DE10061515A1

DE10061515A1 - Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung

Info

Publication number: DE10061515A1
Application number: DE10061515A
Authority: DE
Original assignee: Deutsches Rotes Kreuz Blutspendendienst Baden-Wurt Gemeinnu GmbH
Current assignee: DRK Blutspendedienst Baden Wuerttermberg Hessen gGmbH
Priority date: 1999-12-09
Filing date: 2000-12-11
Publication date: 2001-06-21

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei das Antigen bzw. der Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern, den entsprechenden spezifischen Bindungs partnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung von Mikrotiterplatten mit sich verjüngendem bzw. bombierten Boden zur Durchführung eines Tests zum Nachweis von Anti körpern oder Antigenen durch Detektion einer Agglutinationsreaktion sowie zur Blutgruppenbestimmung.

Stand der Technik

Menschliche Blutgruppensubstanzen, aber auch eine Vielzahl von anderen in einem Organismus gebildeten Substanzen, werden durch spezifische Antigen- Antikörper-Reaktionen nachgewiesen. Diese Reaktion ist detektierbar über eine Vernetzung, Agglutination, von Antigenen (Ag), Antikörpern (Ak) und bestimm ten Trägersubstanzen, die Antigene oder Antikörper tragen, zu einem makros kopisch erfaßbaren Komplex, dem Agglutinat.

Beispiele sind die erythrozytenseitige Blutgruppenbestimmung sowie die Serumgegenprobe. Bei der erstgenannten werden an die Membran des Spender erythrozyten gebundene Blutgruppen-Antigene durch Reaktion mit Antiseren nachgewiesen, die Antikörper als spezifische Bindungspartner enthalten. Die Antikörper sind bekannt (Such-Antikörper), die sich in einer Testflüssigkeit befinden, zum Beispiel Testantikörper-Aufschwemmung, und die unbekannte Erythrozyten (unbekannte Antigene) enthält. Die Agglutination wird unter geeigneten Reaktionsbedingungen durch Reaktion von Antigen und Antikörper hervorgerufen. Damit kann das System ABO und RH und darüber hinaus noch eine Vielzahl von Antigenen bestimmt werden.

Bei der Serumgegenprobe sind die Erythrozyten bekannt, die bekannte Antigene (Such-Antigene) aufweisen. Die Testflüssigkeit, zum Beispiel Serum, beinhaltet die unbekannten körpereigenen Antikörper (sog. Isoagglutinine), die durch Reaktion mit den Test-Erythrozyten nachgewiesen werden. Damit kann ebenfalls die Blutgruppe, jedoch nur ABO, bestimmt werden.

Zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern sind aus der EP 0305337 B1 Verfahren bekannt, die positive bzw. negative Antigen-Antikörper-Reaktionen in einem Reaktionsgefäß optisch sichtbar machen. In einem transparenten Mikroreaktiongefäß, welches eine Dispersion oder Suspension inerter Partikel in Form sogenannter Beads, zum Beispiel Agarose, und die bekannten, für die nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper spezifischen Bindungspartner enthält, wird eine vorbestimmte Menge einer Testflüssigkeit trägergebundener Komplexe zugefügt, die nachzuweisende Antigene bzw. Antikörper an Träger gebunden enthält. Anschließend wird die Mischung zur Sedimentation einem Zentrifugierschritt ausgesetzt; die Sichtbarmachung einer Reaktion ist nur über einen solchen Zentrifugierschritt möglich. Durch normale Gravitation wird eine Sedimentation zum tiefsten Punkt des Gefäßes hin nicht erreicht.

Bei der Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes lagert sich dieser im stark positiven Fall auf den inerten Partikel auf und ist im schwach positiven Fall innerhalb der inerten Partikel vorhanden; bei Abwesenheit eines Antigen- Antikörper-Komplexes, d. h. im negativen Fall, liegt das Sediment unter den inerten Partikeln. Das Verfahren wird in einem einzigen länglich-schmalen Mikroreaktionsgefäß durchgeführt, welches aus drei Abschnitten besteht, nämlich einem oberen, einem mittleren und einem unteren Abschnitt, wobei der obere und der untere Abschnitt zylindrisch gestaltet sind und der obere Abschnitt einen größeren Durchmesser als der untere Abschnitt aufweist. Der mittlere Abschnitt ist konisch gestaltet und verbindet die beiden benachbarten Abschnitte miteinander; eine. Mehrzahl solcher Gefäße kann parallel in Form einer Karte angeordnet sein und als handliche Einheit Verwendung finden.

