Hintergrund der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft das Gebiet von Agglutinationstest, um die Bindung von Liganden
nachzuweisen und insbesondere eine immunologische Bindung (Antigen und Antikörperbindung), wie zum Beispiel die
bei der Blutgruppenserologie ("Immunhämatologie") beteiligte.
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Die Blutgruppenserologie erfordert den Nachweis der Blutzellkompatibilität zwischen einem
Blutspender und einem Empfängerpatienten, vor einer den Patienten einschließenden Transfusion oder
Organtransplantation. Die Blutzellkompatibilität wild durch das Nicht-Auftreten einer immunologischen Reaktion
zwischen Antikörpern nachgewiesen, die in dem Blutserum eines Patienten enthalten sind und den Antigenen, die
auf den Blutzellen des Spenders vorhanden sind.
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Viele verschiedene Blutgruppenantigene werden auf der Oberfläche der roten Blutzellen eines jeden
Individuums gefunden. Diese Antigene, die Produkte von vererbten Genen, existieren bei jedem in einer
einmaligen Kombination, außer eineiigen Zwillingen. Die Blutgruppenzuweisung ist im allgemeinen das Verfahren
des Untersuchens von roten Blutzellen, um zu bestimmen, welche Antigene vorhanden sind und welche fehlen,
wobei normalerweise Antikörper für das untersuchte Antigen verwendet weiden.
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Zusätzlich, wenn eine Person kein bestimmtes Zellantigen auf seinen roten Blutzellen aufweist, kann
sein oder ihr Serum einen Antikörper gegen das Antigen enthalten. Ob der Antikörper in dem Serum vorhanden
ist oder nicht, hängt davon ab, ob das Immunsystem der Person schon vorher mit dem spezifischen Antigen oder
etwas, das sehr ähnlich zu diesem ist, konfrontiert wurde und darauf reagiert hatte. Zum Beispiel wird eine
Person, dessen rote Blutzellen Typ A, d.h., die, "A-Antigene" auf den roten Blutzellen aufweisen, Anti-B-Antikörper
in seinem oder ihrem Serum haben. Daher, wenn so einer Person Typ B Blut gegeben wird, wird eine
immunologische Reaktion mit möglichen schweren klinischen Konsequenzen auftreten.
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Als eine zusätzliche Überlegung sollte bemerkt weiden, daß der menschliche Körper konstant
Antigenen in Pollen, Nahrungsmittel, Bakterien und Viren ausgesetzt ist Einige dieser "natürlichen" Antigene sind
offensichtlich den menschlichen Blutgruppen-Antigenen so ähnlich, daß sie fast jede empfängliche Person dazu
stimulieren, Antikörper herzustellen. Daher werden bestimmte Antikörper im Serum von jedermann, dessen
roten Blutzellen das reziproke Antigen fehlt, erwartet. Dies trifft besonders auf das ABO-System zu. Daher wird
oft ein zweiter bestätigender Test mit dem Patienten/Spenderseren durchgeführt. Der Test auf erwartete
Antikörper des ABO-Blutgruppensystems in Seren wird "reverse" Blutgruppenzuweisung genannt
Die Antikörper des ABO-Blutgruppensystems sind im allgemeinen Immunglobulin M (IgM). Diese
Antikörper weisen zehn Antigenbindimgsstellen pro Molekül auf. Der IgM-Antikörper ist groß genug, um die
Distanz zwischen roten Blutzellen zu überspannen, so daß, wesentlich zentrifugiert werden, die Zellen in einem
Netzwerk "Zelle-Antikörper-Zelle-Antikörper" zusammengebunden werden und mit einander verklumpt in
Agglutinaten verbleiben werden. Zum Beispiel, wenn And-A zu Blutgruppe AO der Blutgruppe AB hinzu
gegeben wild und das Gemisch zentrifugiert wild, werden die Zellen in Klumpen verbleiben, wenn sie
resuspendiert weiden. Mit demselben Antikörper weiden Gruppe 0- und Gruppe B-Zellen als individuelle Zellen
rcsuspendiert. Die durch einen Antikörper verursachte Agglutination, wie zum Beispiel einem IgM-Antikörper, wild
direkte Agglutination genannt.
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Die Anti-Rh-Blutgruppenreaktionen nagen dazu, eine schwächere Agglutination zu ergeben, die durch
die Zugabe von Polymeren hohen Molekulargewichts verstärkt werden kann. Einige Anti-Rh-Antisera bestehen
aus Immunglobulin G (IgG) Antikörpern und weiden eine direkte Agglutination verursachen, wenn dies durch
die Anwesenheit von hohen Proteinkonzentrationen, wie zum Beispiel 25%-Rinderalbumin (oft in
kommerziellen Anti-D-Reagenz-Präparationen gefunden) gefördert wild.
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Solche Förderung wird benötigt, da IgG nicht leicht die Distanz zwischen den Zellen überspannen
kann, die dazu neigen, sich gegenseitig abzustoßen. Daher wird es den rote Zellantigene binden, die seiner
Spezifität entsprechen, aber wird jedoch solche roten Zellen nicht so effektiv agglutinieren, wie dies die größeren IgM-
Antikörper werden. Die Anwesenheit von IgG-Antikörper, der an eine rote Zelle gebunden ist, wird daher
normalerweise durch die Zugabe von Anti-IgG nachgewiesen, was die benötigte Agglutination verursachen und zu
einem Netzwerk von "rote Zelle-IgG/Anti-IgG/IgG-rote Zelle" führen wild.
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Serum anhält natürlicherweise IgG, das den Anti-IgG-Antikörper neutralisieren wird, der hinzugefügt
wird, um an rote Blutzellen zu binden. Daher muß das Serum vor der Zugabe eines solchen Anti-IgG zu den
Zellen entfernt werden. Tests auf IgG das an rote Zellen in vivo gebunden ist, werden direkte Antiglobulintests
genannt Tests für an rote Zellen gebundenes IgG in vitro werden indirekte Antiglobulintests genannt. Solche
Antiglobulintests werden auch "Coombs"-Tests genannt.
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Es ist eine Standard-Blutbankpraxis, auf A-, B- und D-(Rho)-Antigene in einer Probe des Bluts einer
Person zu testen (und in ausgewählten Fällen Tests auf Antigene durchzuführen) und die Ergebnisse durch
Testen der Sera der Person zu überprüfen, um die erworbenen Antikörper zu bestimmen, die vorhanden sein
können. Das Erstgenannte wird als "vorwärts-Typisieren" bezeichnet, während das Letztgenannte als "reverses
Typisieren" bezeichnet wild. Die Ergebnisse aller dieser Typisierungsübungen müssen übereinstimmen.
