DE69019326T2

DE69019326T2 - Reaktionskit.

Info

Publication number: DE69019326T2
Application number: DE1990619326
Authority: DE
Inventors: Tokio Kano; Toshinobu Niimura; Hiroyuki Yonekawa
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1989-12-28
Filing date: 1990-12-24
Publication date: 1995-11-09
Anticipated expiration: 2010-12-25
Also published as: EP0435245A3; EP0435245A2; JPH04208836A; DE69019326D1; EP0435245B1

Description

Diese Erfindung betrifft ein Reaktionskit zum Ausführen von Agglutinationsreaktionen und insbesondere ein Reaktionskit, das für eine Hämanalyse verwendet wird, welche immunologische Antigen-Antikörper-Reaktionen einschließt.
Herkömmliche Reaktionsgefäße, welche für Erfassungen verwendet wurden, indem immunologische Agglutinationsreaktionen verwendet wurden, sind beispielsweise von dem Typ, welcher in der US-A-4,303,616 offenbart ist. Diese Reaktionsgefäße werden gewöhnlich mit dem generischen Namen Mikroplatten bezeichnet.
Ein Erfassungsverfahren, welches diese Art von Reaktionsgefäß verwendet, ist das Partikelagglutinationsverfahren, wodurch Antigene oder Antikörper in der Probe aufgrund einer immunologischen Agglutinationsreaktion erfaßt werden. In diesem Verfahren wird ein spezifischer Markerpartikel verwendet und Antigene oder Antikörper, welche spezifisch mit der Substanz, die gemessen wird, konjugieren, werden auf der Oberfläche des Partikels beschichtet. Um beispielsweise Viren im Blut zu erfassen, wird ein vom Menschen erzeugter Markerpartikel, auf welchem die Antikörper gegen den Virus beschichtet sind, verwendet. Das Verfahren wird durchgeführt, indem das Reaktionsgefäß wie folgt verwendet wird. Zuerst werden die Markerpartikel in dem Reaktionsgefäß mit der Probe gemischt, es findet eine immunologische Reaktion mit den Antigenen oder Antikörpern in der Probe statt, und die Markerpartikel sammeln sich auf einer der Wände (beispielsweise dem Boden) des Reaktionsgefäßes. Die Partikel, welche sich auf der Wand des Gefäßes gesammelt haben, haben jedoch ein unterschiedliches Verteilungsmuster, abhängig davon, ob eine immunologische Reaktion mit der Substanz, welche in der Probe gemessen wurde, auftrat oder nicht. Es ist daher möglich, aus dem Verteilungsmuster von Markerpartikeln auf der Wand des Gefäßes eine positive oder negative Reaktion für die Substanz zu bestimmen.
Ein anderes Verfahren, das gemischte Agglutinationsverfahren, wurde von A.S. Wiener und M.H. Herman berichtet. Dieses Verfahren wurde anschließend in Stufen verbessert, so daß es sogar Blutgruppen bestimmen konnte. Um Blutgruppen zu bestimmen, wird unter Verwendung des Reaktionsgefäßes beispielsweise das folgende Verfahren durchgeführt. Zuerst werden geeignete Mengen einer festgelegten Konzentration roter Blutzellen und einer festgelegten Verdünnung von Serum in dem Reaktionsgefäß gemischt und es wird ihnen erlaubt, eine gewisse Zeit lang zu stehen. Wie in dem oben beschriebenen Verfahren ist das Verteilungsmuster von sedimentierten roten Blutzellen unterschiedlich, abhängig davon ob eine immunologische Reaktion zwischen Antigenen auf den roten Blutzellen und Antikörpern in dem Serum vorlag oder nicht. Es ist daher möglich, aus dem Verteilungsmuster von sedimentierten roten Blutzellen eine positive oder negative Reaktion zu bestimmen.
Das Verteilungsmuster, welches durch diese Verfahren erhalten wird, kann leicht mit dem bloßen Auge beobachtet werden, aber es kann ebenfalls automatisch durch die Verfahren analysiert werden, die in der JP-A 54-78499 offenbart sind. Weiterhin wird in der JP-U 61-39321 ein Verfahren offenbart, wodurch ein Partikelagglutinationsmuster auf einer optisch flachen Fokusebene gebildet wird und das Agglutinationsbild leicht beobachtet wird.
In dem Reaktionsgefäß, welches in der US-A 4,303,616 beschrieben ist, werden jedoch mindestens ca. 50 ul Flüssigkeit benötigt, um ein stabiles und genaues Verteilungsmuster zu bilden. Wenn die Menge an Flüssigkeit weniger als 50 ul beträgt, wird die Sedimentation der Partikel gestört und aufgrund der Oberflächenspannung unregelmäßig und das Verteilungsmuster bildet sich nicht richtig. Aus diesem Grund ist eine Tiefe der Reaktionslösung in diesem Reaktionsgefäß von nicht weniger als 3 mm nötig. Darüber hinaus benötigt aus diesem Grund das Verteilungsmuster eine lange Zeit, um sich zu bilden. In anderen Worten müssen sich die Partikel, wie z.B. rote Blutzellen, die das Verteilungsmuster bilden, über eine beträchtliche Entfernung bewegen, und als ein Ergebnis ist die Zeit, welche benötigt wird um das Muster zu bilden, lang.
Das obige Problem, nämlich daß das Verteilungsmuster nicht richtig gebildet wird, wenn die Menge der Flüssigkeit zu klein ist, kann in einem gewissen Ausmaß dadurch überwunden werden, indem der innere Durchmesser des Reaktionsgefäßes kleiner gemacht wird. In diesem Fall kommt jedoch die Oberflächenspannung zwischen der Reaktionslösung und den Wänden des Reaktionsgefäßes ins Spiel und wiederum sinkt oder hebt sich die Flüssigkeitsoberfläche unregelmäßig. Das Ergebnis ist, daß es schwierig wird, das Verteilungsmuster, welches genau gebildet wurde, zu beobachten.
