DE69116034T2

DE69116034T2 - Immunotestreagenzien und Verfahren zur Bestimmung von Cyclosporin

Info

Publication number: DE69116034T2
Application number: DE69116034T
Authority: DE
Inventors: Steven E Lunetta; Victoria P Meucci; Marjorie A Morrison; Elizabeth A Simpson; Mariola B Zajac
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1990-08-15
Filing date: 1991-08-08
Publication date: 1996-06-20
Anticipated expiration: 2011-08-09
Also published as: CA2049089A1; US5750413A; EP0473961A3; JP3171460B2; ES2084069T3; DK0473961T3; AU642035B2; ATE132504T1; CA2049089C; EP0473961A2; EP0473961B1; DE69116034D1; GR3019512T3; JPH04253999A; US5489668A; AU8247191A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Cyclosporin in einer Testprobe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung nachweisbare Tracerverbin,dungen zur Verwendung in Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays, zum Nachweis der Anwesenheit oder Menge von Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten in einer Testprobe.

Hintergrund der Erfindung.

Cyclosporin [U.S. Patent Nr. 4 117 118; Ruegger, et al., Helvetica Chimica Acta, Band 59(4), Seiten 1075-1092 (1976); U.S. Patent Nr. 4 289 851; und Traber, et al., Helvetica Chimica Acta, Band 60(4), Seiten 1247-1255 (1977) und Band 65(5), Seiten 1655-1677 (1982)] ist ein cyclisches Undecapeptid fungalen Ursprungs, das gewöhnlich als starkes immunosuppressives Agenz zur Vorbeugung gegen das Abstoßen von tansplantierten Organen wie Nieren, Herzen, Knochenmark und Leber beim Menschen verwendet wird. Die Wirksamkeit von Cyclosporin wurde auch im Zusammenhang mit der Behandlung von Krankheitszuständen wie Psoriase, Konjunktivitis, Arthritis, Nephritis, und Autoimmunleiden untersucht [Donnelly, et al., Therapeutic Drug Monitoring, Band 11(6), Seiten 696-700 (1989)]. Während ein gewisser Cyclosporinpegel im Blutstrom erhalten bleiben muß, um dem Abstoßen von transplantierten Organen vorzubeugen, können höhere Blutpegel des Wirkstoffes oder die lang andauerde Einnahme zu Nephrotoxizität, Hepatotoxizität, und zu anderen Nebenwirkungen führen. Darüberhinaus schwankt die Verteilung und der Metabolismus von Cyclosporin in breiter Weise zwischen den Individuen, wie er auch in einem einzelnen Individuum im Verlaufe der Therapie schwankt. Demgemäß ist es notwendig, die Konzentration oder den Pegel an Cyclosporin in biologischen Flüssigkeiten wie Voliblut, Plasma und Serum zur geeigneten Patientenbehandlung zu beobachten [Burchart, et al., Drug Intelligence and Clinical Pharmacy, Band 20, Seite 649-652 (1986) und Shaw, et al., Clinical Chemistry, Band 33(7), Seiten 1269-1288 (1987)]. Die Bestimmung von Cyclosporin in Blut, Plasma und Serum wurde jedoch durch die Anwesenheit von Cyclosporinmetaboliten darin verkompliziert [Maurer, et al., Drug Metabolism and Disposition, Band 12(10), Seiten 120-126 (1984)], und die Toxizitäten, immunsuppressiven Aktivitäten und synergistischen Effekte dieser Metaboliten wurden untersucht (Dindzans, et al., Transplantation Proceedings, Band 19(4), Seite 3490-3493 (1987); Yee, et. Al., Transplant. Proc., Band 18, Seiten 774-776 (1986); und Ryffel, et. al., Transplant. Proc., Band 20 (supplement 2), Seiten 575-584 (1988)]. Obwohl die Bestimmung von Cyclosporin unabhängig von seinen Metaboliten wünschenswert ist, besteht ebenfalls ein Bedarf an Assays, die sowohl die Metaboliten als auch den zu Grunde liegenden Wirkstoff bestimmen (Donnelly, et al., supra). Die Metaboliten von Cyclosporin, die aufgefunden wurden, und in denen der Ring noch intakt ist, stammen von den Hydroxylierungen und Demethylierungen der zu Grunde liegenden Verbindung [Maurer, et al., Drug Metabolism and Disposition, Band 12(1), Seiten 120-126 (1984)]. Die Strukturen von Cyclosporin und einiger seiner Hauptmetaboliten weisen die folgende Formel auf:
Die Struktur von Cyclosporin kann alternativ mittels der folgenden Formel dargestellt werden:
in der "MeBmt" einen N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4-methyl- (L)-threoninrest darstellt; in der "MeVal" einen (N)-Methyl-(L)- valinrest darstellt; in der "MeLeu" einen (N)-Methyl-L- leucinrest darstellt; in der "D-Ala" einen D-Alaninrest darstellt; in der "Ala" einen L-Alaninrest darstellt; in der "Val" einen L-Valinrest darstellt; in der "Abu" einen L-(alpha)- Aminobuttersäurerest darstellt; und in der "Sar" einen Sarcosinrest, ebenfalls als N-Methylglycin bekannt, darstellt. Der Ausdruck "Rest" bezeichnet die kondensierte Form der Aminosäure, wie sie in Peptiden gefunden wird, und von der Konfiguration der Alpha-Aminosäure wird angenommen, das sie die L-Konfiguration ist, sofern nicht eine D-Konfiguration spezifisch angegeben ist. Die herkömmliche Nomenklatur für Cyclosporinanaloga ist hierin durch Bezug auf die Cyclosporinstruktur definiert (d. h. auf Cyclosporin A), indem zunächst jene Reste angegeben werden, die in dem Molekül von solchen abweichen, die im Cyclosporin vorhanden sind, und in dem dann der Ausdruck "Cyclosporin" verwendet wird, um die verbleibenden Reste zu kennzeichnen, die mit denjenigen, die im Cyclosporin vorhanden sind, identisch sind. Daher bezeichnet [Thr]² Cyclosporin, das Cyclosporin, in dem der Aminosäurerest in der 2-Position Threonin ist, d. h. Cyclosporin C.
Die Cyclosporinpegel in Vollblut, Plasma und im Serum sind mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) [Lensmeyer, et al., Clinical Chemistry, Band 31(2), Seiten 196- 201 (1985)], mittels Radioimmunoassay (RIA) unter Verwendung von ³H [Donatsch et al., Journal of Immunoassay, Band 2(1), Seiten 19-32 (1981)] oder mit ¹²&sup5;I [U.S. Patent Nr. 4 727 035 und Mahoney, et al., Clinical Chemistrv, Band 31(3), Seiten 459-462 (1985)], mittels Fluoreszenzimmunoassay (U.S. Patent Nr. 4 727 und mittels Fluoreszenz-Polarisations-Immunoassays (FPIA) [Marty, et al., Analytical Letters, Band 22(13&14), Seiten 2717- 2736 (1989) und Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 283 801 gemessen worden]. Obwohl man mit der HPLC die Cyclosporinmetaboliten vom Cyclosporin selbst unterscheiden kann, ist die HPLC trotzdem zeit- und arbeitsaufwendig, und sie verlangt eine ausgedehnte Probenvorbereitung und wenigstens 30 Minuten zur Durchführung des Assays. Auf ähnliche Weise kranken RIA-Assays an den Nachteilen der Verwendung radioaktiven Materials, das eine besondere Lagerung, einen besonderen Umgang, und eine besondere Entsorgung erfordert, und sie benötigen typischerweise eine Mindestzeit von 2 Stunden zur Durchführung.
Obwohl Fluoreszenz-Polaristions-Immunoassays den oben beschriebenen Verfahren überlegen sind, insbesondere, was die Leichtigkeit der Anwendung betrifft, weisen die im Handel erhältlichen Immunoassays, die auf polyklonalen Antikörpern beruhen, einen Mangel an Spezifität für Cyclosporin in Abgrenzung zu seinen Metaboliten auf. In diesem Zusammenhang ist die Spezifität der Immunoassays von dem verwendeten Antikörper abhängig, und von der relativen Affinität des Antikörpers für Cyclosporin, Cyclosporinmetaboliten und die markierte Form von Cyclosporin. Kürzlich sind monoklonale Antikörper, die gegen Cyclosporin in Abgrenzung gegenüber seinen Metaboliten spezifisch sind, beschrieben worden [Quesniaux, et al., Immunology Letters, Band 12(1), Seiten 120-126 (1985), Clinical Chemistry, Band 33(1), Seiten 32-37 (1987), und Molecular Immunology, Band 24(11), Seiten 1159-1168 (1987)], und von RIA- Assays, die diese Antikörper verwenden, ist herausgefunden worden, daß man sie gut mit der HPLC korrelieren kann.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile der HPLC- und RIA-Verfahren, die oben beschrieben sind, indem sie Reagenzien zur Verfügung stellt, die besonders nützlich bei Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays sind, zum Nachweis von cyclosporin oder Cyclosporin und Cyclosporinmetäboliten. Darüberhinaus ist die vorliegende Erfindung ein Fortschritt gegenüber Immunoassays auf Cyclosporin, die zuvor beschrieben worden sind, insofern, als daß sie neue Tracerverbindungen zur Verwendung in Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays zur Verfügung stellt, indem sowohl spezifische als auch nicht spezifische Antikörper zum Nachweis von Cyclosporin oder Cyclosporinmetaboliten in einer Testprobe verwendet werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Cyclosporinderivatverbindungen einschließlich Cyclosporin oder Analoga von Cyclosporin, die mit einer nachweisbaren Gruppe markiert sind zur Verwendung als Tracerverbindung in einem Immunoassay zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Cyclosporin oder Cyclosporin und seinen Metaboliten in einer Testprobe. Die nachweisbare Gruppe ist Fluorescein oder ein Fluoresceinderivat, wobei solche fluoreszente Tracerverbindungen besonders zur Durchführung von Fluoreszenzpolarisations- Immunoassays nützlich sind.
Die Cyclosporinderivate der vorliegenden Erfindung umfassen die obige nachweisbare Gruppe, wenn sie an Cyclosporin oder an Cyclosporinderivate an den Aminosäuren der ersten Position (dem N-Methyl(4R)-4-but-2E-en-1-yl-methyl-L- threoninrest) in Cyclosporin, an der dritten Position (N- methylglycinrest) von Cyclosporin, der achten Position (D- Alaninrest) von Cyclosporin, oder der zehnten Position (N- Methyl-L-leucinrest) von Cyclosporin gekuppelt ist.
Die Cyclosporinderivate der vorliegenden Erfindung weisen die folgenden Strukturen auf:
in der F1 eine fluoreszente Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fluoresceinderivaten besteht, wobei X&sub1; gleich einer verbindenden Gruppe von 1-15 Atomen, ausschließlich Wasserstoff ist; wobei R&sub1; gleich Wasserstoff, OH oder OCOR&sub6; ist; und wobei R&sub6; eine Alkylgruppe von 1-6 Kohlenstoffatomen ist; und Salze dieser; und
wobei R&sub7; gleich Wasserstoff oder eine Acylgruppe von 1-6 Kohlenstoffatomen ist; wobei R9 gleich Wasserstoff oder OR&sub7; ist; wobei X eine verbindende Gruppe von 1-15 Atomen bei Ausschluß von Wasserstoff ist, und wobei F1 eine fluoreszente Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fluoresceinderivaten besteht, und Salze dieser; und
wobei R&sub7;, gleich Wasserstoff oder einer Acylgruppe von 1-6 Kohlenstoffatomen ist; X&sub1; eine verbindende Gruppe von 1-15 Atomen bei Ausschluß von Wasserstoff ist; und wobei F1 eine fluoreszente Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fluoresceinderivaten besteht; und Salze dieser, und
wobei R&sub7; gleich Wasserstoff oder einer Acylgruppe von 1-6 Kohlenstoffatomen ist, wobei X&sub1; eine verbindende Gruppe von 1-15 Atomen bei Ausschluß von Wasserstoff ist; und wobei F1 eine fluorescente Gruppe ist, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fuoresceinderivaten besteht; und Salze dieser.
Die vorliegende Erfindung liefert ebenfalls ein Verfahren und ein Testkit, das solche Cyclosporintracerverbindungen verwendet.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen.

