BG61671B1

BG61671B1 - Противогъбичен микроорганизъм

Info

Publication number: BG61671B1
Application number: BG96249A
Authority: BG
Inventors: Maria Fattory; Stefaan R. Horemans; Marc Lefebvre; Keith A. Powell; Annabel Renwick
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1989-10-17
Filing date: 1992-04-17
Publication date: 1998-03-31
Also published as: AU6614190A; MY107283A; PL166131B1; SK279149B6; RU2108038C1; JPH05501407A; FI102615B; GB8923407D0; PL166864B1; ATE147580T1; HU9201282D0; BG96249A; FI921722A; AU652132B2; DE69029739T2; EP0496791A1; FI921722A0; ZA908268B; CZ284515B6; CZ503590A3

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до противогьбичен микроорганизъм, по-специално до нови щамове от Pseudomonas fluorescens и до тяхното използване за защита на растенията от гъбични заболявания.

Обикновена микробиологична практика е да се търсят микроорганизми с интересни свойства чрез изследване на голям брой изолати от почвата за представляваща интерес активност и тяхното приложение в практиката. Биологични средства (BCAs), които са активни срещу подобрени растителни патогени, се изолират и те представляват алтернативи или допълнения към химическите средства за борба с патогените.

Предшестващо състояние на техниката

В обикновената практика се взимат проби от почвата от такива места в полето, където патогените, към които проявяваме интерес, изглеждат потиснати в развитието си, което може да означава, че микроорганизмите в самата почва инхибират патогенността. Микроорганизмите от отделните проби се изолират в лаборатория чрез промиване на корените и посяване и растеж върху агар при температури, типични като оптимални температури за микробен растеж, обикновено 25 до 30°С. След това изолатите се проверяват първоначално срещу различни патогени в агар в серии петриеви панички, прилагайки метода на двойните култури. Това представлява първичното подбиране. Надеждните изолати от това определяне след това се подлага на по-обстойна вторична проверка, като се използва почва.

От нашия опит се оказа, че традиционното първично изпитване на е нито достатъчно точно, нито достатъчно селективно по отношение на изолатите, които ще преминат през последващите тестове на проверка и полеви изпитвания. Голям брой изолати (обикновено около 20%), които дават надежда, минават през традиционната първоначална проверка, но повечето от тях отпадат при последващите изпитвания. Сега вече знаем, че някой от преминаващите изолати впоследствие показват не достатъчно полезна активност, докато при първоначалното определяне отпадат някой изолати, които са способни да преминат през следващите тестове за подбор. Изводът от това е, че традиционните тестове пропускат изолати, които са слаби и отхвърлят изолати, които са добри инхибитори на патогенността.

Ясно е, че е необходим нов метод за подбиране на почвени изолати, който да възвръща голям брой от потенциално добрите изолати и да отстранява възможно най-много от материалите със слаба активност.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до метод за подбиране на потенциални противогъбични средства, състоящ се в определяне на инхибиращия ефект на потенциалното противогьбично средство в два теста, първият тест за инхибиране развитието на патогенни микроорганизми в стерилизирана почва, заразена е мицела на Pythium spp., и втори тест отново за инхибиране развитието на болестта в подрастващо растение от вид, чувствителен към заразяване от заразяващ комплекс на гниене в присъствието на този комплекс, идентифициране на средствата, показващи потенциален инхибиращ ефект и в двата теста в сравнение с контрола, и представянето им за по-нататъшни изпитания.

Изобретението е особено полезно при подбиране на микроорганизми от проби почва като биологични средства за борба с патогените, но същия начин на работа може да се използва без каквото и да е приспособяване и при химическите средства за растителна защита.

Както беше посочено по-горе, обичайният метод за изолиране на микроорганизма сам по себе си не е селективен, ето защо изобретението предлага също и предварителен метод на подбор при изолиране на микроорганизми от почвени проби. Този метод се състои в поставяне на слой от влажен стерилен пясък в запечатващ се контейнер, върху него поставяне на почвена проба във влажни условия и засаждане в почвата на семе от растение, възприемчиво към заболяването, запечатване на контейнера, поставяне на контейнера при условия, водещи до развитието на болестта, оставяне на семето да покълне и коренчетата му да преминат от почвения в пясъчния слой, разрязване на тръбата надлъжно през двата слоя, събиране на коренчетата само от пясъчния слой и изолиране на микроорганизмите от събраните коренчета.

