DE69022254T2 - Liganden-Rezeptor-Assays unter Verwendung eines Schwellenwertes. - Google Patents
Liganden-Rezeptor-Assays unter Verwendung eines Schwellenwertes.Info
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Description
- Diese Erfindung liegt in dem Gebiet von Ligandenrezeptor-Assays, einschließlich Immunoassays, zur Detektion selektierter Analyten in einer fluiden Probe. Spezieller betrifft diese Erfindung Verfahren zur Bereitstellung von Schwellenwerten für die Signalerzeugung, die mit den Liganden- Konzentrationen in Ligand-Rezeptor-Assays in Bezug stehen. Die hierin beschriebenen erfinderischen Assays können verwendet werden, um halbquantitative und quantitative Bestimmungen von einem oder mehreren Zielliganden in einem einzelnen Testformat, ohne die Notwendigkeit einer Geräteausstattung zur Signaldetektion zu erhalten. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso Verfahren, die die Quantifizierung von Liganden-Konzentrationen in Proben unter der Verwendung eines einzelnen Kalibrierungspunktes mithilfe eines Gerätes ermöglichen. In diesen Assay-Formaten ist die Intensität eines Signals in direkter Weise mit der Liganden-Konzentration in der Probe verknüpft.
- Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "Ligandenrezeptor-Assay" einen Assay für einen Analyten, der durch die Bildung eines Komplexes zwischen einem Liganden und einer anderen, zur spezifischen Interaktion mit diesem Liganden fähigen Substanz, d.h. einem Ligandenrezeptor, detektiert werden kann. Der Ligand kann der Analyt selbst sein oder eine Substanz, die, falls detektiert, dafür verwendet werden kann, um auf die Gegenwart des Analyten in einer Probe zu schließen. In dem Kontext der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff "Ligand" Haptene, Hormone, Antigene, Antikörper, Deoxyribonucleinsäure (DNS), Ribonucleinsäuren (RNS), Metaboliten der zuvor erwähnten Materialien und andere Substanzen, entweder natürlichen oder synthetischen Ursprungs, die von diagnostischem Interesse sein können und die einen spezifischen Bindungspartner dafür haben, d.h., den Ligandenrezeptor des Ligandenrezeptor-Assays, ein. Im Kontext der vorliegenden Erfindung schließt der Begriff "Ligandenrezeptor" Materialien ein, für den es einen spezifischen Bindungspartner, d.h. den Liganden des Ligandenrezeptor-Assays, gibt. Der Fachmann wird erkennen, daß der Analyt, der von Interesse ist, ein Bauteil eines spezifischen Bindungspaares, entweder der Ligandenrezeptor oder der Ligand, abhängig vom Aufbau des Assays, sein kann.
- Ligandenrezeptor-Assays sind im allgemeinen nützlich zur in-vitro-Bestimmung der Anwesenheit und Konzentration von Liganden in Körperflüssigkeiten, Nahrungsmittelprodukten, tierischen Flüssigkeiten und Umweltproben. Zum Beispiel hat die Bestimmung spezifischer Hormone, Proteine, therapeutischer Arzneimittel und toxischer Drogen in humanem Blut oder Urin in signifikanter Weise die medizinische Diagnose des menschlichen Gesundheitszustandes verbessert. Es gibt einen kontinuierlichen Bedarf an einfachen, schnellen Assays zur qualitativen, halbquantitativen und quantitativen Bestimmung solcher Liganden in einer Probe. Darüberhinaus müssen in vielen Situationen solche Assays einfach genug sein, um von fachfremden Anwendern durchgeführt und interpretiert zu werden.
- Ligandenrezeptor-Assays beruhen auf der Bindung von Liganden durch Rezeptoren, um die Konzentration von Liganden in einer Probe zu bestimmen. Ligandenrezeptor-Assays können als entweder kompetitiv oder nicht-kompetitiv beschrieben werden. Nicht-kompetitive Assays wenden im allgemeinen Rezeptoren in beträchtlichem Überschuß über die Konzentrationen des in dem Assay zu bestimmenden Liganden an. Sandwich-Assays, in denen der Ligand durch das Binden an zwei Rezeptoren detektiert wird, wobei ein Rezeptor markiert ist, um die Detektion zu ermöglichen, und ein zweiter Rezeptor häufigerweise an eine Festphase gebunden ist, um die Trennung von ungebundenen Reagenzien, wie ungebundenen markierten ersten Rezeptor, zu erleichtern, sind Beispiele für nicht-kompetitive Assays. Kompetitive Assays schließen im allgemeinen Liganden aus der Probe, ein markiertes Ligandenanalogon, um die Detektion zu gestatten, und die Kompetition dieser drei Spezies um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen, die durch den Ligandenrezeptor bereitgestellt werden, ein. Den Fachleuten wird bekannt sein, daß viele Variationen dieser grundlegenden kompetitiven Situation früher beschrieben worden sind und hierin nicht im Detail erörtert werden, außer wo sie mit den allgemeinen Zielen der Erfindung im Zusammenhang stehen. Beispiele für Liganden, die häufig durch kompetitive Ligandenrezeptor-Assays gemessen werden, schließen Haptene, Hormone und Proteine ein. Antikörper, die diese Klassen von Liganden binden können, werden häufig in diesen Assays als Ligandenrezeptoren verwendet.
- Kompetitive Ligandenrezeptor-Assays können weiter als entweder homogen oder heterogen beschrieben werden. In homogenen Assays werden alle an der Kompetition teilnehmenden Reaktanten zusammengemischt, und die Menge des Liganden wird durch seinen Effekt auf das Ausmaß der Bindung zwischen dem Ligandenrezeptor und dem markierten Ligandenanalogon bestimmt. Das beobachtete Signal wird durch das Ausmaß dieser Bindung moduliert und kann mit der Menge des Liganden in der Probe in Beziehung gesetzt werden. Das US-Patent Nr. 3 817 837 beschreibt solch einen homogenen kompetitiven Immunoassay, in dem das markierte Ligandenanalogon ein Liganden-Enzym-Konjugat ist und der Ligandenrezeptor ein Antikörper, der fähig ist, entweder an den Liganden oder das Ligandenanalogon zu binden, ist. Das Binden des Antikörpers an das Liganden-Enzym-Konjugat senkt die Aktivität des Enzyms relativ zu der beobachteten Aktivität, wenn das Enzym im ungebundenen Zustand vorliegt. Aufgrund der Kompetition zwischen dem ungebundenen Liganden und dem Liganden-Enzym-Konjugat um Antkörperbindungsstellen erhöht sich die Menge ungebundenen Liganden-Enzym-Konjugats, wenn die Liganden-Konzentration sich erhöht, und erhöht dadurch das beobachtete Signal. Das Produkt der Enzymreaktion kann dann kinetisch unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen werden.
- Im allgemeinen erfordern homogene Assay-Systeme sowohl ein Gerät, um die Ergebnisse zu lesen, als auch die Kalibrierung des beobachteten Signals durch separate Tests mit Proben, die bekannte Konzentrationen des Liganden enthalten. Die Entwicklung homogener Assays hat die Forschung bei kompetitiven Assays dominiert und hat zu verschiedenen im Handel erhältlichen Systemen geführt. Solche Systeme sind jedoch nicht dazu befähigt, Ergebnisse für die Bestimmung mehrfacher Liganden in einer Probe in dem Format eines einzelnen Tests, ohne das Erfordernis einer Instrumentierung, bereitzustellen.
- Heterogene kompetitive Ligandenrezeptor-Assays erfordern die Trennung des gebundenen markierten Liganden oder Rezeptors von dem freien markierten Liganden oder Rezeptors und die Messung entweder der gebundenen oder der freien Fraktion. Verfahren für die Durchführung solcher Assays werden in den US-Patenten Nr. 3 654 090, 4 298 685 und 4 506 009 beschrieben. Solche Verfahren sind jedoch nicht befähigt, halbquantitative oder quantitative Ergebnisse für die Bestimmung von Liganden in einer Probe ohne die Verwendung zusätzlicher Tests, um die Assay- Response zu kalibrieren, bereitzustellen.
- Der Bedarf an Ligandenrezeptor-Assays, die ohne die Verwendung einer Geräteausstattung durchgeführt werden können, hat zu der Entwicklung von Immunoassays geführt, die einfach auszuführen sind und zu einer Response führen, die visuell interpretiert werden kann. Die US- Patente Nr. 4 125 372, 4 200 690, 4 246 339, 4 366 241, 4 446 232, 4 477 576, 4 496 654, 4 632 901, 4 727 019 und 4 740 468 beschreiben Vorrichtungen und Verfahren für Ligandenrezeptor-Assays, die farbige Antworten bzw. eine farbigen Response zur visuellen Interpretation der Ergebnisse entwickeln. Während solche Vorrichtungen einfache Formate zur visuellen Interpretation der Ergebnisse des Assays bereitstellen, kann nur das Vorhandensein oder die Abwesenheit des Liganden bestimmt werden; halbquantitative oder quantitative Bestimmungen unter Verwendung dieser Verfahren erfordern, daß separate Tests unter der Verwendung von Standards bekannter Konzentration durchgeführt werden, um die Beziehung zwischen der beobachteten Response und der Konzentration des Liganden herzustellen.
- Es wurden ebenfalls Verfahren zur internen Kalibrierung von Ligandenrezeptor-Assays entwickelt durch das Bereitstellen von Vorrichtungen, die Referenzzonen in sich eingegliedert haben, wobei die Response in der Referenzzone die Assay-Response für eine bestimmte Konzentration des Liganden repräsentiert. Die durch die unbekannte Konzentration des Liganden in der Probe an einer Testzone erzeugte Response wird mit der Response in der Referenzzone verglichen, um die Konzentration des Liganden in der Probe entweder halbquantitativ oder quantitativ zu bestimmen. Die EP-A-253 464 beschreibt Verfahren zur Verwendung solcher interner Referenzen in nicht- kompetitiven Sandwich-Assays, um halbquantitative Bestimmungen durch das visuelle Lesen der Ergebnisse und quantitative Bestimmungen durch das instrumentelle Lesen der Ergebnisse bereitzustellen. Gleichermaßen beschreiben das US-Patent Nr. 4 540 659 und die EP-A-203 238 Systeme, die Referenzen eingegliedert haben, die die Fähigkeit bereitstellen, halbquantitative Bestimmungen in kompetitiven Ligandenrezeptor-Assays durchzuführen, die visuell interpretiert werden. Jedes dieser Systeme stellt eine visuelle Interpretation der Menge des markierten Ligandenanalogon, das an den auf der Festphase immobilisierten Rezeptor gebunden ist, bereit.
- Unter Verwendung der für kompetitive Ligandenrezeptor-Assays beschriebenen Techniken, ist die Intensität der sich ergebenden Farbe invers mit der Konzentration des Liganden in der Probe verknüpft, so daß Assay-Ergebnisse, deren Farbe intensiver ist als die der Referenz, so interpretiert werden, daß sie bedeuten, daß die Probe Liganden in einer geringen Konzentration als der durch die Konzentration der Referenz repräsentierten enthielt. Ein ernster Nachteil jedoch für die weit verbreitete Verwendung solcher visuell interpretierter kompetitiver Ligandenrezeptor- Assays war diese inverse Beziehung zwischen der Intensität des entwickelten Signals und der Konzentration des Liganden in der Probe. Diese Beziehung sorgt dafür, daß eine Probe mit einer niedrigen Konzentration des Liganden ein starkes Signal in dem Assay erzeugen wird; und umgekehrt, eine Probe mit einer hohen Konzentration des Liganden wird ein kleines Signal in dem Assay erzeugen. Ein weiterer Nachteil solcher Assays ist, daß, falls es für einen einzelnen Test erforderlich ist, gleichzeitig multiple Liganden zu bestimmen, von denen jedem ein halbquantitativer Wert zugewiesen werden soll und von denen jeder spezifische individuelle Konzentrationsziele aufweist, dann individuelle spezifische Referenzzonen für jeden zu bestimmenden Liganden bereitgestellt werden müßten. Unter solchen Umständen wird ein Test für multiple Liganden schwierig herzustellen und komplex zu interpretieren.
- In der EP-A-267 006 und EP-A-271 204 und in der PCT mit der Anmeldungs-Nr. PCT/US86/00668 (Internationale Publikation Nr. WO 86/06170) wurden Verfahren beschrieben, bei denen in dem Assay kein Signal entwickelt wird, bis der Ligand in der Probe einen vorbestimmten Betrag übersteigt. Diese Verfahren verwenden Ligandenrezeptoren, die auf einer Festphase in einer Anordnung immobilisiert sind, die den Kontakt des Liganden in der Probe und des Ligandenanalogon-Konjugates mit den immobilisierten Rezeptoren ermöglicht. Der Kontakt wird in einer chromatographischen Weise gemacht, so daß die den Liganden enthaltende Flüssigkeit durch die Anordnung der Festphase in einer gerichteten Weise gezogen wird. Die Bindungskapazität der Festphase wird empirisch so eingestellt, daß eine vorherbestimmte Menge des Liganden durch die Festphase, während des Durchlaufs der den Liganden enthaltenden Flüssigkeit durch die Festphase, gebunden wird. Der Ligand, das Ligandenanalogon-Konjugat und die Anordnung des immobilisierten Rezeptors erreichen das Gleichgewicht während des Assay- Verfahrens in diesen Verfahren nicht. Dem Fachmann wird bekannt sein, daß die Bindungskapazität des immobilisierten Rezeptors in hohem Maß von den Bedingungen der Immobilisierung und ihrer Wirkung auf die Affinität des Rezeptors für den Liganden abhängig ist und von der Zeit, während der der Ligand und das Ligandenanalogon-Konjugat an den immobilisierten Rezeptor binden können. Die Abhängigkeit dieser Verfahren voll Bedingungen, in denen kein Gleichgewicht besteht, bedingt, daß die Durchführung solcher Assays unvorhersagbar und schwierig zu reproduzieren ist. In der vorliegenden Erfindung werden Gleichgewichtsverfahren verwendet, um in der Lage zu sein, das Verhalten des Assays vorauszusagen, so daß die Entwicklung des Assays einfach und die Durchführung des Assays reproduzierbar ist.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf vereinfachte Verfahren für den Assay von Liganden, der quantitative Ergebnisse ergibt. Dem Fachmann wird bekannt sein, daß quantitative Assays eine Kalibrierung erfordern, um präzise und akurate Ergebnisse zu erreichen. Weil die kompetitiven Assays im allgemeinen zu nicht-linearen Responsefunktionen führen, sind verschiedene Kalibrierungspunkte für solche Assays erforderlich, um die Response über den Assaybereich zu bestimmen. Um das Kalibrierungsverfahren zu simplifizieren, haben sich im Stand der Technik zwei extreme Wege entwickelt. Ein Weg besteht darin, nicht die Anzahl von Kalibratoren oder Wiederholungsversuchen, die nötig sind, die Response zu bestimmen, zu reduzieren, sondern die Häufigkeit einer solchen Kalibrierung zu reduzieren. Solche Assays beruhen auf Geräten, um den Assay durchzuführen und die Variablen kontrollieren, die die Assay- Response beeinflussen, so daß die Kalibrierung selten ist oder durch den Hersteller durchgeführt wird und nicht durch den Anwender des Assays durchgeführt werden muß. Der zweite Weg besteht darin, kein Gerät zu verwenden und ein vereinfachtes Hilfsmittel zur Kalibrierung bereitzustellen, so daß keine zusätzlichen Tests benötigt werden, um die Assay-Response zu kalibirieren. Die vorliegende Erfindung stellt neue Verfahren zur Kalibrierung bereit, die einfach zu verwenden sind, sowohl in auf Geräten beruhenden Assays, als auch in Assays, die visuell interpretiert werden.
- Das Verfahren von US-Patent Nr. 4 540 659 stellt einen Assay zur Quantifizierung eines Liganden in Proben bereit, wo vorherbestimmte Verhältnisse von Antworten auf einer Kalibrierungsoberfläche und einer Messungsoberfläche mit der Konzentration des Liganden in Bezug stehen. Während dieses Verfahren ein grobes Mittel zur Quantifizierung bereitstellen kann, bietet sie nicht die Präzison oder den Genauigkeitsgrad existierender Verfahren, die Instrumente verwenden, noch stellt es eine Quantifizierung ohne die Verwendung von Instrumenten bereit.
- Ein anderer Weg nach dem Stand der Technik, ein nicht-kompetitiver immunochromatographischer Assay wird in den US-Patenten Nr. 4 168 146 und 4 435 504 beschrieben. Dieser Assay stellt ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Vorhandenseins eines einzelnen Analyten in einer Probe in einem visuell interpretierten Immunoassay bereit, erlaubt aber dem Assay nicht, mehrere Analyten ohne mehrfache Vorrichtungen zu verwenden. Darüberhinaus ist dieses Verfahren in der Praxis auf Liganden beschränkt, deren Konzentrationen in der Probe hoch sind verglichen mit Liganden, die durch die Technik kompetitiver Assays gewöhnlich bestimmt werden. Entsprechendermaßen ist diese Art von Weg von begrenzter Nützlichkeit. Klarerweise gibt es einen ungestillten Bedarf an Liganden-Rezeptor-Assays, die fähig zur Bestimmung der Anwesenheit einer Vielzahl von Liganden in einer Probe sind, und die gleichzeitig individualisierte halbquantitative Ergebnisse für jeden Liganden bereitstellen. Darüberhinaus sollte ein solcher Assay solche Resultate in einem Format produzieren, das einfach genug ist, von einem nicht- fachlichen Anwender in korrekter Weise durchgeführt und interpretiert zu werden. Außerdem gibt es einen Bedarf an breit anwendbaren quantitativen Assay-Verfahren, die einfach durchgeführt und interpretiert werden können. Der erfinderische Assays dieser Erfindung erfüllen diese Erfordernisse.
- Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung kompetitiver Ligandenrezeptor- Assays, um in der Lage zu sein, die Konzentration des Liganden halbquantitativ oder quantitativ zu bestimmen. Die Erfindung ermöglicht dem Assay des Ziellieganden in einer Weise ausgeführt zu werden, daß die Liganden-Konzentration relativ zu einer intern spezifizierten Konzentration, der Schwellenwert-Konzentration, bestimmt wird. Die Schwellenwert-Konzentration kann in willkürlicher Weise vorgewählt werden, um einer jeglichen für den Liganden, der von Interesse ist, geeigneten Konzentration äquivalent zu sein, und dient als Kalibrierungspunkt für den Assay dieses Liganden. Die vorliegende Erfindung stellt quantitative Verfahren, die die Schwellenwert- Konzentration als einen Kalibrierungspunkt verwenden, bereit, um vereinfachte Verfahren der Quantifikation zu ermöglichen. Darüberhinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung kompetitiver Liganden-Rezeptor-Assays zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Liganden bereit, wobei jede Bestimmung eine interne Schwellenwert-Konzentration, die spezifisch auf ihren jeweiligen Liganden gerichtet ist, einschließt. Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung kompetitiver Liganden-Rezeptor- Assays zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Liganden, wobei jede Bestimmung ein Kompendium interner Schwellenwert-Konzentrationen, die in spezifischer Weise auf den jeweiligen Liganden gerichtet sind, einschließt. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung gewährleistet, daß die Bestimmung der Konzentration in einer Weise ausgeführt werden kann, die einfach anzuwenden und problemlos zu interpretieren ist.
- Die vorliegende Erfindung betrifft einen Ligandenrezeptor-Assay mit drei Hauptelementen und einem zusätzlichen wahlfreien Element:
- 1) eine Reaktionsphase und -mischung;
- 2) ein wahlfreies Mittel zur Entfernung ausgewählter Spezies aus der Reaktionsmischung;
- 3) eine terminale Festphase; und
- 4) eine signalerzeugende Phase.
- Die Reaktionsphase umfaßt als Teil den Rezeptor für den Zielliganden und das Ligandenanalogon-Konjugat. Das Ligandenanalogon-Konjugat umfaßt ein Ligandenanalogon oder Ligandenanaloga, die an ein signalerzeugendes Element gebunden sind. Der ligandenanaloge Anteil des Ligandenanalogon-Konjugats ist in der Lage, mit dem Zielliganden um die begrenzte Anzahl von Bindungsstellen, die auf dem Ligandenrezeptor vorhanden sind, zu kompetitieren. Aus der Probe und der Reaktionsphase, die das Ligandenanalogon-Konjugat und den Ligandenrezeptor umfaßt, wird eine Reaktionsmischung gebildet. Die Mengen des Ligandenrezeptors und des Ligandenanalogon-Konjugats werden so ausgewählt, daß, falls die Reaktionsmischung im wesentlichen die Bedingungen einer Gleichgewichtsbindung erreicht, im wesentlichen alles Ligandenanalogon-Konjugat an den Ligandenrezeptor gebunden ist, wenn der Ligand in geringerer als der Schwellenwert-Konzentration vorhanden ist, so daß kein umgebundenes Ligandenanalogon als ein Ergebnis des Assay-Verfahrens detektiert wird. Anschließend wird die Reaktionsmischung mit dem nächsten Element des Ligandenrezeptor- Assays kontaktiert.
- An diesem Punkt kann die Reaktionsmischung entweder mit einem wahlfreien Mittel zur Entfernung des Ligandenrezeptors aus der Reaktionsmischung kontaktiert werden oder kann sofort mit der terminalen Festphase kontaktiert werden. Ob ein wahlfreies Mittel nötig oder wünschenswert ist, hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich von den Analyten, die von Interesse sind, ihrer Konzentration und dem gewählten Format des Assays. Die wahlfreien Mittel können in effektiver Weise z.B. in dem Assay von Liganden, in dem der Konzentrationsbereich, der zu umfassen ist, so groß ist, daß ein "Haken"-Effekt möglich ist, verwendet werden.
- Diese Offenbarung beschreibt spezifische Assay-Formate, die ein wahlfreies Mittel verwenden. Andere Anwendungen werden dem Fachmann offensichtlich sein. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "wahlfreies Mittel" eine Vorrichtung oder eine Substanz, die in funktionsfähiger Weise mit einem gegen einen Ligandenrezeptor gerichteten Rezeptor assoziiert sein kann (d.h. komplexiert sein kann mit), d.h. ein (Ligandenrezeptor)-Rezeptor. Daher bindet, wenn die Reaktionsmischung das wahlfreie Mittel kontaktiert, der (Ligandenrezeptor)-Rezeptor an alle mit dem Ligandenrezeptor assoziierten Spezies. In der Reaktionsmischung schließt dies den Ligandenrezeptor, den Ligand:Ligandenrezeptor-Komplex und den Ligandenanalogon- Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex ein. Alternativerweise kann das wahlfreie Mittel ein Teil der Reaktionsphase sein oder es kann in die Reaktionsmischung eingeführt werden, während sie sich dem Gleichgewicht nähert.
- Die Reaktionsmischung wird als nächstes mit der terminale Festphase kontaktiert. Die terminale Festphase trägt den nicht-diffundierbaren immobilisierten Ligandenrezeptor, der zur Bindung der verfügbaren Liganden oder des Ligandenanalogon-Konjugates in der Lage ist. Ein Teil des Liganden und des Ligandenanalogon-Konjugats, der nicht an den Ligandenrezeptor in der Reaktionsmischung gebunden ist, bindet dann an den auf der terminalen Festphase immobilisierten Ligandenrezeptor. Falls nötig, kann der Rest der Reaktionsmischung dann unter Verwendung eines Waschschrittes entfernt werden. Der Waschschritt entfernt jegliches Ligandenanalogon- Konjugat, das nicht an den auf der terminalen Festphase immobilisierenden Ligandenrezeptor gebunden hat; nur Ligandenanalogon-Konjugat, das an die terminale Festphase gebunden ist, bleibt übrig.
