DE2907198C2

DE2907198C2 -

Info

Publication number: DE2907198C2
Application number: DE2907198A
Authority: DE
Inventors: Claude Paris Fr Matte
Original assignee: CENTRE NATIONAL DE TRANSFUSION SANGUINE PARIS FR
Current assignee: CENTRE NATIONAL DE TRANSFUSION SANGUINE PARIS FR
Priority date: 1978-02-28
Filing date: 1979-02-23
Publication date: 1988-02-25
Also published as: CH643068A5; GB2015156A; NL7901536A; FR2418463B1; FR2418463A1; JPS6231299B2; CA1113858A; IT1114209B; SE7901771L; DE2907198A1; SE447933B; JPS54126596A; IT7920592A0; GB2015156B; US4297104A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und identifizieren von viralen Antigenen, d. h. Viren mit Antigeneigenschaften oder zellulären bzw. erythrozytären Antigenen oder Antikörpern in einem biologischen Medium (wie. z. B. menschlichem Blut) gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1.

Bei medizinischen Analysen stellt sich häufig das Problem der genauen Bestimmung der Beschaffenheit von Antigenen, die von einer Zelle oder Teilchen getragen werden, sowie der Beschaffenheit von Antikörpern oder viralen Antigenen, die in einem serologischen Medium enthalten sind. Dies trifft vor allem auf das Gebiet der Bluttransfusion zu, wo unbedingt festgestellt werden muß, ob das Blut des Spenders bzw. der Spender mit dem Blut des künftigen Empfängers verträglich ist. Die gegebenenfalls vorhandene Unverträglichkeit von zwei Blutproben beruht darauf, daß das Plasma der einen Blutprobe Moleküle enthalten kann, die als Antikörper bezeichnet werden und die sich mit den als Antigeneinheiten oder Antige bezeichneten komplementären Struktureinheiten der Membran der roten Blutkörperchen der anderen Probe verbinden können. Ein solches Antigen wird erythrozytäres Antigen genannt. Ein Antikörper, der in der Lage ist, sich nur mit einem bestimmten Antigen zu verbinden, wird als der für dieses Antigen spezifische Antikörper bezeichnet. Die Verbindung von Antikörpern mit Antigeneinheiten auf den roten Blutkörperchen kann zur Agglutinierung dieser roten Blutkörperchen, zu ihrer Zerstörung oder dazu führen, daß sie in ihrer mechanischen Festigkeit stark beeinträchtigt werden, mit dem Risiko, daß bei Bluttransfusionen Zwischenfälle auftreten.

Es muß weiterhin sichergestellt sein, daß mit dem Spenderblut keine Krankheiten auf den Empfänger übertragen werden, die über den Nachweis eines viralen Antigens oder eines Virus mit Antigeneigenschaften oder eines diesem spezifisch entsprechenden Antikörpers festgestellt werden können. Ein Beispiel für eine solche Krankheit ist Hepatitis, die nach Blutübertragung beim Empfänger auftreten kann, wenn das Spenderblut HB-Viren enthält, die Träger des HB_s-Antigens sind.

Dies zeigt wie außerordentlich wichtig es ist, Spenderblut und Empfängerblut daraufhin zu untersuchen, ob irgendwelche Antikörper, zelluläre Antigene und Viren mit Antigeneigenschaften bzw. virale Antige enthalten sind, die bei den Empfängern Unverträglichkeits-Reaktionen oder Krankheiten auslösen können.

Im Falle von Transfusionen muß daher sichergestellt sein, daß das Nachweisverfahren ausreichend empfindlich ist. Außerdem muß das Fehlerrisiko bei der Bestimmung der Spezifität der erythrozytären oder zellulären Antigene, von Antikörpern oder Viren bzw. viralen Antigenen praktisch Null sein.

Zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern (oder von erythrozytären Antigenen) im Plasma oder Serum einer Blutprobe (oder auf roten Blutkörperchen) kennt man die Reaktion nach Coombs bzw. Coombs-Test (vergl. N. Henning, Klinische Laboratoriumsdiagnostik, 3. Aufl., 1966, S. 302 bis 304). Bei diesem bekannten Verfahren wird folgendermaßen gearbeitet, wenn beispielsweise bestimmt werden soll, ob das Plasma einer Humanblutprobe einen bestimmten Antikörper, beispielsweise einen spezifischen Anti-D-Antikörper, d. h., ob es für das Antigen D spezifische Immunoglobine enthält, von denen einige der immunochemischen Klasse G zugehören und infolgedessen IgG bezeichnet werden: In einem Röhrchen wird das Plasma, das analysiert werden soll, mit den roten Blutkörperchen inkubiert, die Antigeneinheiten D tragen, d. h. Einheiten mit einer Antigenaktivität spezifisch für den Antikörper, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit nachgewiesen werden soll; die Immunoglobine des im Plasma gegebenenfalls vorhandenen spezifischen Antikörpers verbinden sich während dieses Miteinander-in-Berührung-Bringens mit den korrespondierenden Antigeneinheiten der roten Blutkörperchen. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsmedium wird gewaschen und dann mit einem Antiglobulin inkubiert, beispielsweise mit Ziegenserum, das Anti-Human- IgG-Immunoglobulin liefert. Im Verlauf dieser Inkubation kuppelt ein Immunoglobulin der Ziege, bereitgestellt von dem Antiglobulin, aufgrund seiner spezifischen Anti-Humanfunktion mit einem menschlichen Immunoglobulin, das gegebenenfalls mit einer spezifischen Antigeneinheit eines roten Blutkörperchens verbunden ist. Nach beendeter Inkubation wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert und hierdurch, wenn der gesuchte spezifische Anti-D-Antikörper tatsächlich im Plasma vorhanden war, eine Agglutinierung der roten Blutkörperchen untereinander hervorgerufen unter Mitwirkung der von dem Antiglobulin gelieferten Immunoglobuline, und zwar aufgrund der Ausbildung von folgenden Bindungsketten:

rotes Blutkörperchen (Antigen D) - spezifisches menschliches Immunoglobulin Anti-D - menschliche Anti-Human- Immunoglobulin - spezifisches menschliches Anti-D-Immunoglobulin - (Antigen D) - rotes Blutkörperchen.

Diese Agglutinierung ist an einem Bodensatz von agglutinierten roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens zu erkennen, wobei dieser Bodensatz aber nicht in allen Fällen gut von einem Bodensatz aus nicht-agglutinierten roten Blutkörperchen unterschieden werden kann. Um sicher zu gehen, ob es sich um einen Bodensatz aus agglutinierten roten Blutkörperchen oder aus nicht agglutinierten roten Blutkörperchen handelt, wird der Röhrcheninhalt leicht bewegt. Bei negativen Reaktionen, d. h. bei Reaktionen mit einem Blutplasma, das nicht den spezifischen Anti-D-Antikörper enthielt, werden die nicht agglutinierten roten Blutkörperchen wieder homogen suspendiert, im Falle der positiven Reaktionen hingegen bleiben die roten Blutkörperchen in mehr oder weniger großen Gruppen miteinander verbunden.

Dieses Verfahren beruht auf relativ langen und komplizierten Reaktionen, die überdies manchmal nicht ausreichend empfindlich sind, was sich als Gefahr erweisen kann.

Das gleiche Problem der genauen Bestimmung der Beschaffenheit von Antigenen auf einer Zelle stellt sich auch im Falle der Transplantation von Organen. Bekanntlich tragen die Lymphozyten eine bestimmte Anzahl von Antigenen, bezeichnet als Antigene des Systems HLA. Vor irgendeinem chirurgischen Eingriff zum Zwecke der Transplantation muß festgestellt werden, welches die HLA-Antigene auf den Lymphozyten des Spenders und auf denen des Empfängers sind, damit die zumindest theoretische Gewebsverträglichkeit zwischen den Lymphozyten der beiden verschiedenen Individuen festgestellt wird; ohne diese zumindest theoretische Verträglichkeit kann eine Organtransplantation überhaupt nicht in Betracht gezogen werden. Aufgrund der hohen Anzahl von verschiedenen Antigenen des Systems HLA, die auf den Lymphozyten vorhanden sein können, muß eine beträchtliche Anzahl von Elementarreaktionen durchgeführt werden, um die jeweilige Spezifität der vorhandenen HLA-Antigene festzustellen; es können z. B. 100 Reaktionen notwendig sein, Maßnahmen, die noch dadurch erheblich erschwert werden, daß die Lymphozytenzellen nur in sehr kleinen Mengen zur Verfügung stehen und infolgedessen nur für Mikroreaktionen verwendet werden.

Außerdem werden beim Nachweisen oder Aufspüren bestimmter Viren oder viraler Antigene, beispielsweise des Antigens HB_s, derzeit radio-immunologische Arbeitsweisen angewandt, die sehr kostspielig und umweltbelastend sind und deshalb einer Sondergenehmigung bedürfen.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von viralen Antigenen, erythrozytären bzw. zellulären Antigenen oder Antikörpern in einem biologischen Medium, beispielsweise einer Humanblutprobe bereitzustellen, das sich allgemein anwenden läßt und den Nachweis beliebiger Arten viraler Antigene in einem flüssigen biologischen Medium sowie aller Arten erythrozytärer bzw. zellulärer Antigene und Antikörper, die in einer Blutprobe enthalten sind, ermöglicht. Das Verfahren soll eine hochempfindliche Analyse ermöglichen, die derjenigen der bekannten Verfahren überlegen ist, und soll dennoch ausgezeichnet spezifisch gegenüber dem viralen Antigen, dem erythrozytären oder zellulären Antigen oder dem gesuchten Antikörper bleiben. In diesem Zusammenhang wird das Analyseverfahren als um so empfindlicher bezeichnet, je geringer die Menge eines viralen Antigens, eines erythrozytären oder zellulären Antigens oder eines Antikörpers einer bestimmten Spezifität ist, die mit seiner Hilfe nachgewiesen werden kann; das Verfahren wird als um so spezifischer angesehen, je besser es ermöglicht, ohne Fehler, d. h. ohne Verwechslung, alle diese Antigene oder Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität nachzuweisen. Mit anderen Worten, ein virales Antigen einer bestimmten Spezifität darf nicht verwechselt werden mit einem viralen Antigen einer anderen Spezifität und das gleiche gilt beim Nachweis von erythrozytären oder zellulären Antigenen und von Antikörpern. Die Erfindung soll weiterhin ein Analyseverfahren bereitstellen, das nicht umweltbelastend ist, mit dessen Hilfe die Zeitspanne beträchtlich verkürzt werden kann, die zum Erhalt der Analyseergebnisse notwendig ist und das zudem auf Reaktionen beruht, die einen sehr sparsamen Umgang mit den Reaktionspartnern ermöglichen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch angegebene Verfahren. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Nachfolgend werden die in dieser Beschreibung verwendeten Begriffe näher definiert.

"Virus mit Antigeneigenschaften" im Sinne der Beschreibung ist ein Virus, für den man den mit ihm reagierenden spezifischen Antikörper kennt. Im folgenden Beschreibungstext werden hierfür die Bezeichnung Virus mit Antigeneigenschaften, Virus oder auch virales Antigen verwendet.

Immunoglobuline sind proteinartige Moleküle tierischer Herkunft, die entweder Antigen- oder Antikörperaktivität oder auch beide Aktivitäten gleichzeitig aufweisen. Für jedes Lebewesen (Mensch oder Tier) existieren Immunoglobuline, die verschiedenen immunochemischen Klassen zugehören, d. h. Immunoglobuline einer Klasse A, kurz IgA, Immunoglobuline einer Klasse G, kurz IgG, usw. Allgemein wird ein Immunoglobulin der immunochemischen Klasse X und der Tierart I mit IgX I. bezeichnet.

Testserum ist im Sinne der Beschreibung ein Serum (oder eine Lösung), das (die) Immunoglobuline einer bestimmten Tierart und einer bestimmten immunochemischen Klasse enthält - beispielsweise Human-Immunoglobuline der Klasse G, oder IgG - die spezifische Antikörperaktivität gegenüber einem bestimmten erythrozytären oder zellulären Antigen einer Gruppe von Individuen der betreffenden Art aufweisen.

In analoger Weise tragen Testkörperchen, Testzellen oder Testteilchen Antigeneinheiten oder -gruppen einer bestimmten Tierart, mit denen sich die Immunoglobuline verbinden können, die die spezifisch entsprechenden Antikörpergruppen zu den Antigeneinheiten tragen.

Als Antiglobulin wird ein Immunserum einer von der Art I verschiedenen Tierart II bezeichnet, welches Immunoglobuline einer artspezifischen Anitkörperaktivität gegenüber IgX I liefert. Das Antiglobulin wird als Ig-II-Anti-IgX bezeichnet oder, wenn keinerlei Verwechslung möglich ist, kurz als Anti-IgX I.

Das erfindungsgemäße Verfahren macht Gebrauch von einer besonderen Art von Reaktionen, nämlich von Reaktionen der "Immuno-Adhärenz" oder Immuno-Haftung. Diese Reaktionen werden so bezeichnet, weil der die Reaktion anzeigende Vorgang in einer Haftung oder Adhärenz besteht zwischen einerseits Zellen, Körperchen oder Teilchen und andererseits dem Boden eines Behälters, überzogen mit einer Schicht oder Haut aus Molekülen, die Antigen- oder Antikörpereigenschaft aufweisen. Diese Haftung ist von immunologischer Beschaffenheit, weil sie durch die Entstehung von Antigen-Antikörper- Bindungen zwischen den Körperchen, Zellen oder Teilchen einerseits und dem Behälter andererseits hervorgerufen wird.

Es wurde beobachtet, daß das erfindungsgemäße Verfahren wesentlich empfindlicher ist als die bekannten Verfahren, und zwar um das Hundertfache bis zum Tausendfachen. Außerdem ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine beträchtliche Verkürzung der Zeit, die zum Erhalt der Analyseergebnisse notwendig ist, und ermöglicht auf diese Weise die Durchführung von Schnelldiagnosen, die jetzt beispielsweise im Falle des Nachweises von erythrozytären Antigenen oder bekannten Antikörpern im Blut innerhalb von sechs Minuten anstatt bisher einer Stunde durchgeführt werden können. Das neue Verfahren ermöglicht außerdem auch eine erhebliche Einsparung an Reaktionspartnern; dies ist sehr wichtig, beispielsweise wenn so kostbare Reaktionspartner benötigt werden, wie lymphozytäre Zellen oder Testsera einer seltenen Spezifität.

Ein weiterer Vorteil des neuen Verfahrens liegt darin, daß keinerlei Radioaktivität beteiligt ist; es ist wesentlich billiger als die radio-immunologischen Verfahren und belastet im Gegensatz zu diesen Verfahren nicht die Umwelt.

Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügte Zeichnung und die nachfolgenden Anwendungsbeispiele näher erläutert.

Die Fig. 1 bis 9b erläutern schematisch die verschiedenen Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens, angewandt auf die Untersuchung einer Blutprobe daraufhin, ob Antigen HB_s enthalten ist.

Fig. 10 erläutert schematisch die Kräfte, denen eine Zelle beim Zentrifugieren unterworfen ist.

Die Fig. 11 bis 14b zeigen schematisch die verschiedenen Stufen des Verfahrens nach der Erfindung, angewandt auf den Nachweis der Anwesenheit von Antigen D auf den roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe; die Fig. 15 bis 18 sind Diagramme von Zentrifugiervorgängen.

Erstes Beispiel der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung

Diese erste Ausführungsform des Verfahrens wird mit Bezug auf die Fig. 1 bis 9b erläutert. Das Verfahren wurde hierbei angewandt, um nachzuweisen, ob das Serum, oder Plasma, einer Humanblutprobe virales Antigen HB_s enthielt, das nachfolgend zur Vereinfachung Antigen HB_s bezeichnet wird.

a) Die erste Stufe des Verfahrens besteht darin, daß die Oberfläche des Bodens eines Behälters vorbereitet wird, der zum Nachweis der Haftung oder der Nichthaftung von Zellen oder Teilchen dient.