Средствата, химически или микробиологични, които преминават през двата теста, описани в изобретението, могат след това да се проверяват по-нататък за свойството им да инхибират гьбична инфекция чрез един или повече от допълнителните тестове, подбрани по следния начин:

а) захарно цвекло, заразено с Aphanomyces cochlioides при температура от 12 до 15°С;

б) грах, заразен с Phytium ultimum при температура от 12 до 15°С;

в) грах, заразен с Phytium ultimum при температура от 24 до 27⁽'С;

г) грах, заразен с Rhizoctonia solani при температура от 24 до 27°С;

д) пшеница, заразена с Fusarium culmorum при температура от 18 до 21°С;

е) соя, заразена с Phytophthora megasperma при температура от 20 до 24°С;

ж) картофен резен, заразен с Fusarium moniliforme при температура от 20 до 24°С;

з) картофен резен, заразен с Fusarium sambusinum при температура от 20 до 24°С и

к) захарно цвекло, заразено с Phoma spp. при температура от 15 до 19°С.

Обобщавайки всички възможни съставни части на изобретението, потенциални биологични средства за унищожаване на патогени могат да се изолират по метод, който е предназначен само да отделя коренно активните организми, подбрани в два начални теста, които идентифицират организмите с голяма възможност за активност и след това се подлагат на подбор в серия щателни изпитвания, които идентифицират средствата, оказващи се в последствие много издръжливи при проверка при голямо разнообразие на полските условия. Това представлява голямо предимство в сравнение с обичайните традиционни методи, които, както беше изложено по-горе, показват склонност да отхвърлят организмите, преминаващи тестовете на изобретението,и пропускат много голям брой организми, които тестове на изобретението сочат за неактивни или по-малко активни от контролата.

Изобретението включва и фунгицидно средство, показващо същото или по-добро инхибиране на гъбичната инфекция, отколкото използваното за сравнение химическо средство, както се показва от по-горе споменатите подбиращи тестове на изобретението.

По метода на изобретението са изолирани и оценени четири вида микроорганизми, които се считат за особено активни срещу различни гъбични заболявания, свързани най-общо с гниене. Поради това изобретението включва също и противогъбични средства при микроорганизми от видовете Pseudomonas fluorescens, чиито култури са депозирани на 1 септември 1989 г. при условията на Будапещенското споразумение в Националната сбирка от промишлени и морски бактерии, Абердин, Великобритания, под каталожни номера 40186, 40187, 40188 и 40190.

Изобретението включва също и противогъбичен селскостопански препарат, съдържащ като активна съставка всеки един или повече от посочените микроорганизми в смес с приемливи за земеделската практика носители.

Примери от видовете селскостопански формулировки, които могат да се използват, са състави за покриване на семената, течност за намокряне на корените или на почвата, гранулирани или прахообразни състави. Основните вещества за тях са общоизвестни.

За да се покаже чрез пример ефективността на подбора съгласно изобретението е използван традиционният метод in vitro за проверяване на около 7000 изолата, като е установено, че той има степен на “пропускане” от около 20%, докато по метода на изобретението се пропускат само около 4 до 5% от изолатите. При това съществен момент е, че колекцията от микроорганизми, които преминават през всеки от двата минимални (първоначални) теста от изобретението, са много сходни, докато традиционното подбиране върху агар пропуска доста несходна колекция от организми. Някой от организмите, които биха били отхвърлени, ако се разчита на традиционните методи на подбор, показват висока активност при последните проверочни изпитвания при полски условия. Това е основното предимство на изобретението: първоначалното скриниране (подбиране) намалява общия брой на микроорганизмите, които се нуждаят от следваща проверка и голяма част от тези, които са набелязани за по-нататъшна проверка, показват след това при полски условия търсената активност. Счита се, че причината се крие в следното. Опитните параметри, например температура и хранителен състав, се оптимизират в традиционния метод, за да се предизвика растеж на микроорганизма в агар. Такова отглеждане е много отдалечено от суровата реалност на околната среда на условия, при които се прилага микроорганизмът. В резултат на това, много от микроорганизмите, които преживяват този първоначален подбор, са обикновено слаби, като са способни да преживеят само в местните условия на агаровата култура. След това пропадат при по-суровите вторични и по-нататъшни изпитания, които се доближават до реалните полски условия. От друга страна, в партида от изолати ще има, и опитът потвърждава това, щамове от микроорганизми, които предпочитат полевите условия, където например температурите са по-ниски или хранителните вещества са по-оскъдни или са с различен състав. Такива микроорганизми не се развиват добре в агаровия опит и нормално ще бъдат отхвърлени. Очевидно е, че двата подбиращи теста в основата на изобретението осигуряват условия, които са по-близки до тези на полето и така дават по-реална преценка за способността на микроорганизма да се развива в околната среда, в която ще се използва.

Изобретението също така предлага метод за инхибиране на гъбично заболяване в растение, състоящ се в прилагане към растението, неговото семе или средата, в която расте, на ефективна доза от противогьбичното средство от изобретението.

В допълнение, чрез изобретението се осигурява метод за защита на културни растения от гьбична инфекция, състоящ се в прилагане към растението, неговите корени или семена, или към почвата, обграждаща растенията, фунгицидно ефективно количество от един или повече Pseudomonas fluoresccns щамове.

