DE69008690T2

DE69008690T2 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von aeroben Bakterien.

Info

Publication number: DE69008690T2
Application number: DE1990608690
Authority: DE
Inventors: Nariyoshi Kawabata
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 1989-12-27
Filing date: 1990-12-26
Publication date: 1994-08-25
Anticipated expiration: 2010-12-27
Also published as: EP0435767B1; EP0435767A3; JP2712677B2; JPH03198767A; EP0435767A2; DE69008690D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren für den Nachweis aerober Bakterien und eine Vorrichtung hierfür und insbesondere auf ein Verfahren (Aktivität) von aeroben Bakterien und eine Vorrichtung dafür.
Die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der Konzentration an lebensfähigen Bakterien, die in verschiedenen Proben zugegen sind, besteht darin, visuell Kolonien zu beobachten, welche durch aseptische Durchführung einer stationären Kultur einer kosntanten Menge an Proben auf einem Agarmedium während mindestens mehr als einem Tag hergestellt werden, um die Anzahl lebensfähiger Zellen auf der Basis der Anzahl Kolonien zu berechnen. Die Anzahl lebensfähiger Zellen kann aber auch mit einer Methode bestimmt werden, in dem mikrobielle Zellen zuerst aus einer Probe extrahiert werden, welche zu einer Farbstofflösung zugesetzt werden zum Färben und anschliessend die Anzahl gefärbter Zellen unter einem Mikroskop gezählt wird.
In der erstgenannten Methode ist es jedoch ziemlich umständlich und zeitraubend, eine Probe auf ein bestimmtes Verdünnungsverhältnis unter einer aseptischen Bedingung zu verdünnen, eine stationäre Kultur während mehreren Tagen durchzuführen und die entstandenen Kolonien visuell zu zählen. In der zweiten Methode werden tote Bakterien, welche in den Proben enthalten sind, verschiedene Feststoffe im Kulturmedium und dergleichen auf ähnliche Weise wie lebensfähige Bakterien gefärbt, so dass es ziemlich schwierig ist, die Anzahl lebensfähiger Zellen von Bakterien genau zu bestimmen.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen von Bakterien und dergleichen auf der Basis einer enzymatischen Messung der Katalase-Aktivität von Bakterien oder Hefen wurde vorgeschlagen (Japanische geprüfte Offenlegungsschrift No. 15999/1980 und U.S. Patent No. 3.383.034). Dieses konventionelle Verfahren umfasst jedoch die Nachteile, dass es die Extraktion von Bakterien und dergleichen aus der Probe erfordert, dass es umständlich ist, geeignete Bedingungen für die Enzymreaktion festzusetzen und dass es schwierig ist, eine rasch ansprechende Bestimmung zu erzielen.
JP 56 140 898 beschreibt eine Vorrichtung umfassend zwei Abteile: in einem Abteil ist eine Elektrode in einer Phosphorsäure-Pufferlösung, welche eine Nährstoffquelle enthält, angebracht und mit Sauerstoff gesättigt; im anderen werden die Bakterien in einer Musterlösung am Leben erhalten. Die Abteile sind durch eine Membran getrennt, welche den Durchgang der Nährstoffe und Sauerstoff erlaubt, aber nicht denjenigen von Bakterien. Die Anzahl lebender Zellen wird auf der Stärke des Stromes, gemessen mit der Sauerstoff-Elektrode, bestimmt.
Es bestand tatsächlich ein grosser Bedarf für eine rasche Messung der Konzentration von lebensfähigen Zellen in der Produktionskontrolle der Fermentation und der Qualitätskontrolle von verderblichen Nahrungsmitteln. Wie bereits erwähnt, war jedoch bisher keine Praktische Nachweismethode vorhanden, welche die obigen Bedürfnisse erfüllt.