Wenn weiterhin der innere Durchmesser des Gefäßes kleiner gemacht wird, so daß die Flüssigkeitsmenge kleiner wird, ist die Zeit, welche zur Bildung des Verteilungsmusters benötigt wird, kürzer, aber dann entsteht das Problem, daß es nötig ist, sehr kleine Reagensmengen zu handhaben. Insbesondere wenn die Flüssigkeitsmenge nicht größer als 5 ul ist, wird es technisch extrem schwierig, Reagenzien genau mit einer hohen Reproduzierbarkeit zu pipettieren.
Weiterhin wird eine sehr feine Oberflächenbearbeitung benötigt, um Gefäße mit kleinem inneren Durchmesser, beispielsweise Vertiefungen mit einem Durchmesser in der Größenordnung von einigen hundert Mikrometern, genau zu fertigen und es ist ebenfalls schwierig, diese effizient zu fertigen.
Das Verfahren, welches in der JP-U 61-39321 beschrieben ist, ist auf der anderen Seite ein Strömungsmeßverfahren, welches eine Walzenpumpe verwendet, um eine Partikelsuspension in das Reaktionsgefäß einzuführen. Die Anzahl an Proben oder Posten, welche gleichzeitig durch ein solches Strömungsverfahren gemessen werden kann, ist jedoch beschränkt und es ist unmöglich, gleichzeitig viele Proben über mehrere Posten zu handhaben, wie in dem Verfahren, in welchem eine herkömmliche Mikroplatte verwendet wird. Weiterhin gibt es einen großen Fehler beim Einführen von gemessenen Mengen einer Probe durch eine Walzenpumpe und das Verfahren ist nicht für die Analyse von sehr kleinen Probenmengen in der Größenordnung von um geeignet.
Die US-A-4 596 695 offenbart eine Reaktionskammer, in welcher eine untere Platte (panel), eine obere Platte und Abstandhalter eine Reaktionszone bilden. In diesem Zitat wird eine Probe in die Reaktionszone eingeführt, indem eine Kapillarwirkung für die Reaktion mit einem Reagens verwendet wird, gefolgt durch Beobachten der Gegenwart einer Agglutination für die benötigte Messung. Diese Reaktionskammer hat kein Mittel zum Neigen der Reaktionszone.
Diese Erfindung zielt darauf ab ein Reaktionskit für Agglutinationsreaktionen zur Verfügung zu stellen, wobei ein genaues Verteilungsmuster von sedimentierten Partikeln in einer kurzen Zeit gebildet wird und das erhaltene Verteilungsmuster genau beobachtet werden kann.
Diese Ziele werden durch ein Kit, wie es in Anspruch 1 beansprucht ist und ein Verfahren, wie es in Anspruch 5 beansprucht ist, erreicht, wobei das Kit ein Reaktionsgefäß, welches eine Reaktionszone, die geeignet ist die Probe durch Kapillarität in das Innere des Reaktionsgefäßes zu saugen, und eine transparente Platte mit einer flachen Oberfläche in wenigstens einem Teil der Reaktionszone aufweist, und eine das Reaktionsgefäß tragende Basis, um das Gefäß in einem bestimmten Winkel zu neigen, umfaßt.
Die Reaktionszone ist im allgemeinen ein Raum, welcher durch 2 transparente Platten mit flachen Oberflächen und 2 Abstandhalter gebildet wird, welche zwischen diese 2 Platten in einem bestimmten Abstand voneinander eingeführt werden.
Die das Reaktionsgefäß tragende Basis neigt das Reaktionsgefäß in einem bestimmten Winkel und behält den Winkel bei. Das Gefäß ist so auf der Basis montiert, daß eine der Seiten, in welche ein Abstandhalter eingeführt wurde, in der unteren Stellung ist.
Bei dem Reaktionsgefäß dieser Erfindung wird die Probe von der Öffnung der Reaktionszone mittels Kapillarität in das Reaktionsgefäß eingeführt. Die Querschnittsfläche der Reaktionszone ist daher geeignet, um die Probe durch Kapillarität in das Innere des Gefäßes zu saugen. Diese Querschnittsfläche ändert sich gemäß der Probe, welche beobachtet wird, aber wenn die Probe aus Blutbestandteilen besteht, beträgt sie vorzugsweise 0,2 - 5 mm².
Diese Erfindung kann vollständiger aus der folgenden detaillierten Beschreibung verstanden werden, wenn sie im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen gesehen wird, in welchen:
Fig. 1A eine perspektivische Ansicht ist, welche eine Ausführungsform des Reaktionsgefäßkits gemäß dieser Erfindung zeigt;
Fig. 1B eine Draufsicht ist, welche aus der Richtung X1 des Reaktionsgefäßes des in Fig. 1A gezeigten Kits gesehen wird;
Fig. 1C eine Querschnittsansicht des Reaktionsgefäßes ist, welches in Fig. 1B gezeigt ist;
Fig. 2A ein Sedimentations-Partikelverteilungsmuster zeigt, welches erhalten wurde, wenn in einem Agglutinationstest, welcher unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits, das in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, durchgeführt wurde, eine Agglutinationsreaktion auftrat;
Fig. 2B ein Sedimentations-Partikelverteilungsmuster zeigt, welches erhalten wurde, wenn in einem Agglutinationstest, welcher unter Verwendung des Reaktionsgefäßes, das in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, durchgeführt wurde, keine Agglutinationsreaktion auftrat;
