JPH04285858A - カラム凝集分析法および装置 - Google Patents
カラム凝集分析法および装置Info
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Abstract
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Description
血液型血清学(「免疫血液学」)に関連するような免疫
学的結合(抗原抗体結合)を検出するための凝集分析に
関する。
しくは臓器移植を行う前に、血液供与者と患者である受
容者との間の血液細胞適合性の決定を要求する。血液細
胞の適合性は、患者の血清中に含まれている抗体と、供
与者からの血液細胞上に存在している抗原との間で免疫
学的反応が生じないことによって決定される。
人の赤血球の表面上に見いだされている。これらの抗原
、即ち遺伝で受け継がれている遺伝子の生産物は、一卵
生双生児を除いて、全ての人の中にユニークな組み合わ
せとして存在している。血液分類は、一般に、どの抗原
が存在しておりそしてどの抗原が存在していないかを決
定するための赤血球に関する試験方法であり、通常、試
験する抗原に対する抗体を用いる。
血球抗原を有していない場合、その人の血清はその抗原
に対する抗体を有している可能性がある。血清中に抗体
が存在しているか否かは、その人の免疫系が、その特定
の抗原またはそれに非常に類似したなにかによって以前
に攻撃を受け、それに反応したかに依存している。例え
ば、赤血球がA型の人、即ち赤血球上に「A」抗原を有
する人は、その人の血清中に抗B抗体を有している。こ
のように、上記の人にB型血液を与えると、起こり得る
重大な臨床的結果と共に免疫反応が生じる。
物、バクテリアおよびウイルス中の抗原にさらされてい
ることを特記しなければならないる。これらの「天然」
の抗原のいくつかは、明らかに、人の血液型抗原に非常
に類似しているため、それらは、ほとんど全ての感受性
の人を刺激して、抗体を生産させる。従って、対応する
抗原を欠く赤血球を有する全ての人の血清中に特定の抗
体が生じることが予想される。このことは特にABO系
に関して事実である。従って、患者/供与者血清に対し
て第二確認試験がしばしば行われる。血清中のABO血
液型系の期待される抗体に関する試験は、「逆」血液型
分類と呼ばれる。
般に免疫グロブリンM(IgM)である。これらの抗体
は、1分子当たり10個の抗原結合部位を有する。この
IgM抗体は、赤血球間の距離を橋かけするのに充分に
大きく、従ってそれらを遠心分離したとき、これらの細
胞は格子「細胞−抗体−細胞−抗体」中で一緒に結合し
、そして凝集体中で一緒になった集塊のまま存在してい
る。例えば、抗Aを血液型Aまたは血液型AB細胞に加
えた後、この混合物を遠心分離すると、これらの細胞は
、再び懸濁させたとき集塊中に残存する。同じ抗体を用
いたとき、O型とB型の細胞は個々の細胞として再懸濁
される。IgM抗体の如き1つの抗体によって生じる凝
集は直接凝集と呼ばれる。
させる傾向にあり、これは高分子量ポリマー類を添加す
ることによって増強され得る。いくつかの抗Rh抗血清
は、免疫グロブリンG(IgG)抗体から成り、そして
25%ウシのアルブミン(しばしば市販の抗D試薬調剤
中に見いだされる)の如き高蛋白濃度が存在しているこ
とによって促進された場合、直接凝集を生じる。
Gは、お互いに反発する傾向にある細胞間の距離を容易
には橋渡しすることができないからである。従って、こ
れは、これが有する特異性に合致する赤血球抗原と結合
するが、より大きなIgM抗体が凝集するようには効率
良く上記赤血球を凝集させない。従って、赤血球に結合
したIgG抗体の存在は、通常、必要な凝集を生じさせ
る抗IgGを添加することで、「赤血球−IgG/抗I
gG/IgG−赤血球」の格子を生じさせることにより
検出される。
抗IgG抗体を中和するIgGを天然に含有している。 従って、上記抗IgGを細胞に添加する前に、血清を除
去する必要がある。インビボで赤血球と結合するIgG
に関する試験は、直接抗グロブリン試験と呼ばれている
。インビトロで赤血球と結合するIgGに関する試験は
、間接抗グロブリン試験と呼ばれている。上記抗グロブ
リン試験はまたクームス・テストと呼ばれている。
(RH−)抗原に関する試験を行い(そして、選択され
た場合、他の抗原に対する試験を行い)、そしてその人
の血清を試験することによってその結果をクロスチェッ
クして、存在している可能性のある後天性抗体を測定す
ることが、血液銀行で実施されている標準的試験である
。前者は「前方型」と呼ばれ、一方後者は「逆型」と呼
ばれる。これらの型決めの実施の各々から得られる結果
は一致する必要がある。
ば抗Aまたは抗B)が入っている標準実験室試験管に患
者の赤血球を入れ、混合して、抗体/抗原結合反応を生
じさせた後、遠心分離するところの、“Landste
iner”法として知られている一般的な方法が存在し
ていた。試験する抗原が存在している場合、この抗体/
抗原結合が生じ、その結果、患者の赤血球の凝集が生じ
る。この試験管を手で振って、その底に存在している遠
心分離されたボタン状の「集塊」細胞を動かす。その後
、この動かされた細胞が「集塊」しているか否かそして
それがどの程度であるかについて、主観的決定を行う。
特徴を減少させそして誤りを減少させるため、この技術
を簡潔化する試みが成された。表面の少なくとも一部に
必要な免疫化学試薬を有する、湿潤可能な、非吸収性で
あるか或はある場合には吸収性を示す試験スライドもし
くは試験カードを用いることで、適合性の試験結果のい