Ein Ziel der Erfindung ist die Beschaffung eines Verfahrens und einer Vorrichtung zur raschen und genauen Bestimmung der Anzahl lebender Zellen von aeroben Bakterien, die in einer Probe vorhanden sind, unter Verwendung einer einfachen Operation.
JP 62 041 641 beschreibt die Verwendung von Vinylpolymeren, welche eine substituierte Pyridiniumgruppe aufweisen, als mikrobielles Adsorptionsmittel für die Kontrolle von Mikroorganismen.
EP 0 160 276, welches gemäss Artikel 54(3) und (4) EPÜ als zum Stand der Technik gehörend zu betrachten ist, beschreibt einen mikrobiellen Sensor, bestehend aus einem Behälter, gefüllt mit einem mikrobiellen Adsorptionsmittel, umfassend ein Polymer, welches eine Pyridiniumgruppe der Formel (A):
enthält, in welcher R eine Benzylgruppe, eine Phenäthylgruppe, eine Alkylgruppe mit 1 bis 16 Kohlenstoffatomen oder eine Pentafluorphenylmethylgruppe bedeutet und X ein Halogenatom darstellt, und eine elektrochemische Bestimmungsvorrichtung, wie eine Sauerstoffelektrode. Der Behälter und die Bestimmungsvorrichtung sind getrennt im mikrobiellen Sensor angeordnet.
Die vorliegende Erfindung erfolgte auf Grund der Feststellung des Erfinders, dass ein geeignetes, in Wasser unlösliches Pyridiniumharz fähig ist, Bakterien in lebendem Zustand intensiv festzuhalten.
Das in Wasser unlösliche Harz vom Pyridinium- Typus, welches in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Vinylcopolymer, zusammengesetzt aus den Komponenten-Einheiten, wie sie durch die folgenden Formeln (I) und (II) dargestellt sind, oder ein vernetztes Vinylpolymer, gebildet durch Vernetzung des Polymers zusammengesetzt aus den Komponenten-Einheiten der Formel (I) durch Verwendung einer polymeren Kette, zusammengesetzt aus der Einheit der Formel (II):
in welcher R&sub1; eine Benzylgruppe, eine Alkylgruppe mit C&sub4; bis C&sub1;&sub6; oder eine Arylgruppe bedeutet, R&sub2; eine Alkylgruppe mit C&sub1; bis C&sub3; darstellt, X ein Halogenatom ist und Y ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit C&sub1; bis C&sub3;, eine Benzylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aethergruppe, eine Carboxygruppe oder eine veresterte Carboxygruppe darstellt, und das molare Verhältnis der Komponenteneinheit (I) zu (II) von 1 : 20 bis 1 : 0,01 beträgt.
Dieses Verhältnis erlaubt es, die Bakterien wirksam festzuhalten, während die Unlöslichkeit in Wasser beibehalten wird.
Ein Polymerisationsgrad von mehr als 100 sollte üblicherweise als genügend betrachtet werden, mit Ausnahme des vernetzten Polymers, in welchem es schwierig ist, den Grad zu definieren.
Das oben genannte, in Wasser unlösliche Harz vom Pyridinium-Typus kann aus den entsprechenden Monomeren gemäss üblicher Polymerisationsverfahren oder Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Ein im Handel erhältliches, in Wasser unlösliches Harz vom Pyrinium-Typus in Form von Pulver, Partikel, Membran, Faser und dergleichen kann jedoch auch verwendet werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen von aeroben Bakterien zur Verfügung gestellt, welches das Aufbringen einer Schicht des oben erwähnten, in Wasser unlöslichen Harzes vom Pyridinium-Typus auf dem Messabschnitt einer Sauerstoff-Messelektrode, das Inberührungbringen einer wässerigen, bakterienhaltigen Probe mit der in Wasser unlöslichen Harzschicht vom Pyridinium- Typus und die Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen von aeroben Bakterien in der Probe auf der Basis der festgestellten Leistung der Sauerstoff-Messelektrode nach Berührung der Probe mit der Harzschicht vom Pyridinium-Typus, umfasst.
