DE69730479T2

DE69730479T2 - Marker und immunologisches Reagens für Dialyse verbundenen Amyloidosis, Diabetes Mellitus und Diabetes Mellitus-Komplikationen

Info

Publication number: DE69730479T2
Application number: DE69730479T
Authority: DE
Inventors: Noriko Tokuyama-shi Matsuda; Hisahiko Tokuyama-shi Iwamoto; Naohiro Tokuyama-shi Hanyu
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1997-10-29
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2017-10-30
Also published as: EP0840126B1; EP0840126A3; US6033862A; EP0840126A2; DE69730479D1

Description

Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen Marker und ein immunologisches Reagens für mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose, Diabetes mellitus und Komplikationen von Diabetes mellitus. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Marker, der für die Diagnose von oder für die Auswertung der Wirkung eines Medikaments für mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose, Diabetes mellitus und Komplikationen von Diabetes mellitus verwendbar ist, und ein immunologisches Reagens zur Diagnose von oder zur Auswertung der Wirkung eines Medikaments für mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose, Diabetes mellitus und Komplikationen von Diabetes mellitus.
Es ist bekannt, dass Protein im Blut mit Glucose nicht-enzymatisch unter Glycosylierung reagiert und zu einem glycosylierten Protein wird. Diese Glycosylierung (engl: glycation) wird als „Maillard-Reaktion" bezeichnet und wird in Reaktionen der frühen Stufe und der späten Stufe unterteilt. Die Reaktion der frühen Stufe wird als eine Stufe definiert, bei der die Seitenketten-Aminogruppe oder N-terminale Aminogruppe des Proteins mit der Carbonylgruppe des Saccharids über eine Schiffsche Base unter Bildung einer Amadori-umgelagerten Verbindung reagiert. Als die Reaktionsprodukte der frühen Stufe sind Hämoglobin A1C, glycosyliertes Albumin und dergleichen bekannt, und es ist bekannt, dass sie als klinischer Marker für Diabetes mellitus verwendet werden.
Ferner ist bekannt, dass sich nach der vorstehend genannten Reaktion der frühen Stufe die an den Seitenkettenaminogruppen des Proteins gebildete Amadori-umgelagerte Verbindung in zwei Richtungen verändert. Eine davon ist eine Reaktion, die von mindestens einem von Fluoreszenz, Bräunung und intramolekularer oder/und intermolekularer Vernetzung begleitet ist (nachstehend auch als „Reaktion A der späten Stufe" bezeichnet), und bei der zweiten handelt es sich um eine oxidative Spaltungsreaktion (nachstehend auch als „Reaktion B der späten Stufe" bezeichnet), an der Sauerstoff und ein Übergangsmetall teilnehmen.
Obwohl ein Endprodukt der Maillard-Reaktion als „AGE" (Advanced Glycation End products = fortgeschrittene Glycosylierungs-Endprodukte) bezeichnet werden kann, bezieht sich der Ausdruck „AGE" im Allgemeinen in den meisten Fällen auf ein Produkt einer Reaktion, die durch mindestens eine von drei charakteristischen Erscheinungen (Fluoreszenz, Bräunung und intramolekulare oder/und intermolekulare Vernetzung), die bei der vorstehend genannten Reaktion A der späten Stufe beobachtet werden, begleitet ist. Es gibt verschiedene Meinungen, ob das Produkt einer Reaktion, die nicht von allen drei vorstehend beschriebenen Erscheinungen begleitet ist, ebenfalls als AGE bezeichnet werden sollte oder nicht. Das bedeutet, dass es zusätzlich zur vorstehenden Definition verschiedene Meinungen über die Definition von AGE gibt, wie z. B. eine, die behauptet, dass sich AGE auf sämtliche Produkte beziehen sollte, die erhalten werden, wenn Glucose und Protein 60 Tage oder mehr in vitro bei 37°C inkubiert werden (was eine Modellreaktion der Maillard-Reaktion ist), eine Ansicht, die behauptet, dass sich AGE nur auf Produkte mit biologischer Aktivität zur Herbeiführung von Komplikationen von Diabetes mellitus aus den vorstehend genannten Produkten beziehen sollte, und dergleichen. Es gibt in der akademischen Welt keine anerkannte Definition des genannten Ausdrucks. Um die vorstehend dargelegte Verwirrung zu vermeiden, bezieht sich der Ausdruck „AGE", wenn er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, nur auf das Produkt einer Reaktion (nämlich das Produkt der Reaktion A der späten Stufe), die von mindestens einem von Fluoreszenz, Bräunung oder intramolekularer oder/und intermolekularer Vernetzung bei der Maillard-Reaktion begleitet ist.
Das Produkt der vorstehend genannten Reaktion A der späten Stufe, d. h. AGE, wird als eine Ansammlung einer Vielzahl von Verbindungen angesehen. Gegenwärtig werden Pyrralin, Pentosidin, Clossline A&B, X1 und dergleichen als AGE-Strukturen vorgeschlagen und sind qualitativ und quantitativ durch Messung der Fluoreszenzintensität oder einer Antigen-Antikörper-Reaktion nachgewiesen. Es wird berichtet, dass die Reaktion A der späten Stufe zum Erzeugen von AGE in vivo abläuft und beim Auftreten von Komplikationen auf der Grundlage von vaskulärer Fehlfunktion beteiligt ist (Monnier, V. M., et al., New England Journal of Medicine, Bd. 314, S. 403, 1986). Es wurde Aufmerksamkeit darauf gerichtet, dass AGE mit dem Auftreten und dem Fortschreiten von Komplikationen bei Diabetes mellitus-Patienten verbunden ist, und es wurde auch berichtet, dass AGE biologische Aktivität aufweist, die mit dem Auftreten und Fortschreiten von Komplikationen von Diabetes mellitus verbunden ist (Morisaki et al., „Saishin Igaku (The Latest Medical Science)", Bd. 49, S. 248, 1994).
Mittlerweile wurde berichtet, dass N^ε-Carboxymethyllysin (nachstehend auch als „CML" abgekürzt), dessen Aminogruppe an der ε-Position carboxymethyliert ist, als Produkt der anderen Reaktion der späten Stufe der Maillard-Reaktion (Reaktion B der späten Stufe) identifiziert ist (Ahmed, M. U., et al., Journal of Biological Chemistry, Bd. 261, S. 4889, 1986), und dass CML in den Linsenproteinen und im Hautcollagen von älteren Personen und von Diabetes mellitus-Patienten vorhanden ist (Dunn, J. A., et al., Biochemistry, Bd. 30, S. 1205, 1991). Ferner wurde berichtet, dass eine Substanz, bei der ein Wasserstoffatom der Seitenketten-Aminogruppe von Rinderserumalbumin (nachstehend als „BSA" abgekürzt) mit einer Carboxymethylgruppe substituiert ist (nachstehend auch als „carboxymethyliert" bezeichnet), eine Reaktion zwischen AGE und einem anti-AGE-Antikörper in starkem Umfang hemmt (Abstract of the 55-th US Diabetes mellitus Academic Society's Meeting, S. 115A, 1995).
Es gibt jedoch keine Berichte über Proteine oder Peptide, bei denen nur der N-Terminus carboxymethyliert ist (nachstehend auch als „carboxymethyliertes Produkt" bezeichnet). Der Unterschied von Verhältnis und Menge des substituierten Proteins oder des Peptids im Protein oder im Peptid in vivo, insbesondere in einer Körperflüssigkeit, zwischen einem Diabetes mellitus-Patienten oder einem Diabetes mellitus-Patienten mit Auftreten einer Komplikation wie Nephropathie oder Retinopathie (nachstehend auch als „Patient mit Komplikationen von Diabetes mellitus" bezeichnet) und einer gesunden Person war nicht bekannt, und die Verwendbarkeit des Proteins oder Peptids, insbesondere die Verwendbarkeit als Marker für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus ist nicht erkannt worden.
Mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose (nachstehend auch einfach als „DRA" bezeichnet; engl: dialysis-related amyloidosis) ist eine amyloide Thesaurose, bei der es sich um eine bei Patienten mit einer lang andauernden Dialysebehandlung beobachtete Komplikation handelt und die hauptsächlich das Karpaltunnelsyndrom und lytische Knochenschäden verursacht.
In den letzten Jahren wurde gefunden, dass es sich bei einer Hauptkomponente von abgelagertem Amyloid um β2-Mikroglobulin handelt (nachstehend auch als „β2M" abgekürzt), und dass Amyloid, das β2M als ein Vorläuferprotein enthält, auf Gelenksynovia abgelagert wird, um Karpaltunnelsyndrom, multiple Arthritis, destruktive Rückenmarksathrose und dergleichen zu verursachen. Es gibt jedoch keinen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose und der Konzentration von β2M im Blut, und es wurde vorgeschlagen, dass andere Faktoren als die Konzentration von β2M im Blut mit dem Auftreten der mit Dialyse in Zusammenhang stehenden Amyloidose in Zusammenhang stehen. Von diesen wird β2M-modifizierten Produkten besondere Aufmerksamkeit geschenkt, und Untersuchungen über die β2M-modifizierten Produkte sind im Gang. Miyata et al. haben kürzlich gefunden, dass das Produkt der späten Stufe der Maillard-Reaktion von Protein (AGE) in abgelagertem Amyloid vorhanden ist und bestätigten, dass β2M eine Pentosidin-Struktur und eine Carboxymethyllysin-Struktur wie das AGE aufweist (nachstehend als „AGE-β2M" abgekürzt), und schlugen die Möglichkeit vor, dass das AGE-β2M beim Fortschreiten von Knochen- oder Gelenksschäden beteiligt ist (J. Clin. Invest. Bd. 92, S. 1243–1252, 1993, und „Rinsyou Toseki (Clinical Dialysis)", Bd. 12, Nr. 8, S. 1163–1170, 1996).
Es kann jedoch nicht behauptet werden, dass die Einzelheiten der Ursachen und der Krankheitshäufigkeit von DRA vollständig ermittelt worden sind, und ihre grundlegende Vermeidung und Behandlungsmaßnahmen müssen noch geschaffen werden. Deshalb wird der Verlangsamung des Krankheitsfortschreitens durch eine angemessene Behandlung auf Grund einer genauen und frühen Diagnose Wichtigkeit beigemessen.
Wie vorstehend beschrieben, ist es sehr wichtig, DRA in ihrem frühen Stadium zu diagnostizieren. Ein konventionelles Diagnoseverfahren weist jedoch Probleme bei der Genauigkeit und der Belastung einer Person auf.
