DE2907198C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen und
identifizieren von viralen Antigenen, d. h. Viren mit
Antigeneigenschaften oder zellulären bzw. erythrozytären
Antigenen oder Antikörpern in einem biologischen Medium (wie. z. B.
menschlichem Blut) gemäß dem Oberbegriff des
Patentanspruchs 1.
Bei medizinischen Analysen stellt sich häufig das Problem
der genauen Bestimmung der Beschaffenheit von Antigenen, die
von einer Zelle oder Teilchen getragen werden, sowie der
Beschaffenheit von Antikörpern oder viralen Antigenen, die in
einem serologischen Medium enthalten sind. Dies trifft vor
allem auf das Gebiet der Bluttransfusion zu, wo unbedingt
festgestellt werden muß, ob das Blut des Spenders bzw. der
Spender mit dem Blut des künftigen Empfängers verträglich
ist. Die gegebenenfalls vorhandene Unverträglichkeit von
zwei Blutproben beruht darauf, daß das Plasma der einen
Blutprobe Moleküle enthalten kann, die als Antikörper
bezeichnet werden und die sich mit den als Antigeneinheiten
oder Antige bezeichneten komplementären Struktureinheiten
der Membran der roten Blutkörperchen der anderen Probe
verbinden können. Ein solches Antigen wird erythrozytäres
Antigen genannt. Ein Antikörper, der in der Lage ist, sich
nur mit einem bestimmten Antigen zu verbinden, wird als der
für dieses Antigen spezifische Antikörper bezeichnet. Die
Verbindung von Antikörpern mit Antigeneinheiten auf den
roten Blutkörperchen kann zur Agglutinierung dieser
roten Blutkörperchen, zu ihrer Zerstörung oder dazu führen,
daß sie in ihrer mechanischen Festigkeit stark
beeinträchtigt werden, mit dem Risiko, daß bei Bluttransfusionen
Zwischenfälle auftreten.
Es muß weiterhin sichergestellt sein, daß mit dem Spenderblut
keine Krankheiten auf den Empfänger übertragen werden,
die über den Nachweis eines viralen Antigens oder eines
Virus mit Antigeneigenschaften oder eines diesem spezifisch
entsprechenden Antikörpers festgestellt werden können. Ein
Beispiel für eine solche Krankheit ist Hepatitis, die nach
Blutübertragung beim Empfänger auftreten kann, wenn das
Spenderblut HB-Viren enthält, die Träger des HBs-Antigens
sind.
Dies zeigt wie außerordentlich wichtig es ist, Spenderblut
und Empfängerblut daraufhin zu untersuchen, ob irgendwelche
Antikörper, zelluläre Antigene und Viren mit Antigeneigenschaften
bzw. virale Antige enthalten sind, die bei den
Empfängern Unverträglichkeits-Reaktionen oder Krankheiten
auslösen können.
Im Falle von Transfusionen muß daher sichergestellt sein,
daß das Nachweisverfahren ausreichend empfindlich ist.
Außerdem muß das Fehlerrisiko bei der Bestimmung der
Spezifität der erythrozytären oder zellulären Antigene, von
Antikörpern oder Viren bzw. viralen Antigenen praktisch Null
sein.
Zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern (oder von
erythrozytären Antigenen) im Plasma oder Serum einer
Blutprobe (oder auf roten Blutkörperchen) kennt man die
Reaktion nach Coombs bzw. Coombs-Test (vergl. N. Henning,
Klinische Laboratoriumsdiagnostik, 3. Aufl., 1966, S. 302 bis
304). Bei diesem bekannten Verfahren wird folgendermaßen
gearbeitet, wenn beispielsweise bestimmt werden soll, ob das
Plasma einer Humanblutprobe einen bestimmten Antikörper,
beispielsweise einen spezifischen Anti-D-Antikörper, d. h.,
ob es für das Antigen D spezifische Immunoglobine enthält,
von denen einige der immunochemischen Klasse G zugehören und
infolgedessen IgG bezeichnet werden: In einem Röhrchen wird
das Plasma, das analysiert werden soll, mit den roten
Blutkörperchen inkubiert, die Antigeneinheiten D tragen, d. h.
Einheiten mit einer Antigenaktivität spezifisch für den
Antikörper, dessen Anwesenheit oder Abwesenheit nachgewiesen
werden soll; die Immunoglobine des im Plasma gegebenenfalls
vorhandenen spezifischen Antikörpers verbinden sich während
dieses Miteinander-in-Berührung-Bringens mit den
korrespondierenden Antigeneinheiten der roten
Blutkörperchen. Das auf diese Weise erhaltene
Reaktionsmedium wird gewaschen und dann mit einem Antiglobulin
inkubiert, beispielsweise mit Ziegenserum, das Anti-Human-
IgG-Immunoglobulin liefert. Im Verlauf dieser Inkubation
kuppelt ein Immunoglobulin der Ziege, bereitgestellt von dem
Antiglobulin, aufgrund seiner spezifischen Anti-Humanfunktion
mit einem menschlichen Immunoglobulin, das
gegebenenfalls mit einer spezifischen Antigeneinheit eines roten
Blutkörperchens verbunden ist. Nach beendeter Inkubation
wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert und hierdurch, wenn
der gesuchte spezifische Anti-D-Antikörper tatsächlich im
Plasma vorhanden war, eine Agglutinierung der roten
Blutkörperchen untereinander hervorgerufen unter Mitwirkung der
von dem Antiglobulin gelieferten Immunoglobuline, und zwar
aufgrund der Ausbildung von folgenden Bindungsketten:
rotes Blutkörperchen (Antigen D) - spezifisches menschliches
Immunoglobulin Anti-D - menschliche Anti-Human-
Immunoglobulin - spezifisches menschliches Anti-D-Immunoglobulin
- (Antigen D) - rotes Blutkörperchen.
Diese Agglutinierung ist an einem Bodensatz von agglutinierten
roten Blutkörperchen am Boden des Röhrchens zu erkennen,
wobei dieser Bodensatz aber nicht in allen Fällen gut von
einem Bodensatz aus nicht-agglutinierten roten Blutkörperchen
unterschieden werden kann. Um sicher zu gehen, ob es
sich um einen Bodensatz aus agglutinierten roten Blutkörperchen
oder aus nicht agglutinierten roten Blutkörperchen
handelt, wird der Röhrcheninhalt leicht bewegt. Bei
negativen Reaktionen, d. h. bei Reaktionen mit einem
Blutplasma, das nicht den spezifischen Anti-D-Antikörper
enthielt, werden die nicht agglutinierten roten Blutkörperchen
wieder homogen suspendiert, im Falle der positiven
Reaktionen hingegen bleiben die roten Blutkörperchen in
mehr oder weniger großen Gruppen miteinander verbunden.
Dieses Verfahren beruht auf relativ langen und komplizierten
Reaktionen, die überdies manchmal nicht ausreichend empfindlich
sind, was sich als Gefahr erweisen kann.
Das gleiche Problem der genauen Bestimmung der Beschaffenheit
von Antigenen auf einer Zelle stellt sich auch im Falle
der Transplantation von Organen. Bekanntlich tragen die
Lymphozyten eine bestimmte Anzahl von Antigenen, bezeichnet
als Antigene des Systems HLA. Vor irgendeinem chirurgischen
Eingriff zum Zwecke der Transplantation muß festgestellt
werden, welches die HLA-Antigene auf den Lymphozyten des
Spenders und auf denen des Empfängers sind, damit die
zumindest theoretische Gewebsverträglichkeit zwischen den
Lymphozyten der beiden verschiedenen Individuen festgestellt
wird; ohne diese zumindest theoretische Verträglichkeit kann
eine Organtransplantation überhaupt nicht in Betracht
gezogen werden. Aufgrund der hohen Anzahl von verschiedenen
Antigenen des Systems HLA, die auf den Lymphozyten vorhanden
sein können, muß eine beträchtliche Anzahl von Elementarreaktionen
durchgeführt werden, um die jeweilige Spezifität
der vorhandenen HLA-Antigene festzustellen; es können z. B.
100 Reaktionen notwendig sein, Maßnahmen, die noch dadurch
erheblich erschwert werden, daß die Lymphozytenzellen nur in
sehr kleinen Mengen zur Verfügung stehen und infolgedessen
nur für Mikroreaktionen verwendet werden.
Außerdem werden beim Nachweisen oder Aufspüren bestimmter
Viren oder viraler Antigene, beispielsweise des Antigens
HBs, derzeit radio-immunologische Arbeitsweisen angewandt,
die sehr kostspielig und umweltbelastend sind und deshalb
einer Sondergenehmigung bedürfen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde ein Verfahren zum Nachweisen und
Identifizieren von viralen Antigenen, erythrozytären bzw.
zellulären Antigenen oder Antikörpern in einem biologischen
Medium, beispielsweise einer Humanblutprobe bereitzustellen,
das sich allgemein anwenden läßt und den Nachweis beliebiger
Arten viraler Antigene in einem flüssigen biologischen
Medium sowie aller Arten erythrozytärer bzw. zellulärer
Antigene und Antikörper, die in einer Blutprobe enthalten
sind, ermöglicht. Das Verfahren soll eine hochempfindliche
Analyse ermöglichen, die derjenigen der bekannten Verfahren
überlegen ist, und soll dennoch ausgezeichnet spezifisch
gegenüber dem viralen Antigen, dem erythrozytären oder
zellulären Antigen oder dem gesuchten Antikörper bleiben. In
diesem Zusammenhang wird das Analyseverfahren als um so
empfindlicher bezeichnet, je geringer die Menge eines
viralen Antigens, eines erythrozytären oder zellulären
Antigens oder eines Antikörpers einer bestimmten Spezifität
ist, die mit seiner Hilfe nachgewiesen werden kann; das
Verfahren wird als um so spezifischer angesehen, je besser es
ermöglicht, ohne Fehler, d. h. ohne Verwechslung, alle diese
Antigene oder Antikörper mit unterschiedlicher Spezifität
nachzuweisen. Mit anderen Worten, ein virales Antigen einer
bestimmten Spezifität darf nicht verwechselt werden mit
einem viralen Antigen einer anderen Spezifität und das
gleiche gilt beim Nachweis von erythrozytären oder
zellulären Antigenen und von Antikörpern. Die Erfindung soll
weiterhin ein Analyseverfahren bereitstellen, das nicht
umweltbelastend ist, mit dessen Hilfe die Zeitspanne
beträchtlich verkürzt werden kann, die zum Erhalt der Analyseergebnisse
notwendig ist und das zudem auf Reaktionen
beruht, die einen sehr sparsamen Umgang mit den Reaktionspartnern
ermöglichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch angegebene
Verfahren. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den
Unteransprüchen angegeben.
Nachfolgend werden die in dieser Beschreibung verwendeten
Begriffe näher definiert.
"Virus mit Antigeneigenschaften" im Sinne der Beschreibung
ist ein Virus, für den man den mit ihm reagierenden
spezifischen Antikörper kennt. Im folgenden Beschreibungstext
werden hierfür die Bezeichnung Virus mit Antigeneigenschaften,
Virus oder auch virales Antigen verwendet.
Immunoglobuline sind proteinartige Moleküle tierischer
Herkunft, die entweder Antigen- oder Antikörperaktivität
oder auch beide Aktivitäten gleichzeitig aufweisen.
Für jedes Lebewesen (Mensch oder Tier) existieren
Immunoglobuline, die verschiedenen immunochemischen Klassen
zugehören, d. h. Immunoglobuline einer Klasse A, kurz IgA,
Immunoglobuline einer Klasse G, kurz IgG, usw. Allgemein
wird ein Immunoglobulin der immunochemischen Klasse X und
der Tierart I mit IgX I. bezeichnet.
Testserum ist im Sinne der Beschreibung ein Serum (oder
eine Lösung), das (die) Immunoglobuline einer bestimmten
Tierart und einer bestimmten immunochemischen Klasse
enthält - beispielsweise Human-Immunoglobuline der Klasse G,
oder IgG - die spezifische Antikörperaktivität gegenüber
einem bestimmten erythrozytären oder zellulären Antigen
einer Gruppe von Individuen der betreffenden Art aufweisen.
In analoger Weise tragen Testkörperchen, Testzellen oder
Testteilchen Antigeneinheiten oder -gruppen einer bestimmten
Tierart, mit denen sich die Immunoglobuline verbinden
können, die die spezifisch entsprechenden Antikörpergruppen
zu den Antigeneinheiten tragen.
Als Antiglobulin wird ein Immunserum einer von der Art I
verschiedenen Tierart II bezeichnet, welches Immunoglobuline
einer artspezifischen Anitkörperaktivität gegenüber IgX I
liefert. Das Antiglobulin wird als Ig-II-Anti-IgX bezeichnet
oder, wenn keinerlei Verwechslung möglich ist, kurz als
Anti-IgX I.
Das erfindungsgemäße Verfahren macht Gebrauch von einer
besonderen Art von Reaktionen, nämlich von Reaktionen der
"Immuno-Adhärenz" oder Immuno-Haftung. Diese Reaktionen
werden so bezeichnet, weil der die Reaktion anzeigende
Vorgang in einer Haftung oder Adhärenz besteht zwischen
einerseits Zellen, Körperchen oder Teilchen und andererseits
dem Boden eines Behälters, überzogen mit einer Schicht oder
Haut aus Molekülen, die Antigen- oder Antikörpereigenschaft
aufweisen. Diese Haftung ist von immunologischer Beschaffenheit,
weil sie durch die Entstehung von Antigen-Antikörper-
Bindungen zwischen den Körperchen, Zellen oder Teilchen
einerseits und dem Behälter andererseits hervorgerufen wird.
Es wurde beobachtet, daß das erfindungsgemäße Verfahren
wesentlich empfindlicher ist als die bekannten Verfahren,
und zwar um das Hundertfache bis zum Tausendfachen. Außerdem
ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine beträchtliche
Verkürzung der Zeit, die zum Erhalt der Analyseergebnisse
notwendig ist, und ermöglicht auf diese Weise die
Durchführung von Schnelldiagnosen, die jetzt beispielsweise im
Falle des Nachweises von erythrozytären Antigenen oder
bekannten Antikörpern im Blut innerhalb von sechs Minuten
anstatt bisher einer Stunde durchgeführt werden können. Das
neue Verfahren ermöglicht außerdem auch eine erhebliche
Einsparung an Reaktionspartnern; dies ist sehr wichtig,
beispielsweise wenn so kostbare Reaktionspartner benötigt
werden, wie lymphozytäre Zellen oder Testsera einer seltenen
Spezifität.
Ein weiterer Vorteil des neuen Verfahrens liegt darin, daß
keinerlei Radioaktivität beteiligt ist; es ist wesentlich
billiger als die radio-immunologischen Verfahren und
belastet im Gegensatz zu diesen Verfahren nicht die Umwelt.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die beigefügte
Zeichnung und die nachfolgenden Anwendungsbeispiele näher
erläutert.
Die Fig. 1 bis 9b erläutern schematisch die verschiedenen
Stufen des erfindungsgemäßen Verfahrens, angewandt auf die
Untersuchung einer Blutprobe daraufhin, ob Antigen HBs
enthalten ist.
Fig. 10 erläutert schematisch die Kräfte, denen eine
Zelle beim Zentrifugieren unterworfen ist.
Die Fig. 11 bis 14b zeigen schematisch die verschiedenen
Stufen des Verfahrens nach der Erfindung, angewandt auf den
Nachweis der Anwesenheit von Antigen D auf den roten Blutkörperchen
einer Humanblutprobe;
die Fig. 15 bis 18 sind Diagramme von Zentrifugiervorgängen.
Diese erste Ausführungsform des Verfahrens wird mit Bezug
auf die Fig. 1 bis 9b erläutert. Das Verfahren wurde hierbei
angewandt, um nachzuweisen, ob das Serum, oder Plasma, einer
Humanblutprobe virales Antigen HBs enthielt, das nachfolgend
zur Vereinfachung Antigen HBs bezeichnet wird.
a) Die erste Stufe des Verfahrens besteht darin, daß die
Oberfläche des Bodens eines Behälters vorbereitet wird, der zum
Nachweis der Haftung oder der Nichthaftung von Zellen oder
Teilchen dient.
Der Behälter, dessen Boden einen auf einer Symmetrieachse
des Behälters gelegenen unteren Konvergenzpunkt aufweisen soll,
ist im vorliegenden Falle ein Becher 1 aus Kunststoff,
beispielsweise aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem im Schnitt V-
förmigen Boden 2. Dieser Boden 2 ist mit einer Schicht oder
einem Häutchen aus Immunoglobulinen 3 oder IgX I überzogen,
die im vorliegenden Falle Immunoglobuline der Ziege der
immunochemischen Klasse G sind, d. h. Ziegen-IgG (Fig. 1).
Diese Ziegen-IgG 3 sind in der Figur als weiße Rechtecke
wiedergegeben.
Die Fixierung der IgG auf dem Kunststoff des Bechers
kann mit Hilfe verschiedener chemischer Verfahren erfolgen,
beispielsweise durch Erzeugung von Carbodiimid-Bindungen
zwischen dem Kunststoff und den IgG-Molekülen oder durch
einfache Adsorption der IgG durch den Kunststoff.
Die IgG-Konzentration ist dabei nicht kritisch. Da
jedoch die Sensibilität oder Empfindlichkeit der Reaktionen
von der Oberflächendichte der fixierten Immunoglobuline
abhängt, wird eine an Immunoglobulinen ausreichend konzentrierte
Lösung verwendet, damit der Becherboden mit Immunoglobulinen
gesättigt und auf diese Weise eine größtmögliche Empfindlichkeit
erreicht wird.