Ferner wird gemäss der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Bestimmung aerober Bakterien geliefert, welche eine Sauerstoff-Messelektrode, welche einen Sauerstoff messenden Abschnitt und eine Durchflusszelle enthält, welche fähig ist, eine wässerige Probe durchzulassen, während die Probe in Berührung mit dem den Sauerstoff messenden Abschnitt ist, wobei die Durchflusszelle mit dem oben erwähnten, in Wasser unlöslichen Harz vom Pyridinium-Typ gefüllt ist.
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendende Sauerstoff-Messelektrode kann mit Vorteil eine Sauerstoff-Messelektrode vom Diaphragma-Typus sein.
Die Bestimmung der vorliegenden Erfindung kann in solcher Weise durchgeführt werden, dass das in Wasser unlösliche Harz vom Pyridinium-Typus zuerst in eine Messzelle eingefüllt wird, und eine Probe sodann in die Zelle verbracht wird, wobei der Messabschnitt der Sauerstoff- Messelektrode darin eingeführt ist. Es wird im allgemeinen bevorzugt, eine Vorrichtung zu verwenden, welche eine Sauerstoff-Messelektrode mit einem Sauerstoff messenden Abschnitt aufweist, welcher mit einer, mit dem in Wasser unlöslichen Harz vom Pyridinium-Typus gefüllten Durchflusszelle ausgestattet ist, so dass die Bestimmungsmethode der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden kann, indem die Probe durch die Durchflusszelle in einer vorbestimmten Zeit hindurchgeleitet wird. Die geeignete Zeit zum Durchlaufen der Probe beträgt 10 bis 30 Minuten, und eine belüftete Probe kann in die Durchflusszelle eingeführt werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung kann die Anzahl lebender Zellen (Aktivität) verschiedener, in der Probe enthaltener aeroben Bakterien rasch bestimmt werden auf der Basis einer Leistung der obigen Sauerstoff-Messelektrode. Die nach der vorliegenden Erfindung zu bestimmenden aeroben Bakterien sind allgemein aerobe Baktieren, welche zu ihrem Wachstum Sauerstoff benötigen und verbrauchen, einschliesslich sogenannte faktultativ anaerobe Bakterien, während anaerobe Bakterien, welche überhaupt keinen Sauerstoff verbrauchen, ausgeschlossen sind.
In der Methode der vorliegenden Erfindung wird eine wässerige Probe, welche Bakterien enthält, dazu geführt, mit dem in Wasser unlöslichen Harz von Pyridinium-Typus in Berührung zu treten um das Harz zu veranlassen, an seiner Oberfläche Bakterienzellen in lebendem Zustand quantitativ festzuhalten. Die festgehaltenen lebenden aeroben Bakterien verbrauchen Sauerstoff. Der Sauerstoffverbrauch wird entsprechend als Verminderung eines elektrischen Stromwertes (Leistung) durch die Sauerstoff- Messelektrode bestimmt. Der Sauerstoffverbrauch ist proportional zu der Anzahl festgehaltener und lebender Bakterien, sodass die Abnahme des elektrischen Stromwertes proportional zur Konzentration an lebenden Bakterien sein muss. Obwohl das unlösliche Harz vom Pyridinium-Typus auch tote Bakterienzellen festhält, verbrauchen die festgehaltenen toten Bakterien keinen Sauerstoff und bewirken keine Herabsetzung des elektrischen Stromwertes. Die Anzahl lebensfähiger Zellen (Aktivität), die in der Probe zugegen sind, kann direkt auf der Basis der Abnahme des elektrischen Stromwertes (Leistung) bestimmt werden, wodurch eine schnell ansprechende und genaue Bestimmung der aeroben Bakterien mit einer einfachen Operation ermöglicht wird.
Die Figuren 1(a) und 1(b) zeigen ein Beispiel einer Vorrichtung zur Bestimmung von aeroben Bakterien nach der vorliegenden Erfindung, wobei Fig. 1(a) eine auseinandergezogene, erläuternde Ansicht ist, welche die Vorrichtung zeigt, und Fig. 1(b) eine erläuternde Ansicht ist, welche die Konstruktion der fertig montierten Vorrichtung darstellt.