Mit anderen Worten wurde DRA bisher mit Kongorot-Färbung hauptsächlich von Gewebe aus einer Stelle, die Symptome zeigte, als Probe diagnostiziert. Dieses Diagnoseverfahren weist jedoch insofern das Problem auf, dass ein lebender Körper physischen Schmerz oder Verletzung erleidet. Es zeigt sich weiter ein solches Problem, dass in manchen Fällen die Probe nicht mit Kongorot gefärbt werden kann, selbst wenn sie anscheinend klinisch die Symptome von DRA zeigt.
Daher wurden in den letzten Jahren Versuche unternommen, als ein genaueres und nicht-invasives Verfahren, DRA durch Markieren von β2M in vivo mit einem radioaktiven Isotop und anschließendes Erhalten eines Bildes der Amyloidablagerungsstelle mit einer Szintillationskamera oder dergleichen zu diagnostizieren. Selbst dieses Diagnoseverfahren weist jedoch die Probleme auf, dass der Einfluss von Isolation oder Ansammlung eines markierenden radioaktiven Isotops auf den lebenden Körper groß ist und dass die Arbeitsweisen des vorstehend beschriebenen Verfahrens schwierig sind.
Wie vorstehend beschrieben, gibt es trotz verschiedener laufender Untersuchungen über den Mechanismus des Auftretens von DRA keine bekannten Beispiele, bei denen die bei diesen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse tatsächlich für ein neues Diagnoseverfahren angewendet wurden, die die Probleme der vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahren lösen. Beispielsweise schlossen Miyata et al. aus ihren Untersuchungen, dass AGE-β2M bei dem Auftreten von DRA beteiligt ist, sie untersuchten jedoch nicht den Zusammenhang zwischen der Konzentration von AGE-β2M in Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, Urin und Lymphe, und dem Auftreten von DRA. In anderen Worten: es ist vollkommen unbekannt, ob AGE-β2M als Marker für DRA wirksam verwendet werden kann oder nicht.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Marker für mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose (DRA) bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein immunologisches Reagens zur Diagnose von DRA, umfassend einen Antikörper, der spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen Marker der vorliegenden Erfindung (nachfolgend als „erster Marker" bezeichnet) reagiert, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein immunologisches Reagens zur Auswertung der Wirkung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von DRA, umfassend einen Antikörper, der spezifisch mit dem vorstehend beschriebenen Marker der vorliegenden Erfindung reagiert, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Marker für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus (nachfolgend als „zweiter Marker" bezeichnet) bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein immunologisches Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus, umfassend einen Antikörper, der spezifisch mit dem zweiten Marker der vorliegenden Erfindung reagiert, bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein immunologisches Reagens zur Auswertung der Wirkung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus, umfassend einen Antikörper, der spezifisch mit dem zweiten Marker der vorliegenden Erfindung reagiert, bereitzustellen.
Weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schaubild, das die Messergebnisse der Antigen-Spezifität eines Antikörpers gegen ein carboxymethyliertes Humanserumalbumin-Präparat mit einem kompetitiven ELISA-Verfahren zeigt, wobei die Ordinate die Extinktion bei 405 nm und die Abszisse die zugegebene Menge des jeweiligen Inhibitors zeigt.
2 ist ein Schaubild, das die Ergebnisse des Unterschieds der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin zwischen Dialysepatienten mit Auftreten von Amyloidose und Dialysepatienten ohne Auftreten von Amyloidose zeigt, wobei die Ordinate die Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin und die Abszisse das Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose zeigt.
3 ist ein Schaubild, das die Ergebnisse des Unterschieds der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin zwischen Patienten mit 100-monatiger Dialyse oder mehr und mit Auftreten von Amyloidose, und Patienten mit 100-monatiger Dialyse oder mehr ohne Auftreten von Amyloidose zeigt, wobei die Ordinate die Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin und die Abszisse das Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose zeigt.
4 ist ein Schaubild, das den Zusammenhang zwischen der Dialysedauer eines jeden Dialysepatienten, die auf der Abszisse aufgetragen ist, und der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin, die auf der Ordinate aufgetragen ist, zeigt; und
5 ist ein Schaubild, das den Zusammenhang zwischen dem Geschlecht und der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin eines jeden Dialysepatienten oder dem Geschlecht und der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin einer jeden gesunden Person zeigt, wobei die Ordinate die Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin und die Abszisse das Geschlecht zeigt. Diese Figur zeigt den Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein einer Dialysebehandlung, die auf der Abszisse aufgetragen ist, und der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin, die auf der Ordinate aufgetragen ist.
Genaue Beschreibung der Ausführungsform
Nachstehend wird kurz beschrieben, wie die Erfinder der vorliegenden Erfindung zu den vorstehend beschriebenen Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung gelangt sind, und ihre Entdeckungen werden kurz beschrieben.
Zuerst bemerkten die beteiligten Erfinder die Tatsache, dass AGE eine einzigartige physiologische Aktivität aufweist, sie überlegten, dass AGE als ein Marker für DRA dienen könnte, und führten verschiedene Untersuchungen zum Zusammenhang zwischen AGE in vivo und dem Auftreten von DRA durch. Als ein Ergebnis fanden sie, dass wesentliche Unterschiede der Konzentration des spezifischen Proteins in vivo oder der mittleren Anzahl der spezifischen Substituentengruppen, die in einem Molekül des spezifischen Proteins vorhanden sind, zwischen DRA-Patienten und gesunden Personen bestehen, mit Bezug auf AGE mit spezifischen Substituentengruppen (d. h. dem Protein mit einer spezifischen Substituentengruppe), und dass die Menge des spezifischen Proteins in einer Probe und die mittlere Anzahl der spezifischen Substituentengruppen, die in einem Molekül des spezifischen Proteins vorhanden sind, leicht mit einem Reagens, das einen Antikörper, der spezifisch mit dem spezifischen Protein reagiert, umfasst, gemessen werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde durch diese Erkenntnisse erzielt.
Zweitens fanden die beteiligten Erfinder, dass ein wesentlicher Unterschied der durch die folgende Gleichung definierten Carboxymethylierungsrate eines bestimmten Proteins in einer Körperflüssigkeit zwischen einem Fall von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus und einer gesunden Person besteht, und dass das carboxymethylierte Protein als ein Marker für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus wirksam verwendet werden kann. Somit wurde die vorliegende Erfindung durch diese Erkenntnis erziel. In der vorliegenden Beschreibung ist die Carboxymethylierungsrate durch die folgende Gleichung für alle spezifischen Proteinarten oder Peptidarten, die in einer Körperflüssigkeits-Probe vorhanden sind, definiert (unabhängig davon, ob eine spezifische Proteinart oder Peptidart durch Carboxymethylierung modifiziert ist oder nicht), und ist eine Kennzahl, die anzeigt, wie viele N-Termini des spezifischen Proteins oder Peptids im Mittel carboxymethyliert sind.
Carboxymethylierungsrate (%) = (Gesamtzahl der Carboxymethylgruppen, die an den N-Termini des spezifischen Proteins oder Peptids vorhanden sind)/(Gesamtzahl der N-Termini, die im spezifischen Protein oder Peptid vorhanden sind) × 100.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können erstens die vorstehend genannten Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung durch die in vitro-Verwendung eines N^α-carboxymethylierten Hämoglobins, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, als Marker für mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose erreicht werden.
Der Begriff „carboxymethyliertes Protein oder carboxymethyliertes Peptid" (nachstehend auch als „carboxymethyliertes Produkt" bezeichnet), wie er in der vorliegenden Beschreibung verwendet wird, bezeichnet ein Hämoglobin, bei dem wenigsten das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist. Bei den zu carboxymethylierenden Aminogruppen handelt es sich um Seitenketten-Aminogruppen oder N-terminale Aminogruppen von Lysin oder dergleichen und schließen in der Aminobindung vorhandenes -NH- nicht ein.
Wie in nachstehend beschriebenen Beispielen gezeigt wird, sind die Menge eines carboxymethylierten Produkts, das im Körper eines DRA-Patienten vorhanden ist, und die mittlere Anzahl von Carboxymethylgruppen, die in einem Molekül des carboxymethylierten Produkts vorhanden sind (kann nachstehend einfach als „Carboxymethylierungsrate" bezeichnet werden), viel höher als die einer gesunden Person (siehe nachstehende Tabellen 1, 2 und 3). Daher kann das carboxymethylierte Produkt, das in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, im Gebiet der klinischen Untersuchung als Marker für DRA verwendet werden. Das bedeutet, dass es möglich ist, durch Messen der Carboxymethylierungsrate und der Menge von carboxymethyliertem Produkt in vivo, insbesondere im Blut, zu beurteilen, ob eine Person Auftreten von DRA aufweist, oder das Auftreten oder Fortschreiten von DRA vorherzusagen. Bei dem nachstehend beschriebenen Beispiel 1 wird, da carboxymethyliertes Hämoglobin als das carboxymethylierte Produkt verwendet wird und eine absolute Menge von Hämoglobin eines DRA-Patienten geringer ist als bei einer gesunden Person, da der DRA-Patient einer künstlichen Dialyse unterzogen wird, der Zusammenhang zwischen dem Auftreten von DRA und der Konzentration von carboxymethyliertem Produkt in einer Probe nicht untersucht. Jedoch wird, wie in Beispiel 2 gezeigt, der günstige Zusammenhang zwischen der Konzentration des carboxymethylierten Produkts (carboxymethyliertes β2M) in der Probe eines DRA-Patienten und der Konzentration des carboxymethylierten Produkts in der Probe einer gesunden Person erkannt.
Während ein Verfahren zum direkten Messen der Menge oder der Carboxymethylierungsrate eines carboxymethylierten Produkts in vivo (wie beispeilsweise im Blut oder Urin) nicht bekannt ist, ist ein Verfahren zum indirekten Messen der Menge eines carboxymethylierten Produkts durch Abbauen eines carboxymethylierten Produkts, um eine carboxymethylierte Aminosäure zu erhalten, und Messen der Menge der carboxymethylierten Aminosäure bereits bekannt. Beispielsweise sind ein Verfahren, das Hydrolysieren eines carboxymethylierten Produkts und Nachweisen einer carboxymethylierten Aminosäure unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie umfasst, ein Verfahren, das Hydrolysieren eines carboxymethylierten Produkts und Nachweisen einer carboxymethylierten Aminosäure unter Verwendung von Gaschromatographie/Massenspektrometrie umfasst, und so weiter, bekannt. Diese indirekten Messverfahren weisen jedoch solche Probleme wie komplizierte Handhabung und niedrige Empfindlichkeit auf, so dass ein direktes Messverfahren, das die Messung erleichtert und eine hohe Empfindlichkeit aufweist, wünschenswert ist. Unter diesen Umständen haben die beteiligten Erfinder ein Verfahren zum Nachweisen eines carboxymethylierten Produkts in vivo entwickelt, das von einer Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung eines Antikörpers (nachstehend auch einfach als „anti-CM-Antikörper" bezeichnet), der spezifisch mit einem carboxymethylierten Produkt reagiert, Gebrauch macht.
