DE69201937T2

DE69201937T2 - Biochemischer Sauerstoffbedarfanalysator, Verfahren zur Analyse, Mikroorganismen zur Verwendung in Analyse.

Info

Publication number: DE69201937T2
Application number: DE69201937T
Authority: DE
Inventors: Hirofumi Akano; Keizo Hatagaki; Naho Kato; Yoshiya Kawamura; Shigeru Maeda; Akira Ohki; Hajime Okumura; Takeshi Sato; Yasushi Takahashi; Mikio Yamada
Original assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Current assignee: Nakano Vinegar Co Ltd
Priority date: 1991-11-22
Filing date: 1992-11-20
Publication date: 1995-11-16
Anticipated expiration: 2012-11-21
Also published as: US5426042A; DE69201937D1; EP0543407A1; US5356792A; EP0543407B1; CA2083410A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen biochemischen Sauerstoffbedarf- (BSB)-Analysator, Verfahren zur Analyse und einen neuen zur Analyse verwendeten Bakterienstamm. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere einen BSB-Analysator, der einen eine Sauerstoffelektrode und eine Mikrobenmembran enthaltenden Mikrobensensor umfaßt. Die Mikrobenmembran wird durch Immobilisierung von zur Gattung Kiebsiella gehörenden Mikroorganismen in einer Membran hergestellt.
Die BSB-Analyse wird gegenwärtig gemäß dem japanischen industriellen Standardverfahren (JIS Industrial Wastewater Test Method K-0102-1972) durchgeführt. Da die Analyse des BSB 5 Tage dauert, sind viele Versuche für eine schnelle BSB- Analyse durch Verwendung von Mikrobensensoren unternommen worden. Die Mikroorganismen Trichosporon cutaneum und aktivierter Klärschlamm sind als auf Mikrobensensoren immobilisierte Mikroben verwendet worden (Japanische Patentanmeldung KOKOKU Nr. 7258/1986, und S. Suzuki, Hrsg., Biosensor, S. 135-136, 140-142, Kodansha Publication (1989). Ferner ist als BSB-Analysator eine Vorrichtung bekannt, die eine mit einem Mikrobensensor ausgestattete Fließzelle umfaßt (Japanische Patentanmeldung KOKAI mit den Nrn. 47895/1978 und 123851/1991).
Der Mikrobensensor weist das Problem auf, daß das BSB-Ergebnis des Mikrobensensors eine geringe Korrelation mit dem des JIS-Verfahrens aufweist. Das Problem liegt unter anderem an den für Mikrobensensoren verwendeten Mikroorganismen. Trichosporon cutaneum weist beispielsweise ein schmales Assimilationsspekrrum für verschiedene organische Substanzen auf, d. h., er reagiert nicht auf Disaccharide, jedoch auf spezifische Weise besonders stark auf bestimmte Substanzen, beispielsweise Ethylalkohole. Ferner ist der Mikrobensensor unpraktisch, da der Sensor für eine normale Antwort der Mikroben auf Proben 1 bis 3 Tage vor der BSB-Analyse aktiviert werden muß. Wenn aktivierter Klärschlamm verwendet wird, muß der auf einer Membran immobilisierte aktivierte Klärschlamm beständig kontrolliert werden, und das Immobilisierungsverfahren ist bei jedem Membranwechsel erforderlich. Die BSB-Analyse kann unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen nicht durchgeführt werden, wenn eine hohe Konzentration von bakteriziden Substanzen wie Arsen in einer Probe enthalten ist.
In einem BSB-Analysator unter Verwendung einer Fließzelle können in den Proben verbliebene Blasen die Analyse beeinflussen. Ferner muß zwischen den Analysen ein Zeitraum von mehr als 30 Minuten liegen, um eine Wirkung einer vorhergehenden Probe auszuschließen, und es dauert lange, unter trockenen Bedingungen aufbewahrte Mikrobenmembranen zu aktivieren. Ferner sind Instandhaltung und Kontrolle des BSB- Analysators mühsam. Unterschiedliche Lösungen müssen in einem großen Analysevolumen hergestellt werden und diese sind leicht abbaubar und müssen häufig ausgetauscht werden.
Die Erfinder haben die vorstehend beschriebenen Probleme untersucht und festgestellt, daß zur Gattung Klebsiella gehörende Mikroorganismen zahlreiche organische Substanzen assimilieren können und in einem kurzen Zeitraum durch ein Aktivierungverfahren aktiviert werden können, also die Eigenschaften besitzen, die für eine BSB-Analyse geeignet sind.
Die BSB-Analyse kann unter Verwendung eines Batch-Verfahrens für die vorliegende Erfindung verwendet werden, die Erfinder stellten jedoch fest, daß eine Mikro-Fließzelle für den erfindungsgemäßen BSB-Analysator nützlich ist, da diese für Proben mit kurzer Verweilzeit, Wechsel von Lösungen und Temperaturkontrolle in einer Fließzelle vorteilhaft ist, Merkmale, die die Eigenschaften des Mikroorganismus am besten ausnutzen, so daß Anwender die BSB-Analyse schnell und genau durchführen können.
