DE69127255T2

DE69127255T2 - Verfahren zur Messung von menschlichem C-Peptid

Info

Publication number: DE69127255T2
Application number: DE1991627255
Authority: DE
Inventors: Tadashi Hara; Masahide Kondo; Takahiro Kyoden
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1990-11-09
Filing date: 1991-11-08
Publication date: 1997-12-04
Anticipated expiration: 2011-11-09
Also published as: DE69127255D1; JP3044569B2; JPH04177166A; EP0484961A1; EP0484961B1

Description

Verfahren zur Messung von menschlichem C-Peptid
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung von menschlichem C-Peptid unter Verwendung von Antikörpern, die das menschliche C-Peptid spezifisch erkennen.
Menschliches C-Peptid ist ein Peptid, das aus 31 Aminosäure-Einheiten besteht und durch Abbau von Promsulin während der biologischen Synthese von Insulin erzeugt wird. Menschliches C-Peptid liegt in den Bauchspeicheldrüsen-β-Zellen in äquimolaren Mengen zu Insulin vor und wird als Reaktion auf einen Reiz ins Blut sezerniert. Dementsprechend steht die Sekretion aktiver Formen von Insulin und des C-Peptids im Zusammenhang. Durch Messung von menschlichem C-Peptid im Blut oder Urin können insulinabhängiger und insulin-unabhängiger Diabetes mellitus, Insulinom und Insulin-Autoimmunkrankheiten diagnostiziert werden. Durch Messung von Insulin im Blut läßt sich überdies die Verläßlichkeit der Diagnose erhöhen.
Als Verfahren zur Messung des C-Peptids sind Radioimmuntests (vgl. die ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichungen 52-25767, 57-37586 und 62-132172), und Enzymimmuntests (vgl. die ungeprüfte Japanische Patentveröffentlichung 1-165962) bekannt, bei denen jeweils unter Verwendung polyclonaler Antikörper ein kompetitives Verfahren genutzt wird. In Wu, C., et al., Acta Academiae Mediciniae Sinicae 11(1989), 51, ist ein Radioimmuntest zur Bestimmung von menschlichem C-Peptid unter Verwendung monoclonaler Antikörper offenbart, die entweder den N- Terminus oder den C-Terminus von menschlichem C-Peptid erkennen.
Aufgrund der Verwendung radioaktiver Isotope entstehen bei den bekannten Radioimmuntests Probleme hinsichtlich der Sicherheit der Person, die den Test durchführt, sowie der Entsorgung des lsotops und der anderen verwendeten Materialien. Weitere Probleme entstehen dadurch, daß die Verwendung des radioaktiven Stoffes eine spezielle Ausrüstung und eine spezielle Meßvorrichtung erfordert.
Die Verwendung polyclonaler Antikörper ist außerdem problematisch, weil es nicht einfach ist, Seren herzustellen, mit denen sich konstante und gleichmäßige Test-Ergebnisse erzielen lassen, und es schwierig ist, die qualität der polyclonalen Antikörper aufrechtzuerhalten. Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, die mit den herkömmlichen Verfahren verbundenen vorstehend erwähnten Probleme zu lösen und ein Verfahren zur Messung von menschlichem C-Peptid bereitzustellen, wobei das menschliche C-Peptid bei einfacher Versuchsdurchführung mit großer Genauigkeit gemessen werden kann. Die Lösung dieses technischen Problems wird durch Bereitstellung der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erreicht.
Erfindungsgemäß wird daher ein Verfahren zur Messung von menschlichem C-Peptid bereitgestellt, das folgende Schritte umfaßt: (a) Inkontaktbringen einer menschliches C-Peptid enthaltenden Probe mit einem ersten Antikörper, der menschliches C-Peptid spezifisch erkennt, und einem zweiten Antikörper, der spezifisch menschliches C-Peptid an einer Stelle erkennt, die sich von der Erkennungsstelle des ersten Antikörpers unterscheidet, (b) Abtrennung. des so produzierten Immunreaktions-Produktes von nicht umgesetzten Antikörpern und (c) Bestimmung des Immunreaktions- Produktes oder der nicht umgesetzten Antikörper.
