FI92790C - Mikrobintorjuntamenetelmä - Google Patents

Description

92790

Mikrobintorj untamenetelmä

Keksintö koskee menetelmää kemiallisen metsäteollisuuden 5 prosessia häiritsevien sienten torjumiseksi luonnonmukaisella tavalla.

Kemiallisen metsäteollisuuden prosessivedet tarjoavat edulliset kasvuolosuhteet mikro-organismeille, varsinkin 10 bakteereille, mutta myös sienille. Prosessivedet sisältävät mikro-organismien kasvulle edullisia ravinteita, ja muutoinkin kasvuolosuhteet ovat sopivat. Lähellä neutraalia oleva happamuusarvo (pH 7-8) suosii bakteerien kasvua, kun taas hapan pH-alue (pH 5-6) on suotuisa sienille.

15 Paperi- ja kartonkikoneiden prosessivesien lämpötila, joka on usein alueella 40-60°C, sopii monille mikrobeille varsin hyvin, ennen kaikkea bakteereille. Sienten kasvu pysähtyy yleensä noin 50°C:ssa tai hieman sen yläpuolella.

20 Käytännössä on havaittu, että korkealuokkaista paperia ja kartonkia voidaan tuottaa, vaikka kiertovesien bakteeripi-toisuudet olisivatkin melko korkeita (107-101 kpl/ml). Tavanomaisen bakteeripopulaation sekaan saattaa silloin tällöin ilmaantua paperin ja kartongin valmistusta häirit- 25 seviä mikrobeja. Tuotannon ja varsinkin ajettavuuden kan- • naita suurinta haittaa saavat aikaan rihmamaiset sienet ja bakteerit, joilla on taipumus muodostaa häiritseviä kasaumia. Sienillä on keskeinen rooli ajettavuutta häiritsevinä tekijöinä. Jonkin verran harvinaisemmiksi on havaittu ta- 30 paukset, joissa rihmamaiset bakteerit ovat olleet kasaumien rungontekijöinä. Sienirihmat keräävät mm. kuituja, • fibrillejä, pihkaa, bakteereja ja täyteaineita sekä väri-hiukkasia. Toisinaan kasaumat ovat limaisio . Ilman tällaisia kasaumien rungontekijöitä paperi- ja kartonkikoneiden 35 tuottavuus olisi nykyistä parempi.

Kasaumia aiheuttavien mikrobien torjuntaan käytetään erikoiskemikaaleja, mikrobintorjunta-aineita, jotka ovat laa- 92790 2 javaikutteisia yhdisteitä. Tämä onkin kemiallisten mik-robintorjunta-aineiden eräs haittapuoli, sillä ne tehoavat paitsi häiriömikrobeihin myös tuotannon kannalta haitattomiin mikrobeihin. Muita kemiallisten mikrobintorjunta-5 aineiden haittoja ovat niiden myrkyllisyys myös ihmisille ja eläimille sekä mahdolliset jäämät paperissa ja kartongissa .

Esillä oleva keksintö perustuu ajatukseen, että nopeakas-10 vuiset ja haitattomat bakteerit voisivat ollakin hyödyllisiä mikrobintorjunnan kannalta viemällä elintilaa hidas-kasvuisemmilta sieniltä ja tällä tavalla estämällä niiden kasvua. Toistaiseksi ei ole olemassa eikä tiettävästi tiedossakaan sellaista kemikaalia, jonka vaikutus voitai-15 siin suunnata pelkästään häiriömikrobeihin niin, etteivät ne vaikuttaisi muihinkin mikrobeihin.

Nyt on yllättäen havaittu, että kiusallisimpien häiriömik-robien, nimittäin sienten, torjuntaan voidaan käyttää hai-20 tattomia, nopeakasvuisia bakteereja. Bakteerien kyky estää sienten kasvua voi perustua useampaankin mekanismiin. Yksi niistä on bakteerien suurempi kasvunopeus sieniin verrattuna, jolloin ne syrjäyttävät sienet yhteisestä kasvuympäristöstä mikrobiologian alalla tunnetulla tavalla.

25 Toinen vaikutustapa on ao. bakteerien erittämät, sienille haitalliset aineenvaihduntatuotteet eli metaboliitit. Nämä voivat inhiboida sienten kasvua. Kolmas vaikutustapa on bakteerien tuottamat entsyymit, esimerkiksi sienten so-luseinämiä hajottavat lyyttiset entsyymit, kuten kitinaa-30 sit.

