DE19951684A1 - Neuer immunologischer Assay zur Bestimmung von C-peptidhaltigen Kontaminanten in Proben von Humanisulin und dessen Derivaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von gentechnisch hergestelltem Humaninsulin und dessen Derivaten (nachdem Humaninsulin oder dessen Derivate aus ihren Vorstufen durch enzymatische Spaltung hergestellt wurden) auf das Vorhandensein von Präproinsulin, dessen Drivaten, C-Peptidhaltigen Insulinderivaten und/oder isoliertem C-Peptid mittels eines nicht radioaktiven Assay mit den folgenden Schritten: DOLLAR A (a) Vermischung der Proben mit Verdünnungspuffer; DOLLAR A (b) Versetzen der nach (a) erhaltenen Mischung mit einem Tracer; DOLLAR A (c) Versetzen der nach (b) erhaltenen Mischung mit Antikörper; DOLLAR A (d) Versetzen der nach (c) erhaltenen Mischung mit "C-peptide second antibody bead"; DOLLAR A (e) Luminometrische Analyse der nach (d) erhaltenen Mischung.

Description

Rekombinante Insuline werden durch Downstream-Processing von Fusionsproteinen, die von transformierten E. coli exprimiert werden, hergestellt. Nach der Faltreaktion werden Insulinvorstufen, die die korrekten Disulfidbrücken des Insulins enthalten, aus dem Präproinsulin durch Trypsinbehandlung herausgeschnitten, wodurch das C-Peptid durch synchrone Spaltung an den Sequenzstellen -Arg-Arg-(B31-B32) und -Lys-Arg-(A1-A0) freigesetzt wird. Die Sequenz des C-Peptids entspricht dem Affen-Peptid, das sich vom Human-C-Peptid durch eine Aminosäureposition (37 Pro statt Leu) unterscheidet.

Nach der Reinigung muß das Endprodukt, nämlich Humaninsulin, auf das Vorhandensein von Spuren von Präproinsulin und dessen Derivaten, C- peptidhaltigen Insulinderivaten und isoliertem C-Peptid (gemeinsam mit dem Begriff C-peptidartige Aktivität bezeichnet) mittels RIA untersucht werden. Im folgenden Text werden die Abkürzungen "HI" für "Humaninsulin", "HIA1" für "Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-Humaninsulin" bzw. "HIA2" für "Lys(B3), Glu(B29)-Humaninsulin" verwendet.

Der Nachteil der RIA-Methode besteht darin, daß ein frisch iodierter Tracer und eine 3-tägige Inkubation mit allen damit in Zusammenhang stehenden Unannehmlichkeiten erforderlich sind. Außerdem ist die Proben­ vorbereitung sehr zeitaufwendig und kompliziert, und es wurde bereits früher durch Messungen nachgewiesen, daß der Assay manchmal unter unvorhersehbaren Störungen bedingt durch Tracer-Qualität, Probenhandhabung sowie Fällungen während der 3-tägigen Inkubation leidet. Dadurch, daß Wiederholungen erforderlich sind, wird also Zeit verschwendet.

Ein weiterer Nachteil der RIA-Methode besteht darin, daß sie sich nicht für HIA1-Proben oder HI-Materialien aus den Reinigungsschritten vor der CPB-Spaltung eignet, da diese Proben bei dem angegebenen pH der Assay-Methode einen Niederschlag bilden. Ein Anheben des pH-Werts des RIA-Assay-Puffers verbessert zwar die Auflösung der Probe, verschlechtert jedoch die Assay-Leistung.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Antikörper herzustellen, die sich im Immunassay für die quantitative Bestimmung von insulin-C-peptidhaltigen Kontaminanten in Endproben der HI(Insuman)-, HIA1­ (Glargine)- und HIA2-Produktion sowie in In-Process-Material der drei Insulinvarianten eignen.

Die Antikörper sollten eine Affinität für isoliertes Affen-C-Peptid und (Prä-)Prolinsulin aufweisen, sollten jedoch auch fähig sein, an Modellverbindungen zu binden (siehe Seite 2), die dergestalt sind, daß sie eine Gruppe möglicher Nebenprodukte und Kontaminanten, die bei der industriellen gentechnischen Herstellung von Insulin erwartet werden können, simulieren.

Ein Antikörperpräparat, das den obengenannten Erfordernissen entspricht, läßt sich in Form eines geeigneten Assays zur quantitativen Bestimmung einer insulin-C-peptidartigen Immunreaktivität in Endproben der Insulinaufreinigung sowie in ausgewähltem In-Process-Material verwenden.

Aufgrund der physikalischen Eigenschaften des Prüfmaterials müssen die verwendeten Antikörper mit ausreichender Affinität mit den Antigenen bei pH 8,5-9,0 reagieren. Die Interaktion darf nicht durch die Probenmatrix beeinflußt werden, die durch einen Insulingehalt von 1 mg/ml gekennzeichnet ist. Es muß möglich sein, mit dem Immunassay C-peptidhaltige Kontaminanten (eine insulin-C-peptidartige Immunreaktivität) unter 10 ng/ml (10 ppm im Vergleich zu Humaninsulin) quantitativ zu bestimmen.

Theoretisch können mehrere C-peptidhaltige Kontaminanten als Nebenprodukte der Insulinproduktion erwartet werden. Diese sind in Fig. 1 dargestellt.

In der vorliegenden Anmeldung wird ein neuer nichtradioaktiver Immunassay beschrieben, bei dem die oben beschriebenen Nachteile des ursprünglichen RIA vermieden werden. Die folgenden stellen die Grundlage für den neuen Assay dar:

• 1. PPI-affinitätsgereinigte Antikörper von Schaf-S95-11.
• 2. Vereinfachte Probenverdünnung in zwei Schritten ohne pH-Kontrolle und pH-Einstellung nach der Probenauflösung in jeder Probe.
• 3. Langzeitstabiler chemolumineszenter C-Peptid-Tracer, so daß der Assay mit ein- und demselben Tracer über einen langen Zeitraum durchgeführt werden kann.
• 4. Mit Sekundärantikörpern (Daiichi Radioisotope Labs. LTD) beschichtete Polystyrolkörner zum Einfangen von Ziegen-Antikörpern gegen Insulin- C-Peptid mit oder ohne gebundene(n) Antigene oder Tracer.
• 5. Einstufige gleichzeitige Inkubation aller Bestandteile über nur 5 Stunden.

Da der Assay bei pH = 8,5-8,7 durchgeführt wird, bleiben die Testmaterialien HI und HIA1 beide während der gesamten Inkubationsdauer in Lösung und können mit dem gleichen Assay, ohne ihn zu variieren, analysiert werden.

Da das C-Peptid der rekombinanten Insuline HI und HIA1 von Affen- Proinsulin stammt, ist zur quantitativen Bestimmung von insulin-C-peptidartiger Immunreaktivität in rekombinanten Insulinendproben und In-Process-Material von HMR ein Assay erforderlich, der sich zum Nachweis von Affen-Insulin-C-Peptid eignet.

Das HIA2-C-Peptid ist im Vergleich mit dem C-Peptid von Humaninsulin in der C-terminalen Region mutiert und verkürzt, und es ist daher künstlich und kein natürlich vorkommendes Peptid.

Einige diagnostische Immunassays, die im Handel erhältlich sind, können zur Bestimmung der Konzentration von Insulin-C-Peptid im Serum verwendet werden.

Alle Assays weisen eine Speziesspezifität für Humaninsulin-C-Peptid auf, einige für Ratten-, Rinder- und Schweine-C-Peptid, jedoch keiner für Affen- C-Peptid.

Ziel der im Handel erhältlichen Assays ist es, sie so spezifisch wie möglich, entweder für C-Peptid oder für Proinsulin, zu machen.

Wir beabsichtigen jedoch, Antikörper (einen Assay) zu erhalten, die bzw. der sowohl mit C-Peptid als auch mit (Prä-)Proinsulin mit beinahe der gleichen Affinität reagieren bzw. reagiert.

Die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendeten Antikörper werden dadurch erhalten, daß man ein Säugetier, vorzugsweise ein Schaf, mit der gereinigten C-Kette von Insulin, vorzugsweise der in dem Europäischen Patent 0 032 675 beschriebenen C-Kette des Affen-Insulins, immunisiert, woran sich eine Affinitätsreinigung mit an einem geeigneten Träger immobilisierten Insulin anschließt, wobei es sich bei diesem Insulin vorzugsweise um ein halbsynthetisches Humaninsulin oder ein rekombinantes Human-PPI handelt. Die Aufreinigung der Antikörper ist in den Beispielen und Anhängen beschrieben.

Wir prüften bei drei im Handel erhältlichen Assays, ob sie den Erfordernissen entsprachen.

1. RIA-coat-C-Peptid, Katalognr. 323.171, BYK Sangtec Diagnostica GmbH & Co. KG (63120 Dietzenbach, Deutschland; Durchführung 3 Stunden)

Dieser Assay eignete sich nicht für die quantitative Bestimmung von Affen- Insulin-C-Peptid in den angegebenen Proben. Dies könnte folgende Ursachen haben:

• - Ungenügende Kreuzreaktivität mit Affen-C-Peptid und/oder PPI (Herstellerangabe: 25%)
• - Ungeeignete Bestandteile des Probenpuffers
• - Störung durch die hohen Konzentrationen an Humaninsulin in den Proben (1 mg/ml).

2. Human-C-Peptide RIA Kit, Katalognr. HCP-20 K, Linco Research Inc. St. Louis, MO 63304-USA (Durchführung des Assay: 2 Tage)

Dieser Assay beruht auf Antikörpern gegen Human-C-Peptid, die eine 90%ige Kreuzreaktivität mit Affen-C-Peptid und eine < 4%ige Kreuzreaktivität mit Human-Proinsulin aufweisen.

Der Assay läßt sich zur Untersuchung der angegebenen HI-Proben durchführen, aufgrund des pH-Werts des Puffers in diesem Kit tritt jedoch eine Ausfällung von Prozeßmaterial bei der HI-Produktion auf. Der Assay kann nicht für HIA1, das bei pH 7,4 nicht löslich ist, angewandt werden.

Ein Vergleich mit dem erfindungsgemäßen Assay, bei dem chemolumineszierende beschichtete Perlen verwendet werden, zeigt, daß die bei dem Assay verwendeten Antikörper zwar stärker an die vom Menschen und Affen isolierten C-Peptide binden, jedoch nicht so gut wie das Antikörperpräparat der vorliegenden Erfindung mit HI PPI und mit an der EDP-Stelle gespaltenem PPI reagieren. Es muß bemerkt werden, daß der Assay mit den beschichteten Perlen bei einem pH von 8,7 und der Linco-Assay bei einem pH von 7,4 durchgeführt wurde.