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Seit dem frühen 20. Jahrhundert war es der generelle Ansatz, bekannt als das "Landsteiner"-Verfahren",
die roten Blutzellen eines Patienten zu einem Standard-Laborteströhrchen hinzuzufügen, der einen
Blutgruppenantikörper (wie zum Beispiel Anti-A oder Anti-B) enthält, zu mischen, um es der Antikörper-Antigen-
Bindungsreaktionen zu erlauben aufzutreten und dann zu zentrifugieren. Wenn das Antigen anwesend ist, das
getestet wird, wird die Antikörper-Antigen-Bildung stattgefunden haben, was zu einer Agglutination der roten
Blutzellen des Patienten führt. Das Teströhrchen wird manuell geschüttelt, um das abzentrifugierte Pellet von
"verklumpten" Zellen vom Boden loszulösen. Eine subjektive Bestimmung wird dann durchgeführt, ob die
losgelösten Zellen "verklumpt" sind und in welchem Ausmaß.
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Wahrend der Mitte des 20. Jahrhunderts wurden Anstrengungen unternommen, um diese Technik zu
vereinfachen, die subjektive Natur des Tests zu minimieren und Fehler zu verringern. Es wurde erkannt, daß ehe
irgendwie permanente Aufzeichnung der Ergebnisse der Kompatibilitätstests erhalten werden konnte, indem
anfeuchtbare entweder nicht-absorbierende oder in einigen Fällen absorbierende Teströhrchen oder Testkarten,
welche die benötigten immunchemischen Reagenzien auf mindestens einem Teil ihrer Oberflächen aufweisen,
verwendet werden. US-Patente Nm. 2,770,572; 2,850,430, 3,074,853; 3,272,319; 3,424,558; 3,502,437 und
3,666,421 und Europäische Patentanmeldung #0104 881-A2 stellen bestimmte Beispiele von solchen
Testkarten und entsprechenden Vorrichtungen dar.
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Vor kürzerer Zeit wurden Techniken entwickelt um die Sensitivität und Genauigkeit von bestimmten
Antiglobulintests, wie zum Beispiel dem sogenannten "Coombs"-Test zu erhöhen. US-Patent Nr. 4,435,293
von Graham et aL beschreibt ein Bluttypisierungssystem (Simwash®), das ein System von Teströhrchen
verwendet, das die Waschschritte des ursprünglichen Coombsverfahren beseitigt, weil das Simwash® ein "selbst-
Waschen" der roten Blutzellen zur Verfügung stellt Antiglobulintests, so wie das gerade Beschriebene erfordern
es, daß die roten Blutzellen frei von ihrem Serum sind, das ungebundene IgG-Antikörper enthält. Mit dem
Simwash®-System weiden die dichten Zellen in eine Säule zentrifugiert, während das weniger dichte Serum oben
verbleibt.
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Die Europäische Patentanmeldung # 0 194 212 beschreibt einen Blutkompatibilitätstest unter der
Verwendung eines Gels in einer Säule, wobei solch ein Gel insbesondere Sephadex® ist, das ein dreidimensionales
Netzwerk oder Matrix von Dextranketten ist, die mit Epichlorhydrin kreuzvernetzt sind (Produkt von Pharmada
Fine Chemicals, Uppsala, Schweden und Piscataway, NJ.) und das agglutinierte rote Blutzellen fängt und es
nicht-agglutinierten Zellen erlaubt, bis zum Boden hindurch zu passieren.
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Eher der Nachteile bei der Verwendung des zuletzt genannten Systems und insbesondere bei der
Herstellung eines solchen Testsystems unter der Verwendung von Gel als ein Medium ist es, daß Gele, wie zum
Beispiel Sephadex®, sich vor der Einführung in ein Teströhrchen abgesetzt haben müssen, um die sogenannten
"Feinstoffe" los zu weiden, die kontaminierende Verbindungen oder Fragmente geringen Molekulargewichts
sind, die mit der Trennungskapazität des Gels interferieren können. Gel-Feinstoffe sind historischerweise dafür
bekannt, chromatographische Trennsäulen zu verstopfen.
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Ein Gel muß auch vor der Verwendung, und um die Menge von Reagenzien genau zu berechnen, die
in Verbindung mit dem Testsystem verwendet weiden sollen, gequollen werden, Berechnungen von benötigten
Mengen von Reagenzien, Puffern und ähnlichen müssen den Gelquellungs-Verdünnungsfaktor
berücksichtigen. Zusätzlich wild einiges der Reagenz verloren, weil es durch das poröse Gel absorbiert wird und nicht für die
Bindung an den Analyten, auf dem getestet wird, zur Verfügung steht Größere Mengen von Reagenz müssen
hinzugefügt weiden, um diesen Vertust auszugleichen. Das Gel ist inhärent ebenfalls gegenüber mechanischer
Behandlung leichter zerbrechlich und kann während des Quellprozesses auseinanderbrechen, was eine
unkontrollierbare Variation bei der Gelpartikelgröße verursacht.
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Ein anderer Nachteil, der bei der Verwendung von Sephadex® erlitten wird, ist, daß es sehr
empfindlich gegenüber Temperaturextremen ist und dazu neigt, auszutrocknen oder auseinander zu brechen, was
Stabilitäts-, Transport- und Lagerprobleme verursacht, die Schrumpfen und damit zusammenhängende
Veränderungen in den Testeigenschaften einschließen. Das Brechen kann dazu führen, daß die oben genannten Feinstoffe
den normalen Fluß der Blutzellen durch das Material verändern oder behindern. Ein zusätzliches Transport- und
Lagerproblem tritt gelegentlich dadurch auf daß Sephadex® enthaltende Testvorrichtungen nicht eingefroren
weiden können.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit
von Bindungsliganden, insbesondere Blutgruppenantigenen oder Antikörpern zur Verfügung, wobei eine
Matrix von im wesentlichen nicht-kompressierbaren Mikropartikeln verwendet wird, wobei die Matrix eine
überlegene Performance zur Verfügung stellt, indem sie die Bewegung von nicht-agglutinierten Liganden,
insbesondere roten Blutzellen, erlaubt, während bevorzugterweise in eher sogenannten "Bandenbildung" agglutinierte
Reaktanten, insbesondere rote Blutzellen, zurückgehalten werden.
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In eher bevorzugten Ausführungsform ist die Vorrichtung der Erfindung ein im wesentlicher
durchsichtiger verlängerter Behälter, der darin angebracht ehe Matrix von im wesentlichen nicht-kompressierbaren
Mikropartikeln aufweist, wobei die Matrix h einer Menge zur Verfügung gestellt wird und innerhalb des
Behälters auf solch eine Weise positioniert ist, um einen Nachweis der Anwesenheit oder Abwesenheit von
agglutinierten Reaktanten zu ermöglichen. Die Mikropartikel können imprägniert mit oder eingetaucht m ein Reagenz
sein, um die Bindungsliganden, wie zum Beispiel Blutgruppenantigene oder Antikörper, vor der Zugabe der
Matrix zu der Vorrichtung nachzuweisen. Alternativ kann eine flüssige Form einer solchen Reagenz zu der
Öffnung des Behälters hinzugegeben werden, so daß die durch die Mikropartikel, die darin enthalten sind,
hindurchfiltern kann. Eine flüssige Probe, die möglicherweise einen Analyten von Interesse enthält, der an das
Reagenz binden wird und eine Agglutinationsreaktion verursachen wird, wird ebenfalls zu dem Behälter
hinzugegeben, entweder zusammen mit dem erwähnten Reagenz oder anschließend an die Zugabe des Reagenz. Der
Behälter wird dann zentrifugiert und die Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutinaten nachgewiesen.