“· Keksinnössä on tarkoituksena hyödyntää prosessiveden omia bakteereja mahdollisimman luontevilla tavoilla. Tällöin on tarjolla useita eri vaihtoehtoja. Eräs mahdollisuus on 35 kemiallinen torjunta siten, että mikrobin torjunta-aineeksi valitaan estobakteeriin tehoamaton, mutta haittamikro- beihin tehoava kemikaali. Tällä tavoin voitaisiin suosia estobakteerien kasvua, mikä puolestaan heikentäisi häi- li 3 92790 riösienten kasvumahdollisuuksia. Tämä vaihtoehto on nykyään käytettävän kemiallisen torjunnan muunnelma, eikä sitä voida pitää luonnonmukaisena. Valitettavasti useimmat torjuntakemikaalit ovat laajavaikutteisia, joten oikean 5 torjunta-aineen löytäminen merkitsee alituista tasapainoilua tehon ja haittavaikutusten välillä.

Keksinnön tarkoituksena on saada aikaan luonnonmukainen, entistä valikoivampi torjuntamenetelmä. Keksinnön mukai-10 sesti kiertovesiin voidaan annostella sopivin väliajoin sienten ja rihmamaisten bakteerien kasvua estäviä estobak-teereja, joita voidaan tuottaa fermenttorissa. Nämä bakteerit on etukäteen osoitettava haitattomiksi tuotantoprosessin kannalta.

15

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettäviin edullisiin estobakteereihin kuuluvat eräät vahvakasvuiset Pseudomonas - ja Enterobacter-bakteerit. joiden on havaittu pystyvän varsin tehokkaasti estämään tehtaan kiertovesien 20 hiiva- ja homesienten kasvua ja parhaassa tapauksessa jopa tuhoamaan niitä. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät estobakteerit on eristetty paperi- ja kartonkitehtaiden kiertovesistä. Estobakteeri Pseudomonas antimicro-bica -bakteerikanta on saatavissa NCIMB-talletuslaitokses-25 ta talletusnumerolla 9898. Estobakteereja tulee lisätä • vähintään pitoisuuteen 102 kpl/ml.

Seuraavissa esimerkeissä on lähemmin kuvattu keksinnön mukaista luonnonmukaista menetelmää.

30

Esimerkki 1

Estobakteerit eristettiin paperi- ja kartonkitehtaiden kiertovesistä käyttäen Difcon-viljelyalustaa, jolla oli seuraava koostumus: 35 tryptoni 2,5 g hiivauute 5,0 g dekstroosi 1,0 g agar 15,0 g vesi 1000 ml 40 pH 7,0 ± 0,2 92790 4

Inkuboitiin alustalla 2 vrk lämpötilassa 37°C käyttäen suodatinkalvomenetelmää.

Sienet (hiiva- ja homesienet) eristettiin nyös paperi- ja 5 kartonkitehtaiden kiertovesistä käyttäen MifGP-viljelyalus- taa: mallasuute 3,0 g hiivauute 3,0 g peptoni 5,0 g 10 glukoosi 10,0 g agar 20,0 g vesi 1000 ml pH 5,5 15 Inkuboitiin 3-5 vrk lämpötilassa 30°C käyttäen suodatin kalvomenetelmää .

Esimerkki 2

Tutkimuksissa selvitettiin kiertovesien bakteerien kykyä 20 estää sienten kasvua laihassa ravintoliemessä. Bakteereil le ja sienille annettiin samanlaiset kasvumahdollisuudet siirrostamalla ne kasvamaan samanaikaisesti.

A) Kartonkitehtaan kiertovedestä eristettyjä bakteereita 25 (yleisimpien bakteerien pitoisuus kiertovesissä oli luok kaa 107 kpl/ml ja harvinaisempien luokkaa 103 kpl/ml) siirrostettiin kutakin kolmea erilaista erikseen kasvamaan kolmeksi vuorokaudeksi laihaan ravintoliemeen, jonka koostumus oli seuraava (mg/1): 30 tryptoni 330 glukoosi 240 hiivauute 240 peptoni 120 35 mallasuute 70 ·“ pH 7,0

Estobakteerien lisäysmäärät olivat 104 - 4xl05 kpl/ml. Samanaikaisesti kunkin bakteerin kasvatusl tmeen siirros-40 tettiin saman tehtaan kiertovedestä eristettyä hiivasien tä. Vertailuun siirrostettiin pelkkää hiivasientä.

Il 5 92790

Inkubointi suoritettiin 30°C:ssa (esimerkit 2, 3, 4A ja 4F) ja 37°C:ssa (esimerkit 4C-4E) Erlenmeyer-kolveissa (50 ml lientä 100 ml:n kolveissa). Esimerkissä 4B lämpötila oli 25°C. Bakteeri- ja hiivapitoisuudet määritettiin 5 uudelleen 1 ja 2 vrk:n inkuboinnin jälkeen. Tulokset on esitetty kuvassa 1.