Der Behälter, dessen Boden einen auf einer Symmetrieachse des Behälters gelegenen unteren Konvergenzpunkt aufweisen soll, ist im vorliegenden Falle ein Becher 1 aus Kunststoff, beispielsweise aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem im Schnitt V- förmigen Boden 2. Dieser Boden 2 ist mit einer Schicht oder einem Häutchen aus Immunoglobulinen 3 oder IgX I überzogen, die im vorliegenden Falle Immunoglobuline der Ziege der immunochemischen Klasse G sind, d. h. Ziegen-IgG (Fig. 1). Diese Ziegen-IgG 3 sind in der Figur als weiße Rechtecke wiedergegeben.

Die Fixierung der IgG auf dem Kunststoff des Bechers kann mit Hilfe verschiedener chemischer Verfahren erfolgen, beispielsweise durch Erzeugung von Carbodiimid-Bindungen zwischen dem Kunststoff und den IgG-Molekülen oder durch einfache Adsorption der IgG durch den Kunststoff.

Die IgG-Konzentration ist dabei nicht kritisch. Da jedoch die Sensibilität oder Empfindlichkeit der Reaktionen von der Oberflächendichte der fixierten Immunoglobuline abhängt, wird eine an Immunoglobulinen ausreichend konzentrierte Lösung verwendet, damit der Becherboden mit Immunoglobulinen gesättigt und auf diese Weise eine größtmögliche Empfindlichkeit erreicht wird.

Nach der Fixierung des Ziegen-IgG am Becherboden wird der mit IgG überzogene Becher mit einer physiologischen Lösung gewaschen, beispielsweise mit physiologischer Kochsalzlösung (9% NaCl); um alle nicht am Becher fixierten IgG zu entfernen, wird mehrere Male gewaschen.

Die auf dem Kunststoff-Becherboden fixierte Schicht aus IgG soll nicht trocken werden; daher wird im Boden des Bechers eine kleine Menge der physiologischen Kochsalzlösung zurückbehalten und die IgG-Schicht behält auf diese Weise ihre Aktivität für einige Stunden.

b) Anschließend werden die Zellen oder Teilchen (nachfolgend Reaktionspartner-Zellen oder -Teilchen bezeichnet) vorbereitet, mit deren Hilfe der Vorgang der Adhärenz oder Nichtadhärenz nachgewiesen wird, je nachdem, ob die Reaktion positiv oder negativ verläuft, d. h. ob das Serum, das analysiert werden soll, HB_s-Antigen enthält oder es nicht enthält. Im hier beschriebenen Beispiel sind diese Zellen rote Blutkörperchen vom Schaf, schematisch mit 4 bezeichnet.

An diese roten Blutkörperchen 4 werden Immunoglobuline gekuppelt, die zwingend der gleichen Tierart und der gleichen immunochemischen Klasse zugehören wie die im Becher fixierten IgX I; einige dieser Immunoglobuline müssen darüber hinaus eine Antikörperaktivität gegenüber dem HB_s-Antigen aufweisen. Die Kupplung dieser Immunoglobuline erfolgt vorteilhafterweise gleichzeitig mit einer Behandlung der roten Blutkörperchen mit Chromichlorid, damit die roten Blutkörperchen Eiweißmoleküle fixieren bzw. binden können. Im vorliegenden Falle werden somit auf den roten Blutkörperchen vom Schaf Ziegen- Anti-HB_s-IgG gekuppelt, die schematisch als gestrichelte Rechtecke wiedergegeben und mit 5 bezeichnet sind. Diese Stufe der Kupplung von IgG auf den roten Blutkörperchen wird schematisch in Fig. 2 gezeigt.

Diese Ziegen-IgG mit Anti-HB_s-Wirkung werden aus dem Serum einer Ziege gewonnen, der gereinigtes Antigen-HB_s injiziert worden ist.

Die auf diese Weise vorbereiteten roten Blutkörperchen werden als "Reaktionspartner-Blutkörperchen" bezeichnet. Natürlich können anstelle der roten Blutkörperchen beliebige andere Zellen oder Teilchen verwendet werden, an die Immunoglobuline gekuppelt werden können.

c) Die so vorbereiteten bzw. vorbehandelten und in physiologischer (Kochsalz-)Lösung suspendierten roten Blutkörperchen 4 des Schafes werden mit dem Serum oder Plasma der Blutprobe inkubiert, die untersucht werden soll, um festzustellen, ob sie Antigen-HB_s enthält oder nicht. In der Praxis wird beispielsweise ein 1 : 50 oder 1 : 100 verdünntes Plasma verwendet.

Bei dieser Inkubation, die außerhalb des zuvor vorbereiteten Bechers durchgeführt wird, wird eine Suspension von vorbereiteten roten Blutkörperchen des Schafes, wie oben beschrieben, mit dem Serum der Blutprobe in Berührung gebracht und das Ganze bei Umgebungstemperatur inkubiert, während einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen zehn Minuten. Diese Inkubationsstufe wird schematisch in Fig. 3 gezeigt, wobei die eiförmigen oder ovalen, feingestrichelten Moleküle 6 das Antigen-HB_s wiedergeben.

Ist in der Serumprobe, die analysiert werden soll, Antigen- HB_s vorhanden, so kuppeln die Moleküle 6 des Antigens mit den Anti-HB_s-IgG 5, die bereits auf den roten Blutkörperchen 4 gebunden sind. Wie schematisch in Fig. 3 gezeigt, ordnen sich die Antigen-Moleküle um die an ein rotes Blutkörperchen gebundenen Anti-HB_s-IgG-Moleküle herum an und erzeugen auf diese Weise eine sterische Hinderung in den intermolekularen Zwischenräumen, die bisher zwischen den Anti-HB_s-IgG-Molekülen vorhanden waren.

Enthält das Serum, das analysiert werden soll, kein Antigen-HB_s, so findet keinerlei Reaktion statt und die roten Blutkörperchen bleiben in dem Zustand, in welchem sie sich am Ende der vorhergehenden Stufe befunden haben, d. h. am Ende der Stufe, in der sie die Anti-HB_s-IgG der Ziege fixiert oder gebunden hatten; infolgedessen findet keinerlei sterische Hinderung um diese Anti-HB_s-IgG-Moleküle herum statt.

Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen werden vorteilhafterweise mehrmals mit physiologischer (Kochsalz-) Lösung gewaschen (Zugabe der Lösung, wieder-in-Suspension-bringen, Zentrifugieren, Dekantieren, Abgießen der überstehenden Flüssigkeit usw.), und zwar in dem Behälter, in welchem inkubiert worden ist.

d) Dann werden in den Becher 1, dessen Boden 2 mit einer Schicht aus Ziegen-IgG 3 überzogen ist, gleichzeitig eingebracht: Zum einen die, wie oben beschrieben, inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen vom Schaf und zum anderen ein Antiglobulin, d. h. ein Immunserum bzw. Antiserum, das Immunoglobuline mit einer spezifischen Antikörperaktivität gegenüber den Immunoglobulinen enthält, die zum einen an den Becher fixiert und zum anderen an die roten Blutkörperchen gebunden sind, d. h. Ig II Anti-IgX I. Im vorliegenden Beispiel wird ein Anti-Ziegen-Antiglobulin des Kaninchens zugegeben, das die Antiziegen-IgG-Immunoglobuline G oder IgG des Kaninchens enthält; diese Immunoglobuline sind schematisch in den Fig. 4a und 4b durch kleine schwarze Rechtecke 7 wiedergegeben; die Fig. 4a entspricht dem Falle einer positiven Reaktion und die Fig. 4b zeigt den Fall einer negativen Reaktion.

Gemäß einer Variante kann zunächst die Suspension der roten Blutkörperchen in den Becher gegeben werden und dann das Antiglobulin.

Die Immunoglobuline des Antiglobulins sind Immunoglobuline mit einer zumindest divalenten Antikörperfunktion gegenüber den Ziegen-IgG; ein Kaninchen-IgG mit Antiziegen-IgG-Wirkung kann somit mit einer dieser Antikörperfunktionen (oder Gruppen) mit einem am Becherboden fixierten Molekül Ziegen-IgG reagieren und mit der anderen Funktion mit einem an das rote Blutkörperchen gebundenen Molekül Anti-HB_s-Ziegen-IgG. Diese Immunoglobuline mit spezifischer Antikörperaktivität gegenüber den Ziegen-IgG werden aus dem Serum eines Tieres von unterschiedlicher Art erhalten, im vorliegenden Falle aus dem Serum eines Kaninchens dem Ziegen-IgG, vorteilhafterweise in gereinigter Form, injiziert worden ist.

Wie weiter unten noch erklärt, wird hier das Antiglobulin in relativ hoher Konzentration verwendet, beispielsweise ein Antiziegen-IgG-Antiglobulin, das mindestens einen Titer von 128 aufweist gemäß der Arbeitsweise von Coombs, und zwar rein oder wenig verdünnt (Verdünnungsverhältnis 1 : 2 oder 1 : 4).

Während der Gesamtdauer dieser Inkubation, die als Antiglobulin-Inkubation bezeichnet wird und die aus weiter unten noch angegebenen Gründen sehr kurz sein muß, wird der Becher vorteilhafterweise ständig in Bewegung gehalten, um auf diese Weise das Gemisch aus Suspension von roten Blutkörperchen und dem Antiglobulin zu homogenisieren.

e) Nach der Antiglobulin-Inkubation wird zentrifugiert, wozu genaue Bedingungen eingehalten werden müssen; durch das Zentrifugieren wird nachgewiesen, ob der Vorgang der Adhärenz eintritt oder nicht, je nachdem, ob die Serumprobe, mit welcher die vorbehandelten roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert worden sind, Antigen-HB_s enthält oder nicht.

Beim Zentrifugieren rotiert der Becher um eine Achse 1 a, die senkrecht steht zur Rotationsachse 1 b des Bechers 1; die erste Phase, Anlagerungsphase bezeichnet, wird nach einer ausreichend kurzen Zeit nach Beginn der Antiglobulin-Inkubation in Gang gesetzt, d. h. ausreichend kurz nach dem Einbringen der Blutkörperchen-Suspension und des Antiglobulins in den Becher, damit noch sehr wenig IgG 3, das am Becher fixiert ist, oder IgG 5, das an die Blutkörperchen gebunden ist, mit einem IgG 7 des Antiglobulins mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung reagiert hat. Vorteilhafterweise wird diese erste Zentrifugierphase nach einer Zeitspanne in Gang gesetzt, die maximal gleich ist der Zeitspanne innerhalb derer 10% des Ziegen-IgG mit den Anti-Ziegen-IgG- Immunoglobulinen des Antiglobulins reagiert haben. In der Praxis bedeutet dies, daß mit dem Zentrifugieren einige Sekunden bis zu einigen zehn Sekunden nach Beginn der Antiglobulin- Inkubation begonnen wird.

Während dieser ersten Zentrifugierphase wird das Reaktionsmedium, bestehend aus Suspension der Blutkörperchen vom Schaf und Antiglobulin, an die Oberfläche des Becherbodens 2 angelagert bzw. dieser Boden damit ausgekleidet, so daß die Anti-HB_s-IgG der Ziege 5, die mit den behandelten und inkubierten roten Blutkörperchen vom Schaf verbunden sind und die Ziegen-IgG 3, die auf dem Kunststoff fixiert sind, einander gegenüberstehen und auf diese Weise eine schnelle anfängliche Haftung oder Adhärenz der roten Blutkörperchen an den Becherboden hervorgerufen wird, und zwar über die Immunoglobuline 7 des Antiglobulins, die einerseits mit den IgG 5 und andererseits mit den IgG 3 kuppeln; diese schnelle Anfangshaftung erfolgt unabhängig davon, ob die Reaktion positiv oder negativ verläuft, d. h. ob auf den roten Blutkörperchen Antigen-HB_s- Moleküle über Anti-HB_s-IgG der Ziege gebunden sind oder nicht. Hierzu wird eine erste mäßige Zentrifugiergeschwindigkeit V ₁ angewandt; wie diese Geschwindigkeit bestimmt wird, wird weiter unten erklärt.

Die Fig. 5a und 5b zeigen stark vergrößert die einander gegenüberliegenden Flächen eines roten Blutkörperchens 4 und des Becherbodens 2 im Verlauf dieser Anlagerungsphase; Fig. 5a entspricht dem Fall einer positiven Reaktion; Fig. 5b entspricht dem Fall einer negativen Reaktion.

In beiden Fällen ordnen sich die Immunoglobuline-Ig 7 des Antiglobulins aufgrund ihrer speziellen Antikörperspezifität gegenüber den Ziegen-IgG zwischen einerseits den an die roten Blutkörperchen gebundenen Ziegen-IgG 5 und andererseits den am Becherboden fixierten Ziegen-IgG 3 an. Man nimmt an, daß während dieser Anlagerung oder diesem Auskleiden, das zu einer mäßig starken Haftung der roten Blutkörperchen an der Oberfläche des Becherbodens 2 führt, sich Gänge oder Freiräume zwischen dem Kunststoff und den roten Blutkörperchen ausbilden, die begrenzt sind von den Molekülketten IgG 5/Ig 7/IgG 3, welche sich gebildet haben; diese Gänge wirken als Filter gegenüber dem späteren Zutritt von neuen Molekülen Ig 7.

Wie oben gesagt, bilden sich diese Gänge sowohl bei einer positiven Reaktion aus, d. h. wenn die roten Blutkörperchen 4 vom Schaf die Antigen-HB_s-Moleküle 6 über die IgG 5 gebunden haben, wie auch im Falle einer negativen Reaktion, bei der die roten Blutkörperchen 4 die Moleküle des viralen Antigens nicht gebunden haben. Jedoch sind im Falle einer positiven Reaktion (Fig. 6a) diese Gänge mit Molekülen des viralen Antigens gefüllt, im Falle einer negativen Reaktion (Fig. 6b) hingegen nicht.

In der Praxis wird in dieser ersten Zentrifugierstufe oder -phase auf etwa 200 g beschleunigt (g = Erdbeschleunigung), während etwa 40 bis 60 Sekunden. Die Reaktion wird in einem Becher ausgeführt, der einen Öffnungswinkel des Konus von 120° aufweist.

f) Darauf wird das Zentrifugieren während mehrerer Minuten unterbrochen. Während dieser Unterbrechung zirkulieren die freien Moleküle Ig 7 in den zuvor während der Anlagerungsphase gebildeten Gängen und haben die Möglichkeit, mit den noch freien IgG 5 der roten Blutkörperchen oder den noch freien IgG 3 des Trägers zu kuppeln. Diese Phase, in der das Zentrifugieren unterbrochen wird, stellt in der Tat eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation dar.

Während der in der ersten Phase des Zentrifugierens erhaltenen mäßigen Anlagerung oder Auskleidung haben sich zwischen Behälter (Wand) und den roten Blutkörperchen Bindungsketten ausgebildet, die bestehen aus: einem IgG fixiert an den Behälter, einem Anti-IgG-Molekül und einem IgG gebunden an ein rotes Blutkörperchen. Erfindungsgemäß wurde im Verlauf von Versuchen festgestellt, daß diese Konfiguration energetisch weniger beständig ist in Anwesenheit eines Überschusses von Anti-IgG-Molekülen als die Konfiguration bestehend aus: einem IgG fixiert an dem Behälter, einem Molekül-Anti-IgG . . . einem Molekül-Anti-IgG, einem IgG gebunden an ein rotes Blutkörperchen. Man konnte hieraus schließen, daß durch Verlängerung der Dauer der Antiglobulin-Inkubation schließlich die Konfigurationen IgG/Anti-IgG . . . Anti-IgG/IgG in größerer Anzahl gebildet werden als die Konfigurationen IgG/Anti-IgG/IgG, was dann die "Enthaftung" bzw. Auflösung der Haftung zwischen den roten Blutkörperchen und dem Behälter hervorgerufen würde. Diese Annahme hat sich bestätigt und hiervon wird vorteilhafterweise Gebrauch gemacht.

Da das Reaktionsgemisch sich in Ruhe befindet, verlängert sich die Antiglobulin-Inkubation und die Ziegen-Anti-IgG 7 reagieren mit den Ziegen-IgG 3 oder 5 in der Weise, daß sich die beständigsten Konfigurationen ausbilden.