3. Human Proinsulin RIA Kit, Katalognr. HP1-15K; K, Linco Research Inc. St. Louis, MO 63304-USA (Durchführung des Assays: 3 Tage)

Mit diesem Assay kann Affen-C-Peptid nicht nachgewiesen werden, und seine Spezifität ist daher für unsere Zwecke nicht ausreichend.

Schlußfolgerung: Assays auf Grundlage von Antikörpern gegen Human-C-Peptid oder Human-Proinsulin, die bei neutralem pH durchgeführt werden, entsprechen unseren Anforderungen nicht.

Unsere Anforderungen lauten:

• - Assay-pH < 8,5
• - Ausreichende Spezifität für PPI
• - Ausreichende Affinität für die Modelltestverbindungen
• - Keine Störung der Affinität durch die Anwesenheit von Humaninsulin (1 mg/ml)
• - Keine Radioaktivität
• - Kurze Assay-Dauer.

Strategie für den erforderlichen Assay:

• - Immunisierung mit Affen-Insulin-C-Peptid, das nicht an einen Träger gebunden ist.
• - Affinitätsreinigung mittels PPI-Säule
• - Entfernung von Antikörpern, die mit Humaninsulin spezifisch oder unspezifisch reagieren, und zwar mittels Immunadsorption an Humaninsulin
• - Screening von Antikörpern aus unterschiedlichen Blutproben durch Untersuchung ihrer Bindung an chemolumineszierenden C-Peptid-Tracer bei pH 8,5.
• - Herstellung von Modell-Testverbindungen.
• - Versuchsdurchführung bei pH < 8,5 mit einem Puffer, der bei diesem pH eine hohe Pufferkapazität aufweist.

Die Erfindung soll nun anhand der Beispiele beschrieben werden, was jedoch keine Beschränkung darstellt.

Beispiele Material

Doppelt destilliertes Wasser
Mononatriumphosphat, Riedel (04269)
Natriumchlorid, Merck
Natriumazid, Merck
Rinderserumalbumin, Behringwerke (ORHD 20/21)
Rinder-Gammaglobulin, Sigma (G-5009)
Glycin, Riedel (33226)
PEG-20%, Biodata
Natriumhydroxid-Fixanal, Riedel (38210)
2 M Natriumhydroxid, Riedel (35254)
Natriumacetat-trihydrat, Merck (6267)
Phosphorsäure, 85%, Riedel (30417)
Halbsynthetisches Humaninsulin (HIet), Charge Nr.: A48 U114 und A48 U118
RIA-Polystyrolröhrchen 12 × 75 mm, Sarstedt (55476)
"C-Peptide second antibody beads", CPIII, Daiichi Radioisotope Labs.; LTD, Tokyo
Proclin 300, Supelco (4-8127)
PBS (Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung), Sigma (D-5652)
Berilux-Lösungen R1 und R2, Behring
Sensor-Chips CM5, Pharmacia BIAcore
Carbodiimid-Kopplungskit, Pharmacia BIAcore
BCA-Assay zur quantitativen Auswertung der Proteinkonzentration, Pierce (Lösung A: Nr. 23223; Lösung B: 23224)
IgG-Standard zur Bestimmung der Proteinkonzentration, Pierce (31204)
Fractogel EMD Azlacton 650 (S), Merck (1.10087)
SDS-Gelelektrophoresesystem mit NuPAGE 4-12% sowie MES-Elektrophoresepuffer, Novex
Silberfärbungskit Plusone, Pharmacia Biotech (Bezeichnung Nr. 17-1150-01).

Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma, Merck oder Riedel de Haen bezogen.

Ausstattung

Multipette, Eppendorf
Mikroliterpipetten, Abimed, Gilson
Microlab M, Hamilton
Meßkolben und Meßzylinder
Whirlymixer Reax 2000, Heidolph
Digital-pH-Meter, Knick
AutoCliniLumat LB 952 T/16, Berthold
Wallac Wizard 1470 Multidetektor Gammazählgerät (mit RIA-Calc, Multi-Calc Software), Wallac
BIAcore 1000, Pharmacia BIAcore
Kühlzentrifuge (GS-6), Beckmann
Suprafuge 22, Heraeus Sepatech
Biofuge 13 R, Megafuge 1.0 R, Heraeus Sepatech
SDS-Gelelektrophoresesystem inklusive Netzgerät Modell 3540, Novex
Eppendorfröhrchen-Inkubator, Eppendorf
Automatisches Hoefer-Gelfärbegerät, Pharmacia
PM400- und PM4000-Waage, Mettler
AT261 Delta Range, Mettler
Ultrafree-15 10 kDa, Millipore (UFV2BGC)
Glas-Vorfilter ∅ 47 mm, Schleicher Schüll (421026)
Membranfilter ∅ 50 mm, 5 µm, Schleicher Schüll (400214)
Membranfilter ∅ 50 mm, 0,2 µm, Schleicher Schüll (404114).

FPLC 1 (Pharmacia) für die Affinitätschromatographie

LCC-500-Plus-Regler
2 × P-500-Pumpe
P50-Pumpe
P-1-Pumpe
Uvicord SII und Leitfähigkeitsanzeiger
ERC 3312 Entgasungsgerät
2211 Superrac-Fraktionensammler
4 × MV-8-Ventile
1 × MV-7-Ventil.

FPLC 2 (Pharmacia) für die Gelpermeationschromatographie

LCC-500-Plus-Regler
2 × P-500-Pumpe
P-1-Pumpe
Uvicord S-Anzeiger
ERC 3612-Entgasungsgerät
2211 Superrac-Fraktionensammler
1 × MV-7-Ventil
Stromabsperreinrichtung
Manuell betätigtes Ventil SRV-4.

Abkürzungen

BSA: bovine serum albumin [Rinderserumalbumin]
CV: coefficient of variation [Variationskoeffizient]
ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay
HIet: semi-synthetic human insulin [halbsynthetisches Humaninsulin]
PBS: phosphate-buffered saline [phosphatgepufferte Kochsalzlösung]
PPI: Präproinsulin
QC: quality control [Qualitätskontrolle]
RIA: radioimmunoassay [Radioimmunassay].

Spezifische Bestandteile des Assays Antikörper

Die Antikörper wurden dadurch erhalten, daß man ein Schaf (S95-11) mit aufgereinigtem Insulin-C-Peptid immunisierte. Die durch Entnehmen einer Blutprobe des Tiers erhaltene Serumprobe wurde gemäß der Aufreinigungsvorschrift im Anhang 1 aufgereinigt.

Die erhaltenen affinitätsgereinigten Antikörper können beim vorliegenden Assay in einer Verdünnung von 1 : 1500 verwendet werden.

Tracer und Standardmaterial

Als Standard und Tracer wird aus rekombinantem Human-HI-Insulin isoliertes C-Peptid (Affen- statt Humansequenz) verwendet. Seine Reinheit beträgt 99%.

Probenpuffer

Der Probenpuffer wird dadurch hergestellt, daß man 0,326 g Bicine (Sigma B-3876) in 100 ml destilliertem H₂O löst. Der pH wird mit 1 N NaOH auf 8,7 eingestellt.

Standard/Verdünnungspuffer

Halbsynthetisches Humaninsulin (HIet, siehe Material) wird in 10 mM HCL gelöst, wodurch man zu einer Lösung von 10 mg/ml gelangt. Diese Insulinlösung wird dann mit Probenpuffer im Verhältnis von 1 : 10 verdünnt.

Antikörperpuffer

Das im Handel erhältliche PBS-Pulver (Sigma D-5652) wird in ungefähr 980 ml Wasser gelöst, und der pH wird durch Zugabe von 1 N NaOH auf 7, 7 eingestellt. Man versetzt mit Tween-20, bis die Endkonzentration an diesem Detergenz 0,05% beträgt. Das Puffervolumen wird in einem Meßzylinder genau auf 1 l gebracht. Schließlich wird BSA auf eine Konzentration von 1,5% (w/v) gelöst.

Durchführung des Assays Auflösung der Proben

Ungefähr 0,5-0,8 mg der Probe werden in 10 mM HCl gelöst, wodurch man zu einer Lösung mit 10 mg/ml gelangt. Das vollständig gelöste Material wird anschließend mit Probenpuffer weiter im Verhältnis 1 : 10 verdünnt.

Herstellung des Tracers

Mit dem Acridiniumacylsulfonamidderivat Ki 256 (Deutsche Patente DE 38 05 318 bzw. DE 36 28 573) läßt sich ein C-Peptid-Tracer durch direkte kovalente Konjugation mit einem lumineszierenden Acridiniumester-Molekülteil herstellen. Durch Zusatz von alkalischem H₂O₂ kann Chemolumineszenz induziert werden (McCarpa, F. (1976) Acc. Chem. Res. 9: 201 et seq.).

Zur Herstellung dieses chemolumineszierenden C-Peptid-Tracers wurden die folgenden Lösungen vermischt und 20 Minuten bei Umgebungs­ temperatur inkubiert:

• 1. 255 µl eines Puffers mit einem Gehalt von 8,17 g KH₂PO₄, 7,12 g Na₂HPO₄, 8,77 g NaCl und 0,5 g NaN₃ in 1 l H₂O. Der pH wird mit 1 N NaOH auf 8,0 eingestellt.
• 2. 125 µl C-Peptid (siehe 4.2.) in einer Konzentration von 2 mg/ml in H₂O,
• 3. 120 µl des Markers Ki 256 (10 mg in 1 ml Acetonitril).

Die kovalente Reaktion des Markers mit funktionellen Gruppen in dem C-Peptid wurde durch Zugabe von 100 µl L-Lysin (10 mg/ml) gestoppt.

Das markierte C-Peptid wurde durch Größenausschluß-Gelchromatographie an einer Superdex Peptide 10/30-Säule (Pharmacia), die in ein FPLC-System integriert war, gereinigt. Als Laufpuffer diente PBS mit 0,04% Proclin. Die Durchflußrate betrug 0,2 ml/min.

Das Protein, das an der Stelle zwischen Aprotin und Cytochrom C eluierte, wurde gesammelt und gepoolt, und aliquote Teile hiervon wurden eingefroren (Batch 2). Die Reproduzierbarkeit der Tracer-Herstellung wurde einmal nachgewiesen.

Die optimale Verdünnung der Tracer-Vorratslösung für die Anwendung im Assay wurde durch Ausprobieren bestimmt.

Tracer-Reinigung mit Superdex Peptide (10/30)

Die Elution der Eichsubstanzen Cytochrom C (C), Aprotinin (A) und Vitamin B1 (B) sind in Fig. 2 dargestellt. Nicht umgesetzter Marker, Lysin und weitere Pufferbestandteile können vom Tracer, der als symmetrischer Peak in einer Stelle zwischen Cytochrom C und Aprotinin (fett dargestellt) eluiert, entfernt werden.