Genaue Beschreibung der Erfindung
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Das folgende ist eine detailliertere Beschreibung von bestimmten Schlüsselaspekten der Erfindung. Die
bevorzugte Vorrichtung dar Erfindung ist im allgemeinen ein Behälter, oder ein verlängertes im wesentlichen
durchsichtiges hohles Teil, das mindestens ein offenes Ende aufweist, das hier manchmal als eine Einlaßöffnung
bezeichnet wird. Mit Einlaßöffnung ist ein Bereich gemeint, zu dem Proben und/oder Reagenzien, Puffer oder
ähnliches hinzugefügt werden können, um gegebenenfalls einen Kontakt mit der Matrix zu erreichen. In einigen
Ausführungsformen weist das verlängerte Teil ein im wesentlichen geschlossenes Ende gegenüber der
Einlaßöffnung auf. Mit im wesentlichen geschlossenes Ende ist zu einem solchen Ausmaß geschlossen gemeint, daß
die Matrix innerhalb des Teils zurückgehalten wird und nicht austreten kann und das Reaktanten, die man in der
Matrix zurückhalten möchte, ebenfalls zurückgehalten werden. Mit verlängert ist an Behälter gemeint, der
irgendwie länger im Verhältnis zu seiner Weite ist und entlang einer Längsachse angeordnet vorliegt. Die Matrix
der Erfindung wird daher auf eine irgendwie säulenförmige Weise eingeschlossen, so daß Reaktanten sich durch
ihre Länge hindurch bewegen können, wenn sie nicht agglutiniert vorliegen und durch die Matrix gefangen
werden wenn sie agglutiniert sind. Eine Behälterform, die in dem Bereich lang genug ist, der die Matrix enthält,
um diese Trennung und ihren Nachweis zu ermöglichen, wild für die Zwecke der Erfindung geeignet sein,
wobei es verstanden wird, daß die verbleibenden Aspekte der Behälterform beachtlich abweichen können. Der
Bereich des hohlen Teils oder Behälters, der die Matrix enthält, wird hier im allgemeinen als die "Agglutinat-
Nachweiszone" bezeichnet.
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Die Gesamtform des Behälters sollte im allgemeinen diesen Trennungsprozess erleichtern. Zum
Beispiel hat in einer bevorzugten Ausführungsform der gesamte Behälter im wesentlichen die Form eines Laborteströhrchens
einschließlich der Teströhrchen die als "konusförmig" in ihrer Gesamtheit oder einem Teil davon
beschrieben weiden können. Andere bevorzugte Ausführungsformen schließen diejenigen Konfigurationen ein,
bei denen nur ein Teil des Behälters konusförmig ist (z.B. der Bereich, der Matrix enthält). In diesem Fall kann
der konusförmige Bereich mit einem Probe-aufnehmenden Bereich verbunden sein, der von einer geeigneten
Form ist, um die Proben oder Reagenzien, wie durch den Verwender hinzugefügt, zu enthalten und kann
abgerundet, würfelförmig oder ähnlich in Konfiguration sein. Lediglich als Beispiel stellen Fig. 1-4 verschiedene
Formen und Konfigurationen von Teilen von Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung
dar.
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Ein Gehäuse, das zwei getrennte Bereiche aufweist, die jeder durch seine betreffende Form definiert
sind, stellt den zusätzlichen Vorteil einer, "oberen" Kammer zur Inkubation von Seium und Zellen vor der
Bewegung dieses Gemisches durch die Matrix zur Verfügung. Dies ist insbesondere zutreffend, wenn die
Verbindung zwischen dieser oberen Kammer (Probe-aufnehmender Bereich) und der Agglutinations-Nachweiszone
(oder der Bereich gerade darüber) durch eine Öffnung definiert ist, die kleiner als die Öffnung ist, zu der die
Proben und Reagenzien hinzugefügt werden (wobei das Letzere die Einlaßöffnung ist). Dies tritt auf, weil das
größere Ausmaß der Einlaßöffnung die Zufuhr von Zellen und Serum erleichtert, während die kleinere Öffnung ihre
Passage durch die Matrix verhindert, bis der Verwender eine Kraft ausübt, wie zum Beispiel Zentrifugation, um
ihre Bewegung zu erreichen. Der Verwender kann daher Kontrolle über den Zeitablauf des Agglutinationassays
ausüben. Fig. 2 und 3 verdeutlichen dieses Konzept Fig. 2 stellt ein Gehäuse 80 mit einer darin
angebrachten oberen Kammer 95 zur Aufnahme von Proben dar, wobei die obere Kammer eine Öffnung 105 aufweist,
die eine Bewegung von Proben nicht erlauben wird, die zu der oberen Kammer hinzugefügt wurden, bis der
Verwender diese Bewegung auf eine geeignete Weise bewirkt Fig. 2 zeigt ebenfalls, eine, anfängliche
Reaktionszone" 103, die Puffer oder ein Reagenz zur Bindung und Agglutinationsschritten des Assays enthält. Eine
Bande von agglutinierten Reaktanten 100 wird innerhalb der Matrix 90 gebildet Fig. 3 zeigt eine alternative
Ausführungsform, der die anfängliche Reaktionszone fehlt. Bei dieser Ausführungsform kann die
Bindungsreaktion vor der Zugabe der Reaktanten zu der Vorrichtung durchgeführt worden sein, wobei die Matrix als ein
Filter für die Aggtutinate dient. Alternativ können die Reaktanten direkt zu der oberen Kammer hinzugefügt
worden sein und es ihnen erlaubt werden, für eine Zeit vor der Zentrifugation zu reagieren und durch die
darunterliegende Matrix zu passieren. Die Agglutinate werden dann, nach der Zentrifugation durch die Öffnung 105
auf der Oberfläche von oder in der Matrix gefangen Fig. 4 stellt noch eine andere Konfiguration für die
Agglutinations-Nachweiszone
der Vorrichtung dar und stellt ebenfalls die Bildung der Bande 100 innerhalb der Matrix
anstelle von auf der Matrix dar.
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Mit "im wesentlichen durchsichtig" ist jedes Material gemeint, das lichtdurchlässig oder transparent
zu solch einem Ausmaß ist, daß die Anwesenheit oder Abwesenheit von Agglutinaten leicht entweder mit dem
bloßen Auge oder durch die Verwendung von Nachweisinstrumenten für diesen Zweck festgestellt werden
kann. Die Vorrichtung kann in ihrer Gesamtheit oder nur in ausgewählten Bereichen, wie zum Beispiel den
Bereich der AgglutinatBandenbildung in einer positiven Probe, im wesentlichen transparent sein. Es liegt
innerhalb der Erwägung der Erfindung, daß die Beobachtung von positiven Agglutinationsreaktionen mit einem
Instrument gemacht werden können, das dazu geeignet ist, optisch oder auf andere Weise Clusteragglutinate
und/oder -Banden oder Pelletbildung innerhalb eines bestimmten Bereichs der Agglutinationsreaktionszone
nachzuweisen. Dieser Beobachtungsprozess kann mit dem Instrument manuell durchgeführt weiden oder es
kann ein sogenannter "user-walk-away" automatisierter Beobachtungsprozess sein.
