DE3103612A1

DE3103612A1 - "verfahren und reagens zur bestimmung von chlorid im blutserum"

Info

Publication number: DE3103612A1
Application number: DE19813103612
Authority: DE
Inventors: Gerhard Ertingshausen; Wai-Tak Law
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Union Carbide Corp
Priority date: 1980-02-04
Filing date: 1981-02-03
Publication date: 1982-01-21
Also published as: FR2475226A1; US4278440A; CA1144460A; JPS56120949A; GB2068541B; GB2068541A; FR2475226B1; DE3103612C2

Description

"Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Chlorid im Blutserum"

Beanspruchte Priorität:

4. Februar 1980, V.St.A., Nr. 118,215

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagens für die direkte quantitative Bestimmung von Chlorid im Blutserum.

Es ist in der Biologie seit langem bekannt, daß Chlorid das extrazelluläre Hauptanion in biologischen Flüssigkeiten ist. Die Bewegung des Chlorids in die rote Zelle und aus der roten Zelle ist wesentlich für den Transport von Bicarbonationen in Antwort auf sich verändernde Mengen von Kohlendioxid. Erhöhte, Chloridwerte im Serum deuten im allgemeinen auf Entwässerung, Hyperventilation, Herzinfarkt, Harnwegobstruktion durch Prostata oder andere Leiden hin. Niedrige Serumchloridwerte findet man bei ausgedehnten Verbrennungen, übermäßigem Erbrechen, metabolischer Acidose, Nephritis, Darmverschluß, Addisonkrise und Diarrhöe.

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3NTO: DEUTSCHE BANK KQ. M

POSTSCHECKKONTO: MÖNCHEN 50175-809 · BANKKON

MÖNCHEN, LEOPOLDSTRASSE 71. KONTO-NR. W/3578«

Das früheste praktisch durchführbare Bestinunungsverfahren für Chlorid wurde von T. Volhard1874 (J. Prakt. ehem., Bd. 9, S. (1874)) angegeben. Seit dieser Zeit sind in der Literatur Dutzende von direkten und indirekten Analyseverfahren beschrieben worden. Die beliebtestenMethoden sind die coulometrische Titration, das spezifische Ion-Elektrodenverfahren und die kolorimetrische Quecksilber(II)-thiocyanat-Methode.

P.W. West und H. Coil berichten in "Anal, ehem.", Bd. 28 (1956), über eine direkte spektrophotometrische Methode für die Chloridbestimmung im Bereich von 0,02 bis 0,2 mVal/1. Später wurde dieses Verfahren, in dem kein Quecksilber verwendet wird, für die Chloridbestimmung im Serum übernommen (vgl. B. Fingerhut,"Clin. Chem. Acta", Bd. 41, S. 247 (1972)). Da das Reagens ein starkes Perchlorsäure-Medium ist, wird die Dialyse zur Vermeidung von Problemen, die mit der Proteinausfällung zusammenhängen, verwendet. Diese Methode fand keine weite Verbreitung in klinischen Laboratorien, obwohl bei dieser direkten kolorimetrischen Bestimmung kein Quecksilber verwendet wird, das in anderen kolorimetrischen Bestimmungsverfahren unerwünschte Beseitigungsprobleme schafft. Festgestellt werden sollte, daß in dem originalen West- und CoIl-Artikel keine Absorptionsveränderung bei einer Säurekonzentration unter 2,On. beobachtet wurde.

Es wurde nun festgestellt, daß man durch Verwendung eines quecksilberfreien Reagens, das Eisen(III)-perchlorat und Perchlorsäure in verdünnten Mengen enthält, und vorzugsweise

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VM ν * ζ- y.

in Gegenwart eines nicht-ionischen Netzmittels zuverlässige Werte bei der direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid erhalten kann.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein neues Verfahren und ein neues Reagens für die direkte quantitative Bestimmung von Chlorid in Blutserum zur Verfügung zu stellen, das die Reaktion zwischen dem Chlorid und Eisen(III)-ionen ausnützt, jedoch kein Quecksilber enthält. Außerdem sollte das neue Reagens Perchlorsäure in niedrigeren Konzentrationen als bisher enthalten. Eine weitere Aufgabe der Erfindung war es, ein Verfahren für die Bestimmung von Chloridionen zur Verfügung zu stellen, das eine hohe Linearität für die Chloridionenbestimmung aufweist, durch andere im Blutserum vorhandene Verbindungen nicht gestört wird und dank einer bichromatischen Methode die Chloridbestimmung in einem spektrophotometrischen Zentrifugalanaiysator erleichtert.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid im Blutserum, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in folgenden Stufen