Nach der Fixierung des Ziegen-IgG am Becherboden wird
der mit IgG überzogene Becher mit einer physiologischen Lösung
gewaschen, beispielsweise mit physiologischer Kochsalzlösung
(9% NaCl); um alle nicht am Becher fixierten IgG zu entfernen,
wird mehrere Male gewaschen.
Die auf dem Kunststoff-Becherboden fixierte Schicht aus
IgG soll nicht trocken werden; daher wird im Boden des Bechers
eine kleine Menge der physiologischen Kochsalzlösung zurückbehalten
und die IgG-Schicht behält auf diese Weise ihre Aktivität
für einige Stunden.
b) Anschließend werden die Zellen oder Teilchen
(nachfolgend Reaktionspartner-Zellen oder -Teilchen bezeichnet) vorbereitet,
mit deren Hilfe der Vorgang der Adhärenz oder Nichtadhärenz
nachgewiesen wird, je nachdem, ob die Reaktion positiv
oder negativ verläuft, d. h. ob das Serum, das analysiert
werden soll, HBs-Antigen enthält oder es nicht enthält.
Im hier beschriebenen Beispiel sind diese Zellen rote
Blutkörperchen vom Schaf, schematisch mit 4 bezeichnet.
An diese roten Blutkörperchen 4 werden Immunoglobuline
gekuppelt, die zwingend der gleichen Tierart und der gleichen
immunochemischen Klasse zugehören wie die im Becher fixierten
IgX I; einige dieser Immunoglobuline müssen darüber hinaus
eine Antikörperaktivität gegenüber dem HBs-Antigen aufweisen.
Die Kupplung dieser Immunoglobuline erfolgt vorteilhafterweise
gleichzeitig mit einer Behandlung der roten Blutkörperchen
mit Chromichlorid, damit die roten Blutkörperchen Eiweißmoleküle
fixieren bzw. binden können. Im vorliegenden Falle
werden somit auf den roten Blutkörperchen vom Schaf Ziegen-
Anti-HBs-IgG gekuppelt, die schematisch als gestrichelte
Rechtecke wiedergegeben und mit 5 bezeichnet sind. Diese Stufe
der Kupplung von IgG auf den roten Blutkörperchen wird schematisch
in Fig. 2 gezeigt.
Diese Ziegen-IgG mit Anti-HBs-Wirkung werden aus dem
Serum einer Ziege gewonnen, der gereinigtes Antigen-HBs injiziert
worden ist.
Die auf diese Weise vorbereiteten roten Blutkörperchen
werden als "Reaktionspartner-Blutkörperchen" bezeichnet. Natürlich
können anstelle der roten Blutkörperchen beliebige andere
Zellen oder Teilchen verwendet werden, an die Immunoglobuline
gekuppelt werden können.
c) Die so vorbereiteten bzw. vorbehandelten und in
physiologischer (Kochsalz-)Lösung suspendierten roten Blutkörperchen
4 des Schafes werden mit dem Serum oder Plasma der
Blutprobe inkubiert, die untersucht werden soll, um festzustellen,
ob sie Antigen-HBs enthält oder nicht. In der Praxis wird
beispielsweise ein 1 : 50 oder 1 : 100 verdünntes Plasma verwendet.
Bei dieser Inkubation, die außerhalb des zuvor
vorbereiteten Bechers durchgeführt wird, wird eine Suspension von
vorbereiteten roten Blutkörperchen des Schafes, wie oben
beschrieben, mit dem Serum der Blutprobe in Berührung gebracht
und das Ganze bei Umgebungstemperatur inkubiert, während
einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen zehn Minuten.
Diese Inkubationsstufe wird schematisch in Fig. 3 gezeigt,
wobei die eiförmigen oder ovalen, feingestrichelten Moleküle 6
das Antigen-HBs wiedergeben.
Ist in der Serumprobe, die analysiert werden soll, Antigen-
HBs vorhanden, so kuppeln die Moleküle 6 des Antigens mit den
Anti-HBs-IgG 5, die bereits auf den roten Blutkörperchen 4
gebunden sind. Wie schematisch in Fig. 3 gezeigt, ordnen sich
die Antigen-Moleküle um die an ein rotes Blutkörperchen gebundenen
Anti-HBs-IgG-Moleküle herum an und erzeugen auf diese Weise
eine sterische Hinderung in den intermolekularen Zwischenräumen,
die bisher zwischen den Anti-HBs-IgG-Molekülen vorhanden waren.
Enthält das Serum, das analysiert werden soll, kein
Antigen-HBs, so findet keinerlei Reaktion statt und die roten
Blutkörperchen bleiben in dem Zustand, in welchem sie sich am Ende
der vorhergehenden Stufe befunden haben, d. h. am Ende der Stufe,
in der sie die Anti-HBs-IgG der Ziege fixiert oder gebunden hatten;
infolgedessen findet keinerlei sterische Hinderung um diese
Anti-HBs-IgG-Moleküle herum statt.
Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen
werden vorteilhafterweise mehrmals mit physiologischer (Kochsalz-)
Lösung gewaschen (Zugabe der Lösung, wieder-in-Suspension-bringen,
Zentrifugieren, Dekantieren, Abgießen der überstehenden Flüssigkeit
usw.), und zwar in dem Behälter, in welchem inkubiert worden
ist.
d) Dann werden in den Becher 1, dessen Boden 2 mit
einer Schicht aus Ziegen-IgG 3 überzogen ist, gleichzeitig
eingebracht: Zum einen die, wie oben beschrieben, inkubierten
und gewaschenen roten Blutkörperchen vom Schaf und zum anderen
ein Antiglobulin, d. h. ein Immunserum bzw. Antiserum, das
Immunoglobuline mit einer spezifischen Antikörperaktivität
gegenüber den Immunoglobulinen enthält, die zum einen an den
Becher fixiert und zum anderen an die roten Blutkörperchen
gebunden sind, d. h. Ig II Anti-IgX I. Im vorliegenden Beispiel
wird ein Anti-Ziegen-Antiglobulin des Kaninchens zugegeben,
das die Antiziegen-IgG-Immunoglobuline G oder IgG des Kaninchens
enthält; diese Immunoglobuline sind schematisch in den Fig. 4a
und 4b durch kleine schwarze Rechtecke 7 wiedergegeben; die
Fig. 4a entspricht dem Falle einer positiven Reaktion und die
Fig. 4b zeigt den Fall einer negativen Reaktion.
Gemäß einer Variante kann zunächst die Suspension der
roten Blutkörperchen in den Becher gegeben werden und dann
das Antiglobulin.
Die Immunoglobuline des Antiglobulins sind Immunoglobuline
mit einer zumindest divalenten Antikörperfunktion gegenüber
den Ziegen-IgG; ein Kaninchen-IgG mit Antiziegen-IgG-Wirkung
kann somit mit einer dieser Antikörperfunktionen (oder Gruppen)
mit einem am Becherboden fixierten Molekül Ziegen-IgG reagieren
und mit der anderen Funktion mit einem an das rote Blutkörperchen
gebundenen Molekül Anti-HBs-Ziegen-IgG. Diese Immunoglobuline
mit spezifischer Antikörperaktivität gegenüber den Ziegen-IgG
werden aus dem Serum eines Tieres von unterschiedlicher Art
erhalten, im vorliegenden Falle aus dem Serum eines Kaninchens
dem Ziegen-IgG, vorteilhafterweise in gereinigter Form, injiziert
worden ist.
Wie weiter unten noch erklärt, wird hier das Antiglobulin
in relativ hoher Konzentration verwendet, beispielsweise ein
Antiziegen-IgG-Antiglobulin, das mindestens einen Titer von 128
aufweist gemäß der Arbeitsweise von Coombs, und zwar rein
oder wenig verdünnt (Verdünnungsverhältnis 1 : 2 oder 1 : 4).
Während der Gesamtdauer dieser Inkubation, die als
Antiglobulin-Inkubation bezeichnet wird und die aus weiter unten
noch angegebenen Gründen sehr kurz sein muß, wird der Becher
vorteilhafterweise ständig in Bewegung gehalten, um auf diese
Weise das Gemisch aus Suspension von roten Blutkörperchen und
dem Antiglobulin zu homogenisieren.
e) Nach der Antiglobulin-Inkubation wird zentrifugiert,
wozu genaue Bedingungen eingehalten werden müssen; durch das
Zentrifugieren wird nachgewiesen, ob der Vorgang der Adhärenz
eintritt oder nicht, je nachdem, ob die Serumprobe, mit welcher
die vorbehandelten roten Blutkörperchen vom Schaf inkubiert
worden sind, Antigen-HBs enthält oder nicht.
Beim Zentrifugieren rotiert der Becher um eine Achse 1 a,
die senkrecht steht zur Rotationsachse 1 b des Bechers 1;
die erste Phase, Anlagerungsphase bezeichnet, wird nach einer
ausreichend kurzen Zeit nach Beginn der Antiglobulin-Inkubation
in Gang gesetzt, d. h. ausreichend kurz nach dem Einbringen der
Blutkörperchen-Suspension und des Antiglobulins in den Becher,
damit noch sehr wenig IgG 3, das am Becher fixiert ist, oder
IgG 5, das an die Blutkörperchen gebunden ist, mit einem IgG 7
des Antiglobulins mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung reagiert hat.
Vorteilhafterweise wird diese erste Zentrifugierphase nach einer
Zeitspanne in Gang gesetzt, die maximal gleich ist der
Zeitspanne innerhalb derer 10% des Ziegen-IgG mit den Anti-Ziegen-IgG-
Immunoglobulinen des Antiglobulins reagiert haben. In der Praxis
bedeutet dies, daß mit dem Zentrifugieren einige Sekunden
bis zu einigen zehn Sekunden nach Beginn der Antiglobulin-
Inkubation begonnen wird.
Während dieser ersten Zentrifugierphase wird das
Reaktionsmedium, bestehend aus Suspension der Blutkörperchen
vom Schaf und Antiglobulin, an die Oberfläche des Becherbodens
2 angelagert bzw. dieser Boden damit ausgekleidet, so daß
die Anti-HBs-IgG der Ziege 5, die mit den behandelten und
inkubierten roten Blutkörperchen vom Schaf verbunden sind und
die Ziegen-IgG 3, die auf dem Kunststoff fixiert sind, einander
gegenüberstehen und auf diese Weise eine schnelle anfängliche
Haftung oder Adhärenz der roten Blutkörperchen an den Becherboden
hervorgerufen wird, und zwar über die Immunoglobuline 7
des Antiglobulins, die einerseits mit den IgG 5 und andererseits
mit den IgG 3 kuppeln; diese schnelle Anfangshaftung
erfolgt unabhängig davon, ob die Reaktion positiv oder negativ
verläuft, d. h. ob auf den roten Blutkörperchen Antigen-HBs-
Moleküle über Anti-HBs-IgG der Ziege gebunden sind oder nicht.
Hierzu wird eine erste mäßige Zentrifugiergeschwindigkeit
V 1 angewandt; wie diese Geschwindigkeit bestimmt wird, wird
weiter unten erklärt.
Die Fig. 5a und 5b zeigen stark vergrößert die einander
gegenüberliegenden Flächen eines roten Blutkörperchens 4 und des
Becherbodens 2 im Verlauf dieser Anlagerungsphase;
Fig. 5a entspricht dem Fall einer positiven Reaktion; Fig. 5b
entspricht dem Fall einer negativen Reaktion.
In beiden Fällen ordnen sich die Immunoglobuline-Ig 7
des Antiglobulins aufgrund ihrer speziellen Antikörperspezifität
gegenüber den Ziegen-IgG zwischen einerseits den an die
roten Blutkörperchen gebundenen Ziegen-IgG 5 und andererseits
den am Becherboden fixierten Ziegen-IgG 3 an. Man nimmt an, daß
während dieser Anlagerung oder diesem Auskleiden, das zu einer
mäßig starken Haftung der roten Blutkörperchen an der Oberfläche
des Becherbodens 2 führt, sich Gänge oder Freiräume zwischen
dem Kunststoff und den roten Blutkörperchen ausbilden, die
begrenzt sind von den Molekülketten IgG 5/Ig 7/IgG 3, welche
sich gebildet haben; diese Gänge wirken als Filter gegenüber
dem späteren Zutritt von neuen Molekülen Ig 7.
Wie oben gesagt, bilden sich diese Gänge sowohl bei
einer positiven Reaktion aus, d. h. wenn die roten Blutkörperchen
4 vom Schaf die Antigen-HBs-Moleküle 6 über die IgG 5
gebunden haben, wie auch im Falle einer negativen Reaktion, bei
der die roten Blutkörperchen 4 die Moleküle des viralen
Antigens nicht gebunden haben. Jedoch sind im Falle einer
positiven Reaktion (Fig. 6a) diese Gänge mit Molekülen des
viralen Antigens gefüllt, im Falle einer negativen Reaktion
(Fig. 6b) hingegen nicht.
In der Praxis wird in dieser ersten Zentrifugierstufe
oder -phase auf etwa 200 g beschleunigt (g = Erdbeschleunigung),
während etwa 40 bis 60 Sekunden. Die Reaktion wird in einem
Becher ausgeführt, der einen Öffnungswinkel des Konus von 120°
aufweist.
f) Darauf wird das Zentrifugieren während mehrerer
Minuten unterbrochen. Während dieser Unterbrechung zirkulieren
die freien Moleküle Ig 7 in den zuvor während der Anlagerungsphase
gebildeten Gängen und haben die Möglichkeit, mit den noch
freien IgG 5 der roten Blutkörperchen oder den noch freien
IgG 3 des Trägers zu kuppeln. Diese Phase, in der das Zentrifugieren
unterbrochen wird, stellt in der Tat eine Verlängerung
der Antiglobulin-Inkubation dar.
Während der in der ersten Phase des Zentrifugierens
erhaltenen mäßigen Anlagerung oder Auskleidung haben sich
zwischen Behälter (Wand) und den roten Blutkörperchen Bindungsketten
ausgebildet, die bestehen aus: einem IgG fixiert an den
Behälter, einem Anti-IgG-Molekül und einem IgG gebunden an
ein rotes Blutkörperchen. Erfindungsgemäß wurde im Verlauf von
Versuchen festgestellt, daß diese Konfiguration energetisch
weniger beständig ist in Anwesenheit eines Überschusses von
Anti-IgG-Molekülen als die Konfiguration bestehend aus:
einem IgG fixiert an dem Behälter, einem Molekül-Anti-IgG . . .
einem Molekül-Anti-IgG, einem IgG gebunden an ein rotes
Blutkörperchen. Man konnte hieraus schließen, daß durch Verlängerung
der Dauer der Antiglobulin-Inkubation schließlich die
Konfigurationen IgG/Anti-IgG . . . Anti-IgG/IgG in größerer
Anzahl gebildet werden als die Konfigurationen IgG/Anti-IgG/IgG,
was dann die "Enthaftung" bzw. Auflösung der Haftung zwischen
den roten Blutkörperchen und dem Behälter hervorgerufen würde.
Diese Annahme hat sich bestätigt und hiervon wird
vorteilhafterweise Gebrauch gemacht.
Da das Reaktionsgemisch sich in Ruhe befindet, verlängert
sich die Antiglobulin-Inkubation und die Ziegen-Anti-IgG 7
reagieren mit den Ziegen-IgG 3 oder 5 in der Weise, daß sich die
beständigsten Konfigurationen ausbilden.
Da aber, wie oben erwähnt, im Falle einer positiven Reaktion
die zwischen roten Blutkörperchen und Kunststoff entstandenen
Gänge wesentlich gedrängter angefüllt sind als im Falle einer
negativen Reaktion, sind im Falle einer negativen Reaktion
(Fig. 6b) wesentlich mehr freie Moleküle Ig 7 vorhanden, die
in den entstandenen Gängen zirkulieren als im Falle einer positiven
Reaktion (Fig. 6a). Dies hat zur Folge, daß die einander
gegenüberliegenden Flächen der roten Blutkörperchen und des
Kunststoffes in den Gängen im Falle einer negativen Reaktion
sehr viel schneller mit Ig 7 gesättigt werden, die mit den
IgG 5 der roten Blutkörperchen oder mit dem IgG 3 des
Kunststoffes kuppeln, als im Falle einer positiven Reaktion. Nach
Ablauf einer gewissen Zeit weisen im Falle einer negativen Reaktion
(Fig. 7b) die einander gegenüberliegenden Flächen der
roten Blutkörperchen und des Kunststoffes einen überwiegenden
Anteil an Konfigurationen folgender Art auf:
Kunststoff + IgG 3 der Ziege/Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen . . .
Anti-Ziegen-IgG Ig 7 vom Kaninchen/Ziegen-IgG 5 + rotes
Blutkörperchen;
diese Konfiguration kann, da zwei Moleküle gleicher Beschaffenheit
einander gegenüberliegen, nicht zur Ausbildung einer
vollständigen Molekülbrücke Kunststoff + Ziegen-IgG 3/Ig 7 vom
Kaninchen mit Anti-Ziegen-IgG-Wirkung/Ziegen-IgG 5 + rotes
Blutkörperchen führen.