Fig. 3A eine perspektivische Ansicht einer Modifikation mit einer unterschiedlichen Gestalt der Abstandhalter ist;
Fig. 3B eine Draufsicht des Reaktionsgefäßes des Kits ist, welches in Fig. 3A gezeigt ist;
Fig. 4A eine perspektivische Ansicht einer anderen Modifikation mit einer unterschiedlichen Gestalt der Abstandhalter ist;
Fig. 4B eine Draufsicht des Reaktionsgefäßes des Kits ist, welches in Fig. 4A gezeigt ist;
Fig. 5A eine perspektivische Ansicht einer Modifikation ist, wobei das Reaktionsgefäß einstückig mit der tragenden Basis gebildet ist;
Fig. 5B eine Draufsicht des Kits ist, welches in Fig. 5A gezeigt ist;
Fig. 6A eine perspektivische Ansicht ist, welche eine andere Modifikation zeigt, wobei das Reaktionsgefäß einstückig mit der tragenden Basis gebildet ist;
Fig. 6B eine Draufsicht ist, welche aus der Richtung Y2 des Kits gesehen wird, welches in Fig. 6A gezeigt ist;
Fig. 6C eine Draufsicht ist, welche aus der Richtung X2 des Kits gesehen wird, welches in Fig. 6A gezeigt ist;
Fig. 7A ein Sedimentations-Partikelverteilungsmuster zeigt, welches erhalten wurde, wenn in einem Agglutinationstest, welcher unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits, welches in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, wobei Antikörper in der Reaktionszone beschichtet wurden, durchgeführt wurde, eine Agglutinationsreaktion auftrat;
Fig. 7B ein Sedimentations-Partikelverteilungsmuster zeigt, welches erhalten wurde, wenn in einem Agglutinationstest, welcher unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits, welches in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, wobei Antikörper in der Reaktionszone beschichtet wurden, durchgeführt wurde, keine Agglutinationsreaktion auftrat;
Fig. 8 eine Ansicht ist, welche ein Verfahren in einem Agglutinationstest unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits, welches in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, zeigt; und
Fig. 9 eine Ansicht ist, welche ein anderes Verfahren in einem Agglutinationstest unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits, welches in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, zeigt.
Wie oben beschrieben ist bei dem Reaktionsgefäßkit gemäß dieser Erfindung die Reaktionszone des Gefäßes durch zwei Platten und Abstandhalter umschlossen, welche diese Platten in einem kleinen Abstand auseinander halten. Es wird ebenfalls, um die Reaktion durchzuführen, die Probe in die Reaktionszone gefüllt. Die Flüssigkeitsoberfläche der Probe in der Reaktionszone ist daher konstant in Kontakt mit der inneren Wand der Zone und wird flach gehalten. Aus diesem Grund gibt es keine Störung des Partikelverteilungsmusters. Zusätzlich ist die Querschnittsfläche der Reaktionszone so, daß die Probe durch Kapillarität in die Zone eingeführt werden kann und sie ist extrem klein. Aus diesem Grund ist die Entfernung, über welche sich die sedimentierten Partikel bewegen, viel kürzer, und das Verteilungsmuster kann in einer kurzen Zeit gebildet werden.
Weiterhin wird die Probe mittels Kapillarität eingeführt und kann beispielsweise in die Öffnung der Reaktionszone getropft werden. Die Menge der Probenlösung in der Reaktionszone ist immer konstant, unabhängig von der eingetropften Menge, und es ist daher nicht besonders wichtig, kleine Mengen genau zu pipettieren.
Wir werden nun einige Ausführungsformen des Reaktionsgefäßkits gemäß dieser Erfindung mit Bezug auf die Zeichnungen beschreiben.
Fig. 1A ist eine perspektivische Ansicht des Reaktionsgefäßkits dieser Erfindung; Fig. lb ist eine Draufsicht, gesehen aus der Richtung X1 des Reaktionsgefäßes, welches in Fig. 1A gezeigt ist; und Fig. 1C ist eine Querschnittsansicht des Reaktionsgefäßes, welches in Fig. 1B gezeigt ist. Wie in diesen Figuren gezeigt ist, sind in dem Reaktionsgefäß dieses Kits die untere Platte 2 und die obere Platte 4, welche aus transparenten Elementen bestehen, im wesentlichen parallel auf beiden Seiten der zwei Abstandhalter 3 angeordnet. Der Teil 5, welcher durch die untere Platte 2, die obere Platte 4 und die zwei Abstandhalter umschlossen ist, ist die Reaktionszone, wo Agglutinationsreaktionen durchgeführt werden, und er ist ebenfalls ein Probeneinlaßkanal zum Einführen der Probe. Die zwei Seiten, wo die Abstandhalter 3 nicht eingeführt sind, bilden eine Probeneinlaßpforte 12, durch welche die Probe eingespritzt oder abgesaugt wird. Der Reaktionsgefäßträger 1 ist mit einer in einem bestimmten Winkel, bezogen auf die Horizontale, geneigten Oberfläche versehen. Das Reaktionsgefäß ist auf der geneigten Oberfläche dieser Trägerbasis angebracht.
Bei dem Reaktionsgefäß dieses Kits ist es wünschenswert, daß die Dicke der Abstandhalter 3, d.h. die Entfernung zwischen der unteren Platte 2 und der oberen Platte 4, 0,05 - 1,0 mm beträgt und daß die Entfernung zwischen den zwei Abstandhaltern 3 0,1 - 1,0 mm beträgt. Weiterhin ist es wünschenswert, daß die Länge der langen Richtung der Reaktionszone 5, d.h. die Breite der oberen Platte 4, 3 - 10 mm beträgt. Darüber hinaus ist es wünschenswert, daß die Steigung der geneigten Oberfläche der das Reaktionsgefäß tragenden Basis 1 bezogen auf die Horizontale 10 - 60º beträgt.