Die vorliegende Erfindung wird nun im einzelnen beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren, d.h. das Sandwich-Verfahren, wird im folgenden beschrieben. Für den Immuntest lassen sich bei diesem Verfahren sowohl monoclonale als auch polyclonale Antikörper verwenden. Die verwendeten monoclonalen Antikörper können mit Hilfe eines bekannten Verfahrens hergestellt werden (vgl. beispielsweise G. Kohler, C. Milstein et al., Nature 256 (1975), 495). Die monoclonalen Antikörper, die in den nachstehend beschriebenen Beispielen verwendet werden, werden gemäß diesem Verfahren hergestellt. Bei den verwendeten polyclonalen Antikörpern kann es sich um ein gegen menschliches C-Peptid gerichtetes Antiserum oder ein Gemisch monoclonaler Antikörper handeln.
Der erste Antikörper, der spezifisch menschliches C-Peptid erkennt, wird vorzugsweise an einer Festphase fixiert, was nach der Immunreaktion die Abtrennung des Immunreaktions-Produktes von den nicht umgesetzten Antikörpern ermöglicht. Zur Fixierung des ersten Antikörpers an eine Festphase kann ein bekanntes Verfahren verwendet werden. Als Festphase lassen sich beispielsweise Polystyrol, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Polycarbonat, Cephalose-Partikel, Latex-Arten, Agarose, Cellulose und Polymethacrylate verwenden.
Der zweite Antikörper, der spezifisch menschliches C-Peptid erkennt, wird vorzugsweise markiert, was nach der Immunreaktion den Nachweis des Immunreaktions-Produktes oder des nicht umgesetzten zweiten Antikörpers ermöglicht. Die Verfahren zur Markierung des zweiten Antikörpers und zum Nachweis des Immunreaktions-Produktes oder des nicht umgesetzten zweiten Antikörpers unterliegen keiner besonderen Beschränkung. Die Markierung und der Nachweis können mit Hilfe bekannter Verfahren durchgeführt werden. Markierungsstoffe, die sich in der vorliegenden Erfindung verwenden lassen, unterliegen keiner besonderen Beschränkung. Als Markierungsstoff seien beispielsweise Enzyme, wie Peroxidase, β-D- Galactosidase, alkalische Phosphatase, Urease, Catalase und β-Glucuronidase, radioaktive Stoffe, wie ³H, ¹²&sup5;H und ¹³¹J, und Fluoreszenzstoffe, wie Fluorescamin, Fluorescein-isothiocyanat und Tetrarhodaminisothiocyanat (TRITC) erwähnt.
Wenn der zweite Antikörper nicht markiert wird, ist die Verwendung eines markierten dritten Antikörpers bevorzugt, der spezifisch das Immunreaktions- Produkt oder den zweiten Antikörper erkennt, was den Nachweis des Immunreaktions-Produktes oder der nicht umgesetzten Antikörper ermöglicht.
Bei der Durchführung des Sandwich-Verfahrens unter Verwendung der vorstehend erwähnten Reagenzien unterliegt die Reihenfolge des Inkontaktbringens der Reagenzien mit der Probe keiner besonderen Beschränkung. Man kann die Reagenzien entweder nacheinander mit der Probe in Kontakt bringen oder zur Durchführung der Immunreaktion die Probe gleichzeitig mit allen Reagenzien versetzen. Bei Nicht-Markierung des zweiten Antikörpers und Verwendung des markierten dritten Antikörpers kann man den markierten dritten Antikörper entweder in das Reaktionsgemisch von Schritt (a) aufnehmen, das die Probe, den ersten Antikörper und den zweiten Antikörper enthält, oder in das Immunreaktions- Produkt oder die nicht umgesetzten Antikörper, nachdem das Immunreaktions- Produkt von den nicht umgesetzten Antikörpern in Schritt (b) abgetrennt worden ist. Zum Schluß wird das Immunreaktions-Produkt, der nicht umgesetzte zweite Antikörper oder der markierte dritte Antikörper nachgewiesen.
Für die Messung nach dem Sandwich-Verfahren können neben den vorstehend erwähnten Stoffen übliche Reagenzien, wie Substrate, Puffermittel, Spülmittel oder Reaktionsabstoppmittel, verwendet werden.
Erfindungsgemäß können mehrere Proben bei hoher Empfindlichkeit und großer Sicherheit in einer kurzen Zeit durch eine im Vergleich zu herkömmlichen Meßverfahren einfache Versuchsdurchführung gemessen werden. Die Messung von menschlichem C-Peptid in einer Probe erfolgt vorteilhafterweise bei einer Konzentration von 0,1 ng/ml bis 50 ng/ml.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele genauer beschrieben, die jedoch den Schutzumfang der Erfindung in keinster Weise beschränken.