- Die terminale Festphase, die nun den Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex enthält, wird dann mit einer signalerzeugenden Phase kontaktiert. Die signalerzeugende Phase ermöglicht dem signalerzeugenden Element des Ligandenanalogon-Konjugates, das an die Festphase gebunden ist, ein detektierbares Signal zu erzeugen. Die Interpretation des detektierbaren Signals ist dergestalt, daß die Abwesenheit eines detektierbaren Signals entweder anzeigt, daß der Zielligand nicht in der Probe vorhanden ist, oder daß der Zielligand in der Probe in einer Konzentration, die geringer als die Schwellenwert-Konzentration ist, vorhanden ist. Anderseits zeigt ein detektierbares Signal die Gegenwart des Zielliganden, entweder in einer Konzentration, die im wesentlichen gleich, oder einer Konzentration, die höher als die Schwellenwert-Konzentration ist, an. Einfache Kalibrierungsverfahren werden durch die vorliegende Erfindung ermöglicht, so daß die Liganden-Konzentration in quantitativer Weise bestimmt werden kann.
- Bei der Interpretation der Patentansprüche und der Beschreibung sollen die folgenden Begriffe die unten aufgeführten Bedeutungen haben.
- Ligand - Ein Bindungspartner fiir einen Ligandenrezeptor.
- Ligandenanalogon - Ein chemisches Derivat des Zielliganden das entweder kovalent oder nicht- kovalent mit anderen Spezies verknüpft sein kann, z.B. mit dem signalerzeugenden Element. Ligandenanalogon und Ligand können dieselben sein, und beide sind fähig, an den Ligandenrezeptor zu binden.
- Ligandenrezeptor - Ein Rezeptor der fähig zum Binden eines Liganden ist, typischerweise ein Antikörper der aber ein Ligand sein kann.
- Ligandenanalogon-Konjugat - Ein Konjugat eines Ligandenanalogon und eines signalerzeugenden Elements.
- Signalerzeugendes Element - Das Element des Ligandenanalogon-Konjugats, das in Verbindung mit der signalerzeugenden Phase das detektierbare Signal entwickelt, z.B. ein Enzym.
- Schwellenwert-Konzentration - Die Konzentration des Liganden in einer Probe, die zu der Erzeugung des ersten detektierbaren Signals führt. Eine Schwellenwert-Konzentration ist ein Referenzpunkt der Konzentration.
- Reaktionsphase - Die normalerweise das Ligandenanalogon-Konjugat, z.B. ein Hapten-Enzym- Konjugat und den Ligandenrezeptor, z.B. einen Antikörper enthaltende Phase.
- Reaktionsmischung - Die Mischung der erwartetermaßen den Zielanalyten enthaltenden Probe und der Reaktionsphase.
- Ligand:Ligandenrezeptor-Komplex - Der Komplex, der auftritt, wenn ein Ligand durch einen Ligandenrezeptor gebunden wird.
- Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex - Der Komplex, der auftritt, wenn Ligandenanalogon-Konjugat durch einen Ligandenrezeptor gebunden wird.
- Wahlfreie Mittel - Ein wahlfreies Mittel das funktionsfähig mit einem Rezeptor assoziiert ist, z.B. ein Antikörper, der fähig ist, an ausgewählte Komponenten der Reaktionsmischung zu binden.
- Terminale Festphase - Die Festphase, auf der das Signal schließlich während des signalerzeugenden Schrittes erzeugt wird.
- Signalerzeugende Phase - Die die Materialien enthaltende Phase, die dem signalerzeugenden Element ermöglichen ein Signal zu erzeugen, z.B. eine Enzymsubstrat-Lösung.
- Liganden-Komplement - Ein spezialisierter Ligand, der bei der Markierung von Ligandenanalogon-Konjugaten Rezeptoren Ligandenanalogon-Konstrukten oder signalerzeugenden Elementen verwendet wird.
- Liganden-Komplement-Rezeptor - Ein Rezeptor für Liganden-Komplemente.
- Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat - Ein aus einem Ligandenanalogon, einem Liganden-Komplement und einem signalerzeugenden Element zusammengesetztes Konjugat.
- Referenz-Ligand - Ein Liganden-Komplement das verwendet wird um ein Referenz-Liganden- Konjugat zur Verwendung bei der Bereitstellung eines Referenz-Konzentrationspunktes herzustellen.
- Referenz-Rezeptor - Ein Rezeptor, der fähig ist, an einen Referenz-Liganden zu binden.
- Referenz-Liganden-Konjugat - Ein aus einem Referenz-Liganden und einer signalerzeugenden Phase bestehendes Konjugat.
- Referenz-Konzentration - Eine Referenz-Konzentration wird entwickelt unter der Verwendung eines Referenz-Liganden-Konjugates und eines Referenz-Rezeptors. Es wird in Verbindung mit der Schwellenwert-Konzentration verwendet, um einen Bereich von Konzentrationen zu definieren.
- Negativer Kontroll-Ligand - Ein zur Herstellung eines negativen Kontroll-Liganden-Konjugates verwendetes Liganden-Komplement. Ein negativer Kontroll-Ligand und ein (negativer Kontroll-Ligand)-Rezeptor gewährleisten ein Mittel, um die Gültigkeit eines Ergebnisses des Assays zu sichern.
- (Negativer Kontroll-Liganden)-Rezeptor - Ein zur Bindung mit einem negativen Kontroll- Liganden fähiger Rezeptor.
- Ligandenrezeptor-Konjugat - Ein Konjugat eines Ligandenrezeptors und eines signalerzeugenden Elementes.
- Ligandenanalogon-Konstrukt - Ein mit einer Festphase oder einem anderen Molekül so verknüpftes Ligandenanalogon, daß wenn es an das Ligandenrezeptor-Konjugat gebunden ist, das Ligandenrezeptor-Konjugat daran gehindert wird, an das immobilisierte Ligandenanalogon auf der terminalen Festphase zu binden.
- Die Fig. 1 ist ein Graph, der die Fraktion des gesamten ungebundenen Liganden als eine Funktion des gesamten Liganden zeigt. Der Graph zeigt, daß, wenn der Wert von K relativ zu dem von L und R ansteigt, sich die funktionelle Form eines Diagramms an freiem Liganden als eine Funktion der Liganden-Gesamtkonzentration einer Stufenfunktion annähert.
- Die Fig. 2 ist ein Graph, der die Wirkung der Variation der Konzentration des Ligandenrezeptors zeigt. Der Graph zeigt, daß das Erhöhen des Wertes von R die Liganden-Konzentration entsprechend der Position der Stufe erhöht.
- Die Fig. 3 ist ein Graph, der die Responsefunktion für Ligandenrezeptor-Assays zeigt, in denen die Gleichgewichtbindungskonstanten nicht im wesentlichen gleich sind für die Bindung des Liganden an den Ligandenrezeptor und für das Binden des Ligandenanalogon-Konjugats an den Ligandenrezeptor. Die Konzentration von Rezeptor-Bindungsstellen ist 0,1 in Einheiten von 1/K.
- Die Fig. 4 ist ein Graph, der die Responsefunktionen für Ligandenrezeptor-Assays zeigt, die als eine Funktion des Verhältnisses der Fraktion des freien zu dem gebundenen Ligandenanalogon- Konjugat versus der Liganden-Konzentration aufgetragen sind. Der Graph zeigt, daß, wenn der Wert von R relativ zu dem Wert von 1/K ansteigt, das Verhältnis der freien zu den gebundenen Konjugat-Fraktion eine lineare Funktion der Liganden-Konzentration oberhalb der Schwellenwert-Konzentration annähert.
- Die Fig. 5 ist ein Graph, der die Responsefunktion für den Ligandenrezeptor-Assay zeigt, aufgetragen als eine Funktion des Verhältnisses der freien zu der gebundenen Liganden-Fraktion versus der Liganden-Konzentration, verglichen zu einer theoretisch abgeleiteten linearen Funktion. Der Graph zeigt, daß die lineare Annäherung sehr gut mit der Assay-Response unter diesen Bedingungen übereinstimmt.
- Die Fig. 6 ist ein Graph, der die Differenz zwischen der theoretisch abgeleiteten Konzentrationsfunktion, die abgeleitet ist aus der Response-Kurve des Quotienten aus der freien und der gebundenen Liganden-Fraktion und einer theoretischen linearen Konzentrationsfunktion als eine Funktion der Liganden-Konzentration. Der Graph zeigt, daß der Fehler, der durch die lineare Annäherung eingeführt wird, im wesentlichen über den gesamten Bereich des Assays vernachlässigbar klein gemacht werden kann.
- Die zuvor erwähnten vier Elemente des Ligandenrezeptor-Assays der vorliegenden Erfindung, nämlich 1) eine Reaktionsphase und -mischung; 2) ein wahlfreies Mittel zur Entfernung ausgewählter Spezies aus der Reaktionsmischung; 3) eine terminale Festphase; und 4) eine signalerzeugende Phase werden im Detail in diesem Abschnitt erklärt werden.
- Die Fig. 7 ist ein Graph, der die visuell interpretierten Assay-Ergebnisse aus den Assays mit Proben von die Schwellenwert-Konzentrationen umschließenden Konzentrationen von Morphium, zeigt. Der Graph zeigt, daß der Assay verläßlicherweise Konzentrationen von Morphium bei und oberhalb der Schwellenwert-Konzentration detektieren kann.
- Die Fig. 8 ist ein Graph, der die Assay-Response in Einheiten der minimalen detektierbaren Farbdifferenz, die vom menschlichen Auge wahrgenommen werden kann, als eine Funktion der Morphium-Konzentration in der Probe zeigt. Der Graph zeigt, daß die Farbe der Assay-Response zuerst sichtbar wird (der Grenzwert der visuellen Detektion, gezeigt als horizontale Linien) bei der Schwellenwert-Konzentration, und die Assay-Response erhöht sich in schneller Weise als eine Funktion der Morphium-Konzentration in der Probe.
- Die Reaktionsphase enthält normalerweise sowohl ein Ligandenanalogon-Konjugat, zusammengesetzt aus einem Konjugat eines Ligandenanalogon und einem signalerzeugenden Element, als auch einen Ligandenrezeptor. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet einen Ligandenrezeptor in der Reaktionsphase, der auf einer nicht-diffusionsfähigen Festphase immobilisiert ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Ligandenrezeptor nicht auf einer nicht-diffusionsfähigen Festphase immobilisiert und kann daher frei in der Lösung zu diffundieren.
- Im allgemeinen erfordern Verfahren zur Herstellung der Reagenzien der ersten Reaktionsphase der vorliegenden Erfindung das In-Betracht-Ziehen der folgenden Faktoren. Das Koppeln des Ligandananalogon mit dem signalerzeugenden Element, um ein Ligandenanalogon-Konjugat herzustellen, muß in einer solchen Weise durchgeführt werden, daß die Erkennung des gekoppelten Ligandenanalogon durch den gegen den ungekoppelten Liganden gerichteten Ligandenrezeptor nicht im wesentlichen beeinträchtigt ist. Die Anzahl von mit einem signalerzeugenden Element gekoppelten Liganden muß ausreichend sein, sicherzustellen, daß die Fähigkeit des Ligandenanalogon-Konjugats mit Liganden, um Bindungsstellen auf dem Ligandenrezeptor zu kompetitieren, nicht im wesentlichen beeinträchtigt ist. In ähnlicher Weise darf die Anzahl von mit einem signalerzeugenden Element gekoppelten Ligandenanaloga nicht so groß sein, daß sie die Fähigkeit des Liganden mit dem Ligandenanalogon-Konjugat um Bindungsstellen auf dem Ligandenrezeptor zu kompetitieren, im wesentlich beeinträchtigt. In der vorliegenden Erfindung werden Ligandenanalogon-Konjugate bevorzugt, bei denen die Anzahl von an das signalerzeugende Element gekoppelten Ligandenanaloga zwischen 1 und 50 liegt. Besonders bevorzugt in der vorliegenden Erfindung werden Ligandenanalogon-Konjugate, bei denen die Anzahl der Ligandenanaloga, die mit dem signalerzeugenden Element gekoppelt sind, zwischen 1 und 10 liegt.
- Ein signalerzeugendes Element ist ein Element, das ein detektierbares Signal hervorbringen kann. Der Fachmann wird erkennen, daß viele Elemente fähig sind, als ein signalerzeugendes Element zu funktionieren, einschließlich, ohne Beschränkung, Radionucleotiden, fluoreszenten Spezies, phosphoreszierenden Spezies, chemiluminiszenten Materialien, Farbstoffen, Enzymen und Sol- Partikeln, die Metalle, Halb-Metalle und Nicht-Metalle oder eine jegliche der oben genannten Spezies enthallten können. Ein bevorzugtes signalerzeugendes Element für die vorliegende Erfindung ist eines, das ein Signal erzeugt, das durch nicht-instrumentelle Mittel detektiert werden kann. Ein besonders bevorzugtes signalerzeugendes Element ist eines, das ein Signal erzeugt, das durch visuelle Mittel detektiert werden kann, z.B. ein Enzym, das fähig ist, mit einem Enzymsubstrat zu reagieren, bei dem das Produkt der enzymatischen Reaktion ein Molekül ist, das elektromagnetische Strahlung im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums absorbiert. Ein besonders bevorzugtes signalerzeugendes Element ist kolloidales Gold, ein Sol- Partikel, das gefärbt ist. Verfahren zur Adsorption von Proteinen an kolloidales Gold werden beschrieben in Georghegan, et al., J. Histochem. Cytochem, 25, 1187-1200 (1977) und in Leuvering, US-Patent Nr. 4 313 734. Proteine mit gekoppelten Ligandenanaloga können in ähnlicher Weise an kolloidales Gold adsorbiert werden, um ein Ligandenanalogon-Konjugat bereitzustellen, das nützlich in Assays ist, die visuell interpretiert werden. Auf besondere Weise bevorzugt in der vorliegenden Erfindung sind kolloidale Goldpartikel, die einen Durchmesser von 10 bis 80 nm besitzen und bei denen die Anzahl von an jeden Partikel gekoppelten Ligandenanaloga zwischen 10 und 10.000 liegt.
- Die Auswahl der Ligandenrezeptoren, um das komplementäre Reagenz für das Ligandenanalogon-Konjugat bereitzustellen, muß mit einem Verständnis der Faktoren, die die Responsefunktionskurven in kompetitiven Sättigungs-Ligandenrezeptor-Assays kontrollieren, durchgeführt werden. Einige dieser Faktoren werden in R.P. Ekins, G.B. Newin und J.L.H. O'Riordan, Theoretical Aspects of "Saturation" and Radioimmunoassay, Radioisotopes in Medicine: In Vitro Studies, R.L. Hayes, F.A. Goswitz und B.E.P. Murphy, Hsg. U.S. Atomic Energy Commission Oak Ridge, Tenn., 59-100 (1968), diskutiert. Von besonderer Wichtigkeit unter solchen Faktoren sind die Gleichgewichtsbindungskonstante des Ligandenrezeptors für den Liganden und die Breite der Funktion, die die Verteilung der Gleichgewichtsbindungskonstanten für solch ein Ensemble von Ligandenrezeptoren beschreibt. Bevorzugt für die Verwendung als Ligandenrezeptoren in Immunoassays werden Antikörper, in besonderer Weise bevorzugte Antikörper für die Verwendung als Ligandenrezeptoren werden monoklonale Antikörper. Verfahren zur Erzeugung monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann gut bekannt. Monoklonale Antikörper mit Bindungskonstanten, die größer sind als 10&sup8; M&supmin;¹, können ohne weiteres entwickelt werden, und aufgrund der Monoklonalität können von einer einzelnen Zellinie stammende und gegen einen spezifischen Liganden gerichtete Antikörperensembles mit einer engen Verteilung von Gleichgewichtsbindungskonstanten hergestellt werden.
- Ekins et al. haben gezeigt, daß die allgemeine Form der Reaktion, die das Binden eines Liganden durch einen Ligandenrezeptor der aus einem Ensemble solcher Ligandenrezeptoren ausgewählt ist, beschreibt, durch den Ausdruck
- L + Ri = LRi
- dargestellt werden kann, wobei L für den Liganden steht und Ri für die Bindungsstelle der i-ten Ligandenrezeptor-Spezies mit i = 1, 2 3, ... n steht. Die die Gleichgewichtsbindung beschreibende Formel wird gegeben als
- Ki [L] [Ri] = [LRi]
- Worin Ki die die Reaktion in der Ri an L bindet, beschreibende Gleichgewichtsbindungskonstante ist. Im einfachsten Fall, in dem alle Ri gleiche Gleichgewichtsbindungskonstanten haben, kann für die Formel eine geschlossene (closed) Lösung erhalten werden, um die Fraktion des ungebundenen Liganden mit der Gesamtmenge des Liganden für eine feststehende Menge des Rezeptors in Bezug zu setzen. Diese Situation ist von besonderem Interesse, falls die Gleichgewichtsbindungskonstanten, K, für die Bindung des Liganden an den Ligandenrezeptor und für das Binden des Ligandenanalogon-Konjugates an den Ligandenrezeptor im wesentlichen äquivalent sind. Die geschlossene Form der Lösung für den einfachsten Fall, in dem alle Ri gleich sind, wird von Ekins als
- (Ff/b)² + Ff/b (1 - L/R - 1/KR) - 1/KR = 0
- angegeben, worin Ff/b das Verhältnis des freien zu dem gebundenen Liganden ist, L die Gesamtkonzentration des Liganden ist, R die Gesamtkonzentration der Ligandenrezeptor- Bindungsstellen ist, und K die Gleichgewichtsbindungskonstante ist. Entsprechendermaßen zeigt die vorliegende Erfindung, daß, wenn der Wert von R relativ zu dem von 1/K ansteigt, sich die funktionelle Form eines Diagramms des freien Liganden als eine Funktion der Liganden- Gesamtkonzentration, derjenigen einer Stufenfunktion annähert, wie in Fig. 1 erläutert. Die vorliegende Erfindung zeigt weiter, daß die Krümmung an der Stufe mit der Beziehung zwischen der Gleichgewichtsbindungskonstante, K, und der Gesamtkonzentration der Ligandenrezeptor- Bindungsstellen R in Bezug steht. In Fig. 1 ist die aufgetragene Funktion die Fraktion des gesamten Liganden, der frei (ungebunden) ist, als eine Funktion des gesamten Liganden. Wenn R relativ zu 1/K ansteigt, so kann aus Fig. 1 ersehen werden, daß ein dramatischeres Stufenwachstum in der Fraktion des freien Liganden auftritt. Im gewöhnlichen Fall wählt man Ligandenrezeptoren wachsender Gleichgewichtskonstanten, K, um ein dramatisches, stufenweises Anwachsen in der Fraktion des freien Liganden zu erreichen. Die Beziehung zwischen der Fraktion des freien Liganden und dem Verhältnis des freien zu dem gebundenen Liganden, Ff/b, wird unten gegeben.
- Lf/L = Ff/b/(Ff/b+1).
- Die vorliegende Erfindung macht von diesen Beziehungen Gebrauch und weitet dieses Konzept weiter aus, indem sie zeigt, daß, falls R hinreichend größer ist als 1/K, die Konzentrationsposition der Stufe dann eine Funktion der relativen Werte von R ist. Wie in Fig. 2 erläutert, erhöht das Erhöhen des Wertes von R die Konzentration, die der Position der Stufe entspricht.
- Um von diesen Beziehungen in Ligandenrezeptor-Assays Verwendung zu machen, muß das Ligandenanalogon-Konjugat und der Ligandenrezeptor so zur Verfügung gestellt werden, daß, wenn er mit einer Probe in einer Reaktionsmischung kontaktiert wird und danach im wesentlichen eine Gieichgewichtsbindung erreicht wurde, in Abwesenheit von Liganden in der Probe im wesentlichen alles Ligandananalogon-Konjugat durch den Ligandenrezeptor gebunden wird. Dem Fachmann wird bekannt sein, daß die Menge des Ligandenrezeptors so gewählt werden kann, daß Bindungsstellen im Überschuß über die Anzahl derjenigen, die nötig sind, um im wesentlichen alles Ligandenanalogon-Konjugat zu binden, in der Reaktionsmischung bereitgestellt werden. Wenn die Menge des Liganden in der Probe die Menge der überschüssigen Bindungsstellen übersteigt, beginnen der Ligand und das Ligandenanalogon-Konjugat um verfügbare Ligandenrezeptor-Bindungsstellen zu kompetitieren. Die Konzentration des Liganden in der Probe, die zu dem ersten detektierbaren Anstieg in der Menge des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugats in der Reaktionsmischung, im wesentlichen bei einer Gleichgewichtsbindung, führt, ist die Schwellenwert-Konzentration. Wie in Fig. 2 erläutert, kann die Schwellenwert-Konzentration durch die geeignete Wahl der Konzentration des Ligandenrezeptors in der Reaktionsmischung ausgewählt werden. Die Anwendung dieses Verfahrens bei visuellen Assays ist von besonderer Wichtigkeit, da das sichtbare Produkt der Assay-Response leicht in einer Weise kontrolliert werden kann, daß keine Response beobachtet wird, bis der Ligand seine Schwellenwert- Konzentration übersteigt. Wie durch Fig. 1 gezeigt, wird die Rate des Anstiegs des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugates und die Fraktion des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugates, falls der Ligand bei einer geringeren als der Schwellenwert-Konzentration vorhanden ist, durch die Gleichgewichtsbindungskonstante und ihre Beziehung zu der Schwellenwert-Konzentration bestimmt. Die Gleichgewichtsbindungskonstante sollte hinreichend sein, um die Response aufgrund ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugates bis auf unterhalb die Stör-Response des Assays, die durch andere Störquellen bereitgestellt wird, zu reduzieren. Der Fachmann wird verstehen, daß das Ligandenanalogon-Konjugat, die signalerzeugende Phase und das Assay- Verfahren in Kombination die Stör-Response des Assays bestimmen. Bevorzugt zur Verwendung als Ligandenrezeptoren in der vorliegenden Erfindung werden Ligandenrezeptoren einer Gleichgewichtsbindungskonstante, die größer ist als 10² x (Schwellenwert-Konzentration)&supmin;¹ ist, in besonderer Weise bevorzugt zur Verwendung werden Ligandenrezeptoren einer Bindungskonstante, die größer ist als 10³ x (Schwellenwert-Konzentration)&supmin;¹ ist.
- Die durch die vorliegende Erfindung beschriebene Assay-Response wurde im Stand der Technik nicht erreicht. Der Stand der Technik lehrt, daß die freie Fraktion des Ligandenanalogon- Konjugates in der Abwesenheit des Liganden, eine signifikante Fraktion des gesamten Ligandenanalogon-Konjugates in dem Assays sein sollte, um die Sensitivität zu maximieren. In der vorliegenden Erfindung wird im wesentlichen das gesamte Ligandenanalogon-Konjugat gebunden, sowohl bei der Abwesenheit des Liganden als auch wenn die Liganden-Konzentration geringer ist als die Schwellenwert-Konzentration ist. Die vorliegende Erfindung betrifft weiter Beispiele von Ligandenrezeptor-Assays, in denen die Gleichgewichtskonstanten für die Bindung des Liganden an den Ligandenrezeptor und für das Binden des Ligandenanalogon-Konjugates an den Ligandenrezeptor nicht im wesentlichen gleich sind. Inbesondere zeigt die vorliegende Erfindung, daß der Anstieg der Responsefunktion über die Schwellenwert-Konzentration durch den Betrag der Gleichgewichtsbindungskonstante des Ligandenrezeptors für das Ligandenanalogon-Konjugat, bezogen auf den Betrag der Gleichgewichtsbindungskonstante des Ligandenrezeptors für den Ligand, bestimmt wird. Falls diese Bindungskonstanten im wesentlichen gleich sind, beschreiben die in Fig. 1 gezeigten Responsefunktionen die Assay-Response. Falls die Bindungskonstanten nicht im wesentlichen gleich sind, variiert die Responsefunktion, wie in Fig. 3 gezeigt. Falls der Betrag der Gleichgewichtsbindungskonstante des Ligandenrezeptors für das Ligandenanalogon-Konjugat (K*) größer als der Betrag der Gleichgewichtsbindungskonstante des Ligandenrezeptors für den Liganden ist, wird der Anstieg der Responsefunktion reduziert, da mehr Ligand nötig ist, um in effektiver Weise mit der gegebenen Konzentration des Ligandenanalogon-Konjugates zu kompetitieren. In ähnlicher Weise wird, falls der Betrag der Gleichgewichtsbindungskonstante des Ligandenrezeptors für die Bindung an das Ligandenanalogon- Konjugat geringer ist als der Betrag der Gleichgewichtsbindungskonstante für das Binden des Liganden, die Steigung der Responsefunktion entsprechendermaßen erhöht, weil weniger Ligand nötig ist, um mit der gegebenen Konzentration des Ligandenanalogon-Konjugates zu kompetitieren.
