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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Reagenzien-Set
zur Analyse einer intrazellulären
Komponente.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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In
den Bereichen Lebensmittelhygiene, Biologie, klinische Tests, Medizin,
Umweltstudien und Studien von ultrareinem Wasser ist es üblich, eine
intrazelluläre
Komponente zu analysieren, die aus in einer Probe enthaltenen Zellen
extrahiert ist.
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Es
gibt verschiedene Gründe
zur Analyse der intrazellulären
Komponente, z.B. zur Bestimmung der Gegenwart/Abwesenheit, des Gehalts
und der Aktivität
der intrazellulären
Komponente, zur Amplifikation von Nucleinsäuren, zur Bestimmung von Mikroorganismen
in einer Probe (z.B. Bestimmung der Gegenwart/Abwesenheit oder des
Typs von Mikroorganismen und Zählen
der Anzahl an lebenden Mikroben).
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Es
ist ein Verfahren zum Extrahieren der intrazellulären Komponente
bekannt, worin zu einer Zellen enthaltenden Probe ein Reagens zum
Extrahieren der intrazellulären
Komponente (im weiteren Verlauf als "Extraktionsreagens" bezeichnet) zugesetzt wird. Beispiele
für das
Extraktionsreagens umfassen diejenigen, die als wirksame Komponente
ein Detergens, Trichloressigsäure,
ein lytisches Enzym, wie z.B. Lysozym, oder Ethanol enthalten.
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Unter
den oben angeführten
Extraktionsreagenzien wird das Detergens enthaltende Reagens häufig verwendet.
Gemäß einem
Verfahren, worin das Extraktionsreagens, das ein Detergens als wirksame
Komponente enthält,
verwendet wird (im weiteren Verlauf als "Detergensverfahren" bezeichnet), umfassen Beispiele für das verwendete
Detergens anionische Detergenzien (z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS),
Kaliumlaurylsulfat, Natriummonolauroylphosphat, Natriumalkylbenzolsulfonat),
kationische Detergenzien (z.B. Benzalkoniumchlorid (BAC), Benzethoniumchlorid
(BZC), Cetylpyridiniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid, Myristildimethylbezylammoniumchlo rid),
ampholytische Detergenzien (z.B. Twittergent-Detergens 3–08, 3–10, 3–12, 3–14, 3–16, Tego)
und nichtionische Detergenzien (z.B. Tween 20, 60, 80, Span 60,
80, Triton X-45, X-100, Polyoxyethylenether, Polyoxyethylenlaurylether).
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Gemäß dem Detergensverfahren
kommt es bei höheren
Detergenskonzentrationen im Extraktionsreagens zu einer höheren Extraktionseffizienz
der intrazellulären
Komponente. Höhere
Detergenskonzentrationen führen
jedoch zu einer verschlechterten Analyseempfindlichkeit und -genauigkeit,
da das Detergens die Analyse der intrazellulären Komponente hemmt.
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Es
ist ein Verfahren zur Messung von Mikroorganismen bekannt, worin
eine intrazelluläre
Komponente, Adenosintriphosphat (ATP), mittels eines Biolumineszenzverfahrens
gemessen wird. Die ATP-Messung mittels Lumineszenzverfahren ist
hinsichtlich einfacher Durchführbarkeit,
kurzer Messzeit und hoher Empfindlichkeit sehr nützlich. Als Biolumineszenzverfahren
wird im Allgemeinen das Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren angewandt.
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Wenn
im Verfahren zur Bestimmung der Anzahl an Zellen mittels Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren
das Detergens zum Extrahieren von ATP verwendet wird, führen höhere Detergenskonzentrationen
zu einer Erhöhung
der Effizienz der ATP-Extraktion, wobei jedoch gleichzeitig die
Analyseempfindlichkeit und -genauigkeit abnimmt, da es zu einer
Hemmung der Lumineszenzreaktion kommt. Es wird angenommen, dass
dies durch die Deaktivierung des Enzyms Luciferase nach Kontakt
mit dem Detergens verursacht wird, was zu einer raschen Abnahme
der Lumineszenz führt.
Andererseits kann eine geringere Detergenskonzentration die Hemmung
der Lumineszenzreaktion verringern, wobei es dabei zu einer unzureichenden
ATP-Extraktionseffizienz kommt.
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Intrazelluläres ATP
kann durch Zugabe eines Extraktionsreagens zu einer Zellen enthaltenden
Probe extrahiert werden. Üblicherweise
wird das Extraktionsreagens so zugesetzt, dass die Endkonzentration
des Detergens circa 0,005% beträgt.
Um eine zufrieden stellende Extraktionsfähigkeit zu erzielen, wird eine
höhere Detergensend konzentration
bevorzugt. Wenn jedoch die Endkonzentration des Detergens hoch ist
(wenn die Endkonzentration beispielsweise 0,01% oder mehr beträgt), kommt
es zu einer starken Verschlechterung der Messempfindlichkeit und
-genauigkeit, da das Detergens die Lumineszenzreaktion wesentlich
hemmt.
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Zudem
hemmt ein Detergens bei der Amplifikation einer Nucleinsäure mittels
PCR-Verfahren die PCR-Reaktion,
wodurch es zu keinem entsprechend gebildeten PCR-Produkt kommt.
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Wenn
die intrazelluläre
Komponente ein Enzym ist, ergibt sich das Problem, dass das extrahierte
Enzym vom Detergens denaturiert oder deaktiviert wird.
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Als
Substanz zur Unterdrückung
der durch das Detergens verursachten Unterbrechung der Analyse (z.B.
einer Biolumineszenzreaktion) ist ein Verfahren bekannt, das Cyclodextrin
oder ein Derivat davon verwendet (japanische nationale Phase der
offengelegten PCT-Anmeldung Nr. 6-504200). Ein weiteres bekanntes
Verfahren zur Messung des intrazellulären ATP umfasst folgende Schritte:
das Kontaktieren einer Zellen enthaltenden Probe mit einem Detergens,
um das intrazelluläre
ATP zu extrahieren; und Messen des ATP mittels Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren,
worin das Lumineszenzreaktionsverfahren angewandt wird, nachdem
die ATP-extrahierte Probe mit Cyclodextrin in Kontakt gebracht worden
ist (japanische Offenlegungsschrift Nr. 7-203995).