くつかの永久的な記録が得られたることが認められてい
た。米国特許2,770,572、2,850,430
、3,074,853、3,272,319、3,42
4,558、3,502,437および3,666,4
21およびヨーロッパ特許出願0 104 881−A
2には、上記試験カードおよびそれに関係したアパルチ
(apparti)に関する選択された実施例が記述さ
れている。
験に関する鋭敏性および正確さを向上させるための技術
、例えばいわゆるクームス・テストが開発された。Gr
aham他の米国特許4,435,293には、初期の
クームス・テスト方法の洗浄段階を除く、試験管システ
ムを用いた血液型分類システム(SimwashR)が
記述されており、このようにSimwashRのシステ
ムは、赤血球の「自己洗浄」を提供している。前述した
ような抗グロブリン試験は、赤血球がそれらの血清(こ
れは、未結合のIgG抗体を含有している)を含んでい
ないことを必要としている。このSimwashRのシ
ステムを用いる場合、密度の高いな細胞をカラム内に遠
心分離させ、一方密どの低い血清はその上部に残存させ
ている。
は、カラム中のゲルを用いた血液適合性試験システムが
記述されており、該ゲルは特に、エピクロルヒドリンを
用いて架橋させたデキストラン鎖の三次元網目構造もし
くはマトリックスであるSephadexR(Phar
macia Fine Chemicals、 Upp
sala、 Sweden and Piscataw
ay、 N.J.)であり、これは、凝集した赤血球を
捕捉し、そして未凝集の細胞をその底に通過させる。
の欠点の1つ、そして特に媒体としてゲルを用いた上記
試験システムの製作における欠点は、このゲルの分離能
力を妨害する、汚染物である低分子量化合物もしくは断
片であるいわゆる「微細物」を取り除くため、試験管に
挿入する前にそのSephadexRの如きゲルを純化
させる必要があることである。歴史的に、ゲルの微細物
がクロマトグラフィー用分離カラムを詰まらせることは
知られていた。
用いられる試薬の量を正確に計算する目的で、使用前に
膨潤させる必要がある。試薬、緩衝剤などの必要量の計
算において、ゲルの膨潤希釈ファクターを考慮に入れる
必要がある。更に、いくらかの試薬がその多孔性ゲルに
よって吸収されるため損失が生じ、そして試験される分
析物との結合に利用されなくなる。この損失を補うため
多量の試薬を添加しなければならない。このゲルはまた
、本来、機械的取り扱いに対して壊れ易く、そしてこの
膨潤過程で***して、ゲルの粒子サイズに制御不可能な
変化を生じさせ得る。
1つの欠点は、それが温度の極端な変化に弱く、そして
乾燥してしまうか或は***して、収縮を含む安定性、輸
送および保存の問題、並びにそれに伴う試験特性の変化
を生じさせる。この崩壊の結果、その材料を通過する血
球の正常な流れを変化させるか或は制限する、上述した
ような微細物を生じさせる。SephadexR含有試
験装置は凍結できないことによっても、追加的な、輸送
および保存問題を生じさせる。
原もしくは抗体の存在を検出するための方法および装置
[これらは、本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成るマ
トリックス(このマトリックスは、非凝集反応体、特に
赤血球の動きを可能にする一方、好適には、凝集された
反応体、特に赤血球をいわゆる「帯層」中に拘束する優
れた性能を与える)を利用]を提供するものである。
本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成るマトリックス(
このマトリックスは、凝集した反応体の存在もしくは不
在の検出を可能にするような量で容器内に配置されてい
る)がその中に配置されている、本質的に透明な細長く
伸びた容器である。該マトリックスを該装置に加えるに
先立って、結合リガンド、例えば血液型抗原もしくは抗
体を検出するための試薬内に該ミクロ粒子を埋め込むか
或は含浸させてもよい。二者択一的に、上記試薬の液状
形態のものを、その中に含まれているミクロ粒子を通し
て濾過させるように、該容器の開口部に加えてもよい。 該試薬と結合しそして凝集反応を生じさせる、対象とな
る分析物を含有している可能性のある液状サンプルを、
上述した試薬と同時か、或は該試薬を添加後、該容器に
加える。この容器を遠心分離した後、凝集体の有無を検
出する。 3、
るより詳細な説明である。本発明の好適な装置は、一般
的にここではしばしば入り口と呼んでいる少なくとも1
つの開口末端を有する、容器または細長く伸びた本質的
に透明な中空部材である。入り口は、本発明のマトリッ
クスとの実際的な接触を達成するために、サンプルおよ
び/または試薬、緩衝剤などを加えるための領域を意味
している。いくつかの具体例において、この細長く伸び
た部材は、該入り口に対して反対側にある本質的に密封
された末端を有している。本質的に密封された末端は、
該マトリックスが該部材内に保持されており、こぼれ出
すことなく、そしてそのマトリックス内に保持されてい
ることが望まれている反応体もまた保持されるような度
合で密封されていることを意味している。細長く伸びた
ものは、その幅に比較していくらか長く、そして縦軸に
沿って1直線になっている容器を意味している。従って
、本発明のマトリックスは、反応体が凝集していない場
合、その長さに沿ってそれらが移動し、そして凝集した
場合、該マトリックスによって捕捉されるようなカラム
状に近いものの中に入れられている。この分離を可能に
しそしてそれらの検出を可能にするマトリックスを入れ
て置く領域に関して充分な長さを有する容器形状は、本