- Daher kann die Steigung der Responsefunktion durch die Variation des Betrags der Gleichgewichtsbindungskonstante des Ligandenrezeptors für das Ligandenanalogon-Konjugat variiert werden. Diese Variation wird am leichtesten in der Praxis durch die Variation der Anzahl von Ligandenanaloga pro signalerzeugendem Element erreicht. Konjugate mit höheren Verhältnissen des Ligandenanalogons zu dem signalerzeugenden Element zeigen einen höheren Betrag der Gleichgewichtsbindungskonstante für die Bindung mit dem Ligandenrezeptor und haben Responsefunktionen, die entsprechendermaßen reduzierte Steigungen haben, bezogen auf Konjugate, die weniger mit Liganden derivatisiert sind. Ligandenanaloga können auf unterschiedliche Weisen mit den signalerzeugenden Elementen gekoppelt werden, um ihre Gleichgewichtsbindungskonstanten für den Ligandenrezeptor zu verändern. Daher kann man Ligandenanaloga entwerfen, die Gleichgewichtsbindungskonstanten von größerem oder kleinerem Betrag zeigen, als der Ligand für den Ligandenrezeptor. Die Fähigkeit, die Steigung der Responsefunktion empirisch einzustellen, ist vorteilhaft bei der Optimierung von Assays.
- Zum Beispiel verwendet in der vorliegenden Erfindung das bevorzugte Verfahren für die Durchführung von Schwellenwert-Immunoassays (wie hierin beschrieben) einen löslichen Antikörper und ein Ligandenanalogon-Konjugat in einer Reaktionsphase, zu der eine möglicherweise einen Zielliganden enthaltenden Probe gegeben wird. Diese Mischung läßt man im wesentlichen zu Bedingungen der Gleichgewichtsbindung kommen. In Abwesenheit des Zielliganden wird im wesentlichen alles Ligandenanalogon-Konjugat an den Antikörper gebunden und ist für das Binden an den auf der terminale Festphase immobilisierten Antikörper nicht verfügbar.
- Die Reaktionsphase kann auf viele Weise bereitgestellt werden. Die korrekten relativen und absoluten Mengen des Ligandenanalogon-Konjugats und des Antikörpers müssen bereitgestellt werden, um im voraus eine Schwellenwert-Konzentration des Zielliganden zu etablieren, unterhalb derer wenig oder kein Signal erzeugt wird. Ein Verfahren besteht darin, ein festgelegtes Probenvolumen mit einer festgelegten Menge des Ligandenanalogon-Konjugats zu mischen, diese Mischung einer festgelegten Menge des Antikörpers zuzugeben und die Endmischung im wesentlichen zu Bedingungen der Gleichgewichtsbindung kommen zu lassen. Ein zweites Verfahren besteht darin, ein festgelegtes Volumen der Probe zu einem festgelegten Volumen des Antikörpers zu geben und dann eine festgelegte Menge des Ligandenanalogon-Konjugats hinzuzufügen. Ein drittes Verfahren besteht darin, eine Probe zu einer Mischung des Ligandenanalogon-Konjugates und des Antikörpers zu geben. Falls der Antikörper und das Ligandenanalogon-Konjugat vor der Zugabe des Liganden aus der Probe haben reagieren können, wird die Disoziierung des Ligandenanalogon-Konjugat:Antikörper-Komplexes der geschwindigkeitsbestimmende Schritt, der die Annäherung an die Bedingungen der Gleichgewichtsbindung beherrscht. Für große Ligandenanalogon-Konjugate kann sich dies als ein inakzeptabel langer Zeitraum für die meisten Anwendungen erweisen.
- Eine praktische Erwägung betrifft die Ausgaben für den Antikörper und für Ligandenanalogon- Konjugat-Reagenzien. Für Liganden, für die es gewünscht wird, daß die Schwellenwert- Konzentration 1 uM oder größer sein soll, können die Kosten der Reagenzien signifikant werden, und daher sollten die Volumen der Reagenzien klein sein, um einen kosteneffektiven Assay-Kit herzustellen. Um sich dieser Erwägung zuzuwenden, besteht eine bevorzugte Methode für die Bereitstellung des Antikörpers und von Ligandenanalogon-Konjugat-Reagenzien darin, sie miteinander zu lyophilisieren, ohne sie miteinander reagieren zu lassen. Solch ein Verfahren kann durchgeführt werden, indem man das korrekte Volumen des ersten Reagenzes in eine Ampulle gibt und es einfriert, gefolgt von der Zufügung des korrekten Volumens des zweiten Reagenzes in die Ampulle, bei schnellem Einfrieren um das Schmelzen des ersten Reagenzes und ein dadurch mögliches Mischen der zwei Reagenzien zu verhindern. Die zwei gefrorenen Reagenzien werden dann co-lyophilisiert. Alternativerweise können der Antikörper und die Ligandenanalogon- Konjugat-Reagenzien als Gesamtmengen separat lyophilisiert und als trockene Zubereitungsformen in den geeigneten Mengen zusammengemischt werden.
- Demzufolge gewährleistet die folgende Erfindung ein Verfahren für einen Ligandenrezeptor- Assay, das ein stufenfunktionähnliches Element in der Funktionskurve der Assay-Response einschließt und gleichzeitig einen Mechanismus für das In-Bezug-Setzen der Position der Stufe mit einer spezifisch ausgewählten Liganden-Konzentration, der Schwellenwert-Konzentration, bereitstellt, die auswählbar ist durch die Einstellung der relativen Werte der Konzentrationen des Ligandenanalogon-Konjugates und des Ligandenrezeptors.
- Die vorliegende Erfindung betrifft weiter vereinfachte Verfahren für quantitative Assays. Ekins et al. zeigen, daß das Verhältnis des freien zu dem gebundenen Liganden eine hyperbolische Funktion der Liganden-Konzentration ist und daß sie sich, wenn das Verhältnis des freien zu dem gebundenen Liganden groß wird, in asymptotischer Weise einer linearen Funktion annähert. Bei der Konstruktion von Assays ist es das Ligandenanalogon-Konjugat, das tatsächlich als eine Reflexion des Status des Liganden gemessen wird. Wenn ein Assay unter der Verwendung von Prinzipien der vorliegenden Erfindung konstruiert wird, ist das Verhältnis des freien zum gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat eine lineare Funktion der Liganden-Konzentration über im wesentlichen den gesamten Bereich des Assays. Die Steigung der Geraden und ihre Achsenabschnitte sind konstante Parameter des Assay-Systems für einen gegebenen Satz von Reagenzien. Fig. 4 zeigt theoretische Diagramme des Quotienten bzw. des Verhältnisses aus freiem und gebundenem Ligandenanalogon-Konjugat als Funktionen der Liganden-Gesamtkonzentration, in denen die Affinität des Rezeptors für den Liganden größer ist als das Inverse der Rezeptor-Konzentration. Falls die Affinitäten des Rezeptors für den Liganden und für das Ligandenanalogon-Konjugat gleich sind, dann sind diese Diagramme dieselben für den Liganden und das Ligandenanalogon-Konjugat. Wie in Fig. 3 beschrieben, beeinflußt die Affinität des Rezeptors für das Ligandenanalogon-Konjugat relativ zu der Affinität des Rezeptors für den Liganden die Steigung der Assay-Response. Dies trifft ebenso für die Response zu, wenn sie als das Verhältnis des freien zu dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugats ausgedrückt wird. Für die hierin beschriebenen Beispiele sind die Affinitäten des Rezeptors für den Liganden und für das Ligandenanalogon-Konjugat gleich. Wenn das Verhältnis der Affinität für das Ligandenanalogon- Konjugat zu dem Inversen der Rezeptor-Konzentration 1000 annähert, nähert sich das Verhältnis des freien zu dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat einer linearen Funktion der Liganden- Konzentration über den gesamten Assay-Bereich an. Wenn sich das Verhältnis des freien zu dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugats als eine Funktion der Liganden-Konzentration aufgetragen wird, werden Diagramme, wie die von Fig. 4 erhalten. In Fig. 5 werden die Diagramme des theoretischen Verhältnisses vom freiem zu gebundenem Ligandenanalogon- Konjugat und eine lineare Regression, die aus denselben theoretischen Daten unter Verwendung von lediglich hohen Verhältnissen erhalten wurde, verglichen. Wenn die Affinität des Rezeptors für das Ligandenanalogon-Konjugat etwa 1000 x größer ist als das Inverse der Rezeptor- Konzentration, wie in Fig. 5 gezeigt, dann ist das Verhältnis des freien zu dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat eine lineare Funktion der Liganden-Konzentration über im wesentlichen den gesamten Bereich des Assays. Der Fehler, der bei der Bestimmung der Konzentration des Liganden unter der Verwendung der linearen Annäherung dieser Erfindung eingeführt wird, kann abgeschätzt werden, indem man die Differenz der aus der theoretischen Response vorausgesagten Liganden-Konzentration und der durch die lineare Näherung bestimmten nimmt, und den Fehler als Prozentsatz der Liganden-Konzentration, wie in Fig. 6 gezeigt, ausdrückt. Wenn die Affinität des Rezeptors für das Ligandenanalogon-Konjugat hinreichend hoch ist, wird der Fehler, wie aus der linearen Annäherung abgeschätzt wird, insignifikant klein, verglichen mit den typischen durch andere Aspekte des Assays eingeführten Fehlern.
- Die Steigung und der Achsenabschnitt der linearen Funktion können für einen gegebenen Satz von Reagenzien bestimmt werden, indem der Assay mit Kalibratoren, die in dem Bereich der Liganden-Konzentrationen, in dem die Funktion strikt linear ist, liegen, durchgeführt wird. Da die Steigung und die Achsenabschnitte konstante Parameter des Assay-Systems sind, müssen ihre Werte nur ein einziges Mal bestimmt werden, z.B. durch den Hersteller. Um die Assay-Response als eine Funktion der Liganden-Konzentration zu bestimmen, muß das Verhältnis von freiem zu gebundenem Ligandenanalogon-Konjugat mit der Assay-Response in Bezug gesetzt werden. Dies kann durch einen einzelnen Kalbrierungspunkt erreicht werden. Dem Fachmann wird erkennen, daß signalerzeugende Elemente in einer Weise verwendet werden können, daß die Assay- Response in direkter Weise proportional zu der Konzentration des freien Ligandenanalogon- Konjugates ist. Der Quotient aus dem freien und dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat für den Kalibrator wird angegeben durch
- Quotient = (Kalibrator - Response) / [(maximale Reponse) - (Kalibrator - Response)]
- wobei das maximale Ansprechen bzw. die maximale Response die Assay-Response ist, wenn das gesamte Ligandenanalogon-Konjugat frei ist. Weil der Quotient aus dem freien und dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat für den Kalibrator eine bekannte Konstante ist, definiert die Kalibrator-Response das maximale Ansprechen gemäß der obigen Gleichung. Dieses maximale Ansprechen wird dann verwendet, um den Quotienten aus dem freien und dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat für die unbekannte Response zu berechnen, der gegeben ist durch
- Quotient = (unbekannte Response) / [(maximale Response) - (unbekannte Response)]
- Dieser Quotient und die lineare Funktion bestimmen die unbekannte Konzentration des Liganden in der Probe. Daher kann ein einzelner Kalibrator verwendet werden, um Proben quantitativ zu untersuchen, wenn ein kompetitiver Assay unter der Verwendung der von der Erfindung gelehrten Prinzipien durchgeführt wird.
- Ein wahlfreies Mittel zur Entfernung von Ligandenrezeptoren aus der Reaktionsmischung kann eingeschlossen sein, wannimmer es nötig oder wünschenswert ist, die Ligandenanalogon- Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplexe in der Reaktionsmischung daran zu hindern, die abschließene Festphase zu kontaktieren. Solch ein wahlfreies Mittel ist nötig, falls z.B. der Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex in der Reaktionsmischung in einem signifikanten Ausmaß während der Inkubation mit der terminale Festphase dissoziiert, so daß der auf der terminale Festphase immobilisierte Ligandenrezeptor dissoziiertes Ligandenanalogon- Konjugat binden könnte, was zu einem detektierbaren Signal sogar bei Abwesenheit von Zielliganden führt. Das wahlfreie Mittel zur Entfernung von Ligandenrezeptoren aus der Reaktionsmischung kann eine jegliche Vorrichtung für das Binden von Ligandenrezeptoren sein, so daß sie aus der Reaktionsmischung, bevor die Reaktionsmischung die terminale Festphase kontaktiert, entfernt werden. Zum Beispiel kann ein solches wahlfreies Mittel aus (Ligandenrezeptor)- Rezeptoren und einer Festphasen-Trägervorrichtung für die Immobilisierung dieser (Ligandenrezeptor)-Rezeptoren bestehen, so daß durch das Binden der Ligandenrezeptoren der Reaktionsmischung an (Ligandenrezeptor)-Rezeptoren, die auf der Festphasen-Trägervorrichtung des wahlfreien Mittels immobilisiert sind, die Ligandenrezeptoren und die mit den Ligandenrezeptor assoziierten Komplexe daran gehindert werden, Ligandenrezeptoren, die an die terminale Festphase gebunden sind, zu kontaktieren. Beispiele für Rezeptoren und Festphasen, die nützlich sein können für die Konstruktion wahlfreier Mittel zur Entfernung von Ligandenrezeptoren, schließen anti-Antikörper-Antikörper, wie Ziege-anti-Maus-IgG oder Ziege-anti-Maus-Fc, Rezeptoren, wie Protein A und Protein G, und Festphasen wie diffundierfähige Perlen, makroporöse Agaroseperlen, Membranen, Filter und poröse Matrices ein. Alternativerweise können auf Festphasen immobilisierte Liganden-Komplement-Rezeptoren verwendet werden, um Ligandenrezeptoren die mit Liganden-Komplement markiert sind, aus der Reaktionsmischung zu entfernen, z.B. Ligandenrezeptoren, die mit Biotin markiert sind, können durch auf Festphasen immobilisiertes Avidin gebunden werden. Ligandenrezeptoren können ebenfalls aus der Reaktionsmischung unter der Verwendung eines (Ligandenrezeptor)-Rezeptors präzipitiert werden. Wenn Perlen als die Festphase verwendet werden, sind die Rezeptoren für die Ligandenrezeptoren normalerweise auf den Perlen immobilisiert, und die Perlen können der Reaktionsmischung als ein Teil der Reaktionsphase zugegeben werden, während der Inkubation der Reaktionsmischung oder nachdem die Reaktionsmischung im wesentlichen die Gleichgewichtsbindung erreicht hat. Eine Zentrifugation oder Filtration kann nötig sein, um die Perlen aus der Reaktionsmischung zu entfernen, bevor sie mit der terminale Festphase kontaktiert wird. Wenn poröse Matrices, einschließlich Membranen und Filtern, als die Festphase verwendet werden, kann die Reaktionsmischung innerhalb der porösen Matrix enthalten sein, oder die Reaktionsmischung kann in die poröse Matrix eingeführt werden, nachdem Bedingungen der Gleichgewichtsbindung im wesentlichen erreicht wurden. In beiden Fällen übt die Matrix die Funktion des Entfernens der Ligandenrezeptoren und ihrer Komplexe, vor dem Kontakt mit der terminale Festphase, aus.
- Die terminale Festphase ist ein fester Träger mit lokalisierten Ligandenrezeptoren für Ziel- Liganden und Ligandenanalogon-Konjugate. Die terminale Festphase der Erfindung kann ein fester Träger sein, auf den an bestimmten Orten Ligandenrezeptoren lokalisiert sind, die fähig sind, Zielliganden und Ligandenanalogon-Konjugat zu binden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung umfaßt der Begriff "lokalisiert" alle physikalischen Mechanismen für die Immobilisierung von Rezeptoren in einer Weise, daß während der Durchführung des Ligandenrezeptor- Assay-Verfahrens im wesentlichen aller Rezeptor an einem vorbestimmten Ort verbleibt. Solche Mechanismen schließen das kovalente Binden, das nicht-kovalente Binden, das chemische Koppeln, das physikalische Einschließen von Partikeln, die funktionell mit Rezeptoren assoziiert sind, und die Adsorption durch hydrophobe/hydrophobe oder hydrophile/hydrophile Wechselwirkungen ein. Die Lokalisierung des Ligandenrezeptors auf dem festen Träger der Festphase der vorliegenden Erfindung kann in einer Anzahl von Arten durchgeführt werden. Der Ligandenrezeptor kann durch die Technik des Einschließens von mit Ligandenrezeptor umkleideten Partikeln durch einen festen Träger mit einer porösen Matrix lokalisiert werden.
- Verfahren für das Einführen dieser Partikel in eine poröse Matrix werden in den US-Patenten Nr. 4 446 232, 4 740 468 und EP-A-200 381 diskutiert. Ein in besonderer Weise bevorzugtes Verfahren zur Lokalisierung des Ligandenrezeptors auf dem festen Träger, wobei der feste Träger eine poröse Matrix ist, umfaßt als Teil die Lokalisation des Ligandenrezeptors auf dem festen Träger durch kovalente oder nicht-kovalente chemische Bindung. Techniken für die Bindung von Ligandenrezeptoren auf einen festen Träger sind im Fachgebiet gut bekannt. Eine Vielzahl fester Träger einschließlich einer porösen Matrix, einer nicht-porösen Matrix, Perlen, Membranen oder Filtern kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche festen Träger können in einer Vielzahl von Testvorrichtungen eingebracht werden, einschließlich Eintauchstäbchen und Vorrichtungen, wie denen, die in den US-Patenten Nr. 4 200 690, 4 246 339, 4 366 241, 4 632 901 und 4 727 019 beschrieben werden. Eine in besonderer Weise bevorzugte Festphase ist eine Membran, die in einer solchen Weise in einer Vorrichtung ausgesetzt ist, daß die Reaktionsmischung, wenn die Reaktionsmischung mit der Membran kontaktiert wird, von ausreichendem Volumen ist, um das Kammervolumen der exponierten Membran vollständig zu füllen, so daß die gesamte Oberfläche der Membran und alle Rezeptor-Bereiche mit der Reaktionsmischung kontaktiert wird. Eine solche Vorrichtung würde ebenfalls ein Mittel, falls nötig, für die Entfernung ungebundener Konjugate von der Membran und ein Mittel zur Kontaktierung der signalerzeugenden Phase mit den an die immobilisierten Rezeptoren auf die Membran gebundenen Konjugaten enthalten.
- Klarerweise würde die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung mit solchen Vorrichtungen einen mit der Fähigkeit ausstatten, auf eine Vielzahl von Analyten in einer einzelnen Probe unter der Verwendung einer einzelnen Testvorrichtung, die Schwellenwert- Immunoassay-Ergebnisse für einen jeden Analyten bereitstellt, zu testen. In der Vielzahl gleichzeitiger Liganden-Assay-Formate kann ein fester Träger, der für jeden zu bestimmenden Liganden wenigstens einen bestimmten Responsebereich, auf dem der Ligandenrezeptor lokalisiert ist, umfaßt, verwendet werden. Darüberhinaus werden die Inkorporation interner negativer Kontrollen, positiver Referenzen und Kalibratoren in bestimmten Responsebereichen zu der durch die Assay-Ergebnisse bereitgestellten Informationen beitragen.
- Darüberhinaus ist die bevorzugte terminale Festphase, wie oben beschrieben, in besonderer Weise nützlich, wo es in hohem Maße wünschenswert ist, gleichzeitig die Anwesenheit von mehr als einem Liganden, der von Interesse ist, zu bestimmen, wie bei der Bestimmung der ursächlichen Agenzien einer toxikologischen Antwort. Dies kann leicht durchgeführt werden durch das Binden von Ligandenrezeptoren innerhalb bestimmter Zonen der Trägermatrix. Ein solches Festphasen- System stellt im wesentlichen ein Panel von Ligandenrezeptoren, die zum Screenen auf Toxine fähig sind, die in einer Flüssigkeitsprobe eines Patienten vorhanden sein können, bereit. Entsprechendermaßen stellt das Muster der Reaktmtät auf dem Fest-Phasen-System, wie durch die Gegenwart gebundener Toxinanalogon-Konjugate bestimmt, eine Indikation der Natur der Toxine, die die toxikologische Antwort hervorrufen, bereit.
- Daher wird in einer der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die Reaktionsmischung, die als Teil Liganden, Ligandenanalogon-Konjugat, Ligandenrezeptor, Liganden: Ligandenrezeptor-Komplex und Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex enthält, mit einer terminale Festphase kontaktiert, auf der Ligandenrezeptor immobilisiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die terminale Festphase aus einer nicht-diffundierbaren Perle, Membran oder einem Filter, auf dem der Rezeptor immobilisiert ist, zusammengesetzt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die terminale Festphase aus einer porösen Matrix, auf der der Ligandenrezeptor immobilisiert ist, zusammengesetzt. Der Ligandenrezeptor kann mittels einer Vielzahl von Verfahren immobilisiert werden, einschließlich von, jedoch nicht beschränkt durch die direkte kovalente chemische Anhaftung, indirekte kovalente chemische Anhaftung, direkte nicht-kovalente chemische Anhaftung, indirekte nicht-kovalente chemische Anhaftung und physikalischen Einschluß. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der auf der terminalen Festphase immobilisierte Ligandenrezeptor fähig zur Bindung mit dem Ligandenanalogon- Konjugat. Darüberhinaus ist in einer bevorzugten Ausführungsform zur Anwendung der vorliegenden Erfindung bei Immunoassays der Ligandenrezeptor ein Antikörper. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Ligandenrezeptor, der auf der terminale Festphase immobilisiert ist, mit dem Ligandenrezeptor identisch, der in der oben erwähnten Reaktionsphase, die zuerst die Probe kontaktiert, eingeschlossen ist. In einer anderen, besonders bevorzugten Ausführungsform für die Anwendung der vorliegenden Erfindung bei Immunoassays ist der Ligandenrezeptor ein monoklonaler Antikörper.
- Die signalerzeugende Phase ist eine Phase, die das signalerzeugende Element befähigt, ein detektierbares Signal zu erzeugen. Elemente der signalerzeugenden Phase können in einer jeglichen oder allen folgenden Komponenten des Assays existieren, der Reaktionsphase, dem wahlfreien Mittel, der terminalen Festphase und der signalerzeugenden Phase. Bevorzugt für die Verwendung als Komponenten der signalerzeugenden Phase werden Materialien, die der signalerzeugenden Phase ermöglichen, ein Signal zu erzeugen, das durch nicht-instrumentelle Mittel detektierbar ist. In besonderer Weise bevorzugt für die Verwendung als Komponenten in der signalerzeugenden Phase werden Materialien, die dem signalerzeugenden Element ermöglichen, ein Signal, das durch visuelle Mittel detektierbar ist, zu erzeugen. Der Fachmann wird gut erkennen, daß eine Vielzahl von Materialien verwendet werden kann, um dieses Ziel zu erreichen, als Beispiel wird das folgende geboten: eine Enzymsubstrat-Lösung, z.B. 3-Indoxylphosphat, das, wenn es mit der terminalen Festphase, die das gebundene Enzym enthält, kontaktiert wird, durch das Enzym, z.B. alkalische Phosphatase des Kalbsdarms (E.C. 3.1.3.1), zu einem sichtbaren, blaugefärbten Reaktionsprodukt, Indigo, umgesetzt wird. Ein anderes Beispiel für eine signalerzeugende Phase umfaßt Gassenbildungs-Verfahren (channeling), wie in dem US- Patent Nr. 4 233 402 beschrieben, wenn sie in Verbindung mit einer terminale Festphase, wie in dem US-Patent Nr. 4 391 904 beschrieben, verwendet werden. Solche Verfahren beseitigen im wesentlichen die Notwendigkeit, ungebundene Konjugate mittels eines Waschmechanismuses zu entfernen; sie werden als die signalerzeugende Phase der Erfindung bevorzugt. Wenn Sol-Partikel, wie kolloidales Gold, als das signalerzeugende Element verwendet werden, ist ein einfaches Waschen der terminalen Festphase im allgemeinen hinreichend, um das Assay-Signal zu enthüllen, so daß eine signalerzeugende Phase unnötig ist.