Der anti-CM-Antikörper wird durch Verwenden eines carboxymethylierten Produkts, das mit einem organisches Syntheseverfahren hergestellt ist, als ein Immunogen (Antigen) erhalten. Ein Protein, das als Ausgangsmaterial zum Synthetisieren eines solchen carboxymethylierten Produkts dient, ist Hämoglobin.
Wenn ein Peptid als Ausgangsmaterial zum Synthetisieren eines carboxymethylierten Produkts verwendet wird, kann das Peptid ein Oligopeptid oder Polypeptid sein, wie durch Produkte, die durch den Abbau des vorstehend beschriebenen Proteins erhalten sind, durch Produkte, die durch künstliches Synthetisieren eines spezifischen Bereichs des vorstehend beschriebenen Proteins erhalten sind, und dergleichen, beispielgebend veranschaulicht wird.
Als Verfahren zum Carboxymethylieren einer Aminogruppe bzw. von Aminogruppen einer α-Aminosäure oder einer Aminogruppe einer Aminosäure, die das vorstehend beschriebene Protein oder Peptid bildet, d. h. ein Verfahren zum Substituieren des Wasserstoffatoms der vorstehend beschriebenen Aminogruppe durch eine -CH₂-COOH-Gruppe, können alle bekannte Verfahren ohne Einschränkung verwendet werden. Beispielsweise wird ein Verfahren wie ein reduktives Alkylierungsverfahren, das in „Shin Seikagaku Jikken Kouza 1, Tanpakushitsu 4 (New Biochemical Experiment Lecture 1, Protein 4)" (herausgegeben von der Japanese Biochemical Society, S. 13–16, Tokyo Kagaku Dojin, veröffentlicht am 20. März 1991) beschrieben ist, bevorzugt, bei dem eine Aldehydverbindung, die durch CHO-COOH dargestellt wird, und ein Protein oder Peptid in einer wässrigen Lösung, wie z. B. einer Boratpufferlösung oder Phosphatpufferlösung, gelöst werden und bei einem pH-Wert von 8 bis 10 in Gegenwart eines Reduktionsmittels für ein hydriertes Produkt, wie z. B. Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid, zur Umsetzung gebracht werden. Bei einem pH-Wert von mehr als 10 kann das Protein oder dergleichen denaturiert werden, während bei einem pH-Wert unter 8 das Reduktionsmittel für ein hydriertes Produkt instabil wird. Um die Umsetzung spezifisch und quantitativ ablaufen zu lassen, beträgt die Reaktionstemperatur vorzugsweise 0 bis 10°C. Alternativ kann ein carboxymethyliertes Produkt durch Inkubieren von reduziertem Zucker und Protein über 60 Tage bei 37°C unter aseptischen Bedingungen in Gegenwart von Sauerstoff erhalten werden.
Das so erhaltene carboxymethylierte Produkt ist im Allgemeinen wasserlöslich und fällt durch Zugabe von Aceton, Alkohol, Ammoniumsulfat, Schwermetallsalz oder dergleichen aus. Das vorstehend genannte carboxymethylierte Produkt kann durch ein bekanntes Verfahren, das von einem Verfahren zum Nachweis einer Aminogruppe abweicht, nachgewiesen werden, wie z. B. durch ein UV-Absorptionsverfahren, ein Farbstoffbindungsverfahren, ein Verfahren mit einem Phenolreagens oder dergleichen. Bei den vorstehend genannten Verfahren wird eine Substanz mit einer Aminogruppe, wie z. B. Protein, Lipid, Saccharid oder dergleichen, leicht carboxymethyliert, wobei im Protein oder Peptid die Seitenketten- oder die N-terminale Aminogruppen von Lysin leicht selektiv carboxymethyliert werden.
Ein Verfahren zum Erhalten von anti-CM-Antikörper unter Verwendung des so synthetisierten carboxymethylierten Produkts als ein Antigen ist nicht auf ein Spezielles beschränkt, und ein Verfahren zum Immunisieren eines Empfängertiers für ein carboxymethyliertes Produkt als ein Antigen kann wahlweise angewandt werden.
In dieser Hinsicht ist das Antigen nicht besonders beschränkt, wenn es ein carboxymethyliertes Produkt ist. Wenn ein carboxymethyliertes Peptid als das Antigen verwendet wird, wird ein carboxymethyliertes Peptid, das an ein herkömmlich bekanntes Trägerprotein wie beispielsweise Hämocyanin, Rinderserumalbumin, β-Galaktosidase oder dergleichen gebunden ist, vorzugsweise als das Antigen verwendet, da es eine besonders geringe Fähigkeit hat, in manchen Fällen eine Immunantwort hervorzurufen. Um das carboxymethylierte Peptid an ein Trägerprotein zu binden, wird im Allgemeinen ein zu diesem Zweck verwendetes Verfahren ohne Beschränkung verwendet.
Die Derivatisierung eines aus dem Antigen gebildeten Antikörpers ist nicht besonders beschränkt. Durch Immunisieren eines Wirtstiers, wie z. B. Kaninchen, Ziege, Maus oder Meerschweinchen gegenüber einem carboxymethyliertem Produkt erhaltenes Antiserum, Aszitesflüssigkeit oder dergleichen, kann, durch Dialyse, Zentrifugalkonzentration, Flüssigkeitschromatographie oder dergleichen gereinigt, als Antigen direkt verwendet werden, oder als polyklonaler Antikörper nach Reinigung mit einem herkömmlichen Verfahren, wie Aussalzen, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Elektrophorese verwendet werden. Alternativ kann ein monoklonaler Antikörper, der aus einem Hybridom, das durch Fusionieren einer antikörperbildenden Zelle, wie z. B. einer Milzzelle oder einer Lymphozytenzelle eines Säugetiers, das durch ein Antigen mit einer Myelomzelle sensibilisiert wurde, hergestellt ist, direkt oder nach Reinigung mit einem herkömmlichen Verfahren, wie Aussalzen, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie oder Elektrophorese, verwendet werden.
Um ein immunologisches Reagens herzustellen, können die Antikörper direkt verwendet werden, während aktive Fragmente (Anteile, die eine Antigen-Erkennungsstelle eines Antikörpers einschließen), wie z. B. Fab, Fab' oder F(ab')2, von Antikörpern, die durch Behandlung der vorstehend beschriebenen Antikörper mit einem Enzym erhalten sind, als anti-CM-Antikörper verwendet werden können.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein immunologisches Reagens zur Diagnose von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose bereitgestellt, das einen Antikörper umfasst, der spezifisch mit einem carboxymethylierten Hämoglobin, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, reagiert.
Das „immunologische Reagens" der vorliegenden Erfindung ist nicht auf eine besondere Art beschränkt, wenn es ein carboxymethyliertes Produkt nachweisen kann, wobei es von einer Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen einem anti-CM-Antikörper und einem carboxymethylierten Produkt Gebrauch macht. Beispielsweise können ein anti-CM-Antikörper, ein Antikörper gegen eine Biokomponente bzw. Biokomponenten wie z. B. β2M oder Hämoglobin und ein carboxymethyliertes Produkt auf einem geeigneten unlöslichen Träger getragen werden, um solche Verfahren wie ein nicht-kompetitives Verfahren, ein kompetitives Verfahren, ein Sandwich-Verfahren oder dergleichen, die unten beschrieben werden, zu bewältigen. Das carboxymethylierte Produkt kann durch Nachweisen einer Antigen-Antikörper-Reaktion, die durch in Kontakt bringen des immunologischen Reagens mit einem Antigen und/oder anti-CM-Antikörper in der Probe gemäß einem Messverfahren ausgelöst wird, gemessen werden. Diese Antigen-Antikörper-Reaktion kann durch Verwendung der Agglutination des unlöslichen Trägers nachgewiesen werden, wenn es sich bei dem immunologischen Reagens der vorliegenden Erfindung um ein sogenanntes Immunagglutionations-Reagens handelt. Falls es sich bei dem immunologischen Reagens der vorliegenden Erfindung um ein sogenanntes Immunoassay-Markierungsreagens handelt, kann die Antigen-Antikörper-Reaktion als eine Änderung der physikalischen Größe von Kolorimetrie, Lumineszenz oder Fluoreszenz oder dergleichen nachgewiesen werden.
Als veranschaulichende Beispiele für das immunologische Reagens der vorliegenden Erfindung umfassen qualitative Reagenzien ein Latex-Agglutinationsreagens, ein Mikrotiter-Agglutinationsreagens und dergleichen, während quantitative Reagenzien ein Radioimmunoassay-Reagens, ein Enzymimmunoassay-Reagens, ein Fluoreszenzimmunoassay-Reagens, ein chemisch-lumineszierendes Immunoassay-Reagens, ein quantitatives Latex-Reagens und dergleichen umfassen.
Was die Form des unlöslichen Trägers, der einen anti-CM-Antikörper oder einen Antikörper gegen eine Biokomponente oder mehrere Biokomponenten oder ein carboxymethyliertes Produkt in einer Probe trägt, betrifft, kann eine geeignete Form gemäß dem Verwendungszweck gewählt werden. Beispielsweise kann er in Form eines Kügelchens, einer Testplatte, einer Scheibe oder eines Filters oder in einer sphärischen oder Röhrenform vorliegen. Als Material für den vorstehend genannten Träger können als Immunoassay-Träger allgemein eingesetzte Materialien wie z. B. Glas, Polysaccharid und Derivate davon, Kieselgel, poröse Keramikmaterialien, Metalloxide, Erythrozyten, synthetische Harze wie Propylen, Styrol, Acrylamid und Acrylnitril verwendet werden, und diese synthetischen Harze weisen eine reaktive funktionelle Gruppe oder mehrere reaktive funktionelle Gruppen, wie z. B. eine Sulfongruppe oder eine Aminogruppe, die mit einem bekannten Verfahren eingeführt worden sind, auf.
Als Verfahren zum Immobilisieren eines anti-CM-Antikörpers oder eines Antikörpers gegen eine Biokomponente oder mehrere Biokomponenten oder eines Antigens in einer Probe auf dem unlöslichen Träger können bekannte Verfahren ohne Beschränkungen herangezogen werden, wie z. B. ein physikalisches Adsorptionsverfahren, ein kovalentes Bindungsverfahren, ein ionisches Bindungsverfahren, ein Vernetzungsverfahren und dergleichen.