Fig. 1 zeigt den allgemeinen synthetischen Ablauf zur Herstellung von Cyclosporintracerverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 zeigt eine Eichkurve, die zur Bestimmung der Menge an Cyclosporin aus einer Serumprobe in einem Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay verwendet wird, das die Cyclosporintracerverbindungen der vorliegenden Erfindung einsetzt.
Fig. 3 zeigt eine Eichkurve, die zur Bestimmung der Menge an Cyclosporin aus einer Vollblutprobe in einem Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay verwendet wird, das die Cyclosporintracer der vorliegenden Erfindung einsetzt.

Eingehende Beschreibung der Erfindung.

Die Cyclosporintracerverbindungen der vorliegenden Erfindung werden gemäß dem allgemeinen Reaktionsschema hergestellt, daß in Figur 1 beschrieben ist, worin R eine Cyclosporingruppe ist, X eine verbindende Gruppe von zwischen 1 und 6 Atomen, ausgenommen Wasserstoff ist,wobei Y gleich Cl oder OCH ist, wobei Z eine nachweisbare Gruppe ist, und wobei R' und Alkylgruppen oder funktionalisierte Alkylgruppen sind, wie R" sie für gewöhnlich in Carbodiimiden aufgefunden werden.
Zum Beispiel wird gemäß dem Reaktionsschema (i) von Figur 1 Cyclosporin oder ein Derivat dessen, das eine freie Hydroxylgruppe enthält, mit einer Lösung von Phosgen in Benzol oder Toluol behandelt, um einen intermediären Chlorkohlensäureester zu bilden. Alternativ kann eine ähnliche Zwischenstufe gebildet werden, indem Carbonyldiimidazol verwendet wird. Der Chlorkohlensäureester wird dann zum Beispiel mit einer Fluoresceingruppe umgesetzt, die mit einer Aminogruppe substituiert ist, wodurch sich eine Carbamatbindung ausbildet, wie dies eingehender in den Beipielen 3, 4, 5, 13, 14, 16 und 17 wie unten beschrieben ist.
Gemäß dem Reaktionsschema (ii) nach Figur 1 wird Cyclosporin oder ein Derivat dessen, das eine freie Hydroxylgruppe enthält, mit Oxalylchlorid behandelt, wodurch sich ein intermediärer Chloroxalylester ausbildet. Diese Zwischenstufe wird dann zum Beispiel mit einer Fluoresceingruppe behandelt, die mit einer Aminogruppe substituiert ist, wodurch sich eine Amidbildung ausbildet, wie dies eingehender in den Beispielen 1 und 2 unten beschrieben ist.
Gemäß dem Reaktionsschema (iii) nach Figur 1 wird Cyclosporin oder eines seiner Derivate, das eine freie Hydroxylgruppe oder eine freie Aminogruppe enthält mit Bernsteinsäureanhydrid behandelt, wodurch sich der intermediäre Säurehalbester oder das Säurehalbamid ausbildet. Die so gebildete freie Carbonsäure wird dann unter Verwendung von Carbodiimid aktiviert und nachfolgend mit zum Beispiel einer Fluoresceingruppe behandelt, die mit einer Aminogruppe substituiert ist, wobei sich eine Amidbildung ausbildet, und wahlweise kann man über die Zwischenstufe eines aktiven Esters weiter vorgehen, wie über einen aktiven N- Hydroxysuccinimidester, wie dies eingehender in den Beispielen 11, 21 und 22 unten beschrieben ist.
Gemäß dem Reaktionsschema (iv) nach Figur 1 wird Cyclosporin oder ein Derivat dessen, das eine freie Aminogruppe enthält, mit einem aktiven Carboxyfluoresceinester in Gegenwart einer Base behandelt. Das Cyclosporinderivat und die Fluoresceingruppe werden daher über eine Amidbindung gebunden, wie dies eingehender in den Beispielen 11, 12 und 20 unten beschrieben ist.
Gemäß dem Reaktonsschema (v) nach Figur 1 wird Cyclosporin oder ein Derivat dessen, das eine freie Aminogruppe enthält, mit einer Fluoresceingruppe behandelt, die mit einer Dichlortriazinylgruppe substituiert ist, wodurch sich eine Stickstoffkohlenstoffbindung ausbildet, wie dies eingehender in den Beispielen 9 und 10 unten beschrieben ist.
Die nachweisbare Gruppenkomponente der Cyclosporintracerverbindungen der vorliegenen Erfindung kann aus Fluorescein und aus Fluoresceinderivaten gewählt sein, die in der Technik bekannt sind, einschließlich aber nicht beschränkt auf Fluoresceinamin, Carboxyfluorescein, (alpha- Iodacetamidofluorescein, 4'-Aminomethylfluorescein, 4'-N- Alkylaminomethylfluorescein, 5-Aminomethylfluorescein, 6- Aminomethylfluorescein, 2,4-Dichlor-1,3,5-triazin-2-yl- aminofluorescein (DTAF), 4-Chlor-6-methoxy-1,3,5-triazin-2-yl- aminofluorescein und Fluoresceinisothiocyanat. Besonders bevorzugte Derivate sind die Aminomethylfluoresceine, die Carboxyfluoresceine und die Fluoresceinamine.
Fluorescein existiert in Abhängigkeit von der Säurekonzentration (pH) der Umgebung in zwei tautomeren Formen. In der offenen Form (Säureform) ist Fluorescein oder ein Fluoresceinderivat (oder ein Tracer, der ein fluoreszentes Molekül enthält) zur Absorbtion vom blauem Licht und zur Emission von grünem Fluoreszenzlicht nach einer Lebensdauer des angeregten Zustandes von ungefähr vier Nanosekunden fähig. Wenn die offene und die geschlossene Form koexistieren, kann die relative Konzentration der Moleküle in der offenen und der geschlossenen Form leicht über Einstellung des pH-Wertes verändert werden. Allgemein werden die Cyclosporintracerverbindungen der vorliegenden Erfindung in Lösung als biologisch verträgliche Salze, wie Natrium-, Kalium-, Ammoniumsalze und dergleichen hergestellt, was den Verbindungen erlaubt, in der fluoreszenten Form zu existieren. Das besondere anwesende Salz hängt von dem Puffer ab, der zur Einstellung des pH-wertes verwendet wird. Zum Beispiel liegen in der Gegenwart von Natriumphosphatpuffer die Verbindungen der vorliegenden Erfindung allgemein in der offenen Form als Natriumsalz vor. Demgemäß umfaßt der Ausdruck "Fluorescein", wie er hierin verwendet wird, sowohl als individuelle Verbindung als auch als Bestandteil eines Tracers, sowohl die offene als auch die geschlossene tautomere Form, wenn sie für ein besonderes Molekül existieren, außer im Zusammenhang mit der Fluoreszenz, da in diesem Fall die offene Form für das Auftreten der Fluoreszenz notwendig ist. Wie dem Fachmann geläufig ist, werden Fluoreszenzmarkierungen ideal in Abhängigkeit von ihrer Größe ausgewählt, d. h. je kleiner das Molekül ist, desto schneller kann es rotieren und desto effektiver ist es daher als Fluoreszenzpolarisations-Immunoassaytracerverbindung. Solche Verbindungen liefern eine fluoreszente Antwort, wenn sie mit polarisiertem Licht einer geeigneten Wellenlänge angeregt werden und ermöglichen dadurch die Fluoreszenzpolarisationsmessung.
Die Cyclosporintracerverbindungen nach der vorliegenden Erfindung können zur Bestimmung der Anwesenheit oder Menge von Cyclosporin oder von Cyclosporinmetaboliten in verdünnten oder unverdünnten Testproben wie Voliblut, Serum, Plasma, Rückenmarksflüssigkeit und dergleichen verwendet werden, indem herkömmliche Immunoassayverfahren nach dem Stand der Technik eingesetzt werden. Gemäß dem Verfahen der vorliegenden Erfindung wird eine Testprobe, von der angenommen wird, daß sie Cyclosporin oder Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten enthält, mit einer Cyclosporintracerverbindung nach der vorliegenden Erfindung und einem geeigneten Antikörper dagegen zusammengegeben, der gemäß den Verfahren nach dem Stand der Technik hergestellt worden ist. Das in der Testprobe vorhandene Cyclosporin und die Tracerverbindung konkurrieren um eine beschränkte Anzahl von Bindungszentren auf dem Antikörper, was zur Bildung von Cyclosporin-Antikörper- und Tracerverbindung- Antikörperkomplexen führt. Durch Einhalten einen konstanten Konzentration der Tracerverbindung und des Antikörpers ist das Verhältnis der Bildung von Cyclosporin-Antikörperkomplex zu Tracer-Antikörperkomplex der Menge an Cyclosporin in der Testprobe direkt proportional.