- Zu Beginn des Ligandenrezeptor-Assays der vorliegenden Erfindung führt man eine fluide Probe, die erwartetermaßen einen Zielliganden für die Reaktionsphase des Ligandenanalogon-Konjugates und des Ligandenrezeptors enthält, ein. Zwischen dem Ligandenanalogon-Konjugat und dem Zielliganden tritt eine Kompetition um die beschränkte Anzahl von Bindungsstellen, die auf dem Ligandenrezeptor verfügbar sind, auf. Die relativen Mengen des Ligandenanalogon-Konjugates und des Ligandenrezeptors sind derart, daß in Abwesenheit des Zielliganden, und nach dem Erreichen von im wesentlichen Gleichgewichtsbindung, im wesentlichen alle verfügbaren Ligandenanaloga auf dem Ligandenanalogon-Konjugat gebunden sind. Ein Fachmann wird gut erkennen, daß für festgelegte Mengen des Ligandenanalogon-Konjugates und des Ligandenrezeptors, das Volumen der Probe variiert werden kann, um die Schwellenwert-Konzentration zu variieren. Signifikante Mengen ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugates sind nicht vorhanden, bis die Summe der effektiven Konzentration des Ligandenanalogons auf dem Ligandenanalogon-Konjugat und die Konzentration des Zielliganden die Konzentration verfügbarer Ligandenrezeptor-Bindungsstellen zu übersteigen beginnt. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "ungebunden" ein Konjugat mit wenigstens einem verfügbaren Ligandenanalogon, das fähig zur Bindung an einen Ligandenrezeptor ist. Das Ligandenanalogon-Konjugat kann mehr als ein Ligandenanalogon haben und kann an sich gebundenen Ligandenrezeptor haben, jedoch kann es, solange es wenigstens ein zusätzliches verfügbares Ligandenanalogon hat, das fähig zur Bindung an einen Ligandenrezeptor ist, als "ungebunden" bezeichnet werden. "Gebundene" Ligandenanalogon-Konjugate sind diejenigen, die keinerlei Ligandenanaloga haben, die zur Bindung verfügbar sind. Es versteht sich, daß die effektive Konzentration des Ligandenanalogon- Konjugates von der Anzahl von Antikörper-Bindungsstellen abhängt, die an ein einzelnes Konjugatmolekül gebunden werden können. Daher werden stark derivatisierte Konjugate, die viele Ligandenanaloga enthalten, höhere Ligandenanalogon-Konzentrationen haben als weniger stark derivatisierte Konjugate. Die Konzentration des Liganden, die zu dem ersten signifikanten Anstieg des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugates führt, was eine detektierbare Assay- Response oberhalb des Hintergrundrauschenes ergibt, ist die Schwellenwert-Konzentration. Der Fachmann wird erkennen, daß das Hintergrundrauschen des Assays abhängig ist von dem Assay- Verfahren und der Natur des Ligandenanalogon-Konjugats und der signalerzeugenden Phase. Es ist im allgemeinen wünschenswert, daß das Hintergrundrauschen geringer ist als 1% der maximalen Response. Wenn die Menge des Liganden die Schwellenwert-Konzentration übersteigt, steigt ebenfalls die Menge des nicht an den Ligandenrezeptor gebundenen Ligandenanalogon-Konjugates. Der Anstieg der Menge ungebundenen Ligandenanalogons auf dem Ligandenanalogon-Konjugat hält an, bis die Menge des Zielliganden bis auf einen solchen Wert angestiegen ist, daß im wesentlichen das gesamte Ligandenanalogon-Konjugat in einem Zustand existiert, in dem es ungebunden an Ligandenrezeptor vorliegt.
- In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Ligandenrezeptor in der Reaktionsphase nicht undiffundierfähig immobilisiert und ist daher zu einer Diffusionsbewegung während der Kompetitions-Reaktion, um Ligandenrezeptor-Bindungsstellen, die zwischen dem Liganden und dem Ligandenanalogon-Konjugat auftreten, in der Lage. In einer in besonderem Maße bevorzugten Ausführungsform nehmen der Zielligand und das Ligandenanalogon-Konjugat an einer Kompetition um Bindungsstellen auf den diffusiblen Ligandenrezeptor teil. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für einen Immunoassay bereit, in dem der Ligandenrezeptor ein monoklonaler Antkörper ist, der frei ist, in der Lösung zu diffundieren. Die Reaktionsmischung enthält als Teil Ligand, Ligandenanalogon-Konjugat, Ligandenrezeptor, Ligand:Ligandenrezeptor-Komplex und Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex. Nach der Kompetitionsreaktion wird die Reaktionsmischung mit einem wahlfreien Mittel, das in funktioneller Weise mit einem (Ligandenrezeptor)-Rezeptor assoziiert ist, kontaktiert. Das mit dem Liganden (Ligandenrezeptor)-Rezeptor assoziierte wahlfreie Mittel bindet alle Spezies, die mit dem Ligandenrezeptor assoziiert sind. Entsprechenderweise kann das mit dem (Ligandenrezeptor)-Rezeptor assoziierte wahlfreie Mittel an den Ligandenrezeptor, den Ligand:Ligandenrezeptor-Komplex und den Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex aus der Reaktionsmischung binden. Die Entfernung von mit dem Ligandenrezeptor assozierten Komponenten aus der Reaktionsmischung durch das wahlfreie Mittel erlaubt nur dem ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugat, mit dem auf der terminale Festphase immobilisierten Ligandenrezeptor kontaktiert zu werden. Daher verweist, wenn ein wahlfreies Mittel verwendet wird, um den Ligandenrezeptor und an den Ligandenrezeptor gebundene Gruppen aus der Reaktionsmischung zu entfernen, das ungebundene Ligandenanalogon-Konjugat in der Reaktionsmischung auf das Ligandenanalogon-Konjugat, das nicht an den Ligandenrezeptor gebunden ist. Falls nur ein Ligand durch ein Assay-Verfahren bestimmt wird, das ein wahlfreies Mittel verwendet, um den Rezeptor aus der Reaktionsmischung zu entfernen, dann kann das Signal aufgrund des freien Ligandenanalogon-Konjugates in der Reaktionsmischung direkt ohne die Notwendigkeit einer terminale Festphase, bestimmt werden.
- Die Reaktionsmischung wird dann mit der terminale Festphase, auf der der Ligandenrezeptor immobilisiert ist, kontaktiert. Entsprechendermaßen stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, worin der Ligandenrezeptor auf einer Festphase immobilisiert ist. Bevorzugte Festphase für die Verwendung zur Immobilisierung des Rezeptors schließen diffundierfähige Perlen, Membranen und Filter ein. In besonderer Weise bevorzugt für die Verwendung als Festphase zur Immobilisierung des Rezeptors ist eine poröse Matrix. Der auf der terminale Festphase immobilisierte Ligandenrezeptor kontaktiert die Komponenten der Reaktionsmischung, die teils aus ungebundenen Liganden und ungebundenem Ligandenanalogon-Konjugat bestehen. Falls die Reaktionsmischung nicht mit einem wahlfreien Mittel kontaktiert wurde, kann die Reaktionsmischung ebenfalls unkomplexierten Ligandenrezeptor, Ligand:Ligandenrezeptor-Komplex und Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex enthalten. Falls die Reaktionsmischung nicht mit einem wahlfreien Mittel kontaktiert wurde, verweist ungebundenes Ligandenanalogon- Konjugat auf Ligandenanalogon-Konjugate, die fähig zur Bindung an immobilisierte Ligandenrezeptoren auf der terminalen Festphase sind, obwohl die Ligandenrezeptoren aus der Reaktionsmischung bereits an einige Ligandenanaloga auf dem Ligandenanalogon-Konjugat gebunden haben können. Eine Kompetition tritt zwischen einem jeglichen ungebundenen Liganden und einem jeglichen ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugat um verfügbare Bindungsstellen auf dem Ligandenrezeptor, der auf der terminalen Festphase immobilisiert ist, auf. Nachdem die Bindungsreaktionen fortschreiten gelassen wurden, können die terminale Festphase und die Reaktionsmischung separiert werden. Ein jegliches Ligandenanalogon-Konjugat, das nicht auf dem an der terminalen Festphase immobilisierten Ligandenrezeptor gebunden hat, wird, falls nötig, durch einen Trennungsschritt entfernt. Das mit dem auf der terminalen Festphase immobilisierten Ligandenrezeptor komplexierte Ligandenanalogon-Konjugat wird mit einer signalerzeugenden Phase kontaktiert, was dem signalerzeugenden Element des komplexierten Ligandenanalogon-Konjugates ermöglicht, ein detektierbares Signal zu entwickeln. Die Interpretation des Signals ist dergestalt, daß die Abwesenheit eines detektierbaren Signals überhalb des Hintergrundrauschenes des Assays anzeigt, daß der Zielligand in einer Konzentration in der Probe vorhanden ist, die geringer ist als die Schwellenwert Konzentration, während das Vorhandensein eines Signals, das oberhalb des Storgerausches des Assays detektierbar ist, anzeigt, daß der Zielligand entweder in einer Konzentration, die im wesentlichen gleich zu oder in einer Konzentration, die großer ist als die Schwellenwert-Konzentration, vorhanden ist.
- Die Reaktionsmischung der vorliegenden Erfindung sollte vor dem Kontakt mit der terminalen Festphase im wesentlichen zum Gleichgewicht kommen gelassen werden, so daß in Gegenwart von einem Zielliganden in einer geringeren als der Schwellenwert-Konzentration das Ligandenanalogon-Konjugat im wesentlichen komplett durch den Ligandenrezeptor in der Reaktionsmischung gebunden wird und nicht an den immobilisierten Ligandenrezeptor auf der terminalen Festphase binden kann. Um zu bestimmen, daß sich die Reaktionsmischung an das Gleichgewicht in korrekter Weise angenähert hat und nachfolgende Ergebnisse des Assays gültig sind, ist der Einschluß eines negativen Kontroll-Liganden-Konjugates eine bevorzugte Methode zur Ausübung dieser Erfindung. Der negative Kontroll-Ligand ist ein Ligand, der normalerweise nicht in Proben gefunden wird. Die Kombination des negativen Kontroll-Liganden-Konjugates, des Ligandenanalogon-Konjugates des Ligandenrezeptors und des (negativen Kontroll- Liganden)-Rezeptors wird in einer Weise bereitgestellt, daß, falls der Assay richtig durchgeführt wird, keine Response an dem Ort des (negativen Kontroll-Liganden)-Rezeptors auf der terminalen Festphase beobachtet wird, weil die Reaktionsmischung im wesentlichen Gleichgewichtsbindungs- Bedingungen erreicht hat, wobei im wesentlichen das gesamte negative Kontroll-Liganden- Konjugat durch (negative Kontroll-Liganden)-Rezeptoren in der Reaktionsmischung gebunden ist. Falls der Reaktionsmischung unzureichend Zeit gelassen wird, um das Gleichgewicht im wesentlichen zu erreichen oder falls die signalerzeugende Phase nicht korrekt durchgeführt wird, können Antworten an den ligandenspezifischen Testorten beobachtet werden, die falscherweise die Gegenwart von Zielliganden in größeren Konzentrationen als denen der Schwellenwert- Konzentrationen anzeigen. Unter diesen Bedingungen würde der Ort der negativen Kontrolle ebenfalls eine beobachtbare Response zeigen, und würde anzeigen, daß der Test ungültig ist. Solch eine negative Kontrolle stellt die Garantie bereit, daß das Protokoll des Assays in korrekter Weise durchgeführt wurde, und bestätigt die Gültigkeit irgendwelcher positiver Ergebnisse. Die Fachleute werden gut erkennen, daß die relativen und absoluten Konzentrationen des negativen Kontroll-Liganden-Konjugates und des negativen Kontroll-Ligandenrezeptors eingestellt werden können, um die Inkubationszeit, die nötig ist, um im wesentlichen Gleichgewichtsbindungs- Bedingungen zu erreichen, zu regulieren. Die Zeit bis zum Gleichgewicht kann eingestellt werden, um gleich der Zeit zu sein, die nötig ist, um für das langsamste Ligandenrezeptor-Paar in dem Assay das Gleichgewicht zu erreichen. Liganden, die als negative Kontroll-Liganden nützlich sind, können aus derselben allgemeinen Klasse von Liganden, die normalerweise nicht in Proben, die von Interesse sind, vorhanden sind, gewählt werden (d.h. Liganden-Komplemente), aber die verwendet werden können, um Liganden-Komplement-Konjugate und Liganden-Komplement- Rezeptoren, die die geeignete Affinität für den Liganden zeigen, zu erzeugen. Solche Liganden schließen z.B. Fluorescein ein.
- Zur Sicherstellung, daß alle Responsebereiche auf der terminalen Festphase durch die Reaktionsmischung kontaktiert wurden, ist der Einschluß eines positiven Kontroll-Liganden-Konjugates in der Reaktionsmischung ein bevorzugtes Verfahren bei der Ausführung der Erfindung. Ein positiver Kontroll-Ligandenrezeptor wird in einem bestimmten Bereich der terminalen Festphase in einer Weise immobilisiert, daß, wenn die Reaktionsmischung mit der terminalen Festphase kontaktiert wird, das positive Kontroll-Liganden-Konjugat an seinen jeweiligen Rezeptor bindet und sich ein detektierbares Signal in dem positiven Kontrollbereich auf der terminalen Festphase ergibt. Die Position und die Form des positiven Kontrollbereichs auf der terminalen Festphase in einer Weise selektiert werden, daß alle anderen einzelnen Rezeptorzonen auf der terminalen Festphase mit der Reaktionsmischung kontaktiert werden müssen, falls der positive Kontrollbereich mit der Reaktionsmischung kontaktiert wird. Falls zum Beispiel die Reaktionsmischung mit einer terminalen Festphase an einem Ende eines rechteckigen Streifens kontaktiert wird, kann der positive Kontollbereich auf dem anderen Ende des Streifens plaziert werden, wobei alle einzelnen Responsebereiche zwischen den beiden Enden des Streifens liegen. Ein detektierbares Ergebnis in dem positiven Kontrollbereich zeigt ferner an, daß das signalerzeugende Element und die signalerzeugende Phase richtig funktionieren, um Assay-Responsen zu erzeugen, falls freie Konjugate in der Reaktionsmischung an die feste Phase binden. Liganden, die nützlich als der positive Kontroll-Ligand sind, können aus derselben Klasse von Liganden (d.h. Liganden- Komplemente) wie negative Kontroll-Liganden ausgewählt werden.
- Ein negatives Kontroll-Liganden-Konjugat, ein negativer Kontroll-Ligandenrezeptor, ein positives Kontroll-Liganden-Konjugat und ein positiver Kontroll-Ligandenrezeptor können verwendet werden, um zu bestimmen, ob die relativen absoluten Beträge der Ligandenanalogon-Konjugate und der Ligandenanalogon-Rezeptoren in der Reaktionsmischung nicht in größerem Maße irrtümlich bereitgestellt wurden. Im allgemeinen werden alle Ligandenanalogon-Konjugate, einschließlich der negativen und positiven Kontroll-Liganden-Konjugate, als eine Mischung bereitgestellt. Ähnlicherweise werden alle Ligandenanalogon-Rezeptoren, einschließlich der negativen und positiven Kontroll-Ligandenrezeptoren, als eine Mischung bereitgestellt. Die relativen und absoluten Mengen eines jeden Ligandenanalogon-Konjugates und Ligandenanalogon-Rezeptor-Paares werden ausgewählt, um eine Schwellenwert-Konzentration zur Bestimmung eines jeden Liganden in dem Assay bereitzustellen. Falls ein Irrtum bei der Füllung der Reagenzien als ein isoliertes Ereignis auftritt, das nicht einen wesentlichen Teil einer Herstellungscharge betrifft, ist es möglich, daß der Irrtum nicht durch Testverfahren für die statistische Qualitätskontrolle entdeckt wird, würde jedoch zu einem Assay führen, der ein falsch- postives oder falsch-negatives Ergebnis hervorbringen könnte. Normalerweise können solche Probleme nur durch ein 100%iges Testen des hergestellten Produktes durch zerstörerische Mittel aufgedeckt werden. Dies ist in klarer Weise eine inakzeptable Lösung für das Problem. Die vorliegende Erfindung verwendet positive und negative Kontrollen, so daß in einem jeden Assay die korrekte Formulierung des Reagenzes entweder bestätigt und der Assay für gültig erklärt wird, oder gezeigt, daß sie falsch ist und der Assay für ungültig erklärt wird. Um diese Ziele zu erreichen, können die negativen Kontroll-Liganden-Konjugate so eingestellt werden, daß der negative Kontroll-Ligandenrezeptor in leichtem Überschuß vorhanden ist, z.B. 10%, über die Menge hinaus, die nötig ist, um das gesamte negative Kontroll-Liganden-Konjugat zu binden. Ähnlicherweise werden das positive Kontroll-Liganden-Konjugat und der positive Kontroll- Ligandenrezeptor in einer Weise bereitgestellt, daß das positive Kontroll-Liganden-Konjugat in leichtem Überschuß vorhanden ist, z.B. 10%, über die Menge hinaus, die durch den positiven Ligandenrezeptor gebunden werden kann. Falls das negative Kontroll-Liganden-Konjugat irrtümlicherweise in einem größeren Überschuß als 10% seines angepeilten Betrages bereitgestellt wird, dann würden alle anderen Ligandenanalogon-Konjugate in ähnlichem Überschuß vorhanden sein, und die negative Kontrollzone auf der terminalen Festphase würde den Fehler signalisieren und das Ergebnis für ungültig erklären. Ähnlicherweise würde, falls der positive Kontroll- Ligandenrezeptor irrtümlicherweise in einem größeren Überschuß als 10% seines angepeilten Betrages bereitgestellt würde, alle anderen Ligandenrezeptoren in ähnlichem Überschuß vorhanden sein, und das sich ergebende Fehlen einer Response in der positiven Kontrollzone auf der terminalen Festphase würde den Fehler signalisieren und das Ergebnis für ungültig erklären. Solche Kontrollmechanismen stellen ein Mittel bereit, um jeden Assay auf die korrekte Formulierung der Reagenzien zu testen.
- Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung verwendet eine Schwellenwert-Konzentration, um den unteren Grenzwert eines Konzentrationsbereiches für einen Zielliganden zu definieren, und einen Referenzpunkt, um den oberen Grenzwert dieses Konzentrationsbereiches zu bestimmen. Die Referenz-Response findet an einem Ort, der unterschiedlich von dem Ort der Test-Response ist, statt und wird weiter ausgewählt, um die durch eine Zielliganden-Konzentration erzeugte Response zu repräsentieren, die dem oberen Grenzwert des Konzentrationsbereiches entspricht. Die Response an dem Referenzort kann durch ein Ligandenrezeptor-Paar bereitgestellt werden, in dem der Referenz-Rezeptor an dem Referenzort immobilisiert ist, und der Referenz-Ligand mit einem signalerzeugenden Element markiert ist, um die Detektion zu gestatten, z.B. unter Verwendung eines Referenz-Liganden-Konjugates. Liganden, die nützlich für solche Zwecke sind, sind Liganden, die normalerweise nicht in den Proben, die von Interesse sind, gefunden werden, d.h. Liganden-Komplemente, so daß keine Kompetition zwischen dem Referenz-Liganden- Konjugat und dem Zielliganden, um entweder Referenz-Rezeptor- oder Ligandenrezeptor- Bindungsstellen auftritt. Liganden, wie Fluorescein, sind als Referenz-Liganden für diesen Zweck nützlich, und Fluorescein-markierte Enzyme sind nützlich als Referenz-Liganden-Konjugate in Verbindung mit anti-Fluorescein-Antikörpern als Referenz-Rezeptoren für den Zweck, eine Referenz-Response bereitzustellen und zu bestimmen, ob die Assay-Response an dem Testort einer Liganden-Konzentration entspricht, die geringer oder im wesentlichen gleich oder größer als der obere Grenzwert des Konzentrationsbereiches ist. Alternativerweise könnte das signalerzeugende Element selbst als das Referenz-Liganden-Konjugat funktionieren, z.B. das Enzym könnte mit einem anti-Enzym-Antikörper als der Referenz-Rezeptor verwendet werden. Da die Steigung einer Funktion der Assay-Response durch das Einstellen des Ausmaßes der Derivatisierung des Ligandenanalogon-Konjugates ausgewählt werden kann, kann die Funktion der Assay-Response optimiert werden, um den gesamten dynamischen Bereich der Funktion der Assay-Response über den ausgewählten Bereich der Zielliganden-Konzentrationen hinaus auszudehnen. Dieser Weg gewährleistet die maximale Möglichkeit, festzustellen, ob die Konzentration des Zielliganden oberhalb, unterhalb oder innerhalb des ausgewählten Konzentrationsbereiches liegt. Keine Signalerzeugung an dem Testort zeigt an, daß die Probe weniger von dem Zielliganden als der untere Grenzwert des Konzentrationsbereiches enthält. Eine detektierbare Signalentwicklung, die geringer ist als die Referenz-Reponse, zeigt an, daß die Probe den Zielliganden in einer Konzentration, die innerhalb des ausgewählten Konzentrationsbereiches liegt, enthält. Assay-Responsen, die im wesentlichen gleich oder größer als die Referenz-Response sind, zeigen an, ob die Probe den Zielliganden in Konzentrationen, die oberhalb des ausgewählten Konzentrationsbereiches liegen, enthält. Die Verwendung von Referenzen, die vorausbestimmte Konzentrationen von Liganden in kompetitiven Assays repräsentieren, wurden in dem US-Patent Nr. 4 540 659 und der EP-A-203 238 beschrieben. Jedoch würden diese Anwendungen zwei solche Referenzpunkte erfordern, um einen Konzentrationsbereich zu bestimmen. Notwendigerweise komprimieren diese Verfahren den dynamischen Bereich der Assay-Response, den man als Bereich der ausgewählten Liganden-Konzentrationen verwenden könnte. Aus diesem Grund ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Verwendung solcher Referenzen eine signifikante Verbesserung zur Durchführung solcher kompetitiver Ligandenrezeptor-Assays, in denen die Konzentration des Liganden, bezogen auf zwei vorausbestimmte Liganden-Konzentrationen, bestimmt wird. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist von besonderer Nützlichkeit bei der Bestimmung von der Liganden Konzentration, bezogen auf einen ausgewählten Konzentrationsbereich.