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Die
Cyclodextrin einsetzenden Verfahren haben jedoch folgende Probleme:
- (1) Cyclodextrin selbst hemmt die Lumineszenz:
wenn beispielsweise ein α-Cyclodextrin in einer
Lumineszenzreaktionslösung
in einer Konzentration von 1% oder 2% vorliegt, wird eine starke
Hemmung von 25% bzw. 50% verursacht.
- (2) Cyclodextrin ist kostenaufwendig: ein α-Cyclodextrin mit der besten
Neutralisationsfähigkeit
kostet etwa 20.000 Yen pro Kilogramm.
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Wie
oben beschrieben ist es für
ein Verfahren, das ein Extraktionsreagens einsetzt, welches als
wirksame Komponente ein Detergens aufweist, unbedingt erforderlich,
ein Verfahren zu entwickeln, womit die effiziente Extraktion einer
intrazellulären
Komponente gewährleistet
ist, ohne dabei die Analyse der intrazellulären Komponente (im weiteren
Verlauf einfach als "Analyse" bezeichnet) zu hemmen.
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Die
hierin verwendete Bezeichnung "Analyse" bezieht sich auf
einen Schritt zur Analyse einer intrazellulären Komponente, auf eine Vorbehandlung
für die
Analyse und zudem auf jedes beliebige Verfahren nach dem Extrahieren
der intrazellulären
Komponente.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Die
Erfinder vorliegender Erfindung haben herausgefunden, dass verzweigtes
Dextrin die beste Substanz zur Unterdrückung der durch das Reaktionsreagens
verursachten Hemmung der Analyse ist (im weiteren Verlauf als "Neutralisieren des
Extraktionsreagens" oder "Neutralisation" bezeichnet). Die
vorliegende Erfindung wurde auf Grundlage dieses Erkenntnis fertiggestellt.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Analyse einer intrazellulären
Komponente, das folgende Schritte umfasst: (1) Zusetzen eines Extraktionsreagens
zu einer Zellen enthaltenden Probe, um die intrazelluläre Komponente
zu extrahieren; (2) Zusetzen von verzweigtem Dextrin oder einem
verzweigten Derivat davon zu der das Extraktionsreagens enthaltenden
Probe; und (3) Analysieren der extrahierten intrazellulären Komponente.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein wie oben beschriebenes Analyseverfahren,
worin das Extraktionsreagens ein Detergens als wirksame Komponente
aufweist.
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Zudem
betrifft die vorliegende Erfindung ein Reagenzien-Set, das folgende
Bestandteile umfasst: (a) ein Extraktionsreagens (das getrennt von
den anderen Kompo nenten gelagert wird); (b) ein verzweigtes Dextrin
oder ein Derivat davon; und (c) ein Reagens zur Analyse einer intrazellulären Komponente.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung detaillierter beschrieben.
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Verfahren zur Analyse
der intrazellulären
Komponente
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1. Zellen enthaltende
Probe
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Die
Zellen können
von Tieren, Pflanzen, Mikroorganismen (z.B. Hefe, Schimmel, Pilzen,
Bakterien, Aktinomyzeten, einzelligen Algen, Viren und Protozoen)
und dergleichen stammen.
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Die
Probe unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sofern sie die oben
angeführten
Zellen enthält.
Beispiele für
eine solche Probe umfassen Lebensmittel, Getränke, Medikamente, Kosmetika,
Meerwasser, Flusswasser, Industriewasser, Abwasser, Erde, Urin,
Fäkalien,
Blut, Sputum, Eiter und Kulturen der oben angeführten Zellen. Die Probe kann
auch in Form einer Lösung
vorliegen, die durch Suspension jeder beliebigen der oben angeführten Proben
in einem geeigneten Lösungsmittel
(z.B. destilliertes Wasser, physiologische Kochsalzlösung, Phosphatpuffer,
Tris-Puffer, Natriumacetatpuffer)
erhalten wird. Wenn ein Prüfling
Feststoffe enthält,
wird der Prüfling
entweder in einem geeigneten Lösungsmittel
suspendiert oder mittels Mischer oder dergleichen homogenisiert,
um als Lösung
behandelbar zu sein.
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Zudem
kann die oben beschriebene Lösungsprobe
durch einen hydrophilen oder hydrophoben Filter filtriert werden,
um die Zellen einzufangen und den Filter als Probe zu verwenden.
Wenn ein Filter mit gefangenen Zellen als Probe verwendet wird,
kann der hydrophile Filter beispielsweise ein aus hydrophilem Polytetrafluorethylen,
hydrophilem Polyvinylidenfluorid, hydrophilem Polyamid, Acetylcellulose,
Nitrocellulose oder dergleichen bestehender Film oder eine Folie
daraus sein. Der hydrophobe Filter kann beispielsweise aus PVDF
(Polyvinylidenfluorid), PTFE (Polytetrafluorethylen), PE (Polyethylen)
oder dergleichen bestehen.
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2. Extrahieren der intrazellulären Komponente
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird zur Zellen enthaltenden Probe zuerst ein Extraktionsreagens zugesetzt,
um eine intrazelluläre
Komponente zu extrahieren.
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Die
intrazelluläre
Komponente unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, sofern es sich um
eine Substanz oder einen Metaboliten handelt, der in den Zellen
enthalten ist. Die intrazelluläre
Komponente kann beispielsweise eine Nucleinsäure, ein Protein, ein Lipid,
ein Vitamin oder ein Polysaccharid sein. Beispiele für die Nucleinsäure umfassen
DNA, RNA, ATP, ADP, AMP und zyklisches AMP. Als Beispiele für ein Lipid
dienen Enzyme, Hormone und verschiedene Peptide.
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Das
erfindungsgemäße Extraktionsreagens
weist folgende Eigenschaften auf:
- 1) es dient
zum Extrahieren einer intrazellulären Komponente; und
- 2) es kann mittels eines verzweigten Dextrins oder eines Derivats
davon neutralisiert werden.
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Das
für die
vorliegende Erfindung verwendete Extraktionsreagens kann als wirksame
Komponente ein Detergens enthalten. Beispiele für das Detergens umfassen anionische
Detergenzien (z.B. Natriumdodecylsulfat (SDS), Kaliumlaurylsulfat,
Natriummonolauroylphosphat, Natriumalkylbenzolsulfonat), kationische
Detergenzien (z.B. Benzalkoniumchlorid (BAC), Benzethoniumchlorid
(BZC), Cetylpyridiniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid, Myristildimethylbenzylammoniumchlorid),
ampholytische Detergenzien (z.B. Twittergent-Detergens 3–08, 3–10, 3–12, 3–14, 3–16, Tego)
und nichtionische Detergenzien (z.B. Tween 20, 60, 80, Span 60,
80, Triton X-45, X-100,
Polyoxyethylenether, Polyoxyethylenlaurylether).