Es ist offensichtlich, daß die Tracerverbindung der vorliegenden Erfindung in Immunoassaysystemen eingesetzt werden kann, die Antikörper verwenden, welche Cyclosporin erkennen, oder Antikörper, die Cyclosporin und Metboliten von Cyclosporin erkennen. Monoklonale und polyklonale Antikörper gegen Cyclosporin sind in [Donatsch, et al., supra, Quesniaux, et al., supra und Quesniaux, et al., International Journal of Pedtide and Protein Research, Band 31, Seiten 173-185 (1988); Europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 283 801; Cacalano, et al., Journal of Immunological Methods, Band 118(2), Seiten 257-263 (1989); und in der internationalen Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer WO 86/02080] beschrieben worden. Demgemäß umfaßt die Bezugnahme auf die Bestimmung von Cyclosporin, wie sie hierin beschrieben ist, die spezifische Bestimmung von Cyclosporin, unabhängig von allen Metaboliten, die in der Testprobe vorhanden sein können, oder die Bestimmung von Cyclosporin und Metaboliten desselben, wobei diese Bestimmung natürlich von dem besonderen verwendeten Antikörper in dem Immunoassaysystem abhängt, wie dies oben beschrieben ist.
Wie dem Fachmann geläufig, wird die Spezifität des Antikörpers teilweise durch die Struktur des Immunogens, das zur Züchtung des Antikörpers verwendet wurde, festgelegt. Immunogene für Analyten geringen Molekulargewichts werden gemäß in der Technik bekannten Verfahren hergestellt, indem der Analyt an ein Molekül mit hohem Molekulargewicht als Träger gekuppelt wird, zum Beispiel an ein Protein über eine kovalente Bindung, um eine geeignete Immunantwort in dem Laboratoriumstier sicherzustellen. Die Position der Anbindung an den Träger an dem Analyten ist derart, daß das Erkennungsvermögen des Antikörpers für dieses Zentrum im allgemeinen niedrig ist.
Wenn die Tracerverbindung der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, sollten die Position der Anbindung der nachweisbaren Gruppe an das derivatisierte Cyclosporinmolekül und die Länge und Art des Verbindungsarms, der die beiden verbindet, derart optimiert werden, daß es zu einer Konkurrenz zwischen der Tracerverbindung und dem Cyclosporin aus der Testprobe in Hinsicht auf die Bindung an den Antikörper kommt. In vielen Fällen ist es vorteilhaft, die nachweisbare Gruppe an einer Stelle des Cyclosporinmoleküls anzubinden, die von dem Antikörper nicht gut erkannt wird, so daß der Antikörper auf jeden Fall an die Tracerverbindung bindet. Typischerweise existieren von denjenigen der Immunogenanbindung verschiedene Zentren, die von dem Antikörper schlecht erkannt werden. Demgemäß kann durch Wechseln der Länge des Verbindungsarms und der Art des Verbindungsarms oft die Bindung des Antikörpers an die Tracerverbindung optimiert werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. Darüberhinaus muß, damit sie für die Beobachtung von Cyclosporin nützlich, ist die Konkurrenz zwischen dem Analyten und der Tracerverbindung derart sein, daß die therapeutischen Dosierbereiche voneinander unterschieden werden könnnen.
Die Struktur der Tracerverbindung ist für die Durchführung eines Immunoassays wichtig, und sie sollte zur Verwendung zusammen mit dem in dem besonderen Assay eingesetzten Antikörper optimiert werden. Wenn zum Beispiel der Antikörper die Tracerverbindung mit einer hohen Affinität bindet, kann die Tracerverbindung nicht von dem Antikörper durch den Analyten verdrängt werden, oder die Tracerverbindung verdrängt konkurrierend den gesamten Analyten vom Antikörper, wodurch die Messung des Analyten unmöglich gemacht wird. Wenn im Gegenteil der Antikörper die Tracerverbindung nicht erkennt, kann kein Signal außer dem Hintergrundrauschen nachgewiesen werden, und keine Messung des Analyten kann durchgeführt werden. Auf ähnliche Weise bestimmt die Struktur der Tracerverbindung zu einem gewissen Ausmaß die Kreuzreaktivität des Antikörpers gegen Metaboliten oder gegen Analoga des Analyten, da die relativen Bindungseigenschaften des Antikörpers mit dem Analyten, mit Analoga des Analyten und der Tracerverbindung die Kreuzreaktivität bestimmen.
Die Cyclosporintracerverbindungen der vorliegenden Erfindung werden in Fluoreszenzpolarisations-Immunoassay- Systemen eingesetzt, in denen die Menge von Cyclosporin in der Testprobe mittels Anregen der Mischung mit polarisiertem Licht und Messen der Polarisation der Fluoreszenz bestimmt wird, die von der freien oder ungebundenen Tracerverbindung und dem Tracer-Antikörper-Komplex emittiert wird. Alle Tracerverbindung, die nicht an den Antikörper komplexiert ist, kann in einer kürzeren Zeit, als sie für die Absorption und Reemission von Fluoreszenzlicht benötigt wird, rotieren. Als Ergebnis ist das reemitierte Licht relativ zufällig orientiert, so daß die Fluoreszenzpolarisation jeglicher Tracerverbindung, die nicht an den Antikörper komplexiert ist, gering, fast null ist. Bei der Komplexierung mit einen spezifischen Antikörper nimmt der so ausgebildete Tracer-Antikörper-Komplex die Rotation des Antikörpermoleküls an, die langsamer als diejenige des relativ kleinen Tracerverbindungsmoleküls ist, wodurch die beobachtete Polarisation zunimmt. Wenn eine solche Bestimmung durchgeführt wird, konkurriert das Cyclosporin mit der Tracerverbindung um die Antikörperzentren, wobei die beobachtete Polarisation der Fluoreszenz des Tracer-Antikörper-Komplexes einen Wert zwischen dem Wert der freien Tracerverbindung und dem Wert des Tracer- Antikörper-Komplexes einnimmt. Wenn demgemäß eine Testprobe eine hohe Konzentration an Cyclosporin oder Metaboliten desselben enthält, ist der beobachtete Polarisationswert näher an demjenigen der freien Tracerverbindung, das heißt er ist niedrig. Wenn umgekehrt die Testprobe eine niedrige Konzentration an Cyclosporin oder an Metaboliten desselben enthält, ist der Polarisationswert näher an demjenigen des Tracer-Antikörper-Komplexes, daß heißt, er ist hoch. Durch aufeinanderfolgendes Anregen der Reaktionsmischung eines Immunoassays mit vertikal und dann mit horizontal polarisiertem Licht und durch Analysieren allein der Vertikalkomponente des emittierten Lichtes, kann die Fluoreszenzpolarisation in der Reaktionsmischung genau bestimmt werden. Das genaue Verhältnis zwischen Polarisation und Konzentration an Cyclosporin wird mittels der Messung der Polarisationswerte von Eichlösungen mit bekannten Konzentrationen bestimmt, und die Konzentration von Cyclosporin kann aus einer von diesen hergestellten Eichkurve interpoltert werden. Wenn Fluoreszenzpolarisationsverfahren eingesetzt werden, können die Ergebnisse quantitativ als "Millipolarisationseinheiten", "Bereichsbreite" (in Millipolarisationseinheiten) und "relative Intensität" angegeben werden. Die Messung der Millipolarisationseinheiten zeigt das Maximum der Polarisation an, wenn eine Maximalmenge an Tracerverbindung an den Antikörper in Abwesenheit jeglichen Analyts in der Testprobe gebunden wird. Je höher die Nettomillipolarisationseinheiten sind, um so besser ist die Bindung der Tracerverbindung an den Antikörper. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Nettomillipolarisationswert von wenigsten ungefähr 130 bevorzugt.
Die "Bereichsbreite" ist eine Anzeige für den Unterschied zwischen der Nettopolarisation und der Minimalmenge an Tracerverbindung, die an den Antikörper gebunden ist. Eine größere Bereichsbreite sorgt für eine bessere numerische Analyse der Werte. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine Bereichsbreite von wenigstens ungefähr 15 Millipolarisationseinheiten bevorzugt.
Die "relative Intensität" ist ein Maß für die Stärke des Fluoreszenzsignals gegenüber der Hintergrundfluoreszenz. Daher ergibt eine höhere Intensität eine genauere Messung. Die Intensität wird als die Summe der vertikal polarisierten Intensität plus dem zweifachen der horizontal polarisierten Intensität ermittelt. Die Intensität kann von einem Signal reichen, daß ungefähr dreimal bis ungefähr dreißigmal stärker als das Hintergrundrauschen ist, jeweils in Abhängigkeit von der Konzentration der Tracerverbindung und von anderen Assayvariablen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine Intensität von ungefähr drei bis zwanzig Mal dem Hintergrundrauschen bevorzugt.