Herstellung des Standards

Eine Vorratslösung des Insulin-C-Peptids (2) in Wasser wird hergestellt (1 mg/ml). Von dieser Vorratslösung wird ein aliquoter Teil entnommen und weiter mit Verdünnungspuffer im Verhältnis 1 : 100 verdünnt. Beide Proben werden bis zur Verwendung eingefroren aufbewahrt.

Die Standards werden von der zweiten (10 µg/ml) Probe durch Verdünnen eines aliquoten Teils mit Verdünnungspuffer im Verhältnis 1 : 100 und anschließend viermaliges Verdünnen im Verhältnis 1 : 4 hergestellt, wodurch man Standards zu 100 ng/ml, 25 ng/ml (S4), 6,25 ng/ml (S3), 1,563 ng/ml (S2) und 0,39 ng/ml (S1) erhält. Alle Verdünnungen werden mit Verdünnungspuffer mit einem Gehalt von 1 mg/ml HIet hergestellt, um die Bedingungen in unbekannten Insulinproben aus der Produktion nachzuahmen. Nur die Standards S1-S4 werden für den Assay verwendet.

Assay-Vorschrift

• 1. Die Standards werden mit 200 µl pro Standardkonzentration und Röhrchen in dreifacher Wiederholung hergestellt.
• 2. Die Proben wurden in zweifacher Wiederholung unter Verwendung von 200 µl der gelösten Proben untersucht.
• 3. Zum Erhalt von S0-Werten wird reiner Verdünnungspuffer verwendet (3 × 200 µl).
• 4. Der Tracer (Ansatz 2) wird im Verhältnis von 1 : 40 000 mit Probenpuffer verdünnt. Jedes Röhrchen wird mit 100 µl dieser Tracer-Lösung befüllt.
• 5. Das Antikörperpräparat 99Ser9 wird im Verhältnis 1 : 1500 mit Antikörperpuffer verdünnt, und jedes Röhrchen wird mit 100 µl der Verdünnung befüllt.
• 6. Die Röhrcheninhalte werden gemischt, und anschließend versetzt man mit einem "C-Peptide second antibody bead", CPIII (Daiichi Radioisotope Labs.; LTD, Tokyo).
• 7. Nachdem 5 Stunden bei Umgebungstemperatur geschüttelt wurde, wird die Flüssigkeit abgesaugt. Die Perlen werden 5mal mit ungefähr 0,8 ml Wasser mit einem manuell bedienbaren, mit 10 Spitzen versehenen Waschkopf, der an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist, gewaschen. Anschließend werden die Proben im Luminometer gemessen. Die Chemolumineszenz in der Probe wird durch die automatisierte Zugabe von 0,3 ml Lösung R1 (H₂O₂) und R2 (NaOH) (nacheinander) stimuliert. Das ausstrahlende Licht wird 1 Sekunde lang gemessen und als RLU (relative light units; relative Lichteinheiten) angezeigt.
• 8. Die Ergebnisse werden automatisch mit der im Analysator befindlichen Software unter Verwendung einer logit/log-Transformation der Standardkurve automatisch verrechnet.

Eigenschaften des Assays Hintergrundvariation unter realistischen Bedingungen Bestimmung von halbsynthetischem Humaninsulin

Aufgabe des Assays ist es, PPI, Insulin-C-Peptid und eventuell vorhandene Insulinkontaminanten, die Teile des C-Peptids, die mit der A- oder B-Kette von Humaninsulin kovalent gebunden sind, nachzuweisen. Diese als Antigen wirkenden Strukturen müssen in Anwesenheit eines Überschusses an Insulin mit korrektem "Processing" bestimmt werden. Um die durch diesen Insulinhintergrund hervorgerufene Variation zu untersuchen, wurde halbsynthetisches Insulin wiederholt analysiert (in Konzentrationen von 1 mg/ml). Für diesen Zweck muß halbsynthetisches Insulin verwendet werden, da es niemals Kontaminanten des Affen-C-Peptids enthalten kann und außerdem, weil es ein Bestandteil des Standards/Verdünnungspuffers ist.

Halbsynthetisches Insulin wurde 10mal in einer Konzentration von 1 mg/ml wie für die Probenauflösung beschrieben gelöst. Diese Insulinproben wurden mit dem Assay am gleichen Tag analysiert.

Die mit den Insulinproben erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Ergebnisse von Proben mit 1 mg/ml halbsynthetischem Humaninsulin und Insulin HIA1 aus Schritt 12/10 des Aufreinigungsverfahrens

Aus den Ergebnissen geht hervor, daß halbsynthetisches Humaninsulin im Durchschnitt die Bindung des Tracers an den Antikörper nicht stört; bei B/B0-Maximalwerten von 106% und Minimalwerten von 91% existiert jedoch eine gewisse Bandbreite.

Hieraus ergibt sich, daß Werte oberhalb 90% B/B0 (= Mittelwert minus 3mal Standardabweichung), die in unbekannten Proben erhalten werden, nicht verrechnet werden sollten und als Hintergrund zu interpretieren sind (Nachweisgrenze).

Eine Probe mit B/B0 < 90% enthält höchstwahrscheinlich < 0,4 ppm C-peptidartige Aktivität.

Die anhand dieser HIet (Hintergrund)-Proben festgestellte Wiederholbarkeit (Unterschiede innerhalb des Assays) beträgt 4%.

Den gleichen Wert, nämlich 4%, findet man in einer Probe, die ungefähr 1 ng/ml C-peptidartige Immunreaktivität enthält (Probe HIA1 055 AKR 01 + 02, siehe Tabelle 1). Wie die HIet-Probe wurde das Testmaterial 10mal bei einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst und am gleichen Tag analysiert.

Anwendung der statistischen Vorgehensweise auf Proben des Insulinendprodukts

Die gleiche statistische Vorgehensweise wurde auf die Endprodukte der HI- und HIA1-Produktion angewandt. Zu diesem Zweck wurden 23 verschiedene HI-Proben und 6 verschiedene HIA1-Proben am gleichen Tag analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Ergebnisse von Proben mit 1 mg/ml HI und HIA1

Aus den Werten geht deutlich hervor, daß HI-Endprodukte durchschnittlich keine C-peptidartige Aktivität enthalten, da die Variation um die Einzelbestimmungen der bei halbsynthetischem Humaninsulin erhaltenen Variation ähnlich ist. Zwischen der HI-Gruppe (24 Einzelproben) und HIet (eine Probe, die 10mal im gleichen Assay analysiert wurde) besteht kein signifikanter Unterschied.

Die Minimal- und Maximalwerte bei den HI-Proben (89,8% bzw. 109%) liegen auch in der Nähe der bei HIet erhaltenen Werte (91% bzw. 106%).

Bezüglich der HIA1-Proben kann eindeutig gesagt werden, daß eine C-peptidartige Immunreaktivität im Endprodukt vorliegt, der Gehalt bewegt sich jedoch im Bereich von 0,5-1 ppm (quantitative Auswertung mit einer Standardkurve, siehe unten).

Standardkurve

Die in 6 unterschiedlichen Assays erhaltenen Standardkurven sind in Fig. 3 dargestellt.

Die Zahlenwerte dieser Kurven, die als B/B0 (%) ausgedrückt werden, sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Die Kurvenstatistik geht aus Tabelle 4 hervor.

Tabelle 3

Originaldaten der Standardkurven

Die Kurvenparameter lauten:

• - ED20 = 14,44 ± 0,99 ng/ml (CV = 6,86%)
• - ED50 = 3,21 ± 0,23 ng/ml (CV = 7,21%)
• - ED80 = 0,91 ± 0,10 ng/ml (CV = 10,71%).

Tabelle 4

Statistische Auswertung der Daten aus 6 Standardkurven und Kontrollproben, die an unterschiedlichen Tagen gemessen wurden

Aus den obigen Daten geht folgendes hervor:

• 1. Die Standardkurve ist in hohem Ausmaß reproduzierbar.
• 2. Halbsynthetisches Humaninsulin wird von dem Antikörper nicht erkannt.
• 3. Eine C-peptidartige Aktivität läßt sich im HI-Ansatz C038 nicht feststellen.
• 4. Die Probenanalyse bei dem Assay ist in hohem Ausmaß reproduzierbar, was aus den erhaltenen CV-Werten hervorgeht, die 3,9% für HIet und 2,97 für den HI-Ansatz C038 betragen.

Spezifität des Assays

Die oben dargestellten Daten zeigen deutlich, daß bei Verwendung des skizzierten Verfahrens der Assay nur minimal durch reines Humaninsulin beeinflußt wird, was eine Grundbedingung für die Bestimmung der C-peptidartigen Immunreaktivität in pharmazeutischen Insulinpräparaten darstellt.

Mit Hilfe der C-peptidhaltigen Modellverbindungen untersuchten wir die Spezifität unseres Antikörpers in der angegebenen Form des Assays. Eine Beschreibung der Modellverbindungen wird in den folgenden Abschnitten geliefert.

• 1. HI PPI
• 2. Human-C-Peptid
  Die C-Kette von synthetischem Humaninsulin stammte von Sigma (Katalognr. C-5051). Die deklarierte Reinheit beträgt 97% und der Peptidgehalt 84%.
• 3. HI (reduziert/alkyliert)
  Das Ziel besteht darin, lineares C-Peptid mit geschützten N- und C-terminalen Enden zu analysieren.
  Diese Kontrolle ahmt ein ungefaltetes PPI nach und zeigt, daß an die mittleren Teile bindende Antikörper zur Spezifität des affinitätsgereinigten Antiserumpräparats beitragen.
  Die Herstellung dieser Kontrollprobe wird in Anhang 2 beschrieben.
• 4. Mit Endoproteinase Asp-N an der EDP (C6-C7)-Stelle des C-Peptids gespaltenes HI.
  Das Ziel besteht darin, ein Humaninsulin mit kovalent gebundenen C-Peptidsequenzen am C-Terminus der B-Kette und/oder am N-Terminus der A-Kette zu analysieren. Diese Kontrolle ahmt Kontaminanten nach, die von der Säurespaltung an der EDP-Stelle im C-Peptid stammen. Außerdem ahmt sie möglicherweise vorhandene Kontaminanten nach, die durch eine unvollständige Trypsinspaltung verursacht sind.
  Die Herstellung dieser Kontrollprobe wird in Anhang 3 beschrieben.
• 5. HIA2-C-Peptid (Charge HD/19, 21.07.99: Reinheit < 99%):
  Dieses C-Peptid ist am N-terminalen Teil im Vergleich zum HI-C-Peptid verkürzt und hat daher Epitope am N-Terminus verloren. Das HIA2- C-Peptid kann als Modell für N-terminal gespaltene oder modifizierte Kontaminanten des isolierten HI-C-Peptids dienen.
  HIA2 PPI (Charge: UB11/30-HP2; Reinheit 96%):
  Wie das HIA2-C-Peptid kann auch dieses mutierte PPI als Modellantigen dienen, das als Hilfe bei der Überprüfung der Immunreaktivitäten des Antikörpers mit PPI bei einem im Vergleich zu HI PPI drastisch geänderten C-Peptidteil dient.

