DE2912173C2

DE2912173C2 - Reaktor/Separator-Vorrichtung

Info

Publication number: DE2912173C2
Application number: DE2912173A
Authority: DE
Inventors: Peter Rocco North Salem N.Y. Farina; Kathy Plamer Peekskill N.Y. Ordonez; Iris Johnston White Plains N.Y. Siewers
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1978-03-31
Filing date: 1979-03-28
Publication date: 1983-05-05
Also published as: AU4564479A; FR2421382A1; JPS54154397A; US4244694A; CH631016A5; AU529435B2; GB2017910B; CA1134172A; GB2017910A; DE2912173A1; SE7902859L; JPS5918663B2

Description

(a) einer Säule, die an beiden Enden offen ist,

(b) einer in der Säule angeordnete Rückhalte- und Filtervorrichtung,

(c) einer Reaktions- und. Trennkammer, die oberhalb der Rückhalte- und Filtervorrichtung angeordnet ist und zumindest eine Matrix für die Immobilisierung und Abtrennung zumindest einer Komponente eines Antigen-Antikörper-Systems enthält,

dadurch gekennzeichnet, daß die Rückhalte- und Filtervorrichtung bei annähernd atmosphärischem Druck für wäßrige Lösungen undurchlässig ist, jedoch für wäßrige Lösungen durchlässig wird, wenn sie einer bestimmten Zentrifugalkraft ausgesetzt wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Säule von zylindrischer Gestalt ist und einen Mittelteil von im wesentlichen gleichförmigem Durchmesser, einem Bodenteil, der sich zu einem kleineren Durchmesser als der mittlere Teil verjüngt, und ~inem oberen Teil, der von größerem Durchmesser ist als der„tnittlere Teil, aufweist, wobei die Rückhalte- und FiltePOrrichtungen in der Säule an einem Punkt angeordnet sinr\ an dem sich der mittlere Teil zu dem kleineren Durchmesser verengt

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückhalte- und Filtervorrichtung die Form einer Scheibe aufweist

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe aus einem porösen Polyäthylenmaterial besteht

5. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe eine Porosität von etwa 25 bis etwa 150 Mikron aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix in der Reaktions- und Trennkammer als Pulver vorliegt.

7. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix in der Reaktions- und Trennkammer als Tablette vorliegt, die nach Kontakt mit der Lösung quillt und sich der Konfiguration der Säulen anpaßt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix an der inneren Wand der Reaktions- und Trennkammer enthalten ist.

Die Erfindung bezieht sich auf einQ Reaktor/Separator- Vorrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Immuno-Schnellanalyse gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Die Einführung der Radioimmunoanalyse (RIA) im Jahre 1959 durch Yalow und Berson (Nature, 184, 1648, 1959) als eine diagnostische Indikatormethode (Tracer-Technik, s. Römpps Chemielexikon, 7. Auflage, S. 3637) zum Ersatz der damals verwendeten langsamen y Methoden hat infolge ihrer p und extremen Empfindlichkeit viele Gebiete 4er klinischen Prüfung und Forschung revolutioniert,
Die_ RIA-Technik basiert auf der Fähigkeit eines

Antikörpers und eines spezifischen Antigens, einen reversiblen Antigen-Antikörper-Komplex zu bilden. Die Analyse wird durchgeführt, indem eine bestimmte Menge eines radiomarkierten Antigens zu Proben hinzugegeben wird, die Antiserum und bekannte Mengen eines »Standard«-Anü"gens enthalten. Während der Inkubation konkurrieren radiomarkiertes Antigen und nicht markiertes Antigen um eine begrenzte Zahl von Bindungsstellen an dem Antikörper. iNach der Inkubation wird das an den Antikörper gebundene Antigen vom freien Antigen abgetrennt und das Verhältnis des freien zum gebundenen kann in eine Dosis-Empfindlichkeitskurve eingetragen werden- Eine unbekannte Serumprobe kann dann nach dem gleichen Verfahren gemessen werden und die Konzentration des Antigens durch Vergleich mit der Standard-Dosis-Empfindlichkeitskurve bestimmt werden.