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Behälter, wie zum Beispiel Laborteströhrchen und Säulen, die im allgemeinen im Stand der Technik
von Immunoassays und Blutbanken bekannt sind, können für die Zwecke der Durchführung des Verfahrens der
Erfindung verwendet werden, so lang wie sie, wenn gewünscht, für Zentrifugation und instrumentelle
Beobachtung geeignet sind. Geeignete Behälter können Materialien wie zum Beispiel Glas, Polystyrol, Polyethylene,
Polypropylen, Polycarbonate und ähnliches umfassen. Bevorzugt ist die Teströhrchenhalterung, die im
allgemeinen eine vorgeformte Rechteck-förmige Halterung ist, die mehrere Röhrchen enthält. Fig. 1 stellt eine
Ausführungsform einer solchen Halterung da. Besonders bevorzugt sind die zwei-kammrigen Laborteströhrchen,
wie zum Beispiel die vorher beschriebenen, insbesondere, wenn solche Teströhrchen in Halterungsform
vorliegen und dazu geeignet sind, mit Reagenzien, Puffern, Matrix und ähnlichen, während der Herstellung der
Vorrichtungen, oder später, wenn die Vorrichtungen dazu verwendet weiden um Assays durchzuführen mit
automatischen Pipettiervorrichtungen befüllt zu weiden.
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Die Matrix der Erfindung umfaßt im wesentlichen nicht-kompressierbare Mikropartikel. Mit, "im
wesentlichen nicht-kompressierbar" ist resistent gegenüber von Veränderung in Form oder Größe gemeint, die
durch die Ausübung von Kraft auf die Matrix verursacht weiden kann, wie z. B. Zentrifugalkraft, magnetische
Kraft, elektrische Kraft, hydrostatischer Druck, Kräfte durch negativen oder positiven Druck und ähnliches oder
Lagerung für eine lange Zeitdauer bei normaler Schwerkraft. Die Partikel können von jeder Form sein, so lange
wie die Bewegung der nicht-agglutinierten Reaktanten nicht durch Unregelmäßigkeiten und so weiter
beeinträchtigt wird. Die Größe der Partikel kann in Abhängigkeit von den bestimmten Bindungsliganden, die in dem
Agglutinationsassay beteiligt sind, erheblich variiren. Ein Durchschnittsfachmann wird verstehen, daß
agglutinierte Reaktanten in oder auf der Oberfläche der Matrix zurückgehalten werden sollten, während nicht-
agglutiniate Reaktanten durch die Matrix zum Boden hindurch laufen oder insgesamt aus der Vorrichtung
heraus. Jedoch, im Fall der Agglutination von roten Blutzellen, betragen bevorzugte Matrix-Mikropartikel
Größenbereiche im allgemeinen von ungefähr 50 Mikron bis 300 Mikron und weiter bevorzugt ungefähr 50 Mikron bis
ungefähr 200 Mikron und am meisten bevorzugt ungefähr 50 Mikron bis ungefähr 150 Mikron.
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Geeignete nicht-kompressierbare Materialien zur Verwendung hierbei umfassen verschiedene
Siliziumdioxid-Verbindungen, einschließlich Glas und Sand, Metallverbindungen, so lange sie hell genug in der
Farbe sind, um, wenn gewünscht, eine visuelle Beobachtung von Agglutination zu erlauben, verschiedene
Plastikverbindungen und ähnliches. Beispielhaft für die oben genannten Materialien sind solche käuflich erhältliche
Polystyrolperlen, wie die, die von Polysciences, Inc. erhalten werden können; Seesand, erhältlich von Fisher oder
Mallinkrodt; Cellulosepartikel wie zum Beispiel die erhältlich von Whatman und Glasperlen, wie zum Beispiel
die, erhältlich von Jaygo Incorporated (von Dragonite) und Hüls Pertrach Systems. Genauere Beispiele dieser
sind in dem experimentellen Beispielsteil dieser Beschreibung beschrieben.
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Die wie oben beschriebene Matrix wild in da Agglutinationsnachweiszone der Vorrichtung der
Erfindung zur Verfügung gestellt. Wenn die Vorrichtung säulenförmig ist, wild die Matrix meistens entlang ihrer
Länge in der Nähe zu einem geschlossenen Ende zur Verfügung gestellt. Jedoch wird einigen
Ausführungsformen die Matrix nur innerhalb eines "mittleren" Tals der Vorrichtung zur Verfügung gestellt und kann sogar,
in einigen Ausführungsformen, auf der Oberfläche eines zweiten Materials liegen, das als ein Stopfen dient, wie
zum Beispiel eine Glasfaser oder ein anderer Typ von Faser. Die Vorrichtungen können ebenfalls Schnittstellen
mit Instrumenten an einer oder mehren Stellen ausbilden. Zum Beispiel kann die Einlaßöffnung mit einem
Instrument verbunden sein, wie zum Beispiel einer Pipettierugsvorrichtung, um dadurch Proben aufzunehmen.
Die Vorrichtung kann eine Schnittstelle mit einer Instrumentierung bilden, die dazu geeignet ist, um die
Bewegung da Reaktanten zu bewirken, zum Beispiel, um sie durch die Matrix zu drücken oder zu ziehen. Bei einigen
Ausführungsformen kann ein Vakuum angelegt werden, um Reagenzflüssigkeit und sogar Nicht-Agglulinate
durch die Vorrichtung zu ziehen, während Agglutinate innerhalb oder auf der Matrix zurückgehalten werden. In
anderen Ausführungsformen kann die Instrumentierung mit einem Teil da Vorrichtung eine Schnittstelle bilden,
um eine Kraft auszuüben, wie zum Beispiel ein Flüssigkeitsstrom, um die Reaktanten durch die Matrix zu
bewegen.
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Vor der Zugabe der Matrix-Mikropartikel zu dieser Zone können sie erst auf jede geeignete Weise
gewaschen werden, um unerwünschte Kontaminanten zu entfernen und um nicht spezifische Bindung zu
vermeiden. Die Partikel können zu der Vorrichtung als eine Schlamme, bestehend aus Partikeln in Antiserum, Puffer
oder anderen gewünschten Reagenzien oder Verdünnungsmitteln, ob allein oder in Kombination hinzugegeben
weiden. Die Partikel können ebenfalls zu dieser Zone in einer trockenen Form hinzugegeben werden und
Antisera, geeignete Puffer und ähnliches anschließend, wenn gewünscht, hinzugefügt werden. In bevorzugten
Ausführungsformen weiden die Mikropartikel vollständig in einer geeigneten Reaktionslösung oder Puffer innerhalb
der Agglutinations-Nachweiszone des Gehäuses eingetaucht und eine Lage aus der Lösung allein erstreckt sich
von einem oberen Teil dar Matrix. Dieser erstreckte Bereich wird als die "anfängliche" Reaktionszone
bezeichnet und ist in säulenförmigen anderen als den zwei-kammrigen Vorrichtungen ein Bereich, worin die Reaktanten
zuerst in Kontakt miteinander kommen, sich mischen und anlangen zu reagieren.