発明の目的に適切であり、この容器の形状に関する残り
の点はかなり異なっていてもよいと理解されるべきであ
る。このマトリックスを入れておくための中空部材の領
域もしくは容器を、ここでは、一般に「凝集検出ゾーン
」と呼んでいる。
離過程を容易にするようなものであるべきである。例え
ば、好適な具体例において、この全体の容器は、基本的
には実験室の試験管の形状のものであり、これらには、
それらの全体もしくは部分が「円錐形」といわれている
試験管が含まれる。他の好適な具体例には、この容器の
一部(例えば、該マトリックスが含まれている部分)の
みが円錐形である構造が含まれる。この場合、利用者が
添加するサンプルもしくは試薬を入れるのに適切な形状
、そして構造が円形、立方形などであってもよい、サン
プルを受け取り部分に、該円錐形領域が連結していても
よい。例示の目的でのみ、図1〜4には、本発明の方法
を実施するための装置の一部に関する種々の形状および
配置が示されている。
るところの、2つの領域を有する入れ物は、血球と血清
の混合物を該マトリックスを通して移動させる前に、保
温するための「上部」チャンバの追加的利点を与えてい
る。このことは、この上部チャンバ(サンプル受け取り
部分)と、凝集検出ゾーン(或はそのちょうど上にある
部分)と、の間の連結部が、サンプルおよび試薬を加え
るための開口部よりも小さい開口によって限定されてい
るとき、特に本当である(後者は入り口部分である)。 これは、そのより大きい入り口開口部が血球および血清
の添加を容易にする一方、利用者が遠心分離の如き力を
与えてそれらを動かす前にそれらが該マトリックスを通
過するのを、そのより小さい開口部が妨げているからで
ある。従って、利用者は、凝集分析のタイミングに関す
る制御を行うことが可能となる。図2および3はこの概
念を説明している。図2は、サンプルを受け取るためそ
こに配置されている上部チャンバ95が備わっている入
れ物80を表しており、上記上部チャンバは利用者が適
当な方法で動きを与えるまで、該上部チャンバに付けら
れたサンプルの動きを止めておく開口105を有してい
る。図2はまた、緩衝剤の入っている「初期反応領域」
103、そしてこの分析に関する結合および凝集段階の
ための試薬を表している。凝集した反応体100の帯が
該マトリックス90内で生じる。図3は、該初期反応ゾ
ーンが欠損している代替具体例である。この具体例中、
この結合反応は、その装置に反応体が添加される前に行
われ、そして該マトリックスは、その凝集物のためのフ
ィルターとして働いてもよい。二者択一的に、この反応
体を該上部チャンバに直接加えた後、遠心分離および下
にある該マトリックスへの通過に先立って、ある期間反
応させてもよい。次に、遠心分離して開口105を通過
させた後、これらの凝集物は該マトリックスの上部もし
くはその中に捕捉させる。図4は、この装置の凝集検出
ゾーンに関する更にもう1つの配置を示しており、そし
てまた、該マトリックスの上部よりはむしろ該マトリッ
クス内に存在している帯100の形成を表している。
の目的のための検出装置の使用によって、凝集物の有無
を容易に確かめることのできるくらい半透明もしくは透
明な、いかなる材料も意味している。この装置は、その
全体もしくは選択された領域のみ、例えば陽性を示すサ
ンプル中の凝集帯形成の領域において、本質的に透明で
あり得る。凝集反応ゾーンの特定領域内の束になった凝
集物および/または帯またはボタン状物の形成を光学的
もしくは他の方法で検出するように設計された装置を用
いて、陽性もしくは陰性の凝集反応の観察を行うことも
本発明に包含される。この観察方法は、この装置を用い
て手動で行うか、或はいわゆる「利用者が離れ得る」自
動化された観察方法であってもよい。
一般的に知られている実験用試験管およびカラムの如き
容器が、それらが、配置そして望まれるならば装置を用
いた観察に、適合している限り、本発明の方法を実施す
る目的で使用されてもよい。適切な容器は、ガラス、ポ
リスチレン、ポリエチレン類、ポリプロピレン、ポリカ
ーボネート類などの如き材料から成っていてもよい。好
適なものは、一般に、いくつかの管が入っている予め成
型された四角形のカートリッジであるところの、試験管
カートリッジである。図1は、このようなカートリッジ
の1つの具体例を表している。特に好適なものは、分析
を行うためにこの装置を使用するとき、特に試験管がカ
ートリッジの形のものであり、そして自動化されたピペ
ット装置を用いて試薬、緩衝剤、マトリックスなどを、
該装置もしくは後者を製造するとき充填するに適合して
いる場合、特に、前述したものの如き2つの部分から成
るチャンバの実験室用試験管である。
性のミクロ粒子から成る。「本質的に非圧縮性」は、該
マトリックスに与えられる力、例えば遠心分離力、磁気
力、電気力、静水圧、負もしくは正圧による力など、或
は正常な重力下での長期間の保存、によって生じ得る、
形もしくは大きさの変化に対する抵抗力を意味している
。未凝集の反応体の動きが不規則さによって妨害されな
い限り、これらの粒子はいかなる形状のものであっても
よい。これらの粒子の大きさは、この凝集分析に関係し
ている特別な結合リガンドに従ってかなり変化し得る。 本分野の技術者は、凝縮した反応体が該マトリックスの
上部内もしくはその上に保持される一方、凝縮していな
い反応体が該マトリックスを通ってその底もしくはその
装置の外側に一緒に出て行くべきであることが分かるで
あろう。しかしながら、赤血球の凝縮の場合、好適なマ
トリックスのミクロ粒子サイズは、一般に約50ミクロ
ン〜約300ミクロン、より好適には約50ミクロン〜