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Die
Bedingungen zur Zugabe des Extraktionsreagens zur Probe (und zwar
der Typ und die Konzentration der wirksamen Komponente des Extraktionsreagens,
die Reaktionszeit und Temperatur) unterliegen keinen besonderen
Einschränkungen
und können
je nach Typ der zu analysierenden intrazellulären Komponente und den Bedingungen
der Probe sowie der Zelle entsprechend ausgewählt werden.
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3. Zugabe des verzweigten
Dextrins oder eines Derivats davon
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Anschließend wird
ein verzweigtes Dextrin oder ein Derivat davon (im weiteren Verlauf
zusammen als "verzweigtes
Dextrin" bezeichnet)
zur das Extraktionsreagens enthaltenden Probe zugesetzt.
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Das
hierin verwendete verzweigte Dextrin bezieht sich auf ein Dextrin,
das einen verzweigten Abschnitt aufweist, der durch Hydrolysieren
von Stärke
mittels eines enzymatischen (z.B. mittels Amylase) oder chemischen
Verfahrens gebildet wird.
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Die
Typen, die Quelle und das Molekulargewicht des verzweigten Dextrins
unterliegen keinen besonderen Einschränkungen, sofern dieses das
Extraktionsreagens neutralisieren kann. Das verzweigte Dextrin kann
mittels eines enzymatischen Verfahrens unter Einsatz von Amylase
oder eines chemischen Verfahrens mittels Säure aus Stärke hergestellt werden, die
aus Mais, Süßkartoffel,
Tapioka, Kartoffeln oder dergleichen stammt. Die Amylase, die zur
Herstellung des verzweigten Dextrins verwendet werden kann, kann
eine Amylase vom Endotyp sein, die Stärke an einem beliebigen Punkt
abbauen kann, oder eine Exotyp-Amylase sein, die Stärke nacheinander
von einem nichtreduzierten Ende abbaut. Insbesondere kann die Amylase
vom Endotyp eine α-Amylase
und die Amylase vom Exotyp eine exo-1,4-α-D-Glucosidase, eine β-Amylase, eine Exo-Maltotrihydrolase,
eine Exo-Maltotetrahydrolase oder eine Exo-Maltohexahydrolase sein.
Die zur Herstellung des verzweigten Dextrins verwendete Säure kann
eine anorganische Säure,
wie z.B. Salzsäure,
oder eine organische Säure,
wie z.B. Oxalsäure,
sein. Das in der vorliegenden Erfindung verwendete verzweigte Dextrin kann
durch Verwendung der oben angeführten
Amylase und/oder Säure
als Katalysator verwendet werden, während die Stärke bei
einer geeigneten Temperatur, einem geeigneten pH und einer geeigneten
Reaktionszeit behandelt wird. Das durch dieses Verfahren hergestellte
verzweigte Dextrin weist Verunreinigungen, wie z.B. ungelöste Stärke, Glukose
und niedermolekulares Oligo saccharid, auf. Das verwendete verzweigte
Dextrin kann solche Verunreinigungen enthalten. Es kann auch ein
gereinigtes verzweigtes Dextrin verwendet werden, bei dem jegliche
Verunreinigungen entfernt worden sind. Außerdem kann im Handel erhältliches
verzweigtes Dextrin ebenfalls verwendet werden. Im Handel erhältliches
verzweigtes Dextrin, das verwendet werden kann, ist beispielsweise
BLD8, BLD12, BLD16 (Sanmatsu Kogyo Ltd.), SR-7 (Organo Corp.), Pinedex #100
(Matsutani Chemical Industry Co., Ltd.) oder NSD Nr. 510 (Nihon
Shiryo Kogyo K. K.).
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Es
wird angenommen, dass verzweigtes Dextrin eine neutralisierende
Wirkung hat, indem es sich an ein Detergens bindet und damit einen
Komplex bildet. Folglich liegt sich die Menge an verwendetem verzweigtem
Dextrin vorzugsweise in einem molaren Überschuss des Extraktionsreagens
vor, wenn eine stöchiometrische
Menge des zu bildenden Komplexes berücksichtigt wird.
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Das
verzweigte Dextrin kann vor der Verwendung in einer Pufferlösung oder
in Wasser gelöst
werden.
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Die
Zugabebedingungen des verzweigten Dextrins zur Probe, die das Extraktionsreagens
enthält
(und zwar der Typ und die Konzentration des verzweigten Dextrins,
die Reaktionszeit und Temperatur), unterliegen keinen besonderen
Einschränkungen
und können
je nach Typ des zu verwendenden Extraktionsreagens sowie der zu
analysierenden intrazellulären
Komponente und dem Zustand der Probe sowie der Zelle entsprechend
ausgewählt
werden. Wenn die Endkonzentration des Detergens nach der Analyse
etwa 0,01 bis 0,05% beträgt,
wird das verzweigte Dextrin zur Endkonzentration im Allgemeinen
in einer Menge von 0,1 bis 30%, vorzugsweise 1 bis 10%, zugesetzt.
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Die
Zugabe des verzweigten Dextrins ermöglicht die Neutralisation des
Extraktionsreagens, und die Analyse kann mit hoher Empfindlichkeit
und Genauigkeit durchgeführt
werden.
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4. Analyse der extrahierten
intrazellulären
Komponente
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Anschließend wurde
zur Probe ein Reagens zur Analyse der intrazellulären Komponente
zugesetzt, um die intrazelluläre
Komponente zu analysieren.
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Das
zur Analyse der intrazellulären
Komponente verwendete Verfahren und Reagens unterliegt keinen besonderen
Einschränkungen,
sofern das Verfahren und das Reagens zur Analyse für die Bestimmung
der Gegenwart/Abwesenheit, des Gehalts und der Aktivität des intrazellulären Inhalts,
zur Amplifikation von Nucleinsäuren,
zur Bestimmung von Mikroorganismen in einer Probe (z.B. Bestimmung
der Gegenwart/Abwesenheit oder des Typs von Mikroorganismen und
Bestimmen der Anzahl an lebenden Mikroben) angewandt werden kann.
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Ein
solches Verfahren kann beispielsweise ein enzymatisches Verfahren,
insbesondere eine Nucleinsäureamplifikation
mittels PCR-Reaktion unter Verwendung einer DNA-Polymerase, und
die Bestimmung des intrazellulären
ATP unter Verwendung von Luciferase sein.