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Zur Verdeutlichung wird das Säulenagglutinationsverfahren der Erfindung im Zusammenhang von
bestimmten Bluttypisierungen und Kompatibilitätsverfahren beschrieben werden. Ein vorwärts-
Bluttypisierungsassay kann unter der Verwendung der Säulenaggtutinationsvorrichtung, wie hier beschrieben,
durchgeführt weiden, indem eine säulenförmige Vorrichtung verwendet wird, zu der die Matrix der Erfindung
hinzugegeben winde. Ein Antiserum, enthaltend monoklonale Antikörper oder polyklonale Antikörper wird m
einem physiologisch kompatiblen Puffer verteilt und dann zur Matrix der Mikropartikel hinzugefügt, um sie
darin einzutauchen und erstreckt sich von der Matrix in Richtung der Einlaßvorrichtung, um die anfängliche
Reaktionszone zu bilden. Geeignete Mengen von solchen Antikörpern können routinemäßig durch den
Durchschnittsfachmann, in Abhängigkeit im allgemeinen von der antigenischen Affinität und Spezifität der Antikörper
optimiert werden. Die Antikörper werden dann in einem Puffer verteilt, der ebenfalls geeignete Zusatzstoffe
enthalten können, die im Stand der Technik bekannt sind, um zu helfen, ihre Reaktivität zu verstärken und einer
nicht spezifischen Bindung vorzubeugen, wie zum Beispiel Polymere hohen Molekulargewichts und ähnliches.
Beispiele von diesen schließen Polyvinyle, Dextran, Gelatine und Polyethylenglycol ein. Polymere niederen
Molekulargewichts können ebenfalls hinzugefügt werden, um die Dichte der Lösung zu erhöhen.
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Zu der anfänglichen Reaktionszone wild eine Kochsalzlösung der roten Blutzellen eines Patienten
hinzugefügt. Der Durchschnittsfachmann wird leicht sicherstellen, daß eine geeignete Suspension von Zellen
ungefähr 2-6% und bevorzugt ungefähr 2-3% ist. Wenn die Suspension zu sehr verdünnt ist, wird jede sich
ergebende Agglutinationsreaktion schwierig abzulesen sein. Wenn die Suspension zu sehr konzentriert ist wild das
System überladen und die Agglutination nicht zu unterscheiden sein. Es wird ein Auftreten der Bindungsreaktion
erlaubt und dann wild die Bewegung der Reaktanten zu und durch die Matrix verursacht. Diese Bewegung wird
im allgemeinen durch eine Kraft, wie zum Beispiel durch die Kräfte, die oben beschrieben wurden, bewirkt. In
bestimmten bevorzugten Ausführungsformen wird eine Zentrifugalkraft, negativer Druck oder eine
hydrostatische Kraft angewandt
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Wenn die zur Ausübung von Kraft auf das Reaktionsgemisch verwendete Technik um ihre Bewegung
auf oder durch die Matrix zu bewirken, Zentrifugation ist, dann wird der Durchschnittsfachmann erkennen, daß
Zentrifugationszeiten und Geschwindigkeiten für optimale Ergebnisse weit variieren können, h bevorzugten
Ausführungsformen sollte die Zentrifugation bei einer Kraft und für eine Zeit stattfinden, um es den Agglutinaten
zu erlauben, falls vorhanden, einen düster oder eine Bande in der Nähe des oberen Teil der Matrixsäule zu
bilden, was zu einer klar beobachtbaren positiven Ablesung führt, wählend die nicht-agglutinierten negativen
Zellen zum Boden der Vorrichtung wandern, um ein Pellet zu bilden. Wenn die Vorrichtung für eine zu lange Zeit
oder bei einer zu hohen Geschwindigkeit gedreht wird, werden die Agglutinate in Richtung auf den Boden des
Röhrchens gedrückt werden. Es ist auch wünschenswert, daß eine Zentrifuge mit einem Ausschwingkopf
verwendet wird, um sicherzustellen, daß die Reaktanten irgendwie durch die Mitte des Matrixbereichs hindurch
wandern und nicht auf der Seite der Vorrichtung liegen.
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In diesem Beispiel, wenn Antikörper gegen Typ B-Blutzellen hinzugefügt wurden, weiden die in der
Probe des Patienten enthaltenen Typ B-Blutzellen an den Antikörper binden, was eine Linie von agglutinierten
Zellen bildet, die nahe dem oberen Teil der Matrix gefangen sind. Typ A-Zellen werden nicht agglutinieren und
zum Boden der Vorrichtung zentrifugiert weiden. Oftmals können die Zellen eines Patienten schwach
reagierende Varianten enthalten. Diese moderate Reaktion kann durch kleinere verstreute Agglutinate über die
Säulenmatrix gezeigt werden, während Negative ein Pellet auf dem Boden der Matrixsäule bilden. Fig. 1 zeigt
Beispiele von Reaktions-Endpunkten, die bei Verwendung des Verfahrens und der Vorrichtung der Erfindung
beobachtet weiden können. Das Röhrchen 10 zeigt eine stark positive Reaktion, mit einer starken Bande 100
von Agglutinaten. Röhrchen 12 zeigt eine positive Reaktion die ein wenig schwächer ist als die vorhergehende,
weil die agglutinierte Bande in kleinere Agglutinate aufgebrochen ist Röhrchen 14 zeigt eine mehr moderat
positive Reaktion mit kleineren Agglutinaten, die durch den mittleren Teil der Matrix hindurch verteilt vorliegen
und sich sogar in einigem Ausmaß auf dem Boden absetzen, wie in Röhrchen 16. Röhrchen 18 zeigt eine sehr
schwache positive Reaktion, wobei die meisten der Zellen auf dem Boden gesammelt sind. Röhrchen 20 zeigt
eine klar Negative, wobei ein Pellet von Zellen 50 auf dem Boden des Röhrchens vorliegt und keine Aggtutinate
innerhalb der Matrix 90 verteilt sind.
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Die Vorrichtung und das Verfahren dar Erfindung können für direkte Agglutinationsuntersuchungen
von der Sorte, wie eben für den Nachweis von vielen verschiedenen Zellen, einschließlich weißen Blutzellen,
Blutplättchen, roten Blutzellen und ähnlichen beschriebenem, verwendet werden. Wenn visuelle Beobachtung
von Agglutinaten gewünscht ist, ist es bevorzugt, zunächst jede farblosen Zellen oder farblosen Partikel, die an
Zellen angeheftet sind, mit einer geeigneten Farbe zu falben, um eine visuell aufnehmbare
Agglutinationsreaktion zu bewirken.