Щамът NC1B 40187 е изолиран от корените на пшеница, събрани от растения, растящи на полето, край ферма, известна като Badbury 2, Dravcott Farm, Chiseldon, Swindon, Wiltshire, Великобритания.

Щамовете NC1B 40186 и 40188 са изолирани от почва, взета от полето, известна на Stockoy Field в Jodoignc в Белгия.

Щамът NC1B 40190 е изолиран от корени на покълнало жито от Lower Garston field, Rushall Farm, Newbury, Великобритания.

Следва описание на изолирането, охарактеризираното и подбирането на бактериал ните изолати за активността им по отношение на някои гъби, заразяващи културни растения. Много голям брой микроорганизми са изолирани, идентифицирани и скринирани по начина, описан по-долу, като са подбрани четирите щама от изобретението, заради изключителното им представяне в тестовете.

Примери на изпълнение на изобретението

Изолиране на микроорганизмите

Приготвя се тръба от диализна тръба с дълбочина 35 cm и ширина 5,5 cm с възел на разстояние 5 до 7 Cm от единия край. Тръбата се пълни до дълбочина 12 cm с измит и изсушен фин пясък, който се навлажнява с дестилирана вода. Тръбите с пясък се поставят за опора вътре в стъклени тръби (7 cm диаметър и дълбочина 30 cm). Тръбите се затварят откъм дъното с гумена тапа, покрита с алуминиево фолио, и откъм върха със запушалка от памук и вълна, обвита след това в алуминиево фолио. Всичко това се стерилизира в автоклав двукратно при 121°С в продължение на 60 min.

Взима се проба от почвата в набелязаното място и докато се използва, се държи при 40°С, в рамките на два дни след взимането. Почвената проба се пресява през сито с отвори 4 mm и се прибавя към тръбите на дълбочина 3 cm върху пясъка. Засажда се семе (грах, пшеница, захарно цвекло, слънчоглед, царевица или соя) и се покрива с почва до обща дълбочина от 6 cm. Тръбите се поставят отвесно в телен кош, който след това се затваря в пластмасов контейнер с отвори, позволяващи въздухообмен и свеждащи до минимум загубите от изпарението. Кошовете се поставят във вегетационна камера и се инкубират в продължение на четири седмици при температура от 10 до 24°С и 70% относителна влажност и цикъл от 16 h ден и 8 h нощ.

След четириседмично инкубиране пластмасовата диализна тръба се отваря чрез разрязване с предварително стерилизиран скалпел. Корените на всяко от растенията се освобождават от пръстта и пясъка и растението се поставя върху бяла пластмасова табличка. Коронната и върховата част на растенията се отрязват и се измиват отделно със стерилна вода.

Отрязаните части се поставят в стерил ни Ерленмайерови колби, съдържащи 20 ml дейонизирана вода и слой от стъклени перли. Колбите се клатят след това върху орбитален инкубатор при 120 об./min в продължение на 30 min. Използвайки чист разтвор от корените и промивките на корените и връхните части от колбите, се приготвя разтвор от 1:9 в стерилен разтвор на Рингер до разреждане 10 ³. След това аликвотна част от 100 μΐ от всеки разтвор се разлива върху повърхността на три среди от агар със следния състав:

1/10 Триптон соев агар Триптон соев бульон 3,0 g

Бактериологичен агар 17,5 g

Дейонизирана вода 1000 ml

Средата се стерилизира в автоклав при 121°С в продължение на 15 min.

Агар с екстракт от корени Пресни пшенични корени 10 g Агар No 3 17,5 g

Дейонизирана вода 1000 ml

Пресните корени се претеглят и смесват с малко количество дейонизирана вода, като се използва смесител за храни. Гъстата суспензия се поставя след това в торба от четири слоя муселин със ситни отвори и се суспендира в останалата дейонизирана вода в 2-литрова чаша и се инкубира при 20°С в продължение на 4 дни. След отстраняване на муселинената торба към екстракта от корени се прибавя агар. Средата се поставя в автоклав за 15 min при 121°С.

Агар с екстракт от почва Почвена проба 10 g

Агар No 3 17,5 g

Дейонизирана вода 1000 ml

Почвата се претегля и се поставя в дейонизираната вода в двулитрова чаша. Почвената суспензия се покрива и се инкубира при 20°С в продължение на четири дни, след което се прецежда през четворен слой муселинов плат със ситни отвори. Към екстракта от почва се прибавя агар и средата се автоклавира при 121 °C за 15 min.

За всяко разреждане се правят по три повторения. Агаровите панички се инкубират при 12°С за период до пет дни, след което се отчитат и записват броят на колониите. Където е възможно, се заделя по една паничка от растение, от местоположение на взимане на пробата и агарова комбинация, която съдържа петдесет или по-малко колонии. Ако това не е възможно, върху паничката се начертава решетка с петдесет пресечни точки и се взимат колониите, които са върху или най-близко до всяка от пресечните точки. Така подборът на колониите е напълно случаен.