Der grundlegende Vorgang zum Messen eines carboxymethylierten Produkts mit einem Immunoassay-Markierungsreagens kann gemäß einem herkömmlichen Nachweisverfahren wie Enzymimmunoassay (EIA), z. B. Radioimmunoassay (RIA), ELISA-Verfahren, Western-Blotting-Verfahren, Dot-Blotting-Verfahren oder dergleichen, durchgeführt werden. Der Vorgang und die Durchführung jedes der vorstehend beschriebenen Nachweisverfahren unterscheiden sich nicht von denen, die im Allgemeinen angewendet werden und können auf bekannten nicht-kompetitiven Verfahren, kompetitiven Verfahren, Sandwich-Verfahren oder dergleichen basieren. Bei dem nicht-kompetitiven Verfahren kann ein carboxymethyliertes Produkt oder ein Anti-CM-Antikörper in einer Probe, nachdem es auf einen unlöslichen Träger aufgetragen worden ist, mit einem Anti-CM-Antikörper oder einem carboxymethylierten Produkt kontaktiert werden. Bei dem kompetitiven Verfahren kann ein künstlich hergestelltes carboxymethyliertes Produkt, nachdem es auf einen unlöslichen Träger aufgebracht worden ist, mit einem Anti-CM-Antikörper, der mit einem carboxymethylierten Produkt in einer Probe umgesetzt wurde, kontaktiert werden. Bei dem Sandwich-Verfahren kann ein Anti-CM-Antikörper oder ein Antikörper gegen eine Biokomponente oder mehrere Biomonponenten, wie z. B. β2M oder Hämoglobin, nach dem er auf einen unlöslichen Träger aufgetragen worden ist, mit einem Antigen in einer Probe und dann mit einem Antikörper gegen eine Biokomponente oder mehreren Biokomponenten oder einem Anti-CM-Antikörper kontaktiert werden. Die Carboxymethylierungsrate eines Proteins oder Peptids oder die Menge eines carboxymethylierten Produkts kann durch diese Verfahren gemessen werden.
Beispiele für das Markierungsmittel zur Verwendung im Immunoassay-Markierungsreagens sind radioaktive Substanzen wie z. B. radioaktives Iod und radioaktiver Kohlenstoff; fluoreszierende Substanzen, wie Fluoresceinisothiocyanat und Tetramethylrhodamin; Enzyme, wie z. B. alkalische Phosphatase und Peroxidase; und dergleichen. Das gemäß dem vorstehend genannten Verfahren erhaltene Antigen-Antikörper Reaktionsprodukt wird unter Verwendung von Radioaktivität, Kolorimetrie, Fluoreszenz, Lumineszenz oder dergleichen nachgewiesen.
Beispielsweise wird ein anti-CM-Antikörper oder ein Antigen in einer Probe in einer Menge von 0,01 bis 1000 μg/cm² auf einen unlöslichen Träger aufgebracht und wird zur Messung mit 0,001 bis 1000 μg eines anti-CM-Antikörpers oder eines Antigens in einer Probe in Kontakt gebracht. Wenn der Antikörper gegen eine Biokomponente oder mehrere Biokomponenten auf einem unlöslichen Träger aufgebracht ist, wird er mit einem Antigen in einer Probe und dann mit einem anti-CM-Antikörper in Kontakt gebracht, wie vorstehend beschrieben. Als der Antikörper, der nicht auf dem unlöslichen Träger aufgebracht ist, wird vorzugsweise ein mit einem Markierungsmittel markierter Antikörper verwendet.
Der grundlegende Vorgang zum Messen eines carboxymethylierten Produkts mit einem Immunagglutinationsreagens kann gemäß einem herkömmlichen Nachweisverfahren durchgeführt werden, wie z. B. mit einem Hämagglutinations-Reaktionsverfahren, einem passiven Agglutinations-Reaktionsverfahren, einem nephelometrischen Immunoassay, einem turbidimetrischen Immunoassay oder dergleichen. Beispielsweise können Teilchen (nachstehend als „sensibilisierte Teilchen" bezeichnet), die 0,001 bis 100 mg eines anti-CM-Antikörpers pro 1 g eines teilchenförmigen unlöslichen Trägers des vorstehend genannten Verfahrens tragen, als eine wirksame Komponente eines immunologischen Reagens verwendet werden, indem sie in einem wässrigen Medium so dispergiert werden, dass sie in einer Menge von 0,001 bis 15 Gew.-% enthalten sind. Im Hinblick auf das leichte Auftreten von Agglutination nach einer Antigen-Antikörper-Reaktion und auf die einfache Beurteilung der Agglutination beträgt der mittlere Teilchendurchmesser des unlöslichen Trägers, der den Antikörper trägt, vorzugsweise 0,05 bis 10 μm. Die gemäß dem vorstehend genannten Verfahren hergestellten sensibilisierten Teilchen werden mit einem Antigen in einer Probe in Kontakt gebracht, um den Grad der Agglutination der sensibilisierten Teilchen zu messen. Der Agglutinationsgrad der Teilchen kann visuell oder durch eine bekannte optische Messung oder andere herkömmliche Verfahren gemessen werden.
Wenn das immunologische Reagens der vorliegenden Erfindung als diagnostisches Reagens verwendet wird, wird die Konzentration eines carboxymethylierten Produkts in einer Probe oder die Carboxymethylierungsrate des carboxymethylierten Produkts unter Verwendung eines anti-CM-Antikörpers gemessen. Veranschaulichende Beispiele der Biokomponente als Probe umfassen Körperflüssigkeiten wie z. B. Blut, Urin, Lymphe, Fruchtwasser, Knochenmarkflüssigkeit und Speichel; extrazelluläre Grundgewebe wie z. B. Hautkollagen und Fibronektin, Gewebe wie z. B. Linsenproteine, Arterie und Niere; und dergleichen. Körperflüssigkeiten, die oft als Probe für klinische Untersuchungen verwendet werden, sind bevorzugt.
Wenn eine Verringerung der Menge oder der Carboxymethylierungsrate eines carboxymethylierten Produkts, das in einer speziellen Biokomponenente enthalten ist, durch Verabreichen eines DRA-Behandlungsmedikaments gemessen wird, kann die Wirkung des Behandlungsmedikaments unter Verwendung des immunologischen Reagens der vorliegenden Erfindung ausgewertet werden.
Das bedeutet, dass gemäß der vorliegenden Erfindung ferner ein immunologisches Reagens zur Auswertung der Wirkung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose bereitgestellt wird, das einen Antikörper, der spezifisch mit einem carboxymethylierten Hämoglobin, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette caboxymethyliert ist, umfasst.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden zweitens die vorstehend genannten Aufgaben und Vorteile der vorliegenden Erfindung durch Verwendung eines N^α-carboxymethylierten Hämoglobins, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, als ein Marker für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes erfüllt.
Während ein Verfahren zum direkten Messen der Carboxymethylierungsrate eines Proteins (beispielsweise eines Proteins im Blut oder Urin) oder eines Peptids in vivo noch nicht verfügbar ist, ist ein Verfahren zum indirekten Messen einer carboxymethylierten Aminosäure durch Abbau eines carboxymethylierten Produkts bereits bekannt. Veranschaulichende Beispiele des Messverfahrens umfassen eines zum Nachweisen einer carboxymethylierten Aminosäure mit Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie durch Hydrolysieren eines carboxymethylierten Produkts; eines zum Nachweisen einer carboxymethylierten Aminosäure mit Gaschromatographie/Massenspektrometrie durch Hydrolysieren eines carboxymethylierten Produkts; und dergleichen. Das Verfahren zum indirekten Messen eines carboxymethylierten Produkts weist jedoch die Probleme auf, dass die Handhabung kompliziert und die Empfindlichkeit niedrig ist. Daher ist ein direktes Messverfahren, das die Messung vereinfacht und eine hohe Empfindlichkeit aufweist, wünschenswert. Unter diesen Umständen haben die beteiligten Erfinder ein Verfahren zum Ableiten eines carboxymethylierten Produkts in vivo, das von einer Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung eines anti-CM-Antikörpers Gebrauch macht, entwickelt.
Der anti-CM-Antikörper wird durch Verwenden eines mit einem organischen Syntheseverfahren synthetisierten carboxymethylierten Produkts als ein Immunogen (Antigen) erhalten. Ein Protein, das als Ausgangsmaterial zum Synthetisieren eines solchen carboxymethylierten Produkts dient, ist Hämoglobin.
Wenn ein Peptid als Ausgangsmaterial zum Synthetisieren eines carboxymethylierten Produkts verwendet wird, kann das Peptid ein Oligopeptid oder ein Polypeptid sein, wie durch Produkte, die durch Abbau des vorstehend genannten Proteins erhalten sind, Produkte, die durch künstliches Synthetisieren eines spezifischen Bereichs des vorstehend genannten Proteins erhalten sind, und dergleichen beispielgebend veranschaulicht wird.
Als ein Verfahren zum Carboxymethylieren einer Aminogruppe oder mehrerer Aminogruppen einer α-Aminosäure oder von Aminogruppen, die an den N-Termini einer Aminosäure, die das vorstehend genannte Protein oder Peptid bilden, vorhanden sind, das heißt, als ein Verfahren zum Substituieren des Wasserstoffatoms der vorstehend genannten Aminogruppe mit einer -CH₂-COOH-Gruppe, kann jedes bekannte Verfahren ohne Beschränkung verwendet werden. Beispielsweise wird, wie vorstehend beschrieben, ein Verfahren angewendet, bei dem eine Aldehydverbindung, die durch CHO-COOH dargestellt wird, eine α-Aminosäure und ein Protein oder Peptid in einer wässriger Lösung wie z. B. einer Boratpufferlösung oder Phosphatpufferlösung gelöst werden, und bei einem pH-Wert von 8 bis 10 in Gegenwart eines Reduktionsmittels für ein hydrogeniertes Produkt wie z. B. Natriumborhydrid oder Cyanoborhydrid miteinander zur Umsetzung gebracht werden, und danach eine N^α-carboxymethylierte α-Aminosäure oder ein carboxymethyliertes Protein oder Peptid (carboxymethyliertes Produkt), bei dem nur Aminogruppen an N-Termini carboxymethyliert sind, durch Ionenchromatographie oder dergleichen ausgegeben werden kann.