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Wenn
die intrazelluläre
Komponente ATP ist, wird diese vorzugsweise anhand eines Verfahrens
bestimmt, das auf einer Biolumineszenzreaktion beruht, beispielsweise
ein Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren. Das Biolumineszenzverfahren
ist hinsichtlich einfacher Durchführbarkeit, kurzer Messzeit und
hoher Empfindlichkeit sehr geeignet.
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Gemäß dem Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahren
wird das Analysereagens für
die Lumineszenz zur Probe zugesetzt, und der Lumineszenzwert davon
wird gemessen. Das hierbei verwendbare Analysereagens ist beispielsweise
ein Luciferin, Luciferase und Magnesium enthaltendes Biolumineszenzreagens
(im weiteren Verlauf als "Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreagens" bezeichnet).
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Der
Lumineszenzwert wird mit einem Luminometer, wie z.B. dem Lumitester
K-100 (Kikkoman Corp.), dem (weiterentwickelten) Lumineszenzmessgerät BLR-201
(Aloka) und Lumat LB9501 (Berthold), gemessen. Wenn als Probe ein
Filter mit gefan genen Zellen verwendet wird, kann die Anzahl der
Zellen durch Abbildung der Lumineszenzstellen auf dem Filter unter
Einsatz eines Biolumineszenz-Bildanalysesystemgeräts, wie
z.B. ARGUS-50/CL [mit zugespitzten Fasern, hergestellt von Hamamatsu
Photonics K. K.], ermittelt werden.
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Der
Einsatz des Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreaktionsverfahrens
ermöglicht
die Bestimmung einer Menge von intrazellulärem ATP, die Bestimmung einer
Anzahl von Zellen in der Probe und dergleichen.
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Das
in der Erfindung verwendete Luciferin und die Luciferase können beispielsweise
aus Insekten (wie z.B. aus Luciola cruciata, Luciola lateralis,
dem amerikanischen Glühwürmchen,
dem russischen Glühwürmchen,
Pynophorus plagiophthalamus und Arachnocampa luminosa) stammen.
Die Luciferase kann eine natürliche,
aus einem lumineszierenden Gewebe der oben angeführten Organismen gereinigte
Luciferase, eine durch Gentechnik hergestellte rekombinante Luciferase
und eine mutierte Luciferase sein, die durch Einführung einer
Mutation, wie z.B. einer Addition, Deletion und Substitution in
einer oder mehreren Aminosäuren
der Aminosäuresequenz
der natürlichen
Luciferase, erhalten wird.
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Als
Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreagens kann auch ein im Handel
erhältliches
Reagenzien-Set, wie z.B. "Lucifer
LU" (Kikkoman Corp.),
eingesetzt werden.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung unterliegt die Reihenfolge der Zugabe des verzweigten
Dextrins zur Probe und der Analyse keinen besonderen Einschränkungen.
Deshalb kann die Analyse nach der Zugabe des verzweigten Dextrins
erfolgen, oder beide Schritte können
gleichzeitig durchgeführt
werden, um den Vorgang zu vereinfachen. Wenn beide Schritte gleichzeitig
ausgeführt
werden, wird ein Reagensgemisch hergestellt, indem das verzweigte
Dextrin zum Analysereagens zugesetzt wird und dies der Probe zugesetzt
wird, die das Extraktionsreagens enthält.
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Reagenzien-Set
der vorliegenden Erfindung
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Ein
Reagenzien-Set der vorliegenden Erfindung umfasst folgende Bestandteile:
- (a) ein Extraktionsreagens (das getrennt von
den anderen Komponenten gelagert wird);
- (b) ein verzweigtes Dextrin oder ein Derivat davon; und
- (c) ein Reagens zur Analyse einer intrazellulären Komponente.
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Von
den oben angeführten
Bestandteilen wird der Bestandteil (a) getrennt von den anderen
Bestandteilen gelagert, wobei die Bestandteile (b) und (c) entweder
voneinander getrennt oder zusammengemischt sein können. Der
Einfachheit halber wird jeder der Bestandteile vorzugsweise in einer
geeigneten Pufferlösung gelöst. Zudem
kann jedem der Bestandteile eine Substanz zugesetzt sein, die zur
pH-Einstellung oder Verbesserung der Haltbarkeit des Reagens führt. Beispiele
für solche
Substanzen umfassen EDTA2Na, Dithiothreit, Ammoniumsulfat, Saccharose,
2-Mercaptoethanol,
HEPES, Tricin und Tris. Diese Substanzen können dem Reagenzien-Set getrennt
von den oben angeführten
Bestandteilen (a) bis (c) zugesetzt werden.
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Der
Bestandteil (c) kann entsprechend der zu analysierenden intrazellulären Komponente
ausgewählt werden.
Wenn ein intrazelluläres
ATP analysiert werden soll, kann der Bestandteil (c) beispielsweise
ein Biolumineszenzreagens (insbesondere Luciferin-Luciferase-Lumineszenzreagens)
sein. Ein im Handel erhältliches
Reagenzien-Set, z.B. Lucifer LU (Kikkoman Corp.), kann ebenfalls
als Lumineszenz-Reagens
verwendet werden.
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Wenn
das erfindungsgemäße Reagenzien-Set
verwendet wird, kann jede der Komponenten zur Probe gemäß dem oben
beschriebenen Verfahren zugesetzt werden, um die intrazelluläre Komponente
zu analysieren.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 stellt
die Fähigkeiten
der verschiedenen verzweigten Dextrine zur Neutralisation der Lumineszenzhemmung
dar.
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2 stellt
die Fähigkeiten
der verschiedenen verzweigten Dextrine zur Neutralisation der Lumineszenzhemmung
dar.
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3 stellt
die Fähigkeiten
verzweigter Dextrine zur Neutralisation von BAC dar.
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4 stellt
die Fähigkeiten
verzweigter Dextrine zur Neutralisation von BZC dar.
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5 stellt
die Fähigkeiten
verzweigter Dextrine zur Neutralisation von Twittergent 3–16 dar.
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6 stellt
die Fähigkeiten
verzweigter Dextrine zur Neutralisation von SDS dar.
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7 stellt
die Fähigkeiten
verzweigter Dextrine zur Neutralisation von Triton X-100 dar.
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BESTE ARTEN
DER DURCHFÜHRUNG
DER ERFINDUNG
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen spezifischer
beschrieben.