Отделните колонии се събират от паничките, като се използва стерилно ухо и се субкултивират върху петриеви панички с диаметър 5 cm, съдържащи 1/10 триптон соев агар (1/10 TSA). Паничките се инкубират след това при 12°С в продължение на 5 дни. След това изолатите се проверяват за чистота. Там, където културата е смесена, изолатът се посява щрихово върху 1/10 TSA под наклон, за да се получат единични колонии. Една колония се подбира и се субкултивира върху 1/10 TSA. Колекцията от култури се съхранява при 4°С.

Описание на микроорганизмите

Морфология

Морфологичното описание на микроорганизмите е следното:

Клетъчна морфология: Грам-отрицателни пръчици;

Морфология на колонията:

NCIB 40186: белезникава, кръгла, правилна, цялостна, слабо изпъкнала, гладка, лъскава, полупрозрачна, 1,5 до 2 mm диаметър.

NCIB 40187: белезникава, кръгла, правилна, цялостна, изпъкнала, гладка, лъскава, полупрозрачна, с диаметър 1 mm.

NCIB 40188: белезникава, кръгла, правилна, цялостна, слабо изпъкнала, гладка, лъскава, полупрозрачна, 1,5 до 2 mm диаметър.

NCIB 40190: белезникава, кръгла, правилна, цялостна, плоска, гладка, лъскава, полупрозрачна, 1 mm диаметър.

Температура на растеж:

Всички щамове при 37°С + ve

41°С - ve 45°с - ve

Флуоресценция всички щамове + ve

Каталаза всички щамове + ve Оксидаза всички щамове + ve Ферментационен в глюкоза OF всички щамове - ve

Бърз тест (API)

NCIB	40186	40187	40188	40190
Нитратна редукция	-	-	-	-
Индолна продукция	-	-	-	-
Киселина от глюкоза	-	-	-	-
Дехидролаза на аргинин	+	+	+	+
Уреаза	-	-	-	-
Хидролиза на ескулин	-	-	-	-
Хидролиза на желатин	+	+	+	+
β-галактозидаза	-	-	-	-
Асимилиране на глюкоза	+	+	+	+
Асимилиране на арабиноза	+	+	+	+
Асимилиране на маноза	+	+	+	+
Асимилиране на манитол	+	+	+	+
Асимилиране на N-	+	+	-	+
ацетилглюкозамин
Асимилиране на малтоза	-	-	-	+
Асимилиране на глюконат	+	+	+	+
Асимилиране на капрат	+	+	+	+
Асимилиране на адипат	-	-	-	+
Асимилиране на малат	+	+	+	+
Асимилиране на цитрат	+	+	+	+
Асимилиране на фенилацетат	-	-	-	+
Цитохромна оксидаза	+	+	+	+

Първично скриниране (подбиране)

Подбиране на почва върху Петриеви панички

Петриеви панички (5 gm) се запълват с 10 ml картофен декстрозен агар (PDA). Агарови избождания (5 mm) от 7-дневна култура на Pythium ultimum, култивирана при 20°С, се поставят централно върху картофения декстрозен агар. Паничките се инкубират 5 дни при 20°С, през което време Pythium ultimum образува колонии в паничките.

Minster Mendip глина се автоклавира при 120°С в продължение на 60 min. Към нея се прибавят пшенични кълнове (1 % т/т) и добре се смесват. Във всяка петриева паничка се поставят приблизително по 8 g почва, за да покрие зеленината от Pythium ulitimum.

Изпитваните бактерии се отглеждат в 1/ 10 TSB или в панички с 1/10 TSA при 12°С в продължение на 48 h.

Към всяка петриева паничка се прибавя по 2 ml от културата, всяка от паничките е в повторение.

Обработване: 1/10 TSB самостоятелно

Металаксил (100 ppm

Изпитваната култура 1/10 TSB прибавен към почвата върху PDA неинокулиран с Pythium

Петриеви панички се инкубират в продължение на 4 дни при 10°С.

Активността, отчетена по скала от 0 до 3, се подбира на база на цялостно инхибиране на гъбния растежа в почвата.

Подбиране при Fusarium върху картоф

Стерилен диск от филтърна хартия (9 cm диаметър) се навлажнява добре с вода и се поставя в основата на стерилна петриева паничка. За всяко изследване се приготвят по две панички.

Култури от Fusarium (Fusarium sambusinum, Fusarium culmorum и Fusarium moniliforme) се отглеждат върху картофен декстрозен агар за 14 дни при 20°С на светлина с оглед да дават конидии. Конидиите след това се суспендират в стерилен солен разтвор (0,85%) и се нагласяват на пропускливост от 20% на спектрофотометър при 420 nm.

