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Fachgebiet
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Die vorliegende Erfindung bezieht
sich auf Antikörper,
die insofern nützlich
und neu sind, als sie Bindungsspezifität an β-Amyloide oder ihre Derivate
haben. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Antikörper, die
für die
Entwicklung von Assays für β-Amyloide
oder ihre Derivate auf der Basis einer Antigen-Antikörper-Reaktion,
Diagnosen von Krankheiten, die mit β-Amyloiden oder ihren Derivaten
zusammenhängen
(zum Beispiel Alzheimer-Krankheit), oder die Entwicklung von präventiven-therapeutischen
Zusammensetzungen für
die Alzheimer-Krankheit geeignet sind.
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Stand der Technik
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Senile Demenz, die durch Alzheimer-Krankheit
verursacht ist, führt
zu schweren sozialen Problemen, und man möchte eine frühe Entwicklung
von Diagnosen und therapeutischen Verfahren für die Alzheimer-Krankheit.
Als Läsion,
die charakteristisch für
die Hirne von Patienten mit Alzheimer-Krankheit ist, ist die übermäßige Bildung
von senilen Plaques und neurofibrillären Tangles bekannt. Dabei
ist ein β-Amyloid
oder Derivat davon einer der Hauptbestandteile der senilen Plaque.
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Das β-Amyloid ist ein Peptid, das
aus etwa 40 Aminosäuren
besteht, und ist in der Nähe
des Transmembranbereichs eines Amyloid-Vorläufer-Proteins (im folgenden
als APP bezeichnet) codiert. Aminosäuresequenzen der β-Amyloide
sind im folgenden gezeigt:
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Gemäß neueren Berichten gehören einige
der Patienten mit familiärer
Alzheimer-Krankheit
zu Familien, die Punktmutationen von APP aufweisen, und es wurde auf
die Möglichkeit
hingewiesen, dass die β-Amyloide
eine der Substanzen sein könnten,
die die Alzheimer-Krankheit verursachen. Vor diesem Hintergrund wurden
die β-Amyloide
als Hauptgegenstand für
die Untersuchung der Alzheimer-Krankheit intensiv untersucht, und
verschiedene Ergebnisse der Untersuchungen wurden vorgelegt.
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Assaysysteme zum leichten Nachweis
der β-Amyloide
mit hoher Empfindlichkeit wurden bisher jedoch kaum beschrieben,
obwohl ein starkes Interesse an den β-Amyloiden bekundet wurde. Der Sandwich-Enzym-Immunoassay
der β-Amyloide
wird nur von P. Seubert et al. beschrieben [Nature, 359, 325–327 (1992)].
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Es wird berichtet, dass das Assaysystem
von P. Seubert et al. eine Nachweisempfindlichkeit von 100 pg/ml
hat, was nicht befriedigend ist. Weiterhin wird berichtet, dass
das Assaysystem auch mit einem partiellen Peptid reagiert, das aus
28 N-terminalen Resten besteht [im folgenden als β-Amyloid
(1-28) bezeichnet]. Es gibt jedoch mehrere hydrophobe Aminosäuren in
C-terminalen Teilen der β-Amyloide β-Amyloid
(29-39), β-Amyloid
(29-40), β-Amyloid
(29-41), β-Amyloid
(29-42) oder β-Amyloid
(29-43). Man geht daher davon aus, dass dieser C-terminale Bereich
in einer Zellmembran eingebettet ist, und es wird angenommen, dass
er eine wichtige Rolle bei der Aggregation und Ablagerung von Peptiden
spielt. Aus diesem Grund ist es wichtig, β-Amyloide, die die Cterminalen
hydrophoben Bereiche aufweisen, zu quantifizieren. Das oben genannte
Assaysystem von P. Seubert et al erfüllt jedoch nicht die sozialen
Anforderungen hinsichtlich Spezifität und Empfindlichkeit.
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Gewöhnlich werden Antikörper gegen
Peptide hergestellt, indem man Komplexe der Peptide mit natürlichen
oder synthetischen Polymerträgern
für eine
Immunisierung verwendet. Auch im Falle der β-Amyloide zeigt der oben beschriebene
Bereicht von P. Seubert et al., dass gegenüber β-Amyloid (1-40) reaktive Antikörper hergestellt
werden können,
indem man N-terminale Teile der β-Amyloide, die hydrophile
Bereiche sind, zum Beispiel β-Amyloid
(1-16), als Immunogene verwendet. Es ist jedoch nicht klar, ob ein
Antikörper
gegen den Cterminalen Teil des β-Amyloids,
bei dem es sich um den in die Zellmembran eingebetteten hydrophoben Bereich
handelt, mit gewöhnlichen
Methoden hergestellt werden kann. Selbst wenn der Antikörper gegen
einen solchen Bereich erhalten werden kann, ist weiterhin überhaupt
nicht gewährleistet,
dass er auch mit dem β-Amyloid
reagiert. Wenn der Antikörper
nur eine äußerst geringe
Affinität
zu dem β-Amyloid
zeigt, ist weiterhin im Allgemeinen nicht ohne weiteres zu erwarten,
dass zum Beispiel der oben genannte Sandwich-Enzym-Immunoassay von P.
Seubert et al mit dem Antikörper
entwickelt werden kann. Obwohl nämlich
bisher verschiedene Antikörperhergestellt
wurden, um die β-Amyloide nachzuweisen,
gibt es keinen Bericht, dass der Antikörper gegen den C-terminalen
Teil des β-Amyloids
hergestellt und auf den Sandwich-Enzym-Immunoassay angewendet wurde, wodurch
man einen Immunoassay entwickelt hätte, mit dem das β-Amyloid
mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität ohne Kreuzreaktion mit β-Amyloid
(1-28) nachgewiesen werden kann. Es wird weiterhin berichtet, dass
das β-Amyloid
(25-35) in seiner Aminosäuresequenz
eine Homologie mit Tachykinin aufweist und cytotoxisch ist [B. A.
Yankner et al., Science, 250, 279–282 (1990)]. Es gibt jedoch überhaupt
keinen Bericht, dass ein Antikörper
gegen das β-Amyloid
(25-35) hergestellt und auf den Sandwich-Enzym-Immunoassay angewendet wurde,
wodurch man einen Immunoassay entwickelt hätte, mit dem das β-Amyloid mit
hoher Empfindlichkeit und Spezifität ohne Kreuzreaktion mit β-Amyloid
(1-28) nachgewiesen werden kann.
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Vor kurzem wurde weiterhin berichtet,
dass von den β-Amyloiden
das β-Amyloid
(1-42) hauptsächlich im
cerebralen Cortex abgelagert wird (senile Plaques), während das β-Amyloid
(1-40) hauptsächlich
in den cerebralen Blutgefäßen abgelagert
wird (Angiopathie) [Arch. Biochem. Biophys., 301, 41–53 (1993)].
Es wird weiterhin vorgeschlagen, dass die Keimbildung durch Peptide,
die den Cterminalen Teil enthalten, wie das β-Amyloid (1-42), das β-Amyloid
(26-42), das β-Amyloid
(26-43) und das β-Amyloid
(34-42), die Ablagerung von wasserlöslichem β-Amyloid (1-40) verursacht [Biochemistry,
32, 4693–4697
(1993)]. Wegen solcher Berichte geht man davon aus, dass der Unterschied
in der Ablagerungsweise zwischen β-Amyloid
(1-40) und β-Amyloid (1-42)
weitgehend mit der Alzheimer-Krankheit zusammenhängt. Wenn Alzheimer-Krankheit
diagnostiziert wird, ist daher eine empfindliche und diskriminierende
Bestim mung von β-Amyloid
(1-40) und β-Amyloid
(1-42) wichtig. Geeignete Antikörper
für diesen
Zweck wurden jedoch noch nicht beschrieben.
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Ein Ziel der vorliegenden Erfindung
besteht darin, einen neuen Antikörper,
der empfindlich und spezifisch ein β-Amyloid mit einem C-terminalen
hydrophoben Bereich oder ein Derivat davon bestimmen kann, vorzugsweise
einen monoklonalen Antikörper,
bereitzustellen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht
darin, ein Verfahren zum Bestimmen eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon mit dem Antikörper
bereitzustellen.
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Offenbarung
der Erfindung
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Um das oben genannte Problem zu lösen, haben
die Erfinder intensive Untersuchungen angestellt. Als Ergebnis haben
die Erfinder mehrere monoklonale Antikörper hergestellt, die verschiedene
Teile von β-Amyloiden
oder Derivaten davon erkennen, und entwickelten ein ausgezeichnetes
Verfahren zur Bestimmung von β-Amyloiden
durch die Verwendung der Antikörper,
woraufhin weitere Untersuchungen folgten, wodurch die vorliegende
Erfindung fertiggestellt wurde.
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Das heißt, die vorliegende Erfindung
stellt bereit: einen Antikörper
(vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper), der spezifisch gegenüber einem
partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids oder
eines Derivats davon reaktiv ist;
eine Hybridomzelle, die den
monoklonalen Antikörper
produziert;
und einen Immunoassay für ein β-Amyloid oder ein Derivat davon
nach einem kompetitiven Verfahren oder einem Sandwich-Verfahren
unter Verwendung des Antikörpers
(ein Verfahren zum Diagnostizieren der Alzheimer-Krankheit).
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Insbesondere haben die Erfinder mehrere
monoklonale Antikörper
hergestellt, indem sie das β-Amyloid
(25-35), das β-Amyloid
(35-43), das β-Amyloid
(1-40) und das β-Amyloid
(1-16) als Immunogene verwendeten. Durch Kombination der Antikörper entwickelten
die Erfinder einen Immunoassay, mit dem β-Amyloide oder Derivate davon
mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität ohne Kreuzreaktion mit dem β-Amyloid
(1-28) nachgewiesen werden können.
Unter Verwendung von β-Amyloid
(25-35), β-Amyloid
(35-43) und β-Amyloid (1-40)
als Immunogene haben die Erfinder nämlich monoklonale Antikörper entwickelt,
die C-terminale Teile von β-Amyloiden
oder Derivaten davon erkennen, zum Beispiel Antikörper, die
als BA-27a, BS-85a und BC-05a bezeichnet werden. Von diesen zeigen
BS-85a und BA-27a
in einem kompetitiven Immunoassay unter Verwendung von markierten β-Amyloiden
jeweils eine äußerst geringe
Affinität
zu den β-Amyloiden.
Dennoch haben Studien gezeigt, dass Kombinationen davon mit zwei
Arten von Antikörpern,
die aus monoklonalen Antikörpern
gegen einen N-terminalen Teil (β-Amyloid
(1-16)) der β-Amyloide
ausgewählt
sind, nämlich
mit Antikörpern,
die als BAN-052a und BAN-50a bezeichnet werden, einen Sandwich-Immunoassay mit äußerst hoher Empfindlichkeit
gegenüber
den β-Amyloiden
ergeben können.
Weiterhin haben die Erfinder gezeigt, dass ein Sandwich-Immunoassay, bei
dem BC-50a mit BAN-50a kombiniert wird, die β-Amyloide in einem Ameisensäureextrakt
aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit mit hoher Empfindlichkeit
ohne Kreuzreaktion mit β-Amyloid
(1-40) nachweist. Weiterhin haben die Erfinder monoklonale Antikörper entwickelt,
die partielle Peptide in zentralen Teilen von β-Amyloiden oder Derivaten davon
erkennen, zum Beispiel den als BP-90a bezeichneten Antikörper.
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Eines der Hauptmerkmale der vorliegenden
Erfindung ist die Bereitstellung von Sandwich-Immunoassays, die
eine hochempfindliche und diskriminierende Bestimmung von β-Amyloid
(1-40) und β-Amyloid
(1-42) ermöglichen.
Der Sandwich-Immunoassay, bei dem BA-27a mit BAN-052a oder BAN-50a
kombiniert wird, kann nämlich
das β-Amyloid
(1-40) nachweisen, kann aber nicht das β-Amyloid (1-42) nachweisen. Weiterhin kann
der Sandwich-Immunoassay, bei dem BC-05a mit BAN-052a oder BAN-50a
kombiniert wird, das β-Amyloid
(1-42) nachweisen, kann aber nicht das β-Amyloid (1-40) nachweisen.
Weiterhin kann der Sandwich-Immunoassay, bei dem BS-85a mit BAN-052a
oder BAN-50a kombiniert wird, das β-Amyloid (1-40) und das β-Amyloid
(1-42) nachweisen. Daher können
gemäß den Sandwich-Immunoassays,
bei denen die monoklona len Antikörper
der vorliegenden Erfindung miteinander kombiniert werden, eine hochempfindliche
und diskriminierende Quantifizierung von β-Amyloid (1-40) und β-Amyloid
(1-42) durchgeführt
werden. Eine solche Technik ist ein überraschendes Ergebnis, das
nicht aus dem Stand der Technik abgeleitet werden kann.
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Insbesondere stellt die vorliegende
Endung folgendes bereit:
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- (1) einen Antikörper,
der spezifisch reaktiv ist gegenüber
einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids
oder gegenüber
einem Derivat des β-Amyloids,
das ausgewählt
ist aus (a) Peptiden, denen 1 bis 17 Aminosäurereste vom N-terminalen Teil
des β-Amyloids
fehlen, (b) Peptiden, bei denen L-Asparaginsäure der β-Amyloide zu L-Isoasparaginsäure, D-Isoasparaginsäure oder
D-Asparaginsäure
isomerisiert ist, und (c) Peptiden, bei denen der Nterminale Teil
der β-Amyloide
Pyroglutaminsäure
aufweist, wobei der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt;
- (2) den in (1) beschriebenen Antikörper, wobei das Derivat des β-Amyloids
ausgewählt
ist aus einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus dem 2.
bis 42. Aminosäurerest
der Sequenz, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, einem
Peptid mit der Aminosäuresequenz,
die aus der 3. bis 42. Aminosäure
der Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, wobei die N-terminale
Glutaminsäure durch
Pyroglutaminsäure
ersetzt ist, einem Peptid mit der Aminosäuresequenz, die aus der 4.
bis 42. Aminosäure
der Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, besteht, und einem Peptid
mit der Aminosäuresequenz,
der der 1. bis 16. oder der 1. bis 17. nosäurerest aus der Sequenz, die
durch eine der Sequenzen SEQ ID NAmiO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellt
wird, fehlt;
- (3) den in (1) oder (2) beschriebenen Antikörper; wobei:
- (i) der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 8 dargestellt wird, und ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt;
- (ii) der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 8 dargestellt wird, erkennt, aber ein partielles Peptid nz,
die durch SEQ ID Nmit einer AminosäuresequeO: 9 dargestellt wird,
nicht erkennt; oder
- (iii) der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 8 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, erkennt;
- (4) den in (1) oder (2) beschriebenen Antikörper, der spezifisch reaktiv
ist gegenüber
einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein partielles
Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 8 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt und ein partielles Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, erkennt;
- (5) den in (1) oder (2) beschriebenen Antikörper, der spezifisch reaktiv
ist gegenüber
einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein
partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 8 dargestellt wird, erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer
Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, nicht erkennt;
- (6) den in (1) oder (2) beschriebenen Antikörper, der spezifisch reaktiv
ist gegenüber
einem β-Amyloid
oder einem Derivat davon, wie es in den Ansprüchen 1 und 2 definiert ist
und das in einem Ameisensäureextrakt aus
dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist,
wobei der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 8 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein partielles Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 9 dargestellt wird, erkennt und das β-Amyloid
oder sein Derivat, das in dem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines
Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist, ein β-Amyloid
mit einer Aminosäuresequenz
ist, die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, und der Antikörper ein β-Amyloid mit einer
Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, ein β-Amyloid mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und ein β-Amyloid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, nicht erkennt;
- (7) den in einem der Abschnitte (1) bis (6) beschriebenen Antikörper, wobei
der Antikörper
ein monoklonaler Antikörper
ist;
- (8) den in (7) beschriebenen Antikörper, bei dem es sich um einen
monoklonalen Antikörper
handelt, der als BA-27a (FERM-BP 4139), BS-85a (FERM-BP 4140) oder
BC-05a (FERM-BP 4457) bezeichnet wird;
- (9) eine Hybridomzelle, die die in (8) beschriebenen monoklonalen
Antikörper
erzeugt;
- (10) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon, wie es in (1) oder (2) definiert ist, in einer Testlösung, umfassend
die Verwendung eines Antikörpers,
wie er in (1) bis (8) definiert ist;
- (11) das Verfahren gemäß (10),
das zwischen einem β-Amyloid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und einem β-Amyloid mit einer
Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, unterscheidet;
- (12) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon, wie es in (1) und (2) definiert ist, in einer Testlösung, umfassend
die Verwendung:
- (1) eines Antikörpers,
wie er in (1) bis (8) definiert ist; und
- (2) eines monoklonalen Antikörpers,
der
- (a) als BAN-052a (FERM-BP 4138) oder
- (b) als BAN-50a (FERM-BP 4163) bezeichnet wird;
und spezifisch
reaktiv ist gegenüber
einem partiellen Peptid auf der N-terminalen Seite eines β-Amyloids
oder einem Derivat davon, wobei der Antikörper ein partielles Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, und/oder ein partielles
Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 10 dargestellt wird, erkennt;
- (13) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon, wie es in (1) und (2) definiert ist, in einer Testlösung, umfassend
die Verwendung:
- (1) eines Antikörpers,
der spezifisch reaktiv ist gegenüber
einem β-Amyloid
oder einem Derivat davon, wobei der Antikörper ein partielles Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht erkennt, aber ein
partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 12 dargestellt wird, erkennt; und
- (2) des Antikörpers,
wie er in (1) bis (8) definiert ist;
- (14) das in (10) bis (13) definierte Verfahren, wobei das Verfahren
zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit verwendet wird; und
- (15) eine Zusammensetzung zur Diagnose der Alzheimer-Krankheit,
die einen Antikörper
gemäß einem
der Abschnitte (1) bis (8) umfasst.
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In Ausführungsform (12) ist der mit
BAN-052a bezeichnete monoklonale Antikörper spezifsch reaktiv gegenüber einem
partiellen Peptid auf der N-terminalen Seite eines β-Amyloids
oder Derivats davon und erkennt ein partielles Peptid mit einer
Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, und/oder ein partielles
Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 10 dargestellt wird.
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Weiterhin ist der mit BAN-50a bezeichnete
monoklonale Antikörper
spezifisch reaktiv gegenüber
einem partiellen Peptid auf der N-terminalen Seite eines β-Amyloids oder Derivats
davon und erkennt ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, und/oder ein partielles Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 10 dargestellt wird.
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In Ausführungsform (13) ist der Antikörper (2)
spezifisch reaktiv gegenüber
einem β-Amyloid
oder einem Derivat davon und erkennt ein partielles Peptid mit einer
Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 7 dargestellt wird, nicht, erkennt aber ein
partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die durch SEQ ID
NO: 12 dargestellt wird.
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Vorzugsweise ist der Antikörper ein
monoklonaler Antikörper.
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Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen
Aspekts (1) sind wie folgt:
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- (16) der in (1) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid
ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz
ist, die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird;
- (17) der in (1) beschriebene Antikörper, wobei das Derivat des β-Amyloids
folgendes ist: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 2.
bis 42. Aminosäure
einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, ein Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die aus der 3. bis 42. Aminosäure
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, wobei die
N-terminale Glutaminsäure
durch Pyroglutaminsäure
substituiert ist, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 4.
bis 42. Aminosäure
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, oder ein
Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
der die 1. bis 16. Aminosäure
oder die 1. bis 17. Aminosäure
einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten
Aminosäuresequenz
fehlen;
- (18) der in (1) beschriebene Antikörper, wobei das partielle Peptid
auf der Cterminalen Seite des β-Amyloids oder
das Derivat davon ein partielles Peptid mit einer Aminosäuresequenz
ist, die ab der 25. Aminosäure
von der N-terminalen Aminosäure
des β-Amyloids
aus gezählt
oder später
beginnt;
- (19) der in (1) bzw. (16) bis (18) beschriebene Antikörper, wobei
der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 7 dargestellten
Aminosäuresequenz
nicht erkennt;
- (20) der in (1) bzw. (16) bis (19) beschriebene Antikörper, wobei
der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten
Aminosäuresequenz
erkennt; und
- (21) der in (1) bzw. (16) bis (19) beschriebene Antikörper, wobei
der Antikörper
ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 9 dargestellten
Aminosäuresequenz
erkennt.
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Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen
Aspekts (3) (i) sind wie folgt:
-
- (22) ein Antikörper,
der spezifisch reaktiv ist gegenüber
einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein
partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz
und/oder ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 9 dargestellten
Aminosäuresequenz
nicht erkennt; und
- (23) der in (24) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein
partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennt.