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Beispiel 1
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Neutralisation von Detergenzien
mit verschiedenen verzweigten Dextrinen
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1. Verzweigte Dextrine
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Es
wurden verschiedene verzweigte Dextrine, die aus verschiedenen Quellen
stammten, auf deren Fähigkeit
zur Neutralisation von Detergenzien untersucht. Es wurden, wie in
Tabelle 1 angeführt,
zwölf Arten verzweigter
Dextrine verwendet.
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Während BLD
8 ein im Handel erhältliches
Produkt von Sanmatsu Kogyo Ltd. ist, wurden andere Proben durch
Behandeln verschiedener in der Tabelle angeführter Stärkematerialien mit Amylase
für diesen
Test hergestellt. In der Tabelle bezieht sich DE auf einen Index,
der die Abbaugeschwindigkeit von Stärke darstellt, worin ein geringerer
DE eine höhere
Viskosität
bedeutet. Die verschiedenen verzweigten Dextrine wurden verwendet,
nachdem diese bei einer Konzentration von 10% (Gew./Vol.) in 25
mM Tricin (pH 7,7%) aufgelöst
worden waren. Zudem wurde α-Cyclodextrin
(αCD, Mercian
Corp.) als Vergleichsneutralisationsmittel verwendet.
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2. Detergens
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Als
Detergens wurde Benzalkoniumchlorid (BAC, Osbanlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe) in einer
Konzentration von 0,1% verwendet, das in 25 mM Tricin (pH 7,75)
gelöst
war.
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3. Bestimmung des ATP
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Zu
einer 100-μl-ATP-Lösung (2 × 10–8 M)
wurden 50 μl
0,1%iges BAC und zudem 50 μl
Lösung
von verzweigtem Dextrin zugesetzt. Danach wurden 50 μl eines Lumineszenzreagens, "Lucifer LU" (Kikkoman Corp.),
zugesetzt, um den erzeugten Lumineszenzwert in 1-Sekunden-Intervallen
1 Minute lang unter Verwendung von Lumat LB-9501 (Berthold) zu messen.
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4. Ergebnisse
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Die 1 und 2 zeigen
die Ergebnisse der Bestimmung. "Ohne
BAC" stellt jenen
Fall dar, bei dem statt 0,1% BAC 25 mM Tricin (pH 7,75) verwendet
wurden. "Nur BAC" stellt jenen Fall
dar, bei dem statt einer Lösung
von verzweigtem Dextrin 25 mM Tricin (pH 7,75) verwendet wurden.
In den Figuren stellt die vertikale Linie den Lumineszenzwert und
die horizontale Linie die verstrichene Zeit nach der Zugabe des
Biolumineszenzreagens dar.
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Im
Fall von "nur BAC" wurde die Luciferase,
die im Biolumineszenzreagens enthalten war, mittels BAC deaktiviert.
Dies führte
zu einer Abnahme des anfänglichen
Lumineszenzwertes, und der Lumineszenzwert wurde, verglichen mit
den Ergebnissen im Falle ohne BAC, stark abgeschwächt. Wenn αCD, das als
Substanz zur Neutralisation eines Detergens bekannt ist, zugesetzt
wurde, kam es zu einer Reduktion des anfänglichen Lumineszenzwertes,
während
die Abschwächung
des Lumineszenzwertes stark verringert wurde. Ähnlich wie αCD verringerten alle verschiedenen
verzweigten Dextrine die Abschwächung
der Lumineszenz. Insbesondere zeigten die Proben A, D, F, G, I und
BLD8 eine starke Verringerungswirkung.
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Folglich
hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, ähnlich wie αCD, die von
einem Detergens verursachte Deaktivierung von Luciferase neutralisieren
und die Verringerung der Lumineszenz hemmen.
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Beispiel 2
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Hemmung der durch unterschiedliche
Neutralisationsmittel selbst verursachten Biolumineszenz
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Cyclodextrin,
das als Neutralisationsmittel für
ein Detergens bekannt ist, weist an sich eine Lumineszenzhemmung
auf und verursacht eine Verschlechterung der Empfindlichkeit und
Genauigkeit. Folglich wurden verzweigte Dextrine auf Biolumineszenzhemmung
untersucht.
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1. Verwendete verzweigte
Dextrine
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Als
verzweigte Dextrine wurden BLD8, BLD12 und BLD16 (alle von Sanmatsu
Kogyo Ltd. hergestellt) sowie α-Cyclodextrin
als Vergleich (αCD,
Mercian Corp.) verwendet.
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2. Bestimmung des ATP
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Zu
einer 100-μl-ATP-Lösung (2 × 10–8 M)
wurden 50 μl
25 mM Tricin (pH 7,75) und zudem 50 μl von 5- und 10%igen Neutralisationslösungen (verzweigte
Dextrine und αCD-Lösung) zugesetzt.
Danach wurden 50 μl
eines Lumineszenzreagens, "Lucifer
LU" (Kikkoman Corp.),
zugesetzt, um den erzeugten Lumineszenzwert unter den Bedingungen
von 5 Sekunden Latenz und 3 Sekunden Integrationszeit unter Verwendung
von Lumat LB-9501 (Berthold) zu messen.
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Zusammen
mit den ermittelten Werten ist auch der relative Prozentsatz des
Lumineszenzwertes, der für
das jeweilige Neutralisationsmittel erhalten wird, in Tabelle 2
angeführt,
wobei der ohne Neutralisationsmittel erhaltene Lumineszenzwert (und
zwar wenn statt der Neutralisationslösung 25 mM Tricin (pH 7,75)
verwendet wurde) 100% beträgt.
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3. Ergebnisse
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αCD wies eine
starke Lumineszenzhemmung von etwa 25 bzw. 50% nach der Verwendung
einer 5%igen Lösung
(1%ige Konzentration bei der Lumineszenzreaktion) und einer 10%igen
Lösung
(2%ige Konzentration bei der Lumineszenzreaktion) auf. Andererseits
zeigten die drei verzweigten Dextrine eine geringe Lumineszenzhemmung,
und deren Hemmung betrug nur wenige Prozent, sogar bei der Verwendung der 10%igen
Lösung.
Folglich hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, verglichen
mit αCD,
das auch als Neutralisationsmittel verwendet werden kann, eine geringe
Lumineszenzhemmung induzieren und somit hinsichtlich Empfindlichkeit
und Genauigkeit der Bestimmung von Vorteil sind.
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Beispiel 3
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Neutralisation
verschiedener Detergenzien mit verzweigten Dextrinen
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Es
wurden verzweigte Dextrine auf ihre Fähigkeit, verschiedene Detergenzien
zu neutralisieren, untersucht.