Häufig sind die klassischen RIA-Methoden mühsam, zeitraubend und enthalten Fehler verursachende Schritte, da sie vielfache Pipettierungen und Teströhrchen, doppelte Analysen, verlängerte Inkubationszeiten und schwierige, ineffiziente Trennungsverfahren erfordern. Es sind verschiedene Vorrichtungen zur Durchführung einer Sättigungsanalyse bekannt Beispielsweise beschreibt die US-PS 39 18 909 eine Vorrichtung, die ein röhrenförmiges Bauteil enthält, das an beiden Enden offen ist und am oberen Ende eine Reaktionskammer enthält Ein hydrophobes Filter befindet sich am Boden der Reaktionskammer und ist oberhalb einer Abscheidungskammer gelegen. Bei der Durchführung der Analyse werden die Reaktanten vermischt und in der oberen Kammer inkubiert, und dann durch das Filter durch Schütteln oder Anlegen einer Druckdifferenz zwischen der oberen und unteren Kammer in die untere Kammer überführt In der unteren Kammer trennt das Trennmittel eine radioaktive Substanz, die an einem konkurrierenden Bindemittel gebunden ist, von deren nicht gebundener Form.

Die US-PS 39 61894 und die US-PS 40 39 652 beschreiben eine Methode zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeitsproben unter Verwendung einer Vorrichtung, die aus einer Säule besteht, die eine unlösliche poröse Matrix enthält, in der sich immobilisierte Bindungspartner für die zu analysierenden Substanzen befinden.

so Die Vorrichtung ist ein zylindrischer Körper mit einer bestimmten Gestalt, die an einem Ende in einer sich ve-jüngenden Spitze ausläuft. Im unteren Teil der Säule befindet sich eine poröse Polyäthylenscheibe, die die Matrix stützt In der US-PS 40 39 652 ist ausgeführt, daß

5$ die Fließcharakteristiken der festen Phase vorzugsweise so sein sollen, daß sie unter dem Einfluß der Schwerkraft schwammähnliche Fluid-Retentionseigenschaften zeigen. Die in der Matrix zurückgehaltene Flüssigkeit kann dann durch Zugabe weiterer Flüssigkeit zu der

ω Vorrichtung verdrängt werden. Wenn einmal eine Flüssigkeitsphase zu der festen Phase hinzugefügt worden ist und darin festgehalten wird, sind die Phasen in einem wirksamen Zustand der Inkubation, bis eine weitere Flüssigkeit, wie z. B. ein Puffer, hinzugefügt wird, um die festgehaltene Flüssigkeit zu verdrängen.

Die DE-OS 26 26 823 beschreibt eine Separatorvorrichtung, in der die Filtervorrichtung so behandelt werden muß, daß sie hydrophil wird. Durch diese

Hyd.rpphilierungsbeh,andlung soll erreicht werden, daß die Filterscheibe in der Filtervorrichtung schon unter atmosphärischem Druck far wäßrige Lösungen durchlässig ist Deshalb ist es mit dieser Filtervorrichtung lediglich möglich, aus einer durch die Vorrichtung hindurchfließenden Flüssigkeit Komponenten herauszufiltern,

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Reaktor/Separator-Vorrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Immuno-Schnellanalyse, wobei die Reaktion und Abtrennung in der gleichen Kammer durchgeführt wei den kann.

Gelöst wird diese Aufgabe ausgehend von einer Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch, daß die Rückhalte- und Filtervorrichtung bei annähernd atmosphärischem Druck für wäßrige Lösungen undurchlässigist, jedoch für wäßrige Lösungen durchlässig wird, wenn sie einer bestimmten Zentrifugalkraft ausgesetzt wird. Eine solche Reaktor/Separator-Vorrichtung kann sicher transportiert und gelagert werden, bis sie eingesetzt wird.

Die Erfindung wird im Folgenden dur^h die Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen näher erläutert:

F i g. 1 ist die Ansicht eines Querschnittes einer erfindungsgemäßen Reaktor/Separator-Vorrichtung.

