JPH04177166A - ヒトｃ―ペプチドの測定方法 - Google Patents

ヒトｃ―ペプチドの測定方法

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JPH04177166A JP30267990A JP30267990A JPH04177166A JP H04177166 A JPH04177166 A JP H04177166A JP 30267990 A JP30267990 A JP 30267990A JP 30267990 A JP30267990 A JP 30267990A JP H04177166 A JPH04177166 A JP H04177166A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体を使
用したヒトＣ−ペプチドの測定方法に関するものである
。
ヒトＣ−ペプチドは、インスリンの生合成の過程におい
てプロインスリンの分解によって生じる３１個のアミノ
酸からなるペプチドである。ヒトＣ−ペプチドは、膵β
細胞内にインスリンと等モル存在し、刺激に応じて血中
に分泌されている。
したがって、インスリンとＣ−ペプチドの分泌動態には
、ある程度の相関関係がある。そこで、血中や尿中のヒ
トＣ−ペプチドを測定することにより、インスリン依存
性糖尿病やインスリン非依存性糖尿病、インスリノーマ
やインスリン自己免疫症候群の診断を行うことが出来る
。さらに血中のインスリンの測定を共に行うことにより
、より信頼性の高い診断が可能になる。
（従来の技術） ヒトＣ−ペプチドの測定法としては、ポリクローナル抗
体を用いた競合法による放射免疫測定法（特開昭５２−
２５７６７、特開昭５７−８７５８６．特開昭８２−１
８２１７２など）、ポリクローナル抗体を用いた競合法
による酵素免疫測定法（特開平１−１６５９６２）が知
られている。
（発明が解決しようとする課題） 従来知られている放射免疫測定法においては、放射性同
位元素を用いるため、取扱い者の安全性や、廃棄処理の
問題、さらに放射性物質を取り扱うための特殊な施設や
特別な測定装置を用意する必要がある。
またポリクローナル抗体を用いる方法は、常に一定の性
能を持った抗血清を作製するのが容易でなく、ポリクロ
ーナル抗体の品質管理に不便な点がある。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは従来技術の問題点を解決するべく、操作が
簡単で測定制度の高いヒトＣ−ペプチドの測定方法につ
いて鋭意検討したところ、これらの問題点を解決できる
ことを見出だし、本発明を完成させた。すなわち本発明
は （ａ）ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体（１）
試料 抗体（１）とは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特異的
に認識する抗体（２） とを接触させ、 （ｂ）免疫反応生成物と未反応の抗体を分離し、（ｃ）
免疫反応生成物または未反応の抗体を定量する ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法 および （ａ）ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体 試料 標識されたヒトＣ−ペプチド を接触させ、 （ｂ）免疫反応生成物と未反応の標識されたヒトＣ−ペ
プチドを分離し、 （ｃ）免疫反応生成物または未反応の標識されたヒトＣ
−ペプチドを検出する ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法 である。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
まずｊ＠１のサンドイツチ法について説明する。
本発明方法において、モノクローナル抗体を用いる場合
は、それ自体公知である方法（Ｇ。
Ｋｏｈｌｅｒ、Ｃ，Ｍｉ　１ｓｔｅｉｎ、、ｅｔａｌ、
　　Ｎａｔｕｒｅ、　　２５６．　４９５．　１９７５
）に準じて製造することができる。実施例に用いたモノ
クローナル抗体もこの方法に準じて得たものである。ま
た、ポリクローナル抗体を用いる場合は、ヒトＣ−ペプ
チドに対する抗血清またはモノクローナル抗体の混合物
を用いればよい。
本発明方法に用いられる抗体を固相に固定化する場合、
その方法は、公知の方法を採用でき、同相としては例え
ば、ポリスチレン、ポリエチレン、・ポリ塩化ビニル、
ポリカーボネート、セファロース粒子、ラテックス、ア
ガロース、セルロース、ポリメタアクリレートなどが使
用される。本発明では免疫反応後に反応生成物と未反応
物とを分離するため、抗体（１）は、以上のような固相
に固定化することが好ましい。
一方、抗体（２）は、免疫反応後の免疫反応物または未
反応の抗体（２）の検出を行いやすくするため、標識化
されていることが好ましい。抗体の標識化の方法とその
検出方法もなんら限定されるものでなく、公知の方法に
より標識化および検出することができる。標識として酵
素を用いる場合、標識物質としては例えば、ペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダー
ゼなどが使われる。標識として放射性物質を用いる場合
、’Ｈ，１２’Ｉ、または１３１１等が、蛍光物質を使
用する場合は、例えば、フルオレスカミン、フルオレラ
センチオシアネート、テトラローダミンイソチオシアネ
ート（ＴＲＩ　ＴＣ）等が常法によりモノクローナル抗
体に結合される。しかしながら、標識物質は上記物質に
何ら限定されるべきものではない。
また、抗体（２）を標識しなかった場合は、免疫反応生
成物または抗体（２）を特異的に認識する標識された第
３の抗体を用いて、反応生成物または未反応物を検出す
ればよい。
以上のような試薬を用いてサンドイツチ法を行えばよい
。その際、試薬の試料との接触順序にはとくに限定はな
く、順次接触させてもよく、また、−度に反応させても
よい。このとき抗体（２）が、標識化されていない場合
、先程の第３の抗体をも反応させる。最後に、免疫反応
生成物と未反応物を分離し、免疫反応生成物、未反応の
抗体（２）またはそれらと反応した第３の抗体の標識を
検出すればよい。
次に競合法について説明する。競合法においては、用い
られる抗体はモノクローナル抗体であり、固相化される
ことが好ましい。一方、標識化されたヒトＣ−ペプチド
を用い、これと試料中のヒトＣ−ペプチドをモノクロー
ナル抗体に対し、競合的に反応を行わせ、反応生成物を
未反応の標識化ヒトＣ−ペプチドと分離し、どちらか一
方の標識を検出すればよい。競合法に用いられる固相お
よびその方法、標識およびその方法などは、サンドイツ