(a) eine Probe des Serums mit einem Reagens zu einer Lösung umsetzt, wobei das Reagens

(i) etwa 0,01 bis etwa 2,On Perchlorsäure in entionlsiertam Wasser,

(.ti) etwa 0,01 bis etwa 1,0n Eisen(III)-perchlorat in entionisiertem Wasser und

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-Jr-

(iii) etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent eines nichtionischen Netzmittels in Form einer wäßrigen Lösung enthält, das die Ausfällung des Proteins möglichst geringhält, jedoch die Absorptionsbestimmung des Chloridkomplexes nicht stört,

(b) die Absorption der Lösung nach Inkubation bestimmt,

(c) diese Absorption mit den Absorptionen von Lösungen mit bekanntem Chloridgehalt vergleicht, und

(d) die Chloridmenge im Serum bestimmt.

Die Figur zeigt eine Serie von Spektralabtastkurven, die nach dem Vermischen der Probe und des Reagens jede Sekunde in
einem analytischen Abtastspektrophotometer aufgenommen wurden. Aus der Figur ist ersichtlich,· daß die durch Bilirubin verursachte Absorption ein Maximum bei 450 nm hat, das sich mit ,der Zeit auf 370 nm verlagert. Die nach 4 Sekunden aufgenommene Absorption bei 420 nm entspricht der zuletzt abgelesenen Absorption bei 340 nm.

Wie oben angegeben^ wurden bisher zur Bestimmung von geringen Mengen Chlorid in wäßrigen Proben Eisen(III)-perchlorat und eine 2n bis 8,5n. Perchlorsäure verwendet. Der gelbe Eisen(III)-chlorokomplex zeigt eine intensive Absorptionsbande in der Nähe von 340 nm, während das Eisen(III)-perchlorat enthaltende Reagens im sauren Medium nur eine geringe Lichtab-

— j& —

sorption in diesem Bereich hat und somit zur quantitativen Bestimmung geeignet ist.

Perchlorsäure ist als gutes Ausfällmittel für Serumproteine bekannt. Um jedoch die Chloridkonzentration im Serum bestimmen zu können, muß man ein Trennungsverfahren für die Serumproteine, wie die von Fingerhut beschriebene Dialyse/ verwenden, bevor die Bestimmungsmethode für ein automatisches Verfahren angepaßt werden kann. Harnstoff wurde verwendet, um die Ausfällung von Protein in einem Perchlorsäuremedium einer anderen Farbreaktion zu verhindern, es wurde jedoch beobachtet, daß Harnstoff ein gefärbtes Produkt mit Eisen (TII)-ionen bildet, dessen Absorption bei 340 nm liegt, und deshalb für die direkte Reaktion nicht geeignet ist.

Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Verfahren wurde festgestellt, daß Eisen(III)-perchlorat und Perchlorsäure in sehr verdünnten Konzentrationen verwendet werden können und daß die Verwendung eines Netzmittels eine getrennte ProtGintrennungsstufe überflüssig macht. Dank einer systematischen Untersuchung der pH-Abhängigkeit der Eisen(III)-chloridkomplexe wurde entdeckt, daß sich Eisen(III)-chloride unter wohldefinierten Bedingungen bei niedriger Azidität bilden. So wurde zum Beispiel beobachtet, daß die Komplexe linear bei 340 nm im und jenseits des physiologischen Bereiches von Chlorid im Serum absorbieren, wobei die Standardkurve dem Beer¹sehen Gesetz unterliegt. Mit dem erfindungsqeiru-ißen Verfahren erhält man eine Empfindlichkeit, die mit

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dem Reagens vergleichbar ist, das konzentrierte Perchlorsäure enthält. Außerdem wurde beobachtet, daß im erfindungsgemäßen Verfahren sich der Chloridkomplex in weniger als einer Minute bildet.

Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Perchlorsäure und Eisen(III)-perchlorat als verdünnte Lösungen verwendet. In der Praxis wurde jedoch festgestellt, daß man die Zusammensetzung des Reagens variieren kann und gute Ergebnisse mit verschiedener Empfindlichkeit erhält. Ein typisches Beispiel für ein erfindungsgemäßes Reagens enthält somit:

1. Perchlorsäure (HClO₄),etwa 0,01 bis etwa 2,On

2. Eisen(III)-perchlorat, nicht-gelbes /Fc(ClO₄)J₃, etwa 0,01 η bis etwa 1,0n

3. Polyoxyäthylen-lauryläther (oder ein entsprechendes nicht-ionisches Netzmittel), etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent.

Für den speziellen im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Analysator ist besonders ein Reagens geeignet, das 0,0378 η Fe(ClO₄)₃, 9,65 % Polyoxyäthylen-lauryläther und 0,246 η HC-IO₄ enthält.

Das nicht-ionische Netzmittel im erfindungsgemäßen Verfahren dient der Unterbindung und/oder Ausschaltung der Ausfällung von Blutproteinen. Im Gegensatz zu Harnstoff bildet das nicht-

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ionische Netzmittel mit Eisen(III)-ionen kein gefärbtes Produkt, das bei 34 0 nm absorbiert, und ist daher ideal für diesen Zweck geeignet.

Die einzigen Anforderungen an das Netzmittel sind, daß es nicht ionisch sein darf, die Ausfällung von Blutproteinen unterdrückt oder verhindert und, im Gegensatz zu Harnstoff, die Absorptionsbestimmung nicht stört. Bevorzugte Netzmittel sind Polyoxyäthylen-äther mit 2 bis 40 Äthylenoxideinheiten, die sich von primären und sekundären Alkoholen mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen ableiten. Ein besonders bevorzugtes nicht-ionisches Netzmittel für das erfindungsgemäße Verfahren ist Polyoxyäthylen-lauryläther, der im Handel erhältlich ist.

Es können aber auch andere nicht-ionische Netzmittel verwendet werden, vorausgesetzt, sie erfüllen die oben angegebenen Bedingungen.

Da das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Reagens ein Oxidationsmittel ist, das Bilirubin oxidiert, erzeugt es bei Serumproben ein dynamisches Interferenzproblem. Bei einer Untersuchung der Interferenz wurde festgestellt, daß das herkömmliche Verfahren der Leerwertbestimmung des Serums, der chemischen Veränderung sowie der Abtrennung durch Extraktion entweder zu kompliziert ist oder zu lange dauert.

bichromatischen Deshalb wird im erfindungsgemäßen/Verfahren ein 420 nm-FiIter zur Durchführung der dynamischen Leerwertbestimmung verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren schließt die Verwendung von

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ΑΛ

-Jf-

Filtern im Bereich von 380 bis 450 nm für die bichromatische Leerwertbestimmung ein. Das 420 nm-Filter wird bevorzugt, da es gleichzeitig die Interferenzen von Bilirubin und Hämoglobin ausschaltet. Der Serum-Leerwert verändert sich mit der Zeit, da der Bilirubin-Absorptionsgipfel sich langsam von 450 nm auf 370 nm verschiebt. Ein Absorptions-Leerwert, der mit dem übereinstimmt, der bei 34 0 nm sowohl für die statische Hämolyse·- als auch die dynamische Bilirubininterferenz gemessen wird, kann bei 420 nm bei entsprechender Zeitwahl erhalten werden; dies wurde experimentell bestimmt und ist auch aus der Figur ersichtlich. Dieser Serum-Leerwert wird gespeichert und von dem bei 340 nm bestimmten Endwert abgezogen. Dieses Verfahren ist einfach, es umgeht die Lagerung einer Serum-Leerprobe und scheidet das Bilirubin-Interferenzproblem aus.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann jeder Analysator, der eine bichromatische Bestimmungsausrüstung hat, verwendet werden. Besonders geeignet ist ein Analysator (CentrifiChem der Firma Union Carbide Corporation), der für das Vermischen und Einbringen der Reagentien ein Zentrifugalfeld verwendet. Wird die Analyse manuell in einem auf 3O⁰C thormostatisierten Spektrophotometer durchgeführt, so wird eine Durchflußküvette bevorzugt. Bei einem Zentrifugalfeld-Analysator werden die Proben und Reagentien mit einem Probenverdünnungsfaktor von 1:40 in die Transferscheibe pipettiert. Die Analysator-Parameter können manuell gewählt werden oder man kann den Computer so programmieren, daß die experimentellen