Fig.2 ist die Ansicht eines Querschnittes, die von oben nach unten die aufeinanderfolgenden Reaktions-, Inkubations- und Abtrennungsfunktionen einer Reaktor/Separator-Vorrichtung zeigt, die an einem handelsüblichen Instrument zur Analyse flüssiger Materialien angebracht ist

Die Säule 10 bei der Vorrichtung gemäß Fig. 1 kann aus nahezu jedem inerten Material bestehen, wie z. B. Glas, Plastik und dergleichen. Ein bevorzugtes Material ist Polystyrol, das durchscheinend hell ist und nicht leicht bricht. Die Säule 10 ist etwa 10 cm lang und hat einen äußeren Säulendurchmesser von etwa 10 mm. Sie kann etwa 2,5 ml Flüssigkeit enthalten. Die Spitze 12 hat einen inneren Durchmesser von etwa 1 mm und der obere Vorratsbehälter 14 hat einen äußeren Durchmesser von etwa 20 mm. Der Stopfen 16 verschließt die Spitze der Säule. Die Rückhaltescheibe 18 ist ein Filter, das für Flüssigkeiten bei atmosphärischen und niedrigen Zentrifugalkräften undurchlässig ist, jedoch bei hohen Zentrifugalkräften für Flüssigkeiten duichlässig ist Die Reaktionskammer 20 enthält das immobilisierte Reagens und lnkubat.

Wie aus F i g. 2 ersichtlich, sind die Reaktor/Separator-Säulen 10 mit einer wasserundurchlässigen Filterscheibe 18 ausgerüstet und mit einer Menge eines immobilisierten Antiserums in einer trockenen Matrix 22 beschickt. Die Säulen, die das Reaktans enthalten, werden in Teströhrchen 24 gelagert, die der Reihe nach an ihrem äußeren Rand in Kugelsitzen 26 in einem Plastikring 28 aufgehängt sind. Die Serumproben und anderen Reagenzien 30 werden in die Ausnehmungen 32 und 34 einer Transferscheibe 36 gebracht, die der Reihe nach auf einem Drehtisch angebracht ist, und automatisch befestigt wird, so daß jede Ausnehmung mit der öffnung der entsprechenden Reaktor/Separator-Säule übereinstimmt. Dann wird ein Motor so in Betrieb genommen, daß durch die Beschleunigung der entstandenen Zentrifugalkraft alle Proben und Reagenzien gleichzeitig auf die Reaktor/Separator-Säule, die das immobilisierte Reaktanz 22 enthält, übertragen werden.

In dem Fall, daß das immobilisierte Reaktans in einer dehydratisierten Matri*, wie z,B_r Polyacrylamid, eingeschlossen ist, findet gleichzeitig mit der Reaktion eine schnelle Rehydratisierung statt Nachdem eine geeignete Inkubationszeit verstrichen ist, wird der Motor auf eine höhere Geschwindigkeit beschleunigt, worauf ein geeignetes Eluierungsmittel 33 angewendet wird, das einen hinreichenden hydrostatischen Druck ausübt, so daß das wasserundurchlässige Filter nunmehr frei durchlässig wird. Dies wird erreicht indem ein Strom einer geeigneten Flüssigkeit ζ,Β, Pufferlösung, aus einem Vorratsbehälter über eine nicht gezeigte Eluierungsmittelpumpe durch eine Leitung 40 und einen Verteiler in die Aushöhlungen 32 und 34 der sich rasch drehenden Transferscheibe geleitet wird. Die Pumpe bewirkt eine bestimmte Fließrate des Eluierungsmitteis über einen bestimmten Zeitraum und die gesamte Menge des Eluierungsmitteis wird automatisch durch die Verteiler auf der Scheibe geteilt die den Fluß in die Reaktor/Separatorsäule leiten. Alle Komponenten 42, die wasserlöslich und nicht an dar immobilisierte Reaktans gebunden sind, laufen frei durch das Filter und werden in den Teströhrchen gesammelt In dem Falle, daß eines der verwendeten Reagenzien radioaktiv ist kann jedes Röhrchen von dem Trägerring entfernt werden und die Radioaktivität des Inhalts gemessen werden. Analysen, bei denen die vorliegende Erfindung in Verbindung mit einem handelsüblichen Analysegerät verwendet wurde, konnten in 7 Minuten durchgeführt werden. Dies erlaubt dem Benutzer die Durchführung kinetischer Festphasenanalysen (Nicht-Gleichgewichtsbedingungen), was mit anderen konventionellen Methoden bisher extrem schwer war.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt somit wenn sie in Verbindung mit analytischen Instrumenten verwendet wird, die Zentrifugalkraft anzuwenden, die Leistungsfähigkeit der Apparatur auf die automatisierte Festphasen-Immunoanalyse auszudehnen.