Da aber, wie oben erwähnt, im Falle einer positiven Reaktion die zwischen roten Blutkörperchen und Kunststoff entstandenen Gänge wesentlich gedrängter angefüllt sind als im Falle einer negativen Reaktion, sind im Falle einer negativen Reaktion (Fig. 6b) wesentlich mehr freie Moleküle Ig 7 vorhanden, die in den entstandenen Gängen zirkulieren als im Falle einer positiven Reaktion (Fig. 6a). Dies hat zur Folge, daß die einander gegenüberliegenden Flächen der roten Blutkörperchen und des Kunststoffes in den Gängen im Falle einer negativen Reaktion sehr viel schneller mit Ig 7 gesättigt werden, die mit den IgG 5 der roten Blutkörperchen oder mit dem IgG 3 des Kunststoffes kuppeln, als im Falle einer positiven Reaktion. Nach Ablauf einer gewissen Zeit weisen im Falle einer negativen Reaktion (Fig. 7b) die einander gegenüberliegenden Flächen der roten Blutkörperchen und des Kunststoffes einen überwiegenden Anteil an Konfigurationen folgender Art auf:

Kunststoff + IgG 3 der Ziege/Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen . . . Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen;

diese Konfiguration kann, da zwei Moleküle gleicher Beschaffenheit einander gegenüberliegen, nicht zur Ausbildung einer vollständigen Molekülbrücke Kunststoff + Ziegen-IgG 3/Ig 7 vom Kaninchen mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen führen.

Da sich diese Konfigurationen während der verlängerten Antiglobulin-Inkubationen in überwiegender Anzahl bilden, sind die Molekülbrücken, die sich zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen während der ursprünglichen schnellen Haftung in der Anlagerungsstufe gebildet haben, nicht mehr in ausreichender Zahl vorhanden, um die Haftung aufrechtzuerhalten. Es findet daher eine Ablösung statt.

Im Falle einer positiven Reaktion hingegen (Fig. 7a) tritt dieser Effekt der Absättigung der gegenüberliegenden Oberflächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Ig 7 sehr viel langsamer ein, so daß die Anzahl der mit den IgG gekuppelten Anti-IgG-Moleküle noch nicht zur Aufhebung der Haftung der roten Blutkörperchen in dem Zeitpunkt führt, zu dem im Falle einer negativen Reaktion bereits eine Ablösung stattfindet.

Die Dauer dieser Unterbrechung beim Zentrifugieren bzw. der verlängerten Antiglobulin-Inkubation wird also so geregelt oder gesteuert, daß das Ausmaß der Sättigung der einander gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Ig-7-Moleküle, das im Falle einer negativen Reaktion zur Ablösung führt, erreicht wird, das aber andererseits der Effekt der Sättigung, der im Falle einer positiven Reaktion zur Ablösung (Aufhebung der Haftung) führt, nicht erreicht wird.

g) Es folgt die letzte Stufe, in der zentrifugiert wird, und zwar bei einer Geschwindigkeit V ₂, die größer ist als die Geschwindigkeit V ₁. Mit Hilfe dieser Zentrifugierphase kann nun unterschieden werden zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion. Die Geschwindigkeit V ₁ wird so gewählt, daß die erzeugte Zentrifugalkraft die stärker mit Ig 7 gesättigten roten Blutkörperchen, d. h. die Blutkörperchen, welche die negative Reaktion anzeigen, in die Kuppe bzw. den Scheitelpunkt 10 des Bechers mitnimmt und dort sammelt (Fig. 8b), während die roten Blutkörperchen, welche die positive Reaktion anzeigen oder kennzeichnen und die an der Becherwand haften bleiben aufgrund der stehengebliebenen Molekülbrücken, nicht mitgenommen werden. Diese Molekülbrücken: Kunststoff + Ziegen-IgG 3/Ig vom Kaninchen mit Anti-Ziegen-IgG- Wirkung/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen (Fig. 8a) bleiben erhalten, weil die Phase oder Stufe der verlängerten Antiglobulin- Inkubation abgebrochen wird, bevor der Sättigungsgrad an Ig 7 des Antiglobulins erreicht ist, welcher zur Ablösung führt.

In der Praxis wird bei Verwendung eines Bechers mit einem Öffnungswinkel des Konus von 120° beim zweiten Mal, d. h. in der letzten Phase mit einer Beschleunigung von etwa 500 g während einer Zeitspanne von etwa 40 Sekunden zentrifugiert.

Die Analysenergebnisse können dann unmittelbar nach Abstoppen dieser zweiten Zentrifugierphase beobachtet werden.

Im Falle einer positiven Reaktion, d. h. in dem Fall, in dem die Serumprobe, mit welcher die roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert worden sind, tatsächlich Antigen-HB_s enthält, bleiben die roten Blutkörperchen am Becherboden haften bzw. fixiert, und zwar über die IgG 3, die Ig 7 und die IgG 5.

Man beobachtet dann beim Betrachten des Bechers entlang seiner Achse 1 b (Fig. 9a) eine homogene Monoschicht von roten Blutkörperchen, die über die gesamte Oberfläche des Becherbodens verteilt ist: es liegt Haftung vor.

Wenn andererseits die analysierte Serumprobe kein Antigen-HB_s enthält, werden die roten Blutkörperchen, wie oben beschrieben, zur Kuppe des Bechers hin mitgenommen und dort gesammelt. Betrachtet man den Becher entlang seiner Achse, so beobachtet man hier, daß sich ein Mikrosediment aus roten Blutkörperchen gebildet hat (Fig. 9b): es liegt keine Haftung vor.

Die Mengen der eingesetzten Reaktionspartner sind nicht kritisch. Als Beispiel sei angegeben, daß in einem Becher mit einem Durchmesser von 1 bis 7 mm das Volumen der eingebrachten Flüssigkeit 15 bis 250 µl beträgt, wobei die Blutkörperchen- Suspension und das Antiglobulin vorteilhafterweise in gleichen Volumina eingesetzt werden.

Wie sich aus der bisherigen Beschreibung ergibt, müssen bestimmte Stufen unter genauen Bedingungen durchgeführt werden.

Die verwendete Antiglobulin-Konzentration hängt ab von der Oberflächendichte an IgG, die die im Verlauf der Stufe b) erhaltenen vorbehandelten und als Reaktionspartner dienenden roten Blutkörperchen aufweisen; dies wird nachfolgend mit Bezug auf das zweite Anwendungsbeispiel des Verfahrens noch näher erläutert.

Die Antiglobulinkonzentration muß ausreichend hoch sein, damit einerseits eine schnelle Anfangshaftung zwischen roten Blutkörperchen und Behälterwand im Verlauf der ersten Zentrifugierstufe stattfindet und damit andererseits ein Überschuß an Anti-IgG-Molekülen vorhanden ist, die ggf. zum Vorgang der Ablösung der roten Blutkörperchen führen können, Kennzeichen der negativen Reaktion, wie weiter oben unter f) erläutert. Die Antiglobulinkonzentration soll andererseits nicht zu hoch sein, damit im Verlauf der Anlagerungsphase nicht zuviel Molekülbrücken zwischen roten Blutkörperchen und Behälterwand ausgebildet werden, da sonst selbst im Falle einer negativen Reaktion kleine Gänge entstehen, die den Umlauf oder die Zirkulation der Anti-IgG-Moleküle beim Abstoppen des Zentrifugierens stören würden.

Bei der Ausführung dieser Reaktionen der Immuno-Haftung wurde zusätzlich zu einer von der Antiglobulinkonzentration abhängigen "Zonen-Erscheinung" bzw. einem "Zonen-Vorgang", d. h. einer starken Schwankung der Sensibilität der Reaktion der Immuno-Haftung um ein Maximum, entsprechend einer bestimmten Antiglobulinkonzentration, noch eine weitere Zonen-Erscheinung bzw. ein weiterer Zonen-Vorgang nachgewiesen, der von der Zeit abhängt, während welcher dieses Antiglobulin mit den IgG vor dem Zentrifugieren in Berührung steht. Diese von der Berührungszeit abhängige Zonen-Erscheinung, die einen stärkeren Einfluß auf die Empfindlichkeit der Reaktion hat als die von der Antiklobulinkonzentration abhängige Zonen-Erscheinung, kann folgendermaßen erklärt werden:

Im Verlauf der Antiglobulin-Inkubation kuppeln die vom Antiglobulin beigesteuerten Anti-IgG-Moleküle einerseits mit den an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG und andererseits mit den an den Kunststoff des Bechers gebundenen IgG, wobei die Anzahl der gekuppelten Anti-IgG-Moleküle von der Inkubationszeit abhängt. Wie schon gesagt, folgt auf die Phase der Antiglobulin-Inkubation eine erste Zentrifugierphase, die auch als Anlagerungsphase bezeichnet wird. Je länger die Inkubation dauert, um so häufiger wird sich ein bereits an ein rotes Blutkörperchen gebundenes Anti-IgG-Molekül während der Anlagerungsphase gegenüber einem Molekül gleicher Beschaffenheit finden, d. h. gegenüber einem Anti-IgG-Molekül, das seinerseits an den Kunststoff fixiert ist. Diese Konfiguration: rotes Blutkörperchen + IgG/Anti-IgG . . . Anti-IgG/IgG + Kunststoff, die während der Anlagerung des roten Blutkörperchens an den Becherboden ausgebildet wird, wirkt sich ungünstig auf die Möglichkeit einer Haftung des roten Blutkörperchens am Kunststoff aus. Hieraus ist leicht zu ersehen, daß die Häufigkeit der Ausbildung derartiger für die Haftung ungünstiger Konfigurationen mit der Dauer der Antiglobulin-Inkubation zunimmt und das infolgedessen die Chancen der Haftung, d. h. die Höhe oder das Ausmaß der Sensibilität dieser Reaktion um so geringer ist, je länger die Antiglobulin-Inkubation dauert.

Die Sensibilität erreicht jedoch für eine Inkubationszeit Null kein Maximum. Es müssen nämlich, damit die Haftung tatsächlich realisierbar und wahrnehmbar ist, in dem Moment, in dem die Anlagerung stattfindet, einige Anti-IgG-Moleküle bereits an einen der Kupplungspartner gebunden sein, d. h. entweder an die IgG, die ihrerseits mit einem roten Blutkörperchen verbunden sind, oder an die IgG, die auf dem Kunststoff fixiert sind. Einige Sekunden oder Bruchteile von Sekunden reichen aus, damit diese einigen Anti-IgG-Moleküle sich binden oder kuppeln können.

Diese außerordentlich kurze Inkubationszeit wird vorteilhafterweise experimentell bestimmt, derart, daß in der unmittelbar auf die Antiglobulininkubation folgenden Stufe, d. h. in der Anlagerungsphase alle Reaktionen zur Anlagerung führen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ sind. Es werden also die verschiedenen Stufen des Verfahrens, beschrieben für eine negative Reaktion, ausgeführt, d. h. im vorliegenden Falle unter Verwendung einer Serumprobe, die kein HB_s-Antigen enthält, wobei die geeignete Dauer der Inkubation so beschaffen ist, daß man in der Anlagerungsphase 100% Anlagerung oder Bindung erzielt.

Weiterhin sei bemerkt, daß die Immuno-Haftung oder Immuno- Adhärenz im Verlauf der Entwicklung der Antiglobulin-Inkubation außerordentlich empfindlich ist für die schwachen oder geringfügigen Verringerungen der Oberflächendichte der an den Kunststoff fixierten IgG, die noch frei sind von Anti-IgG-Molekülen.

Der Zentrifugiervorgang insgesamt ist, wie oben beschrieben, komplex und läuft in mehreren Phasen ab, von denen jede einen besonderen mechanischen Effekt auf die Reaktionen ausübt. Bevor die genauen Bedingungen, die im Verlauf dieser Zentrifugierphasen eingehalten werden müssen, weiter erklärt werden, seien die bei einer Zentrifugation auftretenden oder eingreifenden Kräfte mit Bezug auf Fig. 10 betrachtet.

Das Zentrifugieren, erzeugt durch eine Rotation um eine Achse 1 a, die senkrecht steht zur Rotationsachse 1 b des Bechers, hat den Effekt, daß ein rotes Blutkörperchen H oder eine andere Zelle oder ein anderes Teilchen, das zum Nachweis des Vorgangs der Haftung oder der Nichthaftung verwendet wird, einer Zentrifugalkraft F _c unterworfen ist, die parallel gerichtet ist der Achse 1 b des Bechers. Außerdem spielen noch eine Reihe weiterer Parameter eine Rolle, die wie folgt definiert werden:

Der Winkel α , der von einer Mantellinie des Konus des Bechers mit ihrer Projektion in eine Ebene senkrecht zur Richtung der Zentrifugalkraft gebildet wird und der "Neigungs"-Winkel bezeichnet wird;
die Masse m eines roten Blutkörperchens;
der Zahlenwert n für die Beschleunigung g, die angewandt wird, wenn bei einer Geschwindigkeit von V UpM zentrifugiert wird;
die Zeitspanne t, während welcher die Geschwindigkeit angewandt wird;
die Summe der als nicht spezifisch bezeichneten Kräfte (FNS), welche ein rotes Blutkörperchen am Kunststoff zurückhalten; diese Summe umfaßt die elektrostatischen Kräfte der Anziehung eines roten Blutkörperchens an den Kunststoff; die immunochemischen Bindungen "parasitäre" Spezifität mit Bezug auf die Hauptspezifität, auf welcher die Reaktion beruht, die Widerstandskräfte gegenüber dem Abrutschen oder Abschleudern mittels Unterstützung durch die lokalen Hindernisse (Rauheit des Bechers, Anlehnung oder Abstützen auf der benachbarten Zelle oder den benachbarten Teilchen in geneigter [schräger] Stellung);
die Summe der spezifischen Bindungskräfte, die ein rotes Blutkörperchen auf der Neigung oder geneigten Wand des Bechers zurückhalten, bezeichnet mit FS, und die bestehen aus der Kette der Bindungen zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen, nämlich:

IgG (fixiert an einen Kunststoff)/Molekül Anti-IgG/ (IgG gebunden an das rote Blutkörperchen)

die Anlagerungskraft, die auf das rote Blutkörperchen ausgeübt wird, bei einer Geschwindigkeit von V UpM, d. h. die Kraft der Auflage des roten Blutkörperchens auf dem Kunststoff, entsprechend der Teilkraft der Zentrifugalkraft senkrecht zu einer Mantellinie des Konus. Diese Anlagerungskraft wird mit F _p bezeichnet und ist gleich n×m×cos α; die Kraft zum Abschleudern, die auf ein rotes Blutkörperchen bei einer Geschwindigkeit von V UpM ausgeübt wird, d. h. die Kraft, mit der das rote Blutkörperchen abgelöst oder abgerissen werden soll, durch die Teilkraft der Zentrifugalkraft parallel zu einer Mantellinie des Konus. Diese Abschleuder-Kraft wird als F _d bezeichnet und ist gleich n×m×sin α .

Nach diesen allgemeinen Betrachtungen sollen nun die Vorgänge im einzelnen erläutert werden, die sich im Verlauf der verschiedenen Zentrifugierphasen abspielen.

Im hier beschriebenen Beispiel wird angestrebt, daß in der ersten Zentrifugierphase, d. h. in der Anlagerungsstufe, eine schnelle Haftung der roten Blutkörperchen eintritt und infolgedessen eine schnelle Ausbildung von Gängen zwischen den einander gegenüberliegenden Oberflächen von Kunststoff und roten Blutkörperchen; diese Gänge spielen die Rolle von Filtern gegenüber dem späteren Zutritt von neuen Anti-IgG- Molekülen, wie weiter oben bereits erläutert.

Die Geschwindigkeit V ₁ dieser ersten Zentrifugierphase wird somit so gewählt, daß die Anlagerungskraft F _p1 bewirkt, daß 100% der roten Blutkörperchen haften, und zwar bei allen Reaktionen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ verlaufen. Diese Geschwindigkeit V ₁ muß somit so gewählt werden, daß die Abschleudergeschwindigkeit F _d1 nicht so stark ist, daß die Bindungskräfte, welche die roten Blutkörperchen am Boden des Bechers halten, aufgehoben werden.