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Eine bevorzugte Ausführungsform
des oben beschriebenen Aspekts (3) (ii) ist wie folgt:
-
- (24) ein Antikörper,
der spezifisch reaktiv ist gegenüber
einem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite eines β-Amyloids
mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 1 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 2 dargestellt wird, eines β-Amyloids mit einer Aminosäuresequenz,
die durch SEQ ID NO: 3 dargestellt wird, und/oder eines β-Amyloids mit einer
Aminosäuresequenz, die
durch SEQ ID NO: 5 dargestellt wird, wobei der Antikörper ein
partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 9
dargestellten Aminosäuresequenz
nicht erkennt.
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Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen
Aspekts (3) (iii) sind wie folgt:
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- (25) ein Antikörper,
der spezifisch reaktiv ist gegenüber
einem β-Amyloid
oder einem Derivat davon, das in einem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines
Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten ist, wobei der Antikörper ein
partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz
nicht erkennt, aber ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID
NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennt;
- (26) der in (25) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid
oder sein Derivat, das in dem Ameisensäureextrakt aus dem Gehirn eines
Patienten mit Alzheimer-Krankheit
enthalten ist, ein β-Amyloid
mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz
ist; und
- (27) der in (26) beschriebene Antikörper, wobei der Antikörper ein β-Amyloid
mit einer durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz,
ein β-Amyloid
mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz
und ein β-Amyloid
mit einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz
nicht erkennt.
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Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen
Aspekts (8) sind wie folgt:
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- (28) der in (22) oder (23) beschriebene monoklonale Antikörper, wobei
der Antikörper
mit BA-27a bezeichnet wird;
- (29) der in (24) beschriebene monoklonale Antikörper, wobei
der Antikörper
mit BS-85a bezeichnet wird; und
- (30) der in (25) bis (27) beschriebene monoklonale Antikörper, wobei
der Antikörper
mit BC-05a bezeichnet wird.
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Besonders bevorzugt ist:
-
- (31) der in einem der Abschnitte (1) bis (8) und (16) bis
(30) beschriebene Antikörper,
wobei der Antikörper
für die
Bestimmung eines β-Amyloids
oder Derivats davon durch einen Sandwich-Enzym-Immunoassay verwendet
wird.
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Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen
Aspekts (9) sind wie folgt:
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- (32) eine Hybridomzelle, die den in (28) beschriebenen monoklonalen
Antikörper
produziert;
- (33) eine Hybridomzelle, die den in (29) beschriebenen monoklonalen
Antikörper
produziert; und
- (34) eine Hybridomzelle, die den in (30) beschriebenen monoklonalen
Antikörper
produziert.
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Die Antikörper der oben beschriebenen
Ausführungsform
(13) sind vorzugsweise wie folgt:
-
- (35) der in (13) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid
ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz
ist, die durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID
NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt wird;
- (36) der in (13) beschriebene Antikörper, wobei das Derivat des β-Amyloids
folgendes ist: ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 2.
bis 42. Aminosäure
einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, ein Peptid
mit einer Aminosäuresequenz,
die aus der 3. bis 42. Aminosäure
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, wobei die
N-terminale Glutaminsäure
durch Pyroglutaminsäure
substituiert ist, ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die aus der 4.
bis 42. Aminosäure
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, oder ein
Peptid mit einer Aminosäuresequenz,
der die 1. bis 16. Aminosäure
oder die 1. bis 17. Aminosäure
einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten
Aminosäuresequenz
fehlen;
- (37) der in (13) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid
oder sein Derivat ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, der die 1. bis
16. Aminosäure
oder die 1. bis 17. Aminosäure
einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten
Aminosäuresequenz
fehlen, ist;
- (38) der in (13) beschriebene Antikörper, wobei das β-Amyloid
oder sein Derivat ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, der die 1. bis
16. Aminosäure
oder die 1. bis 17. Aminosäure
einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen, ist;
- (39) der in (13), (35) oder (38) beschriebene Antikörper, wobei
der Antikörper
ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 11 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennt; und
- (40) der in (13), (35) oder (38) beschriebene Antikörper, wobei
der Antikörper
zur Bestimmung eines β-Amyloids
oder eines Derivats davon durch ein Sandwich-Enzym-Immunoassay verwendet
wird.
-
In einer bevorzugten Ausführungsform
des oben beschriebenen Aspekts (12) gilt:
-
- (41) der monoklonale Antikörper ist durch BP-90a bezeichnet.
-
Eine bevorzugte Ausführungsform
des oben beschriebenen Aspekts (10) ist wie folgt:
-
- (42) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon in einer Testlösung,
umfassend das kompetitive Umsetzen des in (1) bis (8) beschriebenen
Antikörpers
mit der Testlösung
und einem markierten β-Amyloid
oder einem Derivat davon und das Messen des Verhältnisses des markierten β-Amyloids oder seines
Derivats, das an den Antikörper
gebunden ist.
-
Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen
Aspekts (12) sind wie folgt:
-
- (43) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon in einer Testlösung,
umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen
ein β-Amyloid
oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid
oder Derivat davon und der Testlösung
und dann das Messen der Aktivität
eines Markers auf dem Träger,
wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen
das β-Amyloid oder Derivat
davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid oder Derivat
davon um den in (1) bis (8) beschriebenen Antikörper handelt und der jeweils
andere ein Antikörper
ist, der ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 7 oder
SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz erkennt;
- (44) das in (43) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei der
Antikörper,
der das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID
NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennt, ein monoklonalen Antikörper
ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird;
- (45) das in (43) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es
sich entweder bei dem auf dem Träger
insolubilisierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um einen monoklonalen Antikörper
handelt, der durch BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnet wird, und
der jeweils andere ein monoklonalen Antikörper ist, der durch BAN-052a
oder BAN-50a bezeichnet wird;
- (46) das in (43) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es
sich entweder bei dem auf dem Träger
insolubilisierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um einen monoklonalen Antikörper
handelt, der durch BA-27a bezeichnet wird, und der jeweils andere
ein monoklonalen Antikörper
ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird, und das β-Amyloid
oder Derivat davon ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 1 dargestellten
Aminosäuresequenz,
ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz,
ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz
und/oder ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz
ist;
- (47) das in (43) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es
sich entweder bei dem auf dem Träger
insolubilisierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um einen monoklonalen Antikörper
handelt, der durch BA-85a bezeichnet wird, und der jeweils andere
ein monoklonalen Antikörper
ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird, und das β-Amyloid
oder Derivat davon ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 1 dargestellten
Aminosäuresequenz,
ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz,
ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz
und/oder ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz
ist; und
- (48) das in (43) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es
sich entweder bei dem auf dem Träger
insolubilisierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um einen monoklonalen Antikörper
handelt, der durch BC-05a bezeichnet wird, und der jeweils andere
ein monoklonalen Antikörper
ist, der durch BAN-052a oder BAN-50a bezeichnet wird, und das β-Amyloid
oder Derivat davon ein Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 5 dargestellten
Aminosäuresequenz
ist.
-
Bevorzugte Ausführungsformen des oben beschriebenen
Aspekts (12) sind wie folgt:
-
- (49) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon in einer Testlösung,
umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen
ein β-Amyloid
oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid
oder Derivat davon und der Testlösung
und dann das Messen der Aktivität
eines Markers auf dem Träger,
wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen
das β-Amyloid oder Derivat
davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β- Amyloid oder Derivat
davon um den in (12) beschriebenen Antikörper handelt und der jeweils
andere der in (1) bis (8) beschriebene Antikörper ist.
- (50) das in (49) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es
sich entweder bei dem auf dem Träger
insolubilisierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um einen monoklonalen Antikörper
handelt, der durch BC-90a bezeichnet wird, und der jeweils andere
ein monoklonalen Antikörper
ist, der durch BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnet wird;
- (51) das in (49) beschriebene Bestimmungsverfahren, wobei es
sich entweder bei dem auf dem Träger
insolubilisierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um einen monoklonalen Antikörper
handelt, der durch BC-90a bezeichnet wird, und der jeweils andere
ein monoklonalen Antikörper
ist, der durch BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnet wird, und das β-Amyloid
oder Derivat davon ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz ist, der die 1.
bis 16. Aminosäure
oder die 1. bis 17. Aminosäure
einer durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten
Aminosäuresequenz fehlen.
-
Von den durch die vorliegende Erfindung
erhaltenen Anti-β-Amyloid-Antikörperproduzierenden
Hybridomen wurden BAN-052, BA-27 und BS-85 am 22. Dezember 1992
beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), unter den folgenden
Zugriffsnummern und am 7. Januar 1993 beim National Institute of
Bioscience and Human-technology, the Agency of Industrial Science
and Technology, the Ministry of International Trade and Industry,
Japan (NIBH), unter den folgenden Zugriffsnummern hinterlegt:
-
Weiterhin wurde von den durch die
vorliegende Erfindung erhaltenen Hybridomzellen BAN-50 am 8. Januar
1993 beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), unter
der folgenden Zugriffsnummer und am 27. Januar 1993 beim National
Institute of Bioscience and Human-technology, the Agency of Industrial
Science and Technology, the Ministry of International Trade and
Industry, Japan (NIBH), unter der folgenden Zugriffsnummer hinterlegt:
-
Weiterhin wurden von den durch die
vorliegende Erfindung erhaltenen Hybridomzellen BC-05 und BP-90
am 2. November 1993 beim National Institute of Bioscience and Human-technology,
the Agency of Industrial Science and Technology, the Ministry of
International Trade and Industry, Japan (NIBH), unter den folgenden
Zugriffsnummern hinterlegt:
-
Der Antikörper, der jeweils von den Hybridomen
erhalten wird, wird dargestellt, indem man den Suffix "a" an den Namen des Hybridoms anhängt.
-
Von den in dieser Beschreibung verwendeten
SEQ ID NO: bezeichnen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 12 Aminosäuresequenzen
der folgenden Peptide:
-
Zu den in der vorliegenden Erfindung
verwendeten β-Amyloiden
gehören
das β-Amyloid (1-38) mit
der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid
(1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz,
das β-Amyloid
(1-40) mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz,
das β-Amyloid
(1-41) mit der durch SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz,
das β-Amyloid (1-42)
mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz und das β-Amyloid
(1-43) mit der durch SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz.
-
Zu den Derivaten der in der vorliegenden
Erfindung verwendeten β-Amyloiden
gehören
Peptide, denen jeweils etwa 1 bis 17 Aminosäurereste von den Nterminalen
Teilen der oben genannten β-Amyloide
fehlen, Peptide, bei denen L-Asparaginsäure der
oben genannten β-Amyloide
zu L-Isoasparaginsäure,
D-Isoasparaginsäure oder
D-Asparaginsäure
isomerisiert ist, und Peptide, bei denen die N-terminalen Teile
der oben genannten β-Amyloide
Pyroglutaminsäure
aufweisen. Beispiele dafür
sind das Peptid mit der Aminosäuresequenz,
die aus der 3. bis 42. Aminosäure
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, das Peptid
mit der Aminosäuresequenz,
die aus der 3. bis 42.
-
Aminosäure der durch SEQ ID NO: 5
dargestellten Aminosäuresequenz
besteht, wobei die N-terminale Glutaminsäure durch Pyroglutaminsäure ersetzt
ist, das Peptid mit der Aminosäuresequenz,
die aus der 4. bis 42. Aminosäure
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz besteht, und das
Peptid mit der Aminosäuresequenz,
der die 1. bis 16. Aminosäure
oder die 1. bis 17. Aminosäure
aus der durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten
Aminosäuresequenz
fehlt (zum Beispiel das β-Amyloid
(17-40) oder das β-Amyloid (18-40)).
Diese β-Amyloide
oder ihre Derivate können
zum Beispiel nach an sich bekannten Verfahren aus Säugern, wie
Menschen, Affen, Ratten und Mäusen,
hergestellt werden, und es kann sich auch um gereinigte natürliche Proben
handeln, die kommerziell erhältlich
sind.
-
Beispiele für die partiellen Peptide auf
den C-terminalen Seiten der β-Amyloide
oder ihrer Derivate sind die partiellen Peptide mit den Aminosäuresequenzen,
die jeweils die ab der 25. Aminosäure von der N-terminalen Aminosäure der β-Amyloide aus gezählt oder
später
beginnen.
-
Beispiele für die Antikörper (vorzugsweise die monoklonalen
Antikörper),
die spezifisch gegenüber den
partiellen Peptiden auf den C-terminalen Seiten der β-Amyloide oder ihren
Derivaten reaktiv sind, sind die Antikörper, die die partiellen Peptide
oder ihre Derivate erkennen, aber nicht das partielle Peptid mit
der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich das
partielle Peptid auf den N-terminalen Seiten der β-Amyloide,
das durch das β-Amyloid
(1-28) dargestellt
wird) erkennen. Von diesen Antikörpern
werden insbesondere die folgenden Antikörper bevorzugt:
-
- (i) die Antikörper,
die die partiellen Peptide mit jeweils den durch SEQ ID NO: 8 und
SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenzen (nämlich β-Amyloid
(25-35) und β-Amyloid
(35-43)) nicht erkennen;
- (ii) die Antikörper,
die das partielle Peptid mit den durch SEQ ID NO: 8 dargestellten
Aminosäuresequenzen (nämlich β-Amyloid
(25-35)) erkennen, und insbesondere die Antikörper, die das partielle Peptid
mit der durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid
(25-35)) erkennen, aber das partielle Peptid mit der durch SEQ ID
NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz
(nämlich β-Amyloid
(35-43)) nicht erkennen; und
- (iii) die Antikörper,
die das partielle Peptid mit den durch SEQ ID NO: 9 dargestellten
Aminosäuresequenzen (nämlich β-Amyloid
(35-43)) erkennen, und insbesondere die Antikörper, die das partielle Peptid
mit der durch SEQ ID NO: 8 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid
(25-35)) nicht erkennen, aber das partielle Peptid mit der durch
SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz (nämlich β-Amyloid
(35-43)) erkennen.
-
Von den Antikörpern des oben beschriebenen
Aspekts (i) werden diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere
das β-Amyloid
(1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz.,
das β-Amyloid
(1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz
und/oder das β-Amyloid (1-40)
mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen. Weiterhin
sind solche Antikörper
bevorzugt, die das β-Amyloid
(1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz, das β-Amyloid
(1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz,
das β-Amyloid
(1-40) mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz
und das β-Amyloid (1-42) mit
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen.
-
Von den Antikörpern des oben beschriebenen
Aspekts (ii) werden diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere
das β-Amyloid
(1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz,
das β-Amyloid
(1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz
und/oder das β-Amyloid (1-40)
mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz und/oder das β-Amyloid (1-42) mit
der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz erkennen.
-
Weiterhin sind von den Antikörpern des
oben beschriebenen Aspekts (iii) diejenigen Antikörper bevorzugt,
die insbesondere die β-Amyloide
erkennen, die in den Ameisensäureextrakten
aus den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten sind (insbesondere
das β-Amyloid
(1-42) mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz).
Weiterhin sind diejenigen Antikörper
bevorzugt, die das β-Amyloid
(1-42) mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennen, aber das β-Amyloid
(1-38) mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz,
das β-Amyloid
(1-39) mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz
und das β-Amyloid
(1-40) mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz
nicht erkennen.
-
Typische Beispiele für die Antikörper des
oben beschriebenen Aspekts (i) umfassen den mit BA-27a bezeichneten
monoklonalen Antikörper,
typische Beispiele für
die Antikörper
des oben beschriebenen Aspekts (ii) umfassen den mit BS-85a bezeichneten
monoklonalen Antikörper,
und typische Beispiele für
die Antikörper des
oben beschriebenen Aspekts (iii) umfassen die mit BC-05a, BC-15a, BC-65a, BC-75a
und BC-55a bezeichneten monoklonalen Antikörper (insbesondere ist BC-05a
bevorzugt).
-
Zu den in der vorliegenden Erfindung
verwendeten monoklonalen Antikörpern,
die spezifisch gegenüber
den partiellen Peptiden auf den N-terminalen Seiten der β-Amyloide
oder deren Derivaten reaktiv sind, gehören zum Beispiel die monoklonalen
Antikörper,
die das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten
Aminosäuresequenz
(β-Amyloid
(1-28)) und/oder das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 10
dargestellten Aminosäuresequenz
(β-Amyloid (1-16)) erkennen.
Insbesondere sind die mit BAN-50a, BAN-052a, BAN-11a, BAN-30a, BAN-20a und BAN-40a bezeichneten
monoklonalen Antikörper
gezeigt, und insbesondere die mit BAN-052a und BAN-50a bezeichneten
monoklonalen Antikörper
sind bevorzugt.
-
Weiterhin gehören zu den in der vorliegenden
Erfindung verwendeten monoklonalen Antikörpern, die spezifisch gegenüber den
partiellen Peptiden in den zentralen Teilen der β-Amyloide oder deren Derivaten
reaktiv sind, zum Beispiel die Antikörper (vorzugsweise monoklonalen
Antikörper),
die das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten
Aminosäuresequenz
nicht erkennen und das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO:
12 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennen. Von diesen Antikörpern
sind diejenigen Antikörper
bevorzugt, die insbesondere die Peptide mit den Aminosäuresequenzen
erkennen, denen die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure der
durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten
Aminosäuresequenzen
fehlen. Insbesondere sind diejenigen Antikörper bevorzugt, die insbesondere
das Peptid mit der Aminosäuresequenz,
der die 1. bis 16. Aminosäure
aus der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz fehlen (die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 11), oder das Peptid mit der Aminosäuresequenz,
der die 1. bis 17. Aminosäure
daraus fehlen (die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 12), erkennen. Insbesondere werden die mit BP-01a,
BP-02a, BP-03a und BP-90a bezeichneten monoklonalen Antikörper verwendet.
Von diesen monoklonalen Antikörpern
können
BP-03a und BP-90a auch das partielle Peptid mit der durch SEQ ID
NO: 11 bezeichneten Aminosäuresequenz
erkennen. Von diesen monoklonalen Antikörpern ist BP-90a besonders
gut geeignet.
-
Verfahren zur Herstellung der Antigene
und Verfahren zur Herstellung der monoklonalen Antikörper sind
unten im Einzelnen erläutert.
-
(1) Herstellung von Antigenen
-
Als Antigene, die zur Herstellung
der Antikörper
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können zum Beispiel beliebige β-Amyloide
oder deren Derivate, partielle Peptide, die durch Hydrolysieren
der β-Amyloide
oder deren Derivate erhalten werden, und synthetische Peptide mit
einer oder mehreren Arten von antigenen Determinanten, die dieselben
wie die der β-Amyloide
sind, verwendet werden (diese werden im folgenden auch kurz als β-Amyloid-Antigene
bezeichnet).
-
Als β-Amyloide oder deren Derivate
werden die oben genannten verwendet. Diese β-Amyloide oder ihre Derivate
können
zum Beispiel nach an sich bekannten Verfahren aus Säugern, wie
Menschen, Affen, Ratten und Mäusen,
hergestellt werden, und es kann sich auch um gereinigte natürliche Proben
handeln, die kommerziell erhältlich
sind. Beispiele für
die partiellen Peptide, die durch Hydrolysieren der β-Amyloide
erhalten werden, sind partielle Peptide, die durch sukzessives Hydrolysieren
des β-Amyloids
(1-43) mit der durch SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz
vom N-Terminus und/oder vom C-Terminus her mit Exoproteasen, wie
Aminopeptidase und Carboxypeptidase oder Gemischen davon, erhalten
werden, sowie partielle Peptide, die durch Hydrolysieren des β-Amyloids
(1-43) mit verschiedenen Endopeptidasen oder Gemischen davon erhalten
werden. Wenn das β-Amyloid
(1-42) nach diesem Verfahren hergestellt wird, ist die Probe in
manchen Fällen
mit β-Amyloid
(1-41) und/oder β-Amyloid
(1-43) kontaminiert.
-
Beispiele für die synthetischen Peptide,
die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Peptide
mit derselben Struktur wie die oben genannten gereinigten natürlichen β-Amyloid-Antigene
und Peptide mit einer oder mehreren Arten von Aminosäuresequenzen,
die dieselben sind wie diejenigen von beliebigen Teilen, die aus
wenigstens 3 Aminosäuren,
vorzugsweise wenigstens 6 Aminosäuren,
in den Aminosäuresequenzen
von β-Amyloid
(1-43) usw. bestehen (im folgenden kurz als β-Amyloid-verwandte synthetische Peptide
bezeichnet).