Die Binde- und Filtervorrichtung ist bevorzug*- in Form einer Scheibe ausgeführt die aus einer Vielzahl poröser Folien hergestellt sein kann. Soiche Materialien könne:; Polyäthylen, Polypropylen, Teflon oder ähnliches sein. Außerdem können anorganische Materialien wie Glas und Keramik ebenso in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In den nachfolgenden Beispielen wird Polyäthylenfolie mit einer Dicke von etwa 1,6 mm und einer Porosität von 25±3 Mikron verwendet. Es können Porositäten von etwa 25 bis etwa 150 und vorzugsweise von 25 bis 40 Mikron verwendet werden. Aus den Folien werden Scheiben von etwa 7,87

so bis 8,03 mm äußerem Durchmesser geschnitten und mit Befestigungswerkzeug im tiefsten Abschnitt des Säulenrohrs befestigt.

Die Sftule selbst kann aus nahezu jedem Material bestehen, z. B. Glas, Plastik und dergl. Ein bevorzugtes Material ist Polystyrol, das durchscheinend, hell und beständig ist und das, falls erwünscht, zweckmäßig verwendet wird, um Antisera, Enzyme und Affinitätsliganden durch physikalische Adsorption oder kovalente Bindung zu immobilisieren. Eine Säule hat bevorzugt eine Länge von etwa 100 mm und einen äußeren Rohrdurchmesser von etwa 10 mm. Sie kann etwa 25 ml Flüssigkeit enthalten. Die Spitze hat vorzugsweise einen äußeren Durchmesser von etwa 1 mm und der obere Vorratsbehälter einen äußeren Durchmesser von 20 mm. Die Säulen können abfcr auch leicht in kleinerer oder größerer Ausführung hergestellt werden.

Bei einem Radius von 13 cm ist die Filterscheibe beispielsweise bei Geschwindigkeiten von 100 U/Min

• oder weniger für Flüssigkeiten undurchlässig, wird jedoch bei der Zugabe von Eluierungsmitteln bei einer gesteigerten Geschwindigkeit von 200 U/Min oder mehr durchlässig. Die angewendete Zentrifugalkraft, die die Scheibe durchlässig macht, ist selbstverständlich eine Funktion der Geschwindigkeit des Instruments und der Entfernung der Vorrichtung vom Rotationszentrum.

Eine erfindungsgemäße Reaktor/Separator-Vorrichtung kann auf verschiedene Art und Weise verwendet werden. Beispielsweise können eine oder mehrere Reaktanten, wie z. B. Antikörper, Enzyme, Proteine, Affinitätsliganden, Ionenaustauscher oder Zellen an den Wänden der Säule befestigt werden. Sie kann aber auch eine oder mehrere auf einem Träger immobilisierte Reaktanten enthalten. Als Träger kommen dabei z. B. Polyacrylamid, Sepharose, Agarose oder andere natürliche Materialien, synthetische Polymere oder anorganische Materialien wie z. B. Glas oder Keramiken in Krage. L)ie Matrix kann beispielsweise in Form eines dehydratisierten Gels, einer festen Matrix, Perlen oder Pulver ausgeführt sein.

Die Vorrichtung kann auch für Reaktionen unter Einschluß von Mikroorganismen, Viren, roten Blutkomponenten, Geweben und dergl. verwendet werden. Sie kann für Festphasen-lmmunoanalysen sowohl von kurzer als auch von langer Dauer verwendet werden. Jedoch ist sie besonders vorteilhaft für Reaktionszeiten von sehr kurzer Dauer, d. h. weniger als 5 Minuten und insbesondere, wenn die Phasen schnell getrennt werden müssen. Gerade bei diesen kurzen Reaktionszeiten sind manuelle Methoden nicht schnell genug, um mehrfache Proben zu verarbeiten.