Половин ухо от бактериите, израсли върху хранителния arap (Oxoid) за 24 h при 20°С, се суспендират в 2,5 ml стерилен солен разтвор. За контрола се приготвя каптан 2,0 g/Ι. Солен разтвор самостоятелно също се използва за контрола.

Суспензия от Fusarium (50 μΐ) се поставя в стерилна микроцентрофужна епруветка, по една епруветка за всеки вариант.

Резенче от картоф с дебелина, по-малка от 10 mm, през котето се избождат с помощта на тапопробивач с диаметър 10 mm четири кладенчета, се поставя във всяка петриева паничка. Повърхността на картофеното резенче се стерилизира с етанол и се подсушава със стерилна филтърна хартия. Резенчетата се използват в рамките на 30 min от изрязването (или на 60 min, ако се съхраняват при 4°С).

Проба от 50 μΐ суспензията от спори на Fusarium (10⁶ конидии/ml) се поставя в три от четирите кладенчета на картофения резен. Проба от бактериалната суспензия (50 μΐ, приблизително 10^s клетки в ml) се размесва със суспензията от Fusarium в едно от трите кладенчета и беномилс концентрация 100 ppm се поставя в другото, като третото кладенче служи като нсзаразсна контрола.

Петриевите панички се покриват с капачките си и се инкубират в продължение на 3 дни при 20°С.

Степента на заразени тъкани се оценява по скала от 0 до 3.

Скриниране (подбиране) срещу Phoma betae

Парченца захарно цвекло. 2,5 х 2,5 х 1,5 mm се изрязват от вътрешността на кореноплода и се навлажняват с около 13 ml стерилна вода в пластмасов съд.

Проба от култура от Phoma betae, с или без проба от фунгицидния микроорганизъм, се разлива върху повърхността на парчетата и те се инкубират 3 седмици.

В края на инкубационния период пробите от захарното цвекло се оценяват за загниване.

Определяне на захарно цвекло/почва

Естествена почва, известна с това, че причинява “загниване” на захарно цвекло, се навлажнява до 45%. Голи семена от захарно цвекло и семена, покрити с изпитваните бактерии, се засаждат в почвата. Пробите след това се инкубират 10 дни при 15°С и 12 h осветление. Противогъбичната ефективност на бактериите се оценява въз основа на броя на поникналите семена в сравнение с химическите средства, използвани за борба с този вредител като Tachigaren/TMTD.

Вторично определяне

За проверка на ефективността на подбраните микроорганизми се използват два теста на подбор: Pythium ultimum и Rhizoctonia solani.

Култури от Pythium ultimum и Rhizoctonia solani се отглеждат върху PDA панички в продължение на 7 дни при 20°С.

Смес от 200 g много фино смлян бял пясък, 5 g царевично брашно, 4 g Beemex пшенични кълнове и 40 ml вода се автоклавират при 120°С 20 min, поставят се в колба и се инокулират с 1 /4 от паничката Pythium. Същият субстрат, но без царевично брашно, се използва за Rhizoctonia.

Колбите се инкубират при 12°С 7 дни.

Серии на разреждане: съдържанието на всяка колба с Pythium ultimum се смесва с фин пясък до крайно тегло 300 g.

Едно колба от Pythium ultimum в 8 1 Mendip Minster глина = 2 нормална (2N).

Тя се разрежда с чиста Mendip глина до по-нататъшни желани концентрации. Изолатите обикновено се проверяват срещу Pythium при N/8 и N/32 при 12-15°С.

3/4 колба от Rhizoctonia solani инкулата в 6 1 Mendip Minster глина = нормална. При определенията се използват концентрации от N/4 и N/16.

Опитът се провежда в 3-инчови саксии, като саксиите са запълнени до 3/4 със заразена почва. Към всяка саксия се засаждат по пет семена от грах и се покриват с чиста почва. Към всяка саксия се прибавят по 35 ml вода или бактериална суспензия чрез поливане. За всеки вариант се правят по 5 повторения. При ВСА подбраните бактериите растат 48 h при 20°С в 1/10 TSG. Цялата суспензия (35 ml) се прибавя в саксиите. Контролите са обикновено 1/10 TSB и химически. При опитите с Rhizoctonia се прибавя чрез поливане в концентрации 10, 100 или 200 ppm Pencycuron, a металаксил в концентрация 100 ppm при опитите с Pythium.

Отглеждат се растения за опитите с R. solani в продължение на 7 до 14 дни при 2025°С и за Pythium при 12 до 15°С в продължение на 14 дни. Поникването на семената се проследява седмично. Растенията се поливат ежедневно. Обръща се особено внимание да се осигури непрекъсната влажност на почвата по време на изпитванията, тъй като и двете заболявания предизвикват загниване.