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1. Verwendete verzweigte
Dextrine
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Als
verzweigte Dextrine wurden BLD8, BLD12 und BLD16 verwendet. Als
Vergleich wurde auch α-Cyclodextrin
(αCD, Mercian
Corp.) verwendet.
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Jedes
der verzweigten Dextrine und αCD
wurde in 25 mM Tricin (pH 7,75) bei einer Konzentration von 10%
(Gew./Vol.) aufgelöst,
um als Neutralisationslösung
verwendet zu werden.
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2. Verwendete Detergenzien
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Als
Detergenzien wurden Benzalkoniumchlorid (BAC, Osbanlösung gemäß der japanischen
Pharmakopöe),
Benzethoniumchlorid (BZC, Hyaminlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe), Twittergent
3–16 (Calbiochem),
Natriumdodecylsulfat (SDS, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
und Triton X-100 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) verwendet.
Diese Detergenzien wurden jeweils in 25 mM Tricin (pH 7,75) bei
einer Konzentration von 0,1 oder 0,01% gelöst, um als Detergenslösungen verwendet
zu werden.
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3. Bestimmung des ATP
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Wie
in Beispiel 1 beschrieben, wurden zu einer 100-μl-ATP-Lösung (2 × 10–8 M)
50 μl Detergens
zu zudem 50 μl
Neutralisationsmittel zugesetzt. Danach wurden 50 μl ei nes Lumineszenzreagens, "Lucifer LU" (Kikkoman Corp.),
zugesetzt, um den erzeugten Lumineszenzwert in 1-Sekunden-Intervallen
30 Sekunden lang unter Verwendung von Lumat LB-9501 (Berthold) zu
messen.
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4. Ergebnisse
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(1) 3 zeigt
die Ergebnisse für
den Fall, bei dem ein 0,1%iges Benzalkoniumchlorid (BAC) als Detergens
verwendet wurde. In dem Fall, bei dem nur BAC verwendet wurde, war
der anfängliche
Lumineszenzwert etwas geringer als jener in dem Fall ohne BAC, wodurch
es zu einer raschen Abschwächung
des Lumineszenzwertes kam. Dies wird auf die durch BAC verursachte
Deaktivierung der Luciferase im Lumineszenzreagens zurückgeführt.
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Wenn αCD als Neutralisationsmittel
verwendet wurde, kam es im Laufe der Zeit zu einer Reduzierung der
Abschwächung
des Lumineszenzwertes. Ähnlich
wie αCD
reduzierten verzweigte Dextrine auch die Abschwächung der Lumineszenz im Laufe
der Zeit. Folglich hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, ähnlich wie αCD, eine
Neutralisationswirkung für
BAC aufweisen.
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Jedes
der verzweigten Dextrine bewirkte einen höheren anfänglichen Lumineszenzwert als
der mit αCD
erhaltene, und der im Laufe der Zeit erhaltene Lumineszenzwert war
immer höher
als der mit αCD
erhaltene.
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Für BAC wurden
höhere
Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel
verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine
bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
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(2) 4 zeigt
die Ergebnisse für
den Fall, bei dem 0,1%iges Benzethoniumchlorid (BZC) als Detergens
verwendet wurde.
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Im
Lumineszenzverlauf, bei dem nur BZC verwendet wurde, war der anfängliche
Lumineszenzwert geringer als der ohne BZC erhaltene, und es kam
zu einer raschen Abschwächung
der Lumineszenz. Wenn αCD als
Neutralisationsmittel verwendet wurde, wurde die Abschwächung des
Lumineszenzwertes im Laufe der Zeit reduziert. Auf ähnliche
Weise reduzierten verzweigte Dextrine auch die Abschwächung der
Lumineszenz im Laufe der Zeit. Folglich hat sich herausgestellt,
dass verzweigte Dextrine, ähnlich
wie αCD,
eine Neutralisationswirkung für
BZC aufweisen.
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Die
Verwendung jedes beliebigen verzweigten Dextrins führte zu
einem höheren
anfänglichen
Lumineszenzwert als einem mit αCD
erhaltenen, und der im Laufe der Zeit erhaltene Lumineszenzwert
war immer höher
als der mit αCD
erhaltene.
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Für BZC wurden
höhere
Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel
verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine
bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
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(3) 5 zeigt
die Ergebnisse für
den Fall, bei dem ein 0,1%iges Twittergent 3–16 als Detergens verwendet
wurde. Im Lumineszenzverlauf, bei dem nur Twittergent 3–16 verwendet
wurde, betrug der anfängliche Lumineszenzwert
ein Drittel des ohne Twittergent 3–16 erhaltenen Lumineszenzwertes,
und es kam zu einer raschen Abschwächung der Lumineszenz. Wenn αCD als Neutralisationsmittel
verwendet wurde, kam es sowohl beim anfänglichen Lumineszenzwert als
auch bei der Abschwächung
des Lumineszenzwertes zu einer großen Verbesserung. Wenn verzweigte
Dextrine verwendet wurden, kam es darüber hinaus, verglichen mit αCD, zu einer
Verbesserung des anfänglichen
Lumineszenzwertes und der Abschwächung
des Lumineszenzwertes. Insbesondere wiesen BLD8 und BLD12 bessere
Neutralisationsfähigkeiten
auf.
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Für Twittergent
3–16 wurden
höhere
Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel
verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine
bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
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(4) 6 zeigt
die Ergebnisse für
den Fall, bei dem ein 0,01%iges Natriumdodecylsulfat (SDS) als Detergens
verwendet wurde. Im Lumineszenzverlauf, bei dem nur SDS verwendet
wurde, lag der Lumineszenzwert signifikant unter demjenigen, der
ohne SDS erhalten wurde. Dies war auf die durch SDS verursachte Hemmung
der Luciferase im Biolumineszenzreagens zurückzuführen, was den Gesamtlumineszenzwert
reduzierte. Wenn αCD
als Neutralisationsmittel verwendet wurde, war der Lumineszenzwert
höher als
derjenige, der ohne Neutralisationsmittel erhalten wurde. Wenn verzweigte
Dextrine verwendet wurden, kam es, ähnlich wie mit αCD, zu einem
hohen Lumineszenzwert.