Die Ergebnisse der Kontrollassays mit den beschriebenen Modellverbindungen sowie ihre Interpretation findet sich in Anhang 5.

Zusammenfassung der Kontrollversuche

Die Gruppe der Modellverbindungen bildet eine ausgezeichnete Darstellung der Spezifitäten unseres affinitätsgereinigten Antiserumpräparats 99Ser9.

Bei Betrachtung der Ergebnisse insgesamt läßt sich eindeutig der Schluß ziehen, daß sich der im vorliegenden Bericht beschriebene Perlenassay am besten zur Messung von C-peptidartiger Aktivität in Proben aus der Insulinproduktion eignet. Dadurch, daß das Antikörperpräparat bei der angegebenen Form des Assays alle Modellverbindungen erkennt, kann geschlossen werden, daß alle wichtigeren und möglicherweise vorhandenen C-Peptidkontaminanten in Proben aus der gentechnischen Insulinproduktion höchstwahrscheinlich von dem Assay erkannt werden können.

Analyse der Entfernung von kontaminierenden C-peptidhaltigen Kontaminanten während der Aufreinigung von HI mit dem beschriebenen Assay (Vergleich mit 3 Alternativ-Assays).

Der neue Immunassay wurde auf die Untersuchung der Entfernung von C-peptidartigen Immunreaktivitäten in 3 unterschiedlichen Produktions­ kampagnen (UA114, UA0115, UA116) verwendet.

Testmaterial aus den Aufreinigungsschritten 12 (Proben SB), 13 (Proben KA und KB) sowie 14 (Proben UA) wurden auf insulin-C-peptidartige Immunreaktivitäten untersucht.

Die mit dem Perlenassay erzielten Ergebnisse werden mit dem Ergebnis der Alternativ-Assays HMR - RIA, Human-C-Peptide RIA Kit der Linco Research Inc. sowie dem von NewLab Diagnostic Systems GmbH entwickelten ELISA-Verfahren verglichen.

Die Meßwerte in den Proben finden sich in den Tabellen in Anhang 6.

Ergebnisse

• 1. Mit dem neuen Immunassay wird die Entfernung von C-Peptid-Immunreaktivitäten in In-Process-Kontrollmaterial des HI-Reinigungsprozesses eindeutig nachgewiesen. Dadurch, daß C-Peptid als Standard verwendet wird, muß mit 2,5-3 mal niedrigeren Werten als beim RIA gerechnet werden. Tatsächlich findet man einen Faktor von ungefähr 4 (Mittelwert), der das Ergebnis der im Vergleich zum RIA drastisch verringerten Inkubationsdauer ist.
• 2. In HI-Endproben läßt sich mit dem im vorliegenden Bericht beschriebenen Assay mit beschichteten Perlen keine C-peptidartige Immunreaktivität nachweisen. Die berechneten Konzentrationen bewegen sich im Bereich derjenigen Werte, die bei HIet meßbar sind.
  Die Mittelwerte der KA/KB- und UB-Proben lauten:
  104,7 ± 3,7 (CV = 3,5%) bei Proben aus KA/KB 114 (n = 8),
  103,8 ± 5,3 (CV = 5,1%) bei Proben aus KA/KB 115 (n = 8),
  99,8 ± 3,7 (CV = 3,7%) bei Proben aus KA/KB 116 (n = 8).
  102,3 ± 3,7 (CV = 3,6%) bei Proben aus UA 114 (n = 4),
  100,3 ± 3,2 (CV = 3,2%) bei Proben aus UA 115 (n = 4),
  99,1 ± 3,8 (CV = 3,8%) bei Proben aus UA 116 (n = 4).
  Alle Werte liegen genau in dem durch wiederholte HIet-Messung bestimmten Variationsbereich.
• 3. Mit dem neuen Immunassay lassen sich Ergebnisse in Proben aus den Aufreinigungsschritten sehr gut reproduzieren (siehe Anhang 6, letzte Reihe in Tabelle C054).
• 4. Der ursprüngliche RIA leidet unter Ausreißern, die nicht durch offensichtliche Fehler bei der Probenbehandlung oder bei der Durchführung des Assays erklärt werden können. Außerdem ist der Assay durch eine schlechte Reproduzierbarkeit gekennzeichnet (siehe Tabellen unten, rot markierte Zeilen).
• 5. Der Linco-RIA ist wesentlich robuster als der ursprüngliche RIA, und seine Reproduzierbarkeit ist besser. Wie der ursprüngliche RIA leidet dieser Assay jedoch ebenfalls unter der Probenverdünnungsmethode, jedoch nicht so stark wie der ursprüngliche RIA (siehe Tabelle unten). Da es sich bei dem Linco-RIA um die empfindlichste Assayvariante, die geprüft wurde, handelt, lassen sich hiermit Spuren von insulin-C-peptidartiger Aktivität in einem Konzentrationsbereich von 0,1-0,5 ng/ml in manchen Endproduktproben nachweisen.
• 6. Bei den "RIA"-, "Linco"- und "Beads"-Assays wurde HIet routinemäßig als Kontrolle mitgeführt (siehe Tabellen unten). Theoretisch kann dieser Wert von allen Ergebnissen abgezogen werden, was anzeigt, daß in den meisten der Endmaterialien der Insulinaufreinigung eine Insulin-C-Peptidimmunreaktivität nicht oder nur in Spuren vorliegt.
• 7. Mit dem NewLab ELISA gelangt man zu keinen deutlichen Ergebnissen, da der Hintergrund mit dem Testmaterial selbst (und nicht mit HIet) bestimmt wird. Außerdem wird der Assay von der Affinität des monoklonalen Antikörpers gegen Human-Proinsulin-C-Peptid beherrscht (Klon M607239; Katalog/Posten Nr. FZ10-C65), und diese Kreuzreaktivität mit PPI ist unbekannt. Zur Stärke der Wechselwirkung mit PPI im Newlab-Assay liegen keine Daten vor. Entsprechend dem Assay-Design (Hauptaufgabengebiet: C-Peptid-Analyse) läßt sich in "Ursprungsproben" eine niedrige C-Peptidimmunreaktivität (falls überhaupt) messen, wobei das Ausmaß dieser Immunreaktivität sogar noch niedriger als beim Linco-Assay ist. Eine Möglichkeit, diese Tatsache zu erklären, könnte darin bestehen, daß die Proben beim Arbeits-pH nicht sehr gut gelöst sind, die entsprechende SAA sieht jedoch nicht vor, daß ein vollständiges Auflösen nachgewiesen werden muß.

Schlußfolgerung

Der beschriebene neue Immunassay eignet sich in hohem Ausmaß zur Untersuchung der Entfernung von C-peptidartiger Immunreaktivität im In-Process-Kontrollmaterial aus der Humaninsulinproduktion und ist sehr empfindlich, präzise und gut reproduzierbar (CV < 5%).

Die mit dem Assay eindeutig nachweisbare Minimalkonzentration an Insulin-C-peptidartiger Aktivität beträgt 0,4 ng/ml. Alle Werte unterhalb dieser Grenze zählen zum Hintergrundrauschen und sind numerisch nicht anzugeben.

Der neue Assay weist die folgenden Vorteile auf:

• - Es handelt sich um einen nichtradioaktiven Assay, bei dem ein chemolumineszierender Marker verwendet wird, der hier bei uns für das Berilux-Diagnosesystem entwickelt wurde (Behringwerke).
• - Der Tracer ist hochstabil, ein- und dasselbe Tracermaterial läßt sich daher über einen langen Zeitraum verwenden (inzwischen 20 Wochen ohne Qualitätsverlust). Vergleichbare, stabile Assaybedingungen über lange Zeiträume sind eine Voraussetzung für Routineanwendungen und für die Langzeitvergleichbarkeit der Ergebnisse.
• - Die Assayzeit beträgt insgesamt nur 5 Stunden. Keine besonderen Vorbereitungen sind erforderlich. Der Assay kann innerhalb von 1-2 Tagen nach Erhalt der Probe durchgeführt werden.
• - Homogener Assay ohne aufeinanderfolgende Schritte oder zwischengeschaltete Waschschritte. Über 50 verschiedene Proben können pro Tag analysiert werden.
• - Zur Durchführung des Assays ist keine komplizierte technische Ausrüstung erforderlich.
• - Der Assay ist preisgünstig (kein routinemäßiges Markieren, kein radioaktives Material, kein radioaktiver Abfall, ausschließlich Labor- Standardausrüstung erforderlich, Kosten für 1050 beschichtete Perlen: 1000.- DM). Geschätzte Kosten für 5 Bestimmungen (inklusive Personal, Amortisation der Ausrüstung, allgemeine Unkosten, usw.) < 200.- DM / Probe, bei < 10 Proben betragen die Kosten pro Probe unter 150.- DM.
• - Das Prinzip des Assays ist einfach, so daß technisches Personal ohne entsprechende Ausbildung rasch zur Durchführung der Analyse angelernt werden kann.
• - Die Proben werden in einem einfachen Verfahren mit zwei Schritten verdünnt, ohne daß man anschließend den pH messen und einstellen muß. Die Probe bleibt während der gesamten Inkubationszeit im gelösten Zustand, und dies trifft auf die HI- und HIA1-Endprodukte sowie alle Zwischenprodukte beim Downstream-Processing zu. Dies trifft bei keinem der Alternativ-Assays zu.
• - Mit einer Wiederholbarkeit von 4% (siehe Tabelle 1) und einer Schwankung innerhalb des Assays von 4% (siehe Tabelle 4) ist der Assay robust. Beide Werte wurden aufgrund der 8/BO-Rohdaten errechnet.
• - Sowohl HI-Proben als auch HIA1-Proben können mit der gleichen Assayvorschrift und den gleichen Bestandteilen und Puffern analysiert werden (siehe Anhang 6 und 7).
• - Eine HIA2-C-peptidartige Immunreaktivität kann mit der gleichen Versuchsvorschrift und den gleichen Bestandteilen und Puffern mit einer Nachweisgrenze von 10 ppm analysiert werden.
• - Die ersten Ergebnisse zeigen, daß der Assay bei Verwendung von Spezialröhrchen oder -Mikroplatten in eine Form, bei der beschichtete Röhrchen oder Mikrotiterplatten verwendet werden, umgewandelt werden kann. So läßt sich der Ankauf der Perlen mit dem zweiten Antikörper vermeiden.
• - Die Empfindlichkeit des Assays kann dadurch verbessert werden, daß man die Inkubationszeit erhöht, oder dadurch, daß man höher konzentrierte Antikörper und Tracer, jedoch in kleineren Volumina, verwendet.
• - Einziger Assay mit genauer Spezifitätsangabe.