Beispiel 1

Messung von menschlichem C-Peptid unter Verwendung von zwei Arten monoclonaler Antikörper

(A) Fixierung eines gegen menschliches C-Peptid gerichteten Antikörpers

In jede Vertiefung einer unbehandelten Mikrotiter-Platte (96 Vertiefungen, von Intermed Co. hergestellte Nunk -Platte) wurden 100 µl einer Lösung eingegeben, die durch Lösen eines aus der Maus stammenden, gegen menschliches C-Peptid gerichteten Antikörpers (nachstehend als "erster Antikörper" bezeichnet) in einer Konzentration von 10 µg/ml in einem 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,6 hergestellt worden war. Es wurde über Nacht bei 4ºC inkubiert.
Danach wurde aus jeder Vertiefung die Lösung entfernt und die Platte wurde dreimal mit einer Lösung (nachstehend als "PBS-T" bezeichnet) gewaschen, die durch Lösen von 0,04 Gew.-% Tween -20 (oberflächenaktives Mittel) in einer Phosphorsäure-gepufferten physiologischen Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 7,2 (0,01 Gew.-% Phosphorsäure-Puffer, der 0,85 Gew.- % NaCl enthielt; nachstehend als "PBS" bezeichnet) hergestellt worden war. Danach wurden in jede Vertiefung 300 µl einer 1,0 Gew.-% Rinderserumalbumin (nachstehend als "BSA" bezeichnet) enthaltenden PBS-T-Lösung eingetragen. Die Blockierungsbehandlung wurde bei 4ºC durchgeführt. Die Mikrotiter-Platte mit dem gegen menschliches C-Peptid gerichteten fixierten Antikörper wurde in diesem Zustand aufbewahrt.

(B) Herstellung eines mit alkalischer Phosphatase markierten Antikörpers (nachstehend als "AP" bezeichnet)

Eine Lösung von N-Succinimidyl-3-(2'-pyridyldithio)-propionat in Ethanol wurde einer Lösung von AP (5 mg/ml) in PBS zugegeben. Das Gemisch wurde zur Reaktionsdurchführung eine Stunde bei Raumtemperatur gehalten. Danach wurde das Reaktionsgemisch gegen PBS dialysiert.
Separat wurde eine Lösung von S-Acetylmercaptobernsteinsäure-anhydrid in 1,4 Dioxan einer Lösung von 1 mg eines aus der Maus stammenden, gegen menschliches C-Peptid gerichteten monoclonalen Antikörpers (der menschliches C-Peptid an einer Stelle erkennt, die sich von der Erkennungsstelle des ersten Antikörpers unterscheidet) in PBS zugegeben. Das Gemisch wurde zur Reaktionsdurchführung eine Stunde bei 30ºC gehalten. Dann wurde das Reaktionsgemisch gegen PBS dialysiert.
Danach wurden die AP-Lösung und die Lösung des aus der Maus stammenden, gegen menschliches C-Peptid gerichteten monoclonalen Antikörpers gemischt. Dem Gemisch wurde eine 1 M Hydroxylamin-Lösung zugegeben und man ließ das erhaltene Gemisch über Nacht bei 4ºC stehen. Aus der so erhaltenen Reaktionslösung wurde der AP-markierte, gegen menschliches C-Peptid gerichtete monoclonale Antikörper mit Hilfe einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines TSK-Gels G-3000SW (Warenzeichen; hergestellt von Tosoh Corp.) aufgereinigt.