Hiivasieni kasvoi vertailukokeessa erinomaisesti saavuttaen 1 vrk:n kohdalla pitoisuuden noin 108 kpl/ml. Sen si-10 jaan hiivasieni tuhoutui kaikkien kolmen bakteerin läsnä ollessa ja sen pitoisuus jäi kaikissa tapauksissa pienemmäksi kuin 10 kpl/ml. Käytetyt estobakteerit määritettiin seuraaviksi: Pseudomonas -sukuun kuuluva bakteeri ja Ente-robacter agglomerans.

15 B) Koe suoritettiin muuten samoin kuin kohdassa A, mutta torjuttavana mikrobina oli nyt hiivasienen asemesta saman kartonkitehtaan homesieni. Estobakteerit olivat samoja. Bakteereja lisättiin pitoisuuteen 104 - 5xl04 kpl/ml ja 20 inkuboitiin 5 vrk ravintoliemessä. Tulokset on esitetty kuvassa 2. Bakteeri 242 on E. agglomerans. bakteeri 243 on tunnistamaton ja bakteeri 246 on E. agglomerans.

Vertailukokeen homesieni kasvoi hyvin ravintoliemessä pi-25 toisuuteen noin 105 kpl/ml. Bakteerit jarruttivat sen kas vua selvästi. Ero vertailuun oli suurimmillaan 3 vrk:n kohdalla yli 3 log-yksikköä jääden 5 vrk:n kohdalla noin 1 log-yksikköön. Käytännössä 3 vrk:n kasvunesto on kuitenkin täysin riittävä. Mikrobintorjunta-aineiden avulla ei voida 30 päästä näin pitkäaikaiseen vaikutukseen yhden annostelu- kerran avulla.

Esimerkki 2 osoittaa, että vahvakasvuiset Pseudomonas- ja Enterobacter-bakteerit pystyvät varsin tehokkaasti estä-35 mään tehtaan kiertovesien hiiva- ja homesienten kasvua ja parhaassa tapauksessa jopa tuhoamaan niitä.

92790 6

Esimerkki 3 Tässä kokeessa käytettiin esimerkissä 2 esitetyistä menetelmistä poiketen sellaista menetelmää, jossa bakteerien annettiin ensin kasvaa yli yön ravintoliemessä, jolloin 5 bakteeripitoisuus oli 107 - 109 kpl/ml. Tämän jälkeen se kaan siirrostettiin torjuttava hiivasieni ja kasvatettiin 2 vrk 30°C:ssa. Näin yritettiin simuloida tilannetta, jossa jokin häiriösieni samasta kiertovedestä yrittää vallata alaa kiertovesien runsaslukuisen bakteeripopulaation 10 keskuudesta. Tässä vaiheessa annettiin mikrobeille ravin- netäydennys (samat ravinteet kuin esimerkissä 1). Tulokset on esitetty kuvassa 3. Hiivasieni kasvoi hyvin vertailussa. Bakteerikanta 2 74 on Enterobacter aacrlomerans. kuten kanta 275.

15

Tuloksista voidaan päätellä, että myöskin menetelmä, joka sisältää bakteerin esikasvatuksen, toimii hyvin.

Esimerkki 4 20 Tässä kokeessa käytettiin em. kartonkitehtaan hioketta, jonka sakeus säädettiin 2 %:iin. Hiokkeen ikä oli kokeessa 1-17 viikkoa.

Hioke steriloitiin ja siihen siirrostettiin samasta teh-25 taasta eristettyjä estobakteereja kasvamaan vuorokaudeksi etukäteen. Tämän jälkeen siirrostettiin torjuttava sieni hiokkeeseen. Vertailuna oli sieni yksinään steriilissä hiokkeessa.

30 A) Torjuttava hiivasieni ja estobakteerit olivat samat kuin esimerkissä 2A, jossa kaikki bakteerit pystyivät torjumaan hiivasienen täydellisesti (ks. kuva l). Estobak-teerien lähtöpitoisuus oli 2xl03 - 5xl04 kpl/ml. Kasvatettiin 3 vrk lämpötilassa 30°C, pH noin 5. Samat bakteerit 35 eivät toimineet yhtä hyvin steriilissä hiokkeessa. Paras hiivan kasvua jarruttava bakteeri oli kanta 246 E. agglo-merans (kuva 4), joka esti kasvua vajaat kaksi vuorokautta. Bakteerikanta 241 on niinikään E. agg1omerans.