Damit die durch Haftung der roten Blutkörperchen am Kunststoff gebildeten Gänge als Filter wirken können im Verlauf der nachfolgenden Phase, wenn das Zentrifugieren unterbrochen wird oder wenn mit sehr geringer Geschwindigkeit zentrifugiert wird, muß außerdem die Geschwindigkeit V ₁ ausreichend schwach sein, damit bei der Anlagerung der roten Blutkörperchen an den Boden des Bechers diese roten Blutkörperchen nicht zerdrückt werden. Wenn nämlich die Anlagerung zu stark ist und die roten Blutkörperchen auf dem Kunststoff dabei zerdrückt werden, werden auch die Gänge zerdrückt und sind nachfolgend nicht mehr vorhanden, und zwar auch im Falle der negativen Reaktionen. Die freien Anti-IgG-Moleküle könnten dann nicht mehr zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen zirkulieren, so daß der Vorgang der Absättigung der einander gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Anti-IgG- Moleküle, der weiter oben bei der Beschreibung der verschiedenen Stufen des Verfahrens näher erläutert ist, nicht mehr ablaufen könnte.

Andererseits darf aber die Geschwindigkeit V ₁ in dieser Anlagerungsstufe nicht zu gering sein. Eine zu schwache Anlagerung oder zu geringe Anlagerung würde eine ungenügende Annäherung der reaktionsfähigen Enden zur Folge haben, d. h. eine ungenügende Annäherung der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG und der an den Kunststoff fixierten IgG, so daß sich die Haftung schlecht ausbilden könnte und die Gänge nicht recht Form annehmen könnten.

Die zweite Zentrifugierphase setzt nicht unmittelbar nach der Anlagerungsstufe ein, sondern nach einer gewissen Pause oder Unterbrechungszeit, in der - wie bereits erläutert - eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation stattfindet. Die zweite Zentrifugierphase wird mit einer Geschwindigkeit V ₂ durchgeführt, die größer ist als die Geschwindigkeit V ₁. Diese Zentrifugiergeschwindigkeit V ₂ muß die Wirkung haben, daß die roten Blutkörperchen, welche am meisten Anti-IgG-Moleküle während der verlängerten Antiglobulin-Inkubation gebunden haben, d. h. die roten Blutkörperchen, die für eine negative Reaktion charakteristisch sind, zum Scheitelpunkt bzw. Kuppe 10 des Becherbodens hin mitgenommen werden, daß aber andererseits die roten Blutkörperchen nicht mitgenommen werden, die eine positive Reaktion kennzeichnen und die, wie oben näher erläutert, infolge der Haftung an den Wänden des Becherbodens auch nach der verlängerten Antiglobulin-Inkubation gebunden bleiben, d. h. nachdem das Zentrifugieren unterbrochen worden ist. Die Geschwindigkeit V ₂ wird daher so gewählt, daß die erzeugte Abschleuderkraft F _d2, die auf ein rotes Blutkörperchen einwirkt, stärker ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte, die dann alleine ein rotes Blutkörperchen zurückhalten, das am Becherboden eine negative Reaktion kennzeichnet; andererseits muß die Abschleuderkraft kleiner sein als die Summe aus FNS + FS, d. h. der unspezifischen und der spezifischen Bindungskräfte, durch die mittels Haftung die roten Blutkörperchen, welche eine positive Reaktion kennzeichnen, am Becherboden zurückgehalten werden.

In diesem Falle werden nur die roten Blutkörperchen, welche eine negative Reaktion kennzeichnen, abgeschleudert und sammeln sich in der Kuppe des Bechers, während die Blutkörperchen, die eine positive Reaktion kennzeichnen, haften bleiben. Die Unterscheidung zwischen positiver und negativer Reaktion ist dann sehr deutlich.

Für jedes untersuchtes System, d. h. für eine besondere Beschaffenheit der als Reaktionspartner verwendeten Zellen oder Teilchen, des viralen Antigens, das nachgewiesen werden soll, und der an der Reaktion beteiligten Moleküle IgX I und Anti-IgX I können somit die optimalen Werte für die oben definierten Parameter festgelegt werden, welche beim Zentrifugieren beteiligt sind, und für die die Reaktion die besten Ergebnisse liefert. Man kann dann feststellen, daß das Verhältnis von Abschleuderkraft F _d zur Anlagerungskraft F _p , das eine mögliche Ablösung bzw. ein mögliches Abschleudern anzeigt, gleich ist:

d. h. tan α . Der Zahlenwert für dieses Verhältnis hängt also nur von dem Neigungswinkel α ab.

Für einen Winkel α = 0 beträgt somit der Wert für tan α ebenfalls 0 und die Möglichkeit, daß das Teilchen abgeschleudert wird, ist gleich 0. Für einen Winkel α = 90° hingegen ist der Zahlenwert für tan a unendlich, so daß ebenfalls die Möglichkeit, daß die Teilchen abgeschleudert werden, unendlich ist, mit anderen Worten ein Nichtabschleudern bzw. Haftenbleiben ist unmöglich.

Die Zwischenwerte für den Winkel α ermöglichen somit eine Dosierung oder mengenmäßige Festlegung des Verhältnisses von Abschleuderkraft zu Anlagerungskraft und die Anpassung dieses Verhältnisses an die Beschaffenheit der Zellen oder als Reaktionspartner verwendeten Teilchen, des viralen Antigens und der beteiligten Moleküle IgG I und Anti-IgG I, so daß man ein spezifisches Abschleudern oder Ablösen von Zellen oder Reaktionspartner-Teilchen, welche eine negative Reaktion kennzeichnen, im Verlauf der zweiten Zentrifugierphase erhält.

Um unter den bestmöglichen Bedingungen arbeiten zu können, soll daher vorteilhafterweise ein Satz Becher mit unterschiedlicher Neigung vorhanden sein, so daß der Becher mit der Neigung α gewählt werden kann, die am besten der Beschaffenheit der in Rede stehenden Reaktion entspricht.

Man kann auf diese Weise gleichzeitig unter den gleichen Bedingungen beim Zentrifugieren, d. h. mit den gleichen Werten für die angewandte Zentrifugalkraft, Analysen von mehreren unterschiedlichen Proben durchführen, in denen virale Antigene unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaffenheit nachgewiesen werden sollen, indem für jede dieser verschiedenen Analyseproben der Becher gewählt wird, dessen Boden einen Neigungswinkel α mit einem solchen Wert aufweist, daß die für eine negative Reaktion charakteristischen Zellen oder Reaktionspartner-Teilchen abgeschleudert werden, wenn die für die zweite Zentrifugierphase gewählte verfügbare Zentrifugalkraft angewandt wird.

Erfindungsgemäß ist somit auch ein Satz von Bechern mit V-förmigem Boden vorgesehen, deren Öffnungswinkel für den Konus unterschiedlich sind und beispielsweise den Bereich von 80 bis 140° umfassen und jeweils um 10° voneinander verschieden sind.

Für das oben beschriebene Beispiel zum Nachweisen von viralem Antigen HB_s in einer Blutprobe werden vorteilhafterweise Becher mit konischem Boden und einem Öffnungswinkel des Konus von 120° verwendet.

Fig. 15 zeigt beispielhaft ein Diagramm der verschiedenen Zentrifugierphasen, die im Verlauf einer Reaktion zum Nachweisen von Antigen HB_s in einer Humanblutprobe durchgeführt werden, wobei die Reaktion der Immuno-Haftung in einem Becher mit konischem Boden und einem Öffnungswinkel des Konus von 120° vorgenommen wird. Auf der Ordinate ist die Zentrifugalkraft, angegeben in g, aufgetragen und auf der Abszisse die Zeit in Sekunden.

Das Reaktionsmedium, welches die zuvor mit der Serumprobe und dem Antiglobulin inkubierten Blutkörperchen enthält, wird in den Becher eingebracht, dessen Boden mit einer Schicht oder Haut aus Ziegen-IgG überzogen ist und dort einer Antiglobulin- Inkubation unterworfen. Wie bereits angegeben, wird der Becher während dieser Inkubation ständig in Bewegung gehalten, beispielsweise hin- und hergehenden Bewegungen in einer Richtung parallel zur Umdrehungsachse. Diese Phase der Antiglobulin- Inkubation und des Schüttelns ist in Fig. 15 mit I bezeichnet. Diese Phase wurde hier mit einer Beschleunigung von 4 g durchgeführt, einem Wert, der keine Auswirkung hat auf das Absinken oder die Anlagerung der roten Blutkörperchen an den Becherboden. Mit der Beschleunigung 4 g wurde während fünfzehn Sekunden zentrifugiert.

Dann wurde die Beschleunigung schnell erhöht bis zu einem Wert von 200 g und dieser Wert bis zur sechzigsten Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Becher beibehalten. In der fünfzehnten Sekunde begann somit eine Phase II, in der die roten Blutkörperchen absanken, wobei die Gesamtmenge der roten Blutkörperchen in der dreißigsten Sekunde am Becherboden versammelt war. Auf diese Phase II folgt die Anlagerungsphase III, in der alle roten Blutkörperchen an dem Becherboden angelagert wurden, und zwar sowohl im Falle der positiven Reaktionen wie im Falle der negativen Reaktionen; gleichzeitig begann die Bildung der "Filtergänge" zwischen der Oberfläche des Becherbodens und den daran anliegenden roten Blutkörperchen.

In der sechzigsten Sekunde begann die Phase der Diffusion der noch frei im Reaktionsmedium zirkulierenden Anti-Ziegen-IgG- Moleküle zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen (Phase IV im Diagramm gemäß Fig. 15); diese Phase stellt, wie bereits oben erläutert, eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation dar. Sie wurde ausgeführt, indem mit einer Beschleunigung von 8 g zentrifugiert wurde, einem Beschleunigungswert, der keinen ausreichend starken Zentrifugal- oder Zentrifugiereffekt erzeugte, damit die zuvor während der Phase III gebildeten Gänge zerdrückt worden wären. Im Verlauf der Phase IV fand fortschreitend die Sättigung der einander gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Becherboden durch Anti-Ziegen-IgG-Moleküle statt; die Schwelle, bei der die Ablösung der roten Blutkörperchen, charakteristisch für die negative Reaktion, im Anschluß an die Sättigung stattfand, wurde in der dreihundertsten Sekunde erreicht.

Die letzte Phase, während welcher die gegebenenfalls vorhandenen roten Blutkörperchen, die eine negative Reaktion kennzeichnen, sich in der Kuppe des Becherbodens sammeln, wurde durchgeführt, indem die Zentrifugierbeschleunigung schnell auf 500 g angehoben wurde; dieser Wert reicht aus, um die für die negative Reaktion kennzeichnenden roten Blutkörperchen mitzureißen, da sie am Ende der Phase IV, in der die Absättigung mit dem Antiglobulin stattfand, praktisch nicht mehr hafteten. In dieser letzten Phase V wurden die roten Blutkörperchen, die ihre Haftung im Verlauf der vorangehenden Phase IV verloren hatten, schnell gesammelt.

Diese letzte Zentrifugierphase wird in dem Moment abgebrochen, in welchem man einen Prozentsatz von abgeschleuderten roten Blutkörperchen erhält, der gerade kennzeichnend ist für eine wirkliche oder tatsächliche negative Reaktion. Im hier gegebenen Beispiel wurde die letzte Zentrifugierphase in der 340sten Sekunde abgebrochen.

Die Zahlenwerte für die Parameter jeder dieser Phasen - Zentrifugiergeschwindigkeit, Dauer - können im vornhinein im Verlauf von Versuchen festgelegt werden, die anhand einer typischen negativen Reaktion mit den gleichen Reaktionspartnern vorgenommen wurden, wobei der Versuch mit den besten Ergebnissen die Werte für die Parameter liefert, die dann für die eigentliche Analysereaktion angewandt werden.

Gemäß einer Variante wird das Zentrifugieren entsprechend der Entwicklung der im Gang befindlichen Reaktion gesteuert; das Verfahren wird dabei gleichzeitig einerseits in einem Becher ausgeführt, in welchem die Analysereaktion der Probe vorgenommen wird und andererseits in einem Becher, in welchem eine negative Kontrollreaktion vorgenommen wird; bei jeder Umdrehung während des Zentrifugierens wird mit einem Stroboskop-Blitz beleuchtet.

Das vergrößerte Bild des Bodens des Bechers, in welchem die Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera aufgenommen und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde: die Oberfläche und die Opazität des Bildes des Mikrosementes, das sich bildet, werden gemessen und die Wachstumskurve dieses Mikrosementes wird mit der Wachstumskurve des Mikrosementes verglichen, das bei einer negativen Bezugsreaktion der gleichen Art erhalten wird. Die Geschwindigkeiten und die Zeitdauer beim Zentrifugieren werden dann so gesteuert, daß die Wachstumskurve des Mikrosementes der negativen Kontrollreaktion der Wachstumskurve der Bezugsreaktion entspricht.

Das Zentrifugieren wird endgültig abgebrochen, wenn die Oberfläche des analysierten Mikrosementes einer Menge abgeschleuderter roter Blutkörperchen entspricht, die zumindest gleich ist der Menge, welche die Unterscheidungsschwelle für eine wahre negative Reaktion darstellt und die folgendermaßen definiert wird:

Im Verlauf von Vorversuchen, durchgeführt an negativen Kontrollreaktionen, wird festgelegt, welchen Prozentsatz an roten Blutkörperchen ein Mikrosediment enthält, das eine wahre negative Reaktion bezeichnet, d. h., daß unterschieden und gemessen werden kann und reproduzierbar ist und das dabei so klein wie möglich ist. Anschließend wird die Standardabweichung σ bestimmt, die für diese negativen Reaktionen erhalten wird. Die Schwelle der Unterscheidung einer negativen Reaktion entspricht dann einem Prozentsatz roter Blutkörperchen in einem Mikrosediment, der gleich ist dem für die negative Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz + 2mal die Standardabweichung. In analoger Weise entspricht die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion einem Prozentsatz roter Blutkörperchen in einem Mikrosediment, der gleich ist dem für eine negative Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz, vermindert um 2mal die Standardabweichung.

Wenn beispielsweise im Falle einer negativen Reaktion die im Sediment zusammengefaßten roten Blutkörperchen im Mittel 12% ausmachen und die Standardabweichung zu 3% bestimmt wurde, liegt die Unterscheidungsschwelle für eine negative Reaktion bei 12% + 2mal 3% = 18%. Entspricht die Oberfläche des Mikrosediments der Analysereaktion einem Prozentsatz an abgeschleuderten und im Sediment zusammengesammelten roten Blutkörperchen am Becherboden, der gleich oder größer ist als 18%, so wird die Reaktion als sicher negativ angesehen. Die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion beträgt in diesem Falle 12% - 2mal 3% = 6%: wenn also die Oberfläche des Mikrosedimentes der Analysereaktion einem Prozentsatz an roten Blutkörperchen, die im Mikrosediment versammelt sind, von 6% oder weniger entspricht, wird die Reaktion als sicher positiv angesehen. Entspricht die Oberfläche des entstandenen Mikrosediments einem Prozentsatz von roten Blutkörperchen zwischen 6 und 18%, so wird die Reaktion als zweifelhaft bewertet und sollte wiederholt werden. Das soeben beschriebene Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde mit Bezug auf den Nachweis des viralen Antigens HB_s in einer Humanblutprobe gegeben. Selbstverständlich kann dieses Verfahren auch für den Nachweis beliebiger anderer viraler Antigene in einer Blutprobe angewandt werden, indem dann in entsprechender Weise die Beschaffenheit der Zellen oder Teilchen, die als Reaktionspartner dienen, die Beschaffenheit der IgX, die am Boden des Bechers fixiert und anbesagten Zellen oder Teilchen gebunden werden, sowie die Beschaffenheit der Anti-IgX-I-Moleküle festgelegt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch auf andere biologische Flüssigkeiten als Blut anwenden, beispielsweise auf Speichel oder Urin, um dort ggf. vorhandene virale Antigene nachzuweisen oder ganz allgemein zum Nachweis von Antigenen, die als "molekular" bezeichnet werden können, d. h. freie Moleküle, die nicht an eine Zelle gebunden sind und die Antigen- Eigenschaften aufweisen, mit der Maßgabe selbstverständlich, daß die verschiedenen Reaktionspartner in entsprechender Weise modifiziert werden, d. h. die Zellen oder Teilchen, die als Reaktionspartner dienen, die Immunoglobuline, die mit diesen Zellen oder Teilchen gekuppelt und am Becher fixiert werden sollen, das Antiglobulin und die verschiedenen anderen Parameter der Reaktion.