約200ミクロン、最も好適には約50ミクロン〜約1
50ミクロンの範囲である。
ラスおよび砂を含む種々の二酸化ケイ素化合物、望まれ
るならば凝集の可視的観察が可能な程充分に明るい色を
有する限り金属化合物、種々のプラスチック化合物など
から成る。上記材料の例は、Polysciences
, Inc.から得られるが如き市販のポリスチレン製
ビード、FisherまたはMallinkrodtか
ら入手可能な海砂、Whatmanから入手可能な如き
セルロース粒子、およびJaygo Incorpor
ated(Dragonite)およびHuels P
etrach Systemsから入手可能な如きガラ
ス製ビードである。これらのより特別な例は、本明細書
の実験実施例項中に列挙する。
置の凝集検出ゾーン内に備えられている。この装置の形
がカラム状である場合、このマトリックスはしばしば、
その長さに沿って閉じてある末端に近づくように備えら
れている。しかしながら、ある具体例においては、この
マトリックスはこの装置の「中間」部分を通してのみ備
えられており、そしてまた、ある具体例中では、グラス
ファイバーもしくは他の種類の繊維の如きプラグとして
働く2番目の材料の上部に乗せられている。この装置は
また、1カ所以上の部位で、使用器具と接触していても
よい。例えば、該入り口は、そこを通してサンプルを受
け取るピペット装置の如き使用器具と連結していてもよ
い。この装置は、該反応体の移動を生じさせるところの
、例えばそれらを該マトリックスを通して押出すか或は
吸い込むように設計された使用器具と接触していてもよ
い。いくつかの具体例において、試薬液を吸い込み、凝
集物を該マトリックス内もしくはその上部に保持させな
がら非凝集物をその装置を通して通過させるため、真空
が使用できる。他の具体例において、液体の流れの如き
力を与えて該マトリックスを通して反応体を移動させる
ための使用器具が、該装置の一部と接触していてもよい
。
を添加するに先立って、それらをいずれかの適切な方法
で最初に洗浄することで、望ましくない汚染物を除去し
、そして非特異的結合を回避してもよい。単独もしくは
組み合わせのいかんに拘らず、抗血清、緩衝剤、或は他
の所望の試薬、或は希釈剤中の粒子から成るスラリー状
の粒子を該装置に加えてもよい。これらの粒子はまた、
乾燥した形態でこのゾーンに加えられてもよく、そして
望まれるならば、抗血清、適当な緩衝剤などを次に添加
する。好適な具体例において、該入れ物の凝集物検出ゾ
ーン内にある適当な反応溶液もしくは緩衝剤中に該ミク
ロ粒子を完全に含浸させた後、該溶液の層のみをこのマ
トリックスの上部から広がらせる。この広がった領域は
「初期反応ゾーン」と呼ばれ、そして該2つの部分から
成るチャンバ装置以外のカラム状装置中、反応体が最初
に互いに接触し、混合した後、反応し始める領域である
。説明のため、本発明のカラム凝集方法を、特定の血液
型および適合性操作に関連して記述する。本発明のマト
リックスが加えられているカラム状装置を用い、ここに
記述したようなカラム凝集装置を利用して、前方血液型
分析を行うことができる。抗血清を含有している単クロ
ーン抗体または多クローン抗体を、生理学的に適合し得
る緩衝剤中に分散させた後、それらを含浸させるための
ミクロ粒子から成るマトリックスに加え、そしてそのマ
トリックスから入り口に向かって広がり、初期反応ゾー
ンを生じる。一般的にこれらの抗体の抗原親和性および
特異性に応じて、本分野の技術者は常規通り、上記抗原
の適切な量を最適に決定し得る。抗体の活性を増強する
助けを与えそして非特異的結合を防止するための本分野
で公知の適切な添加剤、例えば高分子量ポリマー類など
を含有していてもよい緩衝剤中に該抗体を分散させる。 これらの例には、ポリビニル類、デキストラン、ゼラチ
ン、およびポリエチレングリコールが含まれる。この溶
液の密度を上昇させるため、低分子量のポリマーもまた
添加され得る。
胞の食塩水懸濁液を加える。本分野の技術者は、細胞の
適切な懸濁液が約2〜6%、好適には約2〜3%である
ことを容易に確かめることができるであろう。この懸濁
液が希釈され過ぎている場合、いかなる得られる凝集反
応も読み取ることが困難になる。この懸濁液があまりに
も濃い場合、この系は過負荷となり、そして凝集が区別
できなくなる。この結合反応を生じさせた後、これらの
反応体を該マトリックスに向かわせた後、それを通して
移動させる。この動きは、一般に、上述した如き力を与
えることによって行われる。特定の好適な具体例におい
て、遠心分離力、負の圧力、もしくは静水圧力が与えら
れる。
合物を動かす目的でその上に力を与えるために用いられ
る技術が遠心力である場合、本分野の技術者は、遠心分
離の時間および速度が最適な結果を大きく変化させるこ
とを理解するであろう。好適な具体例において、もしあ
れば、このマトリックスカラムの上部近くで凝集物の集
塊もしくは帯を生じさせるに適切な速度および時間で遠
心分離を行うべきであり、それによって、明確に観察で
きる陽性の読み取りを可能にさせる一方、凝集していな
い陰性の細胞がこの装置の底に向かって移動してボタン
状物を形成する。もし長すぎる時間、もしくは高すぎる
速度でこの装置を回転させた場合、これらの凝集物はそ
の管の底に押し出される。このマトリックス部分のいく
らか中心部を通って反応体が移動し、そしてこの装置の
側面上に存在させないようにするため、頭が揺れている
遠心分離器を用いるのも好適である。
加えた場合、この患者のサンプル中に含まれているB型
血球はこの抗体と結合して、該マトリックスの上部近く
で捕捉された凝集細胞から成る1つの線を形成する。A