-
Die oben genannten synthetischen
Peptide können
nach in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, bei
denen es sich entweder um Festphasen-Syntheseverfahren oder Flüssigphasensyntheseverfahren
handeln kann. Beispiele für
solche Verfahren der Peptidsynthese sind Verfahren, die in B. Merrifield, J.
Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1963), M. Bodanszky und M. A. Ondetti,
Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966), Schroder
und Lubke, The Peptide/Academic Press, New York (1965), N. Izumiya
et al., Peptide Gosei no Kiso to Jikken (Fundamentals and Experiments
of Peptide Synthesis), Maruzen (1985), sowie N. Yazima und S. Sakakibara,
Seikagaku Jikken Koza 1 (Course of Biochemical Experiments 1), Chemistry
of Proteins IV, 205 (1977), beschrieben sind. Wenn die β-Amyloide
oder die β-Amyloid-verwandten
synthetischen Peptide zum Beispiel nach den Festkörperverfahren
synthetisiert werden, werden beliebige Harze, die in der Technik
als unlösliche
Harze bekannt sind (wie Chlormethylharze und 4-Oxymethylphenylacetamidomethyl-Harze),
für eine sukzessive
Kondensation von geschützten
Aminosäuren
an die C-terminalen Seiten der β-Amyloide
oder der β-Amyloid-verwandten
synthetischen Peptide gemäß den üblichen
Verfahren verwendet. Dann werden alle Schutzgruppen durch Behandlung
mit Fluorwasserstoff entfernt, und anschließend erfolgt eine Reinigung
mit an sich bekannten Verfahren, wie HPLC (high performance liquid
chromatography). So können
die gewünschten β-Amyloide
oder β-Amyloidverwandten
synthetischen Peptide erhalten werden.
-
N-Geschützte Aminosäuren können nach den Verfahren hergestellt
werden, bei denen man die α-Aminogruppen
mit Boc-Gruppen schützt;
weiterhin zum Beispiel die Hydroxygruppen von Serin und Threonin
mit Bzl-Gruppen; die ω-Carbonsäuregruppen
von Glutaminsäure
und Asparaginsäure
mit OBzl-Gruppen; die ε-Aminogruppe
von Lysin mit einer Cl-Z-Gruppe; die Guanidogruppe von Arginin mit
einer Tos-Gruppe; und die Imidazolgruppe von Histidin mit einer
Bom-Gruppe.
-
Wenn Aminosäuren usw. in der Beschreibung
dieser Erfindung durch Abkürzungen
bezeichnet werden, werden die Abkürzungen, die von der IUPAC-IUB
Commission on Biochemical Nomenclature festgelegt wurden, oder solche,
die in der Fachwelt gewöhnlich
verwendet werden, eingesetzt. Zum Beispiel werden die folgenden
Abkürzungen
verwendet. Wenn die Aminosäuren
als optische Isomere vorliegen können,
sollen die L-Formen gemeint sein, wenn nichts anderes angegeben
ist.
PAM | :
Phenylacetamidomethyl |
Boc | :
t-Butyloxycarbonyl |
Cl-Z | :
2-Chlorbenzyloxycarbonyl |
Br-Z | :
2-Brombenzyloxycarbonyl |
Bzl | :
Benzyl |
OcHex | :
Cyclohexylester |
OBzl | :
Benzylester |
Tos | :
p-Toluolsulfonyl |
HOBt | :
1-Benzotriazol |
MeBzl | :
4-Methylbenzyl |
Bom | :
Benzyloxymethyl |
DCC | :
N,N'-Dichlorhexylcarbodiimid |
Gly | :
Glycin |
Ala | :
Alanin |
Val | :
Valin |
Leu | :
Leucin |
Ile | :
Isoleucin |
Ser | :
Serin |
Thr | :
Threonin |
Cys | :
Cystein |
Met | :
Methionin |
Glu | :
Glutaminsäure |
Asp | :
Asparaginsäure |
Lys | :
Lysin |
Arg | :
Arginin |
His | :
Histidin |
Phe | :
Phenylalanin |
Tyr | :
Tyrosin |
Trp | :
Tryptophan |
Pro | :
Prolin |
Asn | :
Asparagin |
Gln | :
Glutamin |
-
Da die β-Amyloid-Antigene leicht aggregieren,
können
auch insolubilisierte direkt für
die Immunisierung verwendet werden. Weiterhin können auch Komplexe für die Immunisierung
verwendet werden, bei denen die β-Amyloid-Antigene
an geeignete Träger
gebunden oder adsorbiert sind. Was die Träger und das Mischungsverhältnis der
Träger
zu den β-Amyloid-Antigenen
(Haptenen) betrifft, so können
die Antigene in beliebigem Verhältnis
an beliebige Träger
gebunden oder adsorbiert sein, solange die Antikörper gegen die an die Träger gebundenen
oder adsorbierten β-Amyloid-Antigene
effektiv produziert werden. Es können
auch Komplexe verwendet werden, bei denen die Haptenantigene an
natürliche oder
synthetische Polymerträger, welche
gewöhnlich
bei der Herstellung von Antikörpern
gegen die Haptenantigene verwendet werden, in einem Gewichtsverhältnis von
0,1 bis 100, bezogen auf 1 für
das Hapten, gebunden oder adsorbiert sind. Zu den natürlichen
Polymerträgern
gehören
zum Beispiel Serumalbumin von Säugern,
wie Rindern, Kaninchen und Menschen, Thyroglobulin von Säugern, wie
Rindern und Kaninchen, Hämoglobin
von Säugern,
wie Rindern, Kaninchen, Menschen und Schafen, sowie Schlitzschnecken-Hämocyanin.
Beispiele für
die synthetischen Polymerträger,
die verwendet werden können,
sind verschiedene Latices von Polymeren oder Copolymeren, wie Aminosäurepolymeren,
Styrolpolymeren, Acrylpolymeren, Vinylpolymeren und Propylenpolymeren.
-
Außerdem können verschiedene Kondensationsmittel
verwendet werden, um die Haptene und die Träger aneinander zu koppeln.
Beispiele für
die Kondensationsmittel, die zweckmäßigerweise verwendet werden,
sind Diazoniumverbindungen, wie Bis-diazotiertes Benzidin, das Tyrosin,
Histidin und Tryptophan miteinander vernetzt; Dialdehydverbindungen,
wie Glutaraldehyd, das Aminogruppen miteinander vernetzt, Diisocyanatverbindungen,
wie Toluol-2,4-diisocyanat, Dimaleinimidverbindungen, wie N,N'-o-Phenylendimaleinimid, das
Thiolgruppen miteinander vernetzt, Maleinimid-Aktivesterverbindungen,
die Aminogruppen und Thiolgruppen miteinander vernetzen, sowie Carbodiimidverbindungen,
die Aminogruppen und Carboxygruppe miteinander vernetzen. Wenn Aminogruppen
miteinander vernetzt werden, gibt es eine andere Methode, mit der
ein Aktivesterreagens (zum Beispiel SPDP) mit einer Dithiopyridylgruppe
mit einer Aminosäure
umgesetzt und anschließend
eine Thiolgruppe eingeführt
wird, während
in die andere Aminogruppe unter Verwendung eines Maleinimid-Aktivester-Reagens
eine Maleinimidgruppe eingeführt
wird und dann beide miteinander umgesetzt werden.
-
(2) Herstellung von monoklonalen
Antikörpern
-
Die β-Amyloid-Antigene werden allein
oder zusammen mit Trägern
und Verdünnungsmitteln
warmblütigen
Tieren an für
die Antikörperproduktion
geeigneten Stellen verabreicht, zum Beispiel durch intraperitoneale,
intravenöse
und subkutane Injektion. Wenn die β-Amyloid-Antigene verabreicht
werden, kann auch Freunds vollständiges
Adjuvans oder Freunds unvollständiges
Adjuvans verabreicht werden, um die Antikörperproduktionsfähigkeit
zu erhöhen.
Die Dosierung ist gewöhnlich
einmal alle 2 bis 6 Wochen, insgesamt 2- bis 10 mal. Zu den warmblütigen Tieren
gehören
zum Beispiel Affen, Kaninchen, Hunde, Meerschweinchen, Mäuse, Ratten,
Schafe, Ziegen und Hühner.
Für die
Herstellung der monoklonalen Antikörper werden vorzugsweise Mäuse und
Ratten verwendet.
-
Bei der Herstellung der monoklonalen
Antikörper
werden Individuen, die einen hohen Antikörpertiter zeigen, aus den warmblütigen Tieren,
zum Beispiel Mäusen,
die mit den β-Amyloid-Antigenen
immunisiert wurden, ausgewählt.
Nach 2 bis 5 Tagen nach der endgültigen
Immunisierung werden die Milzen oder die Lymphknoten entnommen,
und antikörperproduzierende
Zellen, die darin enthalten sind, werden mit Myelomzellen fusioniert,
wodurch Hybridome hergestellt werden können, die monoklonale Anti-β-Amyloid-Antikörper produzieren.
Der Anti-β-Amyloid-Antikörpertiter
in dem Serum wird zum Beispiel bestimmt, indem man ein unten beschriebenen
markiertes β-Amyloid
mit einem. Antiserum umsetzt und dann die Aktivität eines
an den Antikörper
gebundenen Markierungsmittels bestimmt. Das Fusionsverfahren kann
nach in der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel nach
dem Verfahren von Köhler
und Milstein (Nature, 256, 495 (1975)]. Fusionsbeschleuniger, einschließlich Polyethylenglycol
(PEG) und Sendai-Virus, können
verwendet werden. Insbesondere wird vorzugsweise PEG verwendet.
Beispiele für
die Myelomzellen sind NS-1, P3U1, SP2/0 und AP-1, und P3U1 wird
vorzugsweise verwendet. Das Verhältnis
der zu verwendenden antikörperproduzierenden
Zellen (Milzzellen) zu den Myelomzellen beträgt vorzugsweise etwa 1 : 1
bis 20 : 1. PEG (vorzugsweise PEG 1000 bis PEG 6000) kann in einer
Konzentration von etwa 10 bis 80% hinzugefügt werden, woraufhin eine Inkubation
bei 20 bis 40°C,
vorzugsweise 30 bis 37°C,
während
1 bis 10 Minuten erfolgt, wodurch effektiv eine Zellfusion durchgeführt wird.
-
Verschiedene Verfahren können verwendet
werden, um die Hybridome, die Antiβ-Amyloid-Antikörper produzieren,
zu durchmustern. Beispiele für
solche Verfahren sind ein Verfahren, das folgendes umfasst: die Zugabe
eines Überstands
einer Hybridomkultur zu einer festen Phase (zum Beispiel einer Mikroplatte),
wodurch ein β-Amyloid
oder ein β-Amyloid-verwandtes
synthetisches Peptid direkt oder zusammen mit einem Träger adsorbiert
werden kann, und dann die Zugabe eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers (wenn
eine Mäusezelle
für die
Zellfusion verwendet wird, wird ein Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper verwendet)
oder von Protein A, das mit einem radioaktiven Material markiert
ist, oder eines Enzyms zum Nachweis eines monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörpers, der
an die feste Phase gebunden ist; und ein Verfahren, das folgendes
umfasst: die Zugabe eines Überstands
einer Hybridomkultur zu einer festen Phase, wodurch ein Anti-Immunglobulin-Antikörper oder
Protein A adsorbiert werden kann, und die Zugabe eines β-Amyloids,
das mit einem radioaktiven Material markiert ist, oder eines Enzyms
zum Nachweis eines monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörpers, der
an die feste Phase gebunden ist. Die Selektion und Aufzucht des
monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörpers erfolgt
gewöhnlich
in einem Medium für
Tierzellen, das mit 10–20%
fetalem Kälberserum
ergänzt
ist (zum Beispiel RPMI 1640) und mit HAT (Hypoxanthin, Aminopterin
und Thymidin) versetzt wurde. Der Antikörpertiter des Nybridomkulturüberstands
kann in ähnlicher
Weise bestimmt werden wie bei dem oben genannten Assay für den monoklonalen
Anti-β-Amyloid-Antikörper im
Antiserum.
-
Die Abtrennung und Reinigung der
monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörper erfolgen ähnlich wie
die übliche
Abtrennung und Reinigung von polyklonalen Antikörpern gemäß den Trenn- und Reinigungsverfahren für Immunglobulin
[zum Beispiel Salzfällung,
Alkoholfällung,
isoelektrische Fällung,
Elektrophorese, Adsorption und Desorption mit Ionenaustauschmaterialien
(zum Beispiel DEAE), Ultrazentrifugation, Gelfiltration und spezifische
Reinigung, bei der nur die Antikörper
mit aktiven Adsorptionsmitteln, wie antigenbindenden festen Phasen,
Protein A und Protein G aufgefangen werden]. Weiterhin können das
Hybridom, das die gegenüber einem
Teilbereich des β-Amyloids
reaktiven monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörper produziert,
und das Hybridom, das die gegenüber dem β-Amyloid
reaktiven, aber gegenüber
einem Teilbereich davon unreaktiven monoklonalen Anti-β-Amyloid-Antikörper produziert,
zum Beispiel dadurch selektiert werden, dass man die Bindungseigenschaft
eines Peptids, das dem Teilbereich entspricht, und eines von dem
Hybridom produzierten Antikörpers
bestimmt.
-
Der so erhaltene Antikörper der
vorliegenden Erfindung, der spezifisch reaktiv gegenüber dem
partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
oder des Derivats davon ist, der mit BAN-052a bezeichnete monoklonale
Antikörper,
der mit BAN-50a bezeichnete monoklonale Antikörper und der Antikörper, der spezifisch
reaktiv gegenüber
dem partiellen Peptid im zentralen Teil des β-Amyloids oder des Derivats davon ist,
können
jeweils spezifisch die partiellen Peptide auf der N-terminalen und
der C-terminalen Seite bzw. im zentralen Teil des β-Amyloids
erkennen. Sie können
daher für
die Bestimmung des β-Amyloids
oder des Derivats davon in einer Testlösung, insbesondere für die Bestimmung
durch den Sandwich-Immunoassay, verwendet werden.
-
Die vorliegende Erfindung stellt
nämlich
folgendes bereit:
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- (1) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon in einer Testlösung,
umfassend das kompetitive Umsetzen eines Antikörpers der vorliegenden Erfindung
gegen das β-Amyloid
oder sein Derivat mit der Testlösung
und einem markierten β-Amyloid
oder einem Derivat davon und das Messen des Verhältnisses des markierten β-Amyloids
oder seines Derivats, das an den Antikörper gebunden ist;
- (2) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon in einer Testlösung,
umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen
ein β-Amyloid
oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid
oder Derivat davon und der Testlösung
und dann das Messen der Aktivität
eines Markers auf dem Träger
in dem Verfahren, wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten
Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β- Amyloid oder Derivat
davon um einen Antikörper
handelt, der spezifisch reaktiv gegenüber einem partiellen Peptid
auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
oder des Derivats davon ist, und der jeweils andere ein Antikörper ist,
der ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO: 7 dargestellten
Aminosäuresequenz
(nämlich β-Amyloid
(1-28)) und/oder ein partielles Peptid mit einer durch SEQ ID NO:
10 dargestellten Aminosäuresequenz
(nämlich β-Amyloid
(1-16)) erkennt; und
- (3) ein Verfahren zur Bestimmung eines β-Amyloids oder eines Derivats
davon in einer Testlösung,
umfassend das Umsetzen eines auf einem Träger insolubilisierten Antikörpers gegen
ein β-Amyloid
oder Derivat davon, eines markierten Antikörpers gegen ein β-Amyloid
oder Derivat davon und der Testlösung
und dann das Messen der Aktivität
eines Markers auf dem Träger,
wobei es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen
das β-Amyloid
oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid
oder Derivat davon um einen Antikörper handelt, der spezifisch
reaktiv gegenüber
einem partiellen Peptid in einem zentralen Teil des β-Amyloids
oder des Derivats davon ist, und der jeweils andere ein Antikörper, der ein
partielles Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
oder des Derivats davon erkennt, oder ein Antikörper, der ein partielles Peptid
mit einer durch SEQ ID NO: 7 oder SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz
erkennt, ist.
-
Insbesondere handelt es sich bei
dem Antikörper,
der spezifisch reaktiv gegenüber
dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
oder des Derivats davon ist, um den mit BA-27a, BS-85a oder BC-05a
bezeichneten monoklonalen Antikörper,
bei dem Antikörper,
der das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 7 dargestellten
Aminosäuresequenz
(nämlich β-Amyloid
(1-28)) und/oder
das partielle Peptid mit der durch SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz
(nämlich β-Amyloid
(1-16)) erkennt, um den mit BA-052a oder BAN-50a bezeichneten monoklonalen
Antikörper
und bei dem Antikörper,
der spezifisch reaktiv gegenüber
dem partiellen Peptid im zentralen Teil des β-Amyloids oder des Derivats davon ist,
um den mit BP-90a bezeichneten Antikörper.
-
Besonders bevorzugte Beispiele für die oben
genannten Bestimmungsverfahren (2) sind:
ein Bestimmungsverfahren,
bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen
das β-Amyloid
oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid
oder Derivat davon um den mit BA-27a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt,
der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale
Antikörper
ist und es sich bei dem β-Amyloid
um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
3 oder SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz handelt;
ein
Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten
Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid
oder Derivat davon um den mit BS-85a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt,
der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale
Antikörper
ist und es sich bei dem β-Amyloid
um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:
3 oder SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz handelt; und
ein
Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten
Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder Derivat davon oder bei dem markierten Antikörper gegen das β-Amyloid
oder Derivat davon um den mit BC-05a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt,
der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale
Antikörper
ist und es sich bei dem β-Amyloid
um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz
handelt.
-
Besonders bevorzugte Beispiele für die oben
genannten Bestimmungsverfahren (3) sind:
ein Bestimmungsverfahren,
bei dem es sich entweder bei dem auf dem Träger insolubilisierten Antikörper gegen
das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um den mit BP-90a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt,
der jeweils andere der mit BAN-052a oder BAN-50a bezeichnete monoklonale
Antikörper
ist und es sich bei dem β-Amyloid
oder dem Derivat davon um das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1
dargestellten Aminosäuresequenz,
das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 1 dargestellten Aminosäuresequenz,
das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz,
das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 3 dargestellten Aminosäuresequenz,
das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 4 dargestellten Aminosäuresequenz,
das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 5 dargestellten Aminosäuresequenz
und/oder das Peptid mit der durch SEQ ID NO: 6 dargestellten Aminosäuresequenz
handelt; und
ein Bestimmungsverfahren, bei dem es sich entweder
bei dem auf dem Träger
insolubilisierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
oder bei dem markierten Antikörper
gegen das β-Amyloid
um den mit BP-90a bezeichneten monoklonalen Antikörper handelt,
der jeweils andere der mit BA-27a, BS-85a oder BC-05a bezeichnete
monoklonale Antikörper
ist und es sich bei dem β-Amyloid
oder dem Derivat davon um das Peptid mit der Aminosäuresequenz
handelt, der die 1. bis 16. Aminosäure oder die 1. bis 17. Aminosäure einer
durch eine der Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 6 dargestellten
Aminosäuresequenz
fehlen.
-
Die Bestimmungsverfahren (Immunoassays)
für die β-Amyloide
oder Derivate davon (im folgenden kurz als "β-Amyloide" bezeichnet) der
vorliegenden Erfindung werden im folgenden ausführlicher beschrieben.
-
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung
können
die β-Amyloide
erkennen, so dass die Bestimmung oder der Nachweis der β-Amyloide
durch Gewebefärbung
durchgeführt
werden können.
Für diese
Zwecke können
entweder die Antikörper
selbst oder F(ab')2-,
Fab'- oder Fab-Fraktionen
von Antikörpermolekülen verwendet
werden. Die Messverfahren unter Verwendung der Antikörper der
vorliegenden Erfindung unterliegen keiner besonderen Einschränkung. Jedes
Messverfahren kann verwendet werden, solange die Menge der Antikörper, der
Antigene oder der Antikörper-Antigen-Komplexe,
die der Menge der Antigene (zum Beispiel der Menge der β-Amyloide)
in zu messenden Lösungen
entspre chen, mit chemischen oder physikalischen Mitteln nachgewiesen
und anhand von Standardkurven, die unter Verwendung von Standardlösungen,
die die Antigene in bekannten Mengen enthalten, hergestellt wurden,
berechnet wird. Zum Beispiel werden Nephelometrie, kompetitive Verfahren,
immunometrische Verfahren und Sandwich-Verfahren in geeigneter Weise
verwendet. Im Hinblick auf die Empfindlichkeit und Spezifität ist es
besonders bevorzugt, die unten beschriebenen Sandwich-Verfahren
zu verwenden.