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Folglich
hat sich herausgestellt, dass verzweigte Dextrine, ähnlich wie αCD, eine
Neutralisationswirkung für
SDS aufweisen. Es wurden, insbesondere wenn BLD8 und BLD12 verwendet
wurden, höhere
Lumineszenzwerte erhalten, und diese verzweigten Dextrine wiesen
höhere
Neutralisationsfähigkeiten
auf als αCD.
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(5) 7 zeigt
die Ergebnisse für
den Fall, bei dem ein 0,01%iges Triton X-100 als Detergens verwendet
wurde. Hinsichtlich des Lumineszenzübergangs im Fall, bei dem nur
Triton X-100 verwendet wurde, war der Lumineszenzwert, verglichen
mit dem ohne Triton X-100 erhaltenen Wert, etwas geringer, und das
Triton X-100 hatte keine nennenswerten negativen Auswirkungen auf
die Lumineszenzreaktion. Wenn αCD
als Neutralisationsmittel verwendet wurde, war der Lumineszenzwert
aufgrund der dem αCD
inhärenten
Lumineszenzhemmung gering. Wenn verzweigte Dextrine verwendet wurden,
kam es, verglichen mit den ohne Triton X-100 erhaltenen Werten,
andererseits zu gleichen oder leicht geringeren Lumineszenzwerten.
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Für Triton
X-100 wurden höhere
Lumineszenzwerte erhalten, wenn die verzweigten Dextrine als Neutralisationsmittel
verwendet wurden, was bewies, dass die verzweigten Dextrine über eine
bessere Neutralisationswirkung als αCD verfügten.
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Beispiel 4
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Bestimmung
des intrazellulären
ATP
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Im
Folgenden wird die Bestimmung von intrazellulärem Mikroorganismus-ATP gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
im Vergleich zu Bestimmungen gemäß den drei
herkömmlichen
Verfahren beschrieben.
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Gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 1 wurde das intrazelluläre ATP mittels eines TCA-Extraktionsverfahrens
unter Verwendung von Trichloressigsäure (TCA) extrahiert, um die
ATP-Menge durch eine Luciferin-Luciferase-Reaktion zu bestimmen.
Das TCA-Extraktionsverfahren ist hinsichtlich der ATP-Extraktionseffizienz
sehr vorteilhaft. Da TCA jedoch die Luciferin-Luciferase-Reaktion
stark hemmt, muss die Reaktionslösung
stark verdünnt
werden. Folglich umfasst dieses Verfahren komplizierte Verfahren
und ist auch hinsichtlich der Bestimmungsempfindlichkeit problematisch,
da diese aufgrund der Verdünnung
verschlechtert werden kann.
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Gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 2 wurde ATP mit einem Detergens extrahiert, um eine Menge des
extrahierten ATP durch eine Luciferin-Luciferase-Reaktion ohne Neutralisationsmittel
zu bestimmen.
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Gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 3 wurde ATP mit einem Detergens extrahiert, die Wirkung
des Detergens wurde mit Cyclodextrin neutralisiert; und eine Menge
des extrahierten ATP wurde durch eine Luciferin-Luciferase-Reaktion
bestimmt (japanischen nationale Phase der offengelegten PCT-Anmeldung
Nr. 6-504200, offengelegte japanische Veröffentlichung Nr. 7-203995).
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1. Verwendetes verzweigtes
Dextrin
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Als
verzweigtes Dextrine wurde BLD8 verwendet. Als Vergleich wurde α-Cyclodextrin
(αCD, Mercian Corp.)
verwendet.
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2. Verwendete Detergenzien
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Als
Detergenzien wurden Benzalkoniumchlorid (BAC, Osbanlösung gemäß der japanischen
Pharmakopöe)
und Benzethoniumchlorid (BZC, Hyaminlösung gemäß der japanischen Pharmakopöe) verwendet. Diese
Detergenzien wurden jeweils in 25 mM Tricin (pH 7,75) bei einer
Konzentration von 0,1% gelöst,
um als Detergenslösungen
verwendet zu werden.
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3. Verwendete Mikroorganismen
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Als
Mikroorganismen wurden 3 Typen von Mikroben verwendet, Escherichia
coli (ATCC 25922), Staphylococcus aureus (ATCC 25923) und Bacillus
subtilis (ATCC 9372). Diese Mikroorganismen wurden über Nacht
in einer Nährlösung (Eiken
Chemical Co., Ltd.) bei 35°C
kultiviert, und die Kulturlösungen
wurden als Bestimmungsproben verwendet.
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Gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 1 müssen
die Proben 100fach verdünnt
sein, bevor die Menge des extrahierten ATP bestimmt wird, um die
Hemmung der Lumineszenz durch TCA zu verhindern. Folglich wurde
im herkömmlichen
Verfahren 1 eine rohe Übernacht-Kulturlösung als
Probe verwendet, und 100fach verdünnte Lösungen davon wurden als Proben
in anderen Bestimmungsverfahren verwendet.
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4. Bestimmung des intrazellulären ATP
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(1) Vorliegende Erfindung
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Zu
100 μl einer
Probe wurden 50 μl
einer Detergenslösung
zugesetzt und 20 Sekunden lang stehen gelassen, um das ATP aus dem
Mikroorganismus zu extrahieren. Dann wurden 50 μl einer 10%igen Lösung aus
verzweigtem Dextrin und zudem 50 μl
eines Biolumineszenzreagens zugesetzt und die Lumineszenz unmittelbar
danach gemessen.
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(2) Herkömmliches
Verfahren 1
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Zu
100 μl einer
Probe wurde eine äquivalente
Menge einer 5%igen Trichloressigsäurelösung zugesetzt und 1 Minute
lang stehen gelassen, um das ATP aus dem Mikro organismus zu extrahieren.
Zur extrahierten Lösung
wurden 9,8 ml 25 mM Tricin (pH 7,75) zugesetzt und gut gerührt. 100 μl dieser
Probe wurden in eine Lumineszenzmessröhre platziert, wozu 100 μl 25 mM Tricin
(pH 7,75) und 100 μl
eines Lumineszenzreagens, "Lucifer
LU" (Kikkoman Corp.),
zugesetzt wurden. Unmittelbar danach wurde die Lumineszenz gemessen.
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(3) Herkömmliches
Verfahren 2
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Zu
100 μl einer
Probe wurden 50 μl
einer Detergenslösung
zugesetzt und 20 Sekunden lang stehen gelassen, um das ATP aus dem
Mikroorganismus zu extrahieren. Dann wurden 50 μl 25 mM Tricin (pH 7,75) und
zudem 50 μl
eines Biolumineszenzreagens zugesetzt und die Lumineszenz unmittelbar
danach gemessen.
