode nach Anspruch 2, bei welcher das Reagens ferner ein anorganisches Salz einschließt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetall- und Erdalkalisalzen.

4. Automatisierbare Methode nach Anspruch 1, bei welcher die Chromogenkomponente etwa 765 mg Chromazurol S/Liter Reagens aufweist; das Dimethylsulfoxid in einer Menge von etwa 200 ml Dimethylsulfoxid/Liter Reagens vorliegt; der Puffer etwa 0,33 Mol bis etwa 0,39 Mol Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid/Liter Reagens und etwa 37 g Eisessig/Liter Reagens betragen; wobei die komplexierende Tensidkomponente etwa 270 mg Cetyltrimethylammoniumbromid/Liter Reagens beträgt und wobei das Reagens ferner etwa 98 irmol Magnesiumchlorid/Liter Reagens einschließt sowie eine ausreichende Menge eisenfreies Wasser, um das Reagensvolumen auf etwa 1 Liter zu bringen.

5. Automatisierbare Methode nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, bei welcher die Werte des dekadischen Absorptionsvermögens (A) bei einer Wellenlänge von etwa 630 nm bis etwa 660 nm und vorzugsweise bei etwa 640 nm gemessen werden.

6. Automatisierbare Methode für den Assay auf Eisen in Serum oder heparinisiertem Plasma, umfassend die Schritte:

(a) Herstellen einer Probe, indem eine Serumprobe oder eine heparinisierte Plasmaprobe zu einer ersten Zusammensetzung zugesetzt wird, die aus einem ersten Teil des Dimethylsulfoxids und eisenfreiem Wasser besteht; und

(b) spektrophotometrisches Messen der Werte des dekadischen Absorptionsvermögens der Blindprobe bei einer primären Wellenlänge (1ºλ) und einer sekundären Wellenlänge (2ºλ);

(c) Herstellen einer Probe, indem die Blindprobe einer zweiten Zusammensetzung zugesetzt wird, bestehend aus:

(1) einem Chromogen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chromazurol B, Chromazurol S und Alkalimetall-, Erdalkali-, Rubidium- oder Ammoniumsalzen davon;

(2) einem zweiten Teil von Dimethylsulfoxid, wobei die ersten und zweiten Teile des Dimethylsulfoxids bei ihrer Zugabe in einer ausreichenden Menge vorliegen, um das Chromogen zu solubilisieren, Proteininterferenz im Serum oder heparinisiertem Plasma zu eliminieren und eine Inkubationszeit von etwa 3 Minuten bis etwa 10 Minuten zu erzielen;

(3) einem Puffer, der Eisen nicht komplexiert und einen pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 5,5 gewährt;

(4) einem komplexierenden Tensid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylammoniumhalogeniden und Polyhydroxyalkylethern; sowie

(5) eisenfreiem Wasser;

(d) spektrophotometrisches Messen der Werte des dekadischen Absorptionsvermögens der Probe bei einer primären Wellenlänge (1ºλ) und einer sekundären Wellenlänge (2ºλ);

(e) spektrophotometrisches Messen der Werte des dekadischen Absorptionsvermögens eines Prüfstandards bekannter Eisenkonzentration bei der primären Wellenlänge (1ºλ) und der sekundären Wellenlänge (2ºλ);

(f) Berechnen der Eisenkonzentration in der Probe nach der Gleichung:

(AProbe 1ºλ - ABlindp. 1ºλ) - (AProbe 2ºλ - ABlindp. 2ºλ) / APrüfstanard 1ºλ - APrüfstandard 2ºλ x [Fe]Prüfst = [Fe]Probe

7. Methode nach Anspruch 6, bei welcher die erste Zusammensetzung pro Liter aufweist: etwa 192 g Dimethylsulfoxid, etwa 0,1 g Thioharnstoff, etwa 0,5 ml Polyoxyethylensorbitanmonooleat und eisenfreies Wasser; und wobei die zweite Zusammensetzung pro Liter aufweist: etwa 436 g Dimethylsulfoxid, etwa 1 mMol eines Chromogens, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chromazurol B, Chromazurol S, Alkalimetall-, Erdalkali-, Rubidium oder Ammoniumsalzen davon; etwa 1,3 Mol bis etwa 1,6 Mol Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid, etwa 147 g Eisessig, etwa 0,1 g Thioharnstoff, etwa 2 g Hexadecyltrimethylammoniumbromid und etwa 2 g Magnesiumchlorid.