Das Gefäß wird zentrifugiert und danach der Ort optisch ermittelt, an dem sich die Träger ansammeln. Sammeln sich diese oberhalb der inerten Partikelschicht an, so weist dies auf eine stark positive Antigen-Antikörper-Reaktion hin: Die zu einem Agglutinat vernetzten Träger werden durch die Partikel daran gehindert, gemäß der Zentrifugalkräfte zum Boden des Gefäßes durchzudringen. Bei nega tiver Antigen-Antikörper-Reaktion dringen dagegen die nicht vernetzten Träger zum Gefäßboden vor. Anschließend können die Agglutinationsreaktionen identifiziert werden, indem das Reaktionsgefäß von der Seite betrachtet und die Lage der Träger optisch erfaßt wird.

Problematisch bei diesem Verfahren ist die Erfassung der schwachen Antigen- Antikörper-Reaktionen, bei denen eine ungleichmässige, flockige Verteilung von Agglutinat über die Füllhöhe der Partikel beobachtet wird. Diese Reaktionen lassen sich daher nicht zuverlässig automatisch erfassen. Nachteilig ist auch die Kartenform, in der die Gefäße angeordnet sind und die immer nur sechs Untersuchungen zuläßt. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass nur von der Seite eine Ablesung erfolgen kann.

Technische Aufgabe

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Vermeidung der Nachteile des Standes der Technik ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern oder Antigenen sowie zur Blutgruppenbestimmung anzugeben, welches einfach durchführbar und leicht automatisierbar ist und insbesondere zu höchst zuverlässigen Testergebnissen führt.

Offenbarung der Erfindung sowie deren Vorteile

Die Aufgabe wird bei einem Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testflüssigkeit bzw. einem Testgemisch sowie zur Blutgrup penbestimmung durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bin dungspartner, wobei das Antigen bzw. der Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern, den ent sprechenden spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, dadurch gelöst, dass ein Mikroreaktionsgefäß mit einem sich wenigstens im Bodenbereich von oben nach unten verjüngendem bzw. bombierten Querschnitt verwendet wird, welches im Bereich der sich verjüngenden bzw. bombierten Wandung mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, kodiert wird; eine Substanz in Form von feinen Kügelchen, soge nannten Beads, in das Mikroreaktionsgefäß gefüllt wird; ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Testflüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird; das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird, wobei ein flächiges Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern, Bindungspartnern und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion, hingegen eine räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von Trägern auf eine negative Reaktion Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.

Statt der Kodierung der Wandung des Mikroreaktionsgefäßes können auch die Beads kodiert sein, indem eine Substanz in Farm von feinen Kügelchen, sogenannten Beads, mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, Anti IgG, kodiert wird; ein Mikroreak tionsgefäß mit einem sich wenigstens im Bodenbereich von oben nach unten verjüngendem bzw. bombierten Querschnitt verwendet wird, in welches die kodierten Beads mindestens im Bereich der sich verjüngenden Wandung gefüllt werden; ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Test flüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird; das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird, wobei ein flächiges Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern, Bindungspartnern und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion, hingegen eine räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von Trägern auf eine negative Reaktion Antigen/ Antikörper-Komplex hinweist.

Somit können zur Kodierung Proteine A und/oder G, Antikörper, Such- Antikörper, bekannte Antikörper, Anti IgM oder Anti IgG, genommen werden. Vorteilhaft kann entweder die Wandung des Mikroreaktionsgefäßes - und hier insbesondere der schräge Wandungsteil im Bodenbereich - oder es können die Beads kodiert werden, wie auch die Kodiersubstanzen den Beads zugemischt werden können. Ebenso ist es möglich, sowohl die Wandung des Mikroreak tionsgefäßes als auch die Beads mit derartigen Fangstoffen zu kodieren.