Die neue Reaktor/Separator-Vorrichtung kann auch zweckmäßig verwendet werden, um mit frei gebundenem Analyt aus Serumproteinen zunächst einen enzymatischen Vorbehandlungsschritt und anschließend eine Immunoanalyse durchzuführen. Ein solches Verfahren kann auf folgende Weise durchgeführt werden: Der Reaktor/Separator wird vorzugsweise mit einem Teil von Antiserum beschickt, das von dehydratisiertem Polyacrylamid eingeschlossen ist, das Poren aufv/eist, die im hydratisierten Zustand genügend klein sind, um Enzyme oder Proteine mit mittlerem und niedrigem Molekulargewicht auszuschließen. Mit dem immobilisierten Antiserum ist eine genügende Menge eines proteolytischen Enzyms vermischt, das das Serumprotein, das das interessierende Analyt bindet, denaturieren oder hydrolysieren kann. Die Serumproben und Radiomarkierungen werden zentrifugal in den Reaktor/Separator überführt. Nach der Hydratation des Gels und Solubilisierung des Enzyms beginnen zwei Prozesse: die Freisetzung des proteingebundenen Analyts und dessen Diffusion und Bindung an das Antiserum in der Gelmatrix. Nach einer vorbestimmten Zeit wird die Elution des Enzyms, ungebundenen Analyts und der Radiomarkierung durchgeführt. Wenn andererseits das proteolytische Enzym in der wäßrigen Lösung am stabilsten ist, kann der Vorbehandlungsschritt erfolgreich dadurch durchgeführt v/erden, daß das Enzym und die Serumproben in die inneren und äußeren Ausnehmungen auf der Transferscheibe des Analysengeräts gebracht werden. Wenn der Motor in Betrieb genommen wiiv\ werden die Reagenzien gleichzeitig gemischt und in die Reaktor/Separator-Säule überführt, wo die Inkubation stattfindet.

Besonders gut ist eine erfindungsgemäße Reaktor/ Separator-Vorrichtung zur Durchführung von radioimmunoanalytischen Tests für das thyreoidstimulierende Hormon (TSH) geeignet. Der TSH-Test verwendet eine immunologische Reaktion, bei der markierte und nicht markierte TSH-Moleküle um die Bindungsstellen auf einem spezifischen Antikörpermolekü! konkurrieren.

Die folgenden Beispiele zeigen Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Vorrichtung:

B e i s ρ i e I 1

Wäßrige Standardkurve mit durch Polyacrylamid
immobilisiertem Angiotensin-I-Antiserum

Trockenes von Polyacrylamid umhülltes Angiotensin 1-Antiserum in einer Menge, die hinreicht, um etwa 50% des markierten Antigens zu binden, wurde in eine Polystyrolsäule überführt, die am Boden mit einer wasserundurchlässigen Polyäthylenscheibe ausgerüstet war. Ein 100 μΐ Anteil des Angiotensins 1-(¹²⁵I), verdünnt in Trisacetat-Puffer (0.1 M, pH 7,4, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin), das etwa 20 000cpm pro 100 μΙ ergab, wurde manuell in die äußere Aushöhlung der Transferscheibe eines handelsüblichen Analysensystems pipettiert. Es wurden Standardlösungen von Angioten-

sin I hergestellt, die 100 bis 0 ng/ml in Trisacetat-Puffer enthielten und ein 300 μΙ Anteil jeder Standardkonzentration wurde doppelt in die entsprechenden äußeren Ausnehmungen der Transferscheibe pipettiert. Die Säulen, die das gelumhüllte Antiserum enthielten,

wurden in Teströhrchen gegeben und gleichzeitig mit der Transferscheibe in den Inkubator/Separator-Bauteil des Systems gegeben. Eine Zentrifugation auf dem System von 15 Sekunden Dauer überführte die 400 μΐ der Lösung in die Säulen.

Nach einer 15minütigen Inkubation wurde eine Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit begonnen und 4 ml/Röhrchen Trisacetat-Puffer zu der Transferscheibe hinzugefügt, und eine schnelle gleichzeitige Elution des nicht gebundenen Tracers vom Gel begonnen. Die Elutionslösung, die das ungebundene Angiotensin 1-(¹²⁵I) enthielt, wurde in Röhrchen unter jeder Säule gesammelt und in einem Dreikammer-Gammazählerbauanteil gezählt Die Säulen wurden ebenfalls gezählt, um die gebundene Fraktion zu bestimmen.