Zweites Beispiel für die Ausführung des Verfahrens nach der Erfindung

Mit Bezug auf die Fig. 11 bis 14b sei nun ein anderes Beispiel der Anwendung oder Ausführung des Verfahrens beschrieben, wodurch bestimmt werden kann, ob die roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe die Antigenaktivität D aufweisen. Die Blutkörperchen, die diese Aktivität aufweisen, entsprechen einem Individuum mit positivem Rhesusfaktor. Wenn die roten Blutkörperchen hingegen diese Aktivitäten nicht aufweisen, ist die entsprechende Versuchsperson Rhesus-negativ. Zunächst sei eine erste Ausführung dieses zweiten Beispiels beschrieben:

a) Die erste Stufe besteht, wie im ersten Beispiel, darin, daß die Oberfläche des Trägers vorbereitet wird, auf welcher die Haftung oder Nichthaftung der Zellen bewiesen werden soll (Fig. 11 und 12).

Der Träger ist ein Becher 21 aus Kunststoff, beispielsweise aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem V-förmigen Boden 22. Dieser Boden 22 ist mit einer Schicht oder einem Häutchen aus Immunoglobulinen 23 überzogen, die der gleichen Tierart und der gleichen immunochemischen Klasse zugehören müssen, wie die Globuline mit spezifischer Antikörperwirkung des Antigens, dessen evtl. Vorhandensein auf den roten Blutkörperchen untersucht werden soll. Im vorliegenden Beispiel soll nachgewiesen werden, ob das Antigen D auf der Oberfläche der Membran der menschlichen roten Blutkörperchen vorhanden ist. Der spezifische Antikörper dieses Antigens ist ein Human-Immunoglobulin, vor allem vom Typus G mit Antikörperwirkung oder -funktion Anti-D. Am Boden des Bechers werden somit Human-Immunoglobuline vom Typ G fixiert, die man Human-IgG bezeichnet und die durch weiße Rechtecke 23 angegeben sind.

Die Fixierung oder Bindung der IgG an den Kunststoff, aus welchem der Becher besteht, wird unter den gleichen Bedingungen vorgenommen, wie sie oben im ersten Beispiel angegeben wurden. Nach der Fixierung der IgG an den Becherboden wird mit physiologischer 9%iger Kochsalzlösung gewaschen, um alle nicht fixierten IgG zu entfernen.

Die Konzentration an IgG, die eingebracht wird, ist nicht kritisch. Sie werden vorzugsweise im Überschuß eingebracht, bezogen auf die Menge, welche sich fixieren kann, indem beispielsweise eine Lösung enthaltend 1 mg/ml verwendet wird.

Damit die am Kunststoff gebundene IgG-Schicht nicht trocken wird, beläßt man im Becherboden eine kleine Menge an physiologischer Kochsalzlösung.

b) Die Zellen, die in diesem Beispiel untersucht oder analysiert werden sollen, sind rote Blutkörperchen einer Humanblutprobe, die in physiologischer Kochsalzlösung schwimmen; sie werden außerhalb des Bechers bei Umgebungstemperatur und während einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen 10 Minuten mit einem für die gesuchte Antigenaktivität spezifischen Testserum in Berührung gebracht, d. h. mit einem Serum, das IgG-Moleküle der bekannten Antikörperspezifität Anti-D enthält, die spezifisch mit den Antigen-D-Einheiten kuppeln können, die ggf. auf den roten Blutkörperchen vorhanden sind. Dieses Serum wird Anti-D-Testserum genannt. In der Praxis wird beispielsweise eine Suspension von roten Blutkörperchen aus einer Blutprobe, verdünnt 1 : 50 oder 1 : 100, verwendet.

Fig. 13a zeigt auf der rechten Seite schematisch diese Stufe der Inkubation für den Fall, daß die analysierten roten Blutkörperchen "positiv" sind, d. h., daß sie Anti-D-Einheiten tragen; diese Einheiten werden durch Punkte gekennzeichnet, die auf der Membran der roten Blutkörperchen 24 vorhanden sind. Diese roten Blutkörperchen kuppeln über ihre Antigen-Einheiten mit Antikörper Anti-D-IgG-Moleküle 25 des verwendeten Testserums, wobei diese IgG-Moleküle 25 mit Antikörperaktivität durch gestrichelte Rechtecke wiedergegeben sind; es entsteht ein Komplex, wie er bei 26 gezeigt ist.

In analoger Weise zeigt Fig. 13b schematisch diese Stufe für den Fall, daß die roten Blutkörperchen 24′ "negativ" sind, d. h. keine Antigen-D-Einheiten tragen. In diesem Falle kuppeln die roten Blutkörperchen 24′ keine Anti-D-IgG 25.

Nach beendeter Inkubation wird vorteilhafterweise mehrere Male gewaschen, beispielsweise 3mal mit physiologischer Lösung, wobei jeder Waschgang folgende Arbeitsschritte umfaßt: Einbringen der physiologischen Lösung, erneut in-Suspension- bringen, Zentrifugieren, Dekantieren, Verwerfen der überstehenden Flüssigkeit. Gewaschen wird in dem Behälter, in dem inkubiert worden ist. Man erhält auf diese Weise eine Suspension von inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen, d. h. von roten Blutkörperchen, die in einem Medium frei von IgG 25 schwimmen.

c) Dann werden gleichzeitig in dem Becher 21, dessen Boden mit Human-IgG 23 beschichtet ist, die Suspension der inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen und ein Antiglobulin eingebracht, d. h. eine Lösung von tierischen Antiglobulinen 27, die Antikörperwirkung gegenüber den Human-IgG aufweisen. Diese Immunoglobuline 27 des Antiglobulins sind im Bild schematisch mit schwarzen Rechtecken wiedergegeben.

Gemäß einer Variante kann in einen Becher zunächst die Suspension der roten Blutkörperchen und dann das Antiglobulin eingebracht werden.

Als Antiglobulin wurde hier ein Immunserum einer Ziege verwendet, der man die Human-IgG injiziert hatte. Dieses Immunserum liefert Immunoglobuline, bezeichnet als Ziegen-Ig mit Antihuman-IgG-Wirkung, die eine zumindest divalente Antikörperwirkung gegenüber den Human-IgG aufweisen; ein Antihuman- IgG-Ziegen-Ig kann somit über seine eine Antikörperfunktion mit einem Human-IgG kuppeln, das am Becherboden fixiert ist und über die andere Funktion oder Gruppe mit einem Human-IgG, das an ein rotes Blutkörperchen gebunden ist.

Das Antiglobulin wird hier in starker Konzentration verwendet. Die Sensibilität der Immuno-Haftungsreaktion hängt nämlich von der Antiglobulinkonzentration ab. Eine mögliche Erklärung dieser Erscheinung kann folgendermaßen lauten: gleichgültig wie lange praktisch die Antiglobulin-Inkubation gedauert hat, wird eine 100%ige Absättigung der IgG bei weitem nicht erreicht, und zwar sowohl bei den IgG, gebunden an die roten Blutkörperchen, wie auch bei den an den Becherboden fixierten IgG. Die Auskleidung mittels der Abscheidung von roten Blutkörperchen bewirkt somit, daß sich eine beträchtliche Anzahl von heterologen IgG-Molekülen nähern, d. h. von IgG, die am Becherboden fixiert sind und von IgG, die an die roten Blutkörperchen gebunden sind. Solange jedoch das rote Blutkörperchen nicht durch Haftung immobilisiert worden ist, d. h. solange die Moleküle des Antiglobulins keine Brücke gebildet haben zwischen den an das rote Blutkörperchen gebundenen und den am Kunststoff fixierten IgG, rollt oder gleitet das rote Blutkörperchen auf der Neigung des Becherbodens, der mit IgG überzogen ist, so daß die Zeitdauer der maximalen Annäherung der beiden gegebenen heterologen IgG-Moleküle sehr kurz ist und dies um so mehr, je weniger die roten Blutkörperchen mit IgG besetzt sind. Die Zeitspanne, während welcher die Entfernung günstig bleibt für eine Doppelreaktion mit einem Molekül des Antiglobulins, ist somit sehr kurz. Ist der kürzeste mittlere Abstand zwischen einem Antiglobulin-Molekül und zwei heterologen IgG-Molekülen zu groß, damit die mittlere Zeit des Zutrittes dieses Antiglobulin- Moleküls kleiner ist als die wirksame Zeit der Annäherung von zwei heterologen IgG-Molekülen auf günstige Entfernung, so wird keine Reaktion stattfinden. Man erkennt sofort, daß durch Erhöhen der Antiglobulin-Konzentration diese mittlere Zutritt-Zeit verringert wird.

Außerdem muß, da man nicht im voraus die IgG-Oberflächendichte der roten Blutkörperchen kennen kann, das Antiglobulin in starker Konzentration verwendet werden, um sicherzustellen, daß selbst im Falle einer sehr geringen Oberflächendichte an IgG der roten Blutkörperchen die Anti-IgG-Moleküle mit den wenigen auf den roten Blutkörperchen vorhandenen IgG reagieren können, um sie auf diese Weise an den Behälter anzulagern. In diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß der Einfluß der Antiglobulinkonzentration auf die Empfindlichkeit der Reaktion weniger stark ist im Falle des Nachweises eines viralen Antigens, wie HB_s-Antigen, da in diesem Falle die Oberflächendichte an IgG der roten Blutkörperchen, welche als Reaktionspartner dienen, relativ hoch angesetzt wird.

Man verwendet beispielsweise ein Antiglobulin mit Antihuman- IgG-Wirkung, das einen Titer von mindestens 128 gemäß Coombs aufweist, rein oder wenig verdünnt. In der Praxis wird eine Verdünnung des Antiglobulins verwendet, die die als optimal bestimmte Konzentration aufweist mit Bezug auf die Empfindlichkeit der anderen bekannten Analyseverfahren, insbesondere im Hinblick auf den Coombs-Test, der auf einer Hämagglutination beruht.

Im Becher wird dann die nach der Stufe b) erhaltene Suspension von Blutkörperchen mit dem Antiglobulin inkubiert, wobei der Becher ggf. im Verlauf dieser Antiglobulin-Inkubation in Bewegung gehalten wird.

d) Anschließend an diese Inkubation wird zentrifugiert; dies muß unter genau bestimmten Bedingungen erfolgen, weil bei diesem Zentrifugieren der Vorgang der Haftung eintritt oder nicht, je nachdem, ob die roten Blutkörperchen positiv oder negativ sind.

Wie oben mit Bezug auf das erste Beispiel erklärt, soll die Antiglobulin-Inkubation sehr kurz sein. Man beginnt daher mit dem Zentrifugieren wenige Sekunden bis zu wenigen 10 Sekunden nach dem Einbringen des Reaktionsmediums, bestehend aus Suspension der roten Blutkörperchen und Antiglobulin in den Becher, d. h. nach einer Zeitspanne, die ausreichend kurz ist, damit noch sehr wenige an den Becherboden fixierte IgG (IgG 23) oder an die Blutkörperchen gebundene IgG (IgG 25) mit den Antihuman-IgG-Ig- Molekülen des Antiglobulins besetzt bzw. gekuppelt sind, wenn die entsprechenden Voraussetzungen gegeben sind.

Bei diesem Zentrifugieren wird um eine Achse 21 a rotiert, die senkrecht verläuft zur Rotationsachse 21 b des Bechers, und zwar in zwei Stufen oder Zeitabschnitten bzw. Phasen:

In der ersten Stufe wird das Reaktionsmedium gegen die Fläche des Becherbodens 22 verteilt und daran angelagert, so daß alle Komplexe aus roten Blutkörperchen und IgG, wenn solche gebildet worden sind, oder alle durch die Inkubation mit dem Anti-D-Testserum nicht veränderten roten Blutkörperchen den IgG gegenüberliegen oder -stehen, die an den Kunststoff fixiert sind, indem eine erste Zentrifugiergeschwindigkeit V ₁ angewandt wird, deren Zahlenwert nicht ausreicht, um die roten Blutkörperchen in die Kuppe 30 des Becherbodens mitzunehmen bzw. mitzuziehen.

Wie sich aus den oben dargelegten allgemeinen Betrachtungen ergibt, wird die Geschwindigkeit V ₁ dieser ersten Zentrifugierphase so gewählt, daß die hierdurch erzeugte Abschleuder- Geschwindigkeit F _d1 nicht stark genug ist, um die unspezifischen Bindungskräfte FNS aufzuheben oder zu zerreißen, die die roten Blutkörperchen am Becherboden festhalten. Die roten Blutkörperchen werden somit angelagert und befinden sich in einer Stellung, die es ggf. ermöglicht, daß Antihuman-IgG-Moleküle des Antiglobulins eine Brücke ausbilden zwischen den am Kunststoffboden fixierten Human-IgG und den an den roten Blutkörperchen gebundenen Human-IgG. Diese Anlagerungsphase ermöglicht auch, daß Antihuman-IgG-Moleküle, die bereits fest mit den Komplexen aus positiven roten Blutkörperchen und IgG gebunden sind, den noch verfügbaren IgG-Stellen auf dem Kunststoff gegenüber angeordnet werden, d. h. in eine günstige Stellung, um vollständige Molekülbrücken zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen auszubilden.

Die erste Zentrifugiergeschwindigkeit V ₁ wird außerdem ausreichend lang beibehalten, damit, wenn erforderlich, diese Molekülbrücken zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen sich ausbilden und vervollständigt werden; diese Brücken bestehen aus einer Kette folgender Bindungen:

Kunststoff + IgG 23/Antiglobulin 27/IgG 25/positive Blutkörperchen 24.

In der Praxis wird die Reaktion in einem Becher ausgeführt, der einen Öffnungswinkel des Konus von 120° aufweist; die erste Zentrifugierphase wird mit einer Beschleunigung von etwa 200 g während etwa einer Minute vorgenommen.

e) Hierauf folgt eine zweite Zentrifugierphase, die bei einiger Geschwindigkeit V ₂ durchgeführt wird, welche größer ist als die Geschwindigkeit V ₁. Durch diese zweite Zentrifugierphase kann zwischen positiver und negativer Reaktion unterschieden werden. Die Geschwindigkeit V ₂ wird so gewählt, daß die erzeugte Zentrifugalkraft die negativen roten Blutkörperchen, sofern vorhanden, in die Kuppe 30 des Becherbodens zieht und sie hier versammelt bzw. zusammenballt (Fig. 14b). Sie reicht hingegen nicht aus, um die positiven roten Blutkörperchen mitzunehmen, die an die Becherwand gebunden bleiben, und zwar mit Hilfe der IgG 23, der Antihuman-IgG-Moleküle 27 und der IgG 25 (Fig. 14a). Die Geschwindigkeit V ₂ wird also so gewählt, daß die durch dieses Zentrifugieren erzeugte Abschleudergeschwindigkeit F _d2 eine Intensität aufweist, die größer ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte FNS, die ein negatives rotes Blutkörperchen am Becherboden halten, jedoch kleiner als die Summe aus unspezifischen Bindungskräften und spezifischen Bindungskräften FNS + FS, die ein positives rotes Blutkörperchen am Becherboden festhalten.

In der Praxis wird, wenn diese Reaktion in einem Becher mit einem Scheitelwinkel von 120° ausgeführt wird, in dieser zweiten Phase mit einer Beschleunigung von etwa 1600 g zentrifugiert, und zwar während einiger Sekunden bis zu einigen zehn Sekunden.

Die Analyseergebnisse erscheinen unmittelbar nach Ende der Reaktion.

Im Falle einer positiven Reaktion, d. h. wenn die analysierten roten Blutkörperchen tatsächlich Antigen-D-Aktivität aufweisen, bleiben alle Komplexe 26 aus roten Blutkörperchen und IgG am Becherboden gebunden, und zwar über die Antihuman-IgG- Moleküle 27 (Fig. 14a) und die Human-IgG 23. Man beobachtet dann beim Betrachten des Bechers entlang seiner Achse 21 b (rechte Seite der Fig. 14a) eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen, die über die gesamte Fläche des Becherbodens verteilt sind: es liegt Haftung vor.