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(4) Herkömmliches
Verfahren 3
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Zu
100 μl einer
Probe wurden 50 μl
einer Detergenslösung
zugesetzt und 20 Sekunden lang stehen gelassen, um das ATP aus dem
Mikroorganismus zu extrahieren. Dann wurden 50 μl einer 10%igen α-Cyclodextrinlösung (αCD-Lösung) und
zudem 50 μl
eines Biolumineszenzreagens zugesetzt und die Lumineszenz unmittelbar
danach gemessen.
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5. Ergebnisse
-
Tabelle
3 zeigt die gemäß den oben
beschriebenen Bestimmungsverfahren erhaltenen Lumineszenzwerte,
bei denen Benzalkoniumchlorid (BAC) als Detergens verwendet wurde.
Eine relative Prozentzahl des durch jedes Bestimmungsverfahren erhaltenen
Lumineszenzwertes ist ebenfalls in der Tabelle angeführt, wobei
der gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltene Lumineszenzwert
auf 100% eingestellt ist.
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Der
gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 2 erhaltene Lumineszenzwert (und zwar jenes Verfahren, bei
dem keine Neutralisationsverfahren verwendet wurden) betrug etwa
30 bis 40% jenes durch das herkömmliche
Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren)
erhaltenen Wertes, was auf eine signifikante Lumineszenzhemmung
hinweist. Der gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 3 erhaltene Lumineszenzwert (und zwar jenes Verfahren,
bei dem α-CD
als Neutralisationsmittel verwendet wurde) war, verglichen mit jenem
des herkömmlichen
Verfahrens 2, zwar höher,
betrug jedoch etwa 50% des durch das herkömmliche Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren)
erhaltenen Wertes.
-
Andererseits
betrug der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
(nämlich
jenem Verfahren, bei dem als Neutralisationsmittel verzweigtes Dextrin
verwendet wurde) erhaltene Lumineszenzwert etwa 60 bis 80% des durch
das herkömmliche
Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes, der etwa
dem zweifachen Wert des durch das herkömmliche Verfahren 2 erhaltenen
Wertes ohne Verwendung von Neutralisationsmitteln entspricht, was
bezüglich
Empfindlichkeit und Genauigkeit eine große Verbesserung darstellt. Der
durch die vorliegende Erfindung erhaltene Lumineszenzwert war, verglichen
mit dem durch das herkömmliche
Verfahren 3 unter Verwendung von αCD
als Neutralisationsmittel erhaltenen Wert, höher, was darauf hinweist, dass
die Neutralisationsfähigkeit
des verzweigten Dextrins bei der Bestim mung des intrazellulären ATP von
Mikroorganismen unter Verwendung von BAC besser als die des αCD ist.
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(2)
Tabelle 4 zeigt die gemäß den oben
beschriebenen Bestimmungsverfahren erhaltenen Lumineszenzwerte,
bei denen Benzethoniumchlorid (BZC) als Detergens verwendet wurde.
Eine relative Prozentzahl des durch jedes Bestimmungsverfahren erhaltenen
Lumineszenzwertes ist ebenfalls in der Tabelle angeführt, wobei
der gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltene Lumineszenzwert auf
100% eingestellt ist.
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Der
gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 2 (nämlich
einem Verfahren, bei dem keine Neutralisationsmittel verwendet wurden)
erhaltene Lumineszenzwert betrug etwa 30% des gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes, was, ähnlich dem
BAC-Fall, eine signifikante Lumineszenzhemmung darstellt. Der gemäß dem herkömmlichen
Verfahren 3 (nämlich
einem Verfahren, bei dem αCD
als Neutralisationsmittel verwendet wurde) erhaltene Lumineszenzwert
war nur gering höher
als jener Wert, der ohne Neutralisationsmittel erhalten wurde.
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Andererseits
betrug der gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
(nämlich
jenem Verfahren, bei dem als Neutralisationsmittel verzweigtes Dextrin
verwendet wurde) erhaltene Lumineszenzwert etwa 50 bis 60% des durch
das herkömmliche
Verfahren 1 (TCA-Extraktionsverfahren) erhaltenen Wertes, der etwa
dem zweifachen Wert des durch das herkömmliche Verfahren 2 erhaltenen
Wertes ohne Verwendung von Neutralisationsmitteln entspricht, was
bezüglich
Empfindlichkeit und Genauigkeit eine große Verbesserung darstellt. Der
durch die vorliegende Erfindung erhaltene Lumineszenzwert war, verglichen
mit dem durch das herkömmliche
Verfahren 3 unter Verwendung von αCD
als Neutralisationsmittel erhaltenen Wert, höher, was darauf hinweist, dass
die Neutralisationsfähigkeit
des verzweigten Dextrins bei der Bestimmung des intrazellulären ATP von
Mikroorganismen unter Verwendung von BZC besser als die des αCD ist.
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GEWERBLICHE
ANWENDBARKEIT
-
Verzweigte
Dextrine erweisen sich als sehr gute Substanzen zur Unterdrückung der
Unterbrechung der durch ein Extraktionsreagens verursachten Analyse.
Verzweigte Dextrine verfügen
darüber
hinaus über folgende
Vorteile:
- (1) Die verzweigten Dextrine weisen,
verglichen mit Cyclodextrin, eine schwache Hemmungsaktivität auf eine
Biolumineszenzreaktion auf (wenn α-Cyclodextrin
in einer Lumineszenzreaktionslösung
in einer Konzentration von 1% oder 2% vorliegt, wird eine starke
Hemmung von 25% bzw. 50% verursacht; die verzweigten Dextrine verfügen andererseits über eine
geringe Lumineszenzhemmung und hemmen nur wenige Prozent, wenn sie
in einer Lumineszenzreaktionslösung
in einer Konzentration von 2% vorliegen).
- (2) Die verzweigten Dextrine sind kostengünstig (ein α-Cyclodextrin mit der besten
Neutralisationsfähigkeit kostet
etwa 20.000 Yen pro Kilogramm, während
die verzweigten Dextrine etwa 200 Yen kosten, was in etwa 1/1000
des Preises für α-Cyclodextrin entspricht).
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Die
vorliegende Erfindung wird insbesondere bevorzugt, wenn ein Extraktionsreagens
verwendet wird, das als wirksame Komponente ein Detergens aufweist.
Folglich ist die vorliegende Erfindung vorzugsweise ein Verfahren
zur Analyse verschiedener intrazellulärer Komponenten, einschließlich intrazellulärem ATP.