Die Ergebnisse wurden wie folgt berechnet:

B/T =

Zählungen in der Säule (gebunden)

Zählungen in der Säule (gebunden) + Zählungen, eluiert (frei)

% gebunden, jeder Standard

% gebunden, wenn die Standard-Konzentration im Inkubat % gebunden = B/TX100%,

0 ng/ml.

Aus den Daten wurde eine Empfindlichkeitskurve (doseresponse curve) gebildet und auf halblogarithmischem Papier aufgetragen. Die nicht spezifische Bindung des Antigens am Gel und der Säule wurde durch Einschließen von normalem Kaninchenserum in der Polyacrylamidmatrix und Inkubation und Elution in ähnlicher Weise bestimmt Es wurde gefunden, daß sie weniger als 4% betrug.

Beispiel 2

Automatisierte Analyse für Cortisol unter
Verwendung eines Wärme-Vorbehandlungsschrittes

Es wurden Cortisol-Standards hergestellt, indem zunächst Cortisol in 95%igem Äthanol und dann in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4,0,05% Tween 20) verdünn^ »vurde. Diese Standards wurden nacheinander mit Serum verdünnt, das mit Kohle vorbehandelt worden war, um endogenes Cortisol zu entfernen. Die klinischen Proben wurden mit den Standards auf Serumbasis mit einem Denaturationspuffer (90% 0,1 M Natriumphosphat bei pH 7,4, enthaltend 0,05% Tween 20, 10% Methanol) verdünnt und 30 Minuten auf 60° erhitzt, um das Cortisol bindende Globulin (CBG) zu zerstören.

Nach dem Wärmevorbehandlungsschritt wurden die Standards und Proben zusammen mit radiomarkiertem ~—>:„l .,„A D.

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absorbiertem Antiserum freigesaugt. Normale Salzlösung (1,5 ml) wird zu der Säule hinzugegeben und unmittelbar abgesaugt. Die Spülprozedur mit Salzlösung wird wiederholt, und die Säule dann mit 0,5%

Rinderserumalbumin (BSA)-Salzlösung gefüllt. Nach einer kurzen Inkubation mit der BSA-Lösung (10—30 Minuten) wird die Säule freigesaugt und an der Luft getrocknet. Die Säule enthält an ihrer inneren Wand das immobilisierte Antiserum und kann unmittelbar für die

ίο Analyse von Cortisol verwendet werden oder kann

unter Wasserausschluß bei Umgebungstemperatur

gelagert werden und innerhalb 2 bis 3 Monaten

verwendet werden.

Eine Standardkurve für Cortisol wird entweder manuell oder mit Hilfe des Inkubator/Separators des Analysen-Systems und dem Pipettierbauteil aufgestellt. Cortisol-(^I25I), Markierung, »bekannte« Standardmengen von Cortisol und 0,1 M Natriumphosphat (pH

enthaltend 7 4^-Puffer ^xv^r^'^sn r*v' ^p!T*r G**^C£>m'^rn'^ari^C7'^> v°n

0,05% Tween 20 bei pH 7,4) auf die Transferscheibe des obigen Systems mit einem Gesamtvolumen von 350 μΙ pipettiert. Der Inhalt der Scheibe wurde auf den Ring von Röhrchen übertragen, der die Säulen trug, die von Polyacrylamid umhülltes Cortisol-Antiserum enthielten. Nach der folgenden Inkubation von 15 Minuten wurde die nicht gebundene Fraktion von markiertem Cortisol durch Spülen mit 4 ml/Röhrchen Phosphat/Tween-Puffer wie oben gespült. Die Säulen und Röhrchen wurden in einem Dreilochzähler gezählt und die so erhaltenen Daten zur Aufstellung einer Standardkurve verwendet. Die .iiit diesem Verfahren gemessenen klinischen Proben zeigten eine gute Näherung an die erwarteten Werte, insbesondere wenn sie mit Daten verglichen wurden, die durch Lösungsphasenanalyse mit dem gleichen Antiserum erhalten wurden.