Eine vorteilhafte Ausgestaltung des Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in einem oben offenen und am Boden geschlossenen Mik roreaktionsgefäß durchgeführt wird, das wenigstens in seinem bodennahen Bereich einen sich verjüngenden oder bombierten Querschnitt aufweist, so dass das Gefäß wenigstens in seinem bodennahen Bereich wenigstens teilweise eine schräge bzw. gekrümmte Wandung besitzt, die in den Boden übergeht bzw. den Boden bildet, mindestens in diesen bodennahen Bereich mit schräger bzw. gekrümmter Wandung des Gefäßes die Beads eingefüllt sind; das vorbestimmte Volumen der Testflüssigkeit in das Gefäß auf die Beads aufgegeben wird; das Mikroreaktionsgefäß zentrifugiert wird, bis sich in der Grenzschicht zwischen der schrägen Wandung des Mikroreaktionsgefäßes und der homogenen Schicht aus der Substanz das sichtbare Sediment/Agglutinat ausbildet, wobei eine auf der schrägen Wandung des Gefäßes in der Grenzschicht sich flächig ausbildende Agglutinatschicht auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion hinweist und ein insbesondere im Bereich des tiefsten Punktes des Bodens bzw. der schrägen Wandung des Gefäßes sich bildende, räumlich geringfügig ausgedehnte Abla gerung auf eine negative Reaktion ohne Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt insbesondere darin, dass eine Mehrzahl von Mikroreaktionsgefäßen in eine bekannte, handelsübliche Mikrotiterplatte integriert sind, so dass über die Mikrotiterplatte gleichzeitig soviel Untersuchungen erfolgen können, wie diese Mikroreaktionsgefäße auf weist. Ebenso ist die Ablesung des Ergebnisses von oben oder unten möglich. Diese Vorteile ermöglichen insbesondere auch die automatisierte Ablesung und die Automatisierung des Verfahrens.

Wenn die Wandung des Mikroreaktionsgefäßes kodiert ist, so findet die Reaktion zwischen Beads und Wandung in der Grenzschicht statt. Wenn hingegen die Beads kodiert sind oder die Antikörper in die Beads eingemischt sind, findet die Reaktion, Komplexbildung, zwischen den Beads oder oberhalb derselben statt. Sind sowohl Wandung als auch Beads kodiert oder die Antikörper in die Beads eingemischt, so findet die Reaktion sowohl zwischen den Beads und der Wandung in der Grenzschicht zwischen den Beads oder oberhalb derselben statt.

In weiterer vorteilhafter Ausgestaltung des Verfahrens wird die Analyse, ob in einem Mikroreaktionsgefäß eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, anhand des Sedimentationsbildes optisch durch eine Bedienperson oder automatisch mittels eines Photometers oder mittels einer Video- oder CCD- Kamera vorgenommen. Die Analyse, ob in einem Mikroreaktionsgefäß eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, erfolgt ebenso photometrisch, indem die Absorption des in der Vertiefung enthaltenen Gemischs entlang einer vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet und das so ermittelte örtliche Absorptionsprofil ausgewertet wird. Des Weiteren wird verfahrensgemäß für eine feste Profilbreite die Profillänge ermittelt und eine positive bzw. negative Reaktion dann diagnostiziert, wenn die Profillänge unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmten Wertes liegt.

Die Substanz besteht aus Beads zum Beispiel ein geeignetes Gel in Form feinster Kügelchen, die Beads können aber auch inerte Glaskügelchen oder Plastikkügelchen sein. Derartige Gel-Beads sind in handelsüblicher Form erhältlich, beispielsweise Agarosebeads.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zur Durchführung einer Serumgegen probe, die Isoagglutinine beinhaltet, oder zum Nachweis von irregulären Blut gruppenantikörpern (Antikörper-Suchtest) oder zur erythrozytenseitigen Blut gruppenbestimmung mittels bekannter Antikörper dient, dann enthält die Testflüssigkeit Blutserum mit unbekannten Antikörpern oder unbekannte Erythrozyten. Der Testflüssigkeit oder der Substanz aus Beads wird eine Flüssigkeit zugefügt, die Testerythrozyten oder Testantikörper einer bekannten Blutgruppe enthält. Im speziellen Fall, zum Beispiel für die Serumgegenprobe, sind die Träger mit spezifischen Bindungspartner-Antigenen bekannter Blut gruppe besetzt, die den nachzuweisenden Antikörper (Isoagglutinin) nachweisen. Bei Blutgruppenantikörpern (Antikörper-Suchtest) sind es ebenfalls spezifische Bindungspartner-Antigene, die auf den Erythrozyten sitzen. Diese zeigen dann den irregulären Antikörper an. Bei erythrozytenseitiger Blutgruppenbe stimmung ist das Trägerantigen nicht bekannt, sondern in der Testflüssigkeit oder in der Substanz befindet sich der bekannte Suchantikörper.

Einer der Flüssigkeiten bzw. dem Gemisch oder den Beads können zum Zeitpunkt der Untersuchung Proteine, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene, und/oder Antikörper (Anti-IgG (Coombsserum), Anti-C3d, Anti-IgM) zugesetzt werden, was Einfluß auf die Reaktion nimmt. Die Träger innerhalb der Testflüssigkeit sind Erythrozyten, Leukozyten, Blutplättchen, Latex-Partikel oder Agarose-Partikel, Glaspartikel oder Kunststoffpartikel.