Bei der vorstehend beschriebenen Umsetzung kann das Protein oder dergleichen bei einem pH-Wert von höher als 10 denaturiert werden, und bei einem pH-Wert niedriger als 8 wird das Reduktionsmittel für ein hydrogeniertes Produkt instabil. Um die Reaktion spezifisch und quantitativ fortzuführen, beträgt die Reaktionstemperatur vorzugsweise 0 bis 10°C. Alternativ kann ein carboxymethyliertes Produkt durch Inkubieren von reduziertem Zucker und einem Protein über 60 Tage bei 37°C unter aseptischen Bedingungen in Gegenwart von Sauerstoff erhalten werden.
Die carboxymethylierte α-Aminosäure, das Protein oder Peptid, das durch die vorstehend genannte Umsetzung erhalten wird, ist im Allgemeinen wasserlöslich und fällt bei Zusetzen von Aceton, Alkohol, Ammoniumsulphat, Schwermetallsalz oder dergleichen aus. Das vorstehend genannte carboxymethylierte Produkt kann durch ein bekanntes Verfahren, das von einem Verfahren zum Nachweis einer Aminogruppe abweicht, wie z. B. ein UV-Absorptionsverfahren, ein Farbstoffbindungsverfahren, ein Verfahren mit einem Phenolreagens oder dergleichen nachgewiesen werden. Bei den vorstehend genannten Verfahren wird eine Substanz mit einer Aminogruppe, wie z. B. ein Protein, Lipid, Saccharid oder dergleichen leicht carboxymethyliert, wobei bei dem Protein oder Peptid die Seitenketten- oder N-terminalen Aminogruppen von Lysin leicht selektiv carboxymethyliert werden. Bei der vorstehend genannten Reaktion wird ein carboxymethyliertes Produkt, bei dem nur Aminogruppen an den Seitenketten von Lysin oder Aminogruppen an N-Termini und Seitenketten von Lysin carboxymethyliert sind, zusätzlich zu einem carboxymethylierten Produkt, bei dem nur Aminogruppen an N-Termini carboxymethyliert sind, erhalten. Deshalb wird, wenn das carboxymethylierte Produkt aus dem vorstehend genannten Reaktionsprodukt durch Ionenchromatographie oder dergleichen ausgegeben wird und als Antigen verwendet wird, ein anti-CM-Antikörper erhalten. Wenn bei der vorstehend genannten Reaktion ein carboxymethyliertes Protein oder Peptid, bei dem Aminogruppen nur an N-Termini vorhanden sind (ohne Aminogruppen an Seitenketten), verwendet wird, kann ein carboxymethyliertes Produkt mit hoher Reinheit effizient erhalten werden, und ein anti-CM-Antikörper kann leicht erhalten werden.
Es sollte selbstverständlich sein, dass eine Beschreibung des ersten Markers direkt auf ein Antigen zum Herstellen des anti-CM-Antikörpers oder eines Antikörpers, der durch Verwenden des Antigens hergestellt ist, angewendet wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher auch ein immunologisches Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus bereitgestellt, das einen Antikörper umfasst, der spezifisch mit einem N^α-carboxymethylierten Hämoglobin, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, reagiert.
Es sollte selbstverständlich, dass eine Beschreibung des immunologischen Reagens zur Diagnose von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose direkt auf Sachen, die hier nicht beschrieben sind, angewendet wird, wie z. B. die Form dieses immunologischen Reagens, den Nachweis einer Antigen-Antikörper-Reaktion, spezielle Beispiele des immunologischen Reagens, einen unlöslicher Träger, der einen Antikörper oder ein Antigen trägt, ein Verfahren zum Immobilisieren eines Antikörpers oder Antigens auf diesem Träger, das grundlegende Messverfahren eines carboxymethylierten Produkts in einem Immunoassay-Markierungsreagens oder Immunagglutinations-Reagens oder dergleichen.
Da die Carboxymethylierungsrate eines Proteins, das im Körper eines Falls von Diabetes mellitus oder eines Falls von Komplikationen von Diabetes mellitus vorhanden ist, viel höher ist als die einer gesunden Person (siehe Tabellen 5 bis 7), wie in später beschriebenen Beispielen gezeigt ist, kann das in der vorliegenden Erfindung verwendete carboxymethylierte Produkt als ein Marker für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus im Gebiet der klinischen Untersuchung verwendet werden. In anderen Worten: es ist möglich, durch Messen der Carboxymethylierungsrate eines Proteins oder Peptids in vivo, insbesondere in einer Körperflüssigkeit, zu beurteilen, ob eine Person das Auftreten von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus aufweist, oder das Fortschreiten von Diabetes mellitus oder das Auftreten oder das Fortschreiten von Komplikationen von Diabetes mellitus vorherzusagen.
Das vorstehend genannte immunologische Reagens für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus, das von einem Immunoassay-Verfahren Verwendung macht, wird vorteilhaft als ein Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus oder als ein Reagens zur Auswertung der Wirkung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus verwendet.
Wenn das Reagens als ein diagnostisches Reagens verwendet wird, wird die Menge oder der Anteil eines Antigens in einer Probe, d. h. eine N^α-carboxymethylierte α-Aminosäure oder ein carboxymethyliertes Protein oder Peptid, bei dem N-terminale Aminogruppen carboxymethyliert sind, die bzw. das in einer speziellen Biokomponente enthalten ist, unter Verwendung eines anti-CM-Antikörpers gemessen. Veranschaulichende Beispiele der Biokomponente umfassen Köperflüssigkeiten wie z. B. Blut, Urin, Lymphe, Fruchtwasser, Kochenmarkflüssigkeit und Speichel; extrazelluläre Grundgewebe wie z. B. Hautkollagen und Fibronektin, Gewebe wie z. B. Linsenproteine, Arterie und Niere; und dergleichen. Körperflüssigkeiten, die oft als Probe für klinische Untersuchungen verwendet werden, sind bevorzugt.
Wenn das Reagens als ein Reagens zur Auswertung der Wirkung eines Medikaments verwendet wird, wird eine Verringerung der Menge oder des Anteils einer N^α-carboxymethylierten α-Aminosäure oder eines carboxymethylierten Proteins oder Peptids, bei dem N-terminale Aminogruppen carboxymethyliert sind, die bzw. das in einer speziellen Biokomponente vorhanden ist, durch Verabreichen eines Behandlungsmedikaments für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus gemessen.
Das bedeutet, dass gemäß der vorliegenden Erfindung ferner ein immunologisches Reagens zur Auswertung der Wirkung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus bereitgestellt wird, das einen Antikörper umfasst, der spezifisch mit einem N^α-carboxymethylierten Hämoglobin, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, reagiert.
Die folgenden Beispiele werden zur weiteren Erläuterung der Erfindung bereitgestellt, stellen aber in keiner Weise eine Beschränkung dar.
Beispiel 1
(1) Herstellung von carboxymethyliertem Protein
Zur Carboxymethylierung der Aminogruppen eines Proteins wurde 1 ml einer Lösung von humanem Serumalbumin (Fraktion V, ein Produkt der Sigma Co., Ltd.) mit einem pH-Wert von 9 und einer Konzentration von 1 mg/ml mit 1 ml 0,25 M Glyoxylsäure (ein Produkt der Sigma Co., Ltd.) mit einem pH-Wert von 9 gemischt und 12 Stunden bei 0°C belassen. Dann wurde das entstandene Gemisch mit 1 mg Natriumcyanoborhydrid versetzt und weitere 12 Stunden belassen.
Als Kontrolle wurde humanes Serumalbumin auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, dass keine Glyoxylsäure zugesetzt wurde.
Um die Carboxymethylierungsrate von humanem Serumalbumin zu erhalten, wurden die vorstehend genannten Proben 20 Stunden bei 120°C unter Verwendung von 6 N Salzsäure hydrolysiert und die Aminosäuren der Proben wurden mit einem Aminosäureanalysegerät (Modell 835, ein Produkt von Hitachi, Ltd.) analysiert.
Als ein Ergebnis wurde die Bildung von carboxymethyliertem Lysin (nachstehend einfach „CML" genannt) in dem mit Glyoxylsäure gemischten humanen Serumalbumin beobachtet und die Carboxymethylierungsrate des humanen Serumalbumin betrug 12 mol-%. Andererseits betrug die Carboxymethylierungsrate des nicht mit Glyoxylsäure gemischten humanen Serumalbumin 0 mol-%.
Das mit dem vorstehend genannten Verfahren erhaltene carboxymethylierte humane Serumalbumin wurde 2 Tage bei 4°C gegen eine 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4) dialysiert, um nicht-umgesetzte Anteile von Glyoxylsäure und Natriumcyanoborhydrid zu entfernen und wurde als ein Immunogen zum Herstellen eines Antikörpers gegen ein carboxymethyliertes Protein verwendet.
Ferner wurde im Handel erhältliches Hämoglobin (ein Produkt der Sigma Co., Ltd.) auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben carboxymethyliert. Das Ergebnis der Aminosäureanalyse zeigte, dass die Carboxymethylierungsrate dieses carboxymethylierten Hämoglobins 5 mol-% betrug.
(2) Herstellung von Antikörper gegen carboxymethyliertes Protein
Ein Kaninchen mit einem Gewicht von 2 kg oder mehr wurde mit dem in Beispiel 1 hergestellten carboxymethylierten humanen Serumalbumin als Antigen auf die folgende Weise immunisiert.
Ein Gemisch, das 0,5 ml der Antigenlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml und 0,5 ml komplettes Freund-Adjuvans enthielt, wurde in die Ohrvene des Kaninchens injiziert. Anschließend wurde ein Gemisch, das 0,25 ml der Antigenlösung mit einer Konzentration von 2 mg/ml und 0,25 ml inkomplettes Freund-Adjuvans enthielt, zusätzlich alle 2 Wochen injiziert. Während dieser Zeit wurde zur Bestätigung, ob Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin gebildet worden war, einmal alle 2 Wochen Blut aus der marginalen Ohrvene des Kaninchens entnommen. Nach sechs Wochen wurde durch ein ELISA-Verfahren bestätigt, dass Antikörper gegen das carboxymethylierte humane Serumalbumin gebildet worden war, und das gesamte Blut wurde entnommen.
(3) Herstellung einer Affinitätsreinigungssäule
5 ml Affi-Gel 15 (ein Produkt der Bio-Rad Co., Ltd.) wurden mit 75 ml einer 10 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 4,5) gewaschen und 62,5 ml einer Lösung von humanem Serumalbumin mit einer Konzentration von 10 mg/ml wurden zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde mäßig gerührt. Dann wurde ein nicht-umgesetzter Anteil von humanem Serumalbumin durch Filtration entfernt, 30 ml einer 1 M Ethanolaminlösung wurden zugegeben und bei Raumtemperatur mäßig gerührt, und ein nicht-umgesetzter Anteil von N-Hydroxysuccinimidester wurde blockiert. Ein Träger mit immobilisiertem humanem Serumalbumin wurde in eine Säule geladen und mit Ionenaustauscherwasser gewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm zu 0 wurde. Ferner wurde die Säule mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, äquilibriert.