型血球は凝集せず、この装置の底に遠心分離される。し
ばしば、患者の細胞は弱い反応性を示す異形物を含んで
いる可能性がある。中間的反応は、このカラムマトリッ
クスを通して分散されたより細かい凝集物によって示さ
れ、一方、陰性の場合、このマトリックスカラムの底に
ボタン状物が形成される。図1は、本発明の方法および
装置を用いたとき観察され得る反応終点の例を示してい
る。管10は、凝集の明確な帯100を有する強陽性反
応を示している。管12は、前のものよりもいくらか弱
い陽性反応を示している、と言うのは、凝集した帯がよ
り細かい凝集物に***しているからである。管14は、
このマトリックスの中間部分全体に渡って分散している
より細かい凝集物を有するところの、より中間的な陽性
反応を示しており、管16中と同様、ある程度底に沈澱
している。管18は非常に弱い陽性反応を表しており、
ここでは大部分の細胞がその底に集積している。管20
は明らかな陰性を示しており、細胞のボタン状物50が
この管の底に存在しており、そしてこのマトリックス9
0内にはいかなる凝集物も分散していない。
板、赤血球などを含む数多くの異なる血球の検出に対し
て、上述した種類の直接的凝集試験において利用されて
もよい。凝集物の可視的観察が望まれている場合、いか
なる無色の細胞、或は細胞に粘着している無色の粒子に
対しても、最初に、可視的に感知できる凝集反応を行う
に適切な染料で染色するのが好適である。赤血球中のヘ
モグロビンは、染色無しで天然に上記適切な色を与える
。ABO赤血球、並びにD、C、c、E、e、K抗原な
どを含有している血球に対して、上述したように直接凝
集試験を行うことができる。同様に、血清に関して、特
別な抗原もしくは抗原を含有している細胞に対する抗体
の存在を試験する必要があるとき、それらを公知の抗原
と混合する。もし未知の血清が、提供された公知の抗原
に対する抗体を含有している場合、これらの反応体は凝
集して、それらが該マトリックス上もしくはそこを通過
して下降するとき捕捉される一方、陰性の血清は反応を
起こさず、そして凝集物は捕捉されない。遠心分離、或
は他の適当な手段によって混合物を該マトリックス上も
しくはそれを通して移動させるに先立って、公知の抗原
もしくは抗原を含有している細胞を患者の血清と一緒に
保温するための、2つの部分から成るチャンバ構成を、
最後に述べた分析の実施で利用するのが好適である。
途に関連して、Kell、 DuffyおよびKidd
の抗原の如き予期されない抗体に対して、上述した方法
により患者の血清をスクリーニングすることも可能であ
る。クーム試験の如き抗グロブリン試験もまた行われ得
る。クーム試験において、これらの細胞は、未結合の抗
体を含有している血清を含有していてはならない。ここ
に記述したシステムを用いて、濃密な細胞を該カラム中
に遠心分離する。濃密でない血清は、米国特許番号4,
435,293中に記述されている方法と同様なカラム
の上部に残存する。このマトリックス内に分散された抗
IgGは、抗原と結合しているIgG抗体を有する細胞
を凝集させ、そしてこれらの凝集物は該マトリックスの
上部もしくはその中に捕捉される。結合しているIgG
を全く含んでいない細胞は、このカラムを通過してこの
管の底に移動する。
関連した使用に関して詳しい説明を行ってきた。しかし
ながら、リガンド類のそれらの結合相手との結合の結果
として粒子が凝集するような粒子と会合している結合リ
ガンドのいずれかを伴う結合分析を行うことは、本発明
の範囲内であることを理解すべきである。例えば、赤血
球(抗原を有する)の代わりとなる粒子もしくは他の担
体に付着できるいかなる結合リガンドも適切である。こ
れらの粒子は、抗原を「有している」赤血球と全く同様
、これらのリガンドのための担体として働く。他のリガ
ンドの例には、Schuurs他の再発行特許番号31
,006(その結合リガンドに関する開示に関しては、
ここでは参照にいれられる)中に記述されている特定の
結合蛋白質が含まれる。このような粒子は、米国特許番
号4,140,662(これはここでは参照にいれられ
る)中に記述されているが如き不活性な担体である。適
切な担体の粒子サイズおよび組成は、検出しようとする
結合リガンドに従って変化し、これらの例は引用文献中
に開示されている。適切なマトリックスのミクロ粒子サ
イズおよび組成もまた、選択された担体粒子および結合
リガンドに従って変化する。本明細書の実施例項は、適
切な粒子サイズおよび組成を決定するに有益な技術に関
する案内を提供している。赤血球の凝集システムを説明
したものであるが、本分野の技術者はこの方法で他のシ
ステムを最適化し得るものであることを理解するであろ
う。いくつかの具体例において、可視的に着色している
赤血球に関して得られる効果と同様に、粒子の凝集した
集塊もしくは帯を可視的に観察できるように、これらの
粒子を着色するのも好適である。
に非圧縮性のミクロ粒子から成るマトリックスを利用し
た分析システムを提供することにより、凝集分析に関す
る本分野で公知の装置および方法に関連した欠点を回避
するものである。このシステムの使用前、そして加える
べき試薬量の計算前に、上記粒子を「膨潤」させる必要
がない。これらの粒子は、本分野で公知の他のマトリッ
クスに比べて無孔性であり、従って、加えるべきいかな
る試薬の量も大きく吸収することなく、これにより、こ
の試薬の多くを反応に利用できるようにさせる。また、
粒子サイズの変化が最小限であるため、多くの細かい破
損が生じない。驚くべきことに、遠心分離を用いて該マ
トリックスを通してそれらの反応体を移動させるとき、