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Das Hämoglobin in roten Blutzellen stellt solch eine geeignete Farbe natürlicherweise ohne Färbung
zur Verfügung. Direkte Agglutinationsstudien können an ABO roten Blutzellen, wie oben verdeutlicht,
durchgeführt weiden, sowie an denjenigen Zellen, die D, C, c, E, e und K-Antigene und ähnliches enthalten. Ähnlich,
wenn Sera auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen oder Zellen, die ein Antigen
enthalten, getestet weiden sollen, können sie mit bekannten Antigenen gemischt weiden. Wenn das unbekannte
Serum Antikörper gegen das bekannte Anligen, das zur Verfügung gestellt wird enthält, weiden die Reaktanten
agglutinieren und eingefangen werden, wenn sie auf oder abwärts durch die Matrix bewegt werden, während
negatives Serum keine Reaktion hervorrufen wird und die Agglutinate nicht gefangen weiden. Es ist bevorzugt,
einen dualen Kammeraufbau bei der Durchführung dieser zuletzt genannten Assays zu verwenden, um es den
bekannten Antigenen oder Zellen, die Antigene enthalten, zu erlauben, vor dem Bewegen der Mischung auf
oder durch die Matrix durch Zentrifugation oder andere geeignete Mittel mit dem Serum des Patienten inkubiert
zu werden.
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Im Zusammenhang mit Immunhämatologie-Anwendungen der Vorrichtung und des Verfahrens der
Erfindung kann ein Serum eines Patienten auch auf unerwartete Antikörper auf die oben beschriebene Weise hin
untersucht weiden, wie z. B. die Kell-, Duffy- und Kidd-Antigene. Antiglobulintests, wie zum Beispiel der
Coombs-Test können ebenfalls durchgeführt werden. Bei Coombs-Testen sollten die Zellen frei von Serum
sein, das ungebundene Antikörper enthält. Mit dem hier beschriebenen System weiden die dichten Zellen in die
Säule zentrifugiert. Das weniger dichte Serum verbleibt auf der Oberfläche der Säule, ähnlich zu dem in US-
Patent 4,435,293 beschriebenen Verfahren. Anti-IgG, das innerhalb der Matrix verteilt vorliegt, wird Zellen, die
IgG-Antikörper, gebunden an ihre Antikörper aufweisen agglutinieren und die Aggtutinate weiden auf der
Oberfläche von oder in der Matrix gefangen werden. Zellen die kein IgG gebunden haben, werden durch die
Säule zum Boden des Röhrchens hindurch wandern.
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Die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung wurden sehr detailliert zur
Verwendung in einem Blutserologiekontext beschrieben. Jedoch sollte es verstanden weiden, daß es innerhalb der
Betrachtung
der Erfindung liegt, Bindungsassays durchzuführen, die alle Bindungsliganden einschließen, die mit
Partikeln assoziiert sind, so daß die Partikel als ein Ergebnis der Bindung der Liganden an ihre Bindungspartner
agglutinieren werden. Zum Beispiel kann jeder Bindungsligand, der an einen Partikel oder anderen Träger
angebracht weiden könnte, der den Platz der roten Blutzellen einnimmt (Antigene trägt), geeignet sein. Die Partikel
dienen als Träger für diese Liganden, genauso wie die Blutzelle ihre Artigen "trägt". Solche Partikel können
inerte Träger sein, wie z. B. die beschrieben in US-Patent # 4,140,662. Die geeignete Partikelgröße und
Zusammensetzung des Trägers wird in Abhängigkeit von dem Bindungsliganden variieren, die man nachzuweisen
versucht, wobei Beispiele dieser in dem angegebenen Patent offenbart sind. Die geeignete Matrixmikropartikel-
Größe und Zusammensetzung wird ebenfalls in Übereinstimmung mit den ausgewählten Trägerpartikeln und
Bindungsliganden variieren. Der Beispielsteil dieser Beschreibung stellt Anweisungen in brauchbaren
Techniken zur Verfügung, um die optimale Partikelgröße und -Zusammensetzung zu bestimmen. Obwohl ein rotes
Blutzellen-Agglutinationssystem dargestellt ist, wild ein Durchschnittsfachmann erkennen, daß auch andere
Systeme auf diese Weise optimiert weiden können. Bei einigen Ausführungsformen ist es bevorzugt, daß die
Partikel gefärbt sind, um eine visuelle Beobachtung von agglutinierten Klumpen oder Banden von Partikeln zu
ermöglichen, ähnlich zu dem mit den sichtbaren farbigen roten Blutzellen erhaltenen Effekt.
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Die beanspruchte Vorrichtung und das Verfahren vermeiden die Nachteile, die mit im Stand der
Technik von Agglutinationsassays bekannten Vorrichtungen und Verfahren assoziiert sind, indem eine Assaysystem
zur Verfügung gestellt wird, das eine Matrix von im wesentlichen nicht-komprimierbaren Mikropartikeln
verwendet. Solche Partikel werden nicht vor der Verwendung in diesem System und vor der Berechnung der
Mengen der Reagenzien, die hinzugefügt weren "gequollen" weiden müssen. Die Partikel sind weniger porös, als
andere im Stand der Technik bekannte Matrices und absorbieren daher keine große Menge von jedem Reagenz,
das hinzugefügt werden kann, was mehr von dem Reagenz für die Reaktion erhältlich macht. Auch ist die
Variation bei der Partikelgröße minimal, da erheblich weniger Brechen auftritt Überraschenderweise benötigt das
Assaysystem der Erfindung weniger Zentrifugationszeit wenn Zentrifugation verwendet wird, um die
Reaktanten durch die Matrix zu bewegen.
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Diese Faktoren, führen inter alia zu einem Assaysystem, das dazu neigt, weniger Reagenz zu benötigen
und daher ziemlich kosteneffektiv ist. Zusätzlich stellt das System den weiteren Vorteil von größeren Lager- und
Transportmöglichkeiten zur Verfügung. Zum Beispiel, falls die Vorrichtung während der Transport- oder
Lagerphase umgedreht weiden sollten, kann die Matrix leicht auf ihrem Platz innerhalb des Halterungsteils zurück
geklopft werden. Auch können die Vorrichtungen, die die Matrix der Erfindung enthalten, in einem gefrorenen
Zustand, 15ºC oder Raumtemperatur ohne Stabilitätsprobleme gelagert werden.
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Die folgenden genauen Beispiele erläutern die Erfindung, sollten jedoch nicht als für diese
einschränkend betrachtet werden;
I. Mikropartikelauswahl
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Die folgenden Experimente zeigen eine Auswahl von Substanzen, die es nicht-agglutinierten roten
Blutzellen erlauben weiden,, wenn zentrifugiert, durch eine Säule zu passieren, während agglutinierte rote
Blutzellen entweder auf der Oberfläche von oder in der Säule gefangen werden. Die generellen Verfahren zur
Durchführung der folgenden Experimente waren:
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1. Partikel wurden zu einem Behälter hinzugefügt, wie z. B. einem Teströhrchen;
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2. Zu testende rote Blutzellen werden mit Reagenzien gemischt, die Antikörper enthalten und
dann auf die Partikel-Matrix aufgetragen;
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3. Die Röhrchen weiden in einer Zentrifuge zentrifugiert, die in der Lage ist, die Behälter
horizontal zu drehen;
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4. Die Röhrchen werden auf Agglutination/nicht-Agglutination hin beobachtet
A. Testen verschiedener Partikel:
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Kleine Plastikröhrchen wurden mit ungefähr mit 1/2 ml Nitrocellulose (Whatman Mikrocellulose
DE32, DE52, QA52, SE52 (die Prefixe zeigen verschiedene Ladungen an)) hergestellt. (Das Volumen
bezeichnet gepacktes Volumen - aus Schlämme, die in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt winde)
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Ergebnisse: DE32/Zellen passieren nicht hindurch
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DE52/einige Zellen in oberer 1/2 des Röhrchens, andere passieren bis Boden
Resuspendiert in anti-menschlichem Globulin (AHG); dann IgG-beschichtete Zellen hinzugefügt. (Ortho
Coombs Control Cell® z B. OCC
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Kontrolle und negative Zelle (Selectogen®).