Wenn ein Immunoassayverfahren durchgeführt wird, das eine Tracerverbindung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, kann der pH zwischen ungefähr 4,0 und ungefähr 9,0 liegen, vorzugsweise zwischen ungefähr 6,0 und 8,0, wobei ein Bereich zwischen 7,0 und 7,5 am meisten bevorzugt wird. Der pH des Immunoassaysystems, in dem eine solche Tracerverbindung verwendet wird, muß ausreichend sein, um der Fluoresceingruppe des Tracers zu erlauben, in der offenen Form vorzuliegen. Verschiedene Puffer können verwendet werden, um den pH während eines Immunoassayverfahrens einzustellen und zu erhalten, und sie umfassen, ohne auf diese beschränkt zu sein, Borat, Phosphat, Carbonat, Tris , Barbital und dergleichen. Obwohl alle diese Puffer verwendet werden können, werden Tris- und Phosphatpuffer für die Durchführung eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays bevorzugt.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird bei moderaten Temperaturen, vorzugsweise bei einer konstanten Temperatur durchgeführt. Die Temperatur liegt normalerweise zwischen ungefähr 0º C und ungefähr 50º C, vorzugsweise von ungefähr 15º C bis ungefähr 40º C.
Wie nachfolgend eingehender beschrieben wird, ist von den Cyclosporintracerverbindungen der vorliegenden Erfindung herausgefunden worden, daß sie in einem Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays besonders nützlich sind, in dem zwischen ungefähr 10&supmin;&sup6; M bis ungefähr 10&supmin;¹&sup0; M an Cyclosporin in einer Testprobe bestimmt werden können. Wie dem Fachmann geläufig, können höhere Konzentrationen an Cyclosporin mittels Verdünnung der Testprobe bestimmt werden. Obwohl der Konzentrationsbereich des Cyclosporins in einer Testprobe den Konzentrationsbereich der Assayreagenzien, wie der Tracerverbindung und des Antikörpers bestimmt, können die jeweiligen Reagenzkonzentrationen empirisch bestimmt werden, um die Empfindlichkeit des Assays zu optimieren, wie dies von einem Fachmann durchgeführt werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Reagenzien zur Durchführung eines Fluoreszenzpolarisationsimunoassays eine fluoreszente Tracerverbindung, die 4-Aminomethylfluorescein umfaßt, das an die Hydroxylgruppe von MeBmt in der ersten Cyclosporinposition gekuppelt ist, wie sie in Beispiel 4 unten beschrieben ist, und die durch folgende Formel dargestellt wird:
wobei R&sub1; gleich Wasserstoff ist, X&sub1; gleich einer -CH&sub2;NH - Gruppe ist, und
wobei Fl gleich Fluorescein ist, das an seiner 4'-Position gekuppelt ist, und einen monoklonalen Antikörper gegen Cyclosporin, wie er in der Internationalen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer WO 86/02080 beschrieben ist. Die Verwendung einer solchen fluoreszenten Tracerverbindung gemäß dieser Formel wurde als überraschend nützlich zusammen mit solchen monoklonalen Antikörpern erachtet, da dieser Antikörper mit einem Immunogen hergestellt worden war, das über die Aminosäure in der zweiten Cyclosporinposition an ein Trägerproteinmolekül gekuppelt war, wobei die Bindungseigenschaften eines Cyclosporinantikörpers sonst besonders für strukturelle Veränderungen in der 1-Position empfindlich sind. Wie eingehender in den Beispielen hier unten beschrieben ist, wird ebenfalls eine Ausfällungslösung für einen monoklonalen Antikörper gegen Cyclosporin aus Vollblut, die Methanol, Ethylenglykol und Zinksulfat umfaßt, wie sie in der mitanhängigen U.S. Patentanmeldung (entsprechend der EP-A- 0 471 295) mit dem Titel "Protein Precipitation Reagent", beschrieben ist, und die am gleichen Tage mit der vorliegenden angemeldet wurde; und ein löslichkeitssteigerndes Reagenz, das Saponin und ein Detergenz wie Tergitol [Alkyloxy(polyethylenoxypropylenoxyisopropanol] umfaßt, wie es in der U.S. Patenanmeldung entsprechend der EP-A- 0 471 293), mit dem Titel "Solubilization Reagent For Biological Test Samples", angemeldet am 15 August 1990, beschrieben ist, ebenfalls verwendet. Zusätzlich werden vorzugsweise ein Verdünnungspuffer, Eichlösungen und Kontrollösungen verwendet.
Ein bevorzugtes Immunoassayverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein homogenes Immunoassay, in dem die Fluoreszenzpolarisationsablesungen aus einer Lösung vorgenommen werden, die Antikörper-Fluoreszenztracerverbindungens-Komplexe und freie oder ungebundene Fluoreszenztracerverbindungen enthält, und die daher die Abtrennung solcher Spezies nicht erforderlich macht. Ein solches Immunoassayverfahren ist insbesondere gegenüber zum Beispiel einem Radioimmunoassayverfahren vorteilhaft, in dem der gebundene radioaktive Tracer von dem ungebundenen radioaktiven Tracer abgetrennt werden muß, bevor eine Ablesung vorgenommen werden kann.
Gemäß dem bevorzugten Assayverfahren der vorliegenden Erfindung wird die Testprobe, die Cyclosporin oder Cyclosporin und Metaboliten dieses enthält, mit dem Ausfällungsreagenz, das oben beschrieben wurde, zusammengegeben, gemischt und zentrifugiert, wodurch ein Niederschlag von denaturiertem Protein erhalten wird. Es ist bekannt, daß Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten eine besonders hohe Bindungsaffinität für Proteine, insbesondere Lipoproteine aufweisen. Demgemäß wird, um Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten von solchen Proteinen abzutrennen, die andersartig mit der Immunoassaybestimmung von Cyclosporin und seinen Metaboliten, wie hierin zur Verfügung gestellt, interferieren würden, das Ausfällungsreagenz eingesetzt, um eine solche Trennung durchzuführen, wobei die in einer Testprobe vorhandenen Proteine ausgefällt werden, während gleichzeitig zwischen ungefähr 90% und 110% des in der Testprobe vorhandenen Cyclosporin oder des Cyclosporin und der Cyclosporinmetaboliten erhalten wird. Auf ähnliche Weise ist es wünschenswert, wenn die Testprobe zum Beispiel eine Vollbluttestprobe oder eine andere biologische Testprobe ist, die verschiedene zelluläre Bestandteile enthält, jegliches Cyclosporin oder Cyclosporin und Metaboliten desselben, von solchen zellulären Bestandteilen abzutrennen, um alles Cyclosporin und alle Metaboliten dieses für die Bindung an den Antikörper zur Verfügung zu stellen. Demgemäß wird das oben beschriebene, die Löslichkeit steigernde Reagenz verwendet, um alles Cyclosporin oder alles Cyclosporin und alle seine Metaboliten von solchen zellulären Bestandteilen der Testprobe abzulösen.
Sobald die interferierenden Proteine wie oben beschrieben ausgefällt worden sind, und im Falle, daß zum Beispiel eine Vollbluttestprobe verwendet wird, wobei die Probe zuerst mit dem löslichkeitssteigernden Reagenz wie oben beschrieben behandelt wurde, wird der Überstand, der das Cyclosporin oder das Cyclosporin und die Cyclosporinmetaboliten enthält, dann mit dem Antikörper zusammengegeben. Vor der Zugabe der Tracerverbindung und des Verdünnungspuffers wird eine Fluoreszenzhintergrundablesung vorgenommen, wobei nach einer Inkubationsdauer von ungefähr zehn bis ungefähr dreißig Minuten eine Fluoreszenzpolarisationsablesung wie oben beschrieben vorgenommen wird.
Ein Testkit gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt alle notwendigen Reagenzien, die zur Durchführung eines gewünschten Immunoassays gemäß der vorliegenden Erfindung vonnöten sind. Das Testkit wird in einer handelsüblich verpackten Form zur Verfügung gestellt als Kombination eines oder mehrerer Behälter, die die notwendigen Reagenzien enthalten oder als Zusammensetzung oder Mischung, wenn die gegenseitige Verträglichkeit der Reagenzien dies erlaubt. Besonders bevorzugt ist ein Testkit für die Fluoreszenzpolarisations- Immunoassaybestimmung von Cyclosporin oder Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten, das eine geeignete Fluoreszenztracerverbindung nach der vorliegenden Erfindung, ein geeignetes Antikörperreagenz, ein Ausfällungsreagenz und, wenn die Testprobe eine Vollbluttestprobe ist, ein die Löslichkeit steigerndes Reagenz wie oben beschrieben umfaßt. Es ist offensichtlich, daß das Testkit natürlich andere Substanzen, die in der Technik bekannt sind, enthalten kann, und die vom Standpunkt eines kommerziellen Benutzers wünschenswert sind, wie Puffer, Verdünner, Standardlösungen und dergleichen.
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, wobei sie durch diese nicht eingeschränkt werden soll:

BEISPIEL 1: [O-(Chloroxalyl)MeBmt]¹cyclosporin

Cyclosporin (34, 3mg, 0,0285mmol) und Dimethylaminopyridin (30,2mg, 0,247mmol) wurden in Oxalylchlorid (1,0ml) bei 0º C aufgelöst. Der Kolben wurde mit einem Rührer und einem Trockenrohr ausgerüstet, und die Reaktion wurde auf einem Eisbad 3,5 Stunden lang gerührt. Die Reaktion wurde im Vakuum zur Trockne aufkonzentriert. Der Rückstand wurde in 1,0ml trockenem Dimethylformamid aufgenommen, was eine 0,03M Lösung ergab, und bei den nachfolgenden Reaktionen eingesetzt.

BEISPIEL 2: [O-(Fluorescein-5-ylaminooxalyl)MeBmt]¹cyclosporin

Die in Beispiel 1 beschriebene Lösung in DMF (0,33ml, 9,5µmol) wurde mit Fluoresceinamin Isomer I (5,2mg, 15µmol) in einem verschlossenen Kolben, der mit einem Rührer ausgestattet war, vereinigt. Es wurde Pyridin zugesetzt, bis der anscheinende pH (der mittels Tropfen der Lösung auffeuchtes pH-Papier ermittelt worden war) ungefähr 4-5 betrug. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in 0,5ml Methanol aufgenommen und auf eine 0,5mm Silicagelplatte (20 x 20cm) aufgegeben. Die Platte wurde in 15%igem Methanol/Methylenchlorid entwickelt. Die Fluoreszenzbande bei einem Rf von 0,5 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol entfernt und an einer 0,5mm Silicagelplatte (20 x 20cm) erneut gereinigt, wobei zweimal mit 5% Methanol/Methylenchlorid eluiert wurde. Die gewünschte Bande (Rf 0,37) wurde von der Silicagelplatte mit Methanol entfernt.

BEISPIEL 3: [O-(Chlorformyl)MeBmt]¹cyclosporin (Cyclosporinchlorkohlensäureester)

Cyclosporin (24,2mg, 0,020mmol) wurde in einer 25 Gewichts%, ("w/w") Lösung von Phosgen in Benzol (2,0ml) in einem 10ml Rundkolben gelöst, der mit Verschluß und Rührer ausgerüstet war. Die Reaktion wurde 5 Minuten lang gerührt, um das Cyclosporin aufzulösen, und wurde dann ungestört 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen lassen. Die Reaktion wurde im Vakuum eingeengt, und das Produkt wurde als Feststoff bei 0º C bis zu 6 Monate lang aufbewahrt. Für nachfolgende Reaktionen wurde eine 0,02M Lösung in DMF verwendet.

BEISPIEL 4: [O-(Fluorescein-4'- ylmethylaminoformyl)MeBmt]¹cyclosporin

Cyclosporinchlorkohlensäureester, als 0,02M Lösung in DMF wie in Beispiel 3 beschrieben (0,2ml, 4µmol) wurde mit 4'- Aminomethylfluoresceinhydrochlorid (2,0mg, 5µmol) in einem verschlossenem Kolben mit Rührer zusammengegeben. Pyridin wurde zugesetzt, bis der anscheinende pH (mittels feuchtem pH Papier ermittelt) ungefähr 7 betrug. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine 1mm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 15% Methanol/Methylenchlorid entwickelt. Die Produktbande bei Rf 0,55 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol eluiert.

BEISPIEL 5: [O-(Fluorescein-5- ylmethylaminoformyl)MeBmt]¹cyclosporin

Cyclosporinchlorkohlensäureester (5mg des in Beispiel 3 beschriebenen Feststoffes 4,0µmol) wurde in 150µl trockenem DMF in einen verschlossenen Kolben mit Rührer gelöst. 5- Aminomethylfluoresceinhydrochlorid (3, 2mg, 5µmol) und Triethylamin (2,2µl, 16µmol) wurden zugesetzt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2,5 Tage lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine 1mm Silicagelplatte aufgegeben, die mit 15%ig Methanol/Methylenchlorid eluiert wurde. Die Fluroeszenzbande mit einem Pf von 0,64 wurde isoliert und von der Silicagelplatte mit Methanol entfernt.

BEISPIEL 6: [O-(Chloracetyl)MeBmt]¹cyclosporin

Cyclosporin (1,01g, 0,840mmol) wurde in Chloracetylchlorid (3,0mmol) in einem Rundkolben aufgelöst, der mit Rührer und Trockenrohr ausgestattet war. Dimethylaminopyridin (152,4mg, 1,25mmol) wurde zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2,5 Tage lang gerührt. Die Reaktionsiösung wurde in 10ml kalte (0º C) gesättigte NaHCO&sub3; gegossen und gerührt, während festes NaHCO&sub3; portionsweise bis zum Aufhören der Blasenbildung ungefähr 2 Stunden lang zugesetzt wurde. Die Lösung wurde 3 x mit 20ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten etherischen Extrakte wurden mit 1 x 10ml 0,1N HCl, 3 x 10ml Wasser, und 1 x 10ml gesättigter NaCl Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt, was 1,02g eines gelben glasartigen Rückstandes ergab. Dieses Material wurde der Flash-Chromatographie an 75g Silicagel unterzogen, wobei 5%ig Methanol/Methylenchlorid als Laufmittel verwendet wurde. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden vereinigt und eingeengt, was 0,52g der oben genannten Verbindung (48% Ausbeute) ergab. Die Schnell-Atom-Bombardierungs- Massenspektroskopie zeigte ein (M+H) Signal bei 1278.

BEISPIEL 7: [O-(Azidoacetyl)MeBmt]¹cyclosporin

[O-(Chloracetyl)MeBmt]¹cyclosporin (103,3mg, 0,088mmol) und Natriumazid (6,5mg, 0,10mmol) wurden in einem Rundkolben vereinigt, der mit Rührer und Rückflußkühler ausgerüstet war. Dimethylformamid (1,0ml) und 1 Tropfen Wasser, (um das Natriumazid zu lösen) wurden zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 50º C über Nacht gerührt, dann bei 90º C 1,5 Stunden lang. Die Lösung wurde in 20ml Ether aufgenommen und mit 3 x 10ml Wasser und 1 x 5ml gesättigter wässeriger NaCl Lösung gewaschen, über MgSO&sub4; getrocknet, filtriert und im Vakuum eingeengt, was 92,1mg (88%) eines schwach gelben Feststoffes ergab. Dünnschichtchromatographie (TLC) (Silicagel, 5%ig Methanol/Methylenchlorid) zeigte geringe Verunreinigungen. Das IR Spektrum zeigte eine Azidabsorption bei 2100cm-1.

BEISPIEL 8: [O-(Glycyl)MeBmt]¹cyclosporin

[O-(Azidoacetyl)MeBmt]¹cyclosporin (46,1mg, 0,0359mmol) wurde in 0,5ml absolutem Ethanol in einem 100ml Parr- Hydriergefäß gelöst. 5%ig Palladium auf Calciumcarbonat, vergiftet mit Blei (36,lmg, 78%w/w) und Triethylamin (100µl) wurden zugesetzt, und die Reaktion wurde auf dem Parr-Apparat bei 50 psi H&sub2; bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde aus dem Apparat entfernt und durch einen Celitebausch gefiltert. Das Celite wurde mit zusätzlichem Ethanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate und Waschlösungen wurden im Vakuum eingeengt, was 42mg einer Mischung von zwei Komponenten nach TLC (Silicagel, 5% Methanol/Methylenchlorid Rf's 0,3 und 0,18) ergab. Die Mischung wurde an einem Chromatotron (Harrison Research, 810 Moana Court, Palo Alto, CA) getrennt, wobei ein 1mm Rotor verwendet wurde und mit 5%ig Methanol/Methylenchlorid eluiert wurde. Die Fraktionen, die das reine Produkt enthielten, wurden vereinigt, was 23,4mg an O- (Glycyl)cyclosporin 52% Aussbeute ergab. Das FAB MS zeigte (M+H)+ 1259 und (M+Na)+ 1271 für die gewünschte Verbindung.

BEISPIEL 9: [O-(5-Fluorescein-5-ylamino-3- chlortriazinylglycyl)MeBmt]¹cyclosporin

[O-(Gycyl)MeBmt]¹cyclosporin (Beispiel 8, 5mg, 4µmol) wurde in 8ml Methanol in einem geschlossenen Kolben gelöst, der mit einem Rührer ausgestattet war. 3,5- Dichlortriazinylaminofluorescein Isomer I (DTAF-I, 4,0mg, 8µmol) wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3,5 Tage lang gerührt. Die Lösung wurde auf einer 1mm Silicagelplatte aufgegeben, und mit 20%ig Methanol/Methylenchlorid entwickelt. Die Bande mit einem Rf von 0,75 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol eluiert und an eine lmm Silicagelplatte unter Entwicklung mit 5%ig Methanol/Methylenchlorid erneut gereinigt. Die Bande mit einem Rf von 0,3 wurde von dem Silicagel mit Methanol eluiert.

BEISPIEL 10: [O-(5-Fluorescein-6-ylamino-3- chlortriazinylglycyl)MeBmt]¹cyclosporin

Das Verfahren nach Beispiel 9 wurde angewendet, unter Verwendung von Dichlortriazinylaminofluorescein Isomer II (DTAF- II) anstatt DTAF-I. Die Reaktion wurde 1 Tag lang gerührt. Die erste Reinigung wurde mit 20%ig Methanol/Methylenchlorid (Rf 0,70) durchgeführt, und die zweite Reinigung wurde mit 10%ig Methanol/Methylenchlorid (Rf 0,71) durchgeführt.