本発明の分析システムは遠心分離時間を短縮させる。
試薬を必要とさせ、従って極めてコスト効果の高い分析
システムをもたらす。更に、このシステムは、より長期
の貯蔵安定性および輸送容量に関する追加的利点を与え
る。例えば、輸送もしくは貯蔵段階でこの装置が転倒し
たとしても、このマトリックスは、軽くたたくことで、
容易にその支持部材内の正確な位置に戻すことができる
。また、本発明のマトリックスの入っているこれらの装
置は、安定性の問題を生じさせることなく、冷凍状態、
15℃、もしくは室温で保存できる。
るものであり、それによって制限することを意図したも
のではない。
い赤血球がカラムを通って通過する一方、凝集した赤血
球がそのカラムの上部もしくはその中に捕捉される物質
の選択を示すものである。次の実験を行うための一般的
方法は下記の通りである: 1. 試験管の如き容器に粒子を入れる;2. 抗
体を含んでいる試薬と一緒に試験下の赤血球を混合した
後、粒子から成るマトリックス上に堆積させる; 3. 水平に容器を回転させることができる遠心分離
器中でこれらの管を遠心する; 4. 凝集/非凝集に関してこれらの管を観察する。
ミクロセルロース(Whatman Microsel
lulose DE32、DE52、QA52、SE5
2(接頭語は異なる充填を示している))を用いて、小
型のプラスチック製管を製造した。(容積は充填された
容積であり、燐酸塩緩衝食塩水(PBS)中で製造した
スラリーから得られた) 結果: DE32/細胞は通過せず DE52/いくつかの細胞は管の上1/2中にあり、他
のものは底に通過。
た後、IgGコートした細胞(Ortho Coomb
s Control CellTM、例えばOCC)を
加えた。
nTM)。
ケイ素粒子、およびDowの0.8μポリスチレンラテ
ックス粒子。
過しなかった。
0〜150uの粒子床を通して遠心分離できる。
追加的粒子: セルロースの粒子サイズは赤血球(7.0μ)よりもず
っと大きい(〜100〜150μ)。
1 − 繊維状セルロース粉末 2. セ
ルロースWhatman C F31 − ミクロ
顆粒 3. 酸洗浄ガラス製ビード
− 150μ未満
−
150−212μ
− 425−600μ操作 (1) Ortho Bioclone 抗ATMロ
ット番号BAA 1100中に粒子を懸濁する。
。
ースが上部に粘着。
セルロースを再び底に遠心分離する。
後、液体を加える。
nTM A血球もしくはB血球を加える。
Sorvall GLC−1のミクロタイタープレート
担体)中で遠心分離し、短期間900RPMで、B血球
が底に到達する時間を測定する。
プラス1分 プラス1分 プラス5分
− +
− + − +
− +
− セルロース 1 T T 1/
2 T 1/2 T 1
/2 Tセルロース 2 T T
T T T T
1/10 Tビード(S) 3 部分
T B T B
T B Tビード(M) 4
部分 T B T B
T B Tビード(M) 5
部分 T B T
B T B TT=上部の血
球 B=底部の血球 部もしくは画分は底部の血球を表す。
、約30〜90秒間の、A型血球の回転時間に関してう
まく働いた。
ombs Control CellTM (OCC)
)およびコートとされていない細胞(Affirmag
enTMA細胞)を用いて、市販の抗IgG中で大型の
ビードを試みた(425〜600μ)。
液;900rpmで1分間回転。血清からの血球の分離
は、抗グロブリンが血球を凝集させるのを可能にした。 凝集物は、ビードから成るカラム中に捕捉された。
い血球を遠心分離に通過させる一方、凝集された血球を
捕捉することを可能にする粒子の選択の継続である。2
つのセルロース粉末と3つのガラス製ビードの大きさを
試験した。これらの各々を、市販の血液型血清の抗A中
に懸濁させた。血液群AまたはBの赤血球を加えた後、
試験すべき粒子から成るカラムを通して注意深く遠心分
離した。
好適には、この試験血清により分離された指示血球を用
いて行われる、と言うのは、この血清が比較的多量のI
gG(これは試薬である抗IgGを中和する)を含有し
ているからである。IgG抗体がコートしてあることが
知られている血球を、これらの血球に対する抗体が含有
されていないことが知られているAB型の血清と混合し
た。抗体がコートされていないことが知られている血球
を対照として試験した。これらの混合物を、市販の抗I
gG試薬中のガラス製ビードから成るカラムの上部に加
えた後、遠心分離した。
該セルロース粒子を通って遠心分離された。凝集した血
球は該カラムの上部に残存していた。その陰性を示す血
球の全てが該ガラス製ビードのカラムの底部に存在して
おり、そしてその陽性を示す血球の全てがその上部に残
存していた。
ードから成るカラム中に捕捉された抗IgGにより凝集
させられた。IgG抗体がコートされていない血球は凝
集せず、そして該カラムの底部に存在していた。抗Ig
Gを使用したとき、陽性および陰性を示す実施例との間
に著しい差が見られた。
は、強い反応を与えるものとして選択された。該ガラス
製ビードは、凝集したA血球のための支持体を与え、そ
して凝集していないB血球は該カラムを通って容易に遠
心分離された。この抗体がコートされている血球は該血
清から分離され、ここで、それらは強い反応を検出させ
るに充分な程少なくとも良く懸濁された。血清は該カラ
ムの上部に残存しており、そしてその抗IgGを中和し
ない。
られる〜40メッシュのもの。 洗浄した海砂; Fisher−S25−500から
得られるロット番号901223のもの。
t 7062から得られる乾燥したロット番号7062
KED2のもの。