Dieses Reaktionsgefäßkit kann in Tests verwendet werden, um das Auftreten oder Nichtauftreten von Agglutinationsreaktionen zu verifizieren. In dem Fall, wo z.B. dieses Kit verwendet wird, um das Auftreten einer Reaktion zwischen Blutkörperchen und Antikörpern im Serum zu erfassen, wird das folgende Verfahren durchgeführt.
Zuerst wird eine festgelegte Konzentration einer Blutkörperchensuspension mit einer festgelegten Verdünnung des Serums in einem Teströhrchen gemischt. Die Mischung wird dann mit einer Pipette angesaugt und eine geeignete Menge wird in die Probeneinlaßpforte 12 des Reaktionsgefäßes getropft. Die getropfte Mischung verteilt sich durch Kapillarität über die ganze Reaktionszone 5 hinweg. Dem Reaktionsgefäß wird erlaubt, eine gewisse Zeit lang ungestört zu stehen und Blutkörperchen setzen sich ab. Da das Reaktionsgefäß geneigt ist, bewegen sich die sedimentierten Körperchen entlang der geneigten unteren Platte 2 nach unten, ohne sich auf der unteren Platte 2 zu sammeln. Aus dem Verteilungsmuster der Blutkörperchen, welches sich in dem unteren Teil der Reaktionszone gebildet hat, ist es dann möglich, das Auftreten oder Nichtauftreten einer Reaktion zu verifizieren. Wenn die Körperchen aufgrund einer Antigen-Antikörper-Reaktion agglutinierten, wird ein Positives Muster 10 gebildet, wobei die Körperchen gleichmäßig auf dem oberen Teil der geneigten unteren Platte 2 verteilt sind, wie in Fig. 2A gezeigt ist. Wenn auf der anderen Seite keine Reaktion auftrat und die Körperchen nicht agglutinierten, (bewegen sich) alle Körperchen entlang der geneigten unteren Platte 2 nach unten und ein negatives Muster 11 wird gebildet, wobei die Körperchen auf einer Linie an dem untersten Teil des Gefäßes versammelt sind, wie in Fig. 2B gezeigt ist.
Bei dem Reaktionsgefäß des Kits, welches in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, sind die Abstandhalter 3 rechtwinklig. Die Abstandhalter müssen jedoch nicht rechtwinklig sein und können ebenfalls in der Form der Abstandhalter 6 und 7 sein, welche in den Fign. 3A - 4B gezeigt sind. Durch Verwendung von 10 Abstandhaltern einer solchen Form wird die Probeneinlaßpforte vergrößert und die Einführung von Aliquot-Probenteilen ist leichter.
Bei dem Reaktionsgefäßkit dieser Erfindung können das Gefäß und seine Trägerbasis einstückig geformt sein. Die Fign. 5A und 5B zeigen eine integriertes Reaktionsgefäß dieses Typs. Wie in diesen Figuren gezeigt ist, wird eine röhrenförmige Reaktionszone 5 mit einer solchen Querschnittsfläche, daß ein Ansaugen der Probe durch Kapillarität erlaubt wird, auf der geneigten Oberfläche des integrierten Reaktionsgefäßes 8 zur Verfügung gestellt, und vertiefte Flüssigkeitsmulden 9 werden an beiden Rändern der Reaktionszone 5 zur Verfügung gestellt.
Das integrierte Reaktionsgefäß kann ebenfalls in einer Stabform geformt sein. Bei dem rechtwinkligen stabförmigen Reaktionsgefäß 27, welches in den Fign. 6A - 6C gezeigt ist, werden eine Reaktionszone 32, welche ein durchgehendes Loch mit einem bestimmten Winkel bezogen auf die Horizontale ist, und ein Hohlraum 29, welcher mit dieser Reaktionszone 32 verbunden ist, zur Verfügung gestellt. Die Reaktionszone 32 hat eine solche Querschnittsfläche, daß die Probe durch Kapillarität angesaugt werden kann. In dem Fall, wo dieses stabförmige Reaktionsgefäß 27 in Agglutinations-Reaktionstests verwendet wird, wird das folgende Verfahren durchgeführt. Zuerst wird das Ende 30 des stabförmigen Reaktionsgefäßes 27 in eine vorher vorbereitete Partikelsuspension getaucht, und die Partikelsuspension wird dadurch aus der Probeneinlaßpforte 28 mittels Kapillarität in die Reaktionszone 32 eingeführt. Nachdem die Suspension in die Reaktionszone eingeführt wurde, wird das Reaktionsgefäß 27 aus der Suspension entfernt und horizontal gelegt, um der Reaktion zu erlauben, ungestört für 10 Minuten fortzuschreiten. Nach der Reaktion ist es durch Beobachten des Partikelverteilungsmusters, welches sich in der Reaktionszone 32 gebildet hat, möglich, zu bestimmen, ob es eine Agglutinationsreaktion gab oder nicht. In diesem stabförmigen Reaktionsgefäß 27 ist die Reaktionszone 32 mit dem Hohlraum 29 verbunden und der Hohlraum 29 ist über eine Öffnung 31 mit der Außenseite verbunden, so daß kein unnötiger Druck auf die Reaktionszone 32 wirkt. Weiterhin kann, indem ein negativer Druck von der Öffnung 31 aus angewendet wird, Proben- oder Waschlösung mit Kraft angesaugt werden. Die Reaktionszone 32 kann ebenfalls gewaschen werden, indem eine Waschlösung von der Öffnung 31 eingeführt wird, oder einfach durch Anwenden eines positiven Druckes auf die Öffnung 31.
Wir werden nun einige Agglutinationstests beschreiben, welche das Reaktionsgefäßkit gemäß dieser Erfindung verwenden.