Anhang 1

Aufreinigung von Schaf-Antikörpern gegen Affen-Insulin-C-Peptid zur Verwendung in Immunassays für die quantitative Auswertung von "Präproinsulinartiger Aktivität".

Material

Doppelt destilliertes Wasser
Mononatriumphosphat, Riedel (04269)
Natriumchlorid, Merck
Natriumazid, Merck
Rinderserumalbumin, Behringwerke (ORHD 20121)
Rinder-Gammaglobulin, Sigma (G-5009)
Glycin, Riedel (33226)
PEG-20%, Biodata
Natriumhydroxid-Fixanal, Riedel (38210)
2 M Natriumhydroxid, Riedel (35254)
Natriumacetat-trihydrat, Merck (6267)
85%ige Phosphorsäure, Riedel (30417)
Synthetisches Humaninsulin (Het), HMR-Deutschland
RIA-Polystyrolröhrchen 12 × 75 mm, Sarstedt (55476)
Proclin 300 (Supelco: 4-8127)
PBS (Dulbeccos Phosphate Buffered Saline [Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung]; Sigma: D-5652)
Sensor-Chips CM5 (Pharmacia BIAcore)
Carbodiimid-Kopplungskit (Pharmacia BIAcore).
BCA-Assay zur quantitativen Auswertung der Proteinkonzentration (Pierce: Lösung A: Nr. 23223; solution B: 23224)
IgG-Standard zur Bestimmung der Proteinkonzentration (Pierce: 31204)
Fractogel EMD Azlacton 650 (S), Merck (1.10087).

Alle anderen Chemikalien wurden von Sigma, Merck oder Riedel de Haen bezogen.

Ausstattung

Multipette, Eppendorf
Mikrotiterpipetten, Abimed, Gilson
Microlab M, Hamilton
Meßkolben und Meßzylinder
Whirlymixer Reax 2000, Heidolph
Digitales-pH-Meter, Knick
Kühlzentrifuge, Beckmann (GS-6)
Wallac Wizard 1470 Multidetektor Gammazählgerät (mit RIA-Calc, Multi- Calc Software)
Suprafuge 22 (Heraeus Sepatech)
BIAcore 1000 (Pharmacia BIAcore)
Spectra-III-Elisa-Lesegerät mit Easywin Software (SLT)
Waagen PM400, PM4000, AT261 Delta Range (Mettler)
Ultrafree-15 10 kDa, Minipore (UFV2BGC)
Glas-Vorfilter ∅ 47 mm, Schleicher Schüll (421026)
Membranfilter ∅ 50 mm, 5 µm, Schleicher Schüll (400214)
Membranfilter ∅ 50 mm, 0.2 µm, Schleicher Schüll (404114).

FPLC 1 (Pharmacia) für die Affinitätschromatographie

LCC-500-Plus-Regler
2 × P-500-Pumpe
P50-Pumpe
P-1-Pumpe
Uvicord SII und Leitfähigkeitsanzeiger
ERC 3312 Entgasungsgerät
2211 Superrac-Fraktionensammler
4 × MV-8-Ventile
1 × MV-7-Ventil.

FPLC 2 (Pharmacia) für die Gelpermeationschromatographie

LCC-500-Plus-Regler
2 × P-500-Pumpe
P-1-Pumpe
Uvicord S Anzeiger
ERC 3612 Entgasungsgerät
2211 Superrac-Fraktionensammler
1 × MV-7-Ventil
Stromabsperreinrichtung
Manuell betätigtes Ventil SRV-4.

Herstellung der Affinitätsharze Kopplung von Humaninsulin an Fractogel EMD Azlacton 650 (S) Harzkonditionierung

7 g Fractogel EMD Azlacton 650 (S) wurde 15 Minuten in 140 ml PBS, pH 7,4, schwellen gelassen. Nach dieser Inkubation wurde der Überstand dadurch entfernt, daß man die Mischung durch ein Glasfilter goß. Das verbleibende Gel (ungefähr 24 ml) wurde in 20 ml PBS, pH 7,4, suspendiert.

Auflösen des Humaninsulins

120 mg halbsynthetisches Humaninsulin (Insulin ET [Insulin HPU, HGR, IE Sap. Nr.: 116312, Muster A48, Ch.-B.: U118]) wurden in 3 ml 50 mM Phosphorsäure gelöst. Die Lösung wurde langsam unter Rühren in 50 ml PBS, pH 9,4, getropft. Am Ende dieses Vorgangs war der pH auf 6,65 abgesunken. Schließlich wurde der pH der Insulinlösung dadurch, daß vorsichtig mit 2 M NaOH versetzt wurde, auf 7,4 eingestellt.

Kopplungsreaktion

Die Insulinlösung und das konditionierte Gel wurden vermischt, und es wurde mittels des funktionellen Azlactons bei 4°C Umgebungstemperatur koppeln gelassen. Dadurch, daß man den Reaktionsbecher langsam mit dem Oberteil nach vorne drehte, wurde ein ständiges vorsichtiges Mischen erreicht.

Nach 4 Stunden bei Umgebungstemperatur wurde der Überstand mit dem nichtreagierten Liganden abfiltriert und das Gel wurde mit 120 ml PBS gewaschen.

Eine HPLC-Analyse ergab 67 mg ungebundenes Humaninsulin, es wurden daher 53 mg kovalent am EMD-Fractogel immobilisiert.

Die restlichen aktiven Gruppen an dem Harz wurden durch Zugabe von 120 ml 0,2 M Glycin, pH 8,0, blockiert. Es wurde bei 4°C Umgebungstemperatur reagieren gelassen. Wiederum wurde dadurch, daß man den Reaktionsbecher mit dem Oberteil langsam nach vorne drehte, ein ständiges vorsichtiges Mischen erreicht.

Nach 16-20 Stunden wurde der Überstand mit dem nichtreagierten Glycin abfiltriert, und das Gel wurde durch dreimaliges Waschen mit jeweils 120 ml PBS, pH 7,4, 0,1 M Natriumacetat und 0,2 M Glycin, pH 2,8, gewaschen.

Das entstandene Affinitätsharz mit kovalent gekoppeltem Humaninsulin wurde in PBS pH 7,4 mit 0,04% Proclin als Konservierungsmittel suspendiert und in eine HR 16/15-FPLC-Säule gegossen.

Kopplung von Human-Präproinsulin an Fractogel EMD Azlacton 650 (S) Harzkonditionierung

14,5 g Fractogel EMD Azlacton 650 (S) wurde 15 Minuten in 290 ml PBS, pH 7,4, schwellen gelassen. Nach dieser Inkubation wurde der Überstand dadurch entfernt, daß man die Mischung durch ein Glasfilter goß. Das verbleibende Gel (ungefähr 50 ml) wurde in 20 ml PBS, pH 7,4, suspendiert.

Auflösen des Präproinsulins

250 mg Präproinsulin (Prä-Pro-HI) wurden in 6 ml 50 mM Phosphorsäure gelöst. Die Lösung wurde langsam unter Rühren in 100 ml PBS, pH 9,4, getropft. Am Ende dieses Vorgangs war der pH auf 6.60 abgesunken.

Schließlich wurde der pH der Präpro-HI-Lösung dadurch, daß vorsichtig mit 2 M NaOH versetzt wurde, auf 7,4 eingestellt.

Kopplungsreaktion

Die Präproinsulinlösung und das konditionierte Gel wurden vermischt, und es wurde mittels des funktionellen Azlactons bei 4°C Umgebungstemperatur koppeln gelassen. Dadurch, daß man den Reaktionsbecher langsam mit dem Oberteil nach vorne drehte, wurde ein ständiges vorsichtiges Mischen erreicht.

Nach 4 Stunden bei Umgebungstemperatur wurde der Überstand mit dem nichtreagierten Liganden abfiltriert und das Gel wurde mit 250 ml PBS gewaschen.

Eine HPLC-Analyse ergab 79 mg ungebundenes Präproinsulin, es wurden daher 171 mg kovalent am EMD-Fractogel immobilisiert.

Die restlichen aktiven Gruppen an dem Harz wurden durch Zugabe von 250 ml 0,2 M Glycin, pH 8,0, blockiert. Es wurde bei 4°C Umgebungstemperatur reagieren gelassen. Wiederum wurde dadurch, daß man den Reaktionsbecher mit dem Oberteil langsam nach vorne drehte, ein ständiges vorsichtiges Mischen erreicht.

Nach 16-20 Stunden wurde der Überstand mit dem nichtreagierten Glycin abfiltriert, und das Gel wurde durch dreimaliges Waschen mit jeweils 250 ml PBS, pH 7,4, 0,1 M Natriumacetat und 0,2 M Glycin, pH 2,8, gewaschen.

Das entstandene Affinitätsharz mit kovalent gekoppeltem Präproinsulin wurde in PBS pH 7,4 mit 0,04% Proclin als Konservierungsmittel suspendiert und in eine XK 26/20 FPLC-Säule gegossen.

Affinitätschromatographische Reinigung von Antikörpern gegen Insulin-C-Peptid Herstellung des Serums

Ausgangsmaterial für die Antikörperaufreinigung war ein Serum von Schaf S95-11, das mit gereinigtem Affen-Insulin-C-Peptid immunisiert worden war.

Das Serum wurde bei -20°C aufbewahrt und dann aufgetaut.

Nach dem Auftauen wurde festgestellt, daß das Gesamtvolumen des Serums 79 ml betrug. Das Volumen wurde durch Zusatz von 65 ml Wasser und 16 ml PBS (10fache Konzentration, plus 0,4% Proclin) verdoppelt, um die Pufferkonditionen für die Chromatographie einzustellen. Das verdünnte Serum wurde anschließend 30 Minuten bei 4°C bei 26000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde durch übereinandergelegte 5-µm- und 0,2-µm- Membranen, die durch eine Glasfilterschicht geschützt wurden, filtriert.

Affinitätschromatographie

Der Sinn des Aufreinigungsschemas besteht darin, Antikörper, die unspezifisch an das EMD-Fractogel-Harz und Sequenzen im Humaninsulin binden sowie mögliche Schaf-Anti-Insulin-Antikörper in einem ersten Schritt dadurch zu entfernen, daß man das Serum durch das Humaninsulin-Affinitätsharz gibt.

In einem zweiten Schritt können Antikörper gegen Affen-Insulin-C-Peptid gereinigt werden, nachdem sie an das C-Peptid binden, was einen wesentlichen Teil des am EMD Fractogel immobilisierten Präproinsulins darstellt.

Die Affinitätschromatographie an Präproinsulin wurde deshalb gewählt (statt Chromatographie an immobilisiertem C-Peptid), da eine Bindung an C-Peptid und/oder C-Peptidfragmente, die noch an dem Insulinteil hängen, eine Voraussetzung für die Verwendung der gereinigten Antikörper in einem Immunassay für die quantitative Bestimmung von "präproinsulinartiger Immunreaktivität" ist.