Da sich diese Konfigurationen während der verlängerten
Antiglobulin-Inkubationen in überwiegender Anzahl bilden, sind
die Molekülbrücken, die sich zwischen Kunststoff und roten
Blutkörperchen während der ursprünglichen schnellen Haftung in der
Anlagerungsstufe gebildet haben, nicht mehr in ausreichender
Zahl vorhanden, um die Haftung aufrechtzuerhalten. Es findet
daher eine Ablösung statt.
Im Falle einer positiven Reaktion hingegen (Fig. 7a)
tritt dieser Effekt der Absättigung der gegenüberliegenden
Oberflächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch
Ig 7 sehr viel langsamer ein, so daß die Anzahl der mit
den IgG gekuppelten Anti-IgG-Moleküle noch nicht zur Aufhebung
der Haftung der roten Blutkörperchen in dem Zeitpunkt führt,
zu dem im Falle einer negativen Reaktion bereits eine Ablösung
stattfindet.
Die Dauer dieser Unterbrechung beim Zentrifugieren bzw.
der verlängerten Antiglobulin-Inkubation wird also so geregelt
oder gesteuert, daß das Ausmaß der Sättigung der einander
gegenüberliegenden Flächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff
durch Ig-7-Moleküle, das im Falle einer negativen Reaktion zur
Ablösung führt, erreicht wird, das aber andererseits der Effekt
der Sättigung, der im Falle einer positiven Reaktion zur
Ablösung (Aufhebung der Haftung) führt, nicht erreicht wird.
g) Es folgt die letzte Stufe, in der zentrifugiert wird,
und zwar bei einer Geschwindigkeit V 2, die größer ist als
die Geschwindigkeit V 1. Mit Hilfe dieser Zentrifugierphase
kann nun unterschieden werden zwischen einer positiven
Reaktion und einer negativen Reaktion. Die Geschwindigkeit V 1 wird
so gewählt, daß die erzeugte Zentrifugalkraft die stärker mit
Ig 7 gesättigten roten Blutkörperchen, d. h. die Blutkörperchen,
welche die negative Reaktion anzeigen, in die Kuppe bzw.
den Scheitelpunkt 10 des Bechers mitnimmt und dort sammelt
(Fig. 8b), während die roten Blutkörperchen, welche die
positive Reaktion anzeigen oder kennzeichnen und die an der
Becherwand haften bleiben aufgrund der stehengebliebenen
Molekülbrücken, nicht mitgenommen werden. Diese Molekülbrücken:
Kunststoff + Ziegen-IgG 3/Ig vom Kaninchen mit Anti-Ziegen-IgG-
Wirkung/Ziegen-IgG 5 + rotes Blutkörperchen (Fig. 8a) bleiben
erhalten, weil die Phase oder Stufe der verlängerten Antiglobulin-
Inkubation abgebrochen wird, bevor der Sättigungsgrad an Ig 7
des Antiglobulins erreicht ist, welcher zur Ablösung führt.
In der Praxis wird bei Verwendung eines Bechers mit einem
Öffnungswinkel des Konus von 120° beim zweiten Mal, d. h. in
der letzten Phase mit einer Beschleunigung von etwa 500 g
während einer Zeitspanne von etwa 40 Sekunden zentrifugiert.
Die Analysenergebnisse können dann unmittelbar nach
Abstoppen dieser zweiten Zentrifugierphase beobachtet werden.
Im Falle einer positiven Reaktion, d. h. in dem Fall, in
dem die Serumprobe, mit welcher die roten Blutkörperchen vom
Schaf inkubiert worden sind, tatsächlich Antigen-HBs enthält,
bleiben die roten Blutkörperchen am Becherboden haften bzw.
fixiert, und zwar über die IgG 3, die Ig 7 und die IgG 5.
Man beobachtet dann beim Betrachten des Bechers entlang
seiner Achse 1 b (Fig. 9a) eine homogene Monoschicht von
roten Blutkörperchen, die über die gesamte Oberfläche des
Becherbodens verteilt ist: es liegt Haftung vor.
Wenn andererseits die analysierte Serumprobe kein
Antigen-HBs enthält, werden die roten Blutkörperchen, wie oben
beschrieben, zur Kuppe des Bechers hin mitgenommen und dort
gesammelt. Betrachtet man den Becher entlang seiner Achse,
so beobachtet man hier, daß sich ein Mikrosediment aus roten
Blutkörperchen gebildet hat (Fig. 9b): es liegt keine Haftung
vor.
Die Mengen der eingesetzten Reaktionspartner sind nicht
kritisch. Als Beispiel sei angegeben, daß in einem Becher mit
einem Durchmesser von 1 bis 7 mm das Volumen der eingebrachten
Flüssigkeit 15 bis 250 µl beträgt, wobei die Blutkörperchen-
Suspension und das Antiglobulin vorteilhafterweise in gleichen
Volumina eingesetzt werden.
Wie sich aus der bisherigen Beschreibung ergibt, müssen
bestimmte Stufen unter genauen Bedingungen durchgeführt werden.
Die verwendete Antiglobulin-Konzentration hängt ab von
der Oberflächendichte an IgG, die die im Verlauf der Stufe b)
erhaltenen vorbehandelten und als Reaktionspartner dienenden
roten Blutkörperchen aufweisen; dies wird nachfolgend mit Bezug
auf das zweite Anwendungsbeispiel des Verfahrens noch näher
erläutert.
Die Antiglobulinkonzentration muß ausreichend hoch sein,
damit einerseits eine schnelle Anfangshaftung zwischen roten
Blutkörperchen und Behälterwand im Verlauf der ersten Zentrifugierstufe
stattfindet und damit andererseits ein Überschuß an
Anti-IgG-Molekülen vorhanden ist, die ggf. zum Vorgang der
Ablösung der roten Blutkörperchen führen können, Kennzeichen der
negativen Reaktion, wie weiter oben unter f) erläutert. Die
Antiglobulinkonzentration soll andererseits nicht zu hoch sein,
damit im Verlauf der Anlagerungsphase nicht zuviel Molekülbrücken
zwischen roten Blutkörperchen und Behälterwand ausgebildet
werden, da sonst selbst im Falle einer negativen Reaktion
kleine Gänge entstehen, die den Umlauf oder die Zirkulation
der Anti-IgG-Moleküle beim Abstoppen des Zentrifugierens stören
würden.
Bei der Ausführung dieser Reaktionen der Immuno-Haftung
wurde zusätzlich zu einer von der Antiglobulinkonzentration
abhängigen "Zonen-Erscheinung" bzw. einem "Zonen-Vorgang", d. h.
einer starken Schwankung der Sensibilität der Reaktion der
Immuno-Haftung um ein Maximum, entsprechend einer bestimmten
Antiglobulinkonzentration, noch eine weitere Zonen-Erscheinung
bzw. ein weiterer Zonen-Vorgang nachgewiesen, der von der Zeit
abhängt, während welcher dieses Antiglobulin mit den IgG vor
dem Zentrifugieren in Berührung steht. Diese von der Berührungszeit
abhängige Zonen-Erscheinung, die einen stärkeren Einfluß auf
die Empfindlichkeit der Reaktion hat als die von der
Antiklobulinkonzentration abhängige Zonen-Erscheinung, kann folgendermaßen
erklärt werden:
Im Verlauf der Antiglobulin-Inkubation kuppeln die vom
Antiglobulin beigesteuerten Anti-IgG-Moleküle einerseits mit
den an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG und andererseits
mit den an den Kunststoff des Bechers gebundenen IgG,
wobei die Anzahl der gekuppelten Anti-IgG-Moleküle von der
Inkubationszeit abhängt. Wie schon gesagt, folgt auf die Phase
der Antiglobulin-Inkubation eine erste Zentrifugierphase, die
auch als Anlagerungsphase bezeichnet wird. Je länger die
Inkubation dauert, um so häufiger wird sich ein bereits an ein rotes
Blutkörperchen gebundenes Anti-IgG-Molekül während der Anlagerungsphase
gegenüber einem Molekül gleicher Beschaffenheit finden,
d. h. gegenüber einem Anti-IgG-Molekül, das seinerseits an den
Kunststoff fixiert ist. Diese Konfiguration: rotes Blutkörperchen +
IgG/Anti-IgG . . . Anti-IgG/IgG + Kunststoff, die während der
Anlagerung des roten Blutkörperchens an den Becherboden ausgebildet
wird, wirkt sich ungünstig auf die Möglichkeit einer
Haftung des roten Blutkörperchens am Kunststoff aus. Hieraus
ist leicht zu ersehen, daß die Häufigkeit der Ausbildung
derartiger für die Haftung ungünstiger Konfigurationen mit der
Dauer der Antiglobulin-Inkubation zunimmt und das infolgedessen
die Chancen der Haftung, d. h. die Höhe oder das Ausmaß
der Sensibilität dieser Reaktion um so geringer ist, je länger
die Antiglobulin-Inkubation dauert.
Die Sensibilität erreicht jedoch für eine Inkubationszeit
Null kein Maximum. Es müssen nämlich, damit die Haftung
tatsächlich realisierbar und wahrnehmbar ist, in dem Moment,
in dem die Anlagerung stattfindet, einige Anti-IgG-Moleküle
bereits an einen der Kupplungspartner gebunden sein, d. h.
entweder an die IgG, die ihrerseits mit einem roten Blutkörperchen
verbunden sind, oder an die IgG, die auf dem Kunststoff
fixiert sind. Einige Sekunden oder Bruchteile von Sekunden
reichen aus, damit diese einigen Anti-IgG-Moleküle
sich binden oder kuppeln können.
Diese außerordentlich kurze Inkubationszeit wird
vorteilhafterweise experimentell bestimmt, derart, daß in der
unmittelbar auf die Antiglobulininkubation folgenden Stufe,
d. h. in der Anlagerungsphase alle Reaktionen zur Anlagerung
führen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ sind.
Es werden also die verschiedenen Stufen des Verfahrens,
beschrieben für eine negative Reaktion, ausgeführt, d. h. im
vorliegenden Falle unter Verwendung einer Serumprobe, die
kein HBs-Antigen enthält, wobei die geeignete Dauer der Inkubation
so beschaffen ist, daß man in der Anlagerungsphase 100%
Anlagerung oder Bindung erzielt.
Weiterhin sei bemerkt, daß die Immuno-Haftung oder Immuno-
Adhärenz im Verlauf der Entwicklung der Antiglobulin-Inkubation
außerordentlich empfindlich ist für die schwachen oder geringfügigen
Verringerungen der Oberflächendichte der an den Kunststoff
fixierten IgG, die noch frei sind von Anti-IgG-Molekülen.
Der Zentrifugiervorgang insgesamt ist, wie oben
beschrieben, komplex und läuft in mehreren Phasen ab, von denen
jede einen besonderen mechanischen Effekt auf die Reaktionen
ausübt. Bevor die genauen Bedingungen, die im Verlauf dieser
Zentrifugierphasen eingehalten werden müssen, weiter erklärt
werden, seien die bei einer Zentrifugation auftretenden
oder eingreifenden Kräfte mit Bezug auf Fig. 10 betrachtet.
Das Zentrifugieren, erzeugt durch eine Rotation um eine
Achse 1 a, die senkrecht steht zur Rotationsachse 1 b des Bechers,
hat den Effekt, daß ein rotes Blutkörperchen H oder eine andere
Zelle oder ein anderes Teilchen, das zum Nachweis des Vorgangs
der Haftung oder der Nichthaftung verwendet wird, einer
Zentrifugalkraft F c unterworfen ist, die parallel gerichtet ist der
Achse 1 b des Bechers. Außerdem spielen noch eine Reihe weiterer
Parameter eine Rolle, die wie folgt definiert werden:
Der Winkel α , der von einer Mantellinie des Konus des Bechers
mit ihrer Projektion in eine Ebene senkrecht zur Richtung der
Zentrifugalkraft gebildet wird und der "Neigungs"-Winkel
bezeichnet wird;
die Masse m eines roten Blutkörperchens;
der Zahlenwert n für die Beschleunigung g, die angewandt wird, wenn bei einer Geschwindigkeit von V UpM zentrifugiert wird;
die Zeitspanne t, während welcher die Geschwindigkeit angewandt wird;
die Summe der als nicht spezifisch bezeichneten Kräfte (FNS), welche ein rotes Blutkörperchen am Kunststoff zurückhalten; diese Summe umfaßt die elektrostatischen Kräfte der Anziehung eines roten Blutkörperchens an den Kunststoff; die immunochemischen Bindungen "parasitäre" Spezifität mit Bezug auf die Hauptspezifität, auf welcher die Reaktion beruht, die Widerstandskräfte gegenüber dem Abrutschen oder Abschleudern mittels Unterstützung durch die lokalen Hindernisse (Rauheit des Bechers, Anlehnung oder Abstützen auf der benachbarten Zelle oder den benachbarten Teilchen in geneigter [schräger] Stellung);
die Summe der spezifischen Bindungskräfte, die ein rotes Blutkörperchen auf der Neigung oder geneigten Wand des Bechers zurückhalten, bezeichnet mit FS, und die bestehen aus der Kette der Bindungen zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen, nämlich:
die Masse m eines roten Blutkörperchens;
der Zahlenwert n für die Beschleunigung g, die angewandt wird, wenn bei einer Geschwindigkeit von V UpM zentrifugiert wird;
die Zeitspanne t, während welcher die Geschwindigkeit angewandt wird;
die Summe der als nicht spezifisch bezeichneten Kräfte (FNS), welche ein rotes Blutkörperchen am Kunststoff zurückhalten; diese Summe umfaßt die elektrostatischen Kräfte der Anziehung eines roten Blutkörperchens an den Kunststoff; die immunochemischen Bindungen "parasitäre" Spezifität mit Bezug auf die Hauptspezifität, auf welcher die Reaktion beruht, die Widerstandskräfte gegenüber dem Abrutschen oder Abschleudern mittels Unterstützung durch die lokalen Hindernisse (Rauheit des Bechers, Anlehnung oder Abstützen auf der benachbarten Zelle oder den benachbarten Teilchen in geneigter [schräger] Stellung);
die Summe der spezifischen Bindungskräfte, die ein rotes Blutkörperchen auf der Neigung oder geneigten Wand des Bechers zurückhalten, bezeichnet mit FS, und die bestehen aus der Kette der Bindungen zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen, nämlich:
- IgG (fixiert an einen Kunststoff)/Molekül Anti-IgG/ (IgG gebunden an das rote Blutkörperchen)
die Anlagerungskraft, die auf das rote Blutkörperchen
ausgeübt wird, bei einer Geschwindigkeit von V UpM, d. h.
die Kraft der Auflage des roten Blutkörperchens auf dem
Kunststoff, entsprechend der Teilkraft der Zentrifugalkraft
senkrecht zu einer Mantellinie des Konus. Diese Anlagerungskraft
wird mit F p bezeichnet und ist gleich n×m×cos α;
die Kraft zum Abschleudern, die auf ein rotes Blutkörperchen
bei einer Geschwindigkeit von V UpM ausgeübt wird, d. h.
die Kraft, mit der das rote Blutkörperchen abgelöst oder
abgerissen werden soll, durch die Teilkraft der Zentrifugalkraft
parallel zu einer Mantellinie des Konus. Diese
Abschleuder-Kraft wird als F d bezeichnet und ist gleich
n×m×sin α .
Nach diesen allgemeinen Betrachtungen sollen nun die Vorgänge
im einzelnen erläutert werden, die sich im Verlauf der
verschiedenen Zentrifugierphasen abspielen.
Im hier beschriebenen Beispiel wird angestrebt, daß in der
ersten Zentrifugierphase, d. h. in der Anlagerungsstufe, eine
schnelle Haftung der roten Blutkörperchen eintritt und infolgedessen
eine schnelle Ausbildung von Gängen zwischen den
einander gegenüberliegenden Oberflächen von Kunststoff und
roten Blutkörperchen; diese Gänge spielen die Rolle von
Filtern gegenüber dem späteren Zutritt von neuen Anti-IgG-
Molekülen, wie weiter oben bereits erläutert.
Die Geschwindigkeit V 1 dieser ersten Zentrifugierphase
wird somit so gewählt, daß die Anlagerungskraft F p1 bewirkt,
daß 100% der roten Blutkörperchen haften, und zwar bei allen
Reaktionen, unabhängig davon, ob sie positiv oder negativ
verlaufen. Diese Geschwindigkeit V 1 muß somit so gewählt
werden, daß die Abschleudergeschwindigkeit F d1 nicht so stark
ist, daß die Bindungskräfte, welche die roten Blutkörperchen
am Boden des Bechers halten, aufgehoben werden.
Damit die durch Haftung der roten Blutkörperchen am
Kunststoff gebildeten Gänge als Filter wirken können im
Verlauf der nachfolgenden Phase, wenn das Zentrifugieren unterbrochen
wird oder wenn mit sehr geringer Geschwindigkeit zentrifugiert
wird, muß außerdem die Geschwindigkeit V 1 ausreichend
schwach sein, damit bei der Anlagerung der roten Blutkörperchen
an den Boden des Bechers diese roten Blutkörperchen nicht
zerdrückt werden. Wenn nämlich die Anlagerung zu stark ist
und die roten Blutkörperchen auf dem Kunststoff dabei zerdrückt
werden, werden auch die Gänge zerdrückt und sind nachfolgend
nicht mehr vorhanden, und zwar auch im Falle der negativen
Reaktionen. Die freien Anti-IgG-Moleküle könnten dann nicht mehr
zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen zirkulieren, so daß
der Vorgang der Absättigung der einander gegenüberliegenden
Flächen von roten Blutkörperchen und Kunststoff durch Anti-IgG-
Moleküle, der weiter oben bei der Beschreibung der verschiedenen
Stufen des Verfahrens näher erläutert ist, nicht mehr ablaufen
könnte.