-
Bei Messverfahren unter Verwendung
von Markierungssubstanzen werden Radioisotope, Enzyme, fluoreszente
Substanzen, Iumineszierende Substanzen usw. als Marker Verwendet.
Beispiele für
die Radioisotope sind 125I, 131I, 3N und 14C. Die oben
genannten Enzyme sind vorzugsweise stabil und haben eine hohe spezifische
Aktivität.
Beispiele dafür
sind β-Galactosidase, β-Glucosidase,
Alkalische Phosphatase, Peroxidase und Malat-Dehydrogenase. Beispiele
für die
fluoreszierenden Substanzen sind Fluorescamin und Fluoresceinisothiocyanat.
Zu den Iumineszierenden Substanzen gehören zum Beispiel Luminol; Luminolderivate,
Luciferin und Lucigenin. Weiterhin können auch Biotin-Avidin-Systeme
für die
Bindung der Antikörper
oder der β-Amyloide
an die Marker verwendet werden.
-
Wenn die Antigene oder die Antikörper insolubilisiert
werden, kann entweder physikalische Adsorption oder chemische Bindung,
die gewöhnlich
für die
Insolubilisierung oder Fixierung von Proteinen oder Enzymen verwendet
wird, eingesetzt werden. Beispiele für die Träger sind unlösliche Polysaccharide,
wie Agarose, Dextran und Cellulose, synthetische Harze, wie Polystyrol,
Polyacrylamid und Siliconpolymere, sowie Glas.
-
Bei den Sandwich-Verfahren werden
die Testlösungen
mit den insolubilisierten Anti-β-Amyloid-Antikörpern umgesetzt
(die erste Reaktion), weiterhin werden die markierten Anti-β-Amyloid-Antikörper umgesetzt (die
zweite Reaktion), und dann wird die Aktivität der Marker auf den insolubilisierten
Trägern
bestimmt, wodurch die Menge der β-Amyloide
in den Testlösungen
bestimmt werden kann. Die erste Reaktion und die zweite Reaktion
können
gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden. Die Marker und
die Insolubilisierungsverfahren können gemäß den oben beschriebenen verwendet
werden. Weiterhin sind bei den Immunoassays durch Sandwich-Verfahren
die als Antikörper
für feste
Phasen verwendeten Antikörper
oder die zum Markieren verwendeten Antikörper nicht notwendigerweise
von derselben Art, sondern zwei oder mehr Arten von Antikörpern können für den Zweck
der Erhöhung
der Messempfindlichkeit usw. auch als Gemisch verwendet werden.
-
In den Verfahren der vorliegenden
Erfindung zum Messen der β-Amyloide
durch die Sandwich-Verfahren sind die in der ersten Reaktion verwendeten
Anti-β-Amyloid-Antikörper vorzugsweise
von denjenigen, die in der zweiten Reaktion verwendet werden, hinsichtlich
der Stellen, an denen die Antikörper
an die β-Amyloide binden,
verschieden. Wenn der in der ersten Reaktion verwendete Antikörper zum
Beispiel das partielle Peptid auf der N-terminalen Seite des β-Amyloids erkennt,
ist der in der zweiten Reaktion verwendete Antikörper vorzugsweise ein Antikörper, der
ein anderes partielles Peptid als das partielle Peptid auf der N-terminalen
Seite erkennt (nämlich
das partielle Peptid auf der C-terminalen Seite).
-
Von den monoklonalen Antikörpern, die
unter Verwendung des β-Amyloids
(1-40) als Immunogen
hergestellt werden, wird zweckmäßigerweise
insbesondere ein Antikörper,
der nicht mit dem β-Amyloid
(1-28) reagiert, als monoklonalen Antikörper verwendet, der spezifisch
reaktiv gegenüber
dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
ist. Die Erfinder entwickelten zwei Arten von Hybridomen, von denen
jedes einen solchen Antikörper
produziert. Die von diesen Hybridomen produzierten Antikörper zeigten
in kompetitiven Enzym-Immunoassays
keine Kreuzreaktion mit dem β-Amyloid
(1-28) unter Verwendung des unten beschriebenen β-Galactosidase-markierten β-Amyloids
(1-40), sie reagierten aber mit dem β-Amyloid (1-40) (Antigenkonzentration,
die B/B0 = 0,5 ergibt: 200 bis 250 nM, 40
bis 50 ng/Napf). Wenn . sie weiterhin in den Sandwich-Verfahren
verwendet wurden, insbesondere in Kombination mit BAN-50a oder BAN-052a
als monoklonale Antikörper,
die unter Verwendung des unten beschriebenen β-Amyloids (1-16) als Immunogen,
das das partielle Peptid auf der N-terminalen Seite des β-Amyloids
erkennt, hergestellt wurden, zeigte das Ergebnis, dass das β-Amyloid
unerwarteterweise mit einer höheren
Empfindlichkeit (Nachweisempfindlichkeit: 0,2 pg/Napf) gemessen
werden konnte. Als monoklonale Antikörper von einer Art, die spezifisch
reaktiv gegenüber
dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
ist und für
die Sandwich-Enzym-Immunoassays der vorliegenden Erfindung geeignet
ist, werden nämlich
zweckmäßigerweise
monoklonale Antikörper
verwendet, die mit dem β-Amyloid
(1-40) reagieren, aber nicht mit dem β-Amyloid (1-28) kreuzreagieren.
Diese Antikörper
erfordern nicht notwendigerweise eine hohe Affinität zu dem β-Amyloid
(1-40). Zum Beispiel wird zweckmäßigerweise
BA-27a als ein solcher Antikörper
verwendet.
-
Als monoklonale Antikörper, die
spezifisch reaktiv gegenüber
dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
sind und die in den Sandwich-Immunoassays
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden weiterhin zweckmäßigerweise
Antikörper
verwendet, die unter Verwendung des β-Amyloids (25-35) als Immunogen
hergestellt wurden. Die Erfinder entwickelten fünf Arten von Hybridomen, die
diese Antikörper
produzieren. Die Antikörper
reagierten in kompetitiven Enzym-Immunoassays unter Verwendung des unten
beschriebenen β-Galactosidase-markierten β-Amyloids
(1-40) mit dem β-Amyloid
(25-35) (Antigenkonzentration, die B/B0 =
0,5 ergibt: 20 nM, 1 ng/Napf) und reagierten auch mit dem β-Amyloid
(1-40) (Antigenkonzentration, die B/B0 =
0,5 ergibt: 800 nM, 160 ng/Napf). Weiterhin ergibt die Kombination
der Antikörper
mit BAN-50a oder BAN-052a unerwarteterweise eine höhere Empfindlichkeit
(Nachweisempfindlichkeit: 3 pg/Napf). In den Sandwich-Enzym-Immunoassays
der vorliegenden Erfindung werden nämlich zweckmäßigerweise
monoklonale Antikörper
gegen das β-Amyloid
(25-35) als monoklonale Antikörper
verwendet, die spezifisch reaktiv gegenüber dem partiellen Peptid auf
der C-terminalen Seite des β-Amyloids
sind. Diese Antikörper
erfordern nicht notwendigerweise eine hohe Affinität zu dem β-Amyloid
(1-40). Zum Beispiel wird BS-85a zweckmäßigerweise als ein solcher
Antikörper
verwendet.
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In den Sandwich-Verfahren, bei denen
BS-85a mit BAN-50a oder BAN-052a kombiniert wurde oder BA-27a mit
BAN-50a oder BAN-052a kombiniert wurde, wurde keine Kreuzreaktivität mit dem β-Amyloid
(1-28) beobachtet.
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Als monoklonale Antikörper, die
spezifisch reaktiv gegenüber
dem partiellen Peptid auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
sind und die in den Sandwich-Immunoassays
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden weiterhin zweckmäßigerweise
Antikörper
verwendet, die unter Verwendung des β-Amyloids (35-43) als Immunogen
hergestellt wurden. Die Erfinder stellten achtzehn Arten von Hybridomen
her, die diese Antikörper
produzieren. Von diesen zeigten vier Arten von Antikörpern in
kompetitiven Enzym-Immunoassays unter Verwendung des unten beschriebenen
Peroxidase-markierten β-Amyloids
(35-43) eine hohe Reaktivität gegenüber β-Amyloid-Fraktionen
(Ameisensäureextrakte),
die nach dem Verfahren von Mori et al. [J. Biol. Chem., 267, 17082–17086 (1988)]
aus den Gehirnen der Patienten mit Alzheimer-Krankheit extrahiert
wurden, während
sie keine Reaktivität
gegenüber
einem synthetisierten β-Amyloid
(1-40) zeigten. Die Verwendung dieser Antikörper in den Sandwich-Verfahren in einer
Kombination mit BAN-50a zeigte, dass die in den oben genannten Ameisensäurenextrakten
aus den Gehirnen der Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthaltenen β-Amyloide
mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen wurden und dass das β-Amyloid
(1-40) überhaupt
nicht nachgewiesen wurde. Die Massenspektrometrie wies darauf hin,
dass die in den Ameisensäurenextrakten
aus den Gehirnen der Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthaltenen β-Amyloide hauptsächlich aus
dem β-Amyloid
(1-42) bestanden und dass sie weiterhin molekulare Spezies enthielten,
denen sukzessive N-terminate Teile fehlten, einschließlich des β-Amyloids
(3-42), das Pyroglutaminsäure
an der Nterminalen Position aufweist, des β-Amyloids (2-42) und des β-Amyloids
(4-42).
-
Als monoklonale Antikörper, die
das partielle Peptid auf der N-terminalen Seite des β-Amyloids
erkennen und die in den Sandwich-Immunoassays der vorliegenden Erfindung
verwendet werden, werden andererseits zweckmäßigerweise Antikörper verwendet,
die unter Verwendung des β-Amyloids
(1-16) als Immunogen hergestellt wurden. Die Erfinder stellten acht
Arten von Hybridomen her, die diese Antikörper produzieren. Die Reaktivität dieser
Antikörper
gegenüber β-Amyloid (1-40) wurde
durch kompetitive Verfahren unter Verwendung des unten beschriebenen
Peroxidase-markierten β-Amyloids
(1-16) untersucht. Als Ergebnis zeigten vier Arten von Antikörpern eine
gute Reaktivität
gegenüber
dem β-Amyloid (1-40) (Antigenkonzentration,
die B/B0 = 0,5 ergibt: 25 bis 70 nM, 5 bis
15 ng/Napf). Wenn diese Antikörper
auf die Sandwichverfahren angewendet wurden, wurde weiterhin unerwarteterweise
ein großer
Unterschied in der Empfindlichkeit zwischen diesen Antikörpern beobachtet.
Der monoklonale Antikörper
BAN-052a ergab nämlich
im Vergleich zu drei anderen Arten von Antikörpern (BAN-11a, BAN-20a und
BAN-30a) hervorragende hochempfindliche Sandwich-Bestimmungsverfahren.
Dann wurden sechzehn Arten von Antikörpern neu hergestellt, um monoklonale
Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörper zu
selektieren, die für
die Sandwich-Verfahren besser geeignet sind, und nach den kompetitiven
Verfahren unter Verwendung von Peroxidase-markiertem β-Amyloid
(1-16) untersucht.
Als Ergebnis zeigten von diesen Antikörpern zehn Arten eine gute
Reaktivität
gegenüber β-Amyloid
(1-40). Insbesondere ergab BAN-50a unter anderem äußerst hochempfindliche
Sandwich-Bestimmungsverfahren. In der vorliegenden Erfindung werden
nämlich
mehrere Arten von Antikörpern
gegenüber
dem β-Amyloid
(1-16) als Antikörper bereitgestellt,
die für
die Sandwich-Verfahren geeignet sind und die das partielle Peptid
auf der Nterminalen Seite des β-Amyloids
erkennen, und insbesondere werden zweckmäßigerweise BAN-50a und BAN-052a
verwendet.
-
Als monoklonale Antikörper, die
das partielle Peptid im zentralen Teil des β-Amyloids erkennen und die in den Sandwich-Immunoassays
der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden weiterhin zweckmäßigerweise
Antikörper
verwendet, die unter Verwendung des durch SEQ ID NO: 12 dargestellten β-Amyloids (18-28)
als Immunogen hergestellt wurden. Die Erfinder stellten neun Arten
von Hybridomen her, die diese Antikörper produzieren. Insbesondere
geeignet sind die monoklonalen Antikörper BP-01a, BP-02a, BP-03a
und BP-90a, die von den vier Hybridomen BP-01, BP-02, BP-03 und
BP-90 produziert werden, und BP-03a und BP-90a können auch das durch SEQ ID
NO: 11 dargestellte β- Amyloid (17-28) erkennen.
Von diesen monoklonalen Antikörpern
ist BP-90a besonders gut geeignet.
-
Die monoklonalen Antikörper der
vorliegenden Erfindung können
auch in anderen Assaysystemen als den Sandwichverfahren verwendet
werden, zum Beispiel in kompetitiven Verfahren, immunometrischen
Verfahren und in der Nephelometrie. Bei den kompetitiven Verfahren
werden Antigene in Testlösungen
und markierte Antigene kompetitiv mit den Antikörpern umgesetzt, und anschließend erfolgt
eine Abtrennung der nicht umgesetzten markierten Antigene (F) von
den markierten Antigenen (B), die an die Antikörper gebunden sind (B/F-Trennung).
Dann wird die markierte Menge entweder von B oder von F gemessen,
um die Menge der Antigene in den Testlösungen zu bestimmen. Zu diesen
Reaktionsverfahren gehören
Flüssigphasenverfahren, bei
denen lösliche
Antikörper
als Antikörper
verwendet werden und Polyethylenglycol und die zweiten Antikörper gegen
die oben genannten Antikörper
für die
B/F-Trennung verwendet werden, und Verfestigungsverfahren, bei denen
verfestigte Antikörper
als erste Antikörper
verwendet werden oder lösliche
Antikörper
als erste Antikörper
verwendet werden und verfestigte Antikörper als zweite Antikörper verwendet
werden.
-
Bei den immunometrischen Verfahren
werden Antigene in Testlösungen
und verfestigte Antigene kompetitiv mit festen Mengen von markierten
Antikörpern
umgesetzt, und anschließend
erfolgt eine Trennung der festen Phasen von den flüssigen Phasen,
oder Antigene in Testlösungen
werden mit überschüssigen markierten
Antikörpern
umgesetzt, und dann werden verfestigte Antikörper hinzugefügt, damit
die nicht umgesetzten markierten Antikörper an feste Phasen binden
können,
und anschließend
werden die festen Phasen von den flüssigen Phasen getrennt. Dann
wird die markierte Menge beider Phasen gemessen, um die Menge der
Antigene in den Testlösungen
zu bestimmen.
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Bei der Nephelometrie wird die Menge
der unlöslichen
Niederschläge
gemessen, die als Ergebnis einer Antigen-Antikörper-Reaktion in Gelen oder
Lösungen
entstehen. Selbst wenn die Menge der Antigene in Testlösungen nur
gering ist und die Niederschläge
nur in kleinen Mengen erhalten werden, wird zweckmäßigerweise
Laser-Nephelometrie unter Verwendung von Laserstreuung verwendet.
-
Wenn diese immunologischen Assays
auf die vorliegende Erfindung angewendet werden, müssen keine
besonderen Bedingungen und Operationen entwickelt werden. Das gewöhnliche
Fachverständnis
des Fachmanns kann gewöhnlichen
Bedingungen und Operationen bei den jeweiligen Assays hinzugefügt werden, um
Assaysysteme für
die β-Amyloide
aufzubauen. Wegen Einzelheiten dieser allgemeinen technischen Mittel kann
auf Übersichtsartikel
und Bücher
verwiesen werden [zum Beispiel Radioimmunoassays, herausgegeben von
N. Irie (Verlag Kodansha, 1974), Radioimmunoassays, zweite Serie,
N. Irie N. Irie (Verlag Kodansha, 1979), KOSO MENEKI SOKUTEIHO (Enzyme
Immunoassays), herausgegeben von E. Ishikawa et al. (Verlag Igaku
Shoin, 1978), KOSO MENEKI SOKUTEIHO (Enzyme Immunoassays) (zweite
Auflage, herausgegeben von E. Ishikawa et al. (Verlag Igaku Shoin,
1982), KOSO MENEKI SOKUTEIHO (Enzyme Immunoassays) (dritte Auflage),
herausgegeben von E. Ishikawa et al. (Verlag Igaku Shoin, 1987),
Methods in ENZYMOLOGY, Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part
A), Verlag Academic Press, Ioc. zit., Vol. 73 (Immunochemical Techniques
(Part B), Ioc. zit., Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C),
Ioc. zit., Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected
Immunoassays), Ioc. zit., Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part
E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods), und Ioc.
zit., Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology
and Monoclonal Antibodies)]. Wenn die Assaysysteme für die β-Amyloide
gemäß den Sandwich-Immunoassays
der vorliegenden Erfindung aufgebaut sind, sind sie dementsprechend
nicht auf die unten beschriebenen Beispiele beschränkt.
-
Wie oben beschrieben, können die
Antikörper
der vorliegenden Erfindung die β-Amyloide oder deren Derivate
mit hoher Empfindlichkeit bestimmen, so dass sie als Diagnostikmittel
für die
Alzheimer-Krankheit geeignet sind.
-
Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
-
1 ist
eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt,
die mit dem β-Amyloid
(1-40) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch β-Gal-markiertes β-Amyloid (1-40)
bestimmt wird;
-
2 ist
eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt,
die mit dem β-Amyloid
(25-35) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch β-Gal-markiertes β-Amyloid (1-40)
bestimmt wird;
-
3 ist
eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt,
die mit dem β-Amyloid
(1-16) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch HRP-markiertes β-Amyloid (1-16)
bestimmt wird;
-
4 ist
eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für den Antikörpertiter von Mäusen zeigt,
die mit dem β-Amyloid
(35-43) immunisiert wurden, wobei der Antikörpertiter durch HRP-markiertes β-Amyloid (35-43)
bestimmt wird;
-
5 zeigt
typische Beispiele für
die Durchmusterung von Hybridomen nach der Zellfusion. (a) ist ein Fall,
bei dem mit β-Amyloid
(1-40) immunisierte Mäuse
verwendet wurden, (b) ist ein Fall, bei dem mit β-Amyloid (25-35) immunisierte
Mäuse verwendet
wurden, (c) ist ein Fall, bei dem mit β-Amyloid (1-16) immunisierte Mäuse verwendet
wurden, und (d) ist ein Fall, bei dem mit β-Amyloid (35-43) immunisierte Mäuse verwendet wurden;
-
6(a) ist
eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für die Reaktivität des monoklonalen
Antikörpers
BA-27a, der unter Verwendung des β-Amyloids
(1-40) als Immunogen hergestellt wurde, gegenüber dem β-Amyloid (1-40)
Reaktivität nach einem
kompetitiven EIA-Verfahren unter Verwendung des β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) bestimmt wurde,
und
6(b) ist eine Graphik, die in ähnlicher
Weise die Ergebnisse eines Assays für die Reaktivität des monoklonalen
Antikörpers
BS-85a, der unter Verwendung des β-Amyloids
(25-35) als Immunogen hergestellt wurde, zeigt, wobei diese Reaktivität nach einem
kompetitiven EIA-Verfahren unter Verwendung des β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) bestimmt
wurde;
-
die
7(a) und
7(b) sind Graphiken, die jeweils die Ergebnisse
eines Assays für
die Reaktivität
der monoklonalen Antikörper
BAN-052a und BAN-50a, die unter Verwendung des β-Amyloids (1-16) als Immunogen
hergestellt
kompetitiven EIA-Verfahren
unter Verwendung des HRP-markierten β-Amyloids (1-16) bestimmt wurde;
-
8 ist
eine Graphik, die die Ergebnisse eines Assays für die Reaktivität von
kompetitiven EIA-Verfahren
unter Verwendung des HRP-markierten β-Amyloids (1-16) untersucht
wurde;
-
9 ist
eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in einem Sandwich-EIA
zeigt, wobei BS-85a-HRP als enzymmarkierter Antikörper
Antikörper für teste Phasen verwendet wurden;
-
10 ist
eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in einem Sandwich-EIA
zeigt, wobei BA-27a-HRP als enzymmarkierter Antikörper
Antikörper für feste Phasen verwendet wurden;
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11 ist
eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in einem Sandwich-EIA
zeigt, wobei BAN-052a-HRP als enzymmarkierter Antikör-
-
-
12 ist
eine Graphik, die die Standardkurven für das β-Amyloid (1-40) in
als enzymmarkierte Antikörper und
BAN-052a als Antikörper
für feste
Phasen verwendet wurden;
BS-85a-HRP,
(b) BA-27a-HRP bzw. (c) BC-05a-HRP als enzymmarkierte Antikörper und
BAN-50a als Antikörper
für feste
Phasen verwendet wurden;
-
16 zeigt
die Ergebnisse eines Assays für
die immunologische Aktivität
von β-Amyloid-Fraktionen, die
durch Umkehrphasen-HPLC aus dem Liquor von Patienten mit Alzheimer-Krankheit
eluiert wurden, wobei die immunologische Aktivität durch ein Sandwich-EIA bestimmt
wird, wobei (a) BS-85a-HRP und (b) BA-27a-HRP als enzymmarkierte
Antikörper
und BAN-50a als Antikörper
für feste
Phasen verwendet wurden;
-
17 zeigt
die Ergebnisse einer Fraktionierung von β-Amyloid-Fraktionen, die von
Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen (Ameisensäureextrakte),
durch Umkehrphasen-HPLC (Nachweiswellenlänge: 210 nm) nach einer partiellen
Reinigung durch Gelfiltration;
-
18 zeigt
die Massenspektren von (a) Nr. 35, (b) Nr. 41 und (c) Nr. 43 der
eluierten Fraktionen der Umkehrphasen-HPLC in 17 von β-Amyloid-Fraktionen, die von den Gehirnen von
Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen (Ameisensäureextrakte);
und
-
19 zeigt
die Ergebnisse einer Bestimmung der eluierten Fraktionen der Umkehrphasen-HPLC
in 17 von β-Amyloid-Fraktionen,
die von den Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen (Ameisensäureextrakte),
wobei die Bestimmung mit einem Sandwich-EIA durchgeführt wurde,
wobei (a) BS-85a-HRP, (b) BA-27a-HRP und (c) BC-05a-HRP als enzymmarkierte
Antikörper
und BAN-50a als Antikörper
für feste
Phasen verwendet wurden.