In vorteilhafter Weise kann somit das erfindungsgemäße Verfahren zur erythro zytenseitigen Blutgruppenbestimmung, zur Bestimmung von irregulären Antikörpern und zur Serumgegenprobe eingesetzt werden.

Die Querschnittsfläche des Gefäßes kann im Bereich der Füllhöhe der Substanz wenigstens das Vierfache der Querschnittsfläche des Gefäßes im Bereich unterhalb der Substanz betragen. Es werden Spitzboden- oder Rundboden- Mikrotiterplatten oder Mikrotiterplatten, deren Boden bombiert ist, verwendet, wobei das Mikroreaktionsgefäß eine Vertiefung einer Spitzboden- oder Rundboden-Mikrotiterplatte sein kann.

Die Schicht aus den Beads sowie der Zentrifugierschritt haben die Aufgabe, eine infolge Antigen-Antikörper-Reaktion erfolgte Agglutination der Antigen- und/oder Antikörperträger, d. h. die vernetzten Antigen- und/oder Antikörperträger, durch die Beads zu drücken und in Form einer flächigen Schicht ("Teppich" bzw. "Rasen") im Bereich der V-Vertiefung oder bombierten Vertiefung sichtbar zu machen und zu halten. Dagegen wandern unvernetzte Träger beim Zentrifugieren an der schrägen Wandung entlang und sammeln sich vorzugsweise (weil das Gefäß sich verjüngt) an dem tiefsten Teil des Gefäßbodens unter Ausbildung eines räumlich erheblich weniger ausgedehnten, im Idealfall punktförmigen, optisch erfaßbaren Gebildes ("Knopf") an.

Des Weiteren besitzt das Verfahren den Vorteil, dass als Mikroreaktionsgefäße herkömmliche Mikrotiter-Wegwerfplatten mit V-förmiger oder bombierter Vertiefung zum Einsatz kommen können, die kostengünstig und mit einem Pippettierroboter leicht zu handhaben sind. Diese müssen zur Durchführung des Verfahrens erfindungsgemäß kodiert werden; oder es werden die Beads kodiert und anschließend in die Mikroreaktionsgefäße eingefüllt.

Die Auswertung erfolgt entweder mit dem bloßen Auge oder insbesondere vollautomatisch mit einer Video- oder CCD-Kamera durch Aufsicht bzw. Unteransicht oder Seitenansicht auf das Gefäß. Denkbar ist auch eine photometrische Auswertung.

Die Träger, an welche die nachzuweisenden Antigene bzw. Antikörper oder die spezifischen Bindungspartner gebunden sind, sind vorzugsweise Erythrozyten, Leukozyten, Blutplättchen oder Latex-Partikel. Die Latex-Partikel können zur einfacheren optischen Auswertung sichtbar gefärbt oder fluoreszenz-markiert sein. Die Konzentration der Träger in der Reaktionsflüssigkeit ist so zu wählen, dass das Agglutinat mit der gewählten optischen Detektionsmethode zuver lässig detektierbar ist.

Erfindungsgemäß wird das Sedimentationsbild optisch durch Aufsicht von oben oder unten auf das Reaktionsgefäß oder auch seitlich ausgewertet. Falls von unten oder seitlich gemessen wird, muß das Mikroreaktionsgefäß transparent sein. Es ist vorzugsweise auch transparent, falls von oben ausgewertet wird, um den Kontrast der Träger zum Hintergrund zu erhöhen. Durch die unterschiedlichen Gefäßquerschnitte im oberen Bereich der Substanz und in deren unterem Bereich bzw. im Bereich des Gefäßbodens wird im Falle einer Agglutination in der Grenzschicht ein flächiger "Teppich" bzw. "Rasen" aus vernetzen Trägern erzeugt, während sich die Träger in einem in der Aufsicht kleineren Bereich ansammeln, wenn keine Agglutination erfolgt. Die Antigen- Antikörper-Reaktion kann somit optisch sehr einfach detektiert werden durch Messung der räumlichen Ausdehnung der Ansammlung der Träger. Das Sedimentationsbild kann visuell durch eine Bedienperson oder automatisch auf photometrischem, flurometrischem Weg oder videogesteuert analysiert werden. Da die Trägeransammlung im wesentlichen von oben oder unten vermessen wird, ist eine besonders gute Automatisierbarkeit des Verfahrens gegeben. Ins besondere Mikrotiterplatten mit einer Mehrzahl von Mikroreaktionsgefäßen, die in einer Ebene angeordnet sind, lassen sich in Aufsicht von oben oder unten auf die Platte besonders gut in einem Arbeitsgang auswerten.

Die Deutlichkeit des sichtbaren bzw. detektierbaren Reaktionsergebnisses hängt unter anderem von der gewählten Gefäßform ab. Daher ist das Gefäß, zumindest im Bereich der Schicht aus der Kügelchen-Substanz, sich konisch verjüngend ausgebildet und besitzt eine sich verjüngend verlaufende oder schräg umlaufende bzw. konische bzw. bombierte Wandung, z. B. eine V-Vertiefung einer Spitzboden-Mikrotiterplatte oder eine bombierte, gerundete Vertiefung einer Rundboden-Mikrotiterplatte, die in ihrem unteren Bereich eine schräge Wandung aufweist, wobei die Schräge im Schnitt eine schiefe Ebene oder auch eine gekrümmte Kurve sein kann. Gute Ergebnisse werden allgemein erzielt, wenn die Querschnittsfläche des Gefäßes im Bereich der Füllhöhe der Kügel chen-Substanz wenigstens das Vierfache der Querschnittsfläche des Gefäßes im Bereich unterhalb der Substanz beträgt.

Vorzugsweise erfolgt die Analyse, ob in einem Mikroreaktionsgefäß eine Antikörper-Antigen-Reaktion stattgefunden hat, photometrisch, indem die Absorption des in der Vertiefung enthaltenen Gemischs entlang einer vorbestimmten Linie gemessen und aufgezeichnet und das so ermittelte örtliche Absorptionsprofil ausgewertet wird. Diese Auswertemethode ist gut für die Auswertung einer Vielzahl von Proben, z. B. einer Mikrotiterplatte, in einem Arbeitsgang und damit in einer automatisierten Farm des Verfahrens geeignet. Indem nur ein Absorptionsprofil gemessen wird, ist die zu speichernde und auszuwertende Datenmenge gegenüber beispielsweise Videoauswertung verringert. Vorzugsweise wird dabei für eine feste Profilbreite die Profillänge ermittelt. Eine positive bzw. negative Reaktion wird dann diagnostiziert, wenn die Profillänge unterhalb bzw. oberhalb eines vorbestimmten Wertes liegt. Diese Auswertemethode hat sich als besonders zuverlässig erwiesen.

Das Bild der Reaktionsgefäße kann alternativ mittels einer Video- oder CCD- Kamera oder dergleichen aufgezeichnet werden. Durch Bildanalyse können positive von negativen Reaktionen unterschieden werden. Eine weitere Möglich keit zur Erfassung der Reaktionsbilder ist die Fluoreszenzmarkierung der Träger und Detektion der räumlichen Emission von Fluoreszenzlicht.

Kurzbeschreibung der Zeichnung, in der zeigen:

Fig. 1 einen stark schematisierten Längsschnitt durch den Bodenbereich eines Mikroreaktionsgefäßes, dessen Boden mit Fangstoffen kodiert ist und welches mit Beads gefüllt ist und

Fig. 2 ein weiteres Mikroreaktionsgefäß, bei dem die Beads mit den Fangstoffen kodiert sind, der Boden hingegen nicht.

Die Zeichnung zeigt in beiden Figuren stark schematisch vereinfacht darge stellte Reaktionsgefäße im Längsschnitt, die Vertiefungen in Spitzboden-Mikro titerplatten sind.

Fig. 1 zeigt schematisch ein Reaktionsgefäß 1 bzw. Mikroreaktionsgefäß im Längsschnitt, welches z. B. Vertiefungen in Spitzboden-Mikrotiterplatten sind. Die Mikroreaktionsgefäße 1 sind im oberen Bereich zylinderförmig und verjüngen sich im unteren Bereich konisch. Sie enthalten bis zu einer bestimmten Füllhöhe eine Substanz in Form von feinsten Kügelchen oder Beads 2, insbesondere Beads aus einem Gel. Die Beads- oder Kügelchen-Schicht sollte wenigstens so dick sein, dass die Wandung des Gefäßes im sich verjüngenden Bereich bedeckt ist. Die dargestellten Größenverhältnisse sind nur stark schematisch darge stellt; der Durchmesser der Kügelchen ist erheblich kleiner als der mittlere Durchmesser der Erythrozyten.

Vor dem Einfüllen der Beads werden die Mikrotiterplatten kodiert. Mit der Be zugsziffer 3 sind derartige Fangstoffe bezeichnet, bei denen es sich um Proteine, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper handelt.

Auf die Beads wird ein bestimmtes Volumen der Testflüssigkeit 4 aufgebracht, welche Träger, Antigene und/oder Antikörper 5 enthält. Die Träger, die zum Nachweis einer Antigen-Antikörper-Reaktion optisch detektiert werden, sind hier stark übertrieben als Kreuze dargestellt.

Fig. 2 zeigt schematisch ein Reaktionsgefäße 6 im Längsschnitt, welches z. B. Vertiefungen in Spitzboden-Mikrotiterplatten sind. Hier sind die Beads 7 mit den Fangstoffen 8 kodiert: auf die Beads 7 ist wiederum die Testflüssigkeit 9 gefüllt, welche die Träger 10 enthält.

Bei negativer Reaktion, also nichtagglutinierend, wandern die Träger auf Grund der Zentrifugation auf den V-förmigen Boden des Gefäßes und wandern (sedimentieren) weiter auf dem Boden in der Grenzschicht zur tiefsten Stelle des Mikroreaktionsgefäßes. Der Zentrifugalkraft folgend sammeln sich die nicht agglutinierten Träger am tiefsten Punkt des Gefäßes zu einem räumlich eng umgrenzten Gebilde an, dass optisch leicht zu identifizieren und von den flächigen Agglutinaten gut zu unterscheiden ist.

Bei einer positiven Reaktion werden die Erythrozyten mit den gebundenen Antikörpern auf Grund des größeren Gewichts beim Zentrifugieren durch die Beads-Schicht durchgedrückt. Die freien Antikörper sind hingegen leichter und bleiben oben liegen oder oben schwimmend in der Flüssigkeit zurück.

Zum Antikörper-Suchtest inkubieren die bekannten Suchzellen 15 Minuten bei ca. 37 Grad C mit dem zu untersuchenden Patientenserum. Dieses Gemisch schwimmt auf den Beads. Oder dieses Gemisch wird extra inkubiert und wird erst unmittelbar vor dem Zentrifugationsschritt oder auch dem Schüttelschritt zugefügt. Dabei erfolgt eine Beladung mit inkompletten Antikörpern IgG. Durch die folgende Zentrifugation werden die beladenen Suchzellen zwischen den Beads auf die Plastikwandung zu durchgedrückt. Dort kommt es aufgrund der Kodie rung zu einer Brückenbildung der kodierten Anti-IgG mit IgG auf Erythrozyten, was sich als Rasen ausbildet. Die freien Antikörper und das Serum bleiben hingegen an der Oberfläche, was als Siebeffekt zu bezeichnen ist.

Im Folgenden ist die Verfahrensweise zur Herstellung von kodierten Mikrotiterplatten, die nicht gewaschen zu werden brauchen, beispielsweise von Gel-Coombsplatten, beschrieben:

Herstellung der Gel-Coombplatten a: Mit Anti IgG

Es werden Spitzbodenplatten mit hoher Bindungskapazität genommen [Firma Greiner ELISA-Platte, 96 85 × 127 V Material Microlon 600 (Binding capacity: 600 ng IgG/cm.cm)]. Zur Beschichtung wird 1 ml Anti IgG Hase (Fa. Ortho) + 19 ml Carbonat-Bicarbonate Puffer ph 9,6 (Fa. Sigma) genommen. Dies ent spricht einer Verdünnung von 1 : 20; pro Mikroreaktionsgefäß wird 50 µl (Mikroliter) in die Platte einpippetiert und diese abgedeckt. Die Platte muss bei Raumtemperatur im Dunkeln ca. 17 Stunden inkubieren. Anschließend wird die Platte mit 150 µl PBS Puffer Saline PH7,1 (Fa. Life Technologies) 3mal gewaschen und im Dunkeln bei Zimmertemperatur getrocknet.

b: Mit Protein A und G (Firma Sigma)

Mit diesen Proteinen werden sämtliche Subklassen für IgG abgedeckt. Es werden Spitzbodenplatten mit hoher Bindungskapazität genommen [Firma Greiner ELISA-Platte, V 96 85 × 127 V Material Microlon 600 (Binding capacity: 600 ng IgG/cm.cm)]. Das Protein A und G wird im Verhältnis 1 : 2 gemischt; zum Beispiel 50 µl Protein A + 50 µl G. Dieses Gemisch wird mit 9,9 ml PPS Puffer Saline PH 7,1 gemischt, was dann einer Proteinkonzentration von 0,01 mg/ml entspricht. Davon kommt in jedes Mikroreaktionsgefäß 50 µl in die Platte, die dann abgedeckt wird. Die Platte muss bei Raumtemperatur im Dunkeln ca. 17 Stunden inkubieren. Anschließend wird die Platte mit 150 µl PBS Puffer Saline PH 7,1 l (Fa. Life Technologies) 3mal gewaschen und im Dunkeln bei Zimmertemperatur getrocknet.

Untersuchungsmaterial

Eingesetzt wird Patientenserum; die Röhrchen werden 5 Minuten bei 1789 g anzentrifugiert.

Manueller Ablauf: Es kann aber auch nur Liss als Verdünnungsmedium genommen werden. Die ca. 3% Suchzellen 1 und 2, Selectogen (Ortho Molta) werden mit 1 Teil Testerythrozyten und 2 Teile modifizierten Liss + 2 Teile modifizierte Bromelinlösung, die nur als Verstärker dient, oder auch nur mit 4 Teile Liss versetzt. Dies entspricht einer 0,6% Erythrozytenaufschwemmung. Ein Teil Patientenserum wird mit 1 Teil modifizierten Liss verdünnt.

Verfahrensweise Coombs Antibody Screening

Grenzschichttechnik bei 37 Grad C ohne Waschen mit Zentrifugieren. Es werden einmal Rundbodenplatten und Spitzbodenplatten mit hoher Bin dungskapazität (600 ng IgG/cm.cm) genommen. Die beschichteten Platten werden luftdicht abgedeckt und bei 4-8 Grad C gelagert. Die Haltbarkeit der Platten ist identisch den Elisaplatten und beträgt 6 Monate-1 Jahr.

Untersuchungsmaterial

Eingesetzt wird Patientenserum. Die Röhrchen werden 5 Minuten bei 1789 g anzentrifugiert.

Die handelsüblichen Agarosebeads, die normalerweise in der Chromatographie eingesetzt werden (Fa. ICN), werden 3mal mit Suwasol (Fa. Ortho) und einmal mit modifizierten Liss gewaschen. Anschließend werden 7,5 Teile Agarosebeads und 2,5 Teile modifiziertes Liss vermischt. Die Haltbarkeit der Lösung ist abhängig von dem Verfallsdatum des modifizierten Liss.

Manueller Ablauf

Die Suchzellen 1 und 2, Selctogen werden auf 0,6% mit modifizierten Liss aufgeschwemmt. Pro Behältnis werden 50 µl Agarosebeads in die Platte einpippetiert. Dann werden 25 µl Serum + 25 µl Suchzellen vermischt und pippetiert. Anschließend wird 15 Minuten im modifizierten Liss aufgeschwemmt und bei 37 Grad inkubiert. Die Rundbodenplatten werden am besten bei 965 g für 2 Minuten anzentrifugiert und die Spitzbodenplatten 10 Minuten bei 135 g.

Die angegebenen Mengen der Substanzen, 25 µl Serum + 25 µl Suchzellen, können auch extra während einer gewissen Zeit, zum Beispiel 15 Minuten, inkubiert und anschließend auf die Beads in der Mikrotiterplatte gegeben werden; es erfolgt anschließend der Schritt der Zentrifugation.

Gewerbliche Anwendbarkeit: Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere zum Antikörper-Suchtest, zur Serumgegenprobe, zur erythrozytenseitigen Blutgruppenbestimmung (ABO und RH-Formel), wie auch zur Kreuzprobe geeignet. Mit dem Verfahren kann jede Antigen-Antikörper-Reaktion, die über Partikel bestimmbar ist, durchgeführt werden. Das Verfahren ist insbesondere in Krankenhäusern, in medizinischen Laboratorien oder in Einrichtungen zur Blut- und Plasmagewinnung gewerblich anwendbar. Die besondere Nützlichkeit des Verfahrens liegt in der vollautomatischen Durchführbarkeit des Verfahrens.

Bezugszeichenliste

1

Gefäß

2

Beats

3

Kodierung (Anti-IgG)

4

Flüssigkeit

5

inkomplette Antikörper

6

Gefäß

7

Beets

8

Kodierung (Anti-IgG)

9

Flüssigkeit

10

inkompletter Antikörper

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei das Antigen bzw. der Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden und/oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei positiver Antigen-Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern, den entsprechenden spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß

1. 1.1. ein Mikroreaktionsgefäß mit einem sich wenigstens im Bodenbereich von oben nach unten verjüngendem bzw. bombierten Querschnitt verwendet wird, welches im Bereich der sich verjüngenden bzw. bombierten Wandung mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, kodiert wird;
2. 1.2. eine Substanz in Form von feinen Kügelchen, sogenannten Beads, in das Mikroreaktionsgefäß gefüllt wird;
3. 1.2 ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Test flüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird;
4. 1.3 das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird,

wobei ein flächiges Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern, Bindungspartnern und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion, hingegen eine räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von Trägern auf eine negative Reaktion Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.

2. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern und/oder Antigenen in einer Testflüssigkeit sowie zur Blutgruppenbestimmung durch Reaktion mit einem vorgegebenen spezifischen Bindungspartner, wobei das Antigen bzw. der Antikörper oder der spezifische Bindungspartner in der Testflüssigkeit ungebunden oder an einen Träger gebunden ist und wobei bei positiver Antigen- Antikörper-Reaktion ein Agglutinat aus nachzuweisenden Antigenen bzw. Antikörpern, den entsprechenden spezifischen Bindungspartnern und den Trägern gebildet wird, welches optisch als Sedimentationsbild detektierbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Substanz in Form von feinen Kügelchen, sogenannten Beads, mit Fangstoffen, nämlich Proteinen, wie Protein A und/oder G, und/oder Antigene und/oder Antikörper, kodiert wird;
ein Mikroreaktionsgefäß mit einem sich von oben nach unten verjüngendem Querschnitt verwendet wird, in welches die kodierten Beads mindestens im Bereich der schrägen Wandung gefüllt wird;
ein vorbestimmtes Volumen der Testflüssigkeit auf die Beads dem Gefäß zugefügt wird, wobei der spezifische Bindungspartner entweder der Test flüssigkeit oder den Beads zugesetzt ist, oder eine weitere Flüssigkeit, die den spezifischen Bindungspartner enthält, vor oder nach Zufügen der Testflüssigkeit dem Gefäß zugefügt wird;
das Mikroreaktionsgefäß einem Zentrifugierschritt ausgesetzt wird und das sich ausbildende oder ausgebildete Sediment/Agglutinat in Aufsicht von oben oder unten auf das Mikroreaktionsgefäß ausgewertet wird,
wobei ein flächiges Agglutinat (Rasenbildung) von Antigenen bzw. Antikörpern, Bindungspartnern und Trägern auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion, hingegen eine räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung (Knopfbildung) von Trägern auf eine negative Reaktion Antigen/Antikörper-Komplex hinweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass

1. 3.1 das die Reaktion in einem oben offenen und am Boden geschlossenen Mikroreaktionsgefäß durchgeführt wird, das wenigstens in seinem bodennahen Bereich einen sich verjüngenden oder bombierten Querschnitt aufweist, so dass das Gefäß wenigstens in seinem bodennahen Bereich wenigstens teilweise eine schräge oder gekrümmte Wandung besitzt, die in den Boden übergeht bzw. den Boden bildet,
2. 3.2 mindestens in diesen bodennahen Bereich mit schräger bzw. gekrümmter Wandung des Gefäßes die Beads eingefüllt sind;
3. 3.3 das vorbestimmte Volumen der Testflüssigkeit in das Gefäß auf die Beads aufgegeben wird;
4. 3.4 das Mikroreaktionsgefäß zentrifugiert wird, bis sich in der Grenzschicht zwischen der schrägen bzw. gekrümmten Wandung des Mikroreaktions gefäßes und der homogenen Schicht aus der Substanz das sichtbare Sediment/ Agglutinat ausbildet, wobei eine insbesondere auf der schrägen Wandung des Gefäßes sich flächig ausbildende Agglutinatschicht auf eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion hinweist und ein insbesondere im Bereich des tiefsten Punktes des Bodens bzw. der schrägen oder gekrümmten Wandung des Gefäßes sich bildende, räumlich geringfügig ausgedehnte Ablagerung auf eine negative Reaktion ohne Antigen/Anti körper-Komplex hinweist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse, ob in einem Mikroreaktionsgefäß eine Antikörper-Antigen- Reaktion stattgefunden hat, anhand des Sedimentationsbildes optisch durch eine Bedienperson oder automatisch mittels eines Photometers oder mittels einer Video- oder CCD-Kamera oder eines Fluormeters vorgenommen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Beads aus einem Gel bestehen.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Spitzboden- oder Rundboden-Mikrotiterplatten verwendet werden und das Mikroreaktionsgefäß eine Vertiefung einer Spitzboden- oder Rundboden- Mikrotiterplatte ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroreaktionsgefäß anstatt einem Zentrifugierschritt einem Schüttelschritt unterworfen wird.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die Wandung des Mikroreaktionsgefäßes wenigstens im Bereich des Bodens als auch die Beads mit Fangstoffen kodiert werden.