Andererseits darf aber die Geschwindigkeit V 1 in dieser
Anlagerungsstufe nicht zu gering sein. Eine zu schwache
Anlagerung oder zu geringe Anlagerung würde eine ungenügende
Annäherung der reaktionsfähigen Enden zur Folge haben, d. h.
eine ungenügende Annäherung der an die roten Blutkörperchen
gebundenen IgG und der an den Kunststoff fixierten IgG, so daß
sich die Haftung schlecht ausbilden könnte und die Gänge nicht
recht Form annehmen könnten.
Die zweite Zentrifugierphase setzt nicht unmittelbar
nach der Anlagerungsstufe ein, sondern nach einer gewissen
Pause oder Unterbrechungszeit, in der - wie bereits erläutert -
eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation stattfindet. Die
zweite Zentrifugierphase wird mit einer Geschwindigkeit V 2
durchgeführt, die größer ist als die Geschwindigkeit V 1. Diese
Zentrifugiergeschwindigkeit V 2 muß die Wirkung haben, daß die
roten Blutkörperchen, welche am meisten Anti-IgG-Moleküle
während der verlängerten Antiglobulin-Inkubation gebunden haben,
d. h. die roten Blutkörperchen, die für eine negative Reaktion
charakteristisch sind, zum Scheitelpunkt bzw. Kuppe 10 des
Becherbodens hin mitgenommen werden, daß aber andererseits
die roten Blutkörperchen nicht mitgenommen werden, die eine
positive Reaktion kennzeichnen und die, wie oben näher erläutert,
infolge der Haftung an den Wänden des Becherbodens auch nach der
verlängerten Antiglobulin-Inkubation gebunden bleiben,
d. h. nachdem das Zentrifugieren unterbrochen worden ist.
Die Geschwindigkeit V 2 wird daher so gewählt, daß die erzeugte
Abschleuderkraft F d2, die auf ein rotes Blutkörperchen einwirkt,
stärker ist als die Summe der unspezifischen Bindungskräfte,
die dann alleine ein rotes Blutkörperchen zurückhalten, das
am Becherboden eine negative Reaktion kennzeichnet; andererseits
muß die Abschleuderkraft kleiner sein als die Summe
aus FNS + FS, d. h. der unspezifischen und der spezifischen
Bindungskräfte, durch die mittels Haftung die roten Blutkörperchen,
welche eine positive Reaktion kennzeichnen, am Becherboden
zurückgehalten werden.
In diesem Falle werden nur die roten Blutkörperchen,
welche eine negative Reaktion kennzeichnen, abgeschleudert
und sammeln sich in der Kuppe des Bechers, während die
Blutkörperchen, die eine positive Reaktion kennzeichnen,
haften bleiben. Die Unterscheidung zwischen positiver und
negativer Reaktion ist dann sehr deutlich.
Für jedes untersuchtes System, d. h. für eine besondere
Beschaffenheit der als Reaktionspartner verwendeten Zellen
oder Teilchen, des viralen Antigens, das nachgewiesen werden
soll, und der an der Reaktion beteiligten Moleküle IgX I und
Anti-IgX I können somit die optimalen Werte für die oben
definierten Parameter festgelegt werden, welche beim Zentrifugieren
beteiligt sind, und für die die Reaktion die besten Ergebnisse
liefert. Man kann dann feststellen, daß das Verhältnis von
Abschleuderkraft F d zur Anlagerungskraft F p , das eine mögliche
Ablösung bzw. ein mögliches Abschleudern anzeigt, gleich ist:
d. h. tan α . Der Zahlenwert für dieses Verhältnis
hängt also nur von dem Neigungswinkel α ab.
Für einen Winkel α = 0 beträgt somit der Wert für tan α
ebenfalls 0 und die Möglichkeit, daß das Teilchen abgeschleudert
wird, ist gleich 0. Für einen Winkel α = 90° hingegen ist der
Zahlenwert für tan a unendlich, so daß ebenfalls die Möglichkeit,
daß die Teilchen abgeschleudert werden, unendlich ist,
mit anderen Worten ein Nichtabschleudern bzw. Haftenbleiben
ist unmöglich.
Die Zwischenwerte für den Winkel α ermöglichen somit eine
Dosierung oder mengenmäßige Festlegung des Verhältnisses von
Abschleuderkraft zu Anlagerungskraft und die Anpassung dieses
Verhältnisses an die Beschaffenheit der Zellen oder als
Reaktionspartner verwendeten Teilchen, des viralen Antigens und
der beteiligten Moleküle IgG I und Anti-IgG I, so daß man ein
spezifisches Abschleudern oder Ablösen von Zellen oder
Reaktionspartner-Teilchen, welche eine negative Reaktion kennzeichnen,
im Verlauf der zweiten Zentrifugierphase erhält.
Um unter den bestmöglichen Bedingungen arbeiten zu
können, soll daher vorteilhafterweise ein Satz Becher mit
unterschiedlicher Neigung vorhanden sein, so daß der Becher
mit der Neigung α gewählt werden kann, die am besten der
Beschaffenheit der in Rede stehenden Reaktion entspricht.
Man kann auf diese Weise gleichzeitig unter den gleichen
Bedingungen beim Zentrifugieren, d. h. mit den gleichen Werten
für die angewandte Zentrifugalkraft, Analysen von mehreren
unterschiedlichen Proben durchführen, in denen virale Antigene
unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaffenheit
nachgewiesen werden sollen, indem für jede dieser
verschiedenen Analyseproben der Becher gewählt wird, dessen Boden
einen Neigungswinkel α mit einem solchen Wert aufweist, daß
die für eine negative Reaktion charakteristischen Zellen oder
Reaktionspartner-Teilchen abgeschleudert werden, wenn die
für die zweite Zentrifugierphase gewählte verfügbare Zentrifugalkraft
angewandt wird.
Erfindungsgemäß ist somit auch ein Satz von Bechern mit
V-förmigem Boden vorgesehen, deren Öffnungswinkel für den
Konus unterschiedlich sind und beispielsweise den Bereich von
80 bis 140° umfassen und jeweils um 10° voneinander verschieden
sind.
Für das oben beschriebene Beispiel zum Nachweisen von
viralem Antigen HBs in einer Blutprobe werden vorteilhafterweise
Becher mit konischem Boden und einem Öffnungswinkel des Konus
von 120° verwendet.
Fig. 15 zeigt beispielhaft ein Diagramm der verschiedenen
Zentrifugierphasen, die im Verlauf einer Reaktion zum Nachweisen
von Antigen HBs in einer Humanblutprobe durchgeführt werden,
wobei die Reaktion der Immuno-Haftung in einem Becher mit
konischem Boden und einem Öffnungswinkel des Konus von 120°
vorgenommen wird. Auf der Ordinate ist die Zentrifugalkraft,
angegeben in g, aufgetragen und auf der Abszisse die Zeit
in Sekunden.
Das Reaktionsmedium, welches die zuvor mit der Serumprobe
und dem Antiglobulin inkubierten Blutkörperchen enthält,
wird in den Becher eingebracht, dessen Boden mit einer Schicht
oder Haut aus Ziegen-IgG überzogen ist und dort einer Antiglobulin-
Inkubation unterworfen. Wie bereits angegeben, wird der
Becher während dieser Inkubation ständig in Bewegung gehalten,
beispielsweise hin- und hergehenden Bewegungen in einer Richtung
parallel zur Umdrehungsachse. Diese Phase der Antiglobulin-
Inkubation und des Schüttelns ist in Fig. 15 mit I bezeichnet.
Diese Phase wurde hier mit einer Beschleunigung von 4 g durchgeführt,
einem Wert, der keine Auswirkung hat auf das Absinken
oder die Anlagerung der roten Blutkörperchen an den Becherboden.
Mit der Beschleunigung 4 g wurde während fünfzehn Sekunden
zentrifugiert.
Dann wurde die Beschleunigung schnell erhöht bis zu einem
Wert von 200 g und dieser Wert bis zur sechzigsten Sekunde
nach dem Einbringen des Reaktionsmediums in den Becher beibehalten.
In der fünfzehnten Sekunde begann somit eine Phase II, in der die
roten Blutkörperchen absanken, wobei die Gesamtmenge der roten
Blutkörperchen in der dreißigsten Sekunde am Becherboden
versammelt war. Auf diese Phase II folgt die Anlagerungsphase III,
in der alle roten Blutkörperchen an dem Becherboden angelagert
wurden, und zwar sowohl im Falle der positiven Reaktionen wie im
Falle der negativen Reaktionen; gleichzeitig begann die Bildung
der "Filtergänge" zwischen der Oberfläche des Becherbodens und
den daran anliegenden roten Blutkörperchen.
In der sechzigsten Sekunde begann die Phase der Diffusion
der noch frei im Reaktionsmedium zirkulierenden Anti-Ziegen-IgG-
Moleküle zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen (Phase IV
im Diagramm gemäß Fig. 15); diese Phase stellt, wie bereits oben
erläutert, eine Verlängerung der Antiglobulin-Inkubation dar.
Sie wurde ausgeführt, indem mit einer Beschleunigung von 8 g
zentrifugiert wurde, einem Beschleunigungswert, der keinen
ausreichend starken Zentrifugal- oder Zentrifugiereffekt erzeugte,
damit die zuvor während der Phase III gebildeten Gänge zerdrückt
worden wären. Im Verlauf der Phase IV fand fortschreitend die
Sättigung der einander gegenüberliegenden Flächen von roten
Blutkörperchen und Becherboden durch Anti-Ziegen-IgG-Moleküle
statt; die Schwelle, bei der die Ablösung der roten Blutkörperchen,
charakteristisch für die negative Reaktion, im Anschluß
an die Sättigung stattfand, wurde in der dreihundertsten Sekunde
erreicht.
Die letzte Phase, während welcher die gegebenenfalls
vorhandenen roten Blutkörperchen, die eine negative Reaktion
kennzeichnen, sich in der Kuppe des Becherbodens sammeln, wurde
durchgeführt, indem die Zentrifugierbeschleunigung schnell auf
500 g angehoben wurde; dieser Wert reicht aus, um die für die
negative Reaktion kennzeichnenden roten Blutkörperchen mitzureißen,
da sie am Ende der Phase IV, in der die Absättigung mit
dem Antiglobulin stattfand, praktisch nicht mehr hafteten.
In dieser letzten Phase V wurden die roten Blutkörperchen,
die ihre Haftung im Verlauf der vorangehenden Phase IV verloren
hatten, schnell gesammelt.
Diese letzte Zentrifugierphase wird
in dem Moment abgebrochen, in welchem man einen Prozentsatz
von abgeschleuderten roten Blutkörperchen erhält, der gerade
kennzeichnend ist für eine wirkliche oder tatsächliche negative
Reaktion. Im hier gegebenen Beispiel wurde die letzte
Zentrifugierphase in der 340sten Sekunde abgebrochen.
Die Zahlenwerte für die Parameter jeder dieser Phasen
- Zentrifugiergeschwindigkeit, Dauer - können im vornhinein
im Verlauf von Versuchen festgelegt werden, die anhand einer
typischen negativen Reaktion mit den gleichen Reaktionspartnern
vorgenommen wurden, wobei der Versuch mit den besten Ergebnissen
die Werte für die Parameter liefert, die dann für die eigentliche
Analysereaktion angewandt werden.
Gemäß einer Variante wird das Zentrifugieren entsprechend der
Entwicklung der im Gang befindlichen Reaktion gesteuert;
das Verfahren wird dabei gleichzeitig einerseits in einem Becher
ausgeführt, in welchem die Analysereaktion der Probe vorgenommen
wird und andererseits in einem Becher, in welchem eine
negative Kontrollreaktion vorgenommen wird; bei jeder Umdrehung
während des Zentrifugierens wird mit einem Stroboskop-Blitz
beleuchtet.
Das vergrößerte Bild des Bodens des Bechers, in welchem
die Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera
aufgenommen und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde:
die Oberfläche und die Opazität des Bildes des Mikrosementes,
das sich bildet, werden gemessen und die Wachstumskurve dieses
Mikrosementes wird mit der Wachstumskurve des Mikrosementes
verglichen, das bei einer negativen Bezugsreaktion der gleichen
Art erhalten wird. Die Geschwindigkeiten und die Zeitdauer beim
Zentrifugieren werden dann so gesteuert, daß die Wachstumskurve
des Mikrosementes der negativen Kontrollreaktion der Wachstumskurve
der Bezugsreaktion entspricht.
Das Zentrifugieren wird endgültig abgebrochen, wenn die
Oberfläche des analysierten Mikrosementes einer Menge
abgeschleuderter roter Blutkörperchen entspricht, die zumindest
gleich ist der Menge, welche die Unterscheidungsschwelle für
eine wahre negative Reaktion darstellt und die folgendermaßen
definiert wird:
Im Verlauf von Vorversuchen, durchgeführt an negativen
Kontrollreaktionen, wird festgelegt, welchen Prozentsatz an
roten Blutkörperchen ein Mikrosediment enthält, das eine wahre
negative Reaktion bezeichnet, d. h., daß unterschieden und
gemessen werden kann und reproduzierbar ist und das dabei so klein
wie möglich ist. Anschließend wird die Standardabweichung σ
bestimmt, die für diese negativen Reaktionen erhalten wird.
Die Schwelle der Unterscheidung einer negativen Reaktion
entspricht dann einem Prozentsatz roter Blutkörperchen
in einem Mikrosediment, der gleich ist dem für die negative
Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz + 2mal die Standardabweichung.
In analoger Weise entspricht die Unterscheidungsschwelle
für eine positive Reaktion einem Prozentsatz roter
Blutkörperchen in einem Mikrosediment, der gleich ist
dem für eine negative Reaktion kennzeichnenden Prozentsatz,
vermindert um 2mal die Standardabweichung.
Wenn beispielsweise im Falle einer negativen Reaktion
die im Sediment zusammengefaßten roten Blutkörperchen im Mittel
12% ausmachen und die Standardabweichung zu 3% bestimmt wurde,
liegt die Unterscheidungsschwelle für eine negative Reaktion
bei 12% + 2mal 3% = 18%. Entspricht die Oberfläche des
Mikrosediments der Analysereaktion einem Prozentsatz an abgeschleuderten
und im Sediment zusammengesammelten roten Blutkörperchen
am Becherboden, der gleich oder größer ist als 18%, so wird
die Reaktion als sicher negativ angesehen. Die Unterscheidungsschwelle
für eine positive Reaktion beträgt in diesem Falle
12% - 2mal 3% = 6%: wenn also die Oberfläche des Mikrosedimentes
der Analysereaktion einem Prozentsatz an roten Blutkörperchen,
die im Mikrosediment versammelt sind, von 6% oder
weniger entspricht, wird die Reaktion als sicher positiv
angesehen. Entspricht die Oberfläche des entstandenen Mikrosediments
einem Prozentsatz von roten Blutkörperchen zwischen 6 und 18%,
so wird die Reaktion als zweifelhaft bewertet und sollte wiederholt
werden. Das soeben beschriebene Ausführungsbeispiel des
erfindungsgemäßen Verfahrens wurde mit Bezug auf den Nachweis
des viralen Antigens HBs in einer Humanblutprobe gegeben.
Selbstverständlich kann dieses Verfahren auch für den Nachweis
beliebiger anderer viraler Antigene in einer Blutprobe angewandt
werden, indem dann in entsprechender Weise die Beschaffenheit
der Zellen oder Teilchen, die als Reaktionspartner dienen,
die Beschaffenheit der IgX, die am Boden des Bechers fixiert
und anbesagten Zellen oder Teilchen gebunden werden, sowie die
Beschaffenheit der Anti-IgX-I-Moleküle festgelegt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auch auf andere
biologische Flüssigkeiten als Blut anwenden, beispielsweise
auf Speichel oder Urin, um dort ggf. vorhandene virale Antigene
nachzuweisen oder ganz allgemein zum Nachweis von Antigenen,
die als "molekular" bezeichnet werden können, d. h. freie Moleküle,
die nicht an eine Zelle gebunden sind und die Antigen-
Eigenschaften aufweisen, mit der Maßgabe selbstverständlich,
daß die verschiedenen Reaktionspartner in entsprechender Weise
modifiziert werden, d. h. die Zellen oder Teilchen, die als Reaktionspartner
dienen, die Immunoglobuline, die mit diesen Zellen oder
Teilchen gekuppelt und am Becher fixiert werden sollen, das
Antiglobulin und die verschiedenen anderen Parameter der Reaktion.
Mit Bezug auf die Fig. 11 bis 14b sei nun ein anderes
Beispiel der Anwendung oder Ausführung des Verfahrens
beschrieben, wodurch bestimmt werden kann, ob die roten
Blutkörperchen einer Humanblutprobe die Antigenaktivität D aufweisen.
Die Blutkörperchen, die diese Aktivität aufweisen, entsprechen
einem Individuum mit positivem Rhesusfaktor. Wenn die roten
Blutkörperchen hingegen diese Aktivitäten nicht aufweisen,
ist die entsprechende Versuchsperson Rhesus-negativ. Zunächst
sei eine erste Ausführung dieses zweiten Beispiels beschrieben:
a) Die erste Stufe besteht, wie im ersten Beispiel, darin,
daß die Oberfläche des Trägers vorbereitet wird, auf welcher
die Haftung oder Nichthaftung der Zellen bewiesen werden soll
(Fig. 11 und 12).