-
Beste Methode
zur Durchführung
der Erfindung
-
Beispiele
-
[Beispiel 1] Herstellung
von Antigenen
-
(1) Herstellung des β-Amyloids
(1-40)
-
Das β-Amyloid (1-40) wurde synthetisiert,
indem man 0,71 g (0,5 mmol) eines kommerziell erhältlichen Boc-Val-OCH2-PAM-Harzes (Applied Biosystems) mit einem
Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems) verwendete. Die
Boc-Gruppe an dem Harz wurde mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid
behandelt, um die Aminogruppe von der Schutzgruppe zu befreien.
Dann wurden 2-mmol-Portionen Boc-Gly, Boc-Val, Boc-Met, Boc-Leu,
Boc-Ile, Boc-Ala, Boc-Lys(Cl-Z),
Boc-Asn, Boc-Asp(OcHex), Boc-Glu(OcHex), Boc-Phe, Boc-Gln, Boc-His(Bom), Boc-Tyr(Br-Z),
Boc-Ser(Bzl) und Boc-Arg(Tos) mit HOBt/DCC aktiviert und gemäß der Aminosäuresequenz
des β-Amyloids
(1-40) miteinander konden siert, wobei man 2,70 g eines geschützten β-Amyloid-(1-40)-OCH2-PAM-Harzes erhielt. Das resultierende geschützte β-Amyloid-(1-40)-OCH2-PAM-Harz (0,56 g) wurde 60 Minuten lang
bei 0°C
mit 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von p-Cresol
behandelt, und anschließend
wurde überschüssiger Fluorwasserstoff
durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand
wurde zweimal mit 10 ml Ether gewaschen und dann mit 50%iger wässriger
Essigsäure
extrahiert. Das unlösliche
Material wurde durch Filtration entfernt, und anschließend wurde
mit 50%iger wässriger
Essigsäure
gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, und
die kombinierte Lösung
wurde unter reduziertem Druck auf 2 bis 3 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde
einer Chromatographie auf einer Sephadex-G-25-Säule (2,0 × 85 cm) unterzogen, die mit 50%iger
wässriger
Essigsäure
beladen und mit demselben Lösungsmittel
entwickelt wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert,
wobei man etwa 150 mg eines gelblichweißen Pulvers erhielt. Dieses
wurde in 50 ml 20%igem wässrigem
Acetonitril (das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt) aufgelöst, und
die resultierende Lösung
wurde einer Chromatographie auf einer LiChroprep-RP-18-Säule (4,1 × 10 cm)
unterzogen, die mit demselben Lösungsmittel
gefüllt
war, wobei die Säule
mit einem linearen Gradienten von 20% bis 70% wässrigem Acetonitril (das 0,1%
Trifluoressigsäure
enthielt) eluiert wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen
und wiederum einer Chromatographie auf einer LiChroprep-RP-18-Säule (2,6 × 6 cm)
unterzogen, wobei die Säule
mit einem linearen Gradienten von 0% bis 50% wässrigem Acetonitril (das 0,1%
Trifluoressigsäure
enthielt) eluiert wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen
und lyophilisiert, wobei man 10 mg eines weißen Pulvers erhielt.
-
Analyse der Aminosäuren:
(M + H)
+ durch
Massenspektrometrie: 4328,05
HPLC-Elutionszeit: 22,8 Minuten
-
Säulenbedingungen:
-
Säule:
Wakosil-5C18 HG (4,6 × 100
mm)
Eluenten: A (0,1% wässrige
Trifluoressigsäure)
B
(Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
Elution mit einem
linearen Gradienten von Eluent A zu Eluent B (während 50 Minuten)
Fließgeschwindigkeit:
1,0 ml/min
-
(2) Herstellung des [Cysl7]-β-Amyloids
(1-16)
-
Das [Cys17]-β-Amyloid
(1-16) wurde synthetisiert, indem man 0,75 g (0,5 mmol) eines kommerziell
erhältlichen
Boc-Cys(MeBzl)-OCH2-PAM-Harzes (Applied
Biosystems) mit einem Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems)
verwendete. Die Boc-Gruppe an dem Harz wurde mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid
behandelt, um die Aminogruppe von der Schutzgruppe zu befreien.
Dann wurden 2-mmol-Portionen Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Gln, Boc-His(Bom), Boc-Val,
Boc-Glu(OcHex), Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Gly, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asp(OcHex), Boc-Arg(Tos)
und Boc-Phe mit HOBt/DCC aktiviert und gemäß der Aminosäuresequenz
des [Cysl7]-β-Amyloids (1-16) miteinander
kondensiert, wobei man 1,90 g eines geschützten [Cysl7]-β-Amyloid-(1-16)-(MeBzl)-OCH2-PAM-Harzes
erhielt. Das resultierende geschützte
[Cysl7]-β-Amyloid-(1-16)(MeBzl)-OCH2-PAM-Harz (0,68 g) wurde 60 Minuten lang
bei 0°C
mit 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von p-Cresol
behandelt, und anschließend
wurde überschüssiger Fluorwasserstoff
durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand
wurde zweimal mit 10 ml Ether gewaschen und dann mit 50%iger wässriger
Essigsäure
extrahiert. Das unlösliche
Material wurde durch Filtration entfernt, und anschließend wurde
mit 50%iger wässriger
Essigsäure
gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, und
die kombinierte Lösung
wurde unter reduziertem Druck auf 1 bis 2 ml konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde
einer Chromatographie auf einer Sephadex-G-25-Säule (2,0 × 85 cm) unterzogen, die mit 50%iger
wässriger
Essigsäure
gefüllt
und mit demselben Lösungsmittel
entwickelt wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert,
wobei man 136,7 mg eines weißen
Pulvers erhielt.
-
Analyse der Aminosäuren:
(M + H)
+ durch
Massenspektrometrie: 2056,83
HPLC-Elutionszeit: 14,8 Minuten
-
Säulenbedingungen:
-
Säule:
Wakosil-5C18 HG (4,6 × 100
mm)
Eluenten: A (0,1% wässrige
Trifluoressigsäure)
B
(Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
Elution mit einem
linearen Gradienten von Eluent A zu Eluent B (während 50 Minuten)
Fließgeschwindigkeit:
1,0 ml/min
-
(3) Herstellung des β-Amyloids
(25-35)
-
Das β-Amyloid (25-35) wurde synthetisiert,
indem man 0,66 g (0,5 mmol) eines kommerziell erhältlichen
Boc-Met-OCH2-PAM-Harzes (Applied Biosystems)
mit einem Peptidsynthesizer (Model 430A, Applied Biosystems) verwendete.
Die Boc-Gruppe an dem Harz wurde mit 50% Trifluoressigsäure/Methylenchlorid
behandelt, um die Aminogruppe von der Schutzgruppe zu befreien.
Dann wurden 2-mmol-Portionen Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Ile, Boc-Ala,
Boc-Lys(Cl-Z), Boc-Asn und Boc-Ser(Bzl) mit HOBt/DCC aktiviert und
gemäß der Aminosäuresequenz
des β-Amyloids
(25-35) miteinander kondensiert, wobei man 1,14 g eines geschützten β-Amyloid-(25-35)-OCH2-PAM-Harzes erhielt. Das resultierende geschützte β-Amyloid-(25-35)-OCH2-PAM-Harz (0,61 g) wurde 60 Minuten lang
bei 0°C
mit 10 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff in Gegenwart von p-Cresol
behandelt, und anschließend
wurde überschüssiger Fluorwasserstoff
durch Destillation unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand
wurde zweimal mit 10 ml Ether gewaschen und dann mit 50%iger wässriger
Essigsäure
extrahiert. Das unlösliche
Material wurde durch Filtration entfernt, und anschließend wurde
mit 50%iger wässriger
Essigsäure
gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen wurden vereinigt, und
die kombinierte Lösung
wurde unter reduziertem Druck auf 2 bis 3 ml konzentriert. Die konzentrierte
Lösung
wurde mit 50 ml 0,1%iger wässriger
Trifluoressigsäure
verdünnt
und dann einer Chromatographie auf einer LiChroprep-RP-18-Säule (2,6 × 10 cm),
die mit 0,1%iger wässriger
Trifluoressigsäure
gefüllt
war, unterzogen, wobei die Säule
mit einem linearen Gradienten von 0% bis 50% wässrigem Acetonitril (das 0,1% Trifluoressigsäure enthielt)
eluiert wurde. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert,
wobei man 100 mg eines weißen
Pulvers erhielt. Dieses Pulver wurde in 0,5 ml N-Essigsäure aufgelöst und einer Chromatographie
auf einer mit demselben Lösungsmittel
gefüllten
Sephadex-LH-20-Säule
(1,0 × 96
cm) unterzogen. Die Hauptfraktionen wurden aufgefangen und lyophilisiert,
wobei man 91 mg eines weißen
Pulvers erhielt.
-
Analyse der Aminosäuren:
(M + H)
+ durch
Massenspektrometrie: 2056,83
HPLC-Elutionszeit: 18,9 Minuten
-
Säulenbedingungen:
-
Säule:
Wakosil-5C18 HG (4,6 × 100
mm)
Eluenten: A (0,1% wässrige
Trifluoressigsäure)
B
(Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
Elution mit einem
linearen Gradienten von Eluent A zu Eluent B (während 50 Minuten)
Fließgeschwindigkeit:
1,0 ml/min
-
(4) Herstellung des [Cys34]-β-Amyloids
(35-43)
-
Ein Fmoc-Thr(tBu)-Wang-Harz (0,46
g: 0,25 mmol, Watanabe Kagaku) wurde als Ausgangsstoff verwendet.
Nach der Entfernung der Fmoc-Schutzgruppe mit einer 20% Piperidin-DMF-Lösung wurde
die Peptidkette von der C-terminalen Seite her nach dem DCC-HOBt-Verfahren
nach und nach verlängert,
wobei man eine Fmoc-Aminosäurederivat-Kartusche
(1,0 mmol, Applied Biosystems) verwendete. So wurden 0,73 g eines
geschützten
Peptidharzes erhalten, das durch die folgende Formel dargestellt
wird:
-
Dann wurden 0,75 g Phenol, 0,25 ml
Butandithiol, 0,5 ml Thioanisol, 0,5 ml entionisiertes Wasser und 10
ml Trifluoressigsäure
unter Eiskühlung
zu 0,58 g (0,20 mmol) dieses Peptidharzes gegeben, und das Gemisch
wurde 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Harz wurde durch Filtration
entfernt, und das Filtrat wurde konzentriert. Ether wurde unter
Eiskühlung
zu dem Rückstand
gegeben, und ein Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt.
Nach gründlichem
Waschen mit Ether wurde der Niederschlag getrocknet, wobei man ein
weißes
Pulver erhielt.
-
Ausbeute: 168 mg (89%)
(M +
H)+ durch Massenspektrometrie: 949,5 (theoretischer
Wert = 949,5)
-
(5) Herstellung des β-Amyloids
(1-38) und des β-Amyloids
(1-39)
-
Das β-Amyloid (1-40) wurde restriktiv
mit Carboxypeptidase Y hydrolysiert, wodurch das β-Amyloid (1-38)
und das β-Amyloid
(1-39) hergestellt wurden. Das heißt, 50 μg des β-Amyloids (1-40) (Bachem) und
0,5 μg Carboxypeptidase
Y (Oriental Yeast Co., Ltd.) wurden in 0,5%igem wässrigem
Ammoniumacetat gelöst,
so dass die Lösung
auf 60 μl
gebracht wurde, und anschließend
erfolgte eine zweistündige
Reaktion bei 10°C. Nach
der Reaktion wurde. das Produkt durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung
einer Vydac-C4-Säule (The
Sep/a/ra/tions Group) fraktioniert, und drei Hauptpeaks, die durch
UV-Licht (210 nm) nachgewiesen wurden, wurden durch Massenspektrometrie
identifiziert.
-
Säulenbedingungen:
-
Säule:
Vydac C4 (The Sep/a/ra/tions Group, 4,6 × 250 mm)
Eluenten: A
(5% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
B (80% Acetonitril,
das 0,1% Trifluoressigsäure
enthält)
Elutionsverfahren:
Die Konzentration von Eluent B wurde zuerst 5 Minuten lang auf 30%
gehalten und dann 60 Minuten lang linear auf 30–50% erhöht.
Fließgeschwindigkeit:
0,5 ml/min
-
(M + H)+ durch
Massenspektrometrie:
-
4132,9: β-Amyloid (1-38) (theoretischer
Wert = 4132,6)
4231,6: β-Amyloid
(1-39) (theoretischer Wert = 4231,8)
4330,9: β-Amyloid
(1-40) (theoretischer Wert = 4330,9)
-
[Beispiel 2] Herstellung
von Immunogenen (
-
1) Herstellung des Immunogens,
das das β-Amyloid
(1-40) umfasst
-
Ein Komplex des im oben beschriebenen
Beispiel 1 (1) erhaltenen β-Amyloids
(1-40) mit Rinder-Thyroglobulin
(BTG) wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 0,6
mg des β-Amyloids
(1-40) wurden in 1,1 ml 3 mM Phosphatpuffer (pH 6,5), der 15% DMF
enthielt, gelöst,
und dann wurden 2,5 mg BTG, die in 0,5 ml Wasser gelöst waren,
hinzugefügt.
Weiterhin wurde Glutaraldehyd hinzugefügt, so dass man eine Endkonzentration
von 0,3% erhielt, und anschließend
erfolgte eine dreistündige
Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt
2 Tage lang bei 4°C
gegen physiologische Kochsalzlösung
dialysiert.
-
(2) Herstellung des Immunogens,
das das β-Amyloid
(25-35) enthält
-
Ein Komplex des im oben beschriebenen
Beispiel 1 (3) erhaltenen β-Amyloids
(25-35) mit BTG wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das
heißt,
0,5 mg des β-Amyloids
(25-35) und 2,5 mg BTG wurden in 1 ml Wasser gelöst, das auf pH 4,5 eingestellt
war, und weiterhin wurde Glutaraldehyd hinzugefügt, so dass man eine Endkonzentration
von 0,4% erhielt, und anschließend
erfolgte eine dreistündige
Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt
2 Tage lang bei 4°C
gegen physiologische Kochsalzlösung dialysiert.
-
(3) Herstellung des Immunogens,
das das β-Amyloid
(1-16) enthält
-
Ein Komplex des im oben beschriebenen
Beispiel 1 (2) erhaltenen [Cysl7]-β-Amyloids (1-16) mit
BTG wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 20 mg
BTG wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,9) gelöst, und
die resultierende Lösung
wurde mit 100 μl
einer DMF-Lösung
gemischt, die 2,2 mg (8 μmol)
N-(γ-Maleinimidobutyryloxy)succinimid
(GMBS) enthielt, und anschließend
erfolgte eine 40-minütige Reaktion
bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer
Sephadex-G-25-Säule
fraktioniert. Dann wurden 15 mg BTG mit eingeführter Maleinimidgruppe mit
3,6 mg des [Cysl7]-β-Amyloids (1-16) gemischt, und anschließend erfolgte
eine zweitägige
Reaktion bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde das Produkt 2 Tage lang bei 4°C gegen physiologische
Kochsalzlösung
dialysiert.
-
(4) Herstellung des Immunogens,
das das β-Amyloid
(35-43) enthält
-
Ein Komplex des in Beispiel 1 (4)
erhaltenen [Cys34]-β-Amyloids (35-43) mit Rinderserumalbumin (BSA)
wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das heißt, 21 mg
(0,31 μmol)
BSA wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gelöst, und
die resultierende Lösung
wurde mit 100 μl
einer DMF-Lösung
gemischt, die 3,5 mg (12,5 μmol)
GMBS enthielt, und anschließend
erfolgte eine 35-minütige
Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt
auf einer Sephadex-G-25-Säule
fraktioniert. Dann wurden 4,5 mg BSA mit eingeführter Maleinimidgruppe mit
2,1 mg des [Cys34]-β-Amyloids (35-43) gemischt,
und anschließend
erfolgte eine Reaktion über
Nacht bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde das Produkt 2 Tage lang bei 4°C gegen physiologische
Kochsalzlösung
dialysiert.
-
(5) Herstellung des Immunogens,
das das β-Amyloid
(18-28) enthält
-
Ein Komplex des [Cys29]-β-Amyloids
(18-28) mit BTG wurde hergestellt und als Immunogen verwendet. Das
heißt,
21 mg BTG wurden in 1,5 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,9) gelöst, und
die resultierende Lösung
wurde mit 100 μl
einer DMF-Lösung
gemischt, die 2,4 mg (8,4 μmol)
GMBS enthielt, und anschließend erfolgte
eine 40-minütige
Reaktion bei Raumtemperatur. Nach der Reaktion wurde das Produkt
auf einer Sephadex-G-25-Säule
fraktioniert. Dann wurden etwa 7 mg BTG mit eingeführter Maleinimidgruppe
mit 2,0 mg des [Cys29]-β-Amyloids (18-28) (Accord) gemischt,
und anschließend
erfolgte eine Reaktion über
Nacht bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde das Produkt 3 Tage lang bei 4°C gegen physiologische
Kochsalzlösung
dialysiert.
-
[Beispiel 3] Immunisierung
-
Sechs bis acht Wochen alte weibliche
BALB/c-Mäuse
wurden subkutan mit etwa 80 μg/Maus
jedes der im oben beschriebenen Beispiel 2 erhaltenen Immunogene,
dem β-Amyloid-(1-40)-BTG-Komplex,
dem β-Amyloid-(25-35)-BTG-Komplex,
dem β-Amyloid-(1-16)-BTG-Komplex,
dem β-Amyloid-(35-43)-BSA-Komplex
und dem β-Amyloid-(18-28)-BTG-Komplex,
zusammen mit Freunds vollständigem
Adjuvans immunisiert. Danach wurden die Mäuse zusätzlich zwei- bis dreimal in
dreiwöchigen
Abständen
mit derselben Dosis jedes der Immunogene zusammen mit Freunds unvollständigem Adjuvans
immunisiert.
-
[Beispiel 4] Herstellung
von enzymmarkierten Antigenen
-
(1) Herstellung von mit β-D-Galactosidase
(β-Gal)
markiertem β-Amyloid
(1-40)
-
In 40 μl DMSO wurden 70 μg (16 nmol) β-Amyloid
(1-40) gelöst,
und 160 nmol (10 μl
DMSO-Lösung) Triethylamin
sowie 23 nmol (7 μl
DMSO-Lösung)
N-Succinimidyl-3-(2-pyrimidyldithio)propionat
(SPDP) wurden hinzugefügt,
und anschließend
erfolgte eine 90-minütige
Reaktion bei Raumtemperatur. Die Gesamtmenge der Reaktionslösung wurde
zu 1,7 mg (3,3 nmol) β-Gal
(für Enzym-Immunoassay,
Boehringer Mannheim), das in 0,45 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5)
gelöst
war, gegeben, und anschließend
erfolgte eine eintägige Reaktion
bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule (LKB-Pharmacia) fraktioniert,
wobei man β-Gal-markiertes β-Amyloid (1-40) erhielt.