- Ein bevorzugtes Verfahren der Erfindung verwendet einen einzigen Kalibrierungspunkt, um einen Zielliganden in einem Konzentrationsbereich quantitativ zu testen. Der einzige Kalibrierungspunkt kann entweder als eine externe Kalibrator-Response aus einem separaten Test, der zur selben Zeit wie der Test der Probe durchgeführt wird, oder als eine Referenz-Response an einem Ort, der verschieden von dem Ort der Test-Response ist, bereitgestellt werden. Die externe Kalibrator- Response oder die Referenz-Response wird weiter ausgewählt, um die von einer spezifischen Zielliganden-Konzentration mit einem Quotienten aus dem freien und dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat, der für einen gegebenen Satz Assay-Reagenzien eine Konstante ist, erzeugte Response, zu repräsentieren. Das maximale Ansprechen bzw. die maximale Response des Assays wird bestimmt durch die Kalibrator- oder die Referenz-Response gemäß der Beziehung
- Quotient = (Kalibrator - Response) / [(maximale Response) - (Kalibrator - Response)]
- Die maximale Response wird verwendet, um den Quotienten aus dem freien unnd dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat aus der Assay-Response für die unbekannte Liganden- Konzentration in der Probe unter der Verwendung der Beziehung
- Quotient = (unbekannte Response) / [(maximale Response) - (unbekannte Response)]
- zu bestimmen. Der der unbekannten Liganden-Konzentration entsprechende Quotient aus dem freien und dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat bestimmt zusammen, mit der bekannten Steigung und dem Achsenabschnitt des Verhältnisses des freien zu dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat, als eine Funktion der Konzentration des Liganden, die unbekannte Konzentration des Liganden in der Probe.
- Um die Response bzw. die oben beschriebenen Antworten zu verwenden, um die Verhältnisse des freien zu dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat zu bestimmen, muß die Assay-Response direkt proportional zu der Konzentration des freien Ligandenanalogon-Konjugates in der Reaktionsmischung sein, wenn die Bindungsreaktionen im wesentlichen die Gleichgewichtsbedingungen erreicht haben. Falls das freie Ligandenanalogon-Konjugat in der Reaktionsmischung direkt getestet wird, z.B. durch die Verwendung eines wahlfreien Mittels, um das gebundene Ligandenanalogon-Konjugat zu entfernen, unter anschließendem Messen des verbleibenden freien Ligandenanalogon-Konjugates, ist das einzige weitere Erfordernis, daß das signalerzeugende Element zusammen mit der signalerzeugenden Phase eine Response ergibt, die der Konzentration des freien Ligandenanalogon-Konjugates, das getestet wird, proportional ist. Die Wahl eines Enzyms als das signalerzeugende Element und einer Substratlösung, die ein Produkt erzeugt, das direkt proportional zu der Menge des als signalerzeugende Phase vorhandenen Enzyms ist, werden zur Erzeugung eines Signals in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die Verwendung kolloidalen Goldes als signalerzeugendes Element, für das keine signalerzeugende Phase nötig ist. Falls das freie Ligandenanalogon-Konjugat durch das Kontaktieren der Reaktionsmischung mit einer terminalen Festphase getestet wird, dann muß der auf der Festphase immobilisierte Ligandenrezeptor an die Menge des Ligandenanalogon- Konjugates binden, das direkt proportional zu der Menge des freien Ligandenanalogon- Konjugates ist, das in der Reaktionsmischung vorhanden ist. Zusätzlich muß das signalerzeugende Element zusammen mit der signalerzeugenden Phase ein Signal bereitstellen, das direkt proportional zu der Menge des Ligandenanalogon-Konjugates ist, das an die terminale Festphase gebunden ist. Wenn der einzige Kalibrierungspunkt durch einen externen Kalibrator, der als ein separater Test läuft, bereitgestellt wird, wird eine Kalibrierungsprobe, die eine bekannte Konzentration des Zielliganden enthält, zusätzlich zu der Steigung und dem Achsenabschnitt des Verhältnisses des freien zum gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat als eine Funktion der Liganden-Konzentration, bereitgestellt. Wenn der einzige Kalibrierungspunkt durch eine Referenz-Response auf einer terminalen Festphase bereitgestellt wird, kann die Response an dem Referenzort durch den zuvor für den Referenzpunkt erörterten Mechanismus bereitgestellt werden. Die Response muß die für eine bekannte Konzentration des Liganden erhaltenen Test- Response repräsentieren und muß einen bekannten Quotienten aus dem freien und dem gebundenen Ligandenanalogon-Konjugat mit sich verknüpft haben, so daß eine maximale Assay- Response bestimmt wird. Die Test-Response auf der terminalen Festphase muß proportional zu der Konzentration des freien Ligandenanalogon-Konjugates in der Reaktionsmischung, wie oben beschrieben, sein. Der Fachmann wird gut erkennen, daß der in dem Testbereich auf der terminalen Festphase immobilisierte Ligandenrezeptor im Überschuß über die Kombination des Liganden und des Ligandenanalogon-Konjugates, die mit dem Testbereich kontaktiert werden, vorhanden sein muß, so daß die Menge des Ligandenanalogon-Konjugates, das an seinen Testbereich gebunden hat, direkt proportional zu der Konzentration des freien Ligandenanalogon- Konjugates in der Reaktionsmischung ist. Diese Verfahren stellen vereinfachte Methoden zur Quantifizierung von Liganden in Proben bereit, die keine extensive externe Kalibrierung erfordern, um die Assay-Response zu definieren, oder eine teure Geräteausstattung, um die Variablen zu kontrollieren, die die Assay-Response beeinflussen, so daß eine weniger häufige Kalibrierung notwendig ist.
- Die lineare Beziehung zwischen dem Verhältnis des freien Liganden zu dem gebundenen Liganden in der Reaktionsmischung stellt die Basis für einen visuellen, quantitativen Assay bereit. Bei Konzentrationen des Liganden oberhalb der Schwellenwert-Konzentration ist die Konzentration des gebundenen Liganden im wesentlichen konstant, so daß die Konzentration des freien Liganden im wesentlichen eine lineare Funktion der Liganden-Konzentration oberhalb der Schwellenwert-Konzentration ist. In einer Reaktionsmischung ist, falls die Konzentration des Liganden in der Probe oberhalb der Schwellenwert-Konzentration ist, die Summe der Konzentrationen des freien Liganden und des freien Ligandenanalogon-Konjugates eine lineare Funktion der Liganden-Konzentration. Wenn solch eine Reaktionsmischung mit einer immunochromatographischen Vorrichtung, wie der in dem US-Patent Nr. 4 435 504 beschriebenen, kontaktiert wird, binden der freie Ligand und das freie Ligandenanalogon-Konjugat an die immobilisierten Rezeptoren auf der terminalen Festphase. Der Wanderungsabstand, über welchen das Ligandenanlogon-Konjugat an die Festphase gebunden wird, ist direkt proportional zu der Konzentration des Liganden in der Probe, falls der Rezeptor fähig ist zur Bindung, sowohl des Liganden als auch des Ligandenanalogon-Konjugates. Unter der Voraussetzung, daß die Konzentration des Liganden oberhalb der Schwellenwert-Konzentration ist, ist der Wanderungsabstand des Ligandenanalogon-Konjugates, das an die terminale Festphase gebunden ist, gleich Null. Daher kann die Konzentration des Liganden, die als erste eine visuelle Response entwickelt, ausgewählt werden, die Schwellenwert-Konzentration zu sein, und der Wanderungsabstand der farbigen Response ist direkt proportional zu der Konzentration des Liganden in der Probe, die die Schwellenwert-Konzentration übersteigt, so daß die Kalibrierung des Assays ohne die Notwendigkeit externer Kalibratoren oder Instrumente erreicht wird. Der Assay erlaubt die Quantifizierung von Liganden in Proben bei Konzentrationen, bei denen die Konzentration des Ligandenanalogon-Konjugates größer ist als die klinisch signifikante Konzentration des Liganden in der Probe und vermeidet dadurch die Beschränkungen des Stands der Technik.
- In einer anderen Ausführungsform des Ligandenrezeptor-Assays der Erfindung wird das Ligandenanalogon-Konjugat durch den Einschluß eines spezialisierten Liganden erhöht, der als Liganden-Komplement bezeichnet wird. Das Liganden-Komplement ist ein Ligand, der normalerweise nicht in den zu testenden Proben gefunden wird. Der Einschluß eines Liganden- Komplements schafft ein Konjugat, bei dem sowohl ein Ligandenanalogon als auch ein Liganden- Komplement an das signalerzeugende Element gebunden sind. Eine fluide Probe wird mit einer Reaktionsphase kontaktiert, die ein komplementäres Reaktionspaar des Ligandenanalogon- Liganden-Komplement-Konjugates und des Ligandenrezeptors für den Zielliganden, der von Interesse ist, hat. Der Ligandenrezeptor kann ein auf einer Festphase immobilisierter Antikörper sein. Der Zielligand und das Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat kompetitieren um Bindungsstellen des auf der Festphase immobilisierten Ligandenrezeptors. Falls der Zielligand in einer geringeren als der Schwellenwert-Konzentration vorhanden ist, ist im wesentlichen das gesamte Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat an den Ligandenrezeptor gebunden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Ligandenrezeptor ein monoklonaler Antikörper, der frei durch die Reaktionsmischung diffundieren kann. Wenn der Ligandenrezeptor frei in der Reaktionsmischung diffundieren kann, wird ein wahlfreies Mittel zur Entfernung von Ligandenrezeptoren aus der Reaktionsmischung benötigt, bevor die terminale Festphase, die den immobilisierten Liganden-Komplement-Rezeptor enthält, kontaktiert wird. Der Einschluß eines Liganden-Komplements in das Ligandenanalogon-Konjugat eliminiert das mögliche Problem eines "Haken"-Effekts.
- In bestimmten Assayformaten kann ein Hakeneffekt auftreten, wenn die verbleibende Menge des ungebundenen Liganden, der die terminale Festphase kontaktiert, so groß ist, daß sie wirksam mit dem ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugat um Bindungsstellen auf dem immobilisierten Ligandenrezeptor kompetitiert. Wenn die Kompetition stark das Binden des Zielliganden favorisiert, dann kann das durch jegliche Ligandenanalogon-Konjugate:Ligandenrezeptor- Komplexe, die auf der terminalen Festphase gebildet werden, erzeugte Signal so klein sein, daß es nicht detektierbar ist. Der Assay würde dann inkorrekterweise so interpretiert werden, als würde er anzeigen, daß die Konzentration des Zielliganden in der Probe unterhalb der Schwellenwert- Konzentration wäre. In der vorliegenden Erfindung unter Verwendung einer terminalen Festphase mit einem immobilisierten Rezeptor, der gegen einen Komplement-Liganden gerichtet ist (d.h. Liganden-Komplement-Rezeptor) kann diese Beschränkung überwinden. Wenn die Reaktionsmischung in Kontakt mit einer terminalen Festphase mit einem immobilisierten Liganden- Komplement-Rezeptor gebracht wird, tritt keine Kompetition zwischen den verbleibenden Zielliganden und dem Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat um Bindungsstellen auf dem immobilisierten Liganden-Komplement-Rezeptor auf. Unter diesen Bedingungen wird das Binden des Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugats sowohl maximal als auch unbeeinflußt durch restlichen Zielliganden sein. Ein Haken-Effekt wird nicht auftreten, und die Konzentration des Zielliganden kann korrekt interpretiert werden. Daher zeigt die Abwesenheit eines detektierbaren Signals, die auf den Kontakt der terminalen Festphase mit einer signalerzeugenden Phase folgt, daß der Ligand in einer geringeren Konzentration als der Schwellenwert-Konzentration vorhanden ist, während der Anwesenheit eines detektierbaren Signals die Anwesenheit des Liganden in einer Konzentration, die im wesentlichen gleich oder großer ist als die Schwellenwert-Konzentration, anzeigt.
- Die vorliegende Erfindung ist besonders nützlich bei der Durchführung gleichzeitiger mehrfacher Ligandenrezeptor-Assays. Eine beliebige Anzahl nicht-interagierender komplementärer Ligandenanalogon-Konjugat:Ligandenrezeptor-Reaktionspaare kann gleichzeitig verwendet werden, um mehrere interessierende Zielliganden in einer einzelnen Probe zu bestimmen.
- In den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine fluide Probe, die erwartetermaßen interessierende Zielliganden enthält, mit einer Reaktionsphase kontaktiert, die komplementäre Ligandenanalogon-Konjugat::Ligandenrezeptor-Reaktionspaare in einer Zahl, die gleich der Anzahl der zu bestimmenden Zielliganden ist, enthält. Eine Kompetition tritt zwischen den Zielliganden und ihren entsprechenden Ligandenanalogon-Konjugaten um Bindungsstellen auf den komplementären Ligandenrezeptoren auf. Die multiplen nicht-interagierenden kompetitiven Reaktionen läßt man alle im wesentlichen Gleichgewichtsbindungs-Bedingungen erreichen. Im Gleichgewicht wird für jedes der kompetitiven Systeme die Menge des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugates durch eine Anzahl von Faktoren bestimmt werden, wobei von besonderer Wichtigkeit die Menge des jeweiligen in der Probe vorhandenen Zielliganden ist. In der Abwesenheit des spezifischen Liganden wird im wesentlichen das gesamte jeweilige Ligandenanalogon-Konjugat durch den geeigneten den Ligandenrezeptor gebunden sein. Im Gleichgewicht werden detektierbare Mengen des spezifischen Ligandenanalogon-Konjugates nur vorhanden sein, wenn die Zielliganden-Konzentration im wesentlichen gleich oder größer ist als die jeweilige Schwellenwert-Konzentration. Um das Vorhandensein spezifischer Liganden bei oder oberhalb ihrer jeweiligen Schwellenwert-Konzentrationen zu detektieren, wird die Reaktionsmischung mit einer terminalen Festphase, die einzelne Bereiche immobilisierter Ligandenrezeptoren für die jeweiligen Liganden enthält, und einer signalerzeugenden Phase kontaktiert, um zu bestimmen, welche der Liganden, falls überhaupt, bei oder oberhalb ihrer Schwellenwert-Konzentrationen vorhanden sind.
- Darüberhinaus kann, da jeder auf der terminalen Festphase immobilisierte Ligandenrezeptor an einem einzelnen Ort oder Orten plaziert ist, das durch das signalerzeugende Element hervorgebrachte Signal eines immobilisierten Ligandenanalogon-Konjugates mit einem spezifischen Zielliganden allein in Verbindung gebracht werden. Die Eins-Zu-Eins-Beziehung des detektierbaren Signals mit einem Liganden wird erreicht durch die Korrelation des Signalortes mit der Identifizierung der Lage der spezifischen Ligandenrezeptoren. Die vorliegende Erfindung erlaubt daher die gleichzeitige Bestimmung der Konzentrationen einer Vielzahl von Zielliganden, jede bezüglich einer individuell vorgewählten Schwellenwert-Konzentration, so daß die Abwesenheit eines detektierbaren Signals in einem ligandenspezifischen Responsebereich auf der terminalen Festphase anzeigt, daß der spezifische Zielligand in der Probe in einer Konzentration, die geringer als die ligandenspezifische Schwellenwert-Konzentration ist, vorhanden ist, während die Anwesenheit eines detektierbaren Signals in einem ligandenspezifischen Responsebereich auf der terminalen Festphase anzeigt, daß der spezifische Ligand in der Probe entweder in einer Konzentration, die im wesentlichen gleich oder höher ist als die ligandenspezifische Schwellenwert-Konzentration vorhanden ist.
- Eine der Ausführungsformen der Erfindung ist ein Ligandenrezeptor-Assay für eine Vielzahl von Zielliganden, bei dem die Reaktionsphase Gruppen komplementärer Reagenzien einschließt, wobei eine jede Gruppe eine Vielzahl von Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugaten und einen geeigneten Ligandenrezeptor hat. Die Ligandenanalogon-Liganden-Komplement- Konjugate werden in einer Weise in Verhältnissen, bezogen auf den komplementären Ligandenrezeptor der Reaktionsphase, gebildet, daß während des Komplexierungsschrittes mit ihren jeweiligen auf der terminalen Festphase immobilisierten Liganden-Komplement-Rezeptoren eine Signalerzeugung so auftritt, daß ein jedes komplementäres Ligandenanalogon-Liganden- Komplement-Konjugat::Immobilisierter-Liganden-Komplement-Rezeptor-Paar eine einzigartige Schwellenwert-Konzentration for den gemeinsam geteilten Zielliganden zeigt. Das Kompendium der Schwellenwert-Konzentrationen eines einzelnen Zielliganden stellt einen Mechanismus zur weiteren Identifikation der Konzentrationen des Zielliganden durch den Vergleich mit dem Bereich der Schwellenwert-Konzentrationen bereit. Da die Reaktionsphase eine Vielzahl von Gruppen komplementärer Reaktionspaare einschließt, kann eine Vielzahl von Zielliganden gleichzeitig bestimmt werden, wobei jeder Ligand eine assoziierte Serie von Schwellenwert- Konzentrationen hat. Daher kann auf diese Weise ein jeder Ligand in eine Serie von Konzentrationsbereichen eingeschlossen werden. Beispiele solcher Verwendungen von Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugate zur Bestimmung einer Vielzahl von Analyten bei einer Vielzahl von Schwellenwerthöhen schließen die Verwendung von Ligandenanalogon- Liganden-Komplement-Konjugaten ein, in denen die Liganden-Komplement-Komponente des Konjugates sterisch an der Bindung an den Liganden-Komplement-Rezeptor der terminalen Festphase nach der Komplexierung des Ligandenrezeptors mit der Ligandenanalogon- Komponente des Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugates, gehindert wird. Solche Konjugate werden in dem US-Patent Nr. 4 506 009 beschrieben. Eine Reaktionsmischung, die eine Probe, Ligandenrezeptor und Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat umfaßt, läßt man im wesentlichen sich dem Gleichgewicht annähern. Die Reaktionsmischung wird dann mit einer teninnalen Festphase kontaktiert, auf der ein Liganden-Komplement-Rezeptor lokalisiert ist. Der Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex kann nicht durch den auf der terminalen Festphase immobilisierten Liganden-Komplement-Rezeptor gebunden werden, da der Konjugat-Komplex eine effektive Liganden-Komplement-Konzentration von Null hat. Ungebundenes Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat kann durch den immobilisierten Liganden-Komplement-Rezeptor gebunden werden und, folgend auf irgendwelche nötigen Trennungsschritte von freiem/gebundenem und dem Kontakt mit einer signalerzeugenden Phase, kann die Liganden-Konzentration, bezogen auf die Schwellenwert-Konzentration, bestimmt werden. Wenn eine Vielzahl von Liganden-Komplement-Rezeptoren an spezifischen Orten auf der terminalen Festphase immobilisiert sind, wird ein jeder Ort durch eine einzige Schwellenwert-Konzentration identifiziert, so daß die Anwesenheit eines detektierbaren Signals an einem Ort anzeigt, daß der Ligand in der Probe in einer Konzentration, die im wesentlichen gleich oder größer als die entsprechende Schwellenwert-Konzentration ist, vorhanden ist.
- Ein anderes Beispiel schließt die Verwendung eines Ligandenanalogon-Liganden-Komplement- Konjugates in der Reaktionsmischung und die Verwendung eines wahlfreien Mittels ein. Eine Reaktionsmischung wird aus einer Probe, einem Ligandenrezeptor und einem Ligandenanalogon- Liganden-Komplement-Konjugat gebildet. Die Kompetitionsreaktion zwischen dem Liganden und dem Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugat um die begrenzten Bindungsstellen auf dem Ligandenrezeptor läßt man im wesentlichen das Gleichgewicht annähern. Der Reaktionsmischung wird dann mit einem wahlfreien Mittel kontaktiert, das in funktioneller Weise mit einem (Ligandenrezeptor)-Rezeptor, der an diejenigen Komponenten der Reaktionsmischung, die mit dem Ligandenrezeptor assoziiert sind, binden kann, d.h., an den ungebundenen Ligandenrezeptor, den Liganden:Ligandenrezeptor-Komplex und den Ligandenanalogon-Liganden-Komplement- Konjugat:Ligandenrezeptor-Komplex. Die sich ergebende Reaktionsmischung wird dann mit einer terminalen Festphase, auf der sich immobilisierter Liganden-Komplement-Rezeptor befindet, kontaktiert. Ein Teil des in der Reaktionsmischung verbleibenden ungebundenen Ligandenanalogon-Liganden-Komplement-Konjugats wird durch den auf der terminalen Festphase immobilisierten Liganden-Komplement-Rezeptor gebunden, und der Rest kann, falls nötig, in einem Trennungsschritt entfernt werden. Schließlich wird die terminale Festphase mit einer signalerzeugenden Phase kontaktiert und die Liganden-Konzentration, bezogen auf die Schwellenwert-Konzentration, bestimmt. Wenn multiple Liganden-Komplement-Rezeptoren aus spezifischen Orten auf der terminalen Festphase immobilisiert sind, ist jeder Ort mit einer einzigen Schwellenwert-Konzentration verknüpft, so daß die Anwesenheit eines detektierbaren Signals an einem Ort anzeigt, daß der Ligand in der Probe in einer Konzentration, die im wesentlichen gleich oder größer als die entsprechende Schwellenwert-Konzentration ist, vorhanden ist.
- Der Fachmann wird erkennen, daß ein Rezeptor-Konjugat und ein Ligandenanalogon-Konstrukt in einer Reaktionsmischung verwendet werden können, um Schwellenwert-Konzentrationen zur Bestimmung von Zielliganden in Ligandenrezeptor-Assays bereitzustellen. Im wesentlichen wird das gesamte Rezeptor-Konjugat an das Ligandenanalogon-Konstrukt gebunden und wird an der Bindung an eine terminale Festphase mit immobilisiertem Ligandenanalogon gehindert, wenn der Zielliganden in einer geringeren als der Schwellenwert-Konzentration vorhanden ist. Rezeptor- Konjugate mit multiplen Liganden-Bindungsstellen werden für die Anwendung in dieser Ausführungsform bevorzugt. Ein Ligandenanalogon-Konstrukt kann durch das Binden eines Ligandenanalogons an eine optionelle Festphase, als ein Mittel zur Abtrennung des Rezeptor- Konjugats aus der Reaktionsmischung, gebildet werden. Alternativerweise können Ligandenanalogon-Konstrukte durch das Binden von Ligandenanaloga an großmolekulare Spezies gebildet werden, die Rezeptor-Konjugate, die an solche löslichen Ligandenanalogon-Konstrukte gebunden sind, daran hindern, an immobilisiertes Ligandenanalogon auf der terminalen Festphase zu binden ohne ein Mittel zur Abtrennung des löslichen Ligandenanalogon-Konstrukts aus der Reaktionsmischung zu verwenden. Der Fachmann wird gut erkennen, daß die vorliegende Erfindung diese Verwendung von Rezeptor-Konjugaten und Ligandenanalogon-Konstrukten zur Detektion einzelner oder multipler Zielliganden beabsichtigt.
- Der Fachmann wird erkennen, daß Ligandenrezeptoren der Zielanalyt, der von Interesse ist, sein können. In diesem Fall werden das Rezeptor-Konjugat und ein Ligandenanalogon-Konstrukt in der Reaktionsphase bereitgestellt, so daß, wenn eine Probe, die erwartetermaßen den Zielligandenrezeptor enthält, hinzugefügt wird, um die Reaktionsmischung zu bilden, im wesentlichen das gesamte Rezeptor-Konjugat an das Ligandenanalogon-Konstrukt gebunden ist und daran gehindert wird, an eine terminale Festphase, die immobilisierten Liganden enthält, zu binden, falls die Reaktionsmischung Ligandenrezeptor in einer geringeren als der Schwellenwert- Konzentration des Assays enthält. Die Mengen des Rezeptor-Konjugats und des Ligandenanalogon-Konstrukts werden ausgewählt, um eine vorausbestimmte Schwellenwert-Konzentration des Ligandenrezeptors für den Assay bereitzustellen. Der Fachmann wird erkennen, daß die vorliegende Erfindung einen Assay für multiple Ligandenrezeptoren durch das Bereitstellen eines komplementären Paares von Rezeptor-Konjugat und Ligandenanalogon-Konstrukt für einen einzelnen Bereich des immobilisierten Ligandenanalogons auf der terminalen Festphase für einen jeden Zielligandenrezeptor beabsichtigt.