Der Träger ist ein Becher 21 aus Kunststoff, beispielsweise
aus Polyvinylchlorid (PVC) mit einem V-förmigen Boden 22.
Dieser Boden 22 ist mit einer Schicht oder einem Häutchen
aus Immunoglobulinen 23 überzogen, die der gleichen Tierart
und der gleichen immunochemischen Klasse zugehören müssen, wie
die Globuline mit spezifischer Antikörperwirkung des Antigens,
dessen evtl. Vorhandensein auf den roten Blutkörperchen untersucht
werden soll. Im vorliegenden Beispiel soll nachgewiesen
werden, ob das Antigen D auf der Oberfläche der Membran der
menschlichen roten Blutkörperchen vorhanden ist. Der spezifische
Antikörper dieses Antigens ist ein Human-Immunoglobulin, vor
allem vom Typus G mit Antikörperwirkung oder -funktion Anti-D.
Am Boden des Bechers werden somit Human-Immunoglobuline vom
Typ G fixiert, die man Human-IgG bezeichnet und die durch
weiße Rechtecke 23 angegeben sind.
Die Fixierung oder Bindung der IgG an den Kunststoff, aus
welchem der Becher besteht, wird unter den gleichen Bedingungen
vorgenommen, wie sie oben im ersten Beispiel angegeben wurden.
Nach der Fixierung der IgG an den Becherboden wird mit physiologischer
9%iger Kochsalzlösung gewaschen, um alle nicht
fixierten IgG zu entfernen.
Die Konzentration an IgG, die eingebracht wird, ist nicht
kritisch. Sie werden vorzugsweise im Überschuß eingebracht,
bezogen auf die Menge, welche sich fixieren kann, indem beispielsweise
eine Lösung enthaltend 1 mg/ml verwendet wird.
Damit die am Kunststoff gebundene IgG-Schicht nicht
trocken wird, beläßt man im Becherboden eine kleine Menge
an physiologischer Kochsalzlösung.
b) Die Zellen, die in diesem Beispiel untersucht oder
analysiert werden sollen, sind rote Blutkörperchen einer Humanblutprobe,
die in physiologischer Kochsalzlösung schwimmen;
sie werden außerhalb des Bechers bei Umgebungstemperatur und
während einer Zeitspanne von einigen Minuten bis zu einigen
10 Minuten mit einem für die gesuchte Antigenaktivität spezifischen
Testserum in Berührung gebracht, d. h. mit einem Serum,
das IgG-Moleküle der bekannten Antikörperspezifität Anti-D
enthält, die spezifisch mit den Antigen-D-Einheiten kuppeln
können, die ggf. auf den roten Blutkörperchen vorhanden sind.
Dieses Serum wird Anti-D-Testserum genannt. In der Praxis wird
beispielsweise eine Suspension von roten Blutkörperchen aus
einer Blutprobe, verdünnt 1 : 50 oder 1 : 100, verwendet.
Fig. 13a zeigt auf der rechten Seite schematisch diese
Stufe der Inkubation für den Fall, daß die analysierten roten
Blutkörperchen "positiv" sind, d. h., daß sie Anti-D-Einheiten
tragen; diese Einheiten werden durch Punkte gekennzeichnet,
die auf der Membran der roten Blutkörperchen 24 vorhanden sind.
Diese roten Blutkörperchen kuppeln über ihre Antigen-Einheiten mit
Antikörper Anti-D-IgG-Moleküle 25 des verwendeten Testserums,
wobei diese IgG-Moleküle 25 mit Antikörperaktivität durch
gestrichelte Rechtecke wiedergegeben sind; es entsteht ein
Komplex, wie er bei 26 gezeigt ist.
In analoger Weise zeigt Fig. 13b schematisch diese
Stufe für den Fall, daß die roten Blutkörperchen 24′ "negativ"
sind, d. h. keine Antigen-D-Einheiten tragen. In diesem Falle
kuppeln die roten Blutkörperchen 24′ keine Anti-D-IgG 25.
Nach beendeter Inkubation wird vorteilhafterweise mehrere
Male gewaschen, beispielsweise 3mal mit physiologischer Lösung,
wobei jeder Waschgang folgende Arbeitsschritte umfaßt:
Einbringen der physiologischen Lösung, erneut in-Suspension-
bringen, Zentrifugieren, Dekantieren, Verwerfen der
überstehenden Flüssigkeit. Gewaschen wird in dem Behälter, in dem
inkubiert worden ist. Man erhält auf diese Weise eine Suspension
von inkubierten und gewaschenen roten Blutkörperchen, d. h. von
roten Blutkörperchen, die in einem Medium frei von IgG 25 schwimmen.
c) Dann werden gleichzeitig in dem Becher 21, dessen Boden
mit Human-IgG 23 beschichtet ist, die Suspension der inkubierten
und gewaschenen roten Blutkörperchen und ein Antiglobulin eingebracht,
d. h. eine Lösung von tierischen Antiglobulinen 27,
die Antikörperwirkung gegenüber den Human-IgG aufweisen. Diese
Immunoglobuline 27 des Antiglobulins sind im Bild schematisch
mit schwarzen Rechtecken wiedergegeben.
Gemäß einer Variante kann in einen Becher zunächst die
Suspension der roten Blutkörperchen und dann das Antiglobulin
eingebracht werden.
Als Antiglobulin wurde hier ein Immunserum einer Ziege
verwendet, der man die Human-IgG injiziert hatte. Dieses
Immunserum liefert Immunoglobuline, bezeichnet als Ziegen-Ig
mit Antihuman-IgG-Wirkung, die eine zumindest divalente
Antikörperwirkung gegenüber den Human-IgG aufweisen; ein Antihuman-
IgG-Ziegen-Ig kann somit über seine eine Antikörperfunktion
mit einem Human-IgG kuppeln, das am Becherboden fixiert ist und
über die andere Funktion oder Gruppe mit einem Human-IgG, das
an ein rotes Blutkörperchen gebunden ist.
Das Antiglobulin wird hier in starker Konzentration
verwendet. Die Sensibilität der Immuno-Haftungsreaktion hängt
nämlich von der Antiglobulinkonzentration ab. Eine mögliche
Erklärung dieser Erscheinung kann folgendermaßen lauten:
gleichgültig wie lange praktisch die Antiglobulin-Inkubation
gedauert hat, wird eine 100%ige Absättigung der IgG bei
weitem nicht erreicht, und zwar sowohl bei den IgG, gebunden an
die roten Blutkörperchen, wie auch bei den an den Becherboden
fixierten IgG. Die Auskleidung mittels der Abscheidung von
roten Blutkörperchen bewirkt somit, daß sich eine beträchtliche
Anzahl von heterologen IgG-Molekülen nähern, d. h. von IgG, die
am Becherboden fixiert sind und von IgG, die an die roten
Blutkörperchen gebunden sind. Solange jedoch das rote Blutkörperchen
nicht durch Haftung immobilisiert worden ist, d. h. solange die
Moleküle des Antiglobulins keine Brücke gebildet haben zwischen
den an das rote Blutkörperchen gebundenen und den am Kunststoff
fixierten IgG, rollt oder gleitet das rote Blutkörperchen auf
der Neigung des Becherbodens, der mit IgG überzogen ist, so daß
die Zeitdauer der maximalen Annäherung der beiden gegebenen
heterologen IgG-Moleküle sehr kurz ist und dies um so mehr,
je weniger die roten Blutkörperchen mit IgG besetzt sind. Die
Zeitspanne, während welcher die Entfernung günstig bleibt für
eine Doppelreaktion mit einem Molekül des Antiglobulins, ist somit
sehr kurz. Ist der kürzeste mittlere Abstand zwischen einem
Antiglobulin-Molekül und zwei heterologen IgG-Molekülen zu groß,
damit die mittlere Zeit des Zutrittes dieses Antiglobulin-
Moleküls kleiner ist als die wirksame Zeit der Annäherung von zwei
heterologen IgG-Molekülen auf günstige Entfernung, so wird
keine Reaktion stattfinden. Man erkennt sofort, daß durch
Erhöhen der Antiglobulin-Konzentration diese mittlere Zutritt-Zeit
verringert wird.
Außerdem muß, da man nicht im voraus die IgG-Oberflächendichte
der roten Blutkörperchen kennen kann, das Antiglobulin
in starker Konzentration verwendet werden, um sicherzustellen,
daß selbst im Falle einer sehr geringen Oberflächendichte an
IgG der roten Blutkörperchen die Anti-IgG-Moleküle mit den
wenigen auf den roten Blutkörperchen vorhandenen IgG reagieren
können, um sie auf diese Weise an den Behälter anzulagern. In
diesem Zusammenhang sei bemerkt, daß der Einfluß der
Antiglobulinkonzentration auf die Empfindlichkeit der Reaktion weniger
stark ist im Falle des Nachweises eines viralen Antigens, wie
HBs-Antigen, da in diesem Falle die Oberflächendichte an IgG
der roten Blutkörperchen, welche als Reaktionspartner dienen,
relativ hoch angesetzt wird.
Man verwendet beispielsweise ein Antiglobulin mit Antihuman-
IgG-Wirkung, das einen Titer von mindestens 128 gemäß
Coombs aufweist, rein oder wenig verdünnt. In der Praxis
wird eine Verdünnung des Antiglobulins verwendet, die die als
optimal bestimmte Konzentration aufweist mit Bezug auf die
Empfindlichkeit der anderen bekannten Analyseverfahren, insbesondere
im Hinblick auf den Coombs-Test, der auf einer
Hämagglutination beruht.
Im Becher wird dann die nach der Stufe b) erhaltene
Suspension von Blutkörperchen mit dem Antiglobulin inkubiert,
wobei der Becher ggf. im Verlauf dieser Antiglobulin-Inkubation
in Bewegung gehalten wird.
d) Anschließend an diese Inkubation wird zentrifugiert;
dies muß unter genau bestimmten Bedingungen erfolgen, weil bei
diesem Zentrifugieren der Vorgang der Haftung eintritt oder nicht,
je nachdem, ob die roten Blutkörperchen positiv oder negativ sind.
Wie oben mit Bezug auf das erste Beispiel erklärt, soll
die Antiglobulin-Inkubation sehr kurz sein. Man beginnt daher
mit dem Zentrifugieren wenige Sekunden bis zu wenigen 10 Sekunden
nach dem Einbringen des Reaktionsmediums, bestehend aus Suspension
der roten Blutkörperchen und Antiglobulin in den Becher, d. h. nach
einer Zeitspanne, die ausreichend kurz ist, damit noch sehr wenige
an den Becherboden fixierte IgG (IgG 23) oder an die
Blutkörperchen gebundene IgG (IgG 25) mit den Antihuman-IgG-Ig-
Molekülen des Antiglobulins besetzt bzw. gekuppelt sind, wenn die
entsprechenden Voraussetzungen gegeben sind.
Bei diesem Zentrifugieren wird um eine Achse 21 a rotiert,
die senkrecht verläuft zur Rotationsachse 21 b des Bechers, und
zwar in zwei Stufen oder Zeitabschnitten bzw. Phasen:
In der ersten Stufe wird das Reaktionsmedium gegen die
Fläche des Becherbodens 22 verteilt und daran angelagert, so
daß alle Komplexe aus roten Blutkörperchen und IgG, wenn solche
gebildet worden sind, oder alle durch die Inkubation mit dem
Anti-D-Testserum nicht veränderten roten Blutkörperchen den
IgG gegenüberliegen oder -stehen, die an den Kunststoff fixiert
sind, indem eine erste Zentrifugiergeschwindigkeit V 1 angewandt
wird, deren Zahlenwert nicht ausreicht, um die roten
Blutkörperchen in die Kuppe 30 des Becherbodens mitzunehmen bzw.
mitzuziehen.
Wie sich aus den oben dargelegten allgemeinen Betrachtungen
ergibt, wird die Geschwindigkeit V 1 dieser ersten Zentrifugierphase
so gewählt, daß die hierdurch erzeugte Abschleuder-
Geschwindigkeit F d1 nicht stark genug ist, um die unspezifischen
Bindungskräfte FNS aufzuheben oder zu zerreißen, die die roten
Blutkörperchen am Becherboden festhalten. Die roten Blutkörperchen
werden somit angelagert und befinden sich in einer Stellung,
die es ggf. ermöglicht, daß Antihuman-IgG-Moleküle des
Antiglobulins eine Brücke ausbilden zwischen den am Kunststoffboden
fixierten Human-IgG und den an den roten Blutkörperchen
gebundenen Human-IgG. Diese Anlagerungsphase ermöglicht auch, daß
Antihuman-IgG-Moleküle, die bereits fest mit den Komplexen aus
positiven roten Blutkörperchen und IgG gebunden sind, den noch
verfügbaren IgG-Stellen auf dem Kunststoff gegenüber angeordnet
werden, d. h. in eine günstige Stellung, um vollständige Molekülbrücken
zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen auszubilden.
Die erste Zentrifugiergeschwindigkeit V 1 wird außerdem
ausreichend lang beibehalten, damit, wenn erforderlich, diese
Molekülbrücken zwischen Kunststoff und roten Blutkörperchen
sich ausbilden und vervollständigt werden; diese Brücken bestehen
aus einer Kette folgender Bindungen:
Kunststoff + IgG 23/Antiglobulin 27/IgG 25/positive
Blutkörperchen 24.
In der Praxis wird die Reaktion in einem Becher ausgeführt,
der einen Öffnungswinkel des Konus von 120° aufweist;
die erste Zentrifugierphase wird mit einer Beschleunigung von
etwa 200 g während etwa einer Minute vorgenommen.
e) Hierauf folgt eine zweite Zentrifugierphase, die bei
einiger Geschwindigkeit V 2 durchgeführt wird, welche größer ist
als die Geschwindigkeit V 1. Durch diese zweite Zentrifugierphase
kann zwischen positiver und negativer Reaktion unterschieden
werden. Die Geschwindigkeit V 2 wird so gewählt, daß die erzeugte
Zentrifugalkraft die negativen roten Blutkörperchen, sofern
vorhanden, in die Kuppe 30 des Becherbodens zieht und sie hier
versammelt bzw. zusammenballt (Fig. 14b). Sie reicht hingegen nicht
aus, um die positiven roten Blutkörperchen mitzunehmen, die
an die Becherwand gebunden bleiben, und zwar mit Hilfe der
IgG 23, der Antihuman-IgG-Moleküle 27 und der IgG 25 (Fig. 14a).
Die Geschwindigkeit V 2 wird also so gewählt, daß die durch
dieses Zentrifugieren erzeugte Abschleudergeschwindigkeit F d2
eine Intensität aufweist, die größer ist als die Summe der
unspezifischen Bindungskräfte FNS, die ein negatives rotes
Blutkörperchen am Becherboden halten, jedoch kleiner als die
Summe aus unspezifischen Bindungskräften und spezifischen
Bindungskräften FNS + FS, die ein positives rotes Blutkörperchen
am Becherboden festhalten.
In der Praxis wird, wenn diese Reaktion in einem Becher
mit einem Scheitelwinkel von 120° ausgeführt wird, in dieser
zweiten Phase mit einer Beschleunigung von etwa 1600 g zentrifugiert,
und zwar während einiger Sekunden bis zu einigen zehn
Sekunden.
Die Analyseergebnisse erscheinen unmittelbar nach Ende
der Reaktion.
Im Falle einer positiven Reaktion, d. h. wenn die analysierten
roten Blutkörperchen tatsächlich Antigen-D-Aktivität
aufweisen, bleiben alle Komplexe 26 aus roten Blutkörperchen
und IgG am Becherboden gebunden, und zwar über die Antihuman-IgG-
Moleküle 27 (Fig. 14a) und die Human-IgG 23. Man beobachtet dann
beim Betrachten des Bechers entlang seiner Achse 21 b (rechte
Seite der Fig. 14a) eine homogene Monoschicht aus roten
Blutkörperchen, die über die gesamte Fläche des Becherbodens verteilt
sind: es liegt Haftung vor.
Wenn die analysierten roten Blutkörperchen hingegen keine
Antigen-D-Aktivität aufweisen, werden sie im Verlauf der zweiten
Zentrifugierphase in die Kuppe 30 des Becherbodens mitgenommen
und hier zusammengeballt. Betrachtet man den Becher entlang seiner
Achse, so beobachtet man in diesem Falle die Bildung eines
Mikrosedimentes 31, das aus roten Blutkörperchen besteht (rechte Seite
der Fig. 14b): Es ist nicht zur Haftung gekommen.
Die angewandten Mengen der Reaktionspartner sind nicht
kritisch. In einem Becher mit Durchmesser 1 bis 7 mm wird
beispielsweise ein Flüssigkeitsvolumen von 15 bis 250 µl
eingebracht, wobei vorteilhafterweise gleiche Volumina an Suspension
der roten Blutkörperchen und an Antiglobulin eingesetzt werden.
Das soeben mit Bezug auf die Untersuchung, ob Antigen-
D-Einheiten auf roten Blutkörperchen vorhanden sind oder nicht,
beschriebene Verfahren kann unter den gleichen Bedingungen
angewandt werden, um zu untersuchen, ob Serum oder Plasma einer
Humanblutprobe Anti-D-spezifische Antikörper enthalten. In diesem
Falle wird das Serum, welches analysiert werden soll, mit Test-
Blutkörperchen inkubiert, die bekannte Antigen-D-Spezifität
aufweisen: wenn das Serum, welches analysiert werden soll,
Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält, kuppeln die von
diesem Serum gelieferten Immunoglobuline mit Anti-D-spezifischer
Antikörperwirkung mit den Antigen-D-Einheiten der roten
Blutkörperchen.