BEISPIEL 11: [O-(Fluorescein-5-carboxylglycyl)MeBmt]¹cyclosporin

[O-(Glycyl)MeBmt]¹cyclosporin (Beispiel 8, 5mg, 4µmol) und der N-Hydroxysuccinimidester von 5-Carboxyfluorescein (3,0mg, 8µmol) wurden in einem verschlossenem Kolben, der mit einem Rührer ausgestattet war in Dimethylformamid (saul), Triethylamin (3, 3ul, 24µmol), und Dimethylaminopyridin (Sµmol) vereinigt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die flüchtigen Anteile wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine lmm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 20%ig Methanol/Methylenchlorid entwickelt, und die Bande mit einem Rf von 0,64 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol entfernt. Erneute Reinigung durch präparative Dünnschichtchromatographie mit 2 x 10%ig Methanol/Methylenchlorid ergab eine einzelne Bande mit einem Rf von 0,43.

BEISPIEL 12: [O-(Fluorescein-6-carboxylglycyl)MeBmt]¹cyclosporin

Es wurde das Verfahren nach Beispiel 11 angewendet, wobei der N-Hydroxysuccinimidester von 6-Carboxyfluorescein verwendet wurde. Der Rf der gewünschten Bande nach der ersten Entwicklung mit 20%ig Methanol/Metylenchlorid betrug 0,65; nach der zweiten Reinigung mit 2 x 10%ig Methanol/Methylenchlorid betrug der Rf 0,4.

BEISPIEL 13: [O-(N-Fluorescein-4'-ylmethyl acetamidoaminoformyl)MeBmt]¹cyclosporin

Cyclosporinchlorkohlensäureester, als Lösung in DMF (Beispiel 3, 4µmol) wurde mit 4'-N- Glycylaminomethylfluoresceinhydrochlorid (2,4mg, 5,3µmol) in einem geschlossenen Kolben, der mit einem Rührer ausgestattet war, vereinigt. Pyridin (ungefähr 10 Tropfen) wurde zugegeben, bis der anscheinende pH-Wert ungefähr 8 betrug. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 1 Tag lang gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen, und auf eine 1mm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 15%ig Methanol/Methylenchlorid eluiert. Die Bande bei Rf 0,5 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol eluiert. Erneute Reinigung unter Verwendung von 20%ig Methanol/Methylenchlorid ergab eine Bande bei Rf 0,6.

BEISPIEL 14: [O-(Fluorescein-5-ylaminoformyl)MeBmt]¹cyclosporin

Cyclosporinchlorkohlensäureester, als Lösung in DMF (Beispiel 3, 4µmol) wurde mit Fluoresceinamin Isomer 1 (6,2mg, 18µmol) in einem geschlossenen Kolben, der mit einem Rührer ausgestattet war, vereinigt. Es wurde Pyridin hinzugegeben, bis der anscheinende pH-Wert ungefähr 7 betrug. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 1 Tag lang gerührt. Die flüchtigen Anteile wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine 1mm Silicagelplatte aufgebracht. Die Platte wurde mit 15% Methanol/Methylenchlorid eluiert. Die Bande mit einem Rf von 0,57 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol eluiert. Erneute Reinigung unter Verwendung von 10% Methanol/Methylenchlorid ergab eine Bande mit einem Rf von 0,5.

BEISPIEL 15: [O-AcetylThr]²cyclosporin

[Thr]²cyclosporin (Cyclosporin C, erhalten von der Sandoz AG, Basel, Schweiz; 0,30g, 0,25mmol) wurde in trockenem Pyridin (1,0ml) in einem Rundkolben gelöst, der mit Rührer und Trockenrohr ausgerüstet war. Die Lösung wurde auf einem Eisbad auf 0º C gekühlt. Essigsäureanhydrid (28ml, 0,30mmol) wurde zugegeben, und das Eisbad wurde entfernt. Nach 3 stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde mehr Essigsäureanhydrid (28ml, 0,6mmol insgesamt) zugesetzt. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, und zusätzliche 10ml Essigsäureanhydrid (insgesamt 0,7mmol) wurden zugesetzt. Nach weiteren 6 Stunden Rührens bei Raumtemperatur wurde die Reaktion in 25ml Ether aufgenommen und mit 1,2N HCL (25ml) mit Wasser (25ml) und mit gesättigter NaC1 Lösung (25ml) gewaschen. Die organischen Phasen wurden über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde in CH&sub2;Cl&sub2; und Cyclohexan aufgenommen, um Spuren von Essigsäure zu entfernen. Oben genannte Verbindung wurde in 82%iger Ausbeute (259mg) erhalten. Die Struktur des Produktes wurde mittels 200MHz NMR bestätigt, die das Verschwinden eines Tripletts bei Delta 4.15 und das Auftauchen eines Dubletts bei Delta 5.6 und eine Singuletts bei Delta 1.9 offenbarte.

BEISPIEL 16: [O-ChlorcarbonylMeBmt]¹[O-AcetylThr]²cyclosporin

[O-AcetylThr]²cyclosporin (Beispiel 15, 17,3mg, 13,7µmol) wurde in einer 25%(w/w) Lösung von Phosgen in Benzol (1,0ml) in einem Rundkolben gelöst, der mit einem dichten Verschluß und einem Rührer ausgestattet war. Nach 5 minütigem Rühren zur vollständigen Auflösung des Peptids ließ man die Reaktion bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Die flüchtigen Anteile wurden im Vakuum entfernt und ließen einen blaß-weißen Feststoff als Rückstand zurück.

BEISPIEL 17: [O-(Fluorescein-4'-ylmethylaminoformyl)MeBmt]¹[O- acetylThr]²cyclosporin

[O-ChlorcarbonylMeBmt]¹[O-acetylThr]²cyclosporin (Beispiel 16, 4,6µmol) in 0,3ml trockenem Pyridin, wurde mit 4'- Aminomethylfluoresceinhydrochlorid (5,5mg, 13,8µmol) in einem verschlossenen Kolben vereinigt, der mit einem Rührer ausgestattet war. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Tage lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine 1mm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 15%ig Methanol/Methylenchlorid entwickelt. Die Produktbande mit einem Rf von 0,95 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol eluiert. Erneute Reinigung unter Verwendung von 2 x 5%ig Methanol/Methylenchlorid ergab das Produkt als einzelne Bande mit einem Rf von 0,4. Die Bande wurde von der Silicagelplatte mit Methanol entfernt.

BEISPIEL 18: [O-(Fluorescein-4'-ylmethylaminocarbonyl)-(D)- MeSer]³cyclosporin

[(D)-MeSer]³cyclosporin (13,3mg, 10,8µmol) 1,1'- Carbonyldiimidazol (13µmol) und Dimethylaminopyridin (13µmol) wurden in DMF (0,5ml) in einem Rundkolben vereinigt, der mit Rührer und Trockenrohr ausgestattet war. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Zu einem Drittel dieser Reaktionsmischung wurde 4'-Aminomethylfluoresceinhydrochlorid (3,6mg, 9µmol) und 4-Methylmorpholin (2,0µl, 18,2µmol) zugesetzt. Der anscheinende pH auf nassem pH-Papier betrug 8-9. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden weiter gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine 1mm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 15%ig Methanol/Metylenchlorid eluiert. Die Bande mit einem Rf von 0,6 wurde entfernt, die Verbindung wurde von der Platte mit Methanol eluiert, und das Produkt wurde auf die gleiche Art und Weise erneut gereinigt, indem mit 2 x 10%ig Methanol/Methylenchlorid eluiert wurde. Bande mit einem Rf von 0,72 wurde abgetrennt und obengenannte Verbindung wurde durch Entfernen mit Methanol von der Silicagelplatte erhalten.

BEISPIEL 19: [Thr]²[O-(4'-Fluorescein-4'-ylmethylaminocarbonyl)- (D)-MeSer]³cyclosporin

[Thr]²[(D)-MeSer]³cyclosporin (28,6mg, 22,8µmol) 1,1'- Carbonyldiimidazol (3,3mg, 20µmol), und Dimethylaminopyridin (13µmol) wurden in DMF (150µl) in einem Rundkolben vereinigt, der mit Rührer und Trockenrohr ausgerüstet war. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Zu einem Fünftel dieser Reaktionmischung wurde 4'- Aminomethylfluoresceinhydrochlorid (4,9mg, 12,3µmol) und 4- Methylmorpholin (1 Tropfen) zugesetzt. Der anscheinende pH auf feuchtem pH Papier betrug 8-9. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur weitere 24 Stunden lang rühren lassen. Die flüchtigen Anteile wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine lmm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 15%ig Methanol/Methylenchlorid eluiert. Die Bande mit Rf 0,57 wurde erhalten, und oben genannte Verbindung wurde durch Entfernen von der Silicagelplatte mit Methanol isoliert.

BEISPIEL 20: [(Fluorescein-5-ylcarbonyl)amino Ala]&sup8;cyclosporin

[AminoAla]&sup8;cyclosporin (erhalten von der Sandoz AG, Basel, Schweiz; 3,0mg, 2,5µmol) , 5- (Succinimidoxycarbonyl)fluorescein (Research Organics; 3,1mg, 6,5µmol), und 4-Methylmorpholin (2,0ml, 15µmol) wurden in DMF (100ml) in einem verschlossenen Kolben vereinigt, der mit einem Rührer ausgestattet war. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 2,5 Tage lang gerührt. Die flüchtigen Stoffe wurden im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen, und auf eine 0,5mm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 15%ig Methanol/Metylenchlorid eluiert. Die Bande mit einem Rf von 0,45 wurde abgetrennt und oben genannte Verbindung wurde durch Entfernen mit Methanol von der Silicagelplatte isoliert.