(4) Affinitätsreinigung von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
Der hergestellte Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin wurde mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, auf eine Konzentration von 1 mg/ml verdünnt, und der verdünnte Antikörper wurde in einer Menge von etwa 100 mg auf die Affinitätsreinigungssäule aufgebracht. Dann wurde die Phosphatpufferlösung mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min laufen gelassen, bis die Extinktion bei 280 nm zu 0 wurde. Der Antikörper, der nicht an die Säule gebunden worden war, wurde als Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin gesammelt. Nachdem die Extinktion bei 280 nm zu 0 geworden war, wurde die Phosphatpufferlösung durch eine 0,1 M Glycinpufferlösung (pH-Wert 3,0) ersetzt, der an die Säule gebundene Antikörper wurde eluiert, und die Säule wurde mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, äquilibriert. Der gesammelte Antikörper wurde erneut auf die Säule aufgebracht und der nicht an die Säule gebundene Antikörper wurde gesammelt. Dieser Vorgang wurde ein weiteres Mal wiederholt, und der Antikörper wurde als ein Antikörper zum Biotinmarkieren verwendet.
(5) Markieren von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin mit Biotin
An den so gereinigten Antikörper wurde Biotin unter Verwendung eines Protein-Biotinierungssystem-Kits (ein Produkt der Gibco Co., Ltd.) markiert.
Zu einer Lösung, die durch Verdünnen oder Konzentrieren des gereinigten Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, auf eine Konzentration von 1,5 mg/ml hergestellt worden war, wurde eine Natriumcarbonatpufferlösung (pH-Wert 9,0) unter Erzielung einer Konzentration von 0,05 M zugegeben. Anschließend wurden zu 6,7 ml dieser Antikörperlösung 26 μl einer CAB-NHS-Esterlösung mit einer Konzentration von 50 mg/ml zugegeben und dann bei Raumtemperatur 1 Stunde mäßig gerührt. Zum Beenden der Reaktion wurde ferner Ammoniumchlorid in einer Konzentration von 0,11 M zugegeben. Anschließend wurde die Antikörperlösung in einer mit diesem Kit bereitgestellten Säule entsalzt. Als ferner die Molzahl des eingesetzten Biotins unter Verwendung von Avidin/HABA, das dem Kit beigegeben war, berechnet wurde, wurde gefunden, dass 14 Mol Biotin pro 1 Mol des Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin gebunden waren.
(6) Antigenspezifität von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
Die Antigenspezifität des Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin wurde durch ein kompetitives ELISA-Verfahren bestätigt.
Zu Lösungen der Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin, die mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt (nachstehend als PBS abgekürzt), auf eine Konzentration von jeweils 1 μg/ml verdünnt worden waren, wurde das hergestellte carboxymethylierte humane Serumalbumin auf die Weise zugegeben, dass sich Konzentrationen von jeweils 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml ergaben. Jede dieser Lösungen wurde 1 Stunde bei 37°C belassen und als durch das carboxymethylierte humane Serumalbumin gehemmte Antikörperlösung verwendet.
Aus Hämoglobin (ein Produkt der Sigma Co., Ltd.) hergestelltes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde mit dem gleichen Verfahren wie das zur Herstellung des carboxymethylierten humanen Serumalbumin hergestellt. Das carboxymethylierte Hämoglobin wurde zu Lösungen des Antikörpers gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin mit einer Konzentration von 1 μg/ml auf die Weise zugegeben, dass sich Konzentrationen von jeweils 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml ergaben. Jede dieser Lösungen wurde 1 Stunde bei 37°C belassen und als durch das carboxymethylierte Hämoglobin gehemmte Antikörperlösung verwendet.
Aus β2-Mikroglobulin (ein Produkt der Seikagaku Corporation) hergestelltes carboxymethyliertes β2M wurde mit dem gleichen Verfahren wie dem zur Herstellung des carboxymethylierten humanen Serumalbumin hergestellt. Das carboxymethylierte β2M wurde zu Antikörperlösungen gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin mit einer Konzentration von 1 μg/ml auf die Weise zugegeben, dass sich Konzentrationen von jeweils 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml ergaben.
Jede dieser Lösungen wurden 1 Stunde bei 37°C belassen und als durch das carboxymethylierte β2M gehemmte Antikörperlösung verwendet.
Bevor ein kompetitives ELISA-Verfahren durchgeführt wurde, wurde das hergestellte carboxymethylierte humane Serumalbumin mit PBS auf eine Konzentration von 1 μg/ml verdünnt. Dann wurde die verdünnte Lösung von carboxymethyliertem humanem Serumalbumin auf eine Immunoplatte mit 96 Vertiefungen (ein Produkt der NUNC Co.) in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen, um das carboxymethylierte humane Serumalbumin auf der Immunoplatte zu immobilisieren. Nach 1 Stunde wurde carboxymethyliertes humanes Serumalbumin, das nicht an die Immunoplatte gebunden war, entfernt und PBS, das 0,5% Gelatine enthielt, wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung auf die Immunoplatte aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen, um einen Teil der Immunoplatte, an den das carboxymethylierte humane Serumalbumin nicht gebunden war, zu blockieren. Nach 1 Stunde wurde die Gelatinelösung entfernt, die Immunoplatte wurde dreimal mit PBS gewaschen und die durch das carboxymethylierte humane Serumalbumin gehemmten Antikörperlösungen mit den vorstehend genannten jeweiligen Konzentrationen oder die durch das carboxymethylierte Hämoglobin gehemmten Antikörperlösungen mit den vorstehend genannten jeweiligen Konzentrationen oder die durch das carboxymethylierte β2M gehemmten Antikörperlösungen mit den vorstehend genannten jeweiligen Konzentrationen wurden in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung auf die Immunoplatte aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen. Danach wurde die Immunoplatte dreimal mit PBS gewaschen und eine Lösung eines anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers (ein Produkt der Cosmobio Co., Ltd.), der mit alkalischer Phosphatase einer Konzentration von 1 μg/ml markiert war, wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung auf die Immunoplatte aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen. Dann wurde die Immunoplatte dreimal mit PBS gewaschen und eine Substratlösung, die unter Verwendung eines Substratkits für alkalische Phosphatase (ein Produkt der Bio-Rad Co., Ltd.) gemäss der dem Kit beigegebenen Anleitung hergestellt war, wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgebracht. Nach 5- minütigem Belassen bei Raumtemperatur wurden 100 μl einer 0,4 M Natriumhydroxidlösung pro Vertiefung zugegeben, um die Reaktion der alkalischen Phosphatase zu beenden, und die Extinktion bei 405 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 und Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 Messergebnisse der Antigenspezifität von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
Aus den vorstehend genannten Ergebnissen wird geschlossen, dass der hergestellte Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin auch Reaktivität mit dem carboxymethylierten Hämoglobin und dem carboxymethylierten β2M aufweist, da eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen dem carboxymethylierten humanen Serumalbumin und dem Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin nicht nur durch das carboxymethylierte humane Serumalbumin gehemmt wurde, sondern auch durch das carboxymethylierte Hämoglobin und das carboxymethylierte β2M.
(7) Messung von carboxymethyliertem Hämoglobin im Blut von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose-Patienten
50 μl Blut, das 34 Dialysepatienten, die kein Auftreten von Diabetes mellitus aber von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose aufwiesen, mit einem EDTA-2K enthaltenden Vakuum-Blutentnahmeröhrchen entnommen worden war, wurden mit 250 μl physiologischer Kochsalzlösung einmal gewaschen und durch Zugabe von 1 ml verdünntem Wasser einer hypotonischen Lysis unterzogen, um eine Probe herzustellen.
In der Probe enthaltenes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde mit einem Dot-Blotting-Verfahren gemessen. Nach Messung der Konzentration von Hämoglobin durch ein Cyanmethämoglobin-Verfahren wurde das Hämoglobin an einen PVDF-Film (ein Produkt der Bio-Rad Co., Ltd.) in einer Menge von 500 ng unter Verwendung eines Dot-Blotting-Geräts (ein Produkt der Bio-Rad Co. Ltd.) adsorbiert. Der Film wurde in eine 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 10% Magermilch enthielt, bei Raumtemperatur 1 Stunde eingetaucht und herausgenommen, und es wurden 5 ml der biotinmarkierten Antikörperlösung gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin mit einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Film mit 50 ml einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,05% Tween 20 enthielt, dreimal gewaschen. Anschließend wurde zu dem Film 5 ml einer Biotinkomplexlösung, die mit Avidin-Peroxidase (Vectastine ABC Kit von Funakoshi K. K.) markiert war, zugegeben und eine Inkubation von 1 Stunde wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Film wurde mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung, die 0,05% Tween 20 enthielt (pH-Wert 7,4), dreimal gewaschen und 2 ml eines ECL-Western-Blotting-Nachweisreagens (ein Produkt der Amasham Co., Ltd.) wurde zugegeben. Der Nachweis der Lumineszenzintensität auf dem Film wurde unter Verwendung eines Bio-Rad GS-363-Molecular Imager-Geräts durchgeführt.
Als Kontrolle wurde carboxymethyliertes Hämoglobin mit dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben unter Verwendung des wie vorstehend beschrieben Hergestellten als Probe gemessen (um die Carboxymethylierungsrate von aus Dialysepatienten erhaltenenem Hämoglobin zu erhalten). Die Messergebnisse sind in 2 als DRA(+) gezeigt. Die mittlere Carboxymethylierungsrate von Dialysepatienten mit Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose betrug 1,21%.
Vergleichsbeispiel 1
Die aus einer Probe erhaltene Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten, mit Ausnahme, dass Blut, das 34 Dialysepatienten entnommen wurde, bei denen weder Diabetes mellitus noch mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose auftrat, als Probe verwendet wurde, anstatt von Blut, das Dialysepatienten entnommen wurde, bei denen mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose auftrat. Die Messergebnisse sind in 2 als DRA(–) gezeigt. Die mittlere Carboxymethylierungsrate von Dialysepatienten ohne Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose betrug 0,75%.
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin von Dialysepatienten, bei denen mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose auftrat, viel höher war, als die von Dialysepatienten, bei denen mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose nicht auftrat. Daraus wird geschlossen, dass carboxymethyliertes Hämoglobin als ein Marker für mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose wirksam verwendbar ist.
Beispiel 2
Von den Dialysepatienten mit Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose aus Beispiel 1 wurden nur Patienten gemessen, die 100 Monate oder mehr an Dialyse erfahren hatten. Die mittlere Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin der Patienten betrug 1,32%. Die Ergebnisse sind in 3 als DRA(+) gezeigt.