チ法に用いられるものと実質的に同様である。
測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶
解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用
いられる。
（発明の効果） 以上の説明から明らかなように本発明によれば、（１）
試料中のヒトＣ−ペプチド濃度は、０．１〜５０１ｇ／
＋ｅｌの範囲内で測定することができ、（２）従来法に
比べて極めて簡便な操作で、安全に、短期間にかつ感度
よく多数の検体の測定が可能である。
（実施例） 以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし、本発
明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
実施例１ ２種類のモノクローナル抗体を用いたヒトＣ−ペプチド
ヒトの測定 （Ａ）抗ヒトＣ−ペプチド抗体の固定化未処理マイクロ
タイタープレート（９６ウエル・ヌンクブレート、イン
ターメッド社製）の各ウェルに０．１Ｍ炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した１０μｇ　／　ｍ　ｌ
のマウス由来の抗ヒトＣ−ペプチド抗体（名称Ａ）の溶
液１００μｍを加えて、４℃−夜インキユベートした。
次に、各ウェルの溶液を除去し、リン酸緩衝化生理食塩
水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１％リン酸緩衝液、
ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に０．０４％ツイーン（ｔｗ
ｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回
洗浄した後、１．０％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ
）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウェルに加
えて、４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。
（Ｂ）アルカリフォスファターゼ（以下ＡＰ）標識抗体
の調製 ＰＢＳに溶解したＡＰ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）にＮ−サク
シンイミジル−３−（１−ピリジルジチオ）プロピオネ
ートのエタノール溶液を加え、室温にて１時間反応させ
た後、ＰＢＳで透析した。
また、ＰＢＳに溶解した１ｍｇのマウス由来抗ヒトＣ−
ペプチドモノクローナル抗体（Ａとは異なる部位でヒト
Ｃ−ペプチドを認識するもの）溶液にＳ−アセチルメル
カプト無水コハク酸の１，４ジオキサン溶液を加えて３
０℃で１時間反応させた後、ＰＢＳで透析した。次に、
ＡＰ溶液とマウス由来抗ヒトＣ−ペプチドモノクローナ
ル抗体溶液を混合し、１Ｍヒドロキシルアミン溶液を加
えて４℃中で一晩放置した。この後、上記反応溶液から
ＴＳＫ−ゲルＧ−３０００ＳＷ　（東ソー株式会社製、
商品名）を用いる高速液体クロマトグラフィーにより、
ＡＰ標標識上ヒトＣペプチドモノクローナル抗体を精製
した。
（ｃ）試料中のヒトＣ−ペプチドの定量本実施例中の（
Ａ）で記述した方法で作製したマイクロタイタープレー
トを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ヒト
Ｃ−ペプチドを含む標準試料（０〜５０ｎｇ／ｍｌ　）
を各ウェルにそれぞれ５０μｍ加えた。つぎに本実施例
（Ｂ）で得たＡＰＰ識抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈し、
各ウェルに５０μｍずつ添加した。そのまま室温で２時
間インキュベートした後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液
で３回洗浄した。それに、３　ｍ　ｇ　／　ｍ　ＩＰ−
ニトロフェニルフォスフェート３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ
塩化マグネシウムを含有する５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ
９，５）から成る基質溶液を各ウェルに１００μｍ添加
し、室温で３０分間酵素反応させた後、ＩＮ水酸化ナト
リウム溶液を１００μｍ加えて酵素反応を停止させた。
上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて、波
長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マ
イクロタイタープレートリーダー（東ソー株式会社製、
ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した。
結果を表１に示した。
表１ 実施例２ ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を用いるヒト
Ｃ−ペプチドの測定 固定化抗体として、ラビット由来の抗ヒトＣ−ペプチド
抗体溶液を用いた以外は実施例１と同様にして実験を行
った。結果を表２に示す。
表２

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ［１］ （ａ）ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体（１） 試料抗体（１）とは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特
    異的に認識する抗体（２） とを接触させ、 （ｂ）免疫反応生成物と未反応の抗体を分離し、 （ｃ）免疫反応生成物または未反応の抗体を定量する ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法
    。 ［２］ （ａ）ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識するモノクロー
    ナル抗体試料標識されたヒトＣ−ペプチドを接触させ、 （ｂ）免疫反応生成物と未反応の標識されたヒトＣ−ペ
    プチドを分離し、 （ｃ）免疫反応生成物または未反応の標識されたヒトＣ
    −ペプチドを検出する ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法
    。
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