Скрининг срещу Phytophtora megasperma

Парченце с диаметър 5 mm, изрязано от паничка с култура от P.megasperma, се култивира върху паничка с диаметър от 9 cm върху среда V-8 със следния състав:

V-8 Cambell сок	180 ml
СаСО₃	2,7 g
Дестилирана вода	720 ml
Difco arap	13,5 g
Всички компоненти,	c изкл. на агара, се

смесват и нагряват до температура на парата за 30 min, филтрува се, рн се нагласява на 7,2, агарът се прибавя и средата се стерилизира при 120°С в продължение на 20 min.

Влажно просо (50 g заедно с 20 ml дестилирана вода) се стерилизира двукратно при 110°С в продължение на 45 min 1 /4 паничка от P.megasperma се поставя обърнато с горната си страна върху повърхността на просото и се инкубира на тъмно в продължение на 28 дни при 25°С.

Заразеното с P.megasperma просо (тежащо 2,5 g) се смесва добре със стерилизирана почва (1477,5 g) и вода (112,5 g) в смесител. Използваната почва има състав 1:1:1 о/о смес от много фино смлян бял пясък, полска пръст с pH Ί и торф и се стерилизира при 100°С един час.

В Леонардови съдове се претеглят по 500 g от заразената смес на просо/почва и се покривате пластмасови затварящи паничкп. Водните резервоари на дъното на Леонардовите съдове се напълват с 100 ml дестилирана вода.

На повърхността на сместа от просо/почва се правят четири дупки за засаждане и във всяка от тях се поставя по едно соево зърно (c.v. Azzurra), след което се покрива с околната смес.

Култури от изпитвания организъм се приготвят върху хранителни ага рови панички, култивира се при 28С за 24 h и в 250 ml NB колби (150 ml NB) сс култивират 24 h при 28°С. Проба от 75 ml от културата се центрофугира при 8000 об./min в продължение на 5 min при 20°С. Горната течност се изхвърля, прибавят се нови 75 ml проба, отново се центрофугира и отново се изхвърля отделената отгоре течност. Останалите в центрофужните епруветки пеле ти се мият неколкократно с по 5 ml солен разтвор (9,2 g/Ι). Накрая пелета се диспергира в суспензия от 150 ml солен разтвор.

Със спринцовка от 60 ml се инжектират по 30 ml от солената суспензия във всеки от Леонардовите съдове.

За сравнение с химически средства по 30 ml проби от разтвор на 285,5 g металаксил 35% (търговска марка APRON) в 500 ml дестилирана вода се инжектират в Леонардовите съдове, служещи за контрола.

За контрола също така се използват проби, в които се поставя смес от незаразено просо/почва.

Семената се оставят след това да растат във вегетационна кабина при 20±2°С и осветление 15-17 000 лукса. Отчитането се извършва на база на процентното покълване в сравнение с химическото средство.

Проверка срещу Fusarium culmorum

Отглежда се култура от Fusarium culmorum в PDA в продължение на 10 дни при 20°С, за да се даде възможност за образуване на конидии. Конидите се събират и броят до концентрация 10⁴ до 10⁸ конидии за ml. От този материал се взимат 5 ml и се прибавят към 100 g пшенично семе в бутилка, която се оставя да ротира една нощ при 10°С.

Проба от заразените семена се накисва преди засаждане за 60 min в смес от изпитваната бактерия и ситно смлян бял пясък, за да се получи обвивка от около 10⁶ клетки за едно семе. Друга проба за сравнение се обработва с химическо средство беномил (100 ppm).

Засаждат се сто семена в торф в тава за разсад на дълбочина 2 cm. Торфената смес се полива в началото на опита и на 5-тия ден след засаждането, като опитът се провежда при 20°С в продължение на 2 седмици. След това начално поливане на торфа с оглед покълването на семената торфът се оставя да засъхне, за да се подтикне развитието на болестта.

Поникналите семена се следят за развитието на болестта. Симптомите на болестта се отчитат по скала от 0 (без симптоми) до 4 (силно нападение от болестта).

Резултати

По описаните по-горе тестове са проверени около 7000 изолата за почвени бактерии. В таблица 1 са обобщени резултатите от тези проверки. Цифрите в колонките са по скала от проверки. Цифрите в колонките са по скала от 0 (няма противогъбичен ефект) до 3 (липсват доловими симптоми на заболяване). В табли цата също е включен и сравнителен опит за типичен неефективен бактериален щам, означен като 53/87.

Таблица 1

Първично изпитване	NCIB 40186	40187	40188	40190	53/87
Fusarium culmorum	1	2	0	2	1
Fusarium moniliforme	1	1	0	1	1
Fusarium sambusium	0	1	0	0	1
Pythium utimum	2	3	2	2	0
Aphanomyces	3	1	0	2	0
Phoma betae	2	0	3	1	0
Захарно цвекло/почва	3	2	2	3	0

Вторично изпитване	NCIB 40186	40187	40188	40190	53/87
Rhizoctoria solani	0	3	3	0	0
Pythium ultimum 15°C	3	3	3	0	0
Pythium ultimum 24°C	3	2	2	2	0
Fusarium culmorum	2	2	2	2	0
P.megasperma	2	1	1	1	0

Полски изпитвания от 1989 г.