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Stufen automatisch ablaufen. Die Scheibe wird in den Analysator eingebracht, die Parameter werden eingegeben und die Rotation begonnen. Nach dem Ausdrucken wird der Analysator für die Endergebnisse auf die geänderte Wellenlänge neu eingestellt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des Reagens

Eine Vorratslösung von 0,7n Eisen(III)-perchlorat wird durch Lösen von 360 g Eisen(III)-perchlorat als nicht-gelbe Kristalle in einem Liter entionisiertem Wasser hergestellt. Diese Lösung wird filtriert und mit Kaliumdichromat standardisiert. Eine 5n Perchlorsäure-Vorratslösung wird durch Verdünnen von 450 ml 70-prozentiger Perchlorsäure mit einem Liter entionisiertem Wasser hergestellt und mit Natriumhydroxid standardisiert.

Die Arbcitslösungen werden wie folgt hergestellt: Die Lösung A wird aus den Vorratslösungen hergestellt und enthält 0,0756n Ei sen(III)-perchlorat und 0,492n Perchlorsäure. Die Lösung B wird als wäßrige Lösung hergestellt und enthält 19,3 Gewichtsprozent Polyoxyäthylen-lauryläther. Dieses Netzmittel ist im Handel als 3 0-gewichtsprozentige Lösung erhältlich, Lösung B wird daraus durch Verdünnung hergestellt. Die Lösungen A und B werden im Volumenverhältnis von 1:1 zum er-

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findungsgemäßen Reagens vermischt.

Manuelles Verfahren

In ein 13 χ 100 min-Probenröhrchen werden erst 2 ml Lösung B, dann 70μ1 Probe pipettiert und vermischt. In Serumproben kann eine weiße Trübung erscheinen, sie verschwindet jedoch nach dem Vermischen. Anschließend werden 2 ml Lösung A zugesetzt, das Teströhrchen wird zum Vermischen geschüttelt.

Durch Versetzen eines 13 χ 100 mm-Probenröhrchens mit 2 ml Lösung B, 70μ1 entionisiertem Wasser und 2 ml Reagens A und Vermischen wird eine Reagais-Leerwertlösung hergestellt.

Die Serum-Leerwertlösung wird durch Pl-

pettieren von 4 ml entionisiertem Wasser in ein 13 χ 100 ml-Teströhrchen und Zugabe von 70μ1 Probe sowie anschließendes Vermischen hergestellt.

Beim manuellen Verfahren werden alle Lösungen in einem 30⁰C warmen Wasserbad oder einem Heizblock 5 Minuten inkubiert. Dann werden die Lösungen in das Spektrophotometer eingeführt, die Werte werden abgelesen, wenn die Absorption stabil ist (etwa 15 Sekunden).

Bichromatisches Verfahren

Jedes Instrument, das eine bichromatische Bestimmungsausrüstung hat, wie der CentrifiChem-Analysator, kann verwendet werden. Gemäß der Anleitung für den Analysator werden

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die Proben und das Reagens mit einem Probenverdünnungsfaktor von 1:40 in die Transferscheibe pipettiert. Die Analysator-Parameter können manuell gewählt werden oder der Computer wird so programmiert, daß die experimentellen Stufen automatisch ablaufen. Die Scheibe wird in den Analysator eingebracht, die Parameter werden eingegeben und die Rotation begonnen. Nach dem Ausdrucken wird der Analysator für die Endergebnisse auf die veränderte Wellenlänge eingestellt.

Beispiele 2 bis 9

Mit den gemäß Beispiel 1 hergestellten Reagentien werden verschiedene Human-Blutserumproben auf ihren Chloridgehalt in einem CentrifiChem-Analysator untersucht. Die Serumproben und die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

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Tabelle I Beispiel

2 3 4 5

Probe

-* co

Normalserum ikterisches Serum hämolysiertes Serum trübes Serum

Kontrollserum (500 mg Hämogobin/dl enthaltend)

Kontrollserum (43,5 mg Bilirubin/dl enthaltend)

entionisiertes Wasser (40 mVal Br~/1 haltend)

Kontrollserum (sehr trüb)

coulometrisch
(mVal/1)

102

97

109

103

107
104

32
106

/ci"7

gefunden (mVal/1)

101

96

108

104

106 104

1 105

verwendete Methode

bichromatisch bichromatisch bichromatisch bichromatisch

bichromatisch bichromatisch

ι vn

*) mittels Digital-Meßgerät der Fa. Corning Glass Works

O CO CD

Beispiel 10

Die verscniedenen Parameter des erfindungsgemäßen Verfahrens werden unter Verwendung der bichromatischen und der manuellen Methode verglichen. Auch die Parameter einer Leerwertbestimmung sind angegeben. Alle Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt .

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	Parameter	Linearität	Tabelle II	bi chrctnatisch	manuell
		Genauigkeit	Methode	0-120 mVal/1	0-120 mVal/1
	1.	während 1 Tages
	2.	von Tag zu Tag	1,54 %	1 ,7 %
		Genauigkeit	0,8 %	1 ,4 %
		(% Wiedergewinnung)
	3.	Stabilität
		Verhältnis zur coulo-
	4.	metrischen Methode
	5.	Interferenzen	0,9743	0,968
co		Br"
CD »—k	cn	F~	keine bis zu 40 mVal/1
Ii ι W CD		Bilirubin	keine bis zu 40 mVal/1
G>		Hämoglobin	keine	keine bis zu 5iwj/d]
O		Trübung	keine bis zu 300 mg/dl	keine bis zu 300 ing/d.¹
σ>			keine bis zur starken	keine bis zur starken
<n		Trübuna	Trübung

Leerwert

0-180 mVal/1

1 ,3 % 1 ,8 %

95 - 103 %

1 Jahr bei 25°C

0,9256

keine bis zu 100 mVal/1 keine bis zu 40 mVal/1 keine bis zu 5 mq/dl keine bis zu 500 mg/dl

keine bis zur starken Trübung

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1.λ Verfahren zur direkten quantitativen Bestimmung von Chlorid im Blutserum, dadurch gekennzeichnet , daß man in folgenden Stufen

(i) etwa 0,01n bis etwa 2,0n Perchlorsäure in entionisiertem Wasser,

(ii) etwa 0,01n bis etwa 1,On Eisen(III)-perchlorat in entionisiertem Wasser und

(iii) etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent eines nichtionischen Netzmittels in Form einer wäßrigen Lösungenthält, das die Ausfällung des Proteins möglichst geringhält, jedoch die Absorptionsbestimmung des Chloridkomplexes nicht stört,

(b) die Absorption der Lösung nach Inkubation bestimmt,

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(c) diese Absorption mit den Absorptionen von Lösungen mit

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bekanntem Chloridgehalt vergleicht und (d) die Chloridmenge im Serum bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Absorption der Lösung bei 340 nm bestimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet/ daß man die durch die Gegenwart von Bilirubin in Serumleerproben bedingte Interferenz durch ein bichromatisches Verfahren ausschaltet, bei dem man den Bilirubin-Absorptionsgipfel bei 420 nm während dessen Verlagerung von 460 auf 370 nm mißt und diesen Wert von der Endbestimmung bei 340 nm der Blutserumprobe abzieht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als nicht-ionisches Netzmittel Polyoxyäthylen-lauryläther verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß die BTUtserumprobe in einer Menge von 70μ1 verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch von gleichen Volumina entionisierter Lösungen herstellt, die 0,0756n Eisen(III)-perchlorat bzw. 0,492n Perchlorsäure enthalten, und von diesem Gemisch insgesamt 2 ml verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige 19,3 Gewichtsprozent Polyoxy-

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äthylen-lauryläther enthaltende Lösung in einer Menge von 2 ml verwendet.

8. Reagens zur Verwendung für die direkte quantitative Chloridbestimmung im Blutserum nach Anspruch 1, enthaltend:

(i) etwa 0,01η bis etwa 2,On Perchlorsäure in entionisiertem Wasser,

(ii) etwa 0,01n bis etwa 1,0n Eisen(III)-perchlorat in entionisiertem Wasser und

(iii) etwa 0,1 bis etwa 20 Gewichtsprozent eines nichtionischen Netzmittels in Form einer wäßrigen Lösung, das die Ausfällung des Proteins möglichst geringhält, jedoch die Absorptionsbestimmung des Chloridkomplexes nicht stört.

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