Beispiel 1

Bestimmung der menschlichen Blutgruppen ABO

Wir werden die Bestimmung der menschlichen Blutgruppen ABO unter Verwendung des Reaktionsgefäßes aus den Fign. 1A - 1C mit Bezug auf Fig. 8 beschreiben.
Zuerst wird eine Blutprobe, welche in einem Teströhrchen 13 enthalten ist, durch Zentrifugation oder ein anderes geeignetes Verfahren in einen Blutkörperchen-Bestandteil 15 und einen Blutserum-Bestandteil 14 getrennt. Wenn das Blut mit einem Antikoagulans, wie z.B. Heparin, behandelt wurde, wird der Blutserum-Bestandteil 14 Plasma sein. Als nächstes werden 2 ul des Blutkörperchen-Bestandteils 15 und 18 ul einer vorher vorbereiteten Lösung 17, in einem Behälter 16, in einem Teströhrchen 19 gemischt und zusammen vorreagiert. Diese Lösung 17 besteht aus einer anti-A-Serumverdünnung, welche durch Verdünnen von Standard-anti-A-Serum (Orso Co.) mit physiologischer Salzlösung auf 1/30 hergestellt wurde. Nach der Vorreaktion werden 5 ul einer Blutkörperchensuspension 18 mittels einer Pipette 20 in die Reaktionszone 5 des Reaktionsgefäßes 21 pipettiert. Unter Verwendung eines Reaktionsgefäßes, wobei der Abstand zwischen der unteren Platte 2 und der oberen Platte 4 80 um beträgt, der Abstand zwischen den zwei Abstandhaltern 3 500 um beträgt und die Länge der langen Richtung der Reaktionszone 5 250 um beträgt, und einer Trägerbasis, wobei die Steigung der geneigten Oberfläche 450 beträgt, setzen sich alle menschlichen roten Blutzellen in ca. 10 Minuten in dem unteren Teil der Reaktionszone ab. Nach dem Pipettieren der Blutkörperchensuspension 18 wird daher das Reaktionsgefäß auf die Trägerbasis 1 gestellt, und die Basis wird für ca. 10 Minuten bei 36ºC in einem Inkubator gelassen.
Der Abstand zwischen der unteren und der oberen Platte des Reaktionsgefäßes und der Abstand zwischen den zwei Abstand-
haltern hängen eng mit der Zeit zusammen, welche benötigt wird, um die Partikel zu sedimentieren, und insbesondere sollten sie beide klein sein, um die Sedimentation der Partikel in einer kurzen Zeit abzuschließen. Wenn jedoch der abstand zwischen den zwei Abstandhaltern zu klein ist, wird die Fläche, wo das Partikelverteilungsmuster gebildet wird, kleiner, und daher wächst der Meßfehler. Es ist darüber hinaus nötig, daß die Länge der langen Richtung der Reaktionszone so ist, daß kleine Probenmengen während der Reaktion nicht austrocknen, und so ist, daß sich die Probe durch Kapillarität über die gesamte Reaktionszone hinweg verteilen kann.
Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird das Reaktionsgefäß 21 in den Meßbereich übertragen. Der Meßbereich umfaßt eine Lichtquelle 23 und ein optisches Mikroskopsystem 25, um das Blutkörperchen-Verteilungsmuster vergrößert zu beobachten, und er weist ebenfalls einen Photosensor 26 auf, um die vergrößerte Blutkörperchen-Verteilung in der Reaktionszone abzubilden. Das Auftreten oder Nichtauftreten einer Antigen-Antikörper-Reaktion wird durch Vergrößern der Reaktionszone 5 des Reaktionsgefäßes 21 mittels des optischen Systems 25 und Beobachten des Blutkörperchen-Verteilungsmusters bestimmt. Wahlweise kann, anstelle das Muster mit dem bloßen Auge zu beobachten, das durch den Photosensor 26 erhaltene Bild durch einen Computer analysiert werden, um das Auftreten oder Nichtauftreten der Reaktion zu bestimmen.
Wenn die beobachtete Blutkörperchenverteilung ein Muster des Typs aufweist, welcher in Fig. 2A gezeigt ist, zeigt das, daß A-Antigene auf der Oberfläche der Blutkörperchen in der Probe vorhanden sind, und daß die Blutkörperchen aufgrund von anti-A-Antikörpern agglutiniert sind. Wenn auf der anderen Seite die Blutkörperchenverteilung ein Muster des Typs aufweist, welcher in Fig. 28 gezeigt ist, zeigt das, daß keine Antigene auf der Oberfläche der Blutkörperchen in der Probe vorhanden sind, und daß sich die Zellen frei entlang der geneigten Oberfläche des Reaktionsgefäßes nach unten bewegten.
Die Reaktivität der Probe bezogen auf anti-B-Serum wird auf demselben Weg gemessen, und aus ihrer gemessenen Aktivität, bezogen auf anti-A-Serum und anti-B-Serum, kann die Blutgruppe der Probe bestimmt werden. Wenn die Blutkörperchen in der Probe eine Antigen-Antikörper-Reaktion bezogen auf sowohl anti-A-Serum als auch anti-B-Serum zeigten, ist die Blutgruppe der Probe AB; wenn nur mit Bezug auf anti-A- Serum eine Reaktion auftrat, ist die Blutgruppe der Probe A; wenn nur mit Bezug auf anti-B-Serum eine Reaktion auftrat, ist die Blutgruppe der Probe B; während, wenn keine Reaktion mit einem der Seren auftrat, ist die Blutgruppe der Probe 0.
Die Bestimmung der Blutgruppe, welche vorher 60 Minuten benötigte, kann unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits dieser Erfindung in ca. 10 Minuten erreicht werden.