-
(2) Herstellung von mit
Meerrettich-Peroxidase (HRP) markiertem β-Amyloid (1-16)
-
Das in dem oben beschriebenen Beispiel
1 (2) erhaltene [Cysl7]-β-Amyloid (1-16) wurde mit HRP (für Enzym-Immunoassay, Boehringer
Mannheim) vernetzt, so dass ein markiertes Material für den Enzym-Immunoassay
(EIA) hergestellt wurde. Das heißt, 5 mg (125 nmol) HRP wurden
in 0,95 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8) gelöst, und die resultierende Lösung wurde
mit 50 μl
einer DMF-Lösung
gemischt, die 3,6 mg (1,3 μmol) GMBS
enthielt, und anschließend
erfolgte eine 30-minütige
Reaktion bei 4°C.
Danach wurde das Reaktionsprodukt auf einer Sephadex-G-25-Säule fraktioniert.
Dann wurden 3,3 mg (78 nmol) HRP mit eingeführter Maleinimidgruppe mit
0,56 mg (270 nmol) des [Cysl7]-β-Amyloids
(1-16) gemischt, und anschließend
erfolgte eine eintägige
Reaktion bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule (LKB-Pharmacia) fraktioniert,
wobei man HRP-markiertes β-Amyloid
(1-16) erhielt.
-
(3) Herstellung von HRP-markiertem β-Amyloid
(35-43)
-
Das in dem oben beschriebenen Beispiel
1 (4) erhaltene [Cys34]-β-Amyloid (35-43) wurde mit HRP vernetzt, so dass
ein markiertes Material für
EIA hergestellt wurde. Das heißt,
12 mg (310 nmol) HRP wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8)
gelöst,
und die resultierende Lösung
wurde mit 100 μl
einer DMF-Lösung gemischt,
die 1,3 mg (4,5 μmol)
GMBS enthielt, und anschließend
erfolgte eine 30-minütige
Reaktion bei Raumtemperatur. Danach wurde das Reaktionsprodukt auf
einer Sephadex-G-25-Säule
fraktioniert. Dann wurden 3,2 mg (76 nmol) des so hergestellten
HRP mit eingeführter
Maleinimidgruppe mit 2,1 mg (7,2 μmol)
des in Beispiel 1 (4) erhaltenen [Cys34]-β-Amyloids
(35-43) gemischt,
und anschließend
erfolgte eine eintägige
Reaktion bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule fraktioniert,
wobei man HRP-markiertes β-Amyloid
(35-43) erhielt.
-
(4) Herstellung von HRP-markiertem β-Amyloid
(18-28)
-
Das [Cys29]-β-Amyloid
(18-28) wurde mit HRP vernetzt, so dass ein markiertes Material
für EIA
hergestellt wurde. Das heißt,
16 mg (390 nmol) HRP wurden in 1,4 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8)
gelöst,
und die resultierende Lösung
wurde mit 100 μl
einer DMF-Lösung
gemischt, die 1,1 mg (3,9 μmol)
GMBS enthielt, und anschließend
erfolgte eine 40-minütige
Reaktion bei Raumtemperatur. Danach wurde das Reaktionsprodukt auf
einer Sephadex-G-25-Säule
fraktioniert. Dann wurden 6,0 mg (150 nmol) des so hergestellten
HRP mit einge führten
Maleinimidgruppe mit 2,5 mg (1,9 μmol)
des [Cys29]-β-Amyloids (18-28) gemischt,
und anschließend erfolgte
eine zweitägige
Reaktion bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde das Produkt auf einer Ultrogel-AcA34-Säule fraktioniert,
wobei man HRP-markiertes β-Amyloid
(18-28) erhielt.
-
[Beispiel 5] Bestimmung
des Antikörpertiters
-
(1) Bestimmung des Antikörpertiters
in Antiseren von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid (1-40) immunisiert
wurden
-
Der Antikörpertiter in den Antiseren
von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid
(1-40) immunisiert wurden, wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt.
Um eine Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper herzustellen,
wurden 100 μl
0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6), der 100 μg/ml eines Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörpers (IgG-Fraktion,
Kappel) enthielt, in jeden Napf einer 96-Napf-Mikroplatte gegossen und
24 Stunden lang bei 4°C
stehen gelassen. Dann wurde die Platte mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS,
pH 7,4) gewaschen, und danach wurden 300 μl PBS, das 25% Block Ace (Snow
Brand Milk Products) enthielt, in jeden Napf gegossen, um überschüssige Bindungsstellen
der Näpfe
zu blockieren, und anschließend
wurde wenigstens 24 Stunden lang bei 4°C behandelt. In jeden Napf der
oben genannten Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper wurden
50 μl Puffer
A [0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1% BSA, 0,1 M NaCl, 1 mM
MgCl2, 0,05% CHAPS (3-[(Cholamidopropyl)dimethylammonio]propansulfonsäure) und
0,1% NaN3 enthielt] sowie 100 μl des mit
Puffer A verdünnten
Maus-Anti-β-Amyloid-(25-35)-Antiserums
gegeben, und anschließend
erfolgte eine 16-stündige
Reaktion bei 4°C.
Dann, nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurden 100 μl des im
oben beschriebenen Beispiel 4 (1) hergestellten β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) (200-fache
Verdünnung
mit Puffer A) hinzugefügt,
und anschließend
erfolgte eine eintägige
Reaktion bei Raumtemperatur. Dann, nachdem die Platte mit PBS gewaschen
worden war, wurden 100 μl
einer Lösung
von 20 μg/ml
4-Methylumbelliferyl-β-D-galactosid
(4-MUG) in Puffer A (mit der Maßgabe,
dass kein CHAPS enthalten war) hinzugefügt, und anschlie ßend erfolgte
eine dreistündige
Reaktion bei 37°C,
um die Enzymaktivität
an der festen Phase durch 4-MUG zu bestimmen. Nachdem 100 μl 0,2 M Na2CO3 hinzugefügt worden
waren, um die Reaktion abzubrechen, wurde freigesetztes 4-Methylumbelliferon
bei einer Anregungswellenlänge
von 355 nm und einer Bestimmungswellenlänge von 460 nm unter Verwendung
eines Fluoreszenz-Plattenlesers
(Fluoroscan II, Labosystem) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Von den 8 immunisierten
Mäusen
wiesen 4 Mäuse
einen relativ hohen Antikörpertiter
auf.
-
(2) Bestimmung des Antikörpertiters
in Antiseren von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid (25-35) immunisiert
wurden
-
Der Antikörpertiter in den Antiseren
von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid
(25-35) immunisiert wurden, wurde in ähnlicher Wise wie oben bestimmt.
In jeden Napf der Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper wurden
50 μl Puffer
A, 50 μl
des mit Puffer A verdünnten
Maus-Anti-β-Amyloid-(25-35)-Antiserums und 50 μl des im
oben beschriebenen Beispiel 4 (1) hergestellten β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) (100-fache
Verdünnung
mit Puffer A) gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion
bei 4°C. Dann,
nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurde die Enzymaktivität an der
festen Phase in ähnlicher
Weise unter Verwendung von 4-MUG bestimmt. Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Von den 8 immunisierten
Mäusen
wiesen 5 Mäuse
einen relativ hohen Antikörpertiter
auf.
-
(3) Bestimmung des Antikörpertiters
in Antiseren von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid (1-16) immunisiert
wurden
-
Der Antikörpertiter in den Antiseren
von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid
(1-16) immunisiert wurden, wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt.
In jeden Napf der Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper wurden
50 μl Puffer
C [0,02 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 1% BSA, 0,4 M NaCl und 2
mM EDTA enthielt], 50 μl
des mit Puffer C verdünnten
Maus-Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antiserums
und 50 μl
des im oben beschriebenen Beispiel 4 (2) hergestellten HRP-markierten β-Amyloids
(1-16) (200-fache Verdünnung mit
Puffer C) gegeben, und anschließend
erfolgte eine 16-stündige
Reaktion bei 4°C.
Dann, nachdem die Platte mit PBS gewaschen worden war, wurde die
Enzymaktivität
an der festen Phase bestimmt, indem man 100 μl eines TMB-Mikronapf-Peroxidasesubstrat-Systems
(Kirkegaard & Perry
Lab, Inc., von Funakosi Yakuhin) hinzufügte und 10 Minuten lang bei
Raumtemperatur umsetzte. Nachdem 100 μl 1 M Phosphorsäure hinzugefügt worden
waren, um die Reaktion abzubrechen, wurde die Extinktion bei 450
nm mit einem Plattenleser (MTP-32, Corona) gemessen. Die Ergebnisse
sind in 3 gezeigt. Eine
Erhöhung
des Antikörpertiters
gegen das β-Amyloid
(1-16) wurde bei allen 7 immunisierten Mäusen beobachtet.
-
(4) Bestimmung des Antikörpertiters
in Antiseren von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid (35-43) immunisiert
wurden
-
Gemäß dem in dem oben beschriebenen
Beispiel 5 (3) beschriebenen Verfahren wurden die Mikroplatte mit
gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, das Maus-Anti-β-Amyloid-(35-43)-Antiserum und
das in dem oben beschriebenen Beispiel 4 (3) hergestellte HRP-markierte β-Amyloid
(35-43) miteinander umgesetzt, um den Antikörpertiter in den Seren von
Mäusen
zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Von den 9 immunisierten Mäusen
wiesen 3 Mäuse
einen relativ hohen Antikörpertiter
auf.
-
(5) Bestimmung des Antikörpertiters
in Antiseren von Mäusen,
die mit dem β-Amyloid (18-28) immunisiert
wurden
-
Gemäß dem in dem oben beschriebenen
Beispiel 5 (3) beschriebenen Verfahren wurden die Mikroplatte mit
gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, das Maus-Anti-β-Amyloid-(18-28)-Antiserum und
das in dem oben beschriebenen Beispiel 4 (4) hergestellte HRP-markierte β-Amyloid
(18-28) miteinander umgesetzt, um den Antikörpertiter in den Seren von
Mäusen
zu bestimmen. Von den 7 immunisierten Mäusen wiesen 4 Mäuse einen
relativ hohen Antikörpertiter
auf.
-
[Beispiel 6] Herstellung
von monoklonalem Anti-β-Amyloid-Antikörper
-
Jede der Mäuse, die einen relativ hohen
Antikörpertiter
zeigten, wurde intravenös
mit 0,25 bis 0,3 ml physiologischer Kochsalzlösung, in der 200 bis 300 μg des Immunogens
enthalten waren, geimpft, um die endgültige Immunisierung durchzuführen. Drei
bis vier Tage nach der endgültigen
Immunisierung wurden den Mäusen
die Milzen entnommen, durch ein Edelstahlsieb gedrückt, filtriert
und in Eagles minimalessentiellem Medium (MEM) suspendiert, so dass
man eine Milzzellensuspension erhielt. Als Zellen, die für die Zellfusion verwendet
wurden, wurden die von BALB/c-Mäusen
stammenden Myelomzellen P3-X63.Ag8.U1 (P3U1) verwendet [Current
Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)]. Die Zellfusion
wurde nach dem ursprünglichen
Verfahren durchgeführt
[Nature, 256, 495 (1975)]. Das heißt, die Milzzellen und P3U1
wurden dreimal mit serumfreiem MEM gewaschen und dann gemischt,
so dass man ein Verhältnis
der Anzahl der Milzzellen zur Anzahl der P3U1 von 5 : 1 erhielt.
Das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 800 U/min zentrifugiert, um
die Zellen zu sedimentieren. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde das Sediment leicht aufgelockert, und 0,3 ml 45%iges Polyethylenglycol
(PEG) 6000 (Kochlight) wurden hinzugefügt. Dann ließ man das
Gemisch 7 Minuten lang in einem Wasserbad von 37°C stehen, um die Fusion durchzuführen. Nach
der Fusion wurde MEM mit einer Geschwindigkeit von 2 ml pro Minute
zu den Zellen gegeben. Nachdem die Gesamtmenge des hinzugefügten MEM
15 ml erreicht hatte, wurde der Übertand
durch 15 Minuten Zentrifugation mit 600 U/min entfernt. Das resultierende
Zellsediment wurde in GIT-Medium (Wako Pure Chemical Industries),
das 10% fetales Kälberserum
(GIT-10% FCS) enthielt, suspendiert, was 2 × 105 P3U1-Zellen
pro ml ergab. Die Zellsuspension wurde in einer Menge von 1 ml pro
Napf in 120 Näpfen
von 24-Napf-Multiplatten (Linbro) ausgestrichen. Nach dem Ausstreichen
wurden die Zellen bei 37°C
in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxid inkubiert. Nach 24 Stunden
wurde GIT-10%-FCS-Medium,
das HAT (1 × 10–4 M
Hypoxanthin, 4 × 10–7 M Aminopterin
und 1,6 × 10–3 M
Thymidin) enthielt (HAT-Medium), in einer Menge von 1 ml pro Napf
hinzugefügt, um
eine HAT-Selektionskultur einzuleiten. Die HAT-Selektionskultur
wurde fortgesetzt, indem man 3, 6 und 9 Tage nach der Einleitung
der Kultur 1 ml der alten Flüssigkeit
verwarf und dann 1 ml HAT-Medium hinzufügte. Ein Wachstum der Hybridomzellen
wurde 9 bis 14 Tage nach der Zellfusion beobachtet. Als die Kulturlösung gelb
geworden war (etwa 1 × 106 Zellen/ml), wurde der Überstand abgetrennt, und der
Antikörpertiter
wurde nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren bestimmt.
-
Als typisches Beispiel für die Durchmusterung
der von der Maus stammenden Hybridome nach Immunisierung mit dem β-Amyloid
(1-40) sind die unter Verwendung der Maus Nr. 1 (siehe 1) erhaltenen Ergebnisse
in 5(a) gezeigt. Mit diesem wurden
insgesamt zwei Arten von Hybridomen ausgewählt (Tabelle 1).
-
Tabelle
1
Reaktionsspezifität
der monoklonalen Anti-β-Amyloid-(23-35)-
und -(1-40)-Antikörper
-
-
Als typisches Beispiel für die Durchmusterung
der von der Maus stammenden Hybridome nach Immunisierung mit dem β-Amyloid
(25-35) sind die unter Verwendung der Maus Nr. 8 (siehe 2) erhaltenen Ergebnisse
in 5(b) gezeigt. Mit diesem wurden
insgesamt fünf
Arten von Hybridomen ausgewählt
(Tabelle 1).
-
Als typisches Beispiel für die Durchmusterung
von Hybridomen, die von Mäusen
stammen, die mit dem β-Amyloid
(1-16) immunisiert worden waren, sind die unter Verwendung der Maus
Nr. 5 (siehe 3) erhaltenen Ergebnisse
in 5(c) gezeigt. Mit diesen wurden
zuerst 8 Hybridomstämme
ausgewählt,
und danach wurden weiterhin 16 Hybridomstämme ausgewählt (Tabelle 2).
-
Als typisches Beispiel für die Durchmusterung
der von der Maus stammenden Hybridome nach Immunisierung mit dem β-Amyloid
(35-43) sind die unter Verwendung der Maus Nr. 4 (siehe 4) erhaltenen Ergebnisse
in 5(d) gezeigt. Mit diesen wurden
insgesamt achtzehn Arten von Hybridomen ausgewählt (Tabelle 3). Weiterhin
wurden die von der Maus nach Immunisierung mit dem β-Amyloid
(18-28) stammenden Hybridome durchmustert, wobei insgesamt neun
Arten von Hybridomen ausgewählt
wurden (Tabelle 4).
-
Tabelle
2
Reaktivität
von monoklonalem Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörper
-
-
Tabelle
3
Reaktivität
von monoklonalem Anti-β-Amyloid-(35-43)-Antikörper
-
-
Tabelle
4
Reaktivität
von monoklonalem Anti-β-Amyloid-(18-28)-Antikörper
-
Dann wurden diese Hybridome nach
dem Grenzverdünnungsverfahren
kloniert. Beim Klonieren wurden die BALB/c-Maus-Thymocyten als Feederzellen
in einer Menge von 5 × 105 Zellen pro Napf hinzugefügt. Nach
der Klonierung wurde jedes der Hybridome intraperitoneal in einer
Menge von 1 bis 3 × 106 Zellen/Maus an Mäuse (BALB/c) verabreicht, von
denen jede zuvor intraperitoneal 0,5 ml Mineralöl erhalten hatte. Nach 6 bis
20 Tagen wurden die antikörperhaltigen
Ascitesflüssigkeiten
entnommen.
-
Jeder der monoklonalen Antikörper wurde
mit einer Protein-A-Säule
aus der resultierenden Ascitesflüssigkeit
gereinigt. Das heißt,
6 bis 20 ml der Ascitesflüssigkeit
wurden mit derselben Menge Bindungspuffer (1,5 M Glycin, das 3,5
M NaCl und 0,05% NaN3 enthielt, pH 9,0)
verdünnt
und dann einer Chromatographie auf einer Säule mit rekombinantem Protein
A/Agarose (Repligen), die zuvor mit dem Bindungspuffer äquilibriert worden
war, unterzogen, wobei der spezifische Antikörper mit Elutionspuffer (0,1
M Citratpuffer, der 0,05% NaN3 enthielt,
pH 3,0) eluiert wurde. Das Eluat wurde 2 Tage lang bei 4°C gegen PBS
dialysiert, und anschließend
erfolgte eine Sterilfiltration mit einem 0,22-μm-Filter (Millipore). Die gereinigte Lösung wurde
bei 4°C
oder –80°C aufbewahrt.
Die Klasse und Unterklasse der monoklonalen Antikörper wurde
durch einen ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) bestimmt,
wobei eine feste Phase mit gebundenem gereinigtem monoklonalem Antikörper verwendet
wurde. Das heißt,
100 μl 0,1
M Carbonatpuffer, der 2 μg/ml
des Antikörpers
enthielt (pH 9,6), wurden in jeden Napf einer 96-Napf-Mikroplatte
gegossen, und anschließend
wurde die Platte 24 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. Die überschüssigen Bindungsstellen
der Näpfe
wurden nach dem in dem oben beschriebenen Beispiel 5 beschriebenen
Verfahren mit Block Ace blockiert, und anschließend wurden die Klasse und
Unterklasse des verfestigten Antikörpers mit ELISA untersucht,
wobei man einen Isotyp-Bestimmungskit (Mouse-TyperTM Sub-Isotyping Kit, Bio
RAD) verwendete.
-
[Beispiel 7] Kompetitive
Enzym-Immunoassayverfahren
-
(1) Kompetitives EIA-Verfahren
(1)
-
Die Reaktionsspezifität des monoklonalen
Antikörpers,
der unter Verwendung des β-Amyloids
(1-40) bzw. des β-Amyloids
(25-35) als Immunogen hergestellt worden war, wurde nach dem folgenden
Verfahren untersucht. Zuerst wurde der Antikörpertiter jeder Lösung des
monoklonalen Antikörpers
nach dem Verfahren untersucht, das in Beispiel 5 (1) oder Beispiel
5 (2) beschrieben ist, und die Antikörperkonzentration (etwa 3 bis 15
ng/ml), bei der die Menge des gebundenen markierten Materials etwa
40% der gesättigten
gebundenen Menge erreichte, wurde als die bei dem kompetitiven EIA-Verfahren
verwendete Antikörperkonzentration
bestimmt. Dann wurden in jeden Napf der im oben erwähnten Beispiel
5 beschriebenen Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper 50 μl einer Antikörperlösung, die
mit Puffer A auf die bestimmte Konzentration verdünnt wurde,
50 μl einer
Puffer-A-Lösung
der β-Amyloide
oder ihrer partiellen Peptide, nämlich β-Amyloid
(1-40) (im folgenden wurde das von Bachem bezogene β-Amyloid
(1-40) für
den Immunoassay verwendet), β-Amyloid (1-28) (von
Peninsula bezogen) und β-Amyloid
(25-35), sowie 50 μl
des. in dem oben erwähnten
Beispiel 4 (1) beschriebenen β-Gal-markierten β-Amyloids (1-40) (100fache
Verdünnung
mit Puffer A) gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion
bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde die Platte mit PBS gewaschen, und dann wurde
die Enzymaktivität
an der festen Phase nach dem Verfahren bestimmt, das in dem oben
erwähnten
Beispiel 5 (2) beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
gezeigt. Alle Antikörper
reagierten mit dem β-Galßmarkierten β-Amyloid
(1-40) und zeigten auch Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid (1-40) (Tabelle 1).