- Während die vorliegende Erfindung besonders nützlich zur Durchführung kompetitiver Immunoassays ist, werden die Fachleute erkennen, daß die Erfindung für andere Ligandenrezeptor- Assays, einschließlich nicht-kompetitiver Immunoassays, verwendet werden kann. Zum Beispiel kann in Sandwich-Assays ein Ligandenrezeptor zusammen mit einem Ligandenrezeptor-Konjugat, das an eine andere Stelle auf dem Liganden-Molekül in einer Reaktionsmischung bindet, bereitgestellt werden. Wenn eine erwartetermaßen den Liganden enthaltende Probe zu der Reaktionsphase gegeben wird, läßt man die Bindung des Ligandenrezeptors, des Ligandenrezeptor-Konjugates und des Liganden im wesentlichen die Gleichgewichtsbindung erreichen. Die Menge des Ligandenrezeptors wird ausgewählt, um eine vorausbestimmte Menge des Liganden in einer Weise zu binden, daß, wenn die Reaktionsmischung mit einer den immobilisierten Ligandenrezeptor enthaltenden Festphase kontaktiert wird, eine bekannte Menge des Ligandenrezeptor:Ligand:Ligandenrezeptor-Konjugat-Komplexes an der Bindung an die Festphase gehindert wird, und daher keine Response erzeugt wird, bis die Liganden- Konzentration in der Probe eine ausgewählte Schwellenwert-Konzentration übersteigt.
- Beispiele für Liganden, die als geeignete Ziele der vorliegenden Erfindung dienen könnten, schließen die folgenden ein; Ovulationssteroide und ihre Metaboliten: z.B. Progesteron, Estradiol, Pregnandiol-3α-glucuronid und Estron-3-glucuronid; (Mißbrauchs) Drogen und ihre Metaboliten: z.B. Amphetamine, Barbiturate, Benzodiazepine, Kannabinoide, Kokain, Methadon, Methamphetamin, Methaqualon, Opiate, Phencyclidin, Propoxyphen und tricyclische Antidepressiva; therapeutische Arzneimittel und ihre Metaboliten: z.B. Acetaminophen, Digoxin, Salicylat und Theophyllin; Ovulationshormone: z.B. menschliches Choriongonadotropin und luteinisierendes Hormon; Thyroid-Hormone: z.B. Triiodothyronin und Thyroxin; Mycotoxine: z.B. Aflatoxin B1, Aflatoxin B2, Aflatoxin G1, Aflatoxin M1, Zearalenon, T-2-Toxin und Desoxynivalenol; Ciguatoxin; Umwelttoxine: z.B. polychlorierte Biphenyle, Dioxin und Ethylendibromid; und Proteine und Antikörper, die in der Nosologie von Wert sind: z.B. Apolipoproteine, Albumin, c- reaktives Protein und Antikörper gegen Hepatitis- und HIV-Viren. Die folgenden Beispiele werden als Erläuterung und nicht als Beschränkung angeboten.
- Estron-3-glucuronid (11,2 mg, 25 uMol) und N-Hydroxysuccinimid (2,9 mg, 25 uMol) wurden in 0,1 ml trockenem Dimethylformamid gelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (5,7 mg, 27,5 uMol) wurden hinzugesetzt, und der Kolben wurde mit Stickstoff gespült. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf einer kleinen Fritte filtriert, um den präzipitierten Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Der resultierende N- Hydroxysuccinimidester wurde sofort zur Konjugation mit dem Protein verwendet.
- Eine Lösung aus dem N-Hydroxysuccinimidester des Estron-3-glucuronids (114 ul, 230 mMol) in Dimethylformamid wurde einer Lösung der alkalischen Phosphatase (0,26 ml, 9,8 mg/ml) in 0,1 M Kaliumborat, 0,05 M Kaliumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 8,75, hinzugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur 12 Stunden lang gerührt. Das Konjugat aus Estron-3-glucuronid und alkalischer Phosphatase wurde mittels Chromatographie auf einer Sephadex-G-25-Säule gereinigt.
- Affinitätsgereinigtes Ziege-anti-Maus-Fc (Immunosearch) und Polystyrollatexteilchen (sulfatiert, 1,07 um) (Interfacial Dynamics) wurden gesondert bei 45ºC 1 Stunde lang inkubiert, wobei die Antikörperlösung mit 0,1 M 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure bei einem pH von 5,5 gepuffert wurde. Während des Vortexens der Antikörperlösung wurde die Latexteilchensuspension der Antikörperlösung hinzugegeben, so daß die Endkonzentration des Antikörpers 0,3 mg/ml betrug und die Lösung 1% Latexfeststoffe enthielt. Die Suspension wurde 2 Stunden lang bei 45ºC vor der Zentrifugation der Suspension inkubiert, um die Latexteilchen zu pelletieren. Das Latexpellet wurde in 1% Rinderserumalbumin in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) resuspendiert und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Zentrifugation zur Pelletierung des Latex wurde das Pellet drei Mal durch Resuspendierung in PBS gewaschen und zentrifugiert. Das letztendlich erhaltene Pellet wurde in PBS mit 0,1% Natriumazid bei einem pH von 7,0 mit einer Latexkonzentration von 1% Feststoffen resuspendiert. Diese Präparation wurde verwendet, um die Immunreaktivitäten von Konjugaten zu bestimmen, und als ein wahlweises Mittel zur Entfernung von monoklonalen Antikörpern aus der Reaktionsmischung in dem Assay von Estron- 3-glucuronid. Eine 1%ige Suspension dieser Latexpräparation war in der Lage, 40 ug/ml an monoklonalem Antikörper zu binden.
- Um den Teil des Ligandenanalogon-Konjugats zu bestimmen, der zur Bindung an Antikörper in der Lage war, wurden für den Zielliganden spezifische monoklonale Antikörper mit einer Menge des Ligandenanalogon-Konjugats inkubiert, so daß genügend Antikörper verfügbar war, um alle Konjugate zu binden, an denen ein bindungsfähiger Ligand haftete. Eine ausreichende Menge an Ziege-anti-Maus-Fc-Latex wurde zugesetzt, um den monoklonalen Antikörper zusammen mit jedwedem daran gebundenen Konjugat zu binden. Der Latex wurde von der Mischung mittels Zentrifugation abgetrennt, und die Menge der im Überstand verbliebenen Enzymaktivität wurde bestimmt und mit der der Mischung hinzugesetzten Gesamtmenge an Enyzmaktivität verglichen. Der Prozentteil des immunreaktiven Konjugats war der Prozentteil der Gesamtenzymaktivität, welche an dem Latexpellet gebunden war. Konjugate, die hohe Immunreaktivitäten zeigten, waren für Konjugate repräsentativ, die mit Ligandenanalogen stark derivatisiert waren, wohingegen Konjugate mit geringen Immunreaktivitäten für Konjugate repräsentativ waren, die weniger stark derivatisiert waren.
- Ein Konjugat aus Estron-3-glucuronid und alkalischer Phosphatase wurde hergestellt, und seine Immunreaktivität wurde wie oben beschrieben bestimmt unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, Klon Nr. 27, erhalten von Interpharm Laboratories, Rehovot, Israel. Es zeigte sich, daß das Konjugat eine Immunreaktivität von 99,9% besaß, was anzeigte, daß das Enzym stark derivatisiert war. Standards von Estron-3-glucuronid wurden durch Verdünnungen einer 1 mM Stammlösung hergestellt, die hergestellt wurde, indem eine eingewogene Menge an Estron-3- glucuronid gelöst wurde. Mischungen der Standards und des Konjugats wurden hergestellt, und 100 ul jeder Mischung wurden zu einem gleichen Volumen des monoklonalen Antikörpers in einer Konzentration von 10 ug/ml in einer Suspension von 0,5% Ziege-anti-Maus-Fc-Latex in Vertiefungen von Mikrotiterplatten hinzugesetzt. Die Mischungen mit einer Konjugatendkonzentration von 4 nM und einer Antikörperendkonzentration von 31 nM wurden 5 Minuten unter sanftem Schütteln inkubiert, bevor sie einer Zentrifugation zur Pelletierung des Latex unterzogen wurden. Fünfzig Mikroliter des Überstandes aus jeder Vertiefung wurden Mikrotiterplatten-Vertiefungen, die immobilisierten monoklonalen Antikörper, Klon Nr. 27 (COBIND-Platten, Micro Membranes, Antikörper zu 100 ug/ml unter Verwendung des vom Hersteller angegebenen Protokolls immobilisiert) hinzugesetzt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Die Vertiefungen wurden fünfmal mit boratgepufferter Salzlösung, pH 8,2, gewaschen, und die Anwesenheit von durch gebundenem Enzym hervorgerufener Aktivität wurde bestimmt, indem 200 ul 10 mM Phenolphthaleinmonophosphat, gepuffert durch 2-Amino-2-methyl-1-propanol bei pH 10,2, hinzugesetzt und die Bildung von Phenolphthalein bei 560 nm unter Verwendung eines UVmax-Mikrotiterplatten- Lesegerätes (Molecular Devices) bestimmt wurde. Darüberhinaus wurde die im Überstand verbliebene Enzymaktivität vermessen, indem 10 ul des Überstandes nach der Pelletierung des Latex entfernt, es zu 200 ul 10 mM Phenolphthaleinmonophosphat hinzugesetzt und die Rate der Phenolphthaleinbildung bei 560 nm wie beschrieben kinetisch bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 in Verbindung mit der Konzentration von Estron-3-glucuronid in der Reaktionsmischung gezeigt. Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß bis zur Konzentration von 30 nM an Estron-3-glucuronid sowohl die Aktivität des am Anti-Estron-3-glucuronid gebundenen Enzyms in den Vertiefungen als auch die Enzymaktivität in Überstand auf sehr niedrigen Niveaus blieben. Das immunreaktive Konjugat ist im wesentlichen gänzlich am Antikörper in der Reaktionsmischung gebunden, solange die Konzentration an Estron-3-glucuronid die Schwellenwert-Konzentration des Assays überschreitet, was in diesem Fall etwa 30 nM ist. Die Aktivität des am immobilisierten Antikörper gebundenen Enzyms in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte erreicht ein Maximum, bevor die freie Enzymaktivität im Überstand ein Maximum erreicht, da die Menge an immobilisiertem Antikörper in den Vertiefungen unzureichend ist, um das gesamte verfügbare Konjugat in Gegenwart der Konzentrationen an dem hier verwendeten freien Estron- 3-glucuronid zu binden. Die Ergebnisse zeigen, daß eine terminale Festphase mit einer höheren möglichen Kapazität für die Immobilisierung von Antikörpern den dynamischen Ansprechbereich dieses Assays verbessern würde. Tabelle 1 Estron-3-glucuronid (nM) Aktivität des am terminalen Feststoff gebundenen Enzyms (mOD/min) Enzymaktivit im Überstand (mOD/min)
- Monoklonale Antikörper gegen Estron-3-glucuronid, Klon 155B3 von Interpharm Laboratories, wurden auf Mikrotiterplatten mit 16 Vertiefungen immobilisiert, die eine Immobilon-Membran als Bodenelement der Vertiefungen (Millipore Corporation) enthielten. Der Antikörper wurde auf jeder Membran-Vertiefung eingeführt, indem 0,6 ul einer Lösung aus 6 mg/ml Antikörper, 0,1 M Kaliumphosphat, 10 mg/ml Tetrazol und 0,1% Polyvinylakohol (mittleres Molekulargewicht = 2000), pH 7,4, aufgetragen und 20 Minunten bei Raumtemperatur inkubiert wurden, bevor 20 ul einer Lösung aus 10 mg/ml Kasein, 0,1 M Kaliumphosphat, 10 mg/ml Tetrazol und 0,1% Polyvinylalkohol, pH 7,4, aufgetragen und 5 Minuten lang inkubiert wurde. Die überschüssige Lösung wurde mit Saugpapier abgetupft, und die Platten wurden in einem Exsikkator vor der Anwendung in Assays als terminale Festphase getrocknet.
- Die Assays wurden durchgeführt, indem gleiche Volumina von Estron-3-glucuronid-Standards und an Konjugat von Estron-3-glucuronid und alkalischer Phosphatase gemischt wurden und diese Mischungen mit einer Menge an anti-Estron-3-glucuronid-Antikörper versetzt wurden, die so gewählt war, daß der von den Standards überspannte Konzentrationsbereich die erwartete Schwellenwert-Konzentration einschloß, bestimmt durch die Auswahl der Antikörperkonzentration. Das Reaktionsgesamtvolumen betrug 60 ul für jede Mischung. Nach 10 minütiger Inkubation wurden 20 ul jeder Reaktionsmischung entfernt und den Vertiefungen, die auf Membranen immobilisierten Antikörper enthielten, hinzugesetzt. Die Membranen blieben in Kontakt mit der Reaktionsmischung für etwa 1 Minute, bevor jede Vertiefung durch vakuumunterstützte Filtration mit drei Mal 200 ul Volumina an 0,05% Lubrol PX enthaltender boratgepufferter Salzlösung bei einem pH von 8,2 gewaschen wurde. Die Vertiefungen wurden mittels vakuumunterstützter Filtration mit 50 ul 10 mM Phenolphthaleinmonophosphat enthaltender Substratlösung bei pH 10,2 gespült. Die Vertiefungen wurden durch den Kontakt des Bodens der Vertiefungen mit Saugpapier abgetupft, und 50 ul der gleichen Substratlösung wurden jeder Vertiefung hinzugesetzt. Die Bildungsrate von Phenolphthalein wurde kinetisch unter Verwendung eines UVmax-Mikrotiterplatten-Lesegerätes (Molecular Devices) bei 560 nm bestimmt. Nach Abschluß der Messung des Instrumentes wurden die Vertiefungen mit 50 ul einer 10 mM 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) bei pH 10,2 enthaltenden Substratlösung gewaschen, die Vertiefungen mit Saugpapier abgetupft und 50 ul des BCIP-Substrates hinzugesetzt, um die visuelle Assay Response zu entwickeln. Nach etwa 10 Minuten wurden die Reaktionen gestoppt, indem 50 ul 500 mM EDTA hinzugesetzt und überschüssige Flussigkeitsmengen von den Membranen abgetupft wurden. Die visuellen Reaktionen wurden mit den instrumentellen Messungen verglichen, um die Entwicklung spezifischer Signale zu bestätigen, die visuellen und instrumentellen Responsen befanden sich bei den hier beschriebenen Assays in Übereinstimmung, und es wurden keine visuellen Responsen für Vertiefungen detektiert, bei denen die Konzentration von Estron-3-glucuronid unterhalb der Schwellenwert-Konzentration lag. Die Ergebnisse zweier solcher Assays sind in Tabelle II gezeigt, wobei der eine ein stark derivatisiertes Konjugat, das eine Immunreaktivität von 90% anzeigte, verwendet wurde, und ein anderes, das ein nur wenig derivatisiertes Konjugat, welches eine Immunreaktivität von 26% zeigte, verwendet wurde. Das stark derivatisierte Konjugat zeigte eine Schwellenwert- Konzentration von etwa 100 nM in diesem Assay mit einer allmählichen Zunahme im Ansprechen bis zu einem Maximum, das bei etwa 1000 nM eintrat. Der das Konjugat mit 26% Immunreaktivität verwendende Assay zeigte eine Schwellenwert-Konzentration von etwa 120 nM und eine Assay-Response, welche als eine Funktion der Liganden-Konzentration schneller zunahm. Wir haben herausgefunden, daß der Grad der Derivatisierung, gemessen durch den Prozentanteil der Immunreaktivität für das Konjugat, ein guter Parameter zur Voraussage der Assaycharakteristika, die durch ein bestimmtes Konjugat hervorgerufen werden, ist. Stark derivatisierte Konjugate führen zu Assays, die geringere Responsesteigungen als weniger derivatisierte Konjugate zeigen. Diese Eigenschaft kann von einem Fachmann verwendet werden, um einen Assay für eine spezifische Anwendung zu optimieren. Tabelle II Estron-3-glucuronid (nM) % immunreaktives Konjugat; Aktivität des an der terminalen Festphase gebundenen Enzyms (mOD/min)
- Um die Inkubationszeit zu bestimmen, die die Reaktionsmischung braucht, um im wesentlichen Gleichgewichtsbindungskonditionen zu erreichen, ist der wichtigste zu untersuchende Parameter die Assay-Response in unmittelbarer Nähe der Schwellenwert-Konzentration, da das Erreichen des Gleichgewichts bei diesen Konzentrationen des Zielliganden am langsamsten ist. Ein nützliches Verfahren ist die Durchführung des Assays unter der Verwendung von Zielliganden- Konzentrationen ober- und unterhalb der Schwellenwert-Konzentration und die Untersuchung des Effektes der Abänderung der Inkubationszeit der Reaktionsmischung auf die Assay-Response bei diesen Konzentrationen. Der Assay für Estron-3-glucuronid wurde wie im früheren Beispiel beschrieben unter Verwendung einer Membran als terminale Festphase und des 26% Immunreaktivität zeigenden Konjugats durchgeführt, und unter Verwendung von Estron-3- glucuronid-Standards, so daß die Konzentration in der Reaktionsmischung entweder 100 oder 140 nM war, die beobachtete Schwellenwert-Konzentration von 120 nM einklammernd. Die Reaktionsmischungen wurden für 1, 3, 6 oder 10 Minunten inkubiert, um die minimale Zeit zu bestimmen, die notwendig war, um im wesentlichen Gleichgewichtsbindungsbedingungen zu erreichen. Die in Tabelle III gezeigten Ergebnisse zeigen, daß eine Inkubationszeit von 6 Minuten ausreichend ist, damit kein visuell detektierbares Signal in den 100 nM Estron-3-glucuronid enthaltenden Assays festgestellt wird, wohingegen die Assay-Response von Assays, die 140 nM enthalten, visuell detektierbar bleibt. Tabelle III Aktivität des an der terminalen Festphase gebundenen Enzyms Reaktionsmischung (mOD/min) Inkubationszeit (min)
- Pregnandiolglucuronid (13,3 mg, 25 uMol) und N-Hydroxysuccinimid (2,9 mg, 25 uMol) wurden in 0,1 ml trockenem Dimethylformamid gelöst. Dicyclohexylcarbodiimid (5,7 mg, 27,5 uMol) wurden hinzugesetzt, und der Kolben wurde mit Stickstoff gespült. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf einer kleinen Fritte filtriert, um den präzipitierten Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, und das Lösungsmittel wurde in Vakuum entfernt. Wasserfreies Methanol wurde dem Rückstand hinzugesetzt, und der Kolben wurde bei -20ºC stehengelassen, damit der N-Hydroxysuccinimidester präzipitieren konnte. Die resultierenden Kristalle (12 mg) wurden isoliert, getrocknet und in einem Exsikkator bei -20ºC gelagert.
- Der N-Hydroxysuccinimidester von Pregnandiolglucuronid wurde in trockenem Acetonitril gelöst und mit alkalischer Phosphatase bei 8 mg/ml Protein unter Verwendung eines zehnfachen molaren Überschusses an N-Hydroxysuccinimidester umgesetzt. Die Reaktion wurde in phosphatgepufferter Salzlösung bei einem pH von 7,0 90 Minuten lang durchgeführt. Das Protein wurde von den Reaktanten mittels einer G-25-Chromatographie entfernt und seine Immunreaktivität wurde bestimmt, wie oben beschrieben; sie betrug 96%.
- Ein monoklonaler Antikörper fur Pregnandiol-3α-glucuronid (Klon P44, Interpharm Laboratories) wurde auf Immobilon-Membranen in einer Mikrotiterplatte mit 16 Vertiefungen wie oben immobilisiert, außer daß die für die Immobilisierung verwendete Antikörper-Konzentration 16 mg/ml war. Assays wurden durchgeführt, indem gleiche Volumina an Pregnandiol-3α- glucuronid-Standards und Konjugat aus Pregnandiol-3α-glucuronid und alkalischer Phosphatase gemischt und zu diesen Mischungen eine Menge an anti-Pregnandiol-3α-glucuronid-Antikörper hinzugesetzt wurde, die so gewählt war, daß der von den Standards überspannte Konzentrationsbereich die Schwellenwert-Konzentration einschloß, bestimmt durch die Auswahl der Antikörper- Konzentration. Das gesamte Volumen der Reaktionsmischung betrug 60 ul für jede Mischung. Die Reaktionsmischung wurde 10 Minuten lang inkubiert, und alle verbleibenden Assayschritte wurden durchgeführt, wie es obenstehend in den Assays für Estron-3-glucuronid beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV gezeigt und spiegeln eine Schwellenwert-Konzentration von etwa 3 uM für die ersten visuell detektierbaren Ergebnisse wider. Die Ergebnisse zeigen ferner einen "Haken"-Effekt, der in solchen Immunoassays beobachtet werden kann, wo die Kombination von freiem Liganden und freiem Ligandenanalogon-Konjugat in der Reaktionsmischung in wesentlichem Überschuß über der Menge an immobilisiertem Rezeptor auf der terminalen Festphase vorliegt. Wenn die maximale Assay-Response, die sich bei diesem Assay bei etwa 50 uMol einstellt, mit der maximalen potentiellen Response vergleicht, die erreicht werden könnte, wenn das gesamte freie Ligandenanalogon-Konjugat an der terminalen Festphase gebunden wäre (bestimmt durch das Kontaktieren der das Konjugat enthaltenden Mischung lediglich mit der terminalen Festphase), wird nur 4% der potentiell verfügbaren Response in diesem Assay erreicht. Die Anwendung von terminalen Festphasen mit erhöhten Mengen an immobilisiertem Antikörper, die Verwendung von stark derivatisierten Konjugaten, die in wirksamer Weise mit den Liganden für Bindungsstellen auf der terminalen Festphase kompetitieren können, und die Verwendung von hohen Konzentrationen an Ligandenanalogon-Konjugat sind allesamt wirksame Wege zur Verbesserung des maximalen Ansprechens in den Assays, wo die Schwellenwert-Konzentration hoch ist, so daß die Gefahr eines wesentlichen "Haken"-Effektes minimiert ist. Die Kombination dieser Parameter die angewandt wird, um ein Assay zu optimieren, wird von den Fachleuten im Fachbereich so verstanden, daß sie abhängig von den Zielen einer besonderen Immunoassay- Anwendung ist. Tabelle IV [Pregnandiol-3α-glucuronid (uM) Aktivität des an der terminalen Festphase gebundenen Enzyms (mOD/min)
- Das folgende Beispiel erläutert die Anwendung der Erfindung für einen Assay für eine Reihe von (Mißbrauchs) Drogen. Ein Panel von (Mißbrauchs) Drogen, das für das Screenen von Urinproben nützlich wäre, wurde die fünf von der National Institute of Drug Abuse (NIDA) als wichtigste Drogen angesehenen, Amphetamin, Kokain, Opiate, Phencyclidin und Kannabinoide, einschließen. Die Entwicklung von Antikörpern für diese Haptene erfordern die Synthese von Immunogenen. Methoden für die Synthese solcher Immunogene sind dem Fachmann bekannt, siehe z.B.: US- Patent Nr. 3 817 837, 3 878 187, 3 884 898, 4 203 802 und 4 281 065 und Rodgers, R., Crowl, C.P., Eimstad, W.M., Hu, M.W., Kam, J.K., Ronald, R.C., Rowley, G.L. und Ullman, E.F., Clin. Chem, 24, 95-100 (1976). Die durch solche Methoden erzeugten Immunogene werden dann verwendet, um Mäuse zum Zweck der Hervorrufung einer Immunantwort auf die gewünschten Drogen zu immunisieren. Im Anschluß an einer Erzeugung einer Immunantwort werden die Mäuse geschlachtet und die Milzzellen mit Myelomzellen verschmolzen, um Antikörper- sekretierende Hybridomzellinien zu erzeugen. Eine weitere Charakterisierung der von den Zelllinien abgeleiteten Antkörper wird erreicht, indem die in den Immunosierungsprotokollen angewandten Immunogene verwendet werden. Die Methoden zur Erzeugung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern sind dem Fachmann gut bekannt, siehe z.B.: Liu, D., Purssell, R. und Levy, J.G., Clinical Toxicology, 25, 527-538 (1987). Die bei der Erzeugung von Immunogenen verwendeten Arzneistoffe und die Chemie werden ebenfalls bei der Synthese von Arzneistoff-Enzym-Konjugaten angewandt, welche aus Enzymen, wie alkalischer Phosphatase aus Kalberdarm, die mit Zielarzneistoffen derivatisiert sind, bestehen. Die Methoden für die Herstellung solcher Arzneistoff-derivatisierter Enzyme sind dem Fachmann gut bekannt, siehe z.B. die US-Patente Nr. 3 817 837 und 4 203 802.