Beispiel 2

Test auf anti-HIV-Antikörper

Wir werden einen Test auf anti-HIV-Antikörper unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits aus den Fign. 1a - 1C mit Bezug auf Fig. 8 beschreiben.
Zuerst wird eine Blutprobe durch Zentrifugation oder ein anderes geeignetes Verfahren in einen Blutkörperchen- Bestandteil 15 und einen Blutserum-Bestandteil 14 getrennt. Wenn das Blut mit einem Antikoagulans, wie z.B. Heparin, behandelt wurde, wird der Blutserum-Bestandteil 14 Plasma sein. Nach der Trennung werden 2 ul des überstehenden Blutserums-Bestandteils 14 und 25 ul einer vorher hergestellten Lösung 17 in einem Teströhrchen 19 gemischt und zusammen vorreagiert. Diese Lösung 17 besteht aus sensibilisierten Partikeln, welche mit physiologischer Salzlösung auf 1,0 % (v/v) verdünnt sind, wobei organisch synthetisierte Peptide, welche eine identische Aminosäuresequenz zu HIV-Antigen aufweisen, auf der Oberfläche dieser sensibilisierten Partikel beschichtet sind. Die sensibilisierten Partikel können aus synthetischen Partikeln aus Polystyrol oder Gelatine, welche chemisch modifiziert wurden, tierischen roten Blutzellen, welche durch Glutaraldehyd oder dergleichen fixiert wurden, oder ähnlichen Partikeln bestehen. Das Antigen, welches verwendet wurde um die Partikel zu sensibilisieren, kann ein inaktivierter Virus oder ein rekombinantes Protein sein, welches von Escherichia coli oder dergleichen unter Verwendung von Genmanipulationstechniken hergestellt wurde. Wenn die Vorreaktion abgeschlossen ist, werden 5 ul einer Suspension der sensibilisierten Partikel mittels einer Pipette 20 in die Reaktionszone 5 des Reaktionsgefäßes 21 pipettiert, und das Gefäß wird auf die Trägerbasis 1 gestellt, und die Basis wird für 10 Minuten bei 25 - 37ºC in einem Inkubator gelassen.
Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird die Verteilung der Partikel, welche sich in der Zone 5 des Reaktionsgefäßes 21 abgesetzt haben, unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 1 beobachtet. Wenn die beobachtete Partikelverteilung ein Muster des Typs ergibt, welcher in Fig. 2A gezeigt ist, zeigt das, daß anti-HIV-Antikörper in dem Serum der Probe vorhanden sind, und daß die Partikel aufgrund der anti-HIV-Antikörper agglutiniert sind. Wenn auf der anderen Seite die Partikelverteilung ein Muster des Typs ergibt, welcher in Fig. 2B gezeigt ist, zeigt das, daß keine Antikörper in der Probe vorhanden sind, welche mit den Oberflächenantigenen der sensibilisierten Partikel reagieren.
Durch Variieren des Antigentyps, welcher auf den Partikeln beschichtet ist, kann ein Test auf andere Viren oder Bakterien als HIV, wie z.B. HTLV-1, HB oder Gonococcus, durchgeführt werden. Weiterhin kann unter Verwendung von Antikörper-sensibilisierten Partikeln ein Antigentest auf HBs, Arzneimittel oder Krebsmarker durchgeführt werden. Wenn weiterhin Partikel mit mehreren verschiedenen Farben entsprechend mit verschiedenen Antikörpern oder Antigenen konjugiert werden und beispielsweise eine Farb-CCD-Kamera als Photosensor 26 verwendet wird, können Tests auf mehrere Antikörper oder Antigene in einem Arbeitsgang durchgeführt werden.
Unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits dieser Erfindung kann auf diese Weise ein Test mit hoher Empfindlichkeit in 1/6 der Zeit, welche herkömmlich benötigt wurde, durchgeführt werden. Darüber hinaus kann der Test durchgeführt werden, indem weniger des teuren Partikelreagens verwendet wird, als vorher benötigt wurde.

Beispiel 3

Direkter Kreuzprobentest auf ABO Gruppen unter Verwendung eines Reaktionsgefäßkits mit vorher darauf beschichteten Antikörpern

Zuerst wird ein Antiserum gegen A-Antigene auf der Oberfläche von Blutkörperchen in der Reaktionszone 5 eines Reaktionsgefäßkits, wie es in den Fign. 1A - 1C gezeigt ist, unter Verwendung des unten beschriebenen Verfahrens beschichtet.
Als erstes wird Standard-anti-A-Serum (Orso Co.) mit 10 mM Tris-HCl-Pufferlösung, pH 9, welche 0,15 M NaCl enthält, auf 1/10 verdünnt, 5 ul der verdünnten Lösung werden auf die Reaktionszone 5 der unteren Platte 2 getropft. Nach Auftropfen der Lösung wird die untere Platte 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, während feuchte Bedingungen beibehalten werden, so daß die Lösung nicht austrocknet. Die Reaktionszone 5 wird dann gewaschen, indem 10 mM Phosphatpufferlösung, ph 7,2, welche 0,15 M NaCl enthält, aufgetropft wird. Nach Entfernen der Waschlösung durch leichtes Schütteln der unteren Platte 2 werden 10 ml einer 10 mM Phosphatpufferlösung, ph 7,2, welche 3 % (w/v) Rinderserumalbumin und 0,15 M NaCl enthält, auf die Reaktionszone 5 aufgetropft, und die untere Platte wird bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert, während feuchte Bedingungen beibehalten werden. Durch dieses Verfahren wird der Bereich der Reaktionszone, welcher Blutkörperchen nicht-spezifisch adsorbiert, blokkiert. Nach der Inkubation wird die