Vergleichsbeispiel 2
Von den Dialysepatienten ohne Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose aus Vergleichsbeispiel 1 wurden nur Patienten gemessen, die 100 Monate oder mehr an Dialyse erfahren hatten. Die mittlere Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin der Patienten betrug 0,67%. Die Ergebnisse sind in 3 als DRA(–) gezeigt.
Aus den Ergebnisse ist offensichtlich, dass ein grösserer Unterschied der Carboxymethylierungsrate zwischen Patienten, die über einen langen Zeitraum Dialyse erfahren hatten und bei denen mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose auftrat, und Patienten, die über einen langen Zeitraum Dialyse erfahren hatten, bei denen aber keine mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose auftrat, besteht. Daher ist das carboxymethyliertes Hämoglobin als Marker für mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose bei Patienten, die über einen langen Zeitraum Dialyse erfahren, wirksamer verwendbar.
Referenzbeispiel 1
Die aus einer Probe erhaltene Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten, mit der Ausnahme, dass Blut, das 70 Patienten mit Dialyse unabhängig vom Auftreten von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose entnommen wurde, als Probe verwendet wurde, anstatt von Dialysepatienten, bei denen in Beispiel 1 mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose auftrat. Als die Beziehung zwischen der Dauer der Dialyse der Patienten und der gemessenen Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin untersucht wurde, wurde beobachtet, dass die Carboxymethylierungsrate dazu neigte, mit längerer Dauer der Dialyse anzusteigen. Eine starke Korrelation zwischen diesen Werten wurde jedoch nicht beobachtet (Korrelationskoeffizient r = 0,293). Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt.
Aus Beispiel 1, Vergleichsbeispiel 1, Beispiel 2, Vergleichsbeispiel 2 und Referenzbeispiel 1 wird klar, dass ein Ansteigen der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin die Dauer der Dialyse teilweise, hauptsächlich aber die Anwesenheit des Auftretens von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose wiedergibt.
Referenzbeispiel 2
Als die Carboxymethylierungsrate von männlichen Patienten mit der von weiblichen Patienten, die in Referenzbeispiel 1 gemessen wurde, verglichen wurde, betrug die mittlere Carboxymethylierungsrate von männlichen Patienten 1,20% und die von weiblichen Patienten betrug 0,92%. Es besteht also kein großer Unterschied zwischen ihnen. Die Ergebnisse sind in 5 gezeigt.
Es ist daher offensichtlich, dass die Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin nicht das Geschlecht wiedergibt.
Referenzbeispiel 3
Die aus einer Probe erhaltene Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten, mit Ausnahme, dass Blut, das 47 gesunden Personen entnommen wurde, als Probe verwendet wurde, anstatt von Dialysepatienten, bei denen mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose auftrat. Die Messergebnisse sind in 5 gezeigt. Als die gemessene Carboxymethylierungsrate von männlichen Patienten mit der von weiblichen Patienten verglichen wurde, betrug die mittlere Carboxymethylierungsrate von männlichen Patienten 0,44% und die von weiblichen Patienten betrug 0,49%. Es besteht also kein großer Unterschied zwischen ihnen. Folglich wurde gezeigt, dass die Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin auch im Fall von gesunden Personen das Geschlecht nicht wiedergibt.
Als ferner die in Referenzbeispiel 1 erhaltene Carboxymethylierungsrate von Dialysepatienten mit der Carboxymethylierungsrate von gesunden Personen verglichen wurde, betrug die mittlere Carboxymethylierungsrate von Dialysepatienten 0,97% und die von gesunden Personen betrug 0,45%. Es bestand also ein großer Unterschied zwischen ihnen.
Dies deutet darauf hin, dass die Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin in einem Fall von Nephropathie größer ist als der einer gesunden Person.
Beispiel 3
(1) Herstellung eines carboxymethylierten Peptids
Um die N-terminalen Aminogruppen eines synthetischen Peptids (Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin-Glutaminsäure-Glutaminsäure), das eine aus der β-Kette von Hämoglobin abgeleitete Anordnung aufweist, zu carboxymethylieren, wurde 1 ml des synthetischen Peptids mit einem pH-Wert von 9 und einer Konzentration von 1 mg/ml mit 1 ml 0,25 M Glyoxylsäure (ein Produkt der Sigma Co., Ltd) mit einem pH-Wert von 9 gemischt, und die Mischung wurde 12 Stunden bei 0°C belassen. Dann wurde zu der entstandenen Mischung 1 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben und weitere 12 Stunden belassen.
Als Kontrolle wurde ein synthetisches Peptid auf die gleiche Weise wie vorstehend beschrieben behandelt, mit der Ausnahme, dass keine Glyoxylsäure zugegeben wurde.
Die Carboxymethylierungsraten der vorstehend behandelten synthetischen Peptide wurden durch Messen von nicht-umgesetzten Aminogruppen unter Verwendung von Trinitrobenzolsulfonsäure (nachfolgend als TNBS abgekürzt) gemäss der folgenden Weise erhalten.
Das heisst, 0,5 ml jeder Probe wurde zu 0,5 ml einer 0,1 M wässrigen Natriumhydroxidlösung, die 0,1 M Natriumtetraborat enthielt, zugegeben. Dann wurden 20 μl 1,1 M rekristallisiertes und mit einer wässrigen Salzsäurelösung gewaschenes TNBS zu der vorstehend genannten Lösung zugegeben und dann gerührt. Nach 30 Minuten wurden 2 ml 98,5 mM Natriumdihydrogenphosphat, das 1,5 mM Natriumsulfid enthielt, zugegeben, um die Umsetzung zu beenden. Als die Extinktion bei 420 nm gemessen wurde, wurde die Extinktion von carboxymethyliertem humanem Serumalbumin mit einem Wert von 0,03 und die Extinktion des synthetischen Peptids (Kontrolle), das nicht mit Glyoxylsäure behandelt war, wurde mit einem Wert von 1,25 gefunden. Als ein System, das kein synthetisches Peptid enthielt, auf die gleiche Weise gemessen wurde, betrug die Extinktion 0,03. Es wurde daher gefunden, dass die Carboxymethylierungsrate von carboxymethyliertem synthetischem Peptid 100% betrug.
(2) Kuppeln zwischen carboxymethyliertem Peptid und Rinderserumalbumin
Das wie vorstehend beschrieben hergestellte carboxymethylierte Peptid wurde mit Rinderserumalbumin (nachfolgend als „BSA" abgekürzt) unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDCI) (ein Produkt der Sigma Co., Ltd.) und N-Hydroxybernsteinsäureimid (ein Produkt der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) gekoppelt. Das heißt, dass, nachdem alle Ausgangsmaterialien auf Eis gekühlt waren, 228 μl einer wässrigen N-Hydroxybernsteinsäureimid-Lösung mit einer Konzentration von 10 mg/ml zu 500 μl einer wässrigen Lösung eines carboxymethylierten Peptids mit einer Konzentration von 2,4 mg/ml zugegeben und damit gemischt wurden. Dann wurde der Mischung 1,5 ml einer wässrigen EDCI-Lösung mit einer Konzentration von 20 mg/ml zugegeben, schnell gerührt und 15 Minuten auf Eis umgesetzt. Dann wurden 1160 μl einer wässrigen BSA-Lösung mit einer Konzentration von 5 mg/ml zugegeben und für eine Nacht bei 4°C belassen. Dann wurde ein nicht-gekoppelter Anteil des carboxymethylierten Peptids durch eine Dialysemembran (ein Produkt der Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) mit einem fraktionierten Molekulargewicht von etwa 10000 entfernt. Als Kontrolle wurde ein synthetisches Peptid, dessen N-Terminus mit einer Boc-Gruppe geschützt war (Boc-Valin-Histidin-Leucin-Threonin-Prolin-Glutaminsäure-Glutaminsäure), mit BSA auf die gleiche Weise gekoppelt wie vorstehend beschrieben, so dass die Menge des synthetischen Peptids 10-mal so groß wie jene eines Konjugats des carboxymethylierten Peptids und BSA wurde.
(3) Herstellung von Antikörper gegen carboxymethyliertes Peptid
Dies wurde auf genau die gleiche Weise wie bei Beispiel 1 durchgeführt.
(4) Herstellung einer Affinitätsreinigungssäule
5 ml Affi-Gel 15 (ein Produkt der Bio-Rad Co., Ltd.) wurden mit 15 ml einer 10 mM Acetatpufferlösung (pH-Wert 4,5) gewaschen und 11,6 ml einer Konjugatlösung, die das vorstehend genannte Boc-geschützte Peptid und Rinderserumalbumin mit einer Konzentration von 5 mg/ml enthielt, wurden zugegeben und bei Raumtemperatur 1 Stunde mäßig gerührt. Dann wurde ein nicht-umgesetzter Anteil des Konjugats des Boc-geschützten Peptids und Rinderserumalbumin durch Filtration entfernt, 30 ml einer 1 M Ethanolaminlösung wurden zugegeben und bei Raumtemperatur mäßig gerührt, und ein nicht-umgesetzter Anteil von N-Hydroxysuccinimidester wurde blockiert. Ein Träger mit immobilisiertem Konjugat des Boc-geschützten Peptids und Rinderserumalbumin wurde in eine Säule geladen und mit Ionenaustauscherwasser gewaschen, bis die Extinktion bei 280 nm zu 0 wurde. Ferner wurde die Säule mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, äquilibriert.
(5) Affinitätsreinigung von Antikörper gegen carboxymethyliertes Peptid
Dies wurde auf genau die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein carboxymethyliertes Peptid anstelle von carboxymethyliertem humanem Serumalbumin verwendet wurde.
(6) Markieren von Antikörper gegen carboxymethyliertes Peptid mit Biotin
Dies wurde auf genau die gleiche Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass ein carboxymethyliertes Peptid anstelle von carboxymethyliertem humanem Serumalbumin verwendet wurde. 14 mol Biotin wurden an 1 mol des Antikörpers gegen das carboxymethylierte Peptid gebunden.
(7) Antigenspezifität von Antikörper gegen carboxymethyliertes humanes Serumalbumin
Die Antigenspezifität des Antikörpers gegen carboxymethyliertes Peptid wurde durch ein kompetitives ELISA-Verfahren bestätigt.