- Eine Reaktionsphase wird aus geeigneten Mengen an Arzneistoff-Enzym-Konjugaten und den gegen die NIDA-Drogenauswahl gerichteten monoklonalen Antikörper konstruiert. Die Mengen an Antikörpern werden so gewählt, daß die durch den Assay bestimmten Schwellenwert- Drogenkonzentrationen mit den NIDA-Empfehlungen für das Screenen nach positiven gegenüber negativen Proben konsistent sind. Solche Schwellenwert-Konzentrationen sind: Amphetamin: 1000 ng/ml, Kannabinoide: 100 ng/ml, Kokain: 300 ng/ml, Optiate: 300 ng/ml und Phencyclidin: 25 ng/ml. Die Probe wird mit der Reaktionsphase vermischt, um eine Reaktionsmischung zu bilden, welche reagieren gelassen wird, bis die mehrfachen Kompetitionsreaktionen im wesentlichen Gleichgewichtsbindungskonditionen erreicht haben. Die Reaktionsmischung wird dann in Kontakt mit einer Testvorrichtung gebracht, welches als Teil eine Membran umfaßt, auf der gegen die Droge wirkende Antikörper in getrennten diskreten Reaktionszonen immobilisiert worden sind. Die Anzahl der anti-Drogen-Reaktionszonen entspricht der Anzahl der Drogen- Enzym-Konjugat: anti-Drogen-Antikörper-Paare. Methoden für die Immobilisierung von Antikörpern auf Membranen sind dem Fachmann gut bekannt, siehe z.B.: Pluskal, M.G., Przekop, M.B., Kavonian, M.R., Vecoli, D., Hicks, D.A., BioTechniques, 4, 272 283 (1986). Drogen- Enzym-Konjugat, das nach der Vervollständigung der Reaktion am löslichen, gegen die Droge wirkenden Antikörper in der Reaktionsmischung ungebunden war, bildet dann mit in der drogenspezifischen Reaktionszone auf der Membran immobilisierten anti-Drogen-Antikörpern Komplexe. Eine Waschlösung wird angewandt, um verbleibendes freies Drogen-Enzym-Konjugat in der Reaktionsmischung von dem auf der Membran gebundenen Drogen-Enzym-Konjugat zu trennen. Die Membran wird dann mit einer Lösung kontaktiert, die ein geeignetes Enzymsubstrat enthält, welches in der Lage ist, eine sichtbare Färbung zu entwickeln, z.B. wäre für alkalische Phosphatase aus Kälberdarm eine 3-Indoxylphosphat enthaltende Lösung geeignet. Es wird die Farbentwicklung ermöglicht, und die Antwort jeder Reaktionszone wird so interpretiert, daß die Abwesenheit einer detektierbaren Färbung anzeigt, daß die Droge, auf die die Zone gerichtet ist, bei einer Konzentration liegt, die geringer als die Schwellenwert-Konzentration ist, wohingegen die Gegenwart einer detektierbaren Färbung anzeigt, daß die Zieldroge bei einer Konzentration liegt, die im wesentlichen äquivalent oder größer als die Schwellenwert-Konzentration ist. Jede Reaktionszone wird einzeln interpretiert, so daß es ermöglicht wird, alle fünf Zieldrogen als positiv oder negativ zu bestimmen, entsprechend den von der NIDA angegebenen Schwellenwert- Konzentrationen.
- Morphinsulfat (1,67 g, 5x10&supmin;³ Mol) wurde mit Kaliumcarbonat (2,07 g, 1,5x10&supmin;² Mol) in 80 ml Ethanol gelöst. Die Lösung wurde auf Rückfluß unter Rühren erhitzt, und eine Bromessigsäure (0,7 g, 5x10&supmin;³ Mol) enthaftende Lösung wurde in 2 ml Ethanol hinzugesetzt. Dieses wurde 2 Stunden unter Rückfluß gekocht, dann wurde der Kolben in einem Eiswasserbad gekühlt. Der pH wurde auf 3 mit 12 N Salzsäure eingestellt, und die Präzipitate wurden filtriert. Lösungsmittel wurden unter Vakuum abgedampft, und 10 ml Ethanol wurden dem Rückstand hinzugesetzt. Die Präzipitate wurden filtriert, und die Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde aus Wasser/Aceton (10:90) umkristallisiert. Etwa 300 mg Produkt wurden gewonnen.
- Homocysteinthiolactonhydrochlorid (120 mg, 7,8x10&supmin;&sup4; Mol), 62 mg (7,8x10&supmin;&sup4; Mol) Prridin und 296 mg (7,8x10&supmin;&sup4; Mol) 3-O-Carboxymethylmorphinhydrochlorid wurden in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Zugabe von 1 ml einer 177 mg (8,6x10&supmin;&sup4; Mol) Dicyclohexylcarbodiimid enthaltenden Dimethylformamidlösung folgte. Der Kolben wurde mit Argon gespült und die Lösung 3 Stunden lang bei 25ºC gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgedampft, und dem Rückstand wurden 20 ml Wasser hinzugesetzt. Dann wurde die Lösung 5 Minuten lang gerührt und anschließend der unlösliche Dicyclohexylharnstoff filtriert. Das Filtrat wurde mit 10 ml Methylenchlorid gewaschen. Der pH der wäßrigen Schicht wurde auf 7 mit einer einer gesättigten wäßrigen Kaliumcarbonatlösung eingestellt. Die wäßrige Lösung wurde sechs Mal mit 10 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit 2 g Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Ethanol (20 ml) wurde dem Rückstand zugesetzt und unter Vakuum abgedampft, um das Pyridin zu entfernen. Ethylacetat (10 ml) wurde hinzugesetzt und unlösliche Präzipitate abfiltriert. Etherische Salzsäure (1 M) wurde der Lösung hinzugesetzt, während gerührt wurde, bis der pH bei Lackmus rot war. Der weiße Feststoff wurde filtriert und mit Ethylacetat gewaschen. Das Produkt wurde unter Vakuum getrocknet; die Ausbeute betrug 316 mg.
- Drei mg (6,9x10&supmin;&sup6; Mol) Sulfo-SMCC (Pierce) wurden zu 2,2 ml an 4,9 mg/ml alkalischer Phosphatase in 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,5, zugegeben. Die Proteinlösung wurde 1 Stunde bei 25ºC gerührt, dann wurde das Protein mittels Gelfiltrationschromatographie auf einer Säule von nicht-umgesetztem Sulfo-SMCC abgetrennt, die 40 ml GH 25 (Amicon Corporation), äquilibriert in 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0, enthielt. Die von der Säule eluierte Proteinfraktion wurde gesammelt. Das Morphin-HCTL wurde durch Zugabe von 63 ul 0,12 M Kaliumcarbonat, 0,6 mMol EDTA in 40% Methanol zu 0,6 mg Morphin-HCTL hydrolisiert. Die Lösung stand 10 Minuten bei 25ºC, dann wurden 30 ul der Lösung zu 250 ul der mit Sulfo-SMCC derivatisierten alkalischen Phosphatase (3,6 mg/ml) in 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat, 0,15 M Natriumchlorid, 0,4 mMol Magnesiumchlorid, pH 7,0, hinzugesetzt. Die Lösung wurde 30 Minuten bei 25ºC gerührt, und das Protein wurde von den nicht-umgesetzten Reaktanten mittels Gelfiltrationschromatographie wie oben beschrieben abgetrennt. Die Proteinfraktion wurde gesammelt, und das Konjugat wurde zur Verwendung in Assays in einer Lösung verdünnt, die 1% Rinderserumalbumin, 1 mM Magnesiumchlorid, 0,1 mM Zinkchlorid, 0,1% Natriumazid und 10 mM 3-(4-Morpholino)propansulfonsäure, pH 7,0, enthielt.
- Ein Konjugat aus Morphin und alkalischer Phosphatase wurde hergestellt, und seine Immunreaktivität wurde, wie es oben beschrieben ist, unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der wegen seiner hohen Afinität für Morphin gewählt wurde, bestimmt. Das Konjugat zeigte eine Immunreaktivität von > 99%. Eine Stammlösung von Morphin in Puffer wurde hergestellt, indem eine eingewogene Menge an Morphin in einem bekannten Volumen aufgelöst wurde. Ein Standard mit 1000 nM Morphin wurde von der Stammlösung hergestellt, und weitere im Assay verwendete Standards wurden aus diesem Standard durch direkte Verdünnung gebildet. Der Assay wurde in einer Mikrotiterplatte durchgeführt, indem in jede Vertiefung 25 ul einer Antikörper-Konzentration zugesetzt wurden, die so gewählt war, daß eine Schwellenwert-Konzentration im von den Standards überspannten Konzentrationsbereich vorlag. Standards mit einer Morphinkonzentration von 0, 60, 70, 80 90, 100, 150, 200, 300, 400 und 500 nM wurden in die Mikrotitervertiefungen eingeführt, und zwar 25 ul pro Vertiefung mit jeweils einer Anzahl von sechs für jede Konzentration. Das Konjugat aus Morphin und alkalischer Phosphatase wurde mit einem Volumen von 25 ul zu jeder Vertiefung bei einer Endkonzentration an alkalischer Phosphatase von etwa 1 nM hinzugesetzt. Die Reaktionsmischungen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor 25 ul einer 1%igen Suspension aus Ziege-anti- Maus-Fc-Latex hinzugesetzt wurden und weitere 5 Minuten lang inkubiert wurde. Die Reaktionsmischungen wurden einer Zentrifugation unterzogen, um den Latex zu pelletieren, und 25 ul des Überstandes wurden aus jeder Vertiefung entfernt und bezüglich der Enzymaktivität vermessen, indem sie mit 200 ul 10 mM Phenolphthaleinmonophosphat, gepuffert mittels 2- Amino-2-methyl-1-propanol (AMP), bei pH 10,2, vermischt, und die Bildungsrate von Phenolphthalein wie beschrieben bei 560 nm kinetisch bestimmt wurde. Um die maximale potentielle Antwort des Assays zu bestimmen, wurden sechs Wiederholungen durchgeführt, wobei das Assay-Verdünnungsmittel für die Antikörperlösung substituiert wurde, so daß die gemessene Aktivität die Enzymgesamtaktivität repräsentierte, die erhalten wurde, wenn das gesamte Konjugat nicht vom Antikörper gebunden wurde. Das Verhältnis von freier zu gebundener Aktivität für jede Standardkonzentration wurde bestimmt, indem die mittlere Response (freie Aktivität) durch den Unterschied zwischen der mittleren maximalen Response und der mittleren Response (gebundene Aktivität) geteilt wurde. Das Verhältnis von freier zu gebundener als eine Funktion der Konzentration von Morphin in der Probe wurde einer linearen Regressionsanalyse für die Standards unterzogen, die über der Schwellenwert-Konzentration lagen, die sich nicht der maximalen Response annäherten, wo der Fehler bei der Berechnung vom Verhältnis von freien zum gebundenen groß wird. Es zeigte sich, daß die Standards bei 60, 70 und 80 nM unterhalb der Schwellenwert-Konzentration lagen und keine Assay-Response zeigten, die das Hintergrundrauschen des Assaysystems überschritten. Die Standards bei 300, 400 und 500 nM erzeugten Responsen, die in der Nähe der maximalen Response lagen, was zu großen Fehlern bei der Berechnung des Verhältnisses vom freien zum gebundenen führte. Die durch die Standards bei 90, 100, 150 und 200 nM erzeugten Assay-Responseen wurden bei der linearen Regressionsanalyse verwendet, um die lineare Abhängigkeit des Verhältnisses von freiem zu gebundenem Konjugat als eine Funktion der Morphin-Konzentration zu bestimmen. Die Neigung der Geraden wurde zu 29,346 Einheiten pro uM bestimmt, und der Schnittpunkt des Verhältnisses von freien zu gebundenen auf der Achse lag bei -2,613 Einheiten. Diese Parameter sind Konstanten des Assaysystems, vorausgesetzt, daß die Assayreagenzien und ihre Volumina nicht abgeändert werden. Sie können verwendet werden, um die Konzentration von Morphin in Assayproben zu bestimmen, indem die Konzentration des Morphins aus
- [Morphin] =
- berechnet wird, wobei das Verhältnis von freiem zu gebundenem bestimmt wird, indem die Assay- Response für die Probe durch den Unterschied zwischen der maximalen Response und der Assay- Response geteilt wird. Unter Verwendung der einzelnen in diesem Assay für die sechs Wiederholungsversuche des Kalibrators bei 150 nM erhaltenen Responsen wurde die maximale Assay-Response bestimmt. Jede maximale Assay-Response wurde dann verwendet, um das Verhältnis von freiem zum gebundenen für jede Assayantwort für die 90-, 100- und 200-nM- Standards die entsprechende durch obige lineare Regression bestimmte Konzentation des Morphins zu berechnen. Die Verläßlichkeit uiid Genauigkeit bei der Bestimmung der Konzentrationen der Standards mittels dieses Verfahrens ist eine gute Annäherung der Leistungsfähigkeit des Assaysystems zur Bestimmung von unbekannten Konzentrationen an Morphin in Proben. Die in Tabelle V aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß das Assay sehr genau bei der Quantifizierung von Morphin-Konzentrationen im Bereich von 90 bis 200 nM ist. Es sollte angemerkt werden, daß die tatsächlichen Konzentrationen der Standards nicht notwendigerweise mit den Werten identisch sind, die der Verdünnung der obigen Stammlösung zugeschrieben werden. Der brauchbare Bereich des Assays deckt im allgemeinen den Bereich von 0,05 bis 4 bezüglich des Verhältnisses von freiem zu gebundenem ab. Der Bereich der Liganden- Konzentration, die diesem Bereich entspricht, kann gemäß den Zielen des Assaysystems unter Verwendung der hier beschriebenen Methoden gewählt werden. Tabelle V Quantitativer Morphin-Assay unter Verwendung eines einzelnen Referenzpunktes - 150 nm Kalibrator-Response (mOD/min) Maximale Response (mOD/min) Response (mOD/min) Berechnet [Morphin] (nM) Durchschnitt C.V. Durchschnitt C.V. Gesamtdurchschnitt Gesamt C.V.
- 75 ul einer Lösung aus 20 mg SMCC (Pierce) in 1 ml Acetonitril wurden 1,9 ml 20 mg/ml Rinderserumalbumin in 0,1 M Kaliumborat, 0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,5, hinzugesetzt. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 25ºC gerührt, dann wurde das Protein von dem nicht-umgesetzten Reagenz mittels Gelfiltrationschromatographie auf einer Säule, die GH 25 (Amicon Corporation) equilibriert in 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,0, enthielt, getrennt. Die Proteinfraktion wurde gesammelt. Ein Volumen von 0,42 ml 0,12 M Kaliumcarbonat, 0,6 mM EDTA in 40% Methanol wurden 4 mg Morphin- HCTL hinzugesetzt. Nach 10 Minuten wurden 140 ul der Lösung zu 8,2 ml des mit SMCC derivatisierten Rinderserumalbumins (4,6 mg/ml) hinzugefugt. Die Lösung wurde 2 Stunden lang bei 25ºC gerührt, dann in 2 Litern 10 mM (2-(N-Morpholino))ethansulfonsäure, pH 5,0, dialysiert. Der Dialysepuffer wurde zweimal gewechselt, bevor das Morphin-BSA-Konjugat gesammelt wurde.
- Kolloidales Gold mit einem mittleren Durchmesser von 45 nm wurde gemäß dem Verfahren von Frens, Nature, Physical Sciences, 241, 20 (1973), hergestellt. Das Konjugat aus Morphin und kolloidalem Gold wurde hergestellt, indem 5,6 ml 0,1 M (2-(N-Morpholino))ethansulfonsäure (MES), pH 5,8, tropfenweise zu 50 ml kolloidalem Gold unter schnellem Rühren hinzugesetzt wurden. Das Morphin-BSA-Konjugat (3 mg/ml in 10 mM MES, 0,02% Natriumazid, pH 5,8) wurde in einem Bolus dem kolloidalem Gold unter schnellem Rühren hinzugesetzt. Nach dem vollständigen Vermischen brach man das Rühren ab und inkubierte die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Die Hinzugabe von 1 ml BSA 3 mg/ml in 10 mM MES, 0,02% Natriumazid, pH 5,8) unter Mischen und eine fünf-minütige Inkubation folgten. Polyethylenglykol (mittleres Molekulargewicht 20.000) wurde in einer 1 %igen Lösung (0,59 ml) hinzugesetzt und gemischt. Das kolloidale Gold wurde einer Zentrifugation bei 27.000 g und 4º 12 Minuten lang unterzogen, um es zu pelletieren. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde zweimal mit 35 ml 10 mM Kaliumphosphat, 0,01% Polyethylenglykol, 0,02% Natriumazid, pH 7,0, gewaschen, indem es resuspendiert und einer Zentrifugation, wie beschrieben, unterzogen wurde. Nach der letzten Zentrifugation wurde das Pellet in 0,5 ml Puffer resuspendiert und bei 4ºC gelagert.
- Eine Assayvorrichtung mit terminaler Festphase wurde unter Verwendung einer Nylonmembran (Pall Biodyne C, 1,2 um Porengröße) konstruiert, indem die Membran auf eine Polystyrol kunststoffolie laminiert wurde, die eingestanzten Löcher mit 4 mm im Durchmesser und einen druckreaktiven Kleber (444 Acryl-Kleber, 3M Company) auf ihrer Oberfläche aufweis. Ein monoklonaler Antikörper gegen Morphin wurde auf der Nylonmembran, die in den Löchern im Polystyrol freilag, durch Adsorption immobilisiert. Eine 1 mg/ml Lösung des Antikörpers in Natriumcitrat von 0,1 M, pH 3,0, enthaltendem Puffer wurde auf die Membran (6 ul pro Loch) aufgegeben und für einige wenige Minuten adsorbieren gelassen, bevor eine 0,5% Kasein, 0,5% BSA, 0,1 M Kaliumphosphat, 10% Sucrose pH 7,0, enthaltende Lösung aufgegeben wurde (10 ul pro Loch), um die verbliebenen Adsorptionsstellen zu blockieren. Die in den Reaktionsmischungen angewandten Reagenzien und Proben waren folgende: das oben beschriebene Konjugat aus Morphin und kolloidalem Gold, verdünnt mittels eines Faktors von 3 in 1% BSA, 0,1 M Kaliumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, 0,01 M EDTA, 0,01% Polyethylenglykol (mittleres Molekulargewicht = 20.000), 0,02% Natriumazid, pH 7,0 (hierin als Verdünnungsmittel bezeichnet), ein monoklonaler Antikörper gegen Morphin in einer Konzentration von 0,27 mg/ml im Verdünnungsmittel und Morphin-Standards bei 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45 und 0,5 ug/ml in Urin. Die Standards wurden durch direkte Verdünnung einer 1 ug/ml-Lösung in opiatfreiem Urin hergestellt. Die 1 ug/ml-Lösung wurde aus der 1 mg/ml-Stammlösung, die durch Auflösung einer eingewogenen Menge an Morphinsulfat hergestellt worden war, hergestellt. Die Assays wurden in Mikrotiterplatten-Vertiefungen durch Zugabe von 10 ul der Antikörperlösung, 20 ul der Probe und 10 ul des Konjugats, gefolgt durch eine Inkubation von 5 Minuten vor der Kontaktierung von 20 ul der Reaktionsmischung mit einer der Nylonmembranen mit immobilisiertem Antikörper in der Assayvorrichtung, durchgeführt. Die im Loch freiliegende Membran wurde dann mit Saugpapier von der Bodenseite her kontaktiert, so daß die Reaktionsmischung durch die Membran und in das Saugpapier gezogen wurde. Jedwedes nicht an der Membran gebundene Konjugat wurde durch die Addition von einem Tropfen boratgepufferter Salzlösung mit 0,02% Lubrol, einem nichtionischen Detergenz, pH 8,0, weggewaschen, während die Membran mit dem Saugpapier im Kontakt stand, so daß die Waschlösung durch die Membran gezogen wurde. Die auf der Membran verbleibende Färbung wurde visuell festgestellt und instrumentell unter Verwendung eines Macbeth Color-eye bei 540 nm bestimmt. Die Daten wurden in E*-Einheiten umgewandelt, welche ein Maß des minimalen Farbunterschiedes darstellt, der mit dem menschlichen Auge noch wahrgenommen werden kann. Eine vollständigere Beschreibung dieser Maßeinheit der Färbung kann in Color in Business, Science and Industry, von D.B. Judd und G. Wyszecki, John Wiley and Sons, gefunden werden. Die Assays wurden im Einfachblindversuch unter Verwendung von kodierten Proben in statistischer Reihenfolge durchgeführt, so daß die Konzentrationen der Proben während des Assays nicht bekannt waren. Mit jeder Probe wurden insgesamt neun Wiederholungsassays durchgeführt. Ein Assay, der zu einer Farbung führte, die visuell über der Hintergrundfärbung der Membran detektierbar war, wurde als positiv eingestuft. Die Ergebnisse der visuellen Interpretation der Assays sind in Fig. 7 zusammengefaßt. Die Ergebnisse zeigen, daß das Assay auf genaue Weise die Konzentration des Morphins in Proben in Relation zur Schwellenwert- Konzentration von 0,3 ug/ml bestimmen kann. Die instrumentelle Messung der Assay-Responsen ist in Fig. 8 zusammengefaßt. Das erste detektierbare visuelle Signal oberhalb der Hintergrundfärbung der Membran trat bei 0,3 ug/ml auf, wie sich herausstellte, und die Färbung der Reaktion verstärkte sich nachgewiesenermaßen schnell oberhalb der Schwellenwert-Konzentration.
- 77 mg (1,7x10&supmin;&sup4; Mol) Estron-3-glucuronid, 29 mg (1,9x10&supmin;&sup4; Mol) Homocysteinthiolactonhydrochlorid und 0,015 ml (1,9x10&supmin;&sup4; Mol) Pyridin wurden in 0,47 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Mischung wurde einer 30 mg (1,9x10&supmin;&sup4; Mol) Dicyclohexylcarbodiimid in 0,23 ml Dimethylformamid enthaltenen Lösung hinzugesetzt. Der Kolben wurde mit Argon gespült, verschlossen und 3 Stunden lang bei 25ºC gerührt. Das unlösliche Präzipitat wurde abfiltriert, und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in 0,4 ml einer Ethanol/Wasser(15:12 v/v)-Lösung resuspendiert, und die unlöslichen Präzipitate wurden durch Filtration entfernt.
- Die rohe Reaktionsmischung wurde dann in 0,5 ml einer Ethanol/Wasser(15:12 v/v)-Lösung gelöst und auf eine C18-HPLC-Säule (1 cm x 25 cm) equilibriert mit einer Mischung aus Methanol/Wasser im Verhältnis 1:9 unter Verwendung einer Fließrate von 2,0 ml/min, gegeben. Die Verbindung wurde mit einem Gradientenanstieg von einer Methanol/Wasser-Mischung im Verhältnis von 1:9 zu einer Methanol/Wasser-Mischung im Verhältnis 1:1 innerhalb von 8 Minuten eluiert, und dann wurde linear zu einer 100%igen Methanollösung innerhalb von weiteren 20 Minuten umgestellt. E3G-HCTL eluierte innerhalb von 25 bis 27 Minuten. Die produkthaltigen Fraktionen wurden vereinigt, und das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. 63 mg E3G-HCTL wurden gewonnen.