Щамовете, които показват най-голяма надеждност в първичните и вторични изпитвания, се подбират за полски опити като биологически средства за борба срещу “загниване” при грах и захарно цвекло.

На фигура 1 са показани резултатите, получени с щам NCIB 40186, срещу гниене при грах. Опитът се провежда във Великобритания. Получената ефективност с този щам е около 80% от ефективността, която се получава при химическо третиране с метаксалил (търговска марка APRON). Щам NCIB 40187 се оказва много неефективен при този опит.

На фигурите 2 и 3 са показани резултатите от полевите изпитвания върху захарно цвекло, като се използват щамове NCIB 40186 и 40190. Опитите се провеждат в Белгия. Избират се шест полски парцела. Три парцела (1,2 и 6) се засаждат със захарно цвекло през март, а останалите три - през май. На фигура 2 са показани резултатите следа първото отчитане, извършено 3 седмици след засаждането, а на фигура 3 - резултатите след 6 до 8 седмици след засаждането.

В обобщение тези резултати показват, че загниването при граха, предизвиквано от Pythium ultimum, се намалява при прилагане на щам NCIB 40186 до ниво, сравнимо с това при прилагане на химическа обработка с металаксил. Резултатите от захарното цвекло показват подобрено развитие на разсада при прилагане на щамовете NCIB 40186 и 40190 в сравнение с необработените контролни варианти при всички шест парцела. На три от парцелите състоянието на покълналите семена в присъствието на щамовете е сравнимо с полученото при използване на металаксил.

Полски изпитвания от 1990 година

През 1990 г. полските изпитвания с микроорганизмите NCIB 40186 и 40190 се провеждат с оглед възможността им да инхибират Pythium spp. Опитите се провеждат в САЩ, Белгия и Франция и резултатите са дадени по-долу. За целите на опитите микроорганизмите се прилагат чрез накисване на семената, последвано от изсушаване в пясък за Европейските изпитвания и като смолиста/торфена формулировка за САЩ. По-нататъшни опити продължават в други части на света, където заболяването “загниване” е ендемично, например при зеленчуковите култури в Мала Азия. Въп резултатите от опити по целия свят, защото опитите не са още завършили, поради сезонността на селскостопанската дейност, началните резултати от нашите изследвания са благоприятни и така, тези забележителни микроорганизми показват голям потенциал като търговски средства за биологическа борба. По-нататъшно изпитване на други микроорганизми, споменати тук, продължава лабораторно или във вегетационна камера съгласно обичайната практика за ефективност и безопасност както за човека, така и за околната среда. Наличните в момента резултати потвърждават намерената по-рано и докладвана тук ефективност.

Щамовете NCIB 40186 и 40190 са изследвани за борба с гниенето при захарно цвекло в опити на пет полета в Белгия и Франция. При саденето в началото на пролетта времето 5 е много топло и сухо, което предизвиква някои проблеми при развитието на болестта гниене при захарното цвекло. На всеки от опитните парцели са засадени по 200 семена общо. Резултатите от девет от опитите са налице.

Опити в Белгия и Франция през 1990 г.

Опитна култура: захарно цвекло

Химическо средство за контрола: Tachigaren/TMTD

Брой на поникналите семена от 200 ♦ = LSD при 5% вероятност

Опит, №	Нетретирана контрола	Химически третирана	NCIB 40186	NCIB 40190
1	93	125	130*	114
2	118	141*	124	127
3	118	157*	146*	138*
4	107	139*	131*	122
5	120	150*	128	130
6	84	116*	111*	114*
7	135	153*	143	138
8	119	148*	141	135
9	135	155*	144	144

Опити във Франция през 1990 год.

Опитна култура: грах

Химическо средство: както е показано подолу; 35

Броят на растенията се отнася за средния брой растения, които поникват върху ивица с дължина 5 m на 22-рия ден след третирането.

Колона 2 в таблицата дава броя на растенията, които поникват от 200 семена 22 40 дни след засаждането.

Буквите, дадени след цифрите, показват статистическата значимост. Няма значителна разлика при 5%-на вероятност при еднакви букви.

Контролна обработка

Опити, проведени в нормална полска почва, без да са добавени патогени.

Вариант	Брой на поникналите
Необработени семена	172,58 АС
NCIB 40186 - 107 клетки на семе	184,74 А
APRON - 30 g актив.в-во/100 kg семе	171,50 АС
RIDOMIL 2Е металаксил навлажняване
на бразди	181,00 А
Голи семена 100 клетки/семе	176,00 АС

Опитни варианти

Патоген Pythium се прибавя в количество 200 g/m в браздата

Вариант	Брой на поникналите
Необработени семена	111,25 I
NCIB 40186 - 107 клетки на семе	144,75 DG
APRON - 30 g актив.в-во/100 kg семе	157,25 BCDF
RIDOMIL 2Е металаксил навлажняване
на бразди	164,25 AD
Голи семена 100 клетки/семе	1119088 HI

Опити в Калифорния (САЩ) 1990 год.