Aufreinigungsvorschrift Probenauftrag

Das verdünnte Schafserum wurde durch zwei Affinitätssäulen gepumpt (Durchflußrate: 3,5 ml/min), und zwar in einem Schritt dadurch, daß man die Humaninsulin-EMD-Fractogel-HR16/11-Säule (1. Säule) direkt mit der Prä-Pro-HI-EMD-Fractogel-XK26/11-Säule (2. Säule) verband. In der ersten Säule werden alle unerwünschten bindenden Materialien entfernt, diese Säule wirkt jedoch nicht auf Antikörper gegen Insulin-C-Peptid. Die zweite Säule bindet spezifisch Antikörper gegen Affeninsulin-C-Peptid. Unspezifische Schafantikörper sowie Serumbestandteile können mit dem Affinitätsharz der zweiten Säule keine Reaktion eingehen und fließen durch.

Das gesamte Einfangen spezifischer Antikörper durch die Affinitätssäule wurde durch Analyse des Durchflusses mit dem BIAcore®-System geprüft. In der Durchflußfraktion war keine Bindungsaktivität nachweisbar.

Elution

Nach dem Durchfließen des Serums wurden die beiden Säulen getrennt und einzeln mit 0,1 M Glycin, 0,04% Proclin, pH 2,7 eluiert (Durchflußrate: 5 ml/min).

Bei der ersten Säule führt das genannte Eluieren unter sauren Bedingungen direkt zur Regeneration der Affinitätsmatrix, die anschließend durch ausführliches Equilibrieren mit PBS-Puffer konditioniert werden kann.

Das Elutionsprofil der Präproinsulin-EMD-Fractogel-Säule ist in Fig. 4b dargestellt. Die Fraktionen 9-22 enthalten (gemäß Analyse mit dem BIAcore® System) aktive Antikörper gegen Affen-Insulin-C-Peptid. Die angegebenen Fraktionen wurden gepoolt und mit Amicon Ultrafree-15-Einheiten (Ausschlußgrenze bei einem Molekulargewicht von 10 kD) auf 10 ml eingeengt.

Um die Antikörper weiter zu reinigen und sie in einen neutralen Puffer zu transferieren, wurde das eingeengte Glycineluat an einer Superdex 200­ (26/60)-Größenausschlußsäule chromatographiert. Das Elutionsprofil ist in Fig. 5 dargestellt. Die Fraktionen 17-24 enthalten die gereinigten Schaf- Antikörper gegen Affen-Insulin-C-Peptid.

Um die Antikörper noch stärker zu reinigen, wurde eine zweite Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung der gleichen Superdex 200(26/60)-Säule durchgeführt (Fig. 6). Das in den Fraktionen 17-21 eluierende Protein wurde gepoolt und als Antikörperendpräparat "99Ser9-rechr" aufbewahrt.

Der Durchfluß durch die Affinitäts-Doppelsäule sowie die Elutionsmittel der Präproinsulin-EMD-Fractogel- und Superdex-200-Säulen wurden mit dem BIAcore®-System untersucht.

Mit dieser Technik kann man Antikörper gegen Affen-Insulin-C-Peptid rasch nachweisen, und zwar dadurch, daß man die Affinitätschromatographie in einer 60-nl-Durchflußküvette, die auf der Oberfläche eines Sensor-Chips erzeugt wurde, simuliert. Aktive Antikörper, die an in dieser Durchflußküvette immobilisiertes Präproinsulin binden, lassen sich hochempfindlich mittels Oberflächen-Plasmon-Resonanz nachweisen.

Ergebnisse Ausbeute

Das Volumen des Antikörperpräparats beträgt 24 ml (Bestimmung mittels Meßzylinder).

Die Proteinkonzentration wurde nach dem BCA-Verfahren in Mikrotiterformat gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pierce) bestimmt. Die OD bei 560 nm wurde mit einem Spectra-III-Elisa-Lesegerät bestimmt (SLT).

Die unbekannte Konzentration des Antikörperpräparats wurde durch Konstruktion einer Standardkurve mit IgG in bekannten Konzentrationen berechnet. Der mg/ml-Wert der Unbekannten läßt sich direkt aus den aufgetragenen Werten ablesen.

Das beschriebene Antikörperpräparat weist eine Konzentration von 0.454 mg/ml auf. Die gesamte Antikörperausbeute beträgt 10,9 mg. Das Antikörperpräparat wurde in 1-ml-Portionen aufgeteilt, und jede Portion wurde mit der Bezeichnung 99Ser 9/rechr.F17-22 beschriftet und bei -70°C, in H825, Raum 542, in einem Nunc(Advantage)- Gefrierschrank aufbewahrt.

Schlußfolgerungen

Das oben beschriebene Antikörperpräparat (99Ser 9/rechr.F17-22) läßt sich in Immunassays zur quantitativen Bestimmung von insulin-C-peptidartiger Immunreaktivitäten, insbesondere in der Assayvariante "Chemolumineszenz-Assay beschichteten Perlen" verwenden.

Anhang 2 Alkylierung von HI PPI (Charge 216-1)

3,28 mg des PPI wurden in 109 µL H₂O gelöst, und die Lösung wurde weiter durch Zugabe von 109 µL 10fach konzentriertem PBS-Puffer mit einem Zusatz von 0,4% Proclin verdünnt. Schließlich wurde eine Lösung mit einem PPI-Gehalt von 3 mg/ml durch Zugabe von 875 µl H₂O hergestellt.

10 µL 1 M DTE (in Wasser) wurden zu 990 µl dieser PPI-Lösung pipettiert. Die Probe wurde 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach 1stündiger Reaktion war ein Proteinniederschlag nachweisbar, und dieser war nach Erhöhung des pH-Werts auf 9,0 während der restlichen Reaktionszeit noch immer vorhanden.

Um die Reduktion von S-S-Brücken im PPI zu stoppen und freies Sulfhydril vor der erneuten Oxidation und/oder Bildung neuer S-S-Brücken zu schützen, versetzte man mit 185 mg festem lodacetamid und inkubierte 4 Stunden bei 4°C im Dunklen.

Das entstandene alkylierte PPI wurde anschließend 2mal gegen 400 ml PBS, 0,04% Proclin, in einem Tube-O-Dialyser dialysiert.

Das ausgefällte Protein wurde abzentrifugiert. Im klaren Überstand (1,3 ml) wurden nach Hydrolyse der Probe 23 µg/ml lösliches alkyliertes PPI mittels Aminosäureanalyse bestimmt.

Daß die Derivatisierung wirksam war, wurde durch ein leicht verzögertes Durchdringen bei der SDS-Gelelektrophorese (PAGE #347, Anhang 4), durch die Aminosäureanalyse und durch einen leichteren proteolytischen Abbau mit Endo Asp-N (PAGE #347, Anhang 4) bewiesen. Offenbar spaltet Endo-AspN das reduzierte PPI nicht nur an der DP-Stelle, sondern auch an den derivatisierten Cysteinen.

Anhang 3 Spaltung von HI PPI an der EDP-Stelle mit Endoproteinase Asp-N

Bei der Endoproteinase Asp-N handelt es sich um eine Metalloprotease, die spezifisch Peptidbindungen N-terminal an der Asparaginsäure und an der Cysteinsäure spaltet.

HI PPI (HIA1 PPI) enthält in seiner Sequenz nur eine Asparaginsäure. Sie befindet sich im C-Peptid, wo sie N-terminal von einem Prolinrest befindet, wodurch die säurelabile DP (C6-C7)-Stelle gebildet wird. Diese Stelle befindet sich vermutlich an der Außenseite des PPI-Moleküls und müßte daher von der Endoproteinase Asp-N angegriffen werden. Alle Cysteinreste sind an der S-S-Brückenbildung beteiligt, liegen innerhalb des Moleküls und sind daher vor einem proteolytischen Angriff geschützt.

Durch Spaltung des PPI an der EDP-Stelle läßt sich eine äußerst wertvolle Modellverbindung herstellen, die bei der Bestimmung der Spezifität unserer affinitätsgereinigten Antikörper von Nutzen ist.

Zur Spaltung der EDP-Stelle innerhalb des C-Peptids wurden 50 µl HI PPI (0,7 mg/ml in Wasser) und 50 µl 50 mM Tris/HCl pH 8,0 mit einem Gehalt von 0,2 M Harnstoff vermischt. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 25 µl Endo Asp N (1 µg, gelöst in 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5) begonnen und wurde 32 Stunden bei 37°C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Einfrieren der Probe gestoppt.

Mittels Gelelektrophorese und anschließender Silberfärbung wird nachgewiesen, daß PPI quantitativ an der EDP-Stelle gespalten wird, da nach Reduktion der Disulfidbrücken in dem enzymatisch gespaltenen Protein zwei Banden getrennt werden können (PAGE #347, Anhang 4). In der Position des ungespaltenen reduzierten PPI (das immer noch ein Einzelkettenmolekül ist, PAGE #347, Anhang 4) ist keine verbleibende Proteinbande sichtbar.

Das von Endo Asp-N gespaltene PPI läßt sich als Modell (Kontroll)- Verbindung verwenden, die:

• - eine Kontaminante, die durch Säurespaltung der EDP-Stelle entstanden ist, nachahmt,
• - ein Insulinderivat, das durch unvollständige Trypsinspaltung mit Teilen des C-Peptids, die noch mit dem C-Terminus der A-Kette und/oder am N-Terminus der B-Kette verbunden sind, entstanden ist, nachahmt.

Anhang 4 Analyse von HI und reduziertem/alkyliertem HI sowohl deren Endo-AspN-Spaltprodukte mittels SDS-Gelelektrophorese (4-12%; PAGE #347)

Die Proben wurden in DTE-haltigem SDS-Puffer aufgetragen, um die S-S-Brücken vollständig zu reduzieren. Siehe Fig. 7.

Anhang 5 Spezifität der affinitätsgereinigten Antikörper von Schaf S95-11 in der beschriebenen Assayform

• 1. Analyse von HI PPI, HI(Affen) C-Peptid, reduziertem/alkyliertem PPI sowie Humaninsulin-C-Peptid mit dem wie in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Assay (Grundlage: Präparat 99Ser9). Alle Verbindungen wurden mit Verdünnungspuffer verdünnt (siehe 4.4.), der 1 mg/ml HIet enthielt. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.
• 2. Analyse von HI (Affen) C-Peptid, mit Endo Asp-N gespaltenem HI PPI, sowie HIA2 PPI und HIA2 C-Peptid mit dem in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Assay (Grundlage: Präparat 99Ser9). Alle Verbindungen wurden mit Verdünnungspuffer (siehe 4.4.) verdünnt, der 1 mg/ml HIet enthielt. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt.