BEISPIEL 21: [Epsilon-(N-(Fluorescein-4'- ylmethyl)carboxamidomethylaminosuccinyl)-(D)-Lys]&sup8;cyclosporin

[N-(Succinimidoxysuccinyl)-(D)-Lys]&sup8;cyclosporin (erhalten von der Sandoz AG, Basel, Schweiz; 3,0mg, 2,1 µmol) und 4'- Glycylaminomethylfluorescein (1,8mg, 4,2mol) wurden in DMF (50ml) mit Dimethylaminopyridin (5µmol) und Triethylamin (8,4µmol) in einem verschlossenen Kolben vereinigt, der mit einem Rührer ausgestattet war. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die flüchtigen Anteile wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine 0,5mm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 20%ig Methanol/Metylenchiond eluiert. Die Bande mit einem Rf von 0,70 wurde gesammelt, und oben genannte Verbindung wurde durch Entfernen mit Methanol von der Silicagelplatte isoliert.

BEISPIEL 22: [O-(N-(Fluorescein-4'-ylmethyl)-N- propylaminosuccinyl)MeThr]¹&sup0;cyclosporin

[MeThr]¹&sup0;cyclosporin (erhalten von der Sandoz AG, Basel, Schweiz; 20mg, 17µmol) Bernsteinsäureanhydrid (27,3mg, 0,273mmol) und Dimethylaminopyridin (11,1mg, 0,091mmol) wurden in Pyridin (250ml) in einem geschlossenen Kolben vereinigt, der mit einem Rührer ausgestattet war. Die Reaktion wurde bei 45º C 3 Tage lang gerührt. Die Reaktion wurde in 10ml Ether aufgenommen und mit 10ml 1N HCl gewaschen. Die wässerigen Extrakte wurden mit Sml Ether rückextrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 5ml Wasser und 5ml gesättigter NaCl Lösung gewaschen, dann über wasserfreiem MgSO&sub4; getrocknet, abfiltriert und aufkonzentriert, was 16mg an [(O- Succinyl)MeThr]¹&sup0;cyclosporin ergab, das leicht mit dem Ausgangsmaterial und dem Bis-Succinylderivat verunreinigt war. [(O-Succinyl)MeThr]¹&sup0;cyclosporin (4mg, 3,1µmol) wurde mit Dicyclohexylcarbodiimid (6µmol), N-Hydroxybenzotriazol (6µmol), 4'-Aminomethylfluoreszeinhydrochlorid (12µmol) und Triethylamin (3,1µmol) in DMF (100ml) in einem geschlossenem Kolben vereinigt, der mit einem Rührer ausgestattet war. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die flüchtigen Anteile wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und auf eine 0,5mm Silicagelplatte aufgegeben. Die Platte wurde mit 15%ig Methanol/Metylenchlorid eluiert. Die Bande mit einem Rf von 0,50 wurde gesammelt und auf die gleiche Art und Weise mit 2 x 10%ig Methanol/Methylenchlorid erneut gereinigt. Die Bande mit einem Rf von 0,2 wurde gesammelt, und obige Verbindung wurde durch Entfernen von der Silicagelplatte mit Methanol isoliert.

BEISPIEL 23: [O-(Fluorescein-4'-ylmethylaminoformyl)MeBmt]¹[O- benzoylSer]³cyclosporin

[Ser]³cyclosporin; 20mg, 16µmol) wurde in Pyridin (200ml) in einem geschlossenen Kolben, der mit einem Rührer ausgestattet war, gelöst. Benzoylchlorid (2,1ml, 15µmol) und Dimethylaminopyridin (5mg, 41µmol) wurden zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 45º C 2 Tage lang gerührt. Die flüchtigen Anteile wurden im Vakuum entfernt und die rohe Reaktionsmischung wurde wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben behandelt. Die flüchtigen Anteile wurden im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Methanol aüfgenommen, und auf eine 1mm Silicagelplatte aufgegeben, die mit 1 x 15%ig Methanol/Methylenchlorid entwickelt wurde. Die fluoreszierende Bande bei Rf 0,6 wurde von der Silicagelplatte mit Methanol entfernt, und sie wurde auf die gleiche Art und Weise erneut gereinigt, indem die Platte mit 2 x 10%ig Methanol/Methylenchlorid entwickelt wurde. Die Bande mit einem Rf von 0,3 wurde mit Methanol von der Silicagelplatte entfernt, was oben genannte Verbindung ergab.

BEISPIEL 24: Cyclosporinserum- und Vollblut- Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays.

Reagenzien

Die Reagenzien zur Durchführung eines Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays gemäß der vorliegenden Erfindung wurden wie folgt hergestellt.

(a) Cyclosporin Tracer Reagenz:

Ein 60 nanomolares Cyclosporin Tracer Reagenz wurde hergestellt, das die Cyclosporin Tracer Verbindung gemäß Beispiel 4 in 0,1M Natriumphosphatpufferlösung, pH 7,5 umfaßte, enthaltend 0,01% (Gewicht/Volumen, w/v) Rindergammaglobulin, 0,1%(w/v) Natriumazid, 5,0%(w/v) Ethylenglycol und 0,05%(w/v) Tween 20.

(b) Monoklonale Antikörperformulierung:

Ein monoklonales Antikörperreagenz wurde hergestellt, das monoklonalen Antikörper der Maus (Ascites) gegen Cyclosporin (Sandoz AG, Basel, Schweiz) enthielt, der in einem Citratpuffer verdünnt war, welcher Natriumazid enthielt.

(c) Vorbehandlungslösung:

Eine Vorbehandlungslösung wurde hergestellt, die folgendes umfaßte: 0,1M Trispuffer pH 7,5, 0,1%(w/v) Natriumazid, 0,5%(w/v) Kupfersulafat und 10,0%(w/v)5- Sulfosalicylat.

(d) Verdünnungspuffer:

Ein Verdünnungspuffer wurde hergestellt, der folgendes umfaßte: 0,1M Natriumphosphat, pH 7,5 und 0,1%(w/v) Rindergammaglobulin.

(e) Serumausfällungsreagenz:

Ein Serumausfällungsreagenz wurde hergestellt, das folgendes umfaßte: 10mm Zinksulfat in einem wässerigen Lösungsmittel mit 70%(w/v) Ethylenglykol 25%(w/v) Methanol, und 0,5 Gramm 5-Sulfosalicylsäure.

(f) Vollblutausfällungsreagenz:

Ein Vollblutausfällungsreagenz wurde hergestellt, das folgendes umfaßte: 60mM Zinksulfat, 50%(w/v) Methanol und 30%(w/v) Ethylenglycol.

(g) Löslichkeitssteigerndes Reagenz:

Ein die Auflösung förderndes Reagenz wurde hergestellt, das folgendes umfaßte: 2,0%(w/v) Tergitol, min-Schaum ,2,0%(w/v) Saponin und 0,1%(w/v) Natriumazid.

(h) Eichlösungen:

(1) Die Vollbluteichlösungen für den monoklonalen Antikörper gegen Cyclosporin wurden hergestellt, und umfaßten Cyclosporin und eine künstliche menschliche Vollblutmatrix. Die Eichlösungen wurden in Konzentrationen von 0,0, 100, 250, 500, 1000, und 1500 Nanogramm pro Milliliter hergestellt, wobei Natriumazid als Konservierungsstoff verwendet wurde.
(2) Serumeichlösungen für monoklonalen Antikörper gegen Cyclosporin wurden hergestellt, und sie umfaßten Cyclosporin und eine Serummatix. Die Eichlösungen wurden in einer Konzentration von 0,0, 30, 60, 120, 240 und 400 Nanogramm pro Milliliter hergestellt, wobei Natriumazid als Konservierungsstoff verwendet wurde.

(i) Kontrollösungen

(1) Vollblutkontrollösungen für monoklonalen Antikörper gegen Cyclosporin wurden hergestellt und sie umfaßten Cyclosporin und eine künstliche menschliche Vollblutmatrix. Die Kontrollösungen wurden in Konzentrationen von 150, 400 und 800 Nanogramm pro Milliliter hergestellt, wobei 0,1%ig Natriumazid als Konservierungsstoff verwendet wurde.
(2) Die Serumkontrollösungen für monoklonale Antikörper gegen Cyclosporin wurden hergestellt und sie umfaßten Cyclosporin in einer Serummatrix. Die Kontrollösungen wurden in Konzentrationen von 45, 90 und 320 Nanogramm pro Milliliter hergestellt, wobei Natriumazid als Konservierungsstoff verwendet wurde.