Опитна култура: грах

Опитен патоген: Pythium при 30 g/m в браздата

Опити в Мисисипи (САЩ) 1990 год.

Вариант	% на поникналите
Необработени семена, не е прибавен патоген	93,13 АВ
Патоген + NC1B 40186 - 107 клетки на семе	75,31 BCD
Патоген + голи семена - 100 клетки/семе	51,56 EF
Патоген + APRON - 30 g
активно.в-во/100 kg семе	92,81 АВ

Опитна култура: царевица

Опитен патоген: Fusarium (i) при 10 g/m от браздата (ii) при 30 g/m от браздата

Поникването е отчетено в % 15 дни след засаждането

Вариант	% на поникналите
Необработени семена, не е
прибавен патоген	65,833 С
Не е прибавен патоген,
NCIB 40186 - 107 клетки на семе	67,917 С
Не е прибавен патоген,
каптан обработени семената	69,583 ВС
Патоген (I), без третиране	51,250 D
патоген (1) + NCIB 40186 - 107
клетки на семе	80,000 АВ
Патоген (II), без третиране	69,375 ВС
Патоген (И) + NCIB 40186 -
107 клетки на семена	82,708 А
Патоген (ii) + каптан обработени семена	63,958 С

Claims

Патентни претенции

1. Противогъбичен микроорганизъм, включващ щамове микроорганизми от род Pseudomonas fluorescens, регистриран в № CIMB , GB под номера 40186, 40187, 40188 и 40189.
2. Противогъбичен микроорганизъм съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че този микроорганизъм образува колониите си по кореновата система.
3. Метод за получаване на противогъбичен микроорганизъм съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че щамовете микроорганизми се изолират от почвена проба чрез поставяне в запечатващ се контейнер на слой от влажен стерилен пясък, поставяне на почвената проба при влажни условия върху него и засаждане в почвената проба семе от растение, чувствително към определено заболяване, запечатване на контейнера, поставяне на контейнера при условия, благоприятстващи развитието на болестта, оставяне на семето да поникне и корените му да проникнат от почвения в пясъчния слой, разрязване на тръбата по дължина през двата слоя, събиране на корените само от пясъчния слой и изолиране на микроорганизмите от отделените корени.
4. Метод за определяне на инхибиращия ефект на противогъбичен микроорганизъм съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че инхибиращият ефект се определя в два теста, първият от които се състои в приготвяне на мицел от патоген от Pythium spp. в слой културална среда, поставяне на слой от стерилна почва върху слоя от културата, прибавяне на аликвотна част от предполагаемото противогьбично средство към слоя почва, инкубирането им и оценяване на инхибиращия ефект на противогьбичното средство по растежа на патогена, вторият тест включва инокулиране на почвена проба с патогенна гъба, предизвикваща гниене, за- саждане в заразената с гъба почва на семе от растение, чувствително към заразата на гъбата, прилагане на аликвотна част от предполагаемото противогьбично средство в почвата, ос5 тавяне на семето да покълне и да се развие растение от него и оценяване на инхибиращия ефект на противогъбичното средство върху здравословното състояние на растението, в сравнение с незаразена контрола.
5. Метод за определяне на инхибиращия ефект на противогъбичен микроорганизъм съгласно претенция 1 или 4, характеризиращ се с това, че инхибиращият ефект се определя чрез един или повече от следните допълнителни тестове:

а) захарно цвекло, заразено с Aphanomyces cochlioides при температура от 12 до 15°С;

б) грах, заразен с Pythium ultimum при температура от 12 до 15°С;

в) грах, заразен с Pythium ultimum при температура от 24 до 27°C;

г) грах, заразен с Phizoctonia salani при температура от 24 до 27°С;

д) пшеница, заразена с Fusarium culmorum при температура от 18 до 21°С;

е) соя, заразена с Phytophthora megasperma при температура от 20 до 24°С;

ж) картофен резен, заразен с Fusarium moniliforme при температура от 20 до 24°С;

з) картофен резен, заразен с Fusarium sambusinum при температура от 20 до 24°С;

и) захарно цвекло, заразено с Phoma spp. при температура от 15 до 19°С.
6. Метод за инхибиране развитието на патогенни гъби по растенията, състоящ се в прилагане на ефективна доза от около 10М0⁸клетки/ml и 10⁵-10⁷ клетки/семе от противогъбичното средство съгласно претенция 1 към растението, към неговото семе преди засаждането или към средата, в която растението се развива или ще се развива.