Ergebnisse/Interpretation

• 1. HI C-Peptid und HI PPI werden gleich gut vom Antikörper erkannt, wie aus den Parallelverdünnungsbeziehungen und einer Rechts­ verschiebung (Faktor ~ 6) der Kurve, hervorgeht, die von den Unterschieden bezüglich der Molekulargewichte und einer drastisch reduzierten Inkubationszeit abhängig ist (siehe unten, Tabelle A).
• 2. Human-C-Peptid wird von dem Assay erkannt, um zu einer 50%igen Hemmung zu gelangen, sind jedoch 180 ng/ml erforderlich. Diese Konzentration ist 55mal höher als bei dem Affen-C-Peptid. Aus diesen Daten geht eindeutig die hohe Spezifität des Antikörperpräparats für das Affen-C-Peptid hervor, das sich von der Humansequenz nur an einer Position, nämlich Pro statt Leu am C7, unterscheidet (siehe Tabelle A).
• 3. Es besteht eine deutliche Kreuzreaktivität für mit Endo Asp-N gespaltenes PPI, die Verdünnungskurve ist jedoch wellenförmig, und es tritt im Vergleich zu nativem PPI ein Reaktivitätsverlust um einen Faktor von ~ 10 auf (siehe Tabelle A). Hieraus geht hervor, daß Strukturepitope durch die Einführung einer einzigen Spaltung des C-Peptids zerstört werden, und daß es sich bei der EDP-Stelle um einen wichtigen immunogenen Epitop handelt, der vom Antikörperpräparat 99Ser9 erkannt wird.
• 4. Alkyliertes PPI wird ohne wesentliche Immunreaktivitätsverluste erkannt, woraus hervorgeht, daß Antikörper, die die N- und C-terminalen Aminosäuren spezifisch erkennen, mittels Affinitätschromatographie entfernt werden könnten, so daß sie die Spezifität des Antikörperpräparats nicht beeinflussen können. Da das alkylierte PPI ein lineares C-Peptid mit der Größe von PPI widerspiegelt, sind die Verdünnungskurven von PPI und reduziertem/alkyliertem PPI mehr oder minder deckungsgleich.
• 5. Bei dem HIA2-C-Peptid und dem HIA2 PPI, wo die Epitope am N-terminalen Teil des C-Peptids entfernt und mutiert sind, wird eine deutliche Abflachung der Verdünnungskurven beobachtet. Der Antikörper 99Ser9 bindet jedoch trotzdem an diese Antigene, und zwar mit einer Affinität, die im Vergleich mit den jeweiligen HI-PPI-Strukturen um das ungefähr 35fache verringert ist. Das wellenartige Verhalten der Verdünnungskurven ist für Situationen typisch, bei denen unterschiedliche Populationen monospezifischer Antikörper (wie zum Beispiel in einem polyklonalem Serum) mit Antigenen mit verwandten, jedoch nicht identischen, Epitopen reagieren. Das rasche Abfallen der Hemmkurve bei niedrigen Antigenkonzentrationen stellt die Wechselwirkung der Antikörper mit dem (unveränderten) C-terminalen Teil des linearen C-Peptids dar. Der flache Abschnitt der Kurve zeigt an, daß Antikörper in beträchtlichen Mengen an den mittleren und den N-terminalen Teil des HIA2-C-Peptids, die mutiert und im Vergleich mit HI PPI strukturmäßig verändert sind, mit verringerter Affinität binden. Diese verwandten Antigene können den Tracer (markiertes HI C-Peptid) vom Antikörper nicht so wirksam wie die HI-Antigene verdrängen.
• 6. An der EDP-Stelle gespaltenes PPI HIA2 und PPI HI werden vom Assay beinahe gleich gut erkannt, was wiederum die Wichtigkeit der EDP-Sequenz bei der immunologischen Erkennung durch das Antikörperpräparat 99Ser9 zeigt. Konzentrationen von ≧ 10 ng/ml dieses Antigens bzw. verwandter Antigene können mit dem angegebenen Assay eindeutig nachgewiesen werden.
  Beim ursprünglichen RIA und beim Linco-Assay müssen die Konzentrationen in einer Größenordnung von ≧ 20 ng/ml liegen.
  Für den von NewLab entwickelten ELISA können keine entsprechenden Daten angegeben werden, da keine Kontrollen durchgeführt wurden und da nicht einmal Daten bezüglich der Nachweisgrenze von PPI mit diesem Verfahren existieren. Aufgrund des Assaytyps kann jedoch angenommen werden, daß die Kreuzreaktivität mit PPI und PPI-Derivaten beim ELISA noch niedriger liegt als beim Linco-Assay.

Tabelle A

IC50-Werte mit unterschiedlichen Hemm-Assays und unterschiedlichen Antigenen

Faßt man alle mit den Modellverbindungen erzielten Ergebnisse zusammen, so kann eindeutig festgestellt werden, daß die vom Schaf- S95-11-Präparat 99Ser9 (und 99Ser7, das im RIA verwendet wird) erhaltenen Antikörper, die Anforderungen, unterschiedliche Arten von antigenhaltigen C-Peptiden, die als "C-peptidartige Immunreaktivität" zusammengefaßt werden können, eindeutig zu identifizieren, erfüllen.

Anhang 6

Analyse von In-Process-Material aus der Humaninsulin-HI- Produktion - Entfernung der insulinartigen Immunreaktivität während des Downstream-Processing.

Kurze Beschreibung der verwendeten Assays

RIA: Radioimmunassay; beruht auf dem an immobilisiertem PPI affinitätsgereinigtem Antikörper 99Ser7. Affen-C-Peptid wird als Tracer und HI PPI als Standard verwendet:
Bereich der Standardkurve: 0,39-25 ng/ml (Nachweisgrenze: 0,5 ng/ml).
Linco: im Handel erhältlicher Radioimmungssay; beruht auf Antikörpern gegen Human-C-Peptid. Dieser Assay zeigt eine gute Kreuzreaktivität mit Affen-C-Peptid und PPI auf, im Vergleich zum "Bead"-Assay ist die Bindung an HI PPI jedoch ungefähr dreimal schlechter (siehe Tabelle A, Anhang 5). Als Standard und Tracer wird Human-C-Peptid verwendet.
Bereich der Standardkurve: 0,1 = 5,0 ng/ml (Nachweisgrenze: 0,1 ng/ml).
NewLab: von New Lab Diagnostic Systems GmbH entwickelter Sandwich-ELISA; beruht auf monoklonalem Serum gegen Human-C-Peptid (Fitzgerald) und polyklonalem Serum gegen Affen-C-Peptid. Bei diesem Assay wird isoliertes C-Peptid stark bevorzugt (monoklonal: gegen Human-C-Peptid; polyklonal: gegen Affen-C-Peptid; ohne Affinitätsreinigung an PPI-Harzen). Als Standard wird Affen-C-Peptid verwendet.
Linearer Bereich der Standardkurve: 0,5-10 ng/ml (Nachweisgrenze: 0,5 ng/ml).
Beads: der im vorliegenden Bericht beschriebene Assay. Der nicht radioaktive Assay mit beschichteten Perlen beruht auf 99Ser9-Antikörpern, die nach Affinitätsreinigung an einer HI PPI Affinitätssäule (wie die Antikörper beim RIA) erhalten wurden. Als Standard und Tracer wird Affen-C-Peptid verwendet.
Bereich der Standardkurve: 0,39-25 ng/ml (Nachweisgrenze: 0,4 ng/ml).

Erläuterung der Probenbezeichnung in den folgenden Tabellen

SB-Proben: Testmaterial nach Reinigungsschritt 12 (Ionenaustausch­ chromatographie)
KA- und KB-Proben: Testmaterial nach Reinigungsschritt 13 (Chromatographie mit umgekehrter Phase)
UA-Proben: Testmaterial nach Reinigungsschritt 14 (letzte Kristallisation)

Anhang 7 Analyse von In-Process-Material aus der Insulin-HIA1- Produktion-Entfernung der insulinartigen Immunreaktivität während des Downstream-Processing

Anhang 8 Immunisierung und Serumabnahme eines Schafs (S95/11) mit polyklonalen Antikörpern gegen Affen-C-Peptid Zusammenfassung

Ziel des vorliegenden Berichts ist es, die Immunisierung und die Serumabnahme von einem Schaf, das Antikörper gegen Affen-C-Peptid enthält, zu beschreiben. Zu Beginn der Immunisierung wurde das Schaf (Bezeichnung S95/11) mit dem Antigen (zu Beginn 2 mg Affen-C-Peptid) in gleichen Volumina 1 : 1-Mischung aus 1 ml Kochsalzlösung +1 ml komplettem Freundschem Adjuvans (cFA; Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) immunisiert. Diese Emulsion wurde unmittelbar vor der Verabreichung hergestellt und wurde an 2-3 Stellen subkutan injiziert. Auffrischungen in Abständen von 2-4 Wochen bestanden aus der gleichen Antigenmenge (2 mg C-Peptid) in einer 1 : 1-Mischung aus Kochsalzlösung (1 ml) und 1 ml unvollständigem Freundschem Adjuvans (Sigma Chemicals, Heidelberg, Deutschland). Im Abstand von 2 Wochen bis 2 Monaten wurden Blutproben durch Punktion der Vena jugularis abgenommen. Das Antiserum wurde in aliquote Teile aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt. Bestimmte Proben wurden zur Entwicklung eines Assays für den Nachweis von Präproinsulin in dem Insulinendprodukt ausgewählt.

Rekombinantes Humaninsulin wird aus einem in transfiziertem E. coli hergestellten Fusionsprotein hergestellt. Während des Processing des Humaninsulins von dem denaturierten Fusionsprotein wird als Zwischenprodukt das sogenannte Präproinsulin (PPI) gebildet. Letzteres wird durch enzymatische Spaltung, die von Trypsin katalysiert wird, einem weiteren Processing unterzogen, während dessen durch synchrone Spaltung an den Sequenzpositionen -Arg-Arg- (B31-32) und -Lys-Arg- (A1-A0) aus dem Einzelketten-Präproinsulin (PPI) das zweikettige heterodimere Insulin gebildet wird. Durch weitere Aufreinigungsverfahren wird dann Insulin hergestellt. Die Sequenz des C-Peptids und seiner Homologen entspricht dem Affen-C-Peptid, das sich von dem Human-C-Peptid an einer Aminosäureposition (Pro statt Leu Position 37) abweicht, was aus molekularbiologischen Gründen bei der DNA-Synthese ausgetauscht wurde.

Zur Entwicklung eines Immungssays zum Nachweis von Präproinsulin (< 10 ppm) im Endprodukt eignen sich gegen C-Peptid gerichtete polyklonale Antikörper deshalb besonders, da keine störende Kreuzreaktivität mit Insulin besteht. Im Gegensatz dazu würde bei Immunisierung mit Präproinsulin als Antigen der Großteil der Antikörper gegen Insulin gerichtet sein. Letzteres würde sich bei Anwesenheit eines 10⁶fachen Insulinüberschusses nicht zum Nachweis von Spuren (< 10 ppm) PPI eignen.