Die auf diese Weise inkubierten roten Blutkörperchen
werden dann vorteilhafterweise gewaschen und in den Behälter
eingebracht, wie oben beschrieben, und zwar gleichzeitig mit
dem Antiglobulin; anschließend werden die gleichen Zentrifugierstufen
durchgeführt, wie oben erwähnt.
Ist die Reaktion positiv, d. h. enthält das Serum, das analysiert
werden soll, in der Tat Anti-D-spezifische Antikörper,
so bildet sich eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen
aus, die an der Oberfläche des Becherbodens haften aufgrund
der Ausbildung von Molekülbrücken der Konfiguration Kunststoff +
IgG/Anti-IgG/IgG/rote Blutkörperchen. Enthält hingegen das Serum,
das analysiert werden soll, keine Anti-D-spezifischen Antikörper,
so ist die Reaktion negativ und die Blutkörperchen, die nicht
am Becherboden zur Haftung gebracht werden konnten, finden sich
am Ende der Reaktion in Form eines Mikrosedimentes in der
Kuppe des Bechers.
Das Verfahren wurde bisher beschrieben mit Bezug auf
die Untersuchung, ob rote Blutkörperchen Antigeneinheiten D
tragen oder ob im Plasma oder Serum einer Blutprobe Antikörper
mit Anti-D-Spezifität vorhanden sind; es kann auch für die
Untersuchung oder den Nachweis beliebiger anderer erythrozytärer
Antigene oder beliebiger anderer Antikörper im Plasma einer
Blutprobe angewandt werden. Wird die Untersuchung im Hinblick
auf ein bestimmtes erythrozytäres Antigen geführt, so werden
die Blutkörperchen, für die bestimmt werden soll, ob sie in der
Tat Antigenaktivität aufweisen, mit einem Testserum inkubiert,
das den bekannten spezifischen Antikörper des gesuchten Antigens
enthält. Umgekehrt wird, wenn man wissen will, ob das
Plasma einer Blutprobe einen bestimmten Antikörper enthält,
dieses Serum mit bekannten Test-Blutkörperchen inkubiert, die
die dem gesuchten Antikörper entsprechende Antigen-Aktivität
aufweisen.
Diese Test-Blutkörperchen können rote Blutkörperchen sein,
die Antigeneinheiten tragen, welche für den gesuchten Antikörper
spezifisch sind. Es können statt dessen auch Zellen anderer
Beschaffenheit oder geeignete Teilchen eingesetzt werden,
beispielsweise Kunststoffteilchen, Zellen oder solche Teilchen,
auf denen die für den gesuchten Antikörper spezifischen Antigeneinheiten
vorher gebunden worden sind.
Anschließend werden dann die verschiedenen weiteren
Stufen durchgeführt, wie sie oben beschrieben wurden, indem ggf.
die verschiedenen Arbeits-Parameter verändert werden, beispielsweise
die Parameter für das Zentrifugieren, so daß die Haftung
oder Nichthaftung nachgewiesen werden können.
Das zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens nach
der Erfindung kann auch angewandt werden für Untersuchungen
beliebiger Arten von zellulären Antigenen, beispielsweise Antigen,
das von den Lymphozyten getragen wird oder auch Plättchen-
Antigen, indem in entsprechender Weise die Beschaffenheit der
verschiedenen Reaktionspartner, d. h. Testserum, Immunoglobuline,
die am Becherboden fixiert werden, und Antiglobulin ausgewählt
werden.
Dieses zwe 28151 00070 552 001000280000000200012000285912804000040 0002002907198 00004 28032ite Beispiel des Verfahrens nach der Erfindung
kann gemäß einer Variante oder Abänderung durchgeführt werden,
die nachfolgend beschrieben wird. Es handelt sich wiederum um
den Nachweis, ob die roten Blutkörperchen einer Humanblutprobe
Antigen-D-Aktivität aufweisen oder nicht.
a) Wie in der zuvor beschriebenen Variante besteht die
erste Stufe darin, daß der konische Boden des Bechers aus Kunststoff
so vorbereitet wird, daß er mit Human-IgG beschichtet oder
überzogen ist, d. h. mit Immunoglobulinen der gleichen Tierart
und der gleichen immunochemischen Klasse, denen die in der
nächsten Stufe verwendeten Antigen-D-spezifischen Antikörper
zugehören.
b) Anschließend wird, wie zuvor, in einem anderen Becher
als dem Analysebecher eine Inkubation vorgenommen, der roten
Blutkörperchen, welche analysiert werden sollen und in einer
geeigneten physiologischen Lösung schwimmen, mit einem
Testserum, das Antikörper bekannter Anti-D-Spezifität enthält
(Anti-D-Testserum). Die mit dem Testserum inkubierten roten
Blutkörperchen werden dann zweckmäßigerweise mit physiologischer
Lösung gewaschen.
c) Anschließend werden, immer noch außerhalb des Analysebechers,
die so vorbehandelten roten Blutkörperchen mit einem
Antiglobulin inkubiert, d. h. mit einem tierischen Immunserum,
das Anti-Human-IgG-Immunoglobuline liefert. Diese Inkubation
wird unter den üblichen Temperaturbedingungen vorgenommen,
beispielsweise bei 20°C und während ausreichend langer Zeit, damit
die größtmögliche Anzahl oder zumindest ein hoher Prozentsatz
der an die roten Blutkörperchen gebundenen IgG-Moleküle (im Falle,
daß die roten Blutkörperchen positiv sind) mit den Antihuman-IgG-
Molekülen kuppeln. Vorteilhafterweise dauert eine solche
Inkubation 20 Minuten.
Das verwendete Antiglobulin wird vorteilhafterweise
in höherer Konzentration eingesetzt, aus den gleichen Gründen,
wie sie oben bereits erläutert wurden. Im vorliegenden Falle
wird mit einem Antiglobulin gearbeitet, das einen Coombs-Titer
von mindestens 128 aufweist, verdünnt oder wenig verdünnt, d. h.
in einem Verdünnungsverhältnis von 1 : 2 oder 1 : 4.
d) Am Ende dieser Inkubationszeit wird das Reaktionsmedium,
bestehend aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobulin,
in den Becher gegeben, dessen Boden mit Human-IgG beschichtet bzw.
überzogen ist.
e) Dann wird sofort ein erstes Mal zentrifugiert, wobei
der Becher um eine Achse rotiert, die senkrecht steht zu seiner
Rotationsachse. Diese Zentrifugierphase wird bei einer Geschwindigkeit
V 1 ausgeführt, die ausreichend groß ist, damit die
Blutkörperchen sich an der Oberfläche des Becherbodens anlagern,
die aber nicht ausreicht, um die unspezifischen Bindungskräfte
aufzuheben, durch die die roten Blutkörperchen, sowohl die negativen
wie die positiven, an die Becherwand gebunden sind. Die
Geschwindigkeit V 1 wird somit so bemessen, daß die Intensität
der erzeugten Abschleuderkraft kleiner ist als die Summe der
unspezifischen Bindungskräfte FNS. Diese erste Zentrifugiergeschwindigkeit
wird während einer ausreichenden Zeit beibehalten,
damit die Molekülketten, bestehend aus einem am
Becherboden fixierten Human-IgG, einem Anti-Human-IgG-Molekül
und einem Human-IgG, das spezifisch an eine Antigen-D-Einheit
eines roten Blutkörperchens gekuppelt ist, sich ausbilden
können; diese Zeit wird entsprechend der Beschaffenheit des
untersuchten Antigens oder Antikörpers im voraus bestimmt.
Im vorliegenden Falle wird mit einer Beschleunigung von etwa
200 g während etwa einer Minute zentrifugiert.
f) Anschließend wird - wie bei der ersten Ausführungsform -
ein zweites Mal zentrifugiert.
Genauer gesagt, die Zentrifugiergeschwindigkeit wird auf
einen Wert V 2 gesteigert, der so bemessen ist, wie bereits
erklärt, daß die Intensität der erzeugten Abschleuderkraft
ausreicht, um die Blutkörperchen, die nur über unspezifische
Bindungskräfte an den Becher gebunden sind, d. h. die negativen
Blutkörperchen in die Kuppe des Bechers mitzunehmen, daß die
Intensität hingegen nicht ausreicht, um die Blutkörperchen
mit Antigen-D-Funktion in die Kuppe mitzunehmen; d. h. die Intensität
reicht nicht aus, um die Summe aus unspezifischen Bindungskräften
FNS einerseits und spezifischen Bindungskräften FS
andererseits aufzuheben, durch die die positiven roten Blutkörperchen
an der Neigung des Bechers gehalten werden, und zwar
dank der ausgebildeten Molekülbrücken, Kunststoff + Human-IgG/
Antihuman-IgG/Anti-D-Human-IgG/Antigen D eines Blutkörperchens.
Man beobachtet die gleichen Ergebnisse, wie sie zuvor
erhalten wurden: wenn die Reaktion positiv ist, tritt Haftung
ein und man beobachtet beim Betrachten des Bechers entlang seiner
Rotationsachse eine homogene Monoschicht aus roten Blutkörperchen,
die über den Becherboden verteilt sind. Ist hingegen die
Reaktion negativ, so findet keine Haftung statt und man beobachtet
in der Kuppe des Becherbodens ein Mikrosediment.
Diese zweite Ausführungsform unterscheidet sich von
der ersten oben beschriebenen vor allem darin, daß die
Antiglobulin-Inkubation, d. h. die Inkubation der roten Blutkörperchen,
die zuvor mit dem Testserum inkubiert worden sind,
und der Antihuman-IgG-Moleküle nicht in dem mit Human-IgG
ausgekleideten Becher unmittelbar vor der ersten Zentrifugierphase
vorgenommen wird, sondern außerhalb dieses Bechers und
daß das dabei erhaltene Reaktionsmedium dann erst in den
Becher eingebracht und hier zentrifugiert wird. Was hierbei
angestrebt wird, ist eine maximale Asymmetrie zwischen dem
Prozentsatz an Antihuman-IgG-Molekülen, die mit den an den
Kunststoff gebundenen oder fixierten Human-IgG-Molekülen
reagiert haben, und dem Prozentsatz Antihuman-IgG-Moleküle,
die mit den an die roten Blutkörperchen gebundenen Human-IgG-
Molekülen reagiert haben. Die ideale Bedingung wird erreicht,
wenn 0% der am Kunststoff fixierten Human-IgG-Moleküle
durch Antihuman-IgG-Moleküle besetzt sind bzw. mit diesen
gekuppelt haben und wenn der größtmögliche prozentuale Anteil
an Human-IgG-Molekülen, die an die roten Blutkörperchen
gebunden sind, durch Antihuman-IgG-Moleküle besetzt ist bzw.
mit diesen gekuppelt hat, vorausgesetzt, daß dieses Maximum
unterhalb des Wertes legt, der eine direkte Agglutinierung der
roten Blutkörperchen miteinander über die Anti-IgG-Moleküle
hervorruft.
Es ist nämlich wahrscheinlich, daß die maximale Empfindlichkeit
der Haftungsreaktion erreicht wird, wenn zu Beginn
der Anlagerung der roten Blutkörperchen an die Fläche des
Becherbodens, d. h. zu Beginn der ersten Zentrifugierphase,
eine maximale Asymmetrie erreicht wird der Verteilung der an die
beiden möglichen Kupplungsstellen gebundenen Anti-IgG-Moleküle,
d. h. der an den Kunststoff fixierten IgG und der an die roten
Blutkörperchen gebundenen IgG; diese Asymmetrie ist so
gerichtet oder beschaffen, daß die Kupplungsstelle mit der
geringeren Oberflächendichte an IgG den größeren Prozentsatz
an Anti-IgG-Moleküle gebunden hat. In dem Fall, der hier als
Beispiel dient, ist die Kupplungsstelle (oder Kupplungsende) mit
der geringeren Oberflächendichte an IgG das rote Blutkörperchen
und der Kunststoff weist eine höhere Oberflächendichte
an IgG auf, weil diese Immunoglobuline hier bis zum Sättigungsgrad
fixiert oder gebunden worden sind.
Eine solche Antiglobulin-Inkubation wird als "asymmetrisch"
bezeichnet, während die in der ersten Ausführungsform oben
beschriebene Antiglobulin-Inkubation als symmetrisch bezeichnet
wird, da dort jede der beiden IgG-Kupplungsstellen
gleichzeitig mit dem Antiglobulin in Berührung gebracht
wird.
Im Falle der Identifizierung von erythrozytären oder zellulären
Antigenen oder von Antikörpern kann mit Hilfe einer
asymmetrischen Antiglobulin-Inkubation außerhalb des Analysebechers,
in welchem die Reaktion der Immuno-Haftung stattfindet,
eine um das 10- bis 100fache höhere Empfindlichkeit erreicht
werden als in den Fällen, in denen eine symmetrische Antiglobulin-
Inkubation vorgenommen wird.
Diese zweite Ausführungsform, bei der mit asymmetrischer
Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird, wird somit vorzugsweise
vor allem für solche Reaktionen angewandt, die als schwierig
qualifiziert werden können, d. h. für Reaktionen, die charakterisiert
sind durch eine sehr kleine Anzahl von Immunoglobulinen-Ig,
beispielsweise IgG, welche an die Blutkörperchen gebunden sind;
dies kann das Ergebnis sein, von einer sehr kleinen Menge eines
bestimmten Antikörpers, welcher im analysierten Serum identifiziert
werden soll, oder einer sehr geringen Oberflächendichte eines
zellulären Antigens auf den Blutkörperchen, welche analysiert
werden sollen.
Das Verfahren mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation
kann auch angewandt werden, um zu bestimmen, ob ein Serum den
Antikörper mit der Spezifität Anti-D enthält. In diesem Falle
läßt man das Serum, das analysiert werden soll, mit roten
Test-Blutkörperchen, die die bekannte Antigen-Aktivität D
aufweisen, inkubieren und verfährt dann weiter, wie oben
beschrieben.
Das Verfahren kann auch angewandt werden, um andere
erythrozytäre Antigene als Antigen D zu identifizieren und ganz
allgemein, um alle Arten von zellulären Antigenen zu identifizieren,
beispielsweise lymphozytäre Antigene oder Plättchen-
Antigene; die Reaktionspartner beteiligen sich an der Reaktion
der Immuno-Haftung und die Parameter für das Zentrifugieren werden
dann in geeigneter Weise dem analysierten serologischen System
angepaßt. In analoger Weise kann dieses Verfahren auch für die
Identifizierung aller Arten von Antikörpern angewandt werden,
die im Plasma oder Serum einer Blutprobe enthalten sind.
In dem oben beschriebenen Beispiel des erfindungsgemäßen
Verfahrens, angewandt auf die Identifizierung von erythrozytären
oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern, die im Plasma
einer Blutprobe enthalten sind, umfaßte das Zentrifugieren, mit
welchem die Erscheinung der Haftung oder der Nichthaftung aufgezeigt
wird, zwei Phasen, wobei die zweite Phase bei höherer
Zentrifugiergeschwindigkeit durchgeführt wurde als die erste
Phase.
Gemäß einer Variante kann beim Zentrifugieren mit einer
einzigen Beschleunigung gearbeitet werden, die geeignet ist,
zumindest momentan, alle Körperchen, beispielsweise rote
Blutkörperchen an die Wand des Behälterbodens anzulagern, wobei der
Zahlenwert dieser Beschleunigung so ist, daß unter diesen Teilchen
nur solche, falls vorhanden, langsam und zunehmend von der
Wand abgerissen oder abgeschleudert und in der Kuppe des Behälterbodens
gesammelt werden, die an der Wand des Behälterbodens
nicht haften können, weil sich keine Molekularketten,
bestehend aus einem mit dem Kunststoff verbundenen Immunoglobulin,
einem Molekül des Antiglobulins und einem Immunoglobulin
gebunden an ein Blutkörperchen ausbilden können. In diesem
Falle wird die Beschleunigung der einzigen Zentrifugierphase
ein wenig oberhalb des Wertes gehalten, der dem mittleren
Niveau der Auflösung der unspezifischen
Bindungskräfte entspricht, welche sowohl die eine negative
Reaktion kennzeichnenden Körperchen als auch die eine
positive Reaktion kennzeichnenden Körperchen binden, wobei
diese unspezifischen Bindungskräfte die einzigen Kräfte sind,
welche die für eine negative Reaktion charakteristischen
Körperchen zurückhalten. Da die Beschleunigung bzw. Geschwindigkeit
beim Zentrifugieren gering ist, werden alle Körperchen
an den Becherboden angelagert während einer ausreichenden Zeit,
damit die Molekülbrücken, die sich ausbilden können, fertiggestellt
werden; die Entwicklung und die Fertigstellung dieser
Molekularbrücken verläuft schneller als das Abreißen oder
Abschleudern der Körperchen, das für eine negative Reaktion
charakteristisch ist. Wenn diese Zentrifugiergeschwindigkeit
ausreichend lang beibehalten wird, werden alle die Körperchen,
sofern vorhanden, die am Becherboden nicht haften können, weil
sich keine Molekülbrücken ausbilden können, allmählich von
der Wand des Becherbodens abgelöst und in der Kuppe versammelt,
während alle Blutkörperchen, die eine positive Reaktion
kennzeichnen, an der Wand des Behälterbodens haften bleiben, weil
sich die Molekülbrücken gebildet haben, die entstehen konnten.