7 92790

Verrattaessa esimerkkiin 2A käytettiin tässä hioketta sisältävässä kokeessa mm. ikääntynyttä kasvualustaa, jossa ei ilmeisesti ollut riittävästi ravinteita estobakteerien kunnolliselle toiminnalle eli niiden lisääntymiselle. Käy-5 tännössähän kiertovesiin tulee jatkuvaa ravinnetäydennystä mm. tuoreen hiokkeen kautta.

B) Kun kohdan A koe suoritettiin käyttäen torjuttavana sienenä hometta, havaittiin, että menetelmä toimii parem- 10 min hometta (kuva 5) kuin hiivaa (kuva 4) vastaan. Baktee rien lähtöpitoisuus oli 6x10 kpl/ml. Kasvatettiin 5 vrk lämpötilassa 25°C, pH noin 5. Hometta vastaan bakteerikannan 244 (Pseudomonas -sukuun kuuluva bakteeri) antama teho oli parhaimmillaan hieman yli 1 log-yksikköä.

15 C) Tässä kokeessa (kuva 6) käytettiin estobakteerina kasvinsuojelualalla tunnettua bakteeria Pseudomonas antimic-robica NCIMB 9898 lähtöpitoisuudessa 8xl04 kpl/ml ja torjuttavina sieninä kolmea kartonkitehtaan hiivaa. Kasvatet- 20 tiin 6 vrk lämpötilassa 37°C, pH noin 5. Kontrollihiivat kasvoivat hyvin hiokkeessa pitoisuuteen 10-107 kpl/ml. Pseudomonas-bakteeri kasvoi yksinään hiokkeessa pitoisuuteen noin 107 kpl/ml. Sen läsnäolessa hiivat eivät kasvaneet lainkaan. Hiivojen pitoisuus jäi alle 102 kpl/ml koko 25 koejakson ajan (5 vrk).

D) Tässä kokeessa (kuva 7) P. antimicrobican antama tor-juntatulos hiivakantoja 267 ja 269 vastaan ei ollut yhtä hyvä kuin edellisessä kokeessa B käytettyjä hiivakantoja 30 vastaan. Paras tulos saatiin hiivaa 267 vastaan. Estovai kutus kesti 1-2 vrk.

E) Tässä kokeessa testattiin P. antimicrobican kykyä estää eri tehtaiden hiivojen kasvua hiokkeessa. Havaittiin, että 35 P. antimicrobica toimi erinomaisesti eri tehtailta olevia neljää hiivasientä vastaan (kuva 8). Tämän bakteerin läsnäollessa hiivojen pitoisuudet jäivät tasolle 102 kpl/ml, 92790 8 kun vastaavat pitoisuudet kontrolleissa olivat luokkaa 106- 108 kpl/ml.

F) Tässä kokeessa tutkittiin P. antimicrobican kykyä estää 5 paperitehtaiden homeiden kasvua hiokkeessa, kun bakteeria oli kasvatettu etukäteen 1 vrk hiokkeessa. Bakteeri esti hyvin homeiden kasvun hiokkeessa (kuva 9). Yhdessä tapauksessa estovaikutus jäi noin 2 log-yksikköön, mutta kahdessa muussa tapauksessa homeet eivät kasvaneet lainkaan 10 estobakteerin läsnäollessa.

Kokeissa käytetyt hiiva- ja homesienisuvut ovat tunnistamattomia .

Claims (4)

92790

1. Förfarande för bekämpning av skadlig svampväxt i fab- rikens processvatten, kännetecknat av att till process-vatten tillsätts minst upp till koncentrationen 102 ex./ml fran fabrikens cirkulationsvatten eller frän annat häll 25 isolerade, ur produktionsprocessens synpunkt oskadliga Γ bakterier valda ur gruppen Pseudomonas antimicrobica eller Enterobacter agglomerans.

1. Menetelmä tehtaan prosessivesissä olevien haitallisten sienten kasvun torjumiseksi, tunnettu siitä, että prosessivesiin lisätään vähintään pitoisuuteen 102 kpl/ml 5 tehtaan kiertovesistä tai muualta eristettyjä, tuotanto prosessin kannalta haitattomia bakteereja, jotka on valittu joukosta Pseudomonas antimicrobica tai Enterobacter aaqlomerans.

2. Förfarande enligt patentkrav l, kännetecknat av att 30 bakterien är Pseudomonas antimicrobica NCIMB 9898.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeri on Pseudomonas antimicrobica NCIMB 9898.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu 15 siitä, että sieni on home- tai hiivasieni.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että estobakteerit lisätään hiokkeeseen.

20 Patentkrav

3. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att svampen är en mögel- eller jästsvamp. 35

4. Förfarande enligt patentkrav 1, kännetecknat av att hämningsbakterier tillsätts tili trämassa.