Fig. 2 ist eine erläuternde Ansicht, welche ein Bestimmungssystem zur Durchführung des Verfahrens zur Bestimmung aerober Bakterien gemäss der vorliegenden Erfindung illustriert.
Fig. 3 ist eine grafische Darstellung, welche eine Empfindlichkeit der Methode der vorliegenden Erfindung aufklärt und
Fig. 4 und 6 sind Diagramme, von welchen jedes eine Abhängigkeit zwischen der Anzahl lebensfähiger Zellen (Konzentration) und den Stromabnahmegeschwindigkeiten der Sauerstoff-Messelektrode zeigt.
Als nächstes sind spezifische Beispiele der Bestimmungsmethode der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der Bestimmungsvorrichtung 1 für aerobe Bakterien nach der vorliegenden Erfindung, wie in Fig. 1(b) dargestellt, detailliert beschrieben.
Zuerst wird, wie in den Fig. 1(a) und 1(b) gezeigt, eine Durchflusszelle 4 an einen Messabschnitt einer Sauerstoff-Messelektrode 2 montiert, bestehend aus Acrylharzrohren B, C und D (8 mm innerer Durchmesser und 12 mm äusserer Durchmesser), rostfreien Rohren 41, 42 (1 mm innerer Durchmesser und 2 mm äusserer Durchmesser), Nylonsieben 31, 32 (100 Mehses japanischer Industrie- Standard), einen doppelseitigen Klebstreifen A und Silikon-Dichtungshülsen E, F und G (10 mm innerer Durchmesser und 14 mm äusserer Durchmesser). Nach dem Anbringen der Durchflusszelle 4 werden Perlen aus einem vernetzten Polymer von Poly-N-benzyl-4-vinyl-pyridiniumbromid (vernetztes BVP-Harz) zwischen die Nylonsiebe 31 und 32 in der Durchflusszelle 4 eingefüllt, um eine mit in Wasser unlöslichem Harz von Pyridinium-Typus gefüllte Schicht 3 zu bilden, wodurch die Bestimmungsvorrichtung 1 für aerobe Bakterien nach der vorliegenden Erfindung besteht. In den Zeichnungen bedeutet die Referenzzahl 43 einen Epoxyharzklebstoff (härtend in 12 Stunden) zur Abdichtung und Befestigung der rostfreien Rohre 41 und 42.
Das in dieser Ausführungsform verwendete vernetzte BVP-Harz umfasst in Wasser unlösliche Perlen von 0,2 mm Partikelgrösse, welche einer Quellung mit 0,05 M Phosphat- Puffer bei pH 7,0 während über einer Woche unterworfen wurden, bevor sie in die Vorrichtung eingefüllt wurden. Die harzgefüllte Schicht 3 weist einen Durchmesser von 3 mm und eine Länge von 7,5 mm auf.
Ein Nachweissystem (auf 25ºC gehalten) wurde gebildet unter Verwendung der obigen Bestimmungsvorrichtung 1, wie in Fig. 2 dargestellt, in welcher die Referenzzahl 5 eine Luftpumpe für die Belüftung, 6 eine peristaltische Pumpe, 7 ein Reservoir für Referenzflüssigkeit oder Probenflüssigkeit und 8 eine Aufzeichnungsvorrichtung bedeutet.
Luft und 0,05 M Phosphatpuffer vom PH 7,0 (eine Referenzflüssigkeit) wurden durch das Bestimmungssystem (Flusslinie) mit 4 ml/Minute durchgeleitet. Sobald der Stromwert der Aufzeichnungsvorrichtung konstant war, wurde der Phosphatpuffer umgeschaltet zu einer Probenflüssigkeit, nämlich einer Bakteriensuspension zur Bestimmung. Der Phosphatpuffer und die verwendete Probe von Bakteriensuspension wurden jedes durch das System zirkulieren gelassen. Dann sank der Stromwert, als die Zeit vorüber war. Die Abnahmegeschwindigkeit des Stromwertes, welcher durch die Elektrode festgestellt wurde, wurde in nA/h evaluiert. Da das Festhalten von Bakterienzellen durch das unlösliche Harz vom Pyridinium-Typus ziemlich intensiv und irreversibel erfolgt, wird bevorzugt, das verwendete Harz für jede Messung zu ersetzen.