Im Falle des Nachweises von Antigen-D-Aktivität der roten
Blutkörperchen einer Humanblutprobe beträgt die Beschleunigung
dieser einzigen Zentrifugierphase etwa 250 g und wird während
etwa 400 Sekunden beibehalten, wenn die Analyse in einem Becher
mit einem Scheitelwinkel von 120° des Konus ausgeführt wird.
Mit Bezug auf die Fig. 16 bis 18 seien nun drei
verschiedene Zentrifugier-Diagramme beschrieben, die bei den
oben beschriebenen Reaktionen zum Identifizieren von erythrozytären
Antigenen oder Antikörpern angewandt werden können.
Auf jedem dieser Diagramme ist auf der Ordinate die
angewandte Zentrifugalkraft in Anzahl g angegeben und auf der
Abszisse die Dauer des Zentrifugiervorganges in Sekunden,
wobei die Reaktion der Immunohaftung in einem Becher
ausgeführt wurde, dessen konischer Boden einen Scheitelwinkel von
120° aufwies.
Das erste Diagramm (Fig. 16) entspricht dem Fall, bei
welchem eine symmetrische Antiglobulin-Inkubation vorgenommen
wurde. Im Zeitpunkt 0, nach beendetem Einbringen des Reaktionsmediums
aus Suspension von roten Blutkörperchen und Antiglobulin
in den Becher, wurde diesem eine schwache Zentrifugiergeschwindigkeit,
im vorliegenden Fall von 4 g, erteilt, indem der Becher
um eine Achse senkrecht zu seiner Rotationsachse rotierte.
Diese Phase I umfaßt die ersten 15 Sekunden und ist eine Phase
der Antiglobulin-Inkubation; die Geschwindigkeit reicht nicht
aus, um in irgendeiner Weise ein schnelles Absinken und Anlagern
der roten Blutkörperchen am Becherboden zu bewirken. Ggf. kann
hierbei gleichzeitig das im Becher enthaltene Reaktionsmedium
in Bewegung gehalten werden.
Dann wird die Zentrifugierbeschleunigung schnell erhöht bis
zu einem Wert unterhalb des mittleren Wertes, bei welchem lediglich
die unspezifischen Bindungskräfte FNS aufgehoben werden.
Wird dieses mittlere Niveau mit 230 g bewertet, wie im Falle des
vorliegenden Beispieles, in welchem eine Humanblutprobe daraufhin
untersucht wird, ob auf den roten Blutkörperchen Antigen-D-Aktivität
vorhanden ist, so wird die Beschleunigung auf 200 g gebracht.
Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde läuft eine Phase II ab,
in der die roten Blutkörperchen zum Becherboden hin wandern, wobei
in der 30sten Sekunde alle Blutkörperchen den Becherboden
erreicht haben.
Die Zentrifugierbeschleunigung wird bis zur 60sten Sekunde
bei 100 g gehalten. Hierdurch wird von der 30sten bis zur
60sten Sekunde eine Phase III begrenzt, in welcher die roten
Blutkörperchen am Becherboden angelagert werden; in dieser
Phase können die Molekülbrücken entstehen, welche sich zwischen
Kunststoff und roten Blutkörperchen ausbilden können und in der
60sten Sekunde sind praktisch alle möglichen Molekülbrücken
vorhanden.
Dann wird die Zentrifugiergeschwindigkeit schnell erhöht
bis auf einen solchen Wert, daß die Summe der unspezifischen
Bindungskräfte, durch die alleine die negativen roten
Blutkörperchen am Becher festgehalten werden, aufgehoben oder
zerrissen wird; selbstverständlich muß die Zentrifugierbeschleunigung
unterhalb des Wertes bleiben, bei welchem ein Aufbrechen
oder Auflösen der Summe der spezifischen Bindungskräfte und der
unspezifischen Bindungskräfte, durch die die positiven
Blutkörperchen am Kunststoff gehalten werden, stattfinden würde.
Im vorliegenden Fall wird die Beschleunigung auf 1600 g gebracht.
Die letzte Phase IV ist somit eine Phase, in welcher die
unspezifischen Bindungskräfte aufgehoben werden, wenn nur diese
die roten Blutkörperchen am Kunststoff festhalten; gleichzeitig
werden in dieser Phase die abgelösten oder abgeschleuderten
roten Blutkörperchen schnell gesammelt oder zusammengeballt.
Der Zentrifugiervorgang wird definitiv in der 84sten Sekunde
abgebrochen.
Das gleiche Zentrifugier-Diagramm kann mit nur einer
kleinen Modifizierung auf das Verfahren angewandt werden, wenn
mit asymmetrischer Antiglobulin-Inkubation gearbeitet wird.
In diesem Falle entfällt die Phase oder Stufe I der Antiglobulin-
Inkubation im Becher unter Bewegung, weil die Antiglobulin-
Inkubation außerhalb des Bechers vorgenommen wird zwischen zuvor
mit dem Testserum inkubierten roten Blutkörperchen - oder mit
Test-Blutkörperchen inkubierten Serum, das analysiert werden
soll - und dem Antiglobulin. Nach beendeter asymmetrischer Antiglobulin-
Inkubation wird das Reaktionsmedium in den Becher
verbracht und dann unmittelbar ein erstes Mal mit einer
Beschleunigung von 200 g zentrifugiert.
Eine zweite Art zu zentrifugieren, die sich auf die
Reaktion zum Identifizieren von erythrozytären Antigenen
oder von Antikörpern anwenden läßt, wird im Diagramm gemäß
Fig. 17 gezeigt.
Wie beim Diagramm gemäß Fig. 16, wird bis zur 15ten
Sekunde mit ganz geringer Beschleunigung zentrifugiert, im
vorliegenden Falle mit 4 g, während einer Phase oder Stufe I
der symmetrischen Antiglobulin-Inkubation; ggf. wird der
Becher gleichzeitig während dieser Inkubation zusätzlich in
Bewegung gehalten.
In der 15ten Sekunde wird die Zentrifugierbeschleunigung
schnell erhöht, in diesem Falle aber auf einen Wert, der ganz
leicht oberhalb des Wertes liegt, welcher dem mittleren Niveau
der Aufhebung der unspezifischen Bindungskräfte alleine
entspricht. Dieses mittlere Niveau bzw. diese mittlere Ebene
wird hier mit 230 g bewertet und die Geschwindigkeit daher auf
250 g gebracht. Von der 15ten bis zur 30ten Sekunde läuft die
Phase II, in welcher die roten Blutkörperchen absinken; in der
30sten Sekunde haben alle Blutkörperchen den Becherboden erreicht.
Da die Beschleunigung hier bei 250 g gehalten wird, d. h. ein
wenig oberhalb des mittleren Wertes, bei welchem die unspezifischen
Bindungskräfte aufgehoben werden, folgt hier unmittelbar
auf die Phase II, in der die Blutkörperchen absinken, eine Phase III,
in welcher die unspezifischen Bindungskräfte langsam und
vorsichtig gelöst werden, wenn nur durch diese Bindungskräfte
ein rotes Blutkörperchen an den Kunststoff gebunden ist und dieses
rote Blutkörperchen zu dem Teil der Blutkörperchen gehört,
welche die negative Reaktion kennzeichnen und die am wenigsten
unspezifische Bindungskräfte haben. In dieser Phase werden somit
gleichzeitig die abgelösten oder abgeschleuderten Zellen
zunehmend langsam gesammelt. Die Geschwindigkeit dieser
Sammlung ist außerordentlich gering, so daß unmittelbar
nach der Stufe, in welcher die roten Blutkörperchen absinken,
diese noch ausreichend lange an den Becherboden angelagert
bleiben, damit die Molekülbrücken, welche sich ausbilden können,
entstehen; die Entwicklung der Molekülbrücken verläuft schneller
als das Ablösen oder Abreißen der Zellen. Da die Zentrifugierbeschleunigung
durchgehend bei 250 g gehalten wird, sind nach
Ablauf einer gewissen Zeit alle Molekülbrücken entstanden, die
sich ausbilden konnten, während die nicht spezifisch an den
Becherboden gebundenen roten Blutkörperchen weiterhin allmählich
abgeschleudert werden. Diese Phase III dauert relativ lange und
wird beispielsweise in der 410ten Sekunde abgebrochen.
Die hier angewandte Methode des Ablösens ist so vorsichtig,
daß die erzielten Ergebnisse außerordentlich empfindlich sind.
Dies ist besonders gut geeignet für Reaktionen, bei denen schwache
Bindungen zwischen roten Blutkörperchen und Kunststoff eine
Rolle spielen.
Das Diagramm gemäß Fig. 18 entspricht einem Zentrifugiervorgang,
der entsprechend der Entwicklung der ablaufenden Reaktionen
geregelt oder gesteuert wird. Das Verfahren wird gleichzeitig
in einem Becher ausgeführt, in welchem die Analyse der Probe
vorgenommen wird, und andererseits in einem Becher, in welchem
eine negative Kontrollreaktion ausgeführt wird; dieser Kontrollbecher
wird bei jeder Umdrehung beim Zentrifugieren mit einem
Stroboskop-Blitz beleuchtet.
Das Prinzip dieser Steuerung ist analog dem oben mit
Bezug auf den Nachweis von Antigen HBs dargelegten Prinzip.
Das vergrößerte Bild des Bodens des Bechers, in welchem die
negative Kontrollreaktion abläuft, wird mit einer Fernsehkamera
gefilmt und analysiert, beispielsweise einmal je Sekunde. Die
Oberfläche und die Opazität des Bildes des Mikrosediments, das
sich bei der negativen Kontrollreaktion bildet, werden mit der
Oberfläche und der Opazität des Mikrosedimentes einer negativen
Bezugsreaktion gleicher Art, die zuvor ausgeführt worden
ist, verglichen.
Das Diagramm der Fig. 18 entspricht einem Zentrifugierprogramm,
das angewandt wird auf eine Reaktion zum Identifizieren
von erythrozytärem oder zellulärem Antigen oder von
Antikörpern, bei welchem das mittlere Niveau der Aufhebung
der unspezifischen Bindungskräfte alleine einer Beschleunigung
von 450 g entspricht. Dieses Diagramm eines gesteuerten
Zentrifugierprogrammes kann auf ein serologisches System angewandt
werden, dessen Merkmale im voraus nicht bekannt sind, vor allem nicht
das mittlere Niveau der Aufhebung oder Auflösung der unspezifischen
Bindungskräfte.
Es sei bei diesem Verfahren eine symmetrische Antiglobulin-
Inkubation angenommen. In diesem Falle wird die Zentrifugierbeschleunigung
bis zur 15ten Sekunde bei 4 g gehalten, d. h. bei
einem zu geringen Wert als daß irgendein schnelles Absinken
und Anlagern von Blutkörperchen oder Zellen am Becherboden
erfolgen kann. Dies ist die Phase I der Antiglobulin-Inkubation,
während welcher ggf. der Becher zusätzlich bewegt wird.
In der 15ten Sekunde wird die Beschleunigung schnell auf
200 g erhöht. Von der 15ten bis zur 30sten Sekunde sinken die
Zellen oder Blutkörperchen zum Becherboden hin ab (Phase II)
und bis zur 60sten Sekunde erfolgt dann die Anlagerung der
Zellen oder Blutkörperchen an den Becherboden (Phase III),
während welcher Molekülbrücken entstehen, die sich zwischen
dem Becherboden und den Zellen oder Blutkörperchen ausbilden
können.
Am Ende der Anlagerungsphase, d. h. in der 60sten Sekunde
wird die Beschleunigung um 100 g erhöht und 30 Sekunden bei 300 g
gehalten (Phase IV). In der Sekunde 90 erfolgt eine Messung von
Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen
Kontrollreaktion und diese Messungen werden mit den Werten für
das Mikrosediment der negativen Bezugsreaktion verglichen:
liegen die Meßdaten für Oberfläche und Opazität des
Kontroll-Mikrosedimentes unterhalb der entsprechenden Daten für
das Bezugs-Mikrosediment, so bedeutet dies, daß die Beschleunigung
von 300 g nicht ausreicht, um die unspezifischen Bindungskräfte
aufzuheben bzw. zu brechen.
Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100 g
erhöht und die Beschleunigung von 400 g während 30 Sekunden
beibehalten (Phase V). In der 120sten Sekunde werden erneut
Oberfläche und Opazität des Kontroll-Mikrosediments gemessen
und die erhaltenen Meßdaten mit denjenigen des Bezugs-
Mikrosedimentes verglichen: im vorliegenden Falle, bei welchem
das mittlere Niveau zum Aufbrechen oder Aufheben der unspezifischen
Bindungskräfte bei 450 g liegt, liegen die Meßdaten
für die Oberfläche und die Opazität des Mikrosedimentes der
negativen Kontrollreaktion nach dem Zentrifugieren bei 400 g
noch unterhalb der entsprechenden Meßdaten für das Bezugs-
Mikrosediment, weil die roten Blutkörperchen der negativen
Kontrollreaktion, die durch unspezifische Bindungskräfte
an den Becher gebunden sind, nicht abgelöst bzw. abgeschleudert
werden konnten.
Die Beschleunigung wird also ein weiteres Mal um 100 g
erhöht und erreicht nun den Wert 500 g (Phase VI). Nach
30 Sekunden, d. h. in der 150sten Sekunde, wird eine weitere
Messung von Oberfläche und Opazität des Mikrosedimentes der negativen
Kontrollreaktion vorgenommen; die Meßdaten werden
mit den entsprechenden Meßdaten des Bezugs-Mikrosedimentes
verglichen. Im vorliegenden Falle ist nun das mittlere Niveau
für das Aufheben oder Aufbrechen der unspezifischen Bindungskräfte
überschritten, so daß bei der negativen Kontrollreaktion
ein Mikrosediment erhalten wird, dessen Oberfläche und Opazität
zumindest gleich sind der Oberfläche und Opazität des Bezugs-
Mikrosedimentes. Die Phase oder Stufe, in der die unspezifischen
Bindungskräfte alleine aufgehoben werden und gleichzeitig die
abgelösten oder abgeschleuderten Blutkörperchen gesammelt werden,
beginnt somit mit der 120sten Sekunde. Die Zentrifugierbeschleunigung
wird weiter bei 500 g gehalten und das Zentrifugieren
endgültig abgebrochen, wenn Oberfläche und Opazität des
Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion einer Menge an
abgeschleuderten roten Blutkörperchen entspricht, die gerade repräsentativ
ist für eine tatsächliche oder wahre negative Reaktion:
im vorliegenden Falle wird der Zentrifugiervorgang endgültig
in der 330sten Sekunde abgebrochen.
Die Unterscheidungsschwellen für eine positive Reaktion
und eine negative Reaktion werden auf die gleiche Weise
bestimmt wie vorstehend mit Bezug auf das Verfahren zum Nachweisen
von HBs-Antigen erläutert.
Macht also der Anteil an roten Blutkörperchen in einem
Mikrosediment, das eine echte negative Reaktion anzeigt, wie
in Vorversuchen ermittelt, 12% aus und beträgt die Standardabweichung
3%, so liegt die Unterscheidungsschwelle für eine
echte negative Reaktion, wie oben angegeben, bei 18% roten
Blutkörperchen, die in einem Mikrosediment zusammengefaßt sind,
während die Unterscheidungsschwelle für eine positive Reaktion
einem Anteil von 6% roten Blutkörperchen, versammelt zum Mikrosediment,
entspricht.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet schließlich
die quantitative Bestimmung eines bestimmten erythrozytären
oder zellulären Antigens oder eines bestimmten Antikörpers, der
bzw. das nachgewiesen werden soll. Die Oberfläche und/oder Opazität
des entstandenen Mikrosedimentes hängt nämlich von der Menge an
Antigen oder Antikörper ab, die in dem analysierten Medium
vorhanden ist. Es genügt somit, die gemessene Oberfläche und/oder
Opazität des in einer positiven Reaktion gebildeten Sedimentes
mit den entsprechenden Werten zu vergleichen, die für eine Reihe
von Eich-Produkten erhalten wurden oder mit einer zuvor aufgestellten
Eichkurve, um die im Medium vorhandene Menge Antigen
oder Antikörper zu erhalten.
Dieses zweite Beispiel der Anwendung des Verfahrens kann
auch analog wie beim ersten Beispiel unter den gleichen
Zentrifugierbedingungen mit Proben durchgeführt werden, in denen
erythrozytäre oder zelluläre Antigene oder Antikörper mit
unterschiedlicher Spezifität und von unterschiedlicher Beschaffenheit
nachgewiesen werden sollen.
Wie oben erklärt, hängt nämlich die Möglichkeit, daß
die roten Blutkörperchen abgeschleudert oder abgelöst werden,
nur von der Neigung des Becherbodens ab. Man wird daher für
jede Reaktionsart den Becher auswählen, der die für die in
Betracht gezogene Reaktion am besten geeignete Neigung aufweist,
mit dem Wert, daß bei einer gewählten Beschleunigung nur die
Zellen oder Teilchen abgeschleudert werden, die eine negative
Reaktion kennzeichnen.