Beispiel 3

Automatisierte Analyse für Cortisol

unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms

zur Zerstörung des CBG

Die Analyse wurde in der gleichen Weise wie in dem obigen Beispiel beschrieben, durchgeführt, außer daß der Wärmevorbehandlungsschritt und der Denaturationspuffer weggelassen wurde. Die Inaktivierung des Cortisol bindenden Globulins fand in den Aushöhlungen der Transferscheibe statt, indem 15OuI einer Pepsinlösung (4 mg/ml in 0,14 N HCl, 4100 Einheiten/mg), 50 μΐ Cortisol-Standard auf Serumbasis, 100 μΙ Tracer und 50 μΙ 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,05% Tween 20) etwa 5 Minuten vorkubiert wurden, bevor sie auf die Säulen gegeben wurden, die das Polyacrylamid umhüllte Cortisol-Antiserum enthielt

Mit dieser Technik gemessene Kontrollsera stimmten mit den erwarteten Werten überein.

Beispiel 4

SPRIA bei der

Säulen-Reaktor/Separator-Entwicklung
einer wäßrigen Standardkurve für Cortisol

Eine Polystyrolsäule wird vor der Einführung von 1 ml Cortisol-Antiserum, das mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4 verdünnt wurde, mit einer porösen semipermeablen Scheibe aus Polyäthylen ausgerüstet Nach ein- bis zweistündiger Inkubation mit der Antiserumlösung wurde die Säule von nicht die Aushöhlungen einer Transferscheibe pipettiert. Die mit Antikörper ausgekleideten Säulen werden in die Teströhrchen gesetzt und mit der Transferscheibe in den Inkubator/Separator-Bauteil gesetzt. Durch eine Zentrifugation von 15 Sekunden werden die 1 ml Reaktionskomponenten zu den mit Antikörper überzogenen Säulen überführt, wo die statische Inkubation stattfindet. Nach 1 bis 2 Stunden werden die Säulen zentrifugiert, wobei 2 ml pro Röhrchen 0,1 M Natriumphosphatpuffer zugegeben wird, um die Säule frei von nicht gebundenem Tracer zu spülen. Der Puffer, der den nicht gebundenen Tracer trägt, wird in den Röhrchen, die die Säulen tragen, gesammelt. Ein Gammazähler wird zur Bestimmung des gebundenen Cortisol-(^I25I) in den Röhrchen verwendet. Die nicht spezifische Bindung (NSB) des Tracers an die Polystyrolsäulenoberfläche wird bestimmt, indem die Antiserum-Inkubation aufgehoben wird und eine Säule nur mit BSA behandelt wird. Die Ergebnisse werden wie oben beschrieben berechnet.

Aus diesen Werten wird eine Standardkurve aufgestellt, die Prozentgebundenes gegen Konzentration des Cortisols in jedem Standard angibt.

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Beispiel 5

Affinitätschromatographische Abtrennung von
Cortisol-Antiserum aus Serumproteinen

Eine Menge von Cortisol, das kovalent an Sepharose-4-B gebunden war, wurde in eine Polystyrolsäule gegeben, die mit einer Polyäthylenscheibe ausgerüstet war und in dem Inkubator/Separator-System angeordnet war. Rohes Cortisol-Antiserum (100μΐ), verdünnt mit 300 μΐ 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,4, wurde zu der Reaktor/Separator-Säule hinzugegeben, die das immobilisierte Hapten enthielt Nach einem geeigneten Zeitraum wurde die Säule zentrifugiert und gleichzeitig mit Puffer eluiert, um die ungebundene Fraktion zu entfernen. Die Serumproteine und nicht gebundenen Komponenten, die in den die Säulen tragenden Röhrchen gesammelt waren, wurden entfernt Statt dessen wurden saubere Teströhrchen an deren Stelle gesetzt und das Verfahren wiederholt, wobei der Phosphatpuffer durch eine Säure oder eine chaotropische Lösung ersetzt wurde. Nach der Zentrifugal-Elution wurde das Cortisol-Antiserum aus den Teströhrchen gewonnen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche;

U Realrtor/Separetor-Vbrrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Tmmuno-Schnellanalyse, bei der die Komponenten durch Zentrifugalkraft gemischt, überführt und getrennt werden, bestehend aus einer Kombination von