8. Methode nach Anspruch 6 oder 7, bei welcher die primäre Wellenlänge etwa 630 nm bis etwa 660 nm und vorzugsweise etwa 640 nm beträgt und die sekundäre Wellenlänge etwa 680 nm bis etwa 850 nm und vorzugsweise 700 nm beträgt.

9. Automatisierbare Methode für den Assay auf Eisen in lipämischem Serum oder heparinisiertem Plasma, umfassend die Schritte:

(a) spektrophotometrisches Messen der Werte des dekadischen Absorptionsvermögens einer dynamischen Blindprobe des Serums oder heparinisierten Plasmas ohne Maskierungsmittel;

(b) Schaffen eines Reagens für den Assay auf Eisen, wobei das Reagens aufweist: ein Chromogen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chromazurol B, Chromazurol S und Alkalimetall-, Erdalkali-, Rubidiuim- oder Ammoniumsalzen davon; ein komplexierendes Tensid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylammoniumhalogeniden und Polyhydroxyalkylethern; einen Puffer, der Eisen nicht komplexiert und einen pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 5,5 gewährt; sowie Dimethylsulfoxid in einer ausreichenden Menge, um das Chromogen zu solubilisieren, Proteininterferenz im Serum oder heparinisiertem Plasma zu eliminieren und eine Inkubationszeit in dem Assay von etwa 3 Minuten bis etwa 10 Minuten zu erzielen;

(d) Herstellen einer Probe, indem dem Reagens die dynamische Blindprobe zugesetzt wird;

(e) Herstellen eines Prüfstandards, indem dem Reagens ein Eisenstandard bekannter Eisenkonzentration zugesetzt wird;

(f) inkubieren der Probe, der Blindprobe und des Prüfstandards bei etwa 37 ºC für mindestens etwa drei Minuten;

(g) spektrophotometrisches Messen der Werte des dekadischen Absorptionsvermögens (A) der Probe, der Blindprobe und des Prüfstandards; sowie

(h) Berechnen der Eisenkonzentration in der Probe nach der Gleichung:

AProbe- (AProbe+Adynam.Blindp.) / APrüfstandard - ABlindprobe x [Fe]Prüfst = [Fe]Probe

10. Automatisierbare Methode nach Anspruch 9, bei welcher die Menge von Dimethylsulfoxid in dem Reagens etwa 100 ml/Liter Reagens bis etwa 300 ml/Liter Reagens beträgt.

11. Automatisierbare Methode nach Anspruch 9 oder 10, bei welcher das Reagens ferner ein anorganisches Salz einschließt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkalimetall- und Erdalkalisalzen.

12. Automatisierbare Methode nach Anspruch 9, bei welcher die Chromogenkomponente etwa 765 mg Chromazurol S/Liter Reagens aufweist; das Dimethylsulfoxid in einer Menge von etwa 200 ml Dimethylsulfoxid/Liter Reagens vorliegt; der Puffer etwa 0,33 Mol bis etwa 0,39 Mol Kaliumhydroxid oder Natriumhydroxid/Liter Reagens und etwa 37 g Eisessig/Liter Reagens betragen; wobei die komplexierende Tensidkomponente etwa 270 mg Cetyltrimethylammoniumbromid/Liter Reagens beträgt und wobei das Reagens ferner etwa 98 mMol Magnesiumchlorid/Liter Reagens einschließt sowie eine ausreichende Menge eisenfreies Wasser, um das Reagensvolumen auf etwa 1 Liter zu bringen.

13. Automatisierbare Methode nach Anspruch 9, 10, 11 oder 12, bei welcher die Werte des dekadischen Absorptionsvermögens (A) bei einer Wellenlänge von etwa 630 nm bis etwa 660 nm und vorzugsweise bei etwa 640 nm gemessen werden.

14. Reagens für den Assay auf Eisen in Serum oder heparinisiertem Plasma, umfassend:

(a) ein Chromogen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Chromazurol B, Chromazurol S und Alkalimetall-, Erdalkali-, Rubidium- oder Ammoniumsalzen davon;

(b) ein komplexierendes Tensid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylammoniumhalogeniden und Polyhydroxyalkylethern;

(c) einen Puffer, der Eisen nicht komplexiert und einen pH-Wert von etwa 4,5 bis etwa 5,5 gewährt; sowie

(d) Dimethylsulfoxid in einer ausreichenden Menge, um das Chromogen zu solubilisieren, Proteininterferenz im Serum oder heparinisiertem Plasma zu eliminieren und eine Inkubationszeit in dem Assay von etwa 3 Minuten bis etwa 10 Minuten zu erzielen.