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DE52
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QA52 Alle negativen Zellen passierten zum Boden
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SE52
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Getestetes Aerosil = ungefähr 740 nm Durchmesser-Siliziumdioxidpartikel und
Dow 0,8 u Polystyrol-Latexpaitikel.
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Die Zellen gingen auch nach einem harten Zentrifugieren nicht durch die Suspension hindurch.
Diskussion:
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Menschliche rote Zellen (7 -i Durchmesser) können durch ein Bett von Partikeln von 100-150 u zentrifugiert
werden.
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B. Getestete zusätzliche Partikel in Teströhrchenhalterung:
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Zellulosepartikel sind erheblich größer (100-150p.) als rote Zellen (7,0u).
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1. Zellulose Whatman CF11 - faseriges Cellulosepuder
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2. Zellulose Whatman CF31 - mikrogranulär
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3. Säure-gewaschene Glassperlen - weniger als 150u
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- 150-212u
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- 425-600u
Verfahren
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(1) Die Partikel werden in Ortho Bioclone Anti-A® Charge#BAA 1100 suspendiert.
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(2) Die Suspension wird in den oberen Teil der Vorrichtung geladen.
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(3) Leicht zentrifugiert-Zellulose blieb im oberen Teil stecken.
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Pfropfen mit Sonde aufgebrochen und nochmals geschleudert, um die Zellulose in den Boden zu
laden.
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Die Glasperlen können docken geladen weiden und Flüssigkeit hinzugegeben werden
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(4) 10 ml Affirmagen® A-Zellen oder B-Zellen wurden hinzugefügt.
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(5) In einer Tisch-Ausschwing-Kopf-Zentrifuge (Solvall GLC-1 Mikrotiterplattenträger) zentrifugiert,
900 U/min für kurze Zeitdauern, um für B-Zellen benötigte die Zeit zu finden, um den Boden zu
erreichen.
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T = Zellen auf der Oberfläche
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B = Zellen am Boden
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Teil oder Anteil bezieht sich auf Zellen am Boden.
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Alle Größen der untersuchten Glasperlen arbeiteten zur Typisierung von A-Zellen sehr gut
Drehzeit von zwischen ungefähr 30-90 Sekunden.
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Versuchte große Perle (425-600u) in kommerziellem anti-IgG mit einer starken beschichteten Zelle
(Qrtho Coombs Control Cell® (OCC) und einer nicht-beschichteten Zelle (Affirmagen® A-Zelle).
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25ul AB-Serum; 10ul Zellsuspension; 1 Minute bei 900 U/min gedreht.
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Die Trennung dar Zellen von Serum erlaubte es dem Antiglobulin, die Zellen zu agglutinieren,
Aggtutinate wurden in der Säule aus Perlen gefangen.
Diskussion:
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Die oben genannten Teil B-Untersuchungen waren eine Fortführung der Auswahl von Partikeln, die es
nicht-agglutinierten Zellen erlauben, hindurch zentrifugiert zu weiden, wahrend agglutinierte Zellen gefangen
werden. Zwei Zellulosepulver und drei Glaspedengrößen wurden getestet. Sie wurden alle in kommerziellem
Blutgruppierungs-Serum Anti-A suspendiert. Rote Zellen von Blutgruppe A oder B wurden hinzu gerügt und
sorgfältig durch die Säulen aus Partikeln, die getestet wurden, hindurch zentrifugiert.
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Tests auf IgG-Antikörper in Humanserum werden bevorzugt mit den Indikatorzellen durchgeführt, die
von dem Testserum getrennt sind, weil das Serum relativ große Mengen von IgG enthält, das das Reagenz Anti-
IgG neutralisieren würde. Zellen, die dafür bekannt sind, mit IgG-Antikörpern beschichtet zu sein, wurden mit
Gruppe AB-Serum gemischt, von dem bekannt war, keine Antikörper gegen die Zellen zu enthalten. Zellen, von
denen bekannt war, daß sie nicht mit Antikörpern beschichtet sind, wurden als eine Kontrolle getestet. Die Gemische
winden zum oberen Teil von Säulen aus Glasperlen in kommerziellem Anti-IgG Reagenz hinzugefügt und
dann zentrifugiert.
Ergebnisse:
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Einige, aber nicht alle, der negativen Zellen winden durch die Zellulosepartikel hindurch zentrifugiert.
Die agglutinierten Zellen verblieben auf der Oberfläche der Säule. Alle der negativen Zellen befanden sich auf
dem Boden der Glasperlensäulen, alle der positiven Zellen verblieben auf der Oberfläche.
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Zellen, die mit IgG-Antikorpern beschichtet waren, wurden durch das in der Säule gefangene Anti-IgG
agglutiniert. Zellen, die nicht mit IgG-Antikörpern beschichtet waren, winden nicht agglutiniert und waren am
Boden der Säule. Es konnte es ein deutlicher Unterschied zwischen negativen und positiven Beispielen gesehen
weiden, wenn Anti-IgG verwendet wurde.
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Die Testsera und Zellen, die für diese Experimente verwendet wurden, winden als diejenigen ausgewählt,
die starke Reaktionen ergeben. Die Glasperlen stellten eine Halterung für agglutinierte A-Zellen zur Verfügung
und nicht-agglutinierte B-Zellen winden leicht durch die Säule zentrifugiert. Die Antikörper-beschichteten Zellen
winden von dem Serum, in dem sie suspendiert waren, zumindest gut genug getrennt, um starke Reaktionen
nachzuweisen. Das Serum verblieb in dem oberen Teil der Säule und neutralisiert das Anti-IgG nicht
C. Zusätzliche Partikel:
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Eisenmetallfüllungen 40 mesh, erhalten von Fisher 157-500.
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Seesand, gewaschen; erhalten von Fisher-S25-500, Charge 901223
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Seesand, gewaschen; und getrocknet; erhalten von Malinkrodt 7062-Charge 7062 KED2.
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1. 5-7 mm der zu testenden Partikel wurden zu jeder der zwei Säulen in eher Teströhrchenkassette
hinzugefügt.
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2. Ortho Bioclone Anti-A®, Charge BAA110D winden zu jeder Säule hinzugefügt, es wurde gemischt,
um die eingeschlossene Luft heraus zu bekommen. Die Eisenfüllungen wurden auf solche Weise gepackt, daß
die zum Rühren verwendete Nadel nicht durch die Füllungen oder entlang der Seite hindurch dringen würde.
Einige Luftblasen verblieben am Boden des Röhrchens.