-
Als typische Beispiele sind die Ergebnisse
des kompetitiven EIA-Verfahrens, bei dem BA-27a (IgG2a, κ) bzw. BS-85a
(IgG1, κ)
als Antikörper
gegen das β-Amyloid
(1-40) bzw. das β-Amyloid
(25-35) verwendet wurden, in 6 gezeigt.
Die Standardkurve von BA-27a gegen das β-Amyloid (1-40) zeigte, dass
die Konzentration an β-Amyloid
(1-40), die ein (B/B0) = 0,5 ergab, 200
nM, 40 ng/Napf, betrug. Weiterhin zeigte dieser Antikörper keine
Kreuzreaktivität
gegenüber β-Amyloid
(1-16), β-Amyloid
(1-28) und β-Amyloid
(25-35). Dies bewies, dass der Antikörper mit dem partiellen Peptid
auf der C-terminalen Seite des β-Amyloids
reagiert, aber die partielle Struktur des β-Amyloids (25-35) nicht erkannte
(6(a)). Andererseits betrug die Reaktivität von BS-85a
gegenüber
der partiellen Struktur des β-Amyloids
(25-35) (die Antigenkonzentration, die (B/B0)
= 0,5 ergab, betrug 20 nM, 1 ng/Napf) das 40-fache der Reaktivität gegenüber dem β-Amyloid
(1-40) (die Antigenkonzentration, die (B/B0)
= 0,5 ergab, betrug 800 nM, 160 ng/Napf) (6(b)).
-
(2) Kompetitives EIA-Verfahren
(2)
-
Die Reaktionsspezifität des monoklonalen
Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörpers wurde
in ähnlicher
Weise untersucht, wie es oben beschrieben ist. Zuerst wurde der
Antikörpertiter
jeder Lösung
des monoklonalen Antikörpers
nach dem Verfahren untersucht, das in Beispiel 5 (3) beschrieben
ist, und die Antikörperkonzentration (etwa
3 bis 50 ng/ml), bei der die Menge des gebundenen markierten Materials
etwa 40% der gesättigten
gebundenen Menge erreichte, wurde als die bei dem kompetitiven EIA-Verfahren
verwendete Antikörperkonzentration
bestimmt. Dann wurden in jeden Napf der Mikroplatte mit gebundenem
Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper
50 μl einer
Antikörperlösung, die
mit Puffer C auf die bestimmte Konzentration verdünnt wurde,
50 μl einer
Puffer-C-Lösung der β-Amyloide
oder ihrer partiellen Peptide, nämlich β-Amyloid
(1-40), β-Amyloid
(1-28) und [Cysl7]-β-Amyloid (1-16), sowie 50 μl des in
dem oben erwähnten
Beispiel 4 (2) beschriebenen HRP-markierten β-Amyloids (1-16) (2000fache
Verdünnung
mit Puffer C) gegeben, und anschließend erfolgte eine 16-stündige Reaktion
bei 4°C.
Nach der Reaktion wurde die Platte mit PBS gewaschen, und dann wurde
die Enzymaktivität
an der festen Phase nach dem Verfahren bestimmt, das in dem oben
erwähnten
Beispiel 5 (3) beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2
gezeigt. Von den acht Arten monoklonalen Antikörper, die zuerst ausgewählt wurden,
reagierten vier auch relativ stark mit dem β-Amyloid (1-40), und von den
sechzehn Arten monoklonaler Antikörper, die danach neu ausgewählt wurden,
reagierten zehn auch relativ stark mit dem β-Amyloid (1-40) (Tabelle 2).
Als typische Beispiele sind die Ergebnisse des kompetitiven EIA-Verfahrens
mit den monoklonalen Antikörpern
BAN-052a (IgG1, κ)
und BAN-50a (IgG1, κ),
die von diesen Antikörpern
die höchste
Reaktivität
gegenüber
dem β-Amyloid
(1-40) zeigten, in 7 gezeigt. 7 zeigt, dass diese Antikörper einen ähnlichen
Reaktivitätsgrad
gegenüber β-Amyloid
(1-40), β-Amyloid
(1-28) und β-Amyloid
(1-16) haben. Weiterhin sind in 8 Standardkurven
von β-Amyloid
(1-40) bei dem kompetitiven EIA-Verfahren gezeigt, wobei außer diesen
beiden Arten von Antikörpern
noch die drei Arten von monoklonalen Antikörpern BAN-11a (IgG1, κ), BAN-20a
(IgG1, κ)
und BAN-30a (IgG1, κ), die zuerst
ausgewählt
worden waren und eine hohe Reaktivität gegenüber β-Amyloid (1-40) zeigten, verwendet
wurden. Die Konzentration an β-Amyloid (1-40),
bei der diese Antikörper
ein (B/B0) = 0,5 ergaben, lag innerhalb
des Bereichs von 25 bis 70 nM (5–15 ng/Napf), und unter den
Antikörpern
wurde nur ein Unterschied von weniger als einem Faktor 3 beobachtet. Von
diesen war das kompetitive EIA-Verfahren unter Verwendung von BAN-50a
am empfindlichsten und konnte etwa 0,6 ng/Napf [(B/B0)
= 0,9] des β-Amyloids
(1-40) nachweisen.
-
(3) Kompetitives EIA-Verfahren
(3)
-
Aus 10 g des Gehirns eines Patienten
mit Alzheimer-Krankheit wurden 0,1 g β-Amyloid-Fraktionen (Ameisensäureextrakte)
nach dem Verfahren von Mori et al. (siehe den Text) erhalten. Dann
ließ man
nach dem Verfahren, das in dem oben erwähnten Beispiel 7 (2) beschrieben
ist, die Mikroplatte mit gebundenem Anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper, die
Antikörperlösung, die β-Amyloide
oder ihre partiellen Peptide, nämlich β-Amyloid
(1-40) und [Cys34]-β-Amyloid (35-43) oder die oben
genannte, aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit
stammende β-Amyloid-Fraktion,
sowie das in dem oben erwähnten
Beispiel 4 (3) beschriebene HRP-markierte β-Amyloid (35-43) (50-fache Verdünnung mit
Puffer C) miteinander reagieren. Die Ergebnisse sind in Tabelle
3 gezeigt. Von den zuerst ausgewählten
monoklonalen Antikörpern
reagierten vier Arten von Antikörpern
relativ stark mit der aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammenden β-Amyloid-Fraktion.
Von diesen wurde der monoklonale Antikörper BC-05a (IgG1, κ), der einen
hohen Antikörpertiter
zeigte, ausgewählt
und in dem folgenden Experiment verwendet.
-
(4) Kompetitives EIA-Verfahren
(4)
-
Die Reaktionsspezifität des monoklonalen
Anti-β-Amyloid-(18-28)-Antikörpers wurde
nach dem Verfahren untersucht, das in dem oben erwähnten Beispiel
7 (2) beschrieben ist. Das heißt,
nach der Bestimmung der Konzentration jedes Antikörpers wurde
eine Reaktion durchgeführt,
bei der β-Amyloid
(1-40), [Cys29]-β-Amyloid (17-28) (Accord), [Cys29]-β-Amyloid
(18-28) und β-Amyloid
(1-28) als β-Amyloide
oder ihre partiellen Peptide verwendet wurden und das in dem oben
erwähnten
Beispiel 4 (4) beschriebene HRP-markierte β-Amyloid (18-28) (1000-fache Verdünnung mit Puffer C) als markiertes
Antigen verwendet wurde, und anschließend erfolgte ein Assay der
Enzymaktivität.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt: Alle neun ausgewählten Arten
von Antikörpern
hatten eine hohe Reaktivität
gegenüber
dem β-Amyloid
(18-28), welches ein Antigen ist. Weiterhin reagierten fünf Arten
von Antikörpern
unter diesen auch relativ stark mit dem β-Amyloid (17-28). Keiner der
Antikörper
reagierte mit dem β-Amyloid (1-28) oder
dem β-Amyloid
(1-40).
-
Von diesen wurde in den anschließenden Experimenten
hauptsächlich
der monoklonale Antikörper BP-90a
(IgG1, κ)
verwendet, der eine hohe Reaktivität sowohl gegenüber dem β-Amyloid
(17-28) als auch gegenüber
dem β-Amyloid
(18-28) aufwies.
-
[Beispiel 8] Herstellung
von monoklonalem HRP-markiertem Anti-β-Amyloid-Antikörper
-
(1) BS-85a-HRP
-
Zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,8),
der 4,2 mg (28 nmol) einer gereinigten BS-85a-Fraktion enthielt, wurden 50 μl DMF gegeben,
das 420 nmol GMBS enthielt, und anschließend erfolgte eine 40-minütige Reaktion
bei Raumtemperatur. Die Reaktionslösung wurde auf einer Sephadex-G-25-Säule (Eluent:
0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,7) aufgetrennt, wobei man 3 mg einer
Fraktion eines Antikörpers
mit eingeführten
Maleinimidgruppen erhielt. Dann wurden 50 μl DMF, das 4,5 μmol SPDP
enthielt, zu 1,4 ml 0,02 M Phosphatpuffer (der 0,15 M NaCl enthielt,
pH 6,8), der 12 mg (300 nmol) HRP enthielt, gegeben, und anschließend erfolgte
eine 40-minütige
Reaktion bei Raumtemperatur. Dann wurden 0,5 ml 0,2 M Acetatpuffer
(pH 4,5), der 68 μmol
Dithiothreit enthielt, hinzugefügt,
und es wurde 20 Minuten lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen,
und anschließend
erfolgte eine Trennung auf einer Sephadex-G-25-Säule (Eluent: 0,1 M Phosphatpuffer,
der 2 mM EDTA enthielt, pH 6), wobei man 8 mg HRP mit eingeführten SH-Gruppen
erhielt. Anschließend
wurden 8 mg HRP mit eingeführten
SH-Gruppen mit 3 mg der Fraktion des Antikörpers mit den eingeführten Maleinimidgruppen
gemischt, und das Gemisch wurde mit einem Collodion-Beutel (Sartorius)
auf etwa 0,3 ml konzentriert und anschließend 16 Stunden lang bei 4°C stehen
gelassen. Die Reaktionslösung
wurde einer Chromatographie auf einer Ultrogel-AcA34-Säule unterzogen,
wobei 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,5) als Eluent verwendet wurde, und
dadurch wurde eine BS-85a-HRP-Komplex-Fraktion gereinigt.
-
(2) BA-27a-HRP
-
Unter Verwendung von 4,7 mg einer
gereinigten BA-27a-Fraktion und 14 mg HRP wurde in ähnlicher Weise
eine BA-27a-HRP-Komplex-Fraktion hergestellt.
-
(3) BAN-052a-HRP
-
Unter Verwendung von 5 mg einer gereinigten
BAN-052a-Fraktion und 14 mg HRP wurde in ähnlicher Weise eine BAN-052a-HRP-Komplex-Fraktion
hergestellt.
-
(4) BC-05a-HRP
-
Unter Verwendung von 5 mg einer gereinigten
BC-05a-Fraktion und 14 mg HRP wurde in ähnlicher Weise eine BC-05a-HRP-Komplex-Fraktion
hergestellt.
-
[Beispiel 9] Sandwich-EIA-Verfahren
(1)
-
(1) Sandwich-EIA-Verfahren
unter Verwendung von BS-85a-HRP
-
In jeden Napf einer 96-Napf-Mikrotiterplatte
wurden 100 μl
0,1 M Carbonatpuffer (pH 9,6) gegeben, der in dem oben erwähnten Beispiel
6 beschriebenen gereinigten monoklonalen Antikörper BAN-052a, BAN-11a, BAN-20a,
BAN-30a, BS-85a
oder BA-27a enthielt, und anschließend wurde die Platte 24 Stunden lang
bei 4°C
stehen gelassen. Dann wurden 300 μl
Block Ace, das 4-fach mit PBS verdünnt war, hinzugefügt, um überschüssige Bindungsstellen
der Näpfe
zu inaktivieren.
-
Zu der Platte, die so hergestellt
wurde, wie es oben beschrieben ist, wurden 100 μl einer Standardlösung von β-Amyloid
(1-40) gegeben, die mit Puffer E (0,02 M Phosphatpuffer, der 10%
Block Ace, 0,2% BSA, 0,4 M NaCl, 0,05% CHAPS und 0,05% NaN3 enthielt) verdünnt war, und anschließend erfolgte
eine 24-stündige
Reaktion bei 4°C.
Nach dem Waschen mit PBS wurden 100 μl des in Beispiel 8 (1) hergestellten BS-85a-HRP
(1500-fache Verdünnung
mit Puffer C) hinzugefügt,
und anschließend
erfolgte eine 24-stündige Reaktion
bei 4°C.
Nach dem Waschen mit PBS wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase unter
Verwendung von TMB nach dem Verfahren bestimmt, das in dem oben
erwähnten
Beispiel 5 (3) beschrieben ist (Enzymreaktion: 20 Minuten). Die
Ergebnisse sind in 9 gezeigt.
Wie in Beispiel 7 beschrieben ist, ist die Reaktivität von BS-85a
gegenüber
dem β-Amyloid
(1-40) bei dem kompetitiven EIA-Verfahren nicht so hoch. Wenn es
jedoch als markierter Antikörper
in dem Sandwich-EIA-Verfahren
verwendet wurde, bei dem sich der unter Verwendung des β-Amyloids
(1-16) als Antigen produzierte monoklonale Antikörper in der festen Phase befand,
wie es oben beschrieben ist, wies es das β-Amyloid (1-40) mit einer äußerst hohen
Empfindlichkeit nach. Insbesondere die Verwendung der festen Phase
mit BAN-052a führte
zu einer Empfindlichkeit, die 10- bis 30-mal höher war als die der anderen
drei Arten von festen Phasen mit Antikörpern, und es war möglich, 3 pg/Napf
des β-Amyloids
(1-40) nachzuweisen.
-
(2) Sandwich-EIA-Verfahren
unter Verwendung von BA-27a-HRP
-
In ähnlicher Weise wurden 100 μl der Standardlösung des β-Amyloids
(1-40) zu der Mikroplatte gegeben, auf der BAN-052a, BAN-11a, BAN-20a,
BAN-30a, BS-85a
oder BA-27a fixiert waren, und anschließend erfolgte eine 24-stündige Reaktion
bei 4°C.
Nach dem Waschen mit PBS wurden 100 μl des in dem oben beschriebenen
Beispiel 8 (2) hergestellten BA-27a-HRP (2500-fache Verdünnung mit
Puffer C) hinzugefügt,
und anschließend
erfolgte eine 24-stündige
Reaktion bei 4°C.
Nach dem Waschen mit PBS wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase unter
Verwendung von TMB bestimmt (Enzymreaktion: 20 Minuten). Die Ergebnisse sind
in 10 gezeigt. Ähnlich wie
BS-85a zeigte auch BA-27a bei dem kompetitiven EIA-Verfahren keine hohe
Reaktivität
gegenüber
dem β-Amyloid (1-40). Wenn
es jedoch als markierter Antikörper
in dem Sandwich-EIA-Verfahren
verwendet wurde, wie es oben beschrieben ist, wies es das β-Amyloid
(1-40) mit einer höheren
Empfindlichkeit nach als BS-85a. Insbesondere die Verwendung der
festen Phase mit BAN-052a führte zu
einer Empfindlichkeit, die etwa 30-mal höher war als die der anderen
drei Arten von festen Phasen mit Antikörpern, und es war möglich, 0,6
pg/Napf des β-Amyloids
(1-40) nachzuweisen.
-
(3) Sandwich-EIA-Verfahren
unter Verwendung von BAN-052a-HRP
-
Zu der Mikroplatte, an der BS-85a
oder BA-27a fixiert war, wurden 100 μl der Standardlösung des β-Amyloids
(1-40) gegeben, und anschließend
erfolgte eine 24-stündige
Reaktion bei 4°C.
Nach dem Waschen mit PBS wurden 100 μl des in dem oben beschriebenen
Beispiel 8 (3) hergestellten BAN-052a-HRP (2500-fache Verdünnung mit Puffer C) hinzugefügt, und
anschließend
erfolgte eine 24-stündige Reaktion
bei 4°C.
Nach dem Waschen mit PBS wurde die Enzymaktivität auf der festen Phase unter
Verwendung von TMB bestimmt (Enzymreaktion: 20 Minuten). Die Ergebnisse
sind in 11 gezeigt.
Also auch in dem System, das umgekehrt aufgebaut ist wie das von
Beispiel 8 (2), nämlich
in dem Sandwich-EIA-Verfahren, bei dem der C-terminale Antikörper, wie
BS-85a oder BA-27a
als feste Phase verwendet wurde und der N-terminale Antikörper, BAN- 052a, als markiertes
Material verwendet wurde, war es möglich, 80 pg/Napf bzw. 10 pg/Napf
des β-Amyloids
(1-40) nachzuweisen.
-
Wenn weiterhin auch BAN-052a-HRP
(1000-fache Verdünnung
mit Puffer C) als markiertes Material in dem Sandwich-EIA-Verfahren
unter Verwendung von BAN-052a als feste Phase verwendet wurde, fiel
die Nachweisempfindlichkeit auf 1/100 im Vergleich zu dem Fall,
dass BA-27a-HRP (1500-fache Verdünnung
mit Puffer C) verwendet wurde. Dies lässt vermuten, dass ein Multimer
des β-Amyloids (1-40) unter
den in der vorliegenden Erfindung verwendeten experimentellen Bedingungen
kaum existiert (12).
-
[Beispiel 10] Sandwich-EIA-Verfahren
(2)
-
Aufgrund der Tatsache, dass BAN-052a
von den monoklonalen Anti-β-Amyloid(1-16)-Antikörpern das Sandwich-EIA-Verfahren
mit einer äußerst hohen
Empfindlichkeit ergab, wurden weiterhin sechzehn Arten von Antikörpern hergestellt,
um monoklonale Anti-β-Amyloid-(1-16)-Antikörper auszuwählen, die
für das
Sandwich-EIA-Verfahren besser geeignet sind (Tabelle 2). Als Ergebnis
wurde BAN-50a erhalten. Ergebnisse des Sandwich-EIA-Verfahrens unter
Verwendung von BAN-50a als fester Antikörper sind in
13 und
14 gezeigt.
Obwohl der Assay gemäß dem oben
beschriebenen Beispiel 9 (3) durchgeführt wurde, wurde als Konzentration
des markierten Materials für
BS-85a-HRP eine
1000-fache Verdünnung
(
13) und für BA-27a-HRP
eine 1500-fache Verdünnung
verwendet (
14). Um
weiterhin die Spezifität
dieser Assaysysteme zu untersuchen, wurde auch die Reaktivität gegenüber β-Amyloid
β-Amyloid (1-28)]. Als Ergebnis
war selbst dann, wenn eines der beiden markierten Materialien verwendet wurde,
die Empfindlichkeit für
die feste Phase mit BAN-50a zwei- bis dreimal höher als für die feste Phase mit BAN-052a.
Wenn es mit dem BA-27a-HRP-markierten Material kombiniert wurde,
war es möglich,
0,2 pg/Napf des β-Amyloids
(1-40) nachzuweisen. Weiterhin zeigten die Ergeb nisse, dass keines
der Assaysysteme das β-Amyloid
(1-28) nachwies und dass alle Assaysysteme spezifisch für das β-Amyloid
(1-40) waren.
-
[Beispiel 11] Sandwich-EIA-Verfahren
(3)
-
(1) Spezifität des Sandwich-EIA-Verfahrens
unter Verwendung von BS-85a-HRP oder BA-27a-HRP
-
Die Spezifität von zwei Arten von Systemen
für Sandwich-EIA-Verfahren
wurde eingehender untersucht, wobei BAN-50a als Antikörper der
festen Phase verwendet wurde und BS-85a-HRP oder BA-27a-HRP als
markiertes Material verwendet wurde. Obwohl der Assay gemäß dem oben
beschriebenen Beispiel 10 durchgeführt wurde, wurde als Konzentration
des markierten Materials für
BS-85a-HRP eine
670-fache Verdünnung
und für
BA-27a-HRP eine 1000-fache Verdünnung
verwendet, und die Reaktivität
gegenüber β-Amyloid
(1-38), β-Amyloid (1-39), β-Amyloid
(1-40), β-Amyloid
(1-42) und β-Amyloid
(1-28) wurde untersucht (15(a) und 15(b)), wobei das β-Amyloid(1-38) und das β-Amyloid
(1-39), die in Beispiel 1 (5) hergestellt wurden, verwendet wurden.