Wenn die analysierten roten Blutkörperchen hingegen keine Antigen-D-Aktivität aufweisen, werden sie im Verlauf der zweiten Zentrifugierphase in die Kuppe 30 des Becherbodens mitgenommen und hier zusammengeballt. Betrachtet man den Becher entlang seiner Achse, so beobachtet man in diesem Falle die Bildung eines Mikrosedimentes 31, das aus roten Blutkörperchen besteht (rechte Seite der Fig. 14b): Es ist nicht zur Haftung gekommen.

Die angewandten Mengen der Reaktionspartner sind nicht kritisch. In einem Becher mit Durchmesser 1 bis 7 mm wird beispielsweise ein Flüssigkeitsvolumen von 15 bis 250 µl eingebracht, wobei vorteilhafterweise gleiche Volumina an Suspension der roten Blutkörperchen und an Antiglobulin eingesetzt werden.

Das soeben mit Bezug auf die Untersuchung, ob Antigen- D-Einheiten auf roten Blutkörperchen vorhanden sind oder nicht, beschriebene Verfahren kann unter den gleichen Bedingungen angewandt werden, um zu untersuchen, ob Serum oder Plasma einer Humanblutprobe Anti-D-spezifische Antikörper enthalten. In diesem Falle wird das Serum, welches analysiert werden soll, mit Test- Blutkörperchen inkubiert, die bekannte Antigen-D-Spezifität aufweisen: wenn das Serum, welches analysiert werden soll, Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält, kuppeln die von diesem Serum gelieferten Immunoglobuline mit Anti-D-spezifischer Antikörperwirkung mit den Antigen-D-Einheiten der roten Blutkörperchen.

Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen werden dann vorteilhafterweise gewaschen und in den Behälter eingebracht, wie oben beschrieben, und zwar gleichzeitig mit dem Antiglobulin; anschließend werden die gleichen Zentrifugierstufen durchgeführt, wie oben erwähnt.

Ist die Reaktion positiv, d. h. enthält das Serum, das analysiert werden soll, in der Tat Anti-D-spezifische Antikörper, so bildet sich eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen aus, die an der Oberfläche des Becherbodens haften aufgrund der Ausbildung von Molekülbrücken der Konfiguration Kunststoff + IgG/Anti-IgG/IgG/rote Blutkörperchen. Enthält hingegen das Serum, das analysiert werden soll, keine Anti-D-spezifischen Antikörper, so ist die Reaktion negativ und die Blutkörperchen, die nicht am Becherboden zur Haftung gebracht werden konnten, finden sich am Ende der Reaktion in Form eines Mikrosedimentes in der Kuppe des Bechers.

Das Verfahren wurde bisher beschrieben mit Bezug auf die Untersuchung, ob rote Blutkörperchen Antigeneinheiten D tragen oder ob im Plasma oder Serum einer Blutprobe Antikörper mit Anti-D-Spezifität vorhanden sind; es kann auch für die Untersuchung oder den Nachweis beliebiger anderer erythrozytärer Antigene oder beliebiger anderer Antikörper im Plasma einer Blutprobe angewandt werden. Wird die Untersuchung im Hinblick auf ein bestimmtes erythrozytäres Antigen geführt, so werden die Blutkörperchen, für die bestimmt werden soll, ob sie in der Tat Antigenaktivität aufweisen, mit einem Testserum inkubiert, das den bekannten spezifischen Antikörper des gesuchten Antigens enthält. Umgekehrt wird, wenn man wissen will, ob das Plasma einer Blutprobe einen bestimmten Antikörper enthält, dieses Serum mit bekannten Test-Blutkörperchen inkubiert, die die dem gesuchten Antikörper entsprechende Antigen-Aktivität aufweisen.

Diese Test-Blutkörperchen können rote Blutkörperchen sein, die Antigeneinheiten tragen, welche für den gesuchten Antikörper spezifisch sind. Es können statt dessen auch Zellen anderer Beschaffenheit oder geeignete Teilchen eingesetzt werden, beispielsweise Kunststoffteilchen, Zellen oder solche Teilchen, auf denen die für den gesuchten Antikörper spezifischen Antigeneinheiten vorher gebunden worden sind.

Anschließend werden dann die verschiedenen weiteren Stufen durchgeführt, wie sie oben beschrieben wurden, indem ggf. die verschiedenen Arbeits-Parameter verändert werden, beispielsweise die Parameter für das Zentrifugieren, so daß die Haftung oder Nichthaftung nachgewiesen werden können.

Das zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung kann auch angewandt werden für Untersuchungen beliebiger Arten von zellulären Antigenen, beispielsweise Antigen, das von den Lymphozyten getragen wird oder auch Plättchen- Antigen, indem in entsprechender Weise die Beschaffenheit der verschiedenen Reaktionspartner, d. h. Testserum, Immunoglobuline, die am Becherboden fixiert werden, und Antiglobulin ausgewählt werden.

Dieses zwe 28151 00070 552 001000280000000200012000285912804000040 0002002907198 00004 28032ite Beispiel des Verfahrens nach der Erfindung kann gemäß einer Variante oder Abänderung durchgeführt werden, die nachfolgend beschrieben wird. Es handelt sich wiederum um den Nachweis, ob die roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe Antigen-D-Aktivität aufweisen oder nicht.

a) Wie in der zuvor beschriebenen Variante besteht die erste Stufe darin, daß der konische Boden des Bechers aus Kunststoff so vorbereitet wird, daß er mit Human-IgG beschichtet oder überzogen ist, d. h. mit Immunoglobulinen der gleichen Tierart und der gleichen immunochemischen Klasse, denen die in der nächsten Stufe verwendeten Antigen-D-spezifischen Antikörper zugehören.

b) Anschließend wird, wie zuvor, in einem anderen Becher als dem Analysebecher eine Inkubation vorgenommen, der roten Blutkörperchen, welche analysiert werden sollen und in einer geeigneten physiologischen Lösung schwimmen, mit einem Testserum, das Antikörper bekannter Anti-D-Spezifität enthält (Anti-D-Testserum). Die mit dem Testserum inkubierten roten Blutkörperchen werden dann zweckmäßigerweise mit physiologischer Lösung gewaschen.

c) Anschließend werden, immer noch außerhalb des Analysebechers, die so vorbehandelten roten Blutkörperchen mit einem Antiglobulin inkubiert, d. h. mit einem tierischen Immunserum, das Anti-Human-IgG-Immunoglobuline liefert. Diese Inkubation wird unter den üblichen Temperaturbedingungen vorgenommen, beispielsweise bei 20°C und während ausreichend langer Zeit, damit die größtmögliche Anzahl oder zumindest ein hoher Prozentsatz der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG-Moleküle (im Falle, daß die roten Blutkörperchen positiv sind) mit den Antihuman-IgG- Molekülen kuppeln. Vorteilhafterweise dauert eine solche Inkubation 20 Minuten.

Das verwendete Antiglobulin wird vorteilhafterweise in höherer Konzentration eingesetzt, aus den gleichen Gründen, wie sie oben bereits erläutert wurden. Im vorliegenden Falle wird mit einem Antiglobulin gearbeitet, das einen Coombs-Titer von mindestens 128 aufweist, verdünnt oder wenig verdünnt, d. h. in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 2 oder 1 : 4.

d) Am Ende dieser Inkubationszeit wird das Reaktionsmedium, bestehend aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobulin, in den Becher gegeben, dessen Boden mit Human-IgG beschichtet bzw. überzogen ist.

e) Dann wird sofort ein erstes Mal zentrifugiert, wobei der Becher um eine Achse rotiert, die senkrecht steht zu seiner Rotationsachse. Diese Zentrifugierphase wird bei einer Geschwindigkeit V ₁ ausgeführt, die ausreichend groß ist, damit die Blutkörperchen sich an der Oberfläche des Becherbodens anlagern, die aber nicht ausreicht, um die unspezifischen Bindungskräfte aufzuheben, durch die die roten Blutkörperchen, sowohl die negativen wie die positiven, an die Becherwand gebunden sind. Die Geschwindigkeit V ₁ wird somit so bemessen, daß die Intensität der erzeugten Abschleuderkraft kleiner ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte FNS. Diese erste Zentrifugiergeschwindigkeit wird während einer ausreichenden Zeit beibehalten, damit die Molekülketten, bestehend aus einem am Becherboden fixierten Human-IgG, einem Anti-Human-IgG-Molekül und einem Human-IgG, das spezifisch an eine Antigen-D-Einheit eines roten Blutkörperchens gekuppelt ist, sich ausbilden können; diese Zeit wird entsprechend der Beschaffenheit des untersuchten Antigens oder Antikörpers im voraus bestimmt. Im vorliegenden Falle wird mit einer Beschleunigung von etwa 200 g während etwa einer Minute zentrifugiert.

f) Anschließend wird - wie bei der ersten Ausführungsform - ein zweites Mal zentrifugiert.

Genauer gesagt, die Zentrifugiergeschwindigkeit wird auf einen Wert V ₂ gesteigert, der so bemessen ist, wie bereits erklärt, daß die Intensität der erzeugten Abschleuderkraft ausreicht, um die Blutkörperchen, die nur über unspezifische Bindungskräfte an den Becher gebunden sind, d. h. die negativen Blutkörperchen in die Kuppe des Bechers mitzunehmen, daß die Intensität hingegen nicht ausreicht, um die Blutkörperchen mit Antigen-D-Funktion in die Kuppe mitzunehmen; d. h. die Intensität reicht nicht aus, um die Summe aus unspezifischen Bindungskräften FNS einerseits und spezifischen Bindungskräften FS andererseits aufzuheben, durch die die positiven roten Blutkörperchen an der Neigung des Bechers gehalten werden, und zwar dank der ausgebildeten Molekülbrücken, Kunststoff + Human-IgG/ Antihuman-IgG/Anti-D-Human-IgG/Antigen D eines Blutkörperchens.

Man beobachtet die gleichen Ergebnisse, wie sie zuvor erhalten wurden: wenn die Reaktion positiv ist, tritt Haftung ein und man beobachtet beim Betrachten des Bechers entlang seiner Rotationsachse eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen, die über den Becherboden verteilt sind. Ist hingegen die Reaktion negativ, so findet keine Haftung statt und man beobachtet in der Kuppe des Becherbodens ein Mikrosediment.

Diese zweite Ausführungsform unterscheidet sich von der ersten oben beschriebenen vor allem darin, daß die Antiglobulin-Inkubation, d. h. die Inkubation der roten Blutkörperchen, die zuvor mit dem Testserum inkubiert worden sind, und der Antihuman-IgG-Moleküle nicht in dem mit Human-IgG ausgekleideten Becher unmittelbar vor der ersten Zentrifugierphase vorgenommen wird, sondern außerhalb dieses Bechers und daß das dabei erhaltene Reaktionsmedium dann erst in den Becher eingebracht und hier zentrifugiert wird. Was hierbei angestrebt wird, ist eine maximale Asymmetrie zwischen dem Prozentsatz an Antihuman-IgG-Molekülen, die mit den an den Kunststoff gebundenen oder fixierten Human-IgG-Molekülen reagiert haben, und dem Prozentsatz Antihuman-IgG-Moleküle, die mit den an die roten Blutkörperchen gebundenen Human-IgG- Molekülen reagiert haben. Die ideale Bedingung wird erreicht, wenn 0% der am Kunststoff fixierten Human-IgG-Moleküle durch Antihuman-IgG-Moleküle besetzt sind bzw. mit diesen gekuppelt haben und wenn der größtmögliche prozentuale Anteil an Human-IgG-Molekülen, die an die roten Blutkörperchen gebunden sind, durch Antihuman-IgG-Moleküle besetzt ist bzw. mit diesen gekuppelt hat, vorausgesetzt, daß dieses Maximum unterhalb des Wertes legt, der eine direkte Agglutinierung der roten Blutkörperchen miteinander über die Anti-IgG-Moleküle hervorruft.

Es ist nämlich wahrscheinlich, daß die maximale Empfindlichkeit der Haftungsreaktion erreicht wird, wenn zu Beginn der Anlagerung der roten Blutkörperchen an die Fläche des Becherbodens, d. h. zu Beginn der ersten Zentrifugierphase, eine maximale Asymmetrie erreicht wird der Verteilung der an die beiden möglichen Kupplungsstellen gebundenen Anti-IgG-Moleküle, d. h. der an den Kunststoff fixierten IgG und der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG; diese Asymmetrie ist so gerichtet oder beschaffen, daß die Kupplungsstelle mit der geringeren Oberflächendichte an IgG den größeren Prozentsatz an Anti-IgG-Moleküle gebunden hat. In dem Fall, der hier als Beispiel dient, ist die Kupplungsstelle (oder Kupplungsende) mit der geringeren Oberflächendichte an IgG das rote Blutkörperchen und der Kunststoff weist eine höhere Oberflächendichte an IgG auf, weil diese Immunoglobuline hier bis zum Sättigungsgrad fixiert oder gebunden worden sind.

Eine solche Antiglobulin-Inkubation wird als "asymmetrisch" bezeichnet, während die in der ersten Ausführungsform oben beschriebene Antiglobulin-Inkubation als symmetrisch bezeichnet wird, da dort jede der beiden IgG-Kupplungsstellen gleichzeitig mit dem Antiglobulin in Berührung gebracht wird.

Im Falle der Identifizierung von erythrozytären oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern kann mit Hilfe einer asymmetrischen Antiglobulin-Inkubation außerhalb des Analysebechers, in welchem die Reaktion der Immuno-Haftung stattfindet, eine um das 10- bis 100fache höhere Empfindlichkeit erreicht werden als in den Fällen, in denen eine symmetrische Antiglobulin- Inkubation vorgenommen wird.

Diese zweite Ausführungsform, bei der mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird, wird somit vorzugsweise vor allem für solche Reaktionen angewandt, die als schwierig qualifiziert werden können, d. h. für Reaktionen, die charakterisiert sind durch eine sehr kleine Anzahl von Immunoglobulinen-Ig, beispielsweise IgG, welche an die Blutkörperchen gebunden sind; dies kann das Ergebnis sein, von einer sehr kleinen Menge eines bestimmten Antikörpers, welcher im analysierten Serum identifiziert werden soll, oder einer sehr geringen Oberflächendichte eines zellulären Antigens auf den Blutkörperchen, welche analysiert werden sollen.

Das Verfahren mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation kann auch angewandt werden, um zu bestimmen, ob ein Serum den Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält. In diesem Falle läßt man das Serum, das analysiert werden soll, mit roten Test-Blutkörperchen, die die bekannte Antigen-Aktivität D aufweisen, inkubieren und verfährt dann weiter, wie oben beschrieben.

Das Verfahren kann auch angewandt werden, um andere erythrozytäre Antigene als Antigen D zu identifizieren und ganz allgemein, um alle Arten von zellulären Antigenen zu identifizieren, beispielsweise lymphozytäre Antigene oder Plättchen- Antigene; die Reaktionspartner beteiligen sich an der Reaktion der Immuno-Haftung und die Parameter für das Zentrifugieren werden dann in geeigneter Weise dem analysierten serologischen System angepaßt. In analoger Weise kann dieses Verfahren auch für die Identifizierung aller Arten von Antikörpern angewandt werden, die im Plasma oder Serum einer Blutprobe enthalten sind.

In dem oben beschriebenen Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens, angewandt auf die Identifizierung von erythrozytären oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern, die im Plasma einer Blutprobe enthalten sind, umfaßte das Zentrifugieren, mit welchem die Erscheinung der Haftung oder der Nichthaftung aufgezeigt wird, zwei Phasen, wobei die zweite Phase bei höherer Zentrifugiergeschwindigkeit durchgeführt wurde als die erste Phase.