Reaktionszone 5 erneut mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,2, welche 0,15 M NaCl enthält, gewaschen. Wenn die untere Platte für eine lange Periode aufbewahrt werden soll, werden 0,02 % (w/v) NaN&sub3; zu der letzten Waschlösung zugegeben, und die untere Platte wird nach dem Waschen bei 4ºC gehalten. Darüber hinaus wird zusätzlich zu der unteren Platte 2 die obere Platte 4 ebenfalls behandelt, so daß eine nicht-spezifische Konjugation mit roten Blutkörperchen nicht auftritt. Dieses wird dadurch gemacht, daß die obere Platte 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in einer 10 mM Phosphatpufferlösung, pH 7,2, welche 3 % (w/v) Rinderserumalbumin und 0,15 M NaCl enthält, gelassen wird und sie mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung, ph 7,2, welche 0,15 M NaCl enthält, gewaschen wird. Wenn die obere Platte für eine lange Periode gelassen werden soll, werden 0,02 % (w/v) NaN&sub3; zu der letzten Waschlösung zugegeben, und die obere Platte wird wie in dem Fall der unteren Platte bei 4ºC gehalten. Zusätzlich zu dieser unteren Platte 2 und der oberen Platte 4 wird das Reaktionsgefäß unter Verwendung von zwei Abstandhaltern 3 zusammengebaut, welche mittels eines doppelseitigen Klebebandes oder Klebstoffs befestigt werden.
Wir werden nun mit Bezug auf Fig. 8 den direkten Kreuzprobentest auf ABO Gruppen unter Verwendung eines Reaktionsgefäßkits beschreiben, worin ein Antiserum beschichtet wurde. Das hier verwendete Kit umfaßt ein Reaktionsgefäß, worin die Abstandhalter eine Dicke von 80 um aufweisen, der Abstand zwischen den zwei Abstandhaltern 0,5 mm beträgt und die Länge der langen Richtung der Reaktionszone 5 mm beträgt, und eine das Reaktionsgefäß tragende Basis, wobei der Neigungswinkel 450 beträgt.
Zuerst wird eine Blutprobe durch Zentrifugation oder ein anderes geeignetes Verfahren in einen Blutkörperchen- Bestandteil 15 und einen Blutserum-Bestandteil 14 getrennt. Wenn das Blut mit einem Antikoagulans, wie z.B. Heparin, behandelt wurde, wird der Blutserum-Bestandteil 14 Plasma sein. Als nächstes werden 2 ul des sedimentierten Blutkörperchen-Bestandteils 15 und 98 ul einer Lösung 17 in einem Teströhrchen 19 gemischt, um eine 2 %ige Blutkörperchen- Suspension 18 herzustellen. In diesem Fall ist die Lösung 17 eine physiologische Salzlösung. Die Blutkörperchen-Suspension 18 wird dann mittels einer Pipette 20 in die Reaktionszone 5 des Reaktionsgefäßes 21 eingeführt, worin anti- A-Serum wie oben beschrieben beschichtet wurde. Nach dem Pipettieren wird das Gefäß auf die Trägerbasis 1 gestellt und 10 Minuten lang bei ca. 36ºC inkubiert, wobei darauf geachtet wird, das Gefäß nicht zu schütteln. Das Pipettieren kann durchgeführt werden, nachdem das Reaktionsgefäß 21 auf die Trägerbasis 1 gestellt wurde.
Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, wird das Verteilungsmuster der in der Reaktionszone 5 des Reaktionsgefäßes 21 sedimentierten Partikel wie in Beispiel 1 beobachtet. Wenn A-Antigene auf der Oberfläche der Blutkörperchen in der Probe vorhanden sind, konjugieren die Körperchen mit dem anti-A-Serum, welches in dem Reaktionsgefäß beschichtet war, und die Blutkörperchen werden gleichmäßig über praktisch die ganze Reaktionszone 5 verteilt. Die Verteilung der Körperchen, welche in diesem Fall erscheint, ergibt daher ein Muster des Typs, welcher in Fig. 7A gezeigt ist. Wenn auf der anderen Seite keine A-Antigene auf der Oberfläche der Körperchen in der Probe vorhanden sind, konjugieren die Blutkörperchen nicht mit dem anti-A-Serum, welches in dem Reaktionsgefäß beschichtet ist, und die Körperchen bewegen sich frei entlang der geneigten unteren Platte 2 des Reaktionsgefäßes 21 nach unten. In diesem Fall ergibt daher die Verteilung der Blutkörperchen ein Muster des Typs, welcher in Fig. 7B gezeigt ist. Auf diesem Weg ist es möglich, aus dem Unterschied in dem Verteilungsmuster nach der Reaktion die Gegenwart oder Abwesenheit von A-Antigenen auf der Oberfläche von Blutkörperchen in der Probe zu bestimmen. Die Gegenwart oder Abwesenheit von B-Antigenen auf der Oberfläche der Blutkörperchen kann auf demselben Weg bestimmt werden, indem die Reaktivität der Probe bezogen auf anti-B-Serum gemessen wird.
Aus ihrer gemessen Reaktivität bezogen auf anti-A-Serum und anti-B-Serum kann die Blutgruppe der Probe bestimmt werden. Wenn die Blutkörperchen in der Probe bezogen auf sowohl anti-A-Serum als auch anti-B-Serum eine Antigen-Antikörper- Reaktion zeigten, ist die Blutgruppe der Probe AB; wenn nur eine Reaktion bezogen auf anti-A-Serum vorlag, ist die Blutgruppe der Probe A; wenn nur eine Reaktion bezogen auf anti-B-Serum vorlag, ist die Blutgruppe der Probe B; während, wenn keine Reaktion mit einem der Seren auftrat, ist die Blutgruppe der Probe 0.
Die Bestimmung von Blutgruppen, welche vorher 60 Minuten benötigte, kann unter Verwendung des Reaktionsgefäßkits dieser Erfindung in ca. 10 Minuten erreicht werden.