Claims (34)
1. Verfahren zum Nachweisen und Identifizieren von viralen
oder zellulären Antigenen oder von Antikörpern in einem
biologischen Medium, unter Anwendung von immunologischen
Reaktionen zwischen Immunoglobulinen und einem Antiglobulin,
dessen Moleküle im Stande sind, sich einerseits an ein
erstes Immunoglobulin zu binden, das selbst an einer Zelle
oder ein Teilchen gebunden ist und andererseits an ein zweites
Immunoglobulin derart, daß Brücken zwischen den Zellen
und dem zweiten Immunoglobulin entstehen,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen, die ersten Immunoglobuline und das
Antiglobulin in einen Behälter einbringt, dessen Wand einen auf
der Symmetrieachse des Behälters gelegenen Konvergenzpunkt
aufweist und auf dessen Wänden die zweiten Immunoglobuline
fixiert sind, und daß man den das Reaktionsmedium enthaltenden
Behälter einer Zentrifugal-Kraft aussetzt, die im wesentlichen
parallel zu der Behälterachse gerichtet und ausreichend
stark ist, um eine dauerhafte Bindung der Zellen an die
Wand des Behälters über diese Brücken hervor zu rufen, wenn
der Test positiv ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, zum Nachweis oder Identifizieren
von viralen Antigenen, insbesondere im Blutplasma,
dadurch gekennzeichnet,
daß die ersten und zweiten Immunoglobuline Immunoglobuline
einer immunologischen Klasse X einer Tierart I, bezeichnet
als IgX, sind, wobei die ersten Immunoglobuline
eine Antikörper-Spezifität gegenüber dem viralen
Antigen aufweisen, und vorher an die
Zellen oder Teilchen fixiert worden sind; daß die
Antiglobulinmoleküle von einer Tierart II stammen, die von der
Tierart I verschieden ist, und Antikörper gegenüber dem IgX I
darstellen; daß man das zu analysierende biologische Medium
mit einer Suspension dieser Zellen oder Teilchen vor dem
Einbringen in den Behälter inkubiert; daß die Brücken während
des Zentrifugierens im Falle eines negativen oder eines
positiven Tests entstehen und daß man das Zentrifugieren
abbricht, um diese Brücken durch Reaktion der neuen Moleküle
des Antiglobulins im Falle des negativen Tests aufzubrechen
und später erneut beginnt, um die Zellen oder Teilchen, die
so von der Wand abgelöst sind, am Scheitelpunkt des Behälters
zu sammeln.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Zentrifugieren während einer
solchen Zeitspanne unterbricht, daß man im Falle einer negativen
Reaktion,
eine Absättigung der auf den
einander gegenüberliegenden Flächen von Behälterwand und Zellen
oder Teilchen gebundenen IgX-I-Moleküle durch die Anti-IgX-
I-Moleküle erhält.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Suspension von Zellen oder Teilchen
nach der Inkubation außerhalb des Behälters mit dem biologischen
Medium, das analysiert werden soll, mit einer physiologischen
Lösung wäscht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß man eine Lösung von Anti-IgX-I-
Molekülen mit einem Titer von mindestens 128 Coombs rein oder
verdünnt in einem Verhältnis von 1 : 2 oder 1 : 4 verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Suspension von Zellen
oder Teilchen, die zuvor mit dem biologischen Medium, welches
analysiert werden soll, inkubiert worden ist, und die Lösung von
Molekülen Anti-IgX I gleichzeitig in den Behälter einbringt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch
gekennzeichnet, daß man in den Behälter zunächst
die Suspension von Zellen oder Teilchen einbringt, die zuvor
mit dem biologischen Medium, welches analysiert werden soll,
inkubiert worden ist, und dann die Lösung von Molekülen Anti-IgX I.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß man vor der ersten Zentrifugierphase
die Komponenten des Reaktionsmediums, d. h. die bereits
mit der Probe inkubierte Suspension von Zellen oder Teilchen
und die Lösung von Molekülen Anti-IgX I während einer Zeitspanne
inkubiert, die höchstens gleich ist der Zeitspanne, in der 10%
der an die Zellen oder Teilchen gebundenen oder an die Behälterwand
fixierten Moleküle IgX I mit den Molekülen Anti-IgX I
reagiert haben.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
daß das Reaktionsmedium während dieser Inkubation
bewegt wird.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch
gekennzeichnet, daß man während einigen Sekunden bis zu
einigen 10 Sekunden inkubiert.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch
gekennzeichnet, daß die Beschleunigung und Dauer
der Zentrifugierstufe, d. h. erste Phase, Unterbrechung und
zweite Phase, im voraus bestimmt werden und der Beschleunigung
und Dauer entsprechen, für die unter den gleichen Bedingungen
der Reaktionspartner bei einer negativen Bezugsreaktion die
besten Ergebnisse erzielt worden sind, d. h. daß am Ende der ersten
Zentrifugierstufe oder -phase praktisch 100% Zellen oder Teilchen
an der Behälterwand haften, und daß am Ende der Unterbrechung ein
ausreichender Sättigungsgrad an Anti-IgX-I-Molekülen bei den IgX-
Molekülen erreicht wurde, die an die einander gegenüberliegenden
Flächen der Zellen oder Teilchen und der Behälterwand gebunden
sind, damit die Haftung der Zellen an der Behälterwand wieder
aufgehoben wird und ein Ablösen und Sammeln der Zellen in
der Kuppe des Behälters während der zweiten Zentrifugierphase
stattfindet.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet,
daß der Zeitpunkt des Abbruchs der zweiten
Zentrifugierphase automatisch bestimmt wird, indem das Verfahren
gleichzeitig zum einen in einem Behälter durchgeführt wird,
in welchem die Analyse der Probe vorgenommen wird, und zum
anderen in einem Behälter, in welchem eine negative Kontrollreaktion
durchgeführt wird, und wobei das Bild des Bodens
des Kontrollbehälters in regelmäßigen Intervallen während der
zweiten Zentrifugierphase aufgezeichnet und analysiert wird
und die zweite Zentrifugierphase definitiv abgebrochen wird,
wenn das Bild des Bodens des Kontrollbehälters etwa 18% Zellen
oder Teilchen versammelt in der Kuppe des Behälters entspricht.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch
gekennzeichnet, daß es zum Nachweis des viralen
Antigens HBs in einer Humanblutprobe angewandt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Analyse in einem Behälter vornimmt, dessen
Boden konisch ist und einen Winkel am Scheitelpunkt bzw. an
der Kuppe von 120° aufweist, daß man die erste Zentrifugierphase
mit einer Bechleunigung von 200 g durchführt von der 15.
bis zur 60. Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediums
in den Behälter, das aus der zuvor mit der zu analysierenden
Probe inkubierten Suspension von Zellen oder Teilchen und der
Lösung der Anti-IgX-I-Moleküle besteht, und daß man das Zentrifugieren
von der 60. bis zur 300. Sekunde nach dem Einbringen des Reaktionsmediums
in den Behälter unterbricht und daß man beim zweiten
Zentrifugieren mit einer Beschleunigung von 500 g während 40 Sekunden
arbeitet.
15. Verfahren nach Anspruch 1, zum Nachweis oder zur
Bestimmung von zellulären Antigenen (oder antizellulären
Antikörpern) im Blut,
dadurch gekennzeichnet,
daß die ersten und zweiten Immunoglobuline Immunoglobuline der immunologischen Klasse X sind und von der gleichen Tierart I stammen, wie die für das zu bestimmende Antigen (oder der zu bestimmende Antikörper) spezifischen Antikörper bezeichnet als IgX; daß die Antiglobuline von einer Tierart II stammen, die von der Tierart I verschieden ist, und Antikörper, gegenüber dem IgX I darstellen;
daß eine Bindung zwischen den ersten Immunoglobulinen und den Zellen entsteht durch Inkubieren einer Suspension von Blutkörperchen des zu untersuchenden Bluts mit einem Testserum bzw. einer Suspension von Testblutkörperchen mit dem Plasma des zu untersuchenden Blutes außerhalb des Behälters und
daß sich während des Zentrifugierens die Blutkörperchem am Scheitel des Behälters ansammeln, wenn der Test negativ ist.
daß die ersten und zweiten Immunoglobuline Immunoglobuline der immunologischen Klasse X sind und von der gleichen Tierart I stammen, wie die für das zu bestimmende Antigen (oder der zu bestimmende Antikörper) spezifischen Antikörper bezeichnet als IgX; daß die Antiglobuline von einer Tierart II stammen, die von der Tierart I verschieden ist, und Antikörper, gegenüber dem IgX I darstellen;
daß eine Bindung zwischen den ersten Immunoglobulinen und den Zellen entsteht durch Inkubieren einer Suspension von Blutkörperchen des zu untersuchenden Bluts mit einem Testserum bzw. einer Suspension von Testblutkörperchen mit dem Plasma des zu untersuchenden Blutes außerhalb des Behälters und
daß sich während des Zentrifugierens die Blutkörperchem am Scheitel des Behälters ansammeln, wenn der Test negativ ist.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
daß die Suspension von Blutkörperchen, die
analysiert werden soll (oder die Suspension der Test-Blutkörperchen),
nachdem sie außerhalb des Behälters mit einem Testserum
(oder mit dem Plasma des Blutes, das analysiert werden soll)
inkubiert worden ist, mit einer physiologischen Lösung gewaschen
wird.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine Lösung von Molekülen
Anti-IgX I verwendet, die einen Titer von mindestens 128 gemäß
Coombs aufweist, und zwar rein oder verdünnt in einem Verdünnungsverhältnis
von 1 : 2 oder 1 : 4.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, daß man die beiden Komponenten
des Reaktionsmediums, d. h. die Suspension von Blutkörperchen
und die Lösung der Anti-IgX-I-Moleküle getrennt voneinander
und gleichzeitig in den Behälter einbringt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, daß man zunächst die zuvor inkubierte
Suspension der Blutkörperchen und danach die Lösung der Anti-IgX-I-
Moleküle in den Behälter einbringt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch
gekennzeichnet, daß man vor dem Zentrifugieren im
Behälter die beiden Komponenten des Reaktionsmediums, d. h. die
zuvor inkubierte Suspension von Blutkörperchen und die Lösung
der Anti-IgX-I-Moleküle, während einer Zeitspanne inkubiert, die
höchstens gleich ist der Zeitspanne, bei der 10% der an die
Blutkörperchen oder an die Behälterwand gebundenen IgX-I-Moleküle
mit den Anti-IgX-Molekülen reagiert haben.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Reaktionsmedium während dieser
Inkubation bewegt.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, dadurch
gekennzeichnet, daß man während einiger Sekunden bis
zu einigen 10 Sekunden inkubiert.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Reaktionsgemisch
erst in den Behälter zum Zentrifugieren einbringt,
nachdem die Suspension von Blutkörperchen außerhalb des
Behälters mit der Lösung von Anti-IgX-I-Molekülen inkubiert
worden ist, und daß man unmittelbar nach dem Einbringen des
Reaktionsgemisches in den Behälter zentrifugiert.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Suspension von Blutkörperchen
und die Lösung von Anti-IgX-I-Molekülen etwa 20 Minuten inkubiert.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24,
dadurch gekennzeichnet, daß man bei zwei
unterschiedlichen Beschleunigungen zentrifugiert, und zwar bei einer
ersten Beschleunigung, bei der alle Blutkörperchen an die
Behälterwand angelagert werden und bei einer zweiten, höheren
Beschleunigung, bei welcher nur die Blutkörperchen, die nicht an
der Wand des Behälters haften bleiben können, in der Kuppe des
Behälters gesammelt werden.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch
gekennzeichnet, daß man so zentrifugiert, daß
man eine einzige Beschleunigung erreicht, die geeignet ist,
zumindest momentan alle Blutkörperchen an die Wand des Behälters
anzulagern und außerdem so, daß unter diesen Blutkörperchen
nur diejenigen, sofern vorhanden, die nicht an der Wand des
Behälterbodens haften können, langsam und zunehmend von dieser
Wand abgelöst bzw. abgeschleudert und in der Kuppe des Behälters
gesammelt werden.
27. Verfahren nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet,
daß man zur automatischen Bestimmung des
endgültigen Abbruchs des Zentrifugierens das Verfahren gleichzeitig
und unter gleichen Bedingungen einerseits in einem
Behälter durchführt, in welchem die Analysereaktion der zu
untersuchenden Probe vorgenommen wird, und andererseits in einem
Behälter, in welchem eine zur Kontrolle dienende negative Reaktion
vorgenommen wird, daß man das bei der Kontrollreaktion sich
bildende Mikrosediment in regelmäßigen Intervallen aufzeichnet
und analysiert und das Zentrifugieren endgültig abbricht, wenn
die Analyse des Mikrosediments der Kontrollreaktion anzeigt,
daß etwa 18% Blutkörperchen in der Kuppe des Behälters
gesammelt sind.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 24, dadurch
gekennzeichnet, daß man das Zentrifugieren im
Hinblick auf die im Gang befindlichen Reaktionen steuert oder
regelt, das Verfahren gleichzeitig und unter den gleichen
Bedingungen einerseits in einem Behälter durchführt, in welchem
die Analyse der Probe vorgenommen wird, und andererseits in einem
Behälter, in welchem eine negative Kontrollreaktion ausgeführt
wird, daß man in regelmäßigen Intervallen das Bild des
Mikrosedimentes, das sich bei der negativen Kontrollreaktion bildet,
aufzeichnet und analysiert, daß man die Wachstumskurve für dieses
Mikrosediment und für das Mikrosediment einer negativen Bezugsreaktion
miteinander vergleicht und daß man Zeit und Geschwindigkeit
beim Zentrifugieren so steuert, daß die Wachstumskurve
des analysierten Mikrosedimentes der Wachstumskurve
der Bezugsreaktion entspricht.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet,
daß man das Zentrifugieren definitiv abbricht,
wenn die Analyse des Mikrosedimentes der negativen Kontrollreaktion
anzeigt, daß in der Kuppe des Behälterbodens etwa 18% Blutkörperchen
gesammelt sind.
30. Verfahren nach Anspruch 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Analysereaktion in einem Behälter mit konischem Boden
und einem Scheitelwinkel von 120° durchführt, nachdem die
Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX I zur Inkubation
gebracht worden ist, daß man den Behälter der das Reaktionsgemisch
enthält, um eine Achse dreht, die senkrecht gerichtet ist
zur Konusachse, bei einer geringeren Beschleunigung als derjenigen,
bei der die Blutkörperchen, welche eine negative Reaktion
kennzeichnen, von der Wand des Behälterbodens abgeschleudert werden,
daß man diese Beschleunigung 45 Sekunden beibehält, daß man
anschließend gleichmäßig die Zentrifugierbeschleunigung alle
30 Sekunden um einen Wert von 100 g erhöht, daß man am Ende jeder dieser
Zeitspannen von 30 Sekunden das in der negativen Kontrollreaktion
gebildete Mikrosediment analysiert, bis die Analyse einen
Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters
versammelt sind, entspricht, der zumindest gleich ist dem Prozentsatz,
wie er für die negative Bezugsreaktion erreicht worden ist.
31. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet,
daß man beim Ausführen der Analysereaktion
in einem Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel
von 120°, nachdem die Suspension von Blutkörperchen mit der Lösung
der Anti-IgX-I-Moleküle zum Inkubieren gebracht worden ist,
zentrifugiert, indem man den Behälter um eine Achse dreht, die
senkrecht gerichtet ist zur Achse des konischen Behälterbodens,
mit einer Beschleunigung von 200 g, die während 45 Sekunden beibehalten
wird, und daß man anschließend die Zentrifugierbeschleunigung
schnell bis auf 1600 g erhöht und das Zentrifugieren endgültig
abbricht, nachdem der Zeitpunkt erreicht ist, bei welchem für eine
unter gleichen Bedingungen durchgeführte negative Kontrollreaktion
der Prozentsatz an Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters
gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz, welcher die
Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.
32. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet,
daß man beim Ausführen der Analyse in einem
Behälter mit konischem Boden und einem Scheitelwinkel von 120°,
nachdem die Blutkörperchensuspension mit der Lösung der Anti-IgX-I-
Moleküle inkubiert worden ist, zentrifugiert, indem man den
Behälter um eine Achse dreht, die senkrecht läuft zur Achse
des konischen Behälterbodens, mit einer Beschleunigung von 250 g
und daß man das Zentrifugieren abbricht, nachdem der Zeitpunkt
erreicht worden ist, bei welchem für eine unter gleichen
Bedingungen durchgeführte negative Kontrollreaktion der Prozentsatz
an roten Blutkörperchen, die in der Kuppe des Behälters
gesammelt sind, zumindest gleich ist dem Prozentsatz, welcher
die Schwelle zur Unterscheidung einer negativen Reaktion definiert.
33. Satz von Behältern mit konischen Boden zur Durchführung
von Reaktionen der Immuno-Haftung nach Anspruch 1, in denen
virale Antigene oder zelluläre Antigene oder Antikörper
unterschiedlicher Spezifität und unterschiedlicher Beschaffenheit
nachgewiesen werden sollen, dadurch gekennzeichnet,
daß dieser Satz so viel verschiedene Gruppen
von Behältern umfaßt, wie unterschiedliche Typen oder Arten
von Antigenen oder Antikörpern nachgewiesen werden sollen,
wobei die Behälter jeder Gruppe einen anderen Scheitelwinkel
des konischen Bodens aufweisen als die Behälter jeder der
anderen Gruppen.
34. Satz von Behältern nach Anspruch 33, dadurch
gekennzeichnet, daß er aus einer oder mehreren
Gruppen von Behältern besteht, deren Scheitelwinkel im Konus
der Behälter dieser verschiedenen Gruppen einen der folgenden
Werte aufweist: 80, 90, 100, 110, 120, 130 und 140.
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