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3. 10 ul von Zellen wurden zu jedem hinzugefügt (Ortho Affirmagen Anti-A®, Charge #A844). Die A-
Zelle ist mit Anti-A positiv und die B-Zelle ist negativ.
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4. Für 8 min in Tischausschwingkopfzentrifuge zentrifugiert.
Ergebnisse:
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Die Eisenfüllungen sehen schwarz aus, man kann die roten Zellen nicht sehen. Es müssen Füllungen
verwendet werden, die besser als eine Hintergrundfarbe für die Farbe der Testpartikel, die untersucht werden
(d.h. rote Zellen) geeignet sind. Fisher-Sand und Mallinkrodt-Sand hielten beide die Agglutinate auf dar
Oberfläche, bade Sande erlaubten es den negativen Zellen bis zum Boden hindurch zu passieren.
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Der Mallinkrodt-Sand war weißer und stellte eine bessere Hintergrundfarbe zur Ermittlung einer
negativen Reaktion zur Verfügung.
Diskussion:
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In den oben genannten Teil C-Studien wurden weitere feste Partikel untersucht, um alternative
Trägermedien zu finden.
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Eisenmetallfüllungen und zwei Quellen von Seesand wunden unter der Verwendung von
Blutgruppierungsserum Anti-A mit A- und B-Blutzellen getestet. Die Sande wurden in indirekten Anti-Globulintests
getestet Zweifache Verdünnungen von Anti-D wurden getestet, um die Sensitivität zu bestimmen.
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Die Eisenfüllungen wurden von den Tests ausgeschlossen, da die dunkle Farbe die roten Zellen
verdeckte. Beide Seesande fingen A-Zellen auf einer Säule klar ein, die Anti-A enthielt und erlaubten es den B-
Zellen, hindurch zu dringen. Nach der Einstellung der Zentrifugation und Säulenlänge wurde die Senstitivität des
Anti-Globulintests als vergleichbar mit Standard manuellen Testergebnissen gefunden.
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Die in der vorbeigehenden Studie verwendeten Sandproben wurden in Säurereinigungslösung
(Dichromat) über Nacht eingeweicht. Die Sande wurden in Leitungswasser und dann in destilliertem Wasser
gewaschen und in einem Ofen zur Trocknung plaziert. Die Partikel wurden dann unter einem Präparierglas
betrachtet.
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Eisenfüllungen - alle waren rauh mit hervorstehenden Ecken. Die Partikelgröße variierte weit von etwa
2 mm bis ungefähr 200 mm.
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Fisher-Sand-Partikel aus der Flasche sind geladen und werden durch einen Spatel abgestoßen.
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Aussehen: 100-150 Mikron durchschnittliche Größe (einige sind kleiner); klares Quarz.
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Mallinkrodt-Sand - mehr abgerundet als die Fisher-Proben; durchscheinende Oberfläche,
möglicherweise am Strand abgerundet
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Fisher-Säure-gewaschener Sand ist bräunlich mit dunklen Flecken. Mallinkrodt ist viel weißer mit
weniger Flecken.
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Der getestete Säure-gewaschene Sand gegenüber Sand aus den Flaschen (beide markiert als
"gewaschen") mit Bioclone Anti-A® und vorläufiger Test mit Anti-Humanserum. Der Säure-gewaschene Sand sah
sauberer aus - kein anderer Unterschied wurde bemerkt - keine Zellen schienen an den Sand gebunden zu sein.
D. Zugabe von Lösung hoher Dichte
Coombs-Test
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Anti-Ig 0,5%PEG,2% Dextran 87000 MW.
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Getestetes AB-Serum, Charge 124B40-40 ul
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Ortho Antibody Enhancement Solution®
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(niedrig-ionisch) Charge AES 204-140-40 ul
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10 ul Coombs Control Cell® K430
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Die Anti-Human-Globulinzellen scheinen am Sand kleben zu bleiben. Das Zellpellet am Boden ist mit
A-Zellen ein wenig größer als in den OCC.
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Getestet mit Perlen in normalem Kanninchenserum (NRS), vereinigen und PBS-Verdünnungen von
normalem Kanninchenserum unter der Verwendung von Affirmagen® A-Zellen und OCC-Zellen (IgG-
beschichtet) in einer Teströhrchenhalterung.
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Diese wurden in einer horizontalen Tischzentrifuge für 9 Minuten zentrifugiert und dann in einer
Sorvall GLC; 900 U/min für 5 Minuten. Die Matrix erschien pink-gefärbt. Dies kann an nicht-spezifischer
Adhärenz liegen.
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Mallinkrodt-Seesand mit unverdünntem NRS sah am besten aus, weil weniger Zellen an den Sand
angeheftet werden. Jedoch werden die Zellen durch einen Antikörper in dem unverdünnten RNS agglutiniert.
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Getester Mallinkrodt-Sand
Anti-IgGin 5% PEG K20
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2% Dextran, 20KMW
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0,1% Gelatine in PBS
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Ein definitiver Unterschied wurde zwischen + und - beobachtet.
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Die zweiten zwei Sets wurden 5 Minuten in einer Sorvall GLC bei 1000 U/min zentrifugiert
Wiederholter Test von Mallinkrodt-Sand. Die zweiten zwei Sets
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10 mm Säule
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Zentrifugieren GLC 2000 U/min 5 Minuten
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Anti-IgG wie vorher, Zellen OCC(+) und A(-)
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# Kontrolle #2 Test
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40 ul Serum
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10 ul Zellen 40 ul OAES
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10 ul Zellen
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Ergebnisse: Positive agglutiniert und Negative herunter zentrifugiert. Dies zeigt, daß man das
Serum von dem System abtrennen kann und eine positive Reaktion erhält.
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Getestet weiden Anti-D verdünnt in Serum - wie oben, in den folgenden Verdünnungen.
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Die Testergebnisse sind vergleichbar mit konventionellen Anti-Human-Globulin manuellen Tests
(indirekter Coombs). 1/1000 ist eine definitiv positive Reaktion; 1/2000 sieht wie Agglutination am Boden des
Röhrchens aus; 1/4000 kann leicht agglutiniert sein; die Negative weist ein abgerundetes Zellpellet am Boden
des Röhrchens auf
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Die Aufgabe dieses Experiments war es zu bestimmen, ob ehe Lösung hoher Dichte, wie z. B. die in
dem Simwash Serum/Zell-Trennungssystem® verwendete Dextran-Albuminlösung den Säulenagglutinations-
Antiglobulintest verbessern würde. Anti-IgG wurde in Simwash®-Lösung verdünnt und Albumin hinzugefügt.
Mit IgG-beschichtete Zellen wurden hinzugefügt und nicht-beschichtete Zellen dienten als Kontrolle.
Ergebnisse
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Die beschichteten Zellen wurden agglutiniert und durch die Perlen gefangen. Einige der nicht
beschichteten Zellen binden an die Glasperlen.
Diskussion
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Die Verwendung eines Mediums höherer Dichte stellt eine bessere Trennung von Serum und Zellen
zur Verfügung, was bei der Durchführung der Coombs-Tests besonders brauchbar ist.