Die Konzentration des β-Amyloids
(1-38) und des β-Amyloid
(1-39) in den jeweiligen Fraktionen der. Umkehrphasen-HPLC, die
diesen in Beispiel 1 (5) entsprachen, wurde nach dem kompetitiven
EIA-Verfahren unter Verwendung von BAN-50a gemäß dem Verfahren von Beispiel
7 (2) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass das Assaysystem,
bei dem BS-85a-HRP als markiertes Material verwendet wurde (15(a)), das β-Amyloid (1-38), das β-Amyloid
(1-39) und das β-Amyloid
(1-40) mit fast der gleichen Empfindlichkeit (0,7 pg/Napf) nachwies
und dass es das β-Amyloid
(1-42) mit einer Empfindlichkeit nachwies, die die Hälfte bis
ein Drittel von der der oben genannten drei Arten von β-Amyloiden betrug.
Weiterhin wurde das β-Amyloid
(1-28) überhaupt
nicht nachgewiesen, was ähnliche
Ergebnisse ergab wie in Beispiel 10. Andererseits wies das Assaysystem,
bei dem BA-27a-HRP als markiertes Material verwendet wurde (15(b)), das β-Amyloid (1-30) und das β-Amyloid
(1-42) mit einer Empfindlichkeit von 0,2 pg/Napf bzw. 18 pg/Napf
nach. Weiterhin war es möglich,
das β-Amyloid
(1-38) und das β-Amyloid
(1-39) mit einer Empfindlichkeit von 85 pg/Napf bzw. 17 pg/Napf
nachzuweisen.
-
Die oben genannten Ergebnisse zeigten,
dass das Assaysystem, bei dem BS-85a-HRP
als markiertes Material verwendet wurde, nicht für die C-terminalen Teile der β-Amyloide
spezifisch war und dass es ungefähr gleich
empfindlich auf die β-Amyloide
reagierte, die die Sequenz des β-Amyloids
(25-35) enthielten, bei dem es sich um ein partielles Peptid handelt,
das als Immunogen für
den markierten Antikörper
verwendet wurde. Andererseits wurde das Assaysystem, bei dem BA-27a-HRP
als markiertes. Material verwendet wurde, als spezifisch für den C-Terminus
des β-Amyloids
(1-40) angesehen und reagierte nur schwach gegenüber β-Amyloid (1-38), β-Amyloid
(1-39) und β-Amyloid
(1-40) mit einer Kreuzreaktivität
von 2% oder weniger.
-
(2) Spezifität und Empfindlichkeit
des Sandwich-EIA-Verfahrens unter Verwendung von BC-05a-HRP
-
Die Spezifität und Empfindlichkeit eines
Sandwich-EIA-Verfahrens, bei dem BAN-50a als fester Antikörper verwendet wurde und das
in dem oben beschriebenen Beispiel 8 (4) hergestellte BC-05a-HRP
als markiertes Material verwendet wurde, wurde untersucht. Die Reaktivität gegenüber β-Amyloid
(1-38), β-Amyloid (1-39), β-Amyloid
(1-40), β-Amyloid
(1-42) und β-Amyloid
(1-28) wurde in derselben Weise wie in dem oben beschriebenen Beispiel
11 (1) untersucht, mit der Ausnahme, dass als Konzentration des
markierten Materials eine 200-fache Verdünnung verwendet wurde (15(c)). Als Ergebnis konnte das Sandwich-EIA-Verfahren unter
Verwendung von BC-05a-HRP 0,7 pg/Napf β-Amyloid (1-42) nachweisen,
wies aber die vier von β-Amyloid
(1-42) verschiedenen Arten von β-Amyloiden, nämlich β-Amyloid
(1-38), β-Amyloid
(1-39), β-Amyloid (1-40)
und β-Amyloid
(1-28), überhaupt
nicht nach. Damit war bewiesen, dass das Sandwich-EIA-Verfahren, bei
dem BAN-50a als fester Antikörper
verwendet wurde und BC-05a-HRP als markiertes Material verwendet wurde,
das β-Amyloid
(1-42) mit einer äußerst hohen
Empfindlichkeit und Selektivität
nachweisen kann.
-
Die oben genannten Ergebnisse zeigten,
dass das β-Amyloid
(1-40) und das β-Amyloid (1-42) getrennt bestimmt
werden können,
indem man die beiden Arten von Assaysystemen, bei denen BAN-50a
als fester Antikörper
verwendet wurde und BA-27a-HRP bzw. BC-05a-HRP als markiertes Material
verwendet wurden, miteinander kombiniert.
-
[Beispiel 12] Herstellung
einer festen Affinitätsphase
mit fixiertem monoklonalem Antikörper
-
(1) Herstellung einer
festen Affinitätsphase
mit fixiertem BAN-052a
-
BAN-052a wurde an einem Harz fixiert,
wodurch eine feste Affinitätsphase
hergestellt wurde. Das heißt,
man ließ 45
mg BAN-052a über
Nacht bei 4°C
mit 5 g TSKgel AF-Trecyltoyopearl 650M (Toso) in einer 0,1 M wässrigen
Lösung
von Natriumhydrogencarbonat, die 0,5 M NaCl enthielt, reagieren.
Nach der Reaktion wurde das Produkt mit 0,5 M Kochsalzlösung gewaschen
und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0),
das 0,5 M NaCl enthielt, reagieren gelassen, um überschüssige aktive Gruppen zu blockieren.
Dann wurden 25 ml des so erhaltenen BAN-052a-Trecyltoyopearl mit
PBS gewaschen und anschließend bei
4°C in Puffer
E aufbewahrt.
-
(2) Herstellung einer
festen Affinitätsphase
mit fixiertem BA-27a
-
Ähnlich
wie es oben unter (1) beschrieben ist, wurde BA-27a an einem Füllstoff
fixiert, wodurch eine feste Affinitätsphase hergestellt wurde.
Das heißt,
man ließ 15
mg BA-27a mit 2 g TSKgel AF-Trecyltoyopearl 650M reagieren, wobei
man 10 ml BA-27a-Trecyltoyopearl erhielt.
-
[Beispiel 13] Analyse
von β-Amyloiden,
die im Liquor eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit enthalten
sind
-
Der von einem Patienten mit Alzheimer-Krankheit
stammende Liquor, der unter Verwendung der in dem oben beschriebenen
Beispiel 12 (1) hergestellten festen Affinitätsphase mit dem fixierten BAN-052a
gereinigt wurde, wurde durch Umkehrphasen-HPLC fraktioniert und
mit dem Sandwich-EIA analysiert.
-
Zuerst wurden 1,5 ml des Liquors
eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit zweifach mit Puffer E verdünnt, und
anschließend
wurde er zur partiellen Reinigung von einer mit BAN-052a-Trecyltoyopearl
gefüllten Säule (0,8
x 0,3 cm) eluiert. Als Eluent wurde 60% Acetonitril verwendet, das
0,2% Trifluoressigsäure
enthielt. Dann wurden diese eluierten Fraktionen nach der Konzentrierung
durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Vydac C4 gemäß dem in
Beispiel 1 (5) beschriebenen Verfahren getrennt, und in den eluierten
Fraktionen enthaltene β-Amyloide
wurden nach dem Sandwich-EIA-Verfahren bestimmt, wobei die feste
Phase mit dem gebundenen BAN-50a sowie BS-85a-HRP oder BA-27a-HRP
verwendet wurden, wie es in Beispiel 10 beschrieben ist. Die Ergebnisse
sind in 16 gezeigt.
Die Fraktion Nr. 59 stimmte ungefähr mit der Elutionsposition
des synthetischen β-Amyloids
(1-40) überein,
so dass bei der immunologischen Aktivität, die in den beiden 16(a) und 16(b).
nachgewiesen wurde, davon ausgegangen wurde, dass es sich um diejenige
des β-Amyloids
(1-40) handelt. Die Ergebnisse von 16 zeigten
daher, dass das β-Amyloid
(1-40) im Liquor des Patienten mit Alzheimer-Krankheit in hoher
Konzentration vorlag. 16(a) zeigte
weiterhin, dass molekulare Spezies, die mit BS-85a-HRP allein nachweisbar
waren, ebenfalls in kleinen Mengen enthalten waren (Fraktionen Nr.
47 und 48). Diese werden mit Acetonitrilkonzentrationen eluiert,
die geringer sind als diejenigen, mit denen das β-Amyloid (1-40) eluiert wurde.
Dementsprechend wird davon ausgegangen, dass die in den Fraktionen
Nr. 47 und 48 eluierten Materialien molekulare Spezies sind, die
hydrophiler sind als das β-Amyloid (1-40).
Die Ergebnisse von Beispiel 11 zeigten, dass das Assaysystem, bei
dem BS-85a-HRP als markiertes Material verwendet wurde, auch gegenüber einer
molekularen Spezies, der ein oder zwei Reste vom C-Terminus des β-Amyloids
(1-40) fehlen, genauso empfindlich war wie gegenüber dem β-Amyloid (1-40). Die Wahrscheinlichkeit
ist daher hoch, dass die in den Fraktionen Nr. 47 und 48 beobachtete
immunologische Aktivität diejenige
gegenüber
der molekularen Spezies ist, der der C-terminale Teil des β-Amyloids
(1-40) fehlt.
-
[Beispiel 14] Analyse
von β-Amyloid-Fraktionen,
die aus dem Liquor eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen
-
In Ameisensäure wurden 11 mg der in dem
oben erwähnten
Beispiel 7 (3) beschriebenen β-Amyloid-Fraktionen,
die aus dem Gehirn des Patienten mit Alzheimer-Krankheit stammen
(die Ameisensäureextrakte),
gelöst
und durch Gelfiltration unter Verwendung von TSK G3000PW aufgetrennt.
-
Säulenbedingungen:
-
Säule:
TSK G3000PW (Toso)
Eluenten: 40% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält
Fließgeschwindigkeit:
0,5 ml/min
-
In den eluierten Fraktionen enthaltene β-Amyloide
wurden nach dem Sandwich-EIA-Verfahren
unter Verwendung einer festen Phase mit gebundenem BAN-50a-Antikörper und
BS-85a-HRP, wie es in dem oben erwähnten Beispiel 10 beschrieben
ist, nachgewiesen. Als Ergebnis wurde eine hohe immunologische Aktivität zwischen
14 Minuten und 15 Minuten HPLC-Elutionszeit beobachtet. Dann wurde
0,05% CHAPS zu dieser Fraktion gegeben, anschließend wurde konzentriert, und
eine Trennung wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von
Vydac C4 gemäß dem in
Beispiel 1 (5) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Ergebnisse der Elution
sind in 17 gezeigt.
-
Nachdem jeweils 300 μl der resultierenden
Fraktionen der Nr. 35 und 41 bis 45 konzentriert worden waren, wurden
die konzentrierten Fraktionen einer Massenspektrometrie (HX110,
JEOL) unterzogen. Die Ergebnisse der Analyse für die Fraktionen der Nr. 35,
41 und 43 sind in 18 gezeigt.
Das β-Amyloid
(1-40) war der Hauptbestandteil von Nr. 35, und das β-Amyloid
(1-42) von Nr. 41. Von Nr. 43 war das β-Amyloid (3-42) der Hauptbestandteil
(es wurde vermutet, dass der N-Terminus des β-Amyloids (3-42) in Pyroglutaminsäure umgewandelt
wird, da das Molekulargewicht um 18 kleiner war als erwartet). Weiterhin
enthielt Nr. 43 noch weitere, in kleineren Mengen vorhandene molekulare
Spezies, denen der N-terminale Teil fehlte, als Gemische. Weiterhin
stimmte die Elutionsposition von Nr. 35 mit der von synthetischem β-Amyloid
(1-40) überein.
-
Dann wurde die immunologische Aktivität der eluierten
Fraktionen nach dem Verfahren untersucht, das in dem oben erwähnten Beispiel
11 beschrieben ist. In diesem Fall wurden jeweils 3 μl der Fraktionen
als Probe verwendet, und BC-05a-HRP
wurde als 200-fache Verdünnung
verwendet. Die Ergebnisse sind in 19 gezeigt.
In dem Assaysystem unter Verwendung von BS-85a wurden sowohl die
Peaks von Nr. 35 als auch die von Nr. 41–43 nachgewiesen, in dem Assaysystem
unter Verwendung von BA-27a wurde hauptsächlich der Peak von Nr. 35
nachgewiesen, und in dem Assaysystem unter Verwendung von BC-05a
wurde der Peak von Nr. 41–45
nachgewiesen.
-
Die oben genannten Ergebnisse beruhen
auf der in Beispiel 11 gezeigten Spezifität der jeweiligen Assaysysteme,
was zusammen mit Beispiel 13 darauf hinweist, dass die Assaysysteme
gemäß der vorliegenden Erfindung
wichtige Mittel für
Entwicklungen von Wirkstoffen für
die Diagnose und Aufklärung
von Gründen
der Alzheimer-Krankheit und zur Prävention und Behandlung der
Alzheimer-Krankheit bereitstellen können.
-
[Beispiel 15] Klonierung
des Amyloid-Protein-Vorläufer-(APP)-Gens
des humanen Typs
-
β-Amyloide
sind nur Teile eines riesigen Vorläuferproteins (APP), und bisher
wurden fünf
Arten von cDNAs gefunden, die für
APP codieren. Diese cDNAs, die APP695, APP714, APP751, APP770 und
APP563 genannt werden, werden infolge von alternativem Spleißen bekanntermaßen ausgehend
von demselben APP-Gen produziert. Um eine Plasmid-DNA für die hohe
Expression des APP695 des humanen Typs zu konstruieren, wurde von
diesen ein humanes APP695-Gen kloniert.
-
Zuerst wurde unter Verwendung des
Plasmids pME18s mit einem starken SRα-Promotor [Molecular and Cellular Biology,
8, 466–472
(1988)] als Vektor eine cDNA-Bibliothek von MAC10, von humanen Lungenkrebszellen
stammenden Zellen, hergestellt. Auf der Basis der bereits beschriebenen
cDNA-Nucleotidsequenz von humanem APP wurde eine synthetische DNA
mit der folgenden Sequenz stromaufwärts eines Bereichs, der für das Protein
codiert (Sense):
5'-ATCCCACTCGCACAGCAGCGCACTC-3' (SEQ ID NO: 13)
und
mit der folgenden Sequenz stromabwärts davon (Antisense):
5'-TGCTGTCCAACTTCAGAGGCTGCTG-3' (SEQ ID NO: 14)
hergestellt,
und unter Verwendung derselben als Sonde wurde die oben genannte
cDNA-Bibliothek durchmustert. Die resultierende cDNA wurde kloniert,
und ihre Nucleotidsequenz wurde nach dem synthetischen Kettenabbruchverfahren
bestimmt. Als Ergebnis zeigte sich, dass es sich bei allen um cDNAs
handelte, die für APP751
codieren. Dann wurde eine cDNA-Bibliothek des humanen fetalen Hirns,
die unter Verwendung von λgt10
als Vektor (Stratagene) hergestellt wurde, in ähnlicher Weise durchmustert.
Als Ergebnis wurde eine cDNA erhalten, die für APP695 codiert. Die cDNA-Sequenz
von APP751 stimmte vollständig
mit der von APP695 überein,
abgesehen von einem Protease-Inhibitor-Bereich. Dementsprechend
wurden eine Plasmid-DNA, die cDNA von APP751 aufwies, und eine Phagen-DNA,
die cDNA von APP695 aufwies, gespalten und rekombiniert, um eine
Plasmid-DNA aufzubauen, bei der die cDNA von APP695 stromabwärts des SRα-Promotors
ligiert ist.
-
[Beispiel 16] Aufzucht
von humanen APP695-Ratten-C6-Gliomzellen mit hoher Expression
-
Ratten-C6-Gliomzellen (ATCC CCL 107)
wurden auf einer Kulturschale mit einem Durchmesser von 10 cm bei
37°C in
DMEM, das 10% fetales Kälberserum
enthielt, in Gegenwart von 5% CO2 kultiviert.
Mit 1 μg der
Plasmid-DNA pTB6 [Cell Structure and Function, 12, 205–217 (1987)],
die ein Neomycinresistenz-Gen
aufwies, wurden 20 μg
Plasmid-DNA für
eine hohe Expression von humanem APP695, die in dem oben beschriebenen
Beispiel 15 aufgebaut wurde, gemischt, und das Gemisch wurde nach
dem Calciumphosphat-Copräzipitationsverfahren
in C6-Gliomzellen eingeführt,
die bis zu einer Sättigung
von 80% kultiviert wurden. Nach 24 Stunden wurde Neomycin (GIBCO)
hinzugefügt,
so dass man eine endgültige
Konzentration von 750 μg/ml erhielt,
und die Kultivierung wurde fortgesetzt, um resistente Stämme zu selektieren.
Jeder der 18 so erhaltenen selektierten Stämme wurde in 100 μl PBS suspendiert.
Nach der Lyophilisierung und Ultraschallbehandlung wurde eine SDS-Elektrophorese
durchgeführt,
wobei man ein 8% Polyacrylamid-Gel verwendete. Nach der Transcription
des Proteins auf eine Nitrocellulosemembran wurde eine Western-Blot-Analyse unter
Verwendung eines monoklonalen Anti-Human-APP-Maus-Antikörpers (Boehringer
Mannheim) durchgeführt,
wobei man feststellte, dass C6-695-18 die höchste APP695-Expressionsmenge
aufwies.
-
[Beispiel 17] Nachweis
des 3-kDa-Peptids, das im Kulturüberstand
von humanen APP695-C6-Gliomzellen mit hoher Expression enthalten
ist
-
Um molekulare Spezies von β-Amyloiden
zu identifizieren, die im Kulturüberstand
der im oben erwähnten
Beispiel 16 beschriebenen humanen APP695-C6-Gliomzellen mit hoher Expression enthalten
sind, wurde der Kulturüberstand
in ähnlicher
Weise wie in Beispiel 13 gereinigt und nach dem Sandwich-EIA-Verfahren analysiert.
Das heißt,
1 Liter des Kulturüberstands
wurde mit einer Säule,
die mit dem im oben beschriebenen Beispiel 12 (2) erhaltenen BA-27a-Trecyltoyopearl gefüllt war,
partiell gereinigt, und die resultierenden eluierten Fraktionen
wurden konzentriert, und anschließend erfolgte eine Fraktionierung
durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von Vydac C4.
-
Säulenbedingungen:
-
Säule:
Vydac C4 (4,6 × 250
mm)
Eluenten: A (5% Acetonitril, das 0,1% wässrige Trifluoressigsäure enthält)
B
(80% Acetonitril, das 0,1% Trifluoressigsäure enthält)
Elutionsverfahren:
Die Konzentration von Eluent B wurde zuerst 5 Minuten lang von 15%
auf 25% erhöht
und dann 60 Minuten lang linear von 25 auf 50% erhöht.
Fließgeschwindigkeit:
0,5 ml/min
-
Unter Verwendung einer 96-Napf-Mikroplatte,
auf der BP-90a verfestigt war, und BA-27a-HRP als markiertes Material
gemäß dem in
Beispiel 9 (1) beschriebenen Verfahren wurden die oben genannten
Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen einem Sandwich-EIA-Verfahren unterzogen.
Die Fraktionen Nr. 28 und Nr. 38–39, bei denen eine hohe immunologische
Aktivität
beobachtet wurde, wurden konzentriert und einer Massenspektrometrie
unterzogen. Als Ergebnis zeigte sich, dass das β-Amyloid (20-40) oder das β-Amyloid (18-40)
ein Hauptbestandteil jeder Fraktion war. Die oben genannten Ergebnisse
zeigten, dass das Sandwich-EIA-Verfahren
unter Verwendung von BP-90a und BA-27a selektiv Derivate auf der
C-terminalen Seite des β-Amyloids
nachweisen kann. Es wird daher davon ausgegangen, dass dieses Assaysystem
ein wichtiges Mittel bereitstellt, wenn der Metabolismus von APP
untersucht wird.
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Gewerbliche
Anwendbarkeit
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Als Läsion, die charakteristisch
für die
Hirne von Patienten mit Alzheimer-Krankheit ist, ist die Ablagerung von β-Amyloid
bekannt, das einer der Hauptbestandteile von seniler Plaque ist.
Unter Verwendung der monoklonalen Antikörper dieser Erfindung können die β-Amyloide,
die die C-terminalen hydrophoben Bereiche aufweisen, empfindlich
und spezifisch bestimmt werden, und dieses Bestimmungsverfahren
ist für
die Diagnose von Alzheimer-Krankheit usw. geeignet.