の各々に、試験下の5〜7mmの粒子を加える。
oclone 抗ATM、 ロット番号BAA110D
を加えた後、混合して、含まれている空気を除く。撹拌
のために用いる針がそのくずを通して壁に当たらないよ
うに、鉄くずを充填する。ある程度の空気泡がこの管の
底部に残存している。
Ortho Affirmagen抗ATM、ロット番
号A844)。抗Aに対して、A血球は陽性であり、そ
してB血球は陰性である。 4. 卓上の、頭が振れる遠心分離器中〜8分間遠心
分離する。
ることができない。試験下の試験粒子(即ち赤血球)の
色に対する背景の色として、より適切なくずを使用する
必要がある。Fisherの砂およびMallinkr
odtの砂の両方共、凝集物をその上に保持し、そして
両方の砂共、陰性の血球をその底に通過させた。
あり、陰性の反応を評価するためには優れた背景色を提
供していた。
持媒体を見つけ出すため、追加的固体状粒子をスクリー
ニングした。鉄の金属くずおよび2つの給源からの海砂
に関して、血液型血清抗Aと共にAおよびB血球を用い
て試験した。砂に関しては間接的抗グロブリン試験で試
験した。敏感性を測定するため、抗Dの2倍希釈液を用
いて試験した。
くずは試験から除いた。2つの砂の両方共、明らかに、
抗Aが入っているカラム上でA血球を捕捉し、そしてB
血球を通過させた。遠心分離およびカラムの長さを調節
した後、この抗グロブリン試験の敏感性は標準的マニュ
アル試験結果に匹敵していることが見いだされた。
ロム酸塩)洗浄した溶液中に一晩浸漬した。これらの砂
を水道水で濯いだ後、蒸留水で濯ぎ、そしてオーブンに
入れて乾燥した。その後、これらの粒子を解剖顕微鏡に
より検査した。
た端を有する粗いものであった。粒子サイズは約2mm
〜約200mmで大きく変化していた。
子を充填し、そしてさじで残りを取り除いた。外観:
平均サイズ100〜150ミクロン(中にはより小さ
いものがある);透明な石英。
isherの標本よりも丸い;半透明の表面;恐らくは
砂浜で転がったもの。
点を有する黄褐色である。Mallinkrodtは、
より少ない量の斑点を有すると共により白色である。
ルからの砂(両方共「洗浄した」と表示されている)に
対して、酸洗浄した砂を試験し、そして抗ヒト血清を用
いた予備試験を行った。この酸洗浄したものはより奇麗
に見え(他に特記すべき差はない)、そしていかなる血
球も砂と結合していないように見えた。
ト: 抗IgG 0.5%PEG、2%デキストラン870
00MW。
40μL Ortho抗体増強溶液TM(低イオン性)ロットAE
S 204−140− 40μL 10μL クーム対照血球TM K430。
に見える。底部の血球ボタン状物は、該OCC中よりも
A血球に関していくらか大きい。
enTMA血球およびOCC血球(IgGコートした)
を用いて、正常なラビットの血清(NRS)プールおよ
び正常なラビット血清のPBS希釈液中のビードに関し
て試験した。
遠心分離した後、Sorvall GLC 900
RPM中5分間遠心分離した。このマトリックスはピン
ク色に染色されたように見える。これは、非特異的粘着
によるものであろう。
nkrodtの海砂が最良に見えた、と言うのは、より
少ない量の血球がこの砂に粘着していたからである。し
かしながら、この希釈していないNRS中の抗体により
、血球が凝集する。
1%ゼラチン、 中で試験したMallinkrodt砂抗IgG40μ
L血清 対照
血清OAES40μLの
OAES 10μL血球OAES
5μL血球 − +
血清なし 細胞 OCC
+ −
+ −
OCC 細胞
OCC 細胞明確な差が+と−との間に
観察された。2番目の2組を、Sorvall GLC
中1000RPMで5分間遠心分離した。
。この2番目の2つは次のようにセットした: 10mmのカラム GLC2000RPMで5分間回転 前と同じく抗IgG、血球OCC(+)およびA(−)
番号1対照 番号2試験40μL血
清 10μL血球 40μLのOAES10
μL血球 結果:陽性は凝集され、そして陰性は遠心分離された。 このことは、このシステムから血清が分離でき、そして
陽性の反応が得られることを示している。
したように、下記の如き希釈: 1/100 1/100 1/1000 1/2
000 1/4000 0試験結果は、通常の抗ヒ
トグロブリンマニュアル試験(間接クーム)に匹敵して
いる。1/1000は明確な陽性反応であり;1/20
00はこの管の底部に凝集が生じているように見え;1
/4000は若干凝集しており;そして陰性は、この管
の底部に丸くなったボタン状物の血球を有する。
血球分離SystemR中で用いられているデキストラ
ンアルブミン溶液の如き高密度溶液が、該カラム凝集抗
グロブリン試験を改良するか否かを決定することであっ
た。抗IgGは、添加したSimwashR溶液および
アルブミン中で希釈された。IgGがコートされている
血球を加え、そしてコートされていない血球を対照とし
て用いた。
された。コートされていない血球のいくつかがそのガラ
ス製ビードと結合している。
り良好な分離を与え、特にクームス・テストを実施する
に有益である。
りである。
るマトリックス(このマトリックスは、凝集していない
反応体の移動を可能にするが、凝集している反応体の有
意な移動は可能にしない)から成り、上記マトリックス
が、上記凝集体の観察を可能にするに充分な配置および
量で装置内に配置されている、凝集体を捕捉するための
装置。
な中空支持部材; b) 上記入り口に対してサンプルを受け取る関係に
ある、上記支持部材内に配置された第一結合反応ゾーン
;c) マトリックスが、凝集していない反応体の移