Ferner entwickelten die Erfinder ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikroorganismen in einer Membran, einen die Analysezeit verkürzenden BSB- Analysator, ein Verfahren zur Aktivierung von getrockneten Mikrobenmembranen nach einer längeren Aufbewahrung und ein Verfahren zur Aufrechterhaltung des Aktivitätsniveaus von Mikroorganismen in der Mikrobenmembran unter Verwendung einer Minimalmenge von Lösungen. Diese Verfahren weisen die Nachteile der bisher im Stand der Technik bekannten Verfahren nicht mehr auf und führten zu einem praktischen BSB-Analysator.
Die vorliegende Erfindung wird in der nachstehenden Beschreibung genauer erläutert.
(1) BSB-Analysator, der einen Mikrobensensor umfaßt, der eine Sauerstoffelektrode und eine Mikrobenmembran enthält, wobei zur Gattung Klebsiella gehörende Mikroorganismen in einer Membran immobilisiert sind.
(2) BSB-Analysator nach (1), wobei die zur Gattung Klebsiella gehörenden Mikroorganismen Klebsiella oxytoca umfassen.
(3) BSB-Analysator nach (1), wobei die zur Gattung Klebsiella gehörenden Mikroorganismen Klebsiella oxytoca 12092 umfassen.
(4) BSB-Analysator nach (1), wobei die Mikrobenmembran Mikroorganismen umfaßt, die zur Gattung Klebsiella gehören und in einer porösen hydrophilen Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,65 bis 3 um im Durchmesser unter Verwendung eines Geliermittels immobilisiert sind.
(5) BSB-Analysator nach (4), wobei die zur Gattung Klebsiella gehörenden Mikroorganismen Klebsiella oxytoca umfassen.
(6) BSB-Analysator nach (4), wobei die zur Gattung Klebsiella gehörenden Mikroorganismen Klebsiella oxytoca 12092 umfassen.
(7) BSB-Analysator nach (4), wobei das Geliermittel mindestens ein Mittel aus der Gruppe Alginsäure oder deren Salze, Agar, Gellangummi, Xanthangummi, Gelatine, Carageenan, Johannisbrotkernmehl, Methylcellulose, Pectin und Pullulan umfaßt.
(8) BSB-Analysator nach (1), der eine Fließzelle umfaßt, die mit einem Mikrobensensor ausgerüstet ist, der eine Sauerstoffelektrode und eine Mikrobenmembran enthält, wobei zur Gattung Klebsiella gehörende Mikroorganismen in einer Membran immobilisiert sind.
(9) BSB-Analysator nach (8), wobei eine Flüssigkeitsleitung, die mit dem Einlaß der mit einem Mikrobensensor ausgestatteten Fließzelle verbunden ist, mit einem Auslaß ausgestattet ist.
(10) BSB-Analysator, der eine Fließzelle umfaßt, die mit einem Mikrobensensor ausgestattet ist, der eine Sauerstoffelektrode und eine Mikrobenmembran enthält, wobei Klebsiella oxytoca 12092 in einer porösen hydrophilen Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,65 bis 3 um im Durchmesser unter Verwendung von mindestens einem Geliermittel aus der Gruppe Alginsäure oder deren Salze, Agar, Gellangummi, Xanthangummi, Gelatine, Carageenan, Johannisbrotkernmehl, Methylcellulose, Pectin und Pullulan immobilisiert ist, und einer Flüssigkeitsleitung, die mit dem Einlaß der mit dem Mikrobensensor ausgestatteten Fließzelle verbunden und mit einem Auslaß ausgestattet ist.
(11) BSB-Analyseverfahren unter Verwendung eines der BSB-Analysatoren nach einem der Punkte von (1) bis (10), wobei vor der Verwendung des BSB- Analysators eine Nährlösung auf die Mikrobenmembran aufgebracht wird, die anschließend für die Analyse gewaschen wird.
(12) BSB-Analyseverfahren unter Verwendung eines der BSB-Analysatoren nach einem der Punkte von (1) bis (10), wobei eine Waschlösung oder eine Substratiösung zeitweise auf die Mikrobenmembran aufgebracht wird, wenn der BSB- Analysator für einen längeren Zeitraum nicht benutzt wird.
(13) BSB-Analyseverfahren unter Verwendung eines der BSB-Analysatoren nach einem der Punkte von (1) bis (10), wobei Borsäure oder Sorbinsäure oder deren Salze einer BSB-Probe zugesetzt werden.
(14) BSB-Analyseverfahren unter Verwendung des BSB-Analysators von (10), wobei vor der Verwendung des BSB-Analysators eine Nährlösung auf die Mikrobenmembran aufgebracht wird, die anschließend für eine Analyse gewaschen wird, wobei eine Waschlösung oder Substratlösung zeitweise auf die Mikrobenmembran aufgebracht wird, wenn der BSB-Analysator für einen längeren Zeitraum nicht benutzt wird, und wobei Borsäure oder Sorbinsäure oder deren Salze einer BSB-Probe zugesetzt werden.
(15) Ein zu Klebsiella oxytoca gehörender neuer Stamm Klebsiella oxytoca 12092, der ein breites Assimilationsspektrum aufweist und gegenüber Arsen resistent ist.
Die vorliegende Erfindung stellt einen BSB-Analysator bereit, der zur schnellen und genauen BSB-Analyse verwendet und leicht instandgehalten und überwacht werden kann.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt einen erfindungsgemäßen Mikrobensensor. Der Mikrobensensor umfaßt eine Sauerstoffelektrode 3, die mit einer Mikrobenmembran 2 in Kontakt steht, und einen Aufsatz 1, der die Elektrode von oben verschließt.
Fig. 2 zeigt ein Diagramm