Vorschrift für Cyclosporin Serum FPIA Assay

Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay zur Bestimmung von Cyclosporin in einer Serumprobe unter Verwendung eines Abbott Tdx Therapeutic Drug Monitoring Analyzer wurde wie folgt durchgeführt:
Fünfzig Mikroliter je von Patientenserumproben, die Cyclosporin enthielten, von Kontrollösungen und Eichlösungen wurden in etikettierte Zentrifugengläser pipettiert. Eine Pipette wurde mit dem Serumausfällungsreagenz gefüllt, entlüftet, und 150 Mikroliter wurden in jedes Zentrifugenglas durch Berühren der Wandung des Zentrifugenglases mit dem Ende der Pipettenspitze ausgegeben, während das Reagenz abgefüllt wurde. Die Zentrifugengläser wurden dann verschlossen und auf einem Vortexmixer 10 Sekunden lang vermischt und in einen Zentrifugenkopf so eingesetzt, daß sie gleichmäßig verteilt waren, damit der Zentrifugenkopf austariert war. Die Röhrchen wurden ungefährt 3 Minuten bei 9500g zentrifugiert, bis ein klarer Überstand und ein fester kompakter Niederschlag von denaturiertem Protein erhalten wurden. Nachdem die Zentrifugation abgeschlossen war, wurde jedes Glas geöffnet, und der Überstand wurde in die korrespondierende Probenvertiefung einer Tdx Probenpatrone dekantiert. Da 150 Mikroliter Überstand zur Durchführung des Assays in Übereinstimmung mit der bevorzugten TDx-Assayvorgehensweise notwendig waren, wurde jedes Zentrifugenglas am Rande der korrespondierenden Probenvertiefung der Probenpatrone aufgestoßen, um den gesamten Überstand zu gewinnen.
Der Fluoreszenzpolarisationswert einer jeden Eichlösung, einer jeden Kontrollösung und einer jeden Probe wurden bestimmt, und auf dem Ausgabeband des Abbott TDx Analyzer ausgedruckt. In dem Instrument wurde durch Auftragen der Polarisation P, jeder Eichlösung gegen ihre Konzentration unter Verwendung einer nicht linearen Regressionsanalyse eine Eichkurve erzeugt, und die Konzentration jeder Kontrollösung und jeder Probe wurde aus der gespeicherten Eichkurve (Figur 2) abgelesen, und auf dem Ausgabeband ausgedruckt.
Die Empfindlichkeit des bevorzugten Fluoreszenz- Polarisations-Assays gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt 15,0 Nanogramm/Milliliter an Cyclosporin und Metaboliten. Wenn man dies mit einem handelsüblich erhältlichen Radioimmunoassay unter Verwendung 60 klinischer Proben vergleicht, ergibt eine lineare Regressionsanalyse nach der Methode der kleinsten Quadrate eine Steigung von 0,947 einen Achsenabschnitt von 7,15 und einen Korrelationskoeffizienten von 0,969.
Wenn ein Testkit gemäß der vorliegenden Erfindung zusammen mit dem TDx Analyzer verwendet wird, können die Reagenzien zur Durchführung des Fluoreszenzpolarisationsimmunoassays gemäß der vorliegenden Erfindung in getrennten Gläschen eines TDx Reagenzienpacks vorliegen, wobei die Gläschenkäppen von jedem der Gläschen in dem Reagenzienpack entfernt werden und in die bezeichneten Vertiefungen innerhalb des Reagenzienpacks eingelegt werden können. Demgemäß ist das Assayverfahren von dem Augenblick an völlig automatisiert, sobald man das Reagenzienpack in den TDx Analyzer eingelegt hat.
Wenn ein Assay von Hand durchgeführt werden soll, wird die Testprobe zunächst mit dem Ausfällungsreagenz wie oben beschrieben behandelt, und dann wird sie mit dem Verdünnungspuffer vermischt. Das Antikörperreagenz und die Vorbehandlungslösung werden dann in das Teströhrchen, das die Probe enthält, eingebracht, und eine Ablesung der Hintergrundfluoreszenz wird vorgenommen. Die Tracerverbindung und der Verdünnungspuffer werden zu der Probe hinzugegeben und nach der Inkubation wird eine Fluoreszenzpolarisationsablesung vorgenommen.

Vorschrift für Cyclosporin Vollblut FPIA Assay

Ein Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay zur Bestimmung von Cyclosporin in einer Vollbluttestprobe unter Verwendung eines Abbott TDx Therapeutic Drug Monitoring Analyzer wurde wie folgt durchgeführt:
Einhunderfünfzig Mikroliter je einer Patientenvollblutprobe enthaltend Cyclosporin, an Kontrollösungen und Eichlösungen wurden in etikettierte Zentrifugengläschen pipettiert und 50 Mikroliter des die Auflösung verstärkenden Reagenzes wurden zu jedem der Gläschen zugesetzt. Eine Pipette wurde mit dem Vollblutausfällungsreagenz gefüllt, entlüftet und je 300 Mikroliter wurden in jedes Zentrifugenglas ausgegeben, indem mit dem Ende der Pipettenspitze über die Wandung eines jeden Zentrifugenglases gestrichen wurde, während das Reagenz abgefüllt wurde. Die Zentrifugengläser wurden dann verschlossen und auf einem Vortexmixer zehn Sekunden lang vermischt und in einen Zentrifugenkopf derart eingesetzt, daß die Röhrchen gleichmäßig verteilt waren, so daß der Zentrifugenkopf ausbalanziert war. Die Röhrchen wurden ungefähr 3 Minuten bei 9500g zentrifugiert, bis ein klarer Überstand und ein fester kompakter Niederschlag von denaturiertem Protein erhalten wurden. Nachdem die Zentrifugation vervollständigt war, wurde jedes Röhrchen geöffnet und der Überstand wurde in die korrespondierende Probenvertiefung einer TDx Probenpatrone dekantiert, und der Fluoreszenzpolarisationswert jeder Eichlösung, jeder Kontrollösung und jeder Probe wurde bestimmt und auf dem Ausgabeband des Abbott TDx Analyzers wie oben beschrieben ausgegeben. In dem Gerät wurde durch Auftragen der Polarisation P einer jeden Eichlösung gegen ihre Konzentration unter Verwendung einer nicht linearen Regressions Analyse eine Eichkurve erzeugt, aus der die Konzentration einer jeden Kontrollösung und Probe abgelesen wurde (Figur 3) und auf dem Ausgabeband ausgedruckt.
Es ist offensichlich, das viele Abwandlungen und Veränderungen der vorliegenden Erfindung, wie sie hierin vorgestellt ist, möglich sind, ohne daß vom Grundgedanken und vom Schutzumfang der Erfindung abgewichen wird, und daß demgemäß Einschränkungen nur wirksam sind, sofern sie dem beigefügten Ansprüchen entnommen werden können.

Claims

1. Clydosporinderivat nach folgender Formel:

wobei F1 eine nachweisbare Gruppe aus einem lumineszenten Molekül ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fluoresceinderivaten besteht; wobei X&sub1; eine verbindende Gruppe aus 1-15 Atomen, unter Ausschluß von Wasserstoff, ist; wobei R&sub1; gleich Wasserstoff, OH oder OCOR&sub6; ist; und wobei R eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist; und Salze dieses.

2. Cyclosporinderivat nach folgender Formel:

wobei R&sub7; gleich Wasserstoff oder gleich einer Acylgruppe von 1-6 Kohlenstoffatomen ist; wobei R&sub9; gleich Wasserstoff oder OR&sub7; ist; wobei X&sub1; eine verbindende Gruppe aus 1-15 Atomen, unter Ausschluß von Wasserstoff, ist; und wobei F1 eine nachweisbare Gruppe aus einem lumineszenten Molekül ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fluoresceinderivaten besteht; und Salze dieses.

3. Cyclosporinderivat nach folgender Formel:

wobei R&sub7; gleich Wasserstoff oder gleich einer Acylgruppe von 1-6 Kohlenstoffatomen ist; wobei X&sub1; eine verbindende Gruppe aus 1-15 Atomen, unter Ausschluß von Wasserstoff, ist; und wobei Fl eine nachweisbare Gruppe aus einem lumineszenten Molekül ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fluoresceinderivaten besteht; und Salze dieses.

4. Cyclosporinderivat nach folgender Formel:

5. Cyclosporinderivat nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, wobei die Fluoresceine oder Fluoresceinderivate aus der Gruppe gewählt sind, die aus Aminofluoresceinen, Carboxyfluoresceinen und Fluoresceinaminen besteht.

6. Verfahren zur Bestimmung von Cyclosporin oder von Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten in einer Testprobe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

(a) In-Kontakt-Bringen der Testprobe mit einem Cyclosporinderivat nach der Formel der Ansprüche 1-5 und mit einem Antikörper, der zur Bindung (i) des Cyclosporins oder des Cyclosporins und der Cyclosporinmetaboliten und (ii) des Cyclosporinderivats in der Lage ist, wodurch eine Reaktionslösung mit diesen ausgebildet wird, wobei das Cyclosporinderivat zur Erzeugung einer nachweisbaren Fluoreszenzpolarisationsantwort auf die Anwesenheit des Antikörpers befähigt ist;

(b) Hindurchtretenlassen von planar polarisiertem Licht durch die Reaktionsiösung unter Erhalt einer Fluoreszenzpolarisationsantwort; und

(c) Nachweis der Fluoreszenzpolarisationsantwort aus der Reaktionslösung als Funktion der Menge an Cyclosporin oder an Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten, die in der Testprobe vorhanden ist.

7. Testkit, das für die Bestimmung mittels Fluoreszenzpolarisationsimmunoassay der Menge an Cyclosporin oder Cyclosporin und Cyclosporinmetaboliten in einer biologischen Testprobe nützlich ist, wobei das Testkit folgendes umfaßt:

(a) ein Cyclosporinderivat nach folgender Formel:

wobei Fl eine nachweisbare Gruppe aus einem lumineszenten Molekül ist, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Fluoresceinen und Fluoresceinderivaten besteht; wobei X&sub1; eine verbindende Gruppe aus 1-15 Atomen, unter Ausschluß von Wasserstoff, ist; wobei R&sub1; gleich Wasserstoff, OH oder OCOR&sub6; ist; und wobei R eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen ist; und Salze dieses, und

(b) einen Antikörper, der zur Bindung (i) des Cyclosporins oder des Cyclosporins und der Cyclosporinmetaboliten und (ii) des Cyclosporinderivats in der Laae ist, wobei das Cyclosporinderivat zur Erzeugung einer nachweisbaren Fluoreszenzpolarisationsantwort auf die Anwesenheit des Antikörpers befähigt ist.