Zu Lösungen der Antikörper gegen ein carboxymethyliertes Peptid, die mit einer 10 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,15 M Natriumchlorid enthielt (nachstehend als PBS abgekürzt), auf eine Konzentration von jeweils 1 μg/ml verdünnt worden waren, wurde das hergestellte Konjugat des carboxymethylierten Peptids und BSA (nachstehend als CM-BSA abgekürzt) auf die Weise zugegeben, dass sich Konzentrationen von jeweils 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml ergaben. Jede dieser Lösungen wurde 1 Stunde bei 37°C belassen und als durch CM-BSA gehemmte Antikörperlösung verwendet.
Aus Hämoglobin (ein Produkt der Sigma Co., Ltd.) hergestelltes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde mit dem gleichen Verfahren wie das zur Herstellung des carboxymethylierten Peptids hergestellt. Das carboxymethylierte Hämoglobin wurde zu Lösungen des Antikörpers gegen das carboxymethylierte Peptid mit einer Konzentration von 1 μg/ml auf die Weise zugegeben, dass sich Konzentrationen von jeweils 0,1, 1, 10 und 100 μg/ml ergaben. Jede dieser Lösungen wurde 1 Stunde bei 37°C belassen und als durch das carboxymethylierte Hämoglobin gehemmte Antikörperlösung verwendet.
Bevor ein kompetitives ELISA-Verfahren durchgeführt wurde, wurde das hergestellte CM-BSA mit PBS auf eine Konzentration von 1 μg/ml verdünnt. Dann wurde die verdünnte CM-BSA-Lösung auf eine Immunoplatte mit 96 Vertiefungen (ein Produkt der NUNC Co.) in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen, um das CM-BSA auf der Immunoplatte zu immobilisieren. Nach 1 Stunde wurde CM-BSA, das nicht an die Immunoplatte gebunden war, entfernt und PBS, das 0,5% Gelatine enthielt, wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung auf die Immunoplatte aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen, um einen Teil der Immunoplatte, an den das CM-BSA nicht gebunden war, zu blockieren. Nach 1 Stunde wurde die Gelatinelösung entfernt, die Immunoplatte wurde dreimal mit PBS gewaschen und die durch das CM-BSA gehemmten Antikörperlösungen mit den vorstehend genannten jeweiligen Konzentrationen oder die durch das carboxymethylierte Hämoglobin gehemmten Antikörperlösungen mit den vorstehend genannten jeweiligen Konzentrationen wurden in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung auf die Immunoplatte aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen. Danach wurde die Immunoplatte dreimal mit PBS gewaschen und eine Lösung eines anti-Kaninchen-IgG-Antikörpers (ein Produkt der Cosmobio Co., Ltd.), der mit alkalischer Phosphatase einer Konzentration von 1 μg/ml markiert war, wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung auf die Immunoplatte aufgebracht und 1 Stunde bei 37°C belassen. Dann wurde die Immunoplatte dreimal mit PBS gewaschen und eine Substratlösung, die unter Verwendung eines Substratkits für alkalische Phosphatase (ein Produkt der Bio-Rad Co., Ltd.) gemäss der dem Kit beigegebenen Anleitung hergestellt war, wurde in einer Menge von 100 μl pro Vertiefung aufgebracht. Nach 5-minütigem Belassen bei Raumtemperatur wurden 100 μl einer 0,4 M Natriumhydroxidlösung pro Vertiefung zugegeben, um die Reaktion der alkalischen Phosphatase zu beenden, und die Extinktion bei 405 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. Aus den Ergebnissen wird geschlossen, dass der hergestellte Antikörper gegen das carboxymethyliertes Peptid Reaktivität nicht nur mit einem carboxymethylierten Peptid, sondern auch mit carboxymethyliertem Hämoglobin aufweist, da eine Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen CM-BSA und dem Antikörper gegen das carboxymethylierte Peptid auch durch das carboxymethylierte Hämoglobin gehemmt wurde.
(8) Messung von carboxymethyliertem Hämoglobin im Blut von Diabetes mellitus-Fällen
50 μl Blut, das von 8 Diabetes mellitus-Fällen, die nicht an Komplikationen litten, mit einem EDTA-2K enthaltenden Vakuum-Blutentnahmeröhrchen entnommen worden war, wurden mit 250 μl physiologischer Kochsalzlösung einmal gewaschen und durch Zugabe von 1 ml destilliertem Wasser einer hypotonischen Lysis unterzogen, um eine Probe zu herzustellen. Das mittlere Alter der Fälle betrug 62,1.
In der Probe enthaltenes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde mit einem Dot-Blotting-Verfahren gemessen. Nach Messung der Konzentration von Hämoglobin durch ein Cyanmethämoglobin-Verfahren wurde das Hämoglobin an einen PVDF-Film (ein Produkt der Bio-Rad Co., Ltd.) in einer Menge von 500 ng unter Verwendung eines Dot-Blotting-Geräts (ein Produkt der Bio-Rad Co. Ltd.) adsorbiert. Der Film wurde in eine 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 10% Magermilch enthielt, bei Raumtemperatur 1 Stunde eingetaucht und herausgenommen, und es wurden 5 ml der biotinmarkierten Antikörperlösung gegen carboxymethyliertes Peptid mit einer Konzentration von 1 μg/ml zugegeben. Nach 1 Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurde der Film mit 50 ml einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,05% Tween 20 enthielt, dreimal gewaschen. Anschließend wurde zu dem Film 5 ml einer Biotinkomplexlösung, die mit Avidin-Peroxidase (Vectastine ABC Kit von Funakoshi K. K.) markiert war, zugegeben und eine Inkubation von 1 Stunde wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Film wurde mit einer 20 mM Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,4), die 0,05% Tween 20 enthielt, dreimal gewaschen und 2 ml eines ECL-Western-Blotting-Nachweisreagens (ein Produkt der Amasham Co., Ltd.) wurde zugegeben. Der Nachweis der Lumineszenzintensität auf dem Film wurde unter Verwendung eines Bio-Rad GS-363-Molecular Imager-Geräts durchgeführt.
Als Kontrolle wurde carboxymethyliertes Hämoglobin mit dem gleichen Verfahren wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von im Handel erhältlichem Hämoglobin (ein Produkt der Sigma Co., Ltd) als Probe gemessen. Die Lumineszenzintensität von Hämoglobin, das aus den vorstehend genannten Fällen von Diabetes mellitus erhalten war, ist unten gezeigt, wobei die Lumineszenzintensität des im Handel erhältlichen Hämoglobins 100 beträgt. Die gemessenen Werte der Lumineszenzintensität sind ebenfalls nachstehend gezeigt. Die Messergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Messergebnisse von carboxymethyliertem Hämoglobin, das in Blut, das von Diabetes mellitus-Fällen erhalten ist, enthalten ist
Anmerkung

1) Die Probe ist im Handel erhältliches Hämoglobin

Beispiel 4
In einer Probe enthaltenes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 gemessen, mit der Ausnahme, dass Blut, das von 7 Fällen mit Komplikationen von Diabetes mellitus erhalten war, die zusätzlich zu Diabetes mellitus an Nephropathie oder Retinopathie litten, anstelle von Blut, das von Diabetes mellitus-Fällen erhalten war, als Probe verwendet wurde. Das mittlere Alter der Fälle betrug 66,3. Die Messergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Messergebnisse von carboxymethyliertem Hämoglobin, das in Blut, das von Fällen von Komplikationen von Diabetes mellitus erhalten ist, enthalten ist
Anmerkung

1) Die Probe ist im Handel erhältliches Hämoglobin

Vergleichsbeispiel 3
In einer Probe enthaltenes carboxymethyliertes Hämoglobin wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 3 gemessen, mit der Ausnahme, dass Blut, das von 10 gesunden Personen erhalten war, anstelle von Blut, das von Diabetes mellitus-Fällen erhalten war, als Probe verwendet wurde. Das mittlere Alter der gesunden Personen betrug 60,5. Die Messergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Als die Lumineszenzintensitäten der Gruppe der in Beispiel 3 gemessenen Diabetes mellitus-Fälle mit denen von gesunden Personen statistisch verglichen wurden (t-Test), waren die Lumineszenzintensitäten der Gruppe der Diabetes mellitus-Fälle mit einem signifikanten Unterschied (p, 0,05%) viel höher als die der gesunden Personen. Das bedeutet, dass Blut, das aus einem Diabetes mellitus-Fall erhalten ist, viel mehr Hämoglobin mit carboxymethylierten N-Termini enthält als Blut, das von einer gesunden Person erhalten ist.
Als die Lumineszenzintensitäten der in Beispiel 4 gemessenen Fälle von Komplikationen von Diabetes mellitus mit denen von gesunden Personen durch t-Test verglichen wurden, waren die Lumineszenzintensitäten der Gruppe der Fälle von Komplikationen von Diabetes mellitus mit einem signifikanten Unterschied (p, 0,05%) viel höher als die der gesunden Personen. Das bedeutet, dass Blut, das aus einem Fall mit Komplikationen von Diabetes mellitus erhalten ist, viel mehr Hämoglobin mit carboxymethylierten N-Termini enthält als Blut, das von einer gesunden Person erhalten ist.
Tabelle 4 Messergebnisse von carboxymethyliertem Hämoglobin, das in Blut, das von gesunden Personen erhalten ist, enthalten ist
Anmerkung

1) Die Probe ist im Handel erhältliches Hämoglobin

Claims

In vitro-Verwendung eines N^α-carboxymethylierten Hämoglobins, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, als Marker für eine mit Dialyse in Zusammenhang stehende Amyloidose.
In vitro-Verwendung eines N^α-carboxymethylierten Hämoglobins, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, als Marker für Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Hämoglobin aus einer Körperflüssigkeit oder Gewebe stammt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Marker zur Verwendung bei einer Diagnose oder für eine Auswertung der Wirkung eines Medikaments durch Ex vivo-Messung der Carboxymethylierungsrate von Hämoglobin in vivo geeignet ist.
Immunologisches Reagens, das zur Verwendung (i) bei einer Diagnose von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose, (ii) bei einer Auswertung der Wirkung eines Medikaments zur Behandlung oder Vermeidung von mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose, (iii) bei der Diagnose von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus, oder (iv) bei der Auswertung der Wirkung eines Medikaments bei der Behandlung oder Vermeidung von Diabetes mellitus oder Komplikationen von Diabetes mellitus geeignet ist, wobei das Reagens einen Antikörper, der spezifisch mit einem N^α-carboxymethylierten Hämoglobin, bei dem das N-terminale Valin der β-Kette carboxymethyliert ist, reagiert, umfasst.
Test-Kit, das zur Diagnose von Diabetes mellitus, Komplikationen von Diabetes mellitus oder mit Dialyse in Zusammenhang stehender Amyloidose geeignet ist, umfassend ein immunologisches Reagens gemäß Anspruch 5.