Beispiel 4

Test auf anti-HIV-Antikörper unter Verwendung eines Reaktionsgefäßkits mit vorher darauf beschichteten Antigenen

Tests auf verschiedene Antikörper können unter Verwendung eines Reaktionsgefäßkits durchgeführt werden, worin Antigene anstelle des Antiserums aus Beispiel 3 beschichtet wurden. Wir werden einen Test auf anti-HIV-Antikörper unter Verwendung eines solchen Verfahrens mit Bezug auf Fig. 9 beschreiben.
Als erstes werden unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens wie dem, welches in Beispiel 3 beschrieben wurde, HIV- Antigene in der Reaktionszone 5 des Reaktionsgefäßes beschichtet. Die HIV-Antigene, welche in dem Reaktionsgefäß beschichtet werden, können chemisch synthetisierte HIV- Virus-Oberflächenantigene, rekombinante HIV-Proteine, welche von Escherichia coli hergestellt wurden, oder der HIV- Virus selbst sein.
Als nächstes wird eine Blutprobe durch Zentrifugation oder ein anderes geeignetes Verfahren in einen Blutkörperchen- Bestandteil 15 und einen Blutserum-Bestandteil 14 getrennt. Wenn das Blut mit einem Antikoagulans, wie z.B. Heparin, behandelt wurde, wird der Blutserum-Bestandteil 14 Plasma sein. 2 ul des erhaltenen Serumbestandteils wurden in ein Teströhrchen 19 entfernt, dann wurden 18 ul physiologische Salzlösung zugegeben und damit gemischt. 5 ul dieser verdünnten Serumlösung 27 wurden mittels einer Pipette 34 in ein Reaktionsgefäß 21 pipettiert, worin HIV-Antigene beschichtet worden waren. Nach dem Pipettieren wurde das Reaktionsgefäß auf eine Trägerbasis 1 gestellt und wurde 2 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Gefolgt auf die Reaktion wurde physiologische Salzlösung als Waschlösung über die Düse 35 in die Reaktionszone 5 des Reaktionsgefäßes 21 eingeführt, und Abfallflüssigkeit wurde gleichzeitig durch die Düse 36 von der gegenüberliegenden Seite abgesaugt. Durch dieses Verfahren kann die Reaktionszone 5 gewaschen werden und der Serumbestandteil, welcher nicht mit dem Antigen reagierte, das in dem Reaktionsgefäß 21 beschichtet war, kann herausgewaschen werden. Es ist wünschenswert, daß Waschlösung, welche in der Reaktionszone 5 zurückbleibt, mit Filterpapier abgewischt wird, oder durch Hineinblasen von Luft aus der Düse entfernt wird.
Als nächstes wurde ein Partikelreagens 33, auf welchem anti-human-Antikörper aus Ziegen beschichtet worden waren, mittels einer Düse 37 in das Reaktionsgefäß eingeführt und das Gefäß wurde 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die hier verwendeten anti-human-Antikörper können ebenfalls monoklonale Antikörper sein, welche aus Mäusen oder dergleichen gewonnen wurden, oder eine Substanz wie z.B. Protein A, welches an Antikörper bindet. Weiterhin können die Partikel, auf welchen die Antikörper beschichtet sind, rote Blutzellen sein, die durch Glutaraldehyd oder dergleichen fixiert wurden, oder synthetische Partikel, wie z.B. Polystyrol.
Nachdem die Reaktion vollständig ist, wird das Partikelverteilungsmuster durch dasselbe Verfahren, wie das aus Beispiel 1, beobachtet. Wenn Antikörper gegen HIV in dem Serum der Probe vorhanden sind, konjugieren sie mit den HIV-Antigenen, welche in dem Reaktionsgefäß beschichtet sind, und die Partikel, auf welchen anti-human-Antikörper beschichtet wurden, konjugieren mit den Antikörpern, die mit den Antigenen konjugiert haben. Die Partikelverteilung ist daher ein Muster des Typs, welcher in Fig. 7A gezeigt ist. Wenn auf der anderen Seite keine Antikörper gegen HIV in dem Serum der Probe vorhanden sind, bewegen sich die Partikel frei entlang der geneigten unteren Platte des Reaktionsgefäßes nach unten, ohne irgendeine Reaktion zu verursachen. Die Partikelverteilung ist daher ein Muster des Typs, welcher in Fig. 78 gezeigt ist.
Unter Verwendung dieses Reaktionsgefäßkits kann ein hochempfindlicher Test in einer viel kürzeren Zeit als den 60 - 120 Minuten, welche vorher benötigt wurden, durchgeführt werden.
Durch Variieren des Antigentyps, welcher in dem Reaktionsgefäß beschichtet ist, können Antikörper gegen andere Viren
als HIV, wie z.B. HTLV-1 oder HTLV-II oder Bakterien, ebenfalls erfaßt werden. Weiterhin hat der Antikörper gewöhnlich 2 - 10 Antigen-Bindungsstellen. Partikel, auf welchen dasselbe Antigen beschichtet wurde, wie das Antigen, das in dem Reaktionsgefäß beschichtet wurde, können daher ebenfalls als Partikelreagens 33 verwendet werden. Weiterhin kann ein Test auf ein Antigen ebenfalls durch das "Sandwich"-Verfahren durchgeführt werden, wobei Antikörper sowohl auf dem Reaktionsgefäß als auch auf den Partikeln beschichtet werden.

Claims

1. Reaktionskit zum Beobachten und Erfassen eines Partikelmusters aufgrund einer Agglutinationsreaktion, umfassend:

ein eine Reaktionszone definierendes Mittel zum Aufnehmen einer Probe, wobei das die Reaktionszone definierende Mittel umfaßt:

zwei Platten (2, 4), welche einander gegenüberliegend angeordnet sind, wobei wenigstens eine der Platten in wenigstens einem Teil der Reaktionszone (5) eine flache Oberfläche aufweist und wenigstens eine der Platten transparent ist, um dorthindurch ein in der Reaktionszone (5) gebildetes Partikelmuster visuell zu erfassen;

Abstandhalter (3), welche zwischen den Platten (2, 4) eingefügt sind, um so die zwei Platten in einer Abstandsbeziehung zueinander zu halten, wobei die Reaktionszone (5) in einem Raum zwischen den zwei Platten und den Abstandhaltern definiert ist; und

eine Trägerbasis (1) zum Tragen des die Reaktionszone definierenden Mittels, und welche Mittel einschließt, um das die Reaktionszone definierende Mittel zu einem bestimmten Winkel zu neigen, um dadurch die Reaktionszone so zu neigen, daß einer der Abstandhalter einen Bodenbereich der geneigten Reaktionszone bildet;

wobei ein Teil des Raumes, welcher zwischen den zwei Platten (2, 4) und zwischen den Abstandhaltern (3) als eine Öffnung dient, durch welche eine Probe in die Reaktionszone (5) eingeführt werden kann, in welchem die Öffnung an einer Stelle angeordnet ist, welche von dem Abstandhalter, der den Bodenbereich der geneigten Reaktionszone bildet, verschieden ist

und in welchem die Reaktionszone (5) eine geeignete Querschnittsfläche aufweist, um die Probe durch Kapillarwirkung anzusaugen.

2. Reaktionskit nach Anspruch 1, wobei die zwei Platten (2, 4) beide transparent sind.

3. Reaktionskit nach Anspruch 1 oder 2, wobei das die Reaktionszone definierende Mittel und die Trägerbasis (1) einstückig als eine Einheit (8) gebildet sind.

4. Reaktionskit nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das die Reaktionszone definierende Mittel eine Bodenoberfläche einschließt, welche der Reaktionszone gegenüberliegt, und weiterhin eine Substanz mit einer spezifischen Bindungsaffinität zu einer Probe umfaßt, welche wenigstens auf der Bodenoberfläche des die Reaktionszone definierenden Mittels beschichtet ist.

5. Verfahren zum Bestimmen eines Partikelagglutinationsgrades mittels einer Agglutinationsreaktion unter Verwendung des Reaktionskits gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt:

Herstellen einer Partikelsuspension, welche Partikel mit spezifischen Bindungseigenschaften und ein Substrat mit spezifischen Bindungseigenschaften zu den Partikeln enthält;

Einführen der Partikelsuspension in die Reaktionszone (5);

Stehenlassen des die Reaktionszone definierenden Mittels mit der Partikelsuspension darin auf der Trägerbasis (1) für eine vorbestimmte Zeit; und

Beobachten der Bildung und des Grades von Ausbreitung eines Partikelverteilungsmusters, welches in einem unterem Bereich der Reaktionszone, welche durch das die Reaktionszone definierende Mittel definiert ist, gebildet wird.