動を可能にするが、凝集している反応体の有意な移動は
可能にしないところの、本質的に非圧縮性のミクロ粒子
のマトリックスから成る、上記第一ゾーンに対してサン
プルを受け取る関係にある第二凝集検出ゾーン;から成
る、抗体もしくは抗原の存在を検出するための装置。
る前記2項の装置。
との間に位置している初期サンプル受け取りゾーンを更
に含む前記2項の装置。
る上記中空支持部材の形が円錐形であり、そしてそれが
、上記初期サンプル受け取りゾーンを取り巻いている上
記中空支持部材の一部と連結している前記4項の装置。
る上記中空支持部材と、上記初期サンプル受け取りゾー
ンを取り巻いている中空支持部材と、の連結部が、上記
入り口で限定されている開口よりも小さい開口を限定し
ている前記5項の装置。
50ミクロメートルの範囲にある前記1項の装置。
リスチレン製ビード、二酸化ケイ素の粒子、およびセル
ロースの粒子から本質的に成る群から選択される前記7
項の装置。
る前記8項の装置。
ードである前記8項の装置。
子である前記8項の装置。
前記11項の装置。
である前記8項の装置。
れている前記1項の装置。
14項の装置。
記15項の装置。
液を更に含む前記16項の装置。
る可能性のあるサンプルを、上記結合リガンドのための
相当する結合相手を含有している試薬と接触させ;(b
) マトリックスが、凝集していない反応体の移動を
可能にするが、凝集している反応体の有意な移動は可能
にしない、本質的に非圧縮性のミクロ粒子のマトリック
スから成る装置に、上記サンプルを加え;そして(c)
このマトリックスの上部もしくはその中で、凝集物
の存在の有無を検出する; の段階から成る、リガンドの結合を検出する方法。
粒子から成るマトリックス(このマトリックスは、凝集
していない反応体の移動を可能にするが、凝集している
反応体の有意な移動は可能にしない、そして上記マトリ
ックスが、非凝集もしくは凝集した反応体の観察を可能
にするに充分な配置および量で配置されている)に、抗
体もしくは抗原検出用試薬、そして抗体もしくは抗原が
入っている可能性のある液状サンプルを加え;b)
上記マトリックスに力を加えて、それを通して上記検出
用試薬および上記サンプルを移動させ;そしてc)
上記マトリックスの上部もしくはその中で、凝集した反
応体の存在の有無を検出する; の段階から成る、抗体もしくは抗原の存在を検出する方
法。
もしくはそれに対する抗体である前記19項の方法。
材{この部材の中には、第一結合反応ゾーン、およびそ
れに対して液体を受け取る関係にある第二凝集検出ゾー
ン[この第二ゾーンは、本質的に非圧縮性のミクロ粒子
から成るマトリックス(マトリックスは、凝集していな
い赤色血液細胞の移動を可能にするが、凝集している赤
色液体細胞の有意な移動は可能にしない)を含有してい
る]が配置されている}の入り口に、抗体もしくは抗原
を検出するための試薬、そして抗体もしくは抗原が入っ
ている可能性がある液状サンプルを加え;b) 上記
部材を遠心分離し;そしてc) 上記マトリックスの
上部もしくはその中で、凝集した赤色血液細胞の存在の
有無を検出する;の段階から成る、血液型の抗体もしく
は抗原の存在を検出するための方法。
ゾーンに近い該凝集検出ゾーンの領域にある上記マトリ
ックス内に帯が形成されることによって示される前記2
1項の方法。
Claims (4)
- 【請求項1】 本質的に非圧縮性のミクロ粒子から成
るマトリックス(このマトリックスは、凝集していない
反応体の移動を可能にするが、凝集している反応体の有
意な移動は可能にしない)から成り、上記マトリックス
が、上記凝集体の観察を可能にするに充分な配置および
量で装置内に配置されている、凝集体を捕捉するための
装置。 - 【請求項2】a) 入り口を有する本質的に透明な中
空支持部材; b) 上記入り口に対してサンプルを受け取る関係に
ある、上記支持部材内に配置された第一結合反応ゾーン
;c) マトリックスが、凝集していない反応体の移
動を可能にするが、凝集している反応体の有意な移動は
可能にしないところの、本質的に非圧縮性のミクロ粒子
のマトリックスから成る、上記第一ゾーンに対してサン
プルを受け取る関係にある第二凝集検出ゾーン;から成
る、抗体もしくは抗原の存在を検出するための装置。 - 【請求項3】(a) 結合リガンドが入っている可能
性のあるサンプルを、上記結合リガンドのための相当す
る結合相手を含有している試薬と接触させ;(b)
マトリックスが、凝集していない反応体の移動を可能に
するが、凝集している反応体の有意な移動は可能にしな
い、本質的に非圧縮性のミクロ粒子のマトリックスから
成る装置に、上記サンプルを加え;そして(c) こ
のマトリックスの上部もしくはその中で、凝集物の存在
の有無を検出する; の段階から成る、リガンドの結合を検出する方法。 - 【請求項4】a) 本質的に非圧縮性のミクロ粒子か
ら成るマトリックス(このマトリックスは、凝集してい
ない反応体の移動を可能にするが、凝集している反応体
の有意な移動は可能にしない、そして上記マトリックス
が、非凝集もしくは凝集した反応体の観察を可能にする
に充分な配置および量で配置されている)に、抗体もし
くは抗原検出用試薬、そして抗体もしくは抗原が入って
いる可能性のある液状サンプルを加え;b) 上記マ
トリックスに力を加えて、それを通して上記検出用試薬
および上記サンプルを移動させ;そしてc) 上記マ
トリックスの上部もしくはその中で、凝集した反応体の
存在の有無を検出する; の段階から成る、抗体もしくは抗原の存在を検出する方
法。
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