- E3G-HCTL wurde hydrolisiert, indem 3 ul einer 210 mM E3G-HCTL-Methanol-Lösung in 20 ul einer 0, 12 M K&sub2;CO&sub3; und 0,6 mM EDTA in 40% Methanol enthaltenen Lösung zugegeben wurde. Nach zehn Minuten bei 25ºC wurde die Lösung zu 0,5 ml einer Lösung, die 1,8 mg/ml alkalische Phosphatase-SMCC mit 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat, 0,15 M Natriumchlorid und 0,2 mM MgCl&sub2; bei pH 7,0 enthielt, hinzugegeben. Die Derivatisierung der alkalischen Phosphatase mit Sulfo-SMCC ist obenstehend in Beispiel 4 beschrieben.
- Die Reaktionslösung wurde drei Stunden bei 25ºC gerührt und dann die resultierende Lösung über eine 14 ml großen Säule aus GH 25 (Amicon) chromatographiert, welche mit einer Lösung aus 0,1 M Kaliumphosphat, 0,02 M Kaliumborat und 0,15 M Natriumchlorid bei einem pH von 7,0 equilibriert worden war. Das Eluat des alkalischen Phosphatase-E3G-Konjugats wurde gesammelt und führte zu einer Ausbeute von 1,5 ml bei einer Konzentration von 0,16 mg/ml.
- Sechs 1,8" x 2,0"-Tafeln aus Nylonmembran (5,0 um Pall Biodine C) wurden hergestellt, indem die Tafeln in 6 ml einer Lösung aus 0,41 mg/ml eines monoklonalen anti-E3G-Antikörpers und 0,1 M Natriumcitrat bei einem pH von 3,0 gestellt wurden. Die Lösung wurde 1,5 Stunden bei 25ºC geschüttelt und dann wurden die überschüssige Proteinbindungsstellen auf den Membranen blockiert indem die Membrantafeln in 20 ml einer Lösung aus 0,1 M Kaliumphosphat, 0, 1% w/v Kasein, 0,1% v/v Triton X-100 und 10% w/v Sucrose bei einem pH von 7,0 gestellt wurden, und anschließend konnten die Tafeln drei Minuten einweichen. Die Membranen wurden durch Abtupfen getrocknet und dann in einen Vakuum-Exsikkator über Nacht gestellt.
- Die Membranen wurden zu Streifen einer Größe von 0,3" x 2" geschnitten und dann auf einem Polystyrolstreifen (1" x 3" x 0,020") mit doppelseitigem Kleber (3M Co-444) befestigt. Der Polystyrolstreifen und das Haftlaminat besaßen einen 0,1" x 1,5" großen Schlitz bzw. Einschnitt in der Mitte des zweischichtigen Laminats eingeschnitten.
- Die Reaktionsmischungen wurden hergestellt, indem die Estron-3-glucuronid und Alkalische- Phosphatase-E3G (AP-E3G) enthaltenden Proben mit einem monoklonalen anti-E3G-Antikörper gemischt wurden. Somit wurden Lösungen hergestellt, die 0,9 mg/ml AP-E3G, 0,18 mg/ml monoklonalen anti-E3G-Antikörper und E3G bei folgenden Konzentrationen enthielten: 0,1 uM, 1,6 uM, 2,6 uM, 7,8 uM, 26 uM und 130 uM. Die Reaktionsmischungen wurden acht Minuten lang bei 25ºC inkubieren gelassen, wonach 50 ul der Reaktionsmischung auf ein Ende des Einschnitts auf dem Membran/Polystyrol-Laminat aufgetragen wurden. Der Reaktionsmischung wurde ermöglicht, die Membranvorrichtung vertikal hochzuwandern. Nachdem die Wanderung der Reaktionsmischung abgeschlossen war (innerhalb etwa 12 Minuten), wurde die Membranvorrichtung gewaschen, indem die Vorrichtung in Kontakt mit einem Absorptionsmittel gebracht wurde und mit 0,5 ml einer Lösung aus 50 mM Kaliumborat, 0,15 M NaCl und 0,05% v/v Lubrol gewaschen wurde. Ein 100 ul-Aliquot einer Enzym-Substratlösung, die 4 mg/ml Indoxylphosphat, 0,2 M AMP, 0,5 Tris und 0,1% w/v Natriumazid bei einem pH von 10,2 enthielt, wurde auf die Membran aufgebracht, und dem Enzym wurde ermöglicht, das Substrat eine Minute lang umzuwandeln. Der Substratumwandlungsschritt wurde mit einem 300 ul großen Aliquot einer Lösung aus 0,5 M EDTA bei einem pH von 8,0 abgebrochen. Die Länge des gefärbten Bereiches des Einschnitts wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle VI tabuliert. Tabelle VI
- Der Rf gibt die Strecke des Weges vom AP-E3G-Konjugat entlang der Membran als eine Funktion der Gesamtstrecke des Weges der Reaktionsmischung an.
Claims (38)
1. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge mindestens eines Zielliganden, der in
der Lage ist, mit einem Ligandenanalogon-Konjugat um auf einem Ligandenrezeptor
verfügbare Bindungsstellen zu kompetitieren, wobei das Ligandenanalogon-Konjugat mindestens
ein an ein Signal erzeugendes Element, das zur Aussendung eines detektierbares Signals in
der Lage ist, gebundenes Ligandenanaloges umfaßt, in einer fluiden Probe, die
erwarteterweise den Zielliganden enthält, umfassend die Schritte:
a. Kontaktieren der fluiden Probe mit dem Ligandenanalogon-Konjugat und dem
Ligandenrezeptor zur Bildung einer Reaktionsmischung, wobei die relativen Mengen des
Ligandenanalogon-Konjugats und des Ligandenrezeptors so gewählt werden, daß in
Abwesenheit des Zielliganden und nach einer im wesentlichen abgelaufenen
Gleichgewichtsbindung in der Reaktionsmischung im wesentlichen das ganze
Ligandenanalogon-Konjugat an dem Ligandenrezeptor gebunden ist, so daß kein ungebundes
Ligandenanalogon-Konjugat als ein Ergebnis des Assay-Verfahrens detektiert wird;
b. Detektieren des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugats in der
Reaktionsmischung;
c. In-Bezug-Setzen des detektierbaren Signals zur Anwesenheit oder Menge des
Zielliganden in der fluiden Probe.
2. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge mindestens eines Zielliganden bei
oder oberhalb mindestens einer vorbestimmten Schwellenwert-Ligandenkonzentration,
wobei der Zielligand in der Lage ist, mit einem Ligandenanalogon-Konjugat um die auf einem
Ligandenrezeptor verfügbaren Bindungsstellen zu kompetitieren, wobei das
Ligandenanalogon-Konjugat mindestens ein an ein Signal erzeugendes Element, das zur Aussendung
eines detektierbares Signals in der Lage ist, gebundenes Ligandenanaloges umfaßt, in einer
fluiden Probe, die erwarteterweise den Zielliganden enthält, umfassend die Schritte:
a. Kontaktieren der fluiden Probe mit Ligandenanalogon-Konjugat und dem
Ligandenrezeptor unter Bildung einer Reaktionsmischung;
(i) die relativen Mengen des Ligandenanalogon-Konjugats und des
Ligandenrezeptors sind so gewählt, daß in Abwesenheit des Zielliganden und nach einer im
wesentlichen abgelaufenen Gleichgewichtsbindung in der Reaktionsmischung im
wesentlichen das ganze Ligandenanalogon-Konjugat an dem Ligandenrezeptor
gebunden ist, so daß kein ungebundenes Ligandenanalogon-Konjugat als
Ergebnis des Assay-Verfahrens detektiert wird; und
(ü) die relativen und absoluten Mengen des Ligandenanalogon-Konjugats und des
Ligandenrezeptors sind so gewählt, daß mindestens eine der vorbestimmten
Schwellenwert-Ligandenkonzentrationen unter der Konzentration liegt, wo kein
ungebundenes Ligandenanalogon-Konjugat als ein Ergebnis der Assay-Methode
detektiert wird,
b. Detektieren des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugats in der
Reaktionsmischung;
c. In-Bezug-Setzen des detektierbaren Signals zur Gegenwart oder Menge des
Zielliganden bei oder oberhalb der vorbestimmten Schwellenwert-Ligandenkonzentration.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, in dem der Ligandenrezeptor aus der
Reaktionsmischung nach Schritt (a) entfernt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei eine feste Trägervorrichtung bei dem Entfernungsschritt
verwendet wird, um den Ligandenrezeptor aus der Reaktionsmischung zu entfernen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, worin mindestens ein Rezeptor, der gegen den
Ligandenrezeptor gerichtet ist, auf dem festen Träger immobilisiert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, worin die feste Trägervorrichtung aus der Gruppe gewählt
wird, die aus diffusionsfähigen Perlen, Membranen, Filtern und porösen Matrices besteht.
7. Verfahren nach Anspruch 3, worin in dem Entfernungsschritt Ligandenrezeptor und daran
gebundene Teile aus der Reaktionsmischung durch Präzipitation entfernt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei mindestens ein Rezeptor, der gegen den
Ligandenrezeptor gerichtet ist, verwendet wird, um den Ligandenrezeptor und daran gebundene Teile zu
präzipitieren.
9. Verfahren nach Anspruch 3, worin mindestens einer der Ligandrezeptoren in der
Reaktionsmischung ein Ligandenkomplement-Ligandenrezeptor-Molekül ist und die
Reaktionsmischung mit mindestens einem Ligandenkomplementrezeptor, befähigt zur Bindung daran,
kontaktiert wird, und wobei der Ligandenkomplementrezeptor verwendet wird, um den
Ligandenkomplement-Ligandenrezeptor und daran gebundene Teile aus der
Reaktionsmischung zu entfernen.
10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das Liganderkomplement-Ligandenrezeptor-Molekül an
dem Ligandenrezeptor kovalent gebundenes Biotin ist und der
Ligandenkomplementrezeptor Avidin ist.
11. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin der Ligandenrezeptor eine Diffusionsbewegung
während des kompetitiven Wettbewerbs um die Ligandenrezeptorbindungsstellen
durchmacht, welcher zwischen dem Zielliganden und dem Ligandenanalogon-Konjugat abläuft.
12. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei der Ligandenrezeptor auf einer nicht
diffundieren festen Phase immobilisiert ist.
13. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Verfahren ein Immunoassay ist, in dem der
Ligandenrezeptor ein Antikörper ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Antikörper monoklonal ist.
15. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin die Anzahl der an das signalerzeugende
Element gekoppelten Ligandenanaloge zwischen 1 und 50 ist.
16. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Anzahl der an das signalerzeugende
Element gekoppelten Ligandenanaloge zwischen 1 und 10 liegt.
17. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, welches ferner mindestens einen auf einer festen
Phase an mindestens einem bestimmten Ort oder Orten immobilisierten Ligandenrezeptor
zur Detektion mindestens eines ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugats in der
Reaktionsmischung umfaßt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die feste Phase aus der Gruppe gewählt wird, die aus
porösen und nicht-porösen Matrices, Perlen, Membranen und Filtern besteht.
19. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die feste Phase eine so in eine Vorrichtung
eingebrachte Membran ist, daß die Reaktionsmischung mit der Membran kontaktiert wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, mit einer Vorrichtung zur Entfernung des ungebundenen
Ligandenanalogon-Konjugats von der Membran und mit einer Vorrichtung zur
Kontaktierung der signalerzeugenden Phase mit dem Ligandenanalogon-Konjugat, gebunden an den
auf der Membran immobilisierten Rezeptor.
21. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Reaktionsmischung ebenfalls ein
Ligandenkomplement-Ligandenanalogon-Konjugat enthält und worin mindestens ein
Ligandenkomplementrezeptor auf einer festen Phase an mindestens einem bestimmten Ort oder Orten
immobilisiert ist zur Detektion mindestens eines ungebundenen Ligandenkomplement-
Ligandenanalogon-Konjugats in der Reaktionsmischung.
22. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Reaktionsmischung ebenfalls ein
Ligandenkomplement-Ligandenanalogon-Konjugat enthält und worin mindestens ein Ligandenrezeptor und
mindestens ein Ligandenkomplementrezeptor auf einer festen Phase an bestimmten Orten
immobilisiert sind zur Bestimmung mindestens eines ungebundenen
Ligandenanalogon-Konjugats und mindestens eines ungebundenen
Ligandenkomplement-Ligandenanalogon-Konjugats in der Reaktionsmischung.
23. Verfahren nach Anspruch 19, 21 oder 22 mit mindestens einem Ort oder Orten, die zur
halbquantitativen Bestimmung von mindestens einem Zielliganden für mindestens eine
Konzentration des Zielliganden in der fluiden Probe in der Lage sind.
24. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das signalerzeugende Element durch eine
nicht-instrumentale Vorrichtung detektiert wird.
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das signalerzeugende Element mittels einer visuellen
Methode detektiert wird.
26. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das signalerzeugende Element ein Enzym ist.
27. Verfahren zur Bestimmung der Menge mindestens eines Zielliganden, der in der Lage ist, mit
einem Ligandenanalogon-Konjugat um auf einem Ligandenrezeptor verfügbare
Bindungsstellen zu kompetitieren, wobei das Ligandenanalogon-Konjugat mindestens ein an ein
Signal erzeugendes Element, das zur Aussendung eines detektierbares Signals in der Lage
ist, gebundenes Liganden-Analoges umfaßt, in einer fluiden Probe, umfassend die Schritte:
a. Kontaktieren der fluiden Probe mit dem Ligandenanalogon-Konjugat und dem
Ligandenrezeptor zur Bildung einer Reaktionsmischung, wobei die relativen Mengen des
Ligandenanalogon-Konjugats und des Ligandenrezeptors so gewählt werden, daß in
Abwesenheit des Zielliganden und nach einer im wesentlichen abgelaufenen
Gleichgewichtsbindung in der Reaktionsmischung im wesentlichen das ganze
Ligandenanalogon-Konjugat an den Ligandenrezeptor gebunden ist, so daß kein ungebundes
Ligandenanalogon-Konjugat als ein Ergebnis des Assay-Verfahrens detektiert wird;
b. Detektieren des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugats in der
Reaktionsmischung;
c. In-Bezug-Setzen des detektierbaren Signals zu der Menge des Zielliganden in der
fluiden Probe unter Verwendung der Beziehung, daß, wenn die Affinität des Rezeptors
zum Ligandenanalogon-Konjugat im wesentlichen größer als das Inverse der
Rezeptorkonzentration ist, dann das Verhältnis des freien zum gebundenen
Ligandenanalogon-Konjugat eine lineare Funktion der Ligandenkonzentration über im wesentlichen
den gesamten Assay-Bereich ist.
28. Verfahren zur Bestimmung der Menge mindestens eines Zielliganden, wobei der Zielligand
in der Lage ist, mit einem Ligandenanalogon-Konjugat um die auf einem Ligandenrezeptor
verfügbaren Bindungsstellen zu kompetitieren, wobei das Ligandenanalogon-Konjugat
mindestens ein an ein Signal erzeugendes Element, das zur Aussendung eines detektierbares
Signals in der Lage ist, gebundenes Ligandenanaloges umfaßt, in einer fluiden Probe,
umfassend die Schritte:
a. Kontaktieren der fluiden Probe mit Ligandenanalogon-Konjugat und dem
Ligandenrezeptor unter Bildung einer Reaktionsmischung;
(i) die relativen Mengen des Ligandenanalogon-Konjugats und des
Ligandenrezeptors sind so gewählt, daß in Abwesenheit des Zielliganden und nach einer im
wesentlichen abgelaufenen Gleichgewichtsbindung im wesentlichen das ganze
Ligandenanalogon-Konjugat an dem Ligandenrezeptor gebunden ist, so daß
kein ungebundenes Ligandenanalogon-Konjugat als Ergebnis des Assay-
Verfahrens detektiert wird; und
(ii) die relativen Mengen des Ligandenanalogon-Konjugats und des
Ligandenrezeptors sind so gewählt, daß mindestens eine der vorbestimmten
Schwellenwert-Ligandenkonzentrationen unter der Konzentration liegt, wo kein
ungebundenes Ligandenanalogon-Konjugat-Signal als ein Ergebnis der Assay-Methode
detektiert wird;
b. Detektieren des ungebundenen Ligandenanalogon-Konjugats in der
Reaktionsmischung;
c. In-Bezug-Setzen des detektierbaren Signals zu der Menge des Zielliganden in der
fluiden Probe unter Verwendung der Beziehung, daß, wenn die Affinität des
Rezeptors für das Ligandenanalogon-Konjugat im wesentlichen größer als das Inverse der
Rezeptorkonzentration ist, dann das Verhältnis des freien zum gebundenen
Ligandenanalogon-Konjugats eine lineare Funktion der Ligandenkonzentration über im
wesentlichen den gesamten Assay-Bereich ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, worin die Affinität des Rezeptors für das
Ligandenanalogon-Konjugat mindestens 500mal größer als das Inverse der Rezeptorkonzentration
ist.
30. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Reaktionsmischung ein Ligandenkonjugat
zur negativen Kontrolle und einen Ligandenrezeptor zur negativen Kontrolle enthält, wobei
die Detektion des ungebundenen Ligandenkonjugats zur negativen Kontrolle in der
Reaktionsmischung eine Indikation für ein ungültiges Verfahrensergebnis ist.
31. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Reaktionsmischung mindestens ein
Ligandenkonjugat zur Referenz enthält, wobei die Detektion des Ligandenkonjugats zur Referenz
mindestens eine Referenzkonzentration für mindestens einen Zielliganden definiert, welcher
in Verbindung mit der vorbestimmten Schwellenwertkonzentration für den Zielliganden
verwendet wird, um das Ansprechen des Verfahrens zu dem Bereich der
Zielligandenkonzentration in Beziehung zu setzen.
32. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das signalerzeugende Element ein kolloidales
Goldteilchen ist.
33. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Reaktionsmischung (1) mindestens ein
Ligandenkonjugat zur negativen Kontrolle und mindestens einen Ligandenrezeptor zur
negativen Kontrolle, der zur Bindung daran in der Lage ist, enthält, wobei der
Ligandenrezeptor zur negativen Kontrolle in einem leichten Überschuß gegenüber der Menge vorliegt,
die zur Bindung des gesamten Ligandenkonjugats zur negativen Kontrolle benötigt wird,
und (2) mindestens einen Ligandenrezeptor zur positiven Kontrolle enthält, der zur Bindung
daran in der Lage ist, wobei das Ligandenkonjugat zur positiven Kontrolle in leichtem
Überschuß gegenüber der Menge des Ligandenrezeptors zur positiven Kontrolle zur
Bestätigung der Assay-Antwort vorliegt.
34. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von mindestens einem Zielliganden, der in der
Lage ist, mit einem Ligandenanalogon-Konjugat um auf einem Ligandenrezeptor verfügbare
Bindungsstellen zu kompetitieren, wobei das Ligandenanalogon-Konjugat mindestens ein an
ein kolloidales Goldteilchen gekoppeltes Ligandenanaloges enthält, in einer fluiden Probe,
das erwartungsgemäß den Zielliganden enthält, umfassend die Schritte:
a. Kontaktieren der fluiden Probe mit dem Ligandenanalogon-Konjugat und dem
Ligandenrezeptor zur Bildung einer Reaktionsmischung, wobei die relativen Mengen des
Ligandenanalogon-Konjugats und des Ligandenrezeptors so gewählt werden, daß in
Abwesenheit des Zielliganden und nach einer im wesentlichen abgelaufenen
Gleichgewichtsbindung in der Reaktionsmischung im wesentlichen das ganze
Ligandenanalogon-Konjugat an dem Ligandenrezeptor gebunden ist, so daß kein ungebundes
Ligandenanalogon-Konjugat als ein Ergebnis des Assay-Verfahrens detektiert wird;
b. Detektieren von ungebundenem Ligandenanalogon-Konjugat in der
Reaktionsmischung mittels einer visuellen Methode unter Verwendung mindestens eines auf einer
festen Phase an mindestens einem bestimmten Ort immobilisierten Ligandenrezeptors;
c. In-Bezug-Setzen des detektierbaren Signals zur Gegenwart des Zielliganden in der
fluiden Probe.
35. Verfahren nach Anspruch 34, in dem der Ligandenrezeptor aus der Reaktionsmischung nach
Schritt (a) entfernt wird.
36. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart mindestens eines Zielliganden bei oder oberhalb
mindestens einer vorbestimmten Schwellenwert-Ligandenkonzentration, wobei der
Zielligand in der Lage ist, mit einem Ligandenanalogon-Konjugat um die auf einem
Ligandenrezeptor verfügbaren Bindungsstellen zu kompetitieren, wobei das
Ligandenanalogon-Konjugat mindestens ein mit einem kolloidalen Goldteilchen verbundenes
Ligandenanaloges umfaßt, in einer fluiden Probe, die erwarteterweise den Zielliganden enthält,
umfassend die Schritte:
a. Kontaktieren der fluiden Probe mit Ligandenanalogon-Konjugat und dem
Ligandenrezeptor unter Bildung einer Reaktionsmischung;
(i) die relativen Mengen des Ligandenanalogon-Konjugats und des
Ligandenrezeptors sind so ausgewählt, daß in Abwesenheit des Zielliganden und nach einer im
wesentlichen abgelaufenen Gleichgewichtsbindung in der Reaktionsmischung in
wesentlichen das ganze Ligandenanalogon-Konjugat an dem Ligandenrezeptor
gebunden ist, so daß kein ungebundenes Ligandenanalogon-Konjugat als
Ergebnis des Assay-Verfahrens detektiert wird; und
(ii) die relativen und absoluten Mengen des Ligandenanalogon-Konjugats und des
Ligandenrezeptors werden so gewählt, daß mindestens eine der vorbestimmten
Schwellenwert-Ligandenkonzentrationen unter der Konzentration liegt, wo kein
ungebundenes Ligandenanalogon-Konjugat als ein Ergebnis der Assay-Methode
detektiert wird;
b. Detektieren von ungebundenem Ligandenanalogon-Konjugat in der
Reaktionsmischung mittels einer visuellen Methode unter Verwendung mindestens eines auf einer
festen Phase immobilisierten Ligandenrezeptors an mindestens einem bestimmten Ort;
c. In-Bezug-Setzen des detektierbaren Signals zur Gegenwart des Zielliganden bei oder
oberhalb der vorbestimmten Schwellenwert-Ligandenkonzentration in der fluiden
Probe.
37. Verfahren nach Anspruch 36, bei dem der Ligandenrezeptor aus der Reaktionsmischung
nach Schritt (a) entfernt wird.
38. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart oder Menge mindestens eines Zielliganden, der
zur Bindung an einer ersten Bindungsstelle zu einem ersten Ligandenrezeptor und
gleichzeitig zur Bindung an einer zweiten Bindungsstelle zu einem zweiten Ligandenrezeptor-
Konjugat in der Lage ist, wobei das zweite Ligandenrezeptor-Konjugat mindestens einen
mit einem signalerzeugenden Element, das zur Aussendung eines detektierbaren Signals in
der Lage ist, gekoppelten Ligandenrezeptor umfaßt, in einer fluiden Probe, die
erwartungsgemäß den Zielliganden enthält, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist:
a. Kontaktieren der fluiden Probe mit dem ersten Ligandenrezeptor und dem zweiten
Ligandenrezeptor-Konjugat unter Bildung einer Reaktionsmischung, wobei die Menge
des ersten Ligandenrezeptors so gewählt wird, daß nach einer im wesentlichen
abgelaufenen Gleichgewichtsbindung in der Reaktionsmischung eine vorbestimmte
Menge eines Konjugatkomplexes aus erstem Ligandenrezeptor: Zielligand: zweitem
Ligandenrezeptor gebildet wird;
b. Kontaktieren der Reaktionsmischung mit einer festen Phase, die den immobilisierten
ersten Ligandenrezeptor enthält;
c. Detektieren von an der festen Phase gebundenem zweiten Ligandenrezeptor-
Konjugat;
d. In-Bezug-Setzen des detektierbaren Signals zur Gegenwart des Zielliganden bei oder
oberhalb einer vorbestimmten Schwellenwert-Zielligandenkonzentration.
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