Beispiel 1

Ein Profil der Abnahme eines elektrischen Stromwertes an der Sauerstoff-Messelektrode nach Zufuhr von E. coli (Escherichia coli) -Suspension mit einer optischen Dichte von 0,2 bei 610 nm in das obige System ist in Fig. 3 dargestellt, welche eine Stromabnahme-Geschwindigkeit von 90 nA/h zeigt.

Beispiel 2

Wenn E. coli (Escherichia coli) -Suspension mit einer optischen Dichte von 0,1 bei 610 nm in das obige System gegeben wurde, wurde eine Stromabnahme-Geschwindigkeit von 58 nA/h festgestellt.

Beispiel 3

Wenn E. coli (Escherichia coli) -Suspension mit einer optischen Dichte von 0,1 bei 610 nm bei 121ºC unter Verwendung eines Autoklaven während 20 Minuten sterilisiert wurde und dann in das obige System verbracht wurde, wurde keine wesentliche Stromabnahme über dem analytisch zulässigen Fehlerbereich festgestellt.

Beispiel 4

Wenn E. coli (Escherichia coli) -Suspension mit einer optischen Dichte von 0,7 bei 610 nm in das obige System verbracht wurde, wurde eine Stromabnahme-Geschwindigkeit von 428 nA/h festgestellt.

Beispiel 5

Wenn Pseudomonas aeruginosa-Suspension mit einer optischen Dichte von 0,1 bei 610 nm in das obige System verbracht wurde, wurde eine Stromabnahme-Geschwindigkeit von 39 nA/h festgestellt.

Beispiel 6

Wenn Staphylococcus aureau-Suspension mit einer optischen Dichte von 0,1 bei 610 nm in das obige System verbracht wurde, wurde eine Stromabnahme-Geschwindigkeit von 38 nA/h festgestellt.
Eine Eichkurve, erhalten aus den Resultaten der Beispiele 1, 3 und 4 ist in Fig. 4 dargestellt.

Beispiel 7

Bacillus subtilis-Suspension mit einer optischen Dichte von 0,01, 0,05, 0,1 und 0,2 bei 610 nm wurden einzeln in das obige System verbracht und die spezifischen Stromabnahme-Geschwindigkeiten wurden beobachtet. Die Abhängigkeit zwischen den beobachteten Stromabnahme- Geschwindigkeiten und entsprechender Absorption (O.D) ist in Fig. 5 dargestellt.

Beispiel 8

Saccharomyces cereisiae-Suspensionen mit einer optischen Dichte von 0,05, 0,1, 0,2 und 0,4 bei 610 nm wurden in das obige System verbracht und die spezifischen Stromabnahme-Geschwindigkeiten wurden obeobachtet. Eine Abhängigkeit zwischen den beobachteten Stromabnahme- Geschwindigkeiten und entsprechender Absorption ist in Fig. 6 dargestellt.
Diese Beispiele zeigen eine ausgezeichnete Linearität der Geschwindigkeit zu O.D, so dass die Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen genau und rasch durchgeführt werden kann.
Wie oben erklärt, verwirklicht die Bestimmungsmethode aerober Bakterien und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung eine schnell ansprechende und einfach durchzuführende Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen (Aktivität) von in verschiedenen wässerigen Proben enthaltenen aeroben Bakterien.
Die vorliegende Erfindung ist daher von recht grossem Nutzen, insbesondere bei der Verfahrenssteuerung von Fermentationen und in der Qualitätskontrolle von Nahrungsmitteln.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen von aeroben Bakterien, umfassend

- das Aufbringen einer in Wasser unlöslichen Harzschicht vom Pyridinium-Typus auf einen Messabschnitt einer Sauerstoff-Messelektrode;

- das Inberührungbringen einer wässerigen, bakterienhaltigen Probe mit der in Wasser unlöslichen Harzschicht vom Pyridium-Typus, welcher ein Vinylcopolymer, zusammengesetzt aus den Komponenteneinheiten, wie sie durch die folgenden Formeln (I) und (II) dargestellt sind, oder ein vernetztes Vinylpolymer, gebildet durch Vernetzung eines Polymers, zusammengesetzt aus der Komponenteneinheit der Formel (I) mit einer polymeren Kette, zusammengesetzt aus der Einheit der Formel (II)

in welcher R&sub1; eine Benzylgruppe, eine Alkylgruppe mit C&sub4; bis C&sub1;&sub6; oder eine Arylgruppe darstellt, R&sub2; eine Alkylgruppe mit C&sub1; bis C&sub3; bedeutet, X ein Halogenatom ist und Y ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit C&sub1; bis C&sub3;, eine Benzylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aethergruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Carbonsäureestergruppe darstellt, umfasst, und in welcher das Vinylcopolymer und das vernetzte Vinylpolymer jedes ein molares Verhältnis der Komponenteneinheit (I) zu (II) von 1 : 20 bis 1 : 0,01 aufweist,

- Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen der aeroben Bakterien in der Probe als Leistung der Sauerstoff-Messelektrode, bewirkt durch die Berührung der Probe mit der Harzschicht vom Pyridinium-Typus.

2. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen nach Anspruch 1, in welchen das Vinylcopolymer und das vernetzte Vinylpolymer in Pulverform vorliegen.

3. Verfahren zur Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Zellen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, in welchem die wässerige Probe mit der in Wasser unlöslichen Harzschicht vom Pyridinium-Typus während 10 bis 30 Minuten in Berührung gebracht wird.

4. Vorrichtung zur Bestimmung aerober Bakterien, umfassend:

- eine Sauerstoff-Messelektrode mit einem Sauerstoff messenden Abschnitt;

- eine Durchflusszelle, welche befähigt ist, eine wässerige Probe durchzulassen, wobei die Probe in Berührung mit dem den Sauerstoff messenden Abschnitt ist, und

- ein in dieser Durchflusszelle enthaltenes, in Wasser unlösliches Harz vom Pyridinium-Typus, wobei das in Wasser unlösliche Harz vom Pyridinium-Typus ein Vinylcopolymer, zusammengesetzt aus Komponenteneinheiten, wie sie durch die folgenden Formeln (I) und (II) dargestellt sind, oder ein vernetztes Vinylpolymer, gebildet durch Vernetzung des Polymers, zusammengesetzt aus der Komponenteneinheit der Formel (I), mit einer polymeren Kette, zusammengesetzt aus der Einheit der Formel II

in welcher R&sub1; eine Benzylgruppe, eine Alkylgruppe mit C&sub4; bis C&sub1;&sub6; oder eine Arylgruppe darstellt, R&sub2; eine Alkylgruppe mit C&sub1; bis C&sub3; bedeutet, X ein Halogenatom ist und Y ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit C&sub1; bis C&sub3;, eine Benzylgruppe, eine Arylgruppe, eine Aethergruppe, eine Carboxylgruppe oder eine Carbonsäureestergruppe darstellt, umfasst, und worin das Vinylcopolymer und das vernetzte Vinylpolymer jedes ein molares Verhältnis der Komponenteneinheit (I) zu (II) von 1 : 20 bis 1 : 0,01 aufweist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 4, in welcher das Vinylcopolymer und das vernetzte Vinylpolymer in Pulverform vorliegen.