(C) Bestimmung des C-Peptids in Proben

Die Temperatur der mit Hilfe des in (A) dieses Beispiels beschriebenen Verfahrens hergestellten Mikrotiter-Platte mit dem gegen menschliches C- Peptid gerichteten fixierten Antikörper wurde wieder auf Raumtemperatur eingestellt. Die Platte wurde mit PBS-T-Lösung gewaschen. In jede Vertiefung wurden 50 µl einer Standardprobe gegeben, die menschliches C-Peptid in einer Konzentration von 0 bis 50 ng/ml enthielt. Der mit Hilfe des in (B) dieses Beispiels beschriebenen Verfahrens hergestellte AP-markierte, gegen menschliches C-Protein gerichtete monoclonale Antikörper wurde mit PBS-T verdünnt. In jede Vertiefung wurden 50 µl der Verdünnung gegeben. In diesem Zustand erfolgte eine 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur. Dann wurde die Lösung entfernt und es wurde dreimal mit PBS-T-Lösung gewaschen. Danach wurden in jede Vertiefung 100 µl einer Substratlösung zugegeben, die aus 3 mg/ml p-Nitrophenylphosphat und einem 50 mM Kohlensäure-Puffer bestand, der 10 mM Magnesiumchlorid enthielt und einen pH-Wert von 9,5 aufwies. Bei Raumtemperatur wurde eine 30-minütige Enzymreaktion durchgeführt. Zur Beendigung der Enzymreaktion wurden dem Reaktionsgemisch 100 µl einer 1 N Natriumhydroxid-Lösung zugegeben.
Die Bestimmung von menschlichem C-Peptid in jeder Vertiefung der Mikrotiter-Platte erfolgte durch Messung der Extinktions-Intensität bei einer Wellenlänge von 405 nm und einer Bezugs-Wellenlänge von 492 nm unter Verwendung einer automatischen Mikrotiterplatten-Ablesevorrichtung (Modell MPR-A4, hergestellt von Tosoh Corp.). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1

Beispiel 2

Messung von menschlichem C-Peptid unter Verwendung eines polyclonalen und eines monoclonalen Antikörpers

Die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden wiederholt, wobei als Antikörper zur Fixierung allerdings nicht der gegen menschliches C-Peptid gerichtete Antikörper wie bei dem in (A) von Beispiel 1 beschrieben Verfahren verwendet wurde, sondern eine Lösung eines aus Kaninchen stammenden, gegen menschliches C-Peptid gerichteten Antiserums, wobei alle anderen Bedingungen im wesentlichen gleich blieben. Die Ergebnisse der Bestimmung von menschlichem C-Peptid sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2

Claims

1. Verfahren zur Messung von menschlichem C-Peptid, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Probe, die menschliches C-Peptid enthält, mit einem ersten Antikörper, der spezifisch menschliches C-Peptid erkennt, und einem zweiten Antikörper, der spezifisch menschliches C- Peptid an einer Stelle erkennt, die verschieden von der Stelle ist, die vom ersten Antikörper erkannt wird, (b) Abtrennung des so produzierten Immunreaktionsprodukts von nicht umgesetzten Antikörpern, und (c) Bestimmung des Immunreaktionsprodukts oder der nicht umgesetzten Antikörper.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Antikörper an einer festen Phase fixiert ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der zweite Antikörper markiert ist mit einer Markierungssubstanz, ausgewählt aus Enzymen, radioaktiven Substanzen und fluoreszierenden Substanzen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der zweite Antikörper nicht markiert ist; und ein markierter dritter Antikörper, der spezifisch den zweiten Antikörper erkennt, zusammengebracht wird entweder mit dem Reaktionsgemisch aus der Probe, dem ersten Antikörper und dem zweiten Antikörper in Schritt (a), oder mit dem Immunreaktionsprodukt oder den nicht umgesetzten Antikörpern, nachdem das Immunreaktionsprodukt von den nicht umgesetzten Antikörpern in Schritt (b) abgetrennt worden ist.