Das Ziel des vorliegenden Berichts besteht darin, die Immunisierung und Serumabnahme von einem Schaf, das gegen Affen-C-Peptid gerichtete Antikörper enthält, zu beschreiben und zu dokumentieren. Bestimmte Proben wurden zur Entwicklung eines Assay zum Nachweis von Präproinsulin in dem Insulinendprodukt ausgewählt.

Zur Vermeidung von insulinartigen immunogenen Determinanten in dem verwendeten C-Peptid, wie -Lys oder -Lys-Arg- bei Position 34 oder 34-35 des C-Peptids wurde Affen-C-Peptid ohne diese basischen Aminosäuren Arg- hergestellt und als Affen-C-Peptid verwendet.

Testsystem Tiere

Ein weibliches Schaf wurde von Gerhard Mundschenk (Zwerggasse 2; 65468 Trebur-Astheim) käuflich erworben und auf einem Bauernhof (Hermann Kettenbach, Im Birkenfeld 38, 65719 Hofheim-Langenhain) gehalten, wo es eine normale Standard-Ziegenration erhielt. Das Schaf wurde mit der Bezeichnung S95/11 versehen.

Studienplan sowie Vorschrift bei der aktiven Immunisierung und der Blutabnahme

Zu Beginn der Immunisierung wurde das Schaf mit dem Antigen (zu Beginn 2 mg Affen-C-Peptid) in gleichen Volumina 1 : 1-Mischung aus 1 ml Kochsalzlösung +1 ml komplettem Freundschem Adjuvans (cFA; Charge Nr.: 70052; Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA) immunisiert. Diese Emulsion wurde unmittelbar vor der Verabreichung hergestellt und wurde an 2-3 Stellen subkutan injiziert. Auffrischungen in Abständen von 2-4 Wochen bestanden aus der gleichen Antigenmenge (2 mg C-Peptid) in einer 1 : 1-Mischung aus Kochsalzlösung (1 ml) und 1 ml unvollständigem Freundschem Adjuvans (Charge Nr.: 96H8950; Sigma Chemicals, Heidelberg, Deutschland). Im Abstand von 2 Wochen bis 2 Monaten wurden Blutproben durch Punktion der Vena jugularis abgenommen. Für weitere Angaben und den Zeitplan der Immunisierung und Blutabnahme, siehe Tabelle 1 im Anhang. Das Antiserum wurde in aliquote Teile aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C aufbewahrt. Bestimmte Proben wurden zur Entwicklung eines Assays für den Nachweis von Präproinsulin in dem Insulinendprodukt ausgewählt.

Ergebnisse

Da es sich bei dem vorliegenden Bericht um eine Beschreibung der Immunisierung und Herstellung eines Blutserums gegen ein Antigen handelt, sei auf den Anhang hingewiesen, in dem der Zeitplan der Immunisierung und Serumabnahme sowie Herstellung angeführt ist.

Diskussion und Schlußfolgerungen

Die Vorgehensweise beim Immunisieren, inklusive die Tatsache, daß anfänglich cFA und später iCA verwendet wurde, sowie der Zeitplan entsprechen den in der Literatur zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen angegebene Antigene und Peptide beschriebenen Standardverfahren.

Bibliographie für Anhang 8

Cußler, K., Hartfinger, J.: Gibt es Alternativen zum Einsatz von Freundschem Adjuvans bei der Immunisierung von Labortieren? Tagungsabschnitt "Immunisierung und Adjuvantien" des 4. Österreichischen Internationalen Kongresses über "Ersatz- und Ergänzungsmethoden zu Tierversuchen in der biomedizinischen Forschung", 24-26. September 1995 (Linz).

Bennett, B., Check, I.J., Olsen, M. R., Hunter, R. L.: A comparison of comercially available adjuvants for use in research. [Vergleich von im Handel erhältlichen Adjuvantien für Forschungszwecke] J. Immunol. Meth. 153, 31-40, 1992.

Finger, H.: "Das Freundsche Adjuvans - Wesen und Bedeutung". In: G. Heyman (Ed.): Arbeiten aus dem Paul-Ehrlich-Institut, dem Georg-Speyer-Haus und dem Ferdinand-Blum-Institut zu Frankfurt a. M., Heft 60, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1964.

Fineberg, S. E., Galloway, J. A., Fineber, N., Golduran, J.: Effects of species origin, purification levels and formulation on insulin immunogenicity. [Wirkung der artmäßigen Herkunft, Reinigungsstufen und Formulierung auf die Immunogenität von Insulin] Diabetes 32, 592, 1983.

Tabellarische Zusammenfassung Tabelle 1

Dokumentation des Immunisierungsschemas und der Blutabnahme für die Herstellung von Antiseren mit polyklonalen Antikörpern gegen Affen-C-Peptid im Schaf; die Antigenmenge (Affen-C-Peptid) wurde in einer 1 : 1-Mischung aus 1,0 ml 0,9%iger Kochsalzlösung bzw. 1 ml Adjuvans gelöst. Die Blutabnahmen fanden an den angegebenen Tagen statt.

Immunisierungsschema

Antigen: Affen-C-Peptid; Charge Nr.: DJIII, 543
Adjuvans: Erstimmunisierung: KFA (Difco) Charge 70052LA
Adjuvans: Auffrischung: IFA (Sigma) Charge 96H8950

Blutabnahme und Serumvolumen

Anhang 9 Probenvorbereitung

Es ist bekannt, daß sich Insulin in neutralen Lösungen nach dem Kristallisieren oder Gefriertrocknen nur schlecht löst. Um hochkonzentrierte Insulinlösungen zu erhalten, müssen Insulinproben daher zuerst in Säure gelöst werden (z. B. verdünnte phosphorige Säure oder HCl), und anschließend mußte durch rasche Zugabe einer geeigneten Menge NaOH ein basischer pH (9,0-10,5) eingestellt werden. Der Arbeits-pH wird anschließend durch Titration oder durch Zugabe entsprechender Puffer eingestellt.

Die genannte Vorgehensweise ist zeitmäßig und verfahrenstechnisch sehr aufwendig, und jede Probe muß einzeln behandelt werden.

Um diese umständliche Vorgehensweise umgehen zu können, prüften wir unterschiedliche Vorschriften für die Auflösung von Insulin.

Das Ziel bestand darin, klare Insulinlösungen mit einer Konzentration von 1 mg/ml und einem pH von 8,6-9,0 zu erhalten.

• - Ein pH von < 9 ist günstig, um HIA1 und Insulin in In-Process-Material (insbesondere Material nach Trypsinspaltung) in Lösung zu halten (der IP von HIA1 beträgt 7,4).
• - Ein pH von < 9,0 begünstigt eine hohe Affinität und stabile Interaktionen zwischen Antigen und Antikörper.

Wir prüften unterschiedliche geeignete Puffer im pH-Bereich von 8-9,5, um auf eine stabile Antigen(HI PPI)/Antikörper-Bindung bei pH 9,0 zu screenen. Bei den Testpuffern handelte es sich um: Tris, TAPS, Bicine, GlyGly, BisTrisPropane, Ches, Phosphat/EDTA (entsprechend dem Human-C-Peptid-RIA-Kit von Linco Research Inc.).

Außerdem wurden unterschiedliche Pufferkonzentrationen untersucht, und es zeigte sich, daß eine Erhöhung der Pufferkonzentrationen bei dem vorgegebenen pH von 9,0 zu einer allmählichen Störung der Antigen/Antikörper-Bindung führte.

Aufgrund des Obengesagten wählten wir für den Endvergleich vier Puffer in einer Konzentration von 20 mM:

• 1. Tris* (Merck -108382),
• 2. TAPS** (Sigma T-5130),
• 3. Bicine*** (Sigma B-3876)
• 4. GlyGly**** (Calbiochem 3630).

Wir stellten diese Puffer dadurch her, daß wir die erforderliche Menge Feststoff in Wasser lösten und den pH durch Zugabe der entsprechenden Menge NaOH auf 9,0 einstellten.

Alle wiesen im pH-Bereich von 8,5-9,0 eine gute Antigen/Antikörper- Bindung auf.

Insulinproben zu ungefähr 0,5-0,8 mg wurden in 10 mM HCl gelöst, wodurch man eine Lösung von 10 mg/ml erhielt. Das klare, gelöste Material wurde anschließend im Verhältnis 1 : 10 mit einem der obengenannten Puffer weiter verdünnt.

Die Ergebnisse können der folgenden Tabelle entnommen werden:

Bei allen Beispielen ist der pH nach Zugabe der sauren Insulinlösung unverändert oder nur minimal verändert, zu unserem Erstaunen wurde jedoch nur mit Bicine-Puffer immer wieder eine klare Lösung von HIA1 oder In-Process-Material erzielt.

Die Auswahl des Bicine-Puffersystems stellte daher einen wichtigen Durchbruch bei der Erstellung einer einfachen Vorgehensweise bei der Probenauflösung und bei der Erzielung stabiler Analyt/Puffer- Bedingungen während der Inkubationsdauer des Immunassays dar.

* Tris(hydroxymethyl)aminomethan, pKa = 8,3
** (N-tris[Hydroxymethyl]-3-aminopropansulfonsäure, pKa = 8,4
*** (N,N-bis[2-Hydroxyethyl]glycin), pKa = 8,3
**** Glycylglycin, pKa = 8,2.

Anhang 10 Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene polyklonale Antikörper

Die folgenden Antikörper wurden erhalten:

Z2127, 99Ser1_SD2/F17-22
Z94, 99Ser2_SD2/P3
S95-11, 99Ser7/SD2-650/F17-22
S95-11, 99Ser8/SD2-651/F17-21
S95-11, 99Ser9/SD2-652/F17-24
S95-11, 99Ser10/SD2-680/F15-25
S95-11, 99Ser11/SD2-681/F15-24
S95-11, 99Ser12/SD2-6821F15-24.

Claims (1)

1. Verfahren zur Untersuchung von gentechnisch hergestelltem Humaninsulin und dessen Derivaten (nachdem Humaninsulin oder dessen Derivate aus ihren Vorstufen durch enzymatische Spaltung hergestellt wurden) auf das Vorhandensein von Präproinsulin, dessen Derivaten, C-peptidhaltigen Insulinderivaten und/oder isoliertem C-Peptid mittels eines nicht radioaktiven Assays mit den folgenden Schritten:

   • a) Vermischung der Proben mit Verdünnungspuffer;
   • b) Versetzen der nach (a) erhaltenen Mischung mit einem Tracer;
   • c) Versetzen der nach (b) erhaltenen Mischung mit Antikörper;
   • d) Versetzen der nach (c) erhaltenen Mischung mit "C-peptide second antibody bead";
   • e) luminometrische Analyse der nach (d) erhaltenen Mischung.