Gemäß einer Variante kann beim Zentrifugieren mit einer einzigen Beschleunigung gearbeitet werden, die geeignet ist, zumindest momentan, alle Körperchen, beispielsweise rote Blutkörperchen an die Wand des Behälterbodens anzulagern, wobei der Zahlenwert dieser Beschleunigung so ist, daß unter diesen Teilchen nur solche, falls vorhanden, langsam und zunehmend von der Wand abgerissen oder abgeschleudert und in der Kuppe des Behälterbodens gesammelt werden, die an der Wand des Behälterbodens nicht haften können, weil sich keine Molekularketten, bestehend aus einem mit dem Kunststoff verbundenen Immunoglobulin, einem Molekül des Antiglobulins und einem Immunoglobulin gebunden an ein Blutkörperchen ausbilden können. In diesem Falle wird die Beschleunigung der einzigen Zentrifugierphase ein wenig oberhalb des Wertes gehalten, der dem mittleren Niveau der Auflösung der unspezifischen Bindungskräfte entspricht, welche sowohl die eine negative Reaktion kennzeichnenden Körperchen als auch die eine positive Reaktion kennzeichnenden Körperchen binden, wobei diese unspezifischen Bindungskräfte die einzigen Kräfte sind, welche die für eine negative Reaktion charakteristischen Körperchen zurückhalten. Da die Beschleunigung bzw. Geschwindigkeit beim Zentrifugieren gering ist, werden alle Körperchen an den Becherboden angelagert während einer ausreichenden Zeit, damit die Molekülbrücken, die sich ausbilden können, fertiggestellt werden; die Entwicklung und die Fertigstellung dieser Molekularbrücken verläuft schneller als das Abreißen oder Abschleudern der Körperchen, das für eine negative Reaktion charakteristisch ist. Wenn diese Zentrifugiergeschwindigkeit ausreichend lang beibehalten wird, werden alle die Körperchen, sofern vorhanden, die am Becherboden nicht haften können, weil sich keine Molekülbrücken ausbilden können, allmählich von der Wand des Becherbodens abgelöst und in der Kuppe versammelt, während alle Blutkörperchen, die eine positive Reaktion kennzeichnen, an der Wand des Behälterbodens haften bleiben, weil sich die Molekülbrücken gebildet haben, die entstehen konnten.

Im Falle des Nachweises von Antigen-D-Aktivität der roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe beträgt die Beschleunigung dieser einzigen Zentrifugierphase etwa 250 g und wird während etwa 400 Sekunden beibehalten, wenn die Analyse in einem Becher mit einem Scheitelwinkel von 120° des Konus ausgeführt wird.

Mit Bezug auf die Fig. 16 bis 18 seien nun drei verschiedene Zentrifugier-Diagramme beschrieben, die bei den oben beschriebenen Reaktionen zum Identifizieren von erythrozytären Antigenen oder Antikörpern angewandt werden können. Auf jedem dieser Diagramme ist auf der Ordinate die angewandte Zentrifugalkraft in Anzahl g angegeben und auf der Abszisse die Dauer des Zentrifugiervorganges in Sekunden, wobei die Reaktion der Immunohaftung in einem Becher ausgeführt wurde, dessen konischer Boden einen Scheitelwinkel von 120° aufwies.

Das erste Diagramm (Fig. 16) entspricht dem Fall, bei welchem eine symmetrische Antiglobulin-Inkubation vorgenommen wurde. Im Zeitpunkt 0, nach beendetem Einbringen des Reaktionsmediums aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobulin in den Becher, wurde diesem eine schwache Zentrifugiergeschwindigkeit, im vorliegenden Fall von 4 g, erteilt, indem der Becher um eine Achse senkrecht zu seiner Rotationsachse rotierte. Diese Phase I umfaßt die ersten 15 Sekunden und ist eine Phase der Antiglobulin-Inkubation; die Geschwindigkeit reicht nicht aus, um in irgendeiner Weise ein schnelles Absinken und Anlagern der roten Blutkörperchen am Becherboden zu bewirken. Ggf. kann hierbei gleichzeitig das im Becher enthaltene Reaktionsmedium in Bewegung gehalten werden.

Dann wird die Zentrifugierbeschleunigung schnell erhöht bis zu einem Wert unterhalb des mittleren Wertes, bei welchem lediglich die unspezifischen Bindungskräfte FNS aufgehoben werden. Wird dieses mittlere Niveau mit 230 g bewertet, wie im Falle des vorliegenden Beispieles, in welchem eine Humanblutprobe daraufhin untersucht wird, ob auf den roten Blutkörperchen Antigen-D-Aktivität vorhanden ist, so wird die Beschleunigung auf 200 g gebracht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde läuft eine Phase II ab, in der die roten Blutkörperchen zum Becherboden hin wandern, wobei in der 30sten Sekunde alle Blutkörperchen den Becherboden erreicht haben.

Die Zentrifugierbeschleunigung wird bis zur 60sten Sekunde bei 100 g gehalten. Hierdurch wird von der 30sten bis zur 60sten Sekunde eine Phase III begrenzt, in welcher die roten Blutkörperchen am Becherboden angelagert werden; in dieser Phase können die Molekülbrücken entstehen, welche sich zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen ausbilden können und in der 60sten Sekunde sind praktisch alle möglichen Molekülbrücken vorhanden.

Dann wird die Zentrifugiergeschwindigkeit schnell erhöht bis auf einen solchen Wert, daß die Summe der unspezifischen Bindungskräfte, durch die alleine die negativen roten Blutkörperchen am Becher festgehalten werden, aufgehoben oder zerrissen wird; selbstverständlich muß die Zentrifugierbeschleunigung unterhalb des Wertes bleiben, bei welchem ein Aufbrechen oder Auflösen der Summe der spezifischen Bindungskräfte und der unspezifischen Bindungskräfte, durch die die positiven Blutkörperchen am Kunststoff gehalten werden, stattfinden würde. Im vorliegenden Fall wird die Beschleunigung auf 1600 g gebracht. Die letzte Phase IV ist somit eine Phase, in welcher die unspezifischen Bindungskräfte aufgehoben werden, wenn nur diese die roten Blutkörperchen am Kunststoff festhalten; gleichzeitig werden in dieser Phase die abgelösten oder abgeschleuderten roten Blutkörperchen schnell gesammelt oder zusammengeballt. Der Zentrifugiervorgang wird definitiv in der 84sten Sekunde abgebrochen.

Das gleiche Zentrifugier-Diagramm kann mit nur einer kleinen Modifizierung auf das Verfahren angewandt werden, wenn mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird. In diesem Falle entfällt die Phase oder Stufe I der Antiglobulin- Inkubation im Becher unter Bewegung, weil die Antiglobulin- Inkubation außerhalb des Bechers vorgenommen wird zwischen zuvor mit dem Testserum inkubierten roten Blutkörperchen - oder mit Test-Blutkörperchen inkubierten Serum, das analysiert werden soll - und dem Antiglobulin. Nach beendeter asymmetrischer Antiglobulin- Inkubation wird das Reaktionsmedium in den Becher verbracht und dann unmittelbar ein erstes Mal mit einer Beschleunigung von 200 g zentrifugiert.

Eine zweite Art zu zentrifugieren, die sich auf die Reaktion zum Identifizieren von erythrozytären Antigenen oder von Antikörpern anwenden läßt, wird im Diagramm gemäß Fig. 17 gezeigt.

Wie beim Diagramm gemäß Fig. 16, wird bis zur 15ten Sekunde mit ganz geringer Beschleunigung zentrifugiert, im vorliegenden Falle mit 4 g, während einer Phase oder Stufe I der symmetrischen Antiglobulin-Inkubation; ggf. wird der Becher gleichzeitig während dieser Inkubation zusätzlich in Bewegung gehalten.

In der 15ten Sekunde wird die Zentrifugierbeschleunigung schnell erhöht, in diesem Falle aber auf einen Wert, der ganz leicht oberhalb des Wertes liegt, welcher dem mittleren Niveau der Aufhebung der unspezifischen Bindungskräfte alleine entspricht. Dieses mittlere Niveau bzw. diese mittlere Ebene wird hier mit 230 g bewertet und die Geschwindigkeit daher auf 250 g gebracht. Von der 15ten bis zur 30ten Sekunde läuft die Phase II, in welcher die roten Blutkörperchen absinken; in der 30sten Sekunde haben alle Blutkörperchen den Becherboden erreicht. Da die Beschleunigung hier bei 250 g gehalten wird, d. h. ein wenig oberhalb des mittleren Wertes, bei welchem die unspezifischen Bindungskräfte aufgehoben werden, folgt hier unmittelbar auf die Phase II, in der die Blutkörperchen absinken, eine Phase III, in welcher die unspezifischen Bindungskräfte langsam und vorsichtig gelöst werden, wenn nur durch diese Bindungskräfte ein rotes Blutkörperchen an den Kunststoff gebunden ist und dieses rote Blutkörperchen zu dem Teil der Blutkörperchen gehört, welche die negative Reaktion kennzeichnen und die am wenigsten unspezifische Bindungskräfte haben. In dieser Phase werden somit gleichzeitig die abgelösten oder abgeschleuderten Zellen zunehmend langsam gesammelt. Die Geschwindigkeit dieser Sammlung ist außerordentlich gering, so daß unmittelbar nach der Stufe, in welcher die roten Blutkörperchen absinken, diese noch ausreichend lange an den Becherboden angelagert bleiben, damit die Molekülbrücken, welche sich ausbilden können, entstehen; die Entwicklung der Molekülbrücken verläuft schneller als das Ablösen oder Abreißen der Zellen. Da die Zentrifugierbeschleunigung durchgehend bei 250 g gehalten wird, sind nach Ablauf einer gewissen Zeit alle Molekülbrücken entstanden, die sich ausbilden konnten, während die nicht spezifisch an den Becherboden gebundenen roten Blutkörperchen weiterhin allmählich abgeschleudert werden. Diese Phase III dauert relativ lange und wird beispielsweise in der 410ten Sekunde abgebrochen.

Die hier angewandte Methode des Ablösens ist so vorsichtig, daß die erzielten Ergebnisse außerordentlich empfindlich sind. Dies ist besonders gut geeignet für Reaktionen, bei denen schwache Bindungen zwischen roten Blutkörperchen und Kunststoff eine Rolle spielen.

Das Diagramm gemäß Fig. 18 entspricht einem Zentrifugiervorgang, der entsprechend der Entwicklung der ablaufenden Reaktionen geregelt oder gesteuert wird. Das Verfahren wird gleichzeitig in einem Becher ausgeführt, in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird, und andererseits in einem Becher, in welchem eine negative Kontrollreaktion ausgeführt wird; dieser Kontrollbecher wird bei jeder Umdrehung beim Zentrifugieren mit einem Stroboskop-Blitz beleuchtet.

Das Prinzip dieser Steuerung ist analog dem oben mit Bezug auf den Nachweis von Antigen HB_s dargelegten Prinzip. Das vergrößerte Bild des Bodens des Bechers, in welchem die negative Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera gefilmt und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde. Die Oberfläche und die Opazität des Bildes des Mikrosediments, das sich bei der negativen Kontrollreaktion bildet, werden mit der Oberfläche und der Opazität des Mikrosedimentes einer negativen Bezugsreaktion gleicher Art, die zuvor ausgeführt worden ist, verglichen.

Das Diagramm der Fig. 18 entspricht einem Zentrifugierprogramm, das angewandt wird auf eine Reaktion zum Identifizieren von erythrozytärem oder zellulärem Antigen oder von Antikörpern, bei welchem das mittlere Niveau der Aufhebung der unspezifischen Bindungskräfte alleine einer Beschleunigung von 450 g entspricht. Dieses Diagramm eines gesteuerten Zentrifugierprogrammes kann auf ein serologisches System angewandt werden, dessen Merkmale im voraus nicht bekannt sind, vor allem nicht das mittlere Niveau der Aufhebung oder Auflösung der unspezifischen Bindungskräfte.

Es sei bei diesem Verfahren eine symmetrische Antiglobulin- Inkubation angenommen. In diesem Falle wird die Zentrifugierbeschleunigung bis zur 15ten Sekunde bei 4 g gehalten, d. h. bei einem zu geringen Wert als daß irgendein schnelles Absinken und Anlagern von Blutkörperchen oder Zellen am Becherboden erfolgen kann. Dies ist die Phase I der Antiglobulin-Inkubation, während welcher ggf. der Becher zusätzlich bewegt wird.

In der 15ten Sekunde wird die Beschleunigung schnell auf 200 g erhöht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde sinken die Zellen oder Blutkörperchen zum Becherboden hin ab (Phase II) und bis zur 60sten Sekunde erfolgt dann die Anlagerung der Zellen oder Blutkörperchen an den Becherboden (Phase III), während welcher Molekülbrücken entstehen, die sich zwischen dem Becherboden und den Zellen oder Blutkörperchen ausbilden können.

Am Ende der Anlagerungsphase, d. h. in der 60sten Sekunde wird die Beschleunigung um 100 g erhöht und 30 Sekunden bei 300 g gehalten (Phase IV). In der Sekunde 90 erfolgt eine Messung von Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion und diese Messungen werden mit den Werten für das Mikrosediment der negativen Bezugsreaktion verglichen: liegen die Meßdaten für Oberfläche und Opazität des Kontroll-Mikrosedimentes unterhalb der entsprechenden Daten für das Bezugs-Mikrosediment, so bedeutet dies, daß die Beschleunigung von 300 g nicht ausreicht, um die unspezifischen Bindungskräfte aufzuheben bzw. zu brechen.

Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100 g erhöht und die Beschleunigung von 400 g während 30 Sekunden beibehalten (Phase V). In der 120sten Sekunde werden erneut Oberfläche und Opazität des Kontroll-Mikrosediments gemessen und die erhaltenen Meßdaten mit denjenigen des Bezugs- Mikrosedimentes verglichen: im vorliegenden Falle, bei welchem das mittlere Niveau zum Aufbrechen oder Aufheben der unspezifischen Bindungskräfte bei 450 g liegt, liegen die Meßdaten für die Oberfläche und die Opazität des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion nach dem Zentrifugieren bei 400 g noch unterhalb der entsprechenden Meßdaten für das Bezugs- Mikrosediment, weil die roten Blutkörperchen der negativen Kontrollreaktion, die durch unspezifische Bindungskräfte an den Becher gebunden sind, nicht abgelöst bzw. abgeschleudert werden konnten.

Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100 g erhöht und erreicht nun den Wert 500 g (Phase VI). Nach 30 Sekunden, d. h. in der 150sten Sekunde, wird eine weitere Messung von Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion vorgenommen; die Meßdaten werden mit den entsprechenden Meßdaten des Bezugs-Mikrosedimentes verglichen. Im vorliegenden Falle ist nun das mittlere Niveau für das Aufheben oder Aufbrechen der unspezifischen Bindungskräfte überschritten, so daß bei der negativen Kontrollreaktion ein Mikrosediment erhalten wird, dessen Oberfläche und Opazität zumindest gleich sind der Oberfläche und Opazität des Bezugs- Mikrosedimentes. Die Phase oder Stufe, in der die unspezifischen Bindungskräfte alleine aufgehoben werden und gleichzeitig die abgelösten oder abgeschleuderten Blutkörperchen gesammelt werden, beginnt somit mit der 120sten Sekunde. Die Zentrifugierbeschleunigung wird weiter bei 500 g gehalten und das Zentrifugieren endgültig abgebrochen, wenn Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion einer Menge an abgeschleuderten roten Blutkörperchen entspricht, die gerade repräsentativ ist für eine tatsächliche oder wahre negative Reaktion: im vorliegenden Falle wird der Zentrifugiervorgang endgültig in der 330sten Sekunde abgebrochen.

Die Unterscheidungsschwellen für eine positive Reaktion und eine negative Reaktion werden auf die gleiche Weise bestimmt wie vorstehend mit Bezug auf das Verfahren zum Nachweisen von HB_s-Antigen erläutert.

Macht also der Anteil an roten Blutkörperchen in einem Mikrosediment, das eine echte negative Reaktion anzeigt, wie in Vorversuchen ermittelt, 12% aus und beträgt die Standardabweichung 3%, so liegt die Unterscheidungsschwelle für eine echte negative Reaktion, wie oben angegeben, bei 18% roten Blutkörperchen, die in einem Mikrosediment zusammengefaßt sind, während die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion einem Anteil von 6% roten Blutkörperchen, versammelt zum Mikrosediment, entspricht.

Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet schließlich die quantitative Bestimmung eines bestimmten erythrozytären oder zellulären Antigens oder eines bestimmten Antikörpers, der bzw. das nachgewiesen werden soll. Die Oberfläche und/oder Opazität des entstandenen Mikrosedimentes hängt nämlich von der Menge an Antigen oder Antikörper ab, die in dem analysierten Medium vorhanden ist. Es genügt somit, die gemessene Oberfläche und/oder Opazität des in einer positiven Reaktion gebildeten Sedimentes mit den entsprechenden Werten zu vergleichen, die für eine Reihe von Eich-Produkten erhalten wurden oder mit einer zuvor aufgestellten Eichkurve, um die im Medium vorhandene Menge Antigen oder Antikörper zu erhalten.

Dieses zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens kann auch analog wie beim ersten Beispiel unter den gleichen Zentrifugierbedingungen mit Proben durchgeführt werden, in denen erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität und von unterschiedlicher Beschaffenheit nachgewiesen werden sollen.

Wie oben erklärt, hängt nämlich die Möglichkeit, daß die roten Blutkörperchen abgeschleudert oder abgelöst werden, nur von der Neigung des Becherbodens ab. Man wird daher für jede Reaktionsart den Becher auswählen, der die für die in Betracht gezogene Reaktion am besten geeignete Neigung aufweist, mit dem Wert, daß bei einer gewählten Beschleunigung nur die Zellen oder Teilchen abgeschleudert werden, die eine negative Reaktion kennzeichnen.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von viralen oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern in einem biologischen Medium, unter Anwendung von immunologischen Reaktionen zwischen Immunoglobulinen und einem Antiglobulin, dessen Moleküle im Stande sind, sich einerseits an ein erstes Immunoglobulin zu binden, das selbst an einer Zelle oder ein Teilchen gebunden ist und andererseits an ein zweites Immunoglobulin derart, daß Brücken zwischen den Zellen und dem zweiten Immunoglobulin entstehen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen, die ersten Immunoglobuline und das Antiglobulin in einen Behälter einbringt, dessen Wand einen auf der Symmetrieachse des Behälters gelegenen Konvergenzpunkt aufweist und auf dessen Wänden die zweiten Immunoglobuline fixiert sind, und daß man den das Reaktionsmedium enthaltenden Behälter einer Zentrifugal-Kraft aussetzt, die im wesentlichen parallel zu der Behälterachse gerichtet und ausreichend stark ist, um eine dauerhafte Bindung der Zellen an die Wand des Behälters über diese Brücken hervor zu rufen, wenn der Test positiv ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, zum Nachweis oder Identifizieren von viralen Antigenen, insbesondere im Blutplasma, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten und zweiten Immunoglobuline Immunoglobuline einer immunologischen Klasse X einer Tierart I, bezeichnet als IgX, sind, wobei die ersten Immunoglobuline eine Antikörper-Spezifität gegenüber dem viralen Antigen aufweisen, und vorher an die Zellen oder Teilchen fixiert worden sind; daß die Antiglobulinmoleküle von einer Tierart II stammen, die von der Tierart I verschieden ist, und Antikörper gegenüber dem IgX I darstellen; daß man das zu analysierende biologische Medium mit einer Suspension dieser Zellen oder Teilchen vor dem Einbringen in den Behälter inkubiert; daß die Brücken während des Zentrifugierens im Falle eines negativen oder eines positiven Tests entstehen und daß man das Zentrifugieren abbricht, um diese Brücken durch Reaktion der neuen Moleküle des Antiglobulins im Falle des negativen Tests aufzubrechen und später erneut beginnt, um die Zellen oder Teilchen, die so von der Wand abgelöst sind, am Scheitelpunkt des Behälters zu sammeln.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zentrifugieren während einer solchen Zeitspanne unterbricht, daß man im Falle einer negativen Reaktion, eine Absättigung der auf den einander gegenüberliegenden Flächen von Behälterwand und Zellen oder Teilchen gebundenen IgX-I-Moleküle durch die Anti-IgX- I-Moleküle erhält.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Suspension von Zellen oder Teilchen nach der Inkubation außerhalb des Behälters mit dem biologischen Medium, das analysiert werden soll, mit einer physiologischen Lösung wäscht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Anti-IgX-I- Molekülen mit einem Titer von mindestens 128 Coombs rein oder verdünnt in einem Verhältnis von 1 : 2 oder 1 : 4 verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Suspension von Zellen oder Teilchen, die zuvor mit dem biologischen Medium, welches analysiert werden soll, inkubiert worden ist, und die Lösung von Molekülen Anti-IgX I gleichzeitig in den Behälter einbringt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in den Behälter zunächst die Suspension von Zellen oder Teilchen einbringt, die zuvor mit dem biologischen Medium, welches analysiert werden soll, inkubiert worden ist, und dann die Lösung von Molekülen Anti-IgX I.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der ersten Zentrifugierphase die Komponenten des Reaktionsmediums, d. h. die bereits mit der Probe inkubierte Suspension von Zellen oder Teilchen und die Lösung von Molekülen Anti-IgX I während einer Zeitspanne inkubiert, die höchstens gleich ist der Zeitspanne, in der 10% der an die Zellen oder Teilchen gebundenen oder an die Behälterwand fixierten Moleküle IgX I mit den Molekülen Anti-IgX I reagiert haben.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsmedium während dieser Inkubation bewegt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man während einigen Sekunden bis zu einigen 10 Sekunden inkubiert.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschleunigung und Dauer der Zentrifugierstufe, d. h. erste Phase, Unterbrechung und zweite Phase, im voraus bestimmt werden und der Beschleunigung und Dauer entsprechen, für die unter den gleichen Bedingungen der Reaktionspartner bei einer negativen Bezugsreaktion die besten Ergebnisse erzielt worden sind, d. h. daß am Ende der ersten Zentrifugierstufe oder -phase praktisch 100% Zellen oder Teilchen an der Behälterwand haften, und daß am Ende der Unterbrechung ein ausreichender Sättigungsgrad an Anti-IgX-I-Molekülen bei den IgX- Molekülen erreicht wurde, die an die einander gegenüberliegenden Flächen der Zellen oder Teilchen und der Behälterwand gebunden sind, damit die Haftung der Zellen an der Behälterwand wieder aufgehoben wird und ein Ablösen und Sammeln der Zellen in der Kuppe des Behälters während der zweiten Zentrifugierphase stattfindet.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Zeitpunkt des Abbruchs der zweiten Zentrifugierphase automatisch bestimmt wird, indem das Verfahren gleichzeitig zum einen in einem Behälter durchgeführt wird, in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird, und zum anderen in einem Behälter, in welchem eine negative Kontrollreaktion durchgeführt wird, und wobei das Bild des Bodens des Kontrollbehälters in regelmäßigen Intervallen während der zweiten Zentrifugierphase aufgezeichnet und analysiert wird und die zweite Zentrifugierphase definitiv abgebrochen wird, wenn das Bild des Bodens des Kontrollbehälters etwa 18% Zellen oder Teilchen versammelt in der Kuppe des Behälters entspricht.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es zum Nachweis des viralen Antigens HB_s in einer Humanblutprobe angewandt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Analyse in einem Behälter vornimmt, dessen Boden konisch ist und einen Winkel am Scheitelpunkt bzw. an der Kuppe von 120° aufweist, daß man die erste Zentrifugierphase mit einer Bechleunigung von 200 g durchführt von der 15. bis zur 60. Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Behälter, das aus der zuvor mit der zu analysierenden Probe inkubierten Suspension von Zellen oder Teilchen und der Lösung der Anti-IgX-I-Moleküle besteht, und daß man das Zentrifugieren von der 60. bis zur 300. Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Behälter unterbricht und daß man beim zweiten Zentrifugieren mit einer Beschleunigung von 500 g während 40 Sekunden arbeitet.

15. Verfahren nach Anspruch 1, zum Nachweis oder zur Bestimmung von zellulären Antigenen (oder antizellulären Antikörpern) im Blut, dadurch gekennzeichnet,
daß die ersten und zweiten Immunoglobuline Immunoglobuline der immunologischen Klasse X sind und von der gleichen Tierart I stammen, wie die für das zu bestimmende Antigen (oder der zu bestimmende Antikörper) spezifischen Antikörper bezeichnet als IgX; daß die Antiglobuline von einer Tierart II stammen, die von der Tierart I verschieden ist, und Antikörper, gegenüber dem IgX I darstellen;
daß eine Bindung zwischen den ersten Immunoglobulinen und den Zellen entsteht durch Inkubieren einer Suspension von Blutkörperchen des zu untersuchenden Bluts mit einem Testserum bzw. einer Suspension von Testblutkörperchen mit dem Plasma des zu untersuchenden Blutes außerhalb des Behälters und
daß sich während des Zentrifugierens die Blutkörperchem am Scheitel des Behälters ansammeln, wenn der Test negativ ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension von Blutkörperchen, die analysiert werden soll (oder die Suspension der Test-Blutkörperchen), nachdem sie außerhalb des Behälters mit einem Testserum (oder mit dem Plasma des Blutes, das analysiert werden soll) inkubiert worden ist, mit einer physiologischen Lösung gewaschen wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Molekülen Anti-IgX I verwendet, die einen Titer von mindestens 128 gemäß Coombs aufweist, und zwar rein oder verdünnt in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 2 oder 1 : 4.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man die beiden Komponenten des Reaktionsmediums, d. h. die Suspension von Blutkörperchen und die Lösung der Anti-IgX-I-Moleküle getrennt voneinander und gleichzeitig in den Behälter einbringt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst die zuvor inkubierte Suspension der Blutkörperchen und danach die Lösung der Anti-IgX-I- Moleküle in den Behälter einbringt.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Zentrifugieren im Behälter die beiden Komponenten des Reaktionsmediums, d. h. die zuvor inkubierte Suspension von Blutkörperchen und die Lösung der Anti-IgX-I-Moleküle, während einer Zeitspanne inkubiert, die höchstens gleich ist der Zeitspanne, bei der 10% der an die Blutkörperchen oder an die Behälterwand gebundenen IgX-I-Moleküle mit den Anti-IgX-Molekülen reagiert haben.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsmedium während dieser Inkubation bewegt.

22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, daß man während einiger Sekunden bis zu einigen 10 Sekunden inkubiert.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsgemisch erst in den Behälter zum Zentrifugieren einbringt, nachdem die Suspension von Blutkörperchen außerhalb des Behälters mit der Lösung von Anti-IgX-I-Molekülen inkubiert worden ist, und daß man unmittelbar nach dem Einbringen des Reaktionsgemisches in den Behälter zentrifugiert.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man die Suspension von Blutkörperchen und die Lösung von Anti-IgX-I-Molekülen etwa 20 Minuten inkubiert.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man bei zwei unterschiedlichen Beschleunigungen zentrifugiert, und zwar bei einer ersten Beschleunigung, bei der alle Blutkörperchen an die Behälterwand angelagert werden und bei einer zweiten, höheren Beschleunigung, bei welcher nur die Blutkörperchen, die nicht an der Wand des Behälters haften bleiben können, in der Kuppe des Behälters gesammelt werden.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man so zentrifugiert, daß man eine einzige Beschleunigung erreicht, die geeignet ist, zumindest momentan alle Blutkörperchen an die Wand des Behälters anzulagern und außerdem so, daß unter diesen Blutkörperchen nur diejenigen, sofern vorhanden, die nicht an der Wand des Behälterbodens haften können, langsam und zunehmend von dieser Wand abgelöst bzw. abgeschleudert und in der Kuppe des Behälters gesammelt werden.

27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß man zur automatischen Bestimmung des endgültigen Abbruchs des Zentrifugierens das Verfahren gleichzeitig und unter gleichen Bedingungen einerseits in einem Behälter durchführt, in welchem die Analysereaktion der zu untersuchenden Probe vorgenommen wird, und andererseits in einem Behälter, in welchem eine zur Kontrolle dienende negative Reaktion vorgenommen wird, daß man das bei der Kontrollreaktion sich bildende Mikrosediment in regelmäßigen Intervallen aufzeichnet und analysiert und das Zentrifugieren endgültig abbricht, wenn die Analyse des Mikrosediments der Kontrollreaktion anzeigt, daß etwa 18% Blutkörperchen in der Kuppe des Behälters gesammelt sind.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zentrifugieren im Hinblick auf die im Gang befindlichen Reaktionen steuert oder regelt, das Verfahren gleichzeitig und unter den gleichen Bedingungen einerseits in einem Behälter durchführt, in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird, und andererseits in einem Behälter, in welchem eine negative Kontrollreaktion ausgeführt wird, daß man in regelmäßigen Intervallen das Bild des Mikrosedimentes, das sich bei der negativen Kontrollreaktion bildet, aufzeichnet und analysiert, daß man die Wachstumskurve für dieses Mikrosediment und für das Mikrosediment einer negativen Bezugsreaktion miteinander vergleicht und daß man Zeit und Geschwindigkeit beim Zentrifugieren so steuert, daß die Wachstumskurve des analysierten Mikrosedimentes der Wachstumskurve der Bezugsreaktion entspricht.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man das Zentrifugieren definitiv abbricht, wenn die Analyse des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion anzeigt, daß in der Kuppe des Behälterbodens etwa 18% Blutkörperchen gesammelt sind.

30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß man die Analysereaktion in einem Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120° durchführt, nachdem die Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX I zur Inkubation gebracht worden ist, daß man den Behälter der das Reaktionsgemisch enthält, um eine Achse dreht, die senkrecht gerichtet ist zur Konusachse, bei einer geringeren Beschleunigung als derjenigen, bei der die Blutkörperchen, welche eine negative Reaktion kennzeichnen, von der Wand des Behälterbodens abgeschleudert werden, daß man diese Beschleunigung 45 Sekunden beibehält, daß man anschließend gleichmäßig die Zentrifugierbeschleunigung alle 30 Sekunden um einen Wert von 100 g erhöht, daß man am Ende jeder dieser Zeitspannen von 30 Sekunden das in der negativen Kontrollreaktion gebildete Mikrosediment analysiert, bis die Analyse einen Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters versammelt sind, entspricht, der zumindest gleich ist dem Prozentsatz, wie er für die negative Bezugsreaktion erreicht worden ist.

31. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Ausführen der Analysereaktion in einem Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120°, nachdem die Suspension von Blutkörperchen mit der Lösung der Anti-IgX-I-Moleküle zum Inkubieren gebracht worden ist, zentrifugiert, indem man den Behälter um eine Achse dreht, die senkrecht gerichtet ist zur Achse des konischen Behälterbodens, mit einer Beschleunigung von 200 g, die während 45 Sekunden beibehalten wird, und daß man anschließend die Zentrifugierbeschleunigung schnell bis auf 1600 g erhöht und das Zentrifugieren endgültig abbricht, nachdem der Zeitpunkt erreicht ist, bei welchem für eine unter gleichen Bedingungen durchgeführte negative Kontrollreaktion der Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz, welcher die Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.

32. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Ausführen der Analyse in einem Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120°, nachdem die Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX-I- Moleküle inkubiert worden ist, zentrifugiert, indem man den Behälter um eine Achse dreht, die senkrecht läuft zur Achse des konischen Behälterbodens, mit einer Beschleunigung von 250 g und daß man das Zentrifugieren abbricht, nachdem der Zeitpunkt erreicht worden ist, bei welchem für eine unter gleichen Bedingungen durchgeführte negative Kontrollreaktion der Prozentsatz an roten Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz, welcher die Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.

33. Satz von Behältern mit konischen Boden zur Durchführung von Reaktionen der Immuno-Haftung nach Anspruch 1, in denen virale Antigene oder zelluläre Antigene oder Antikörper unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaffenheit nachgewiesen werden sollen, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Satz so viel verschiedene Gruppen von Behältern umfaßt, wie unterschiedliche Typen oder Arten von Antigenen oder Antikörpern nachgewiesen werden sollen, wobei die Behälter jeder Gruppe einen anderen Scheitelwinkel des konischen Bodens aufweisen als die Behälter jeder der anderen Gruppen.

34. Satz von Behältern nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einer oder mehreren Gruppen von Behältern besteht, deren Scheitelwinkel im Konus der Behälter dieser verschiedenen Gruppen einen der folgenden Werte aufweist: 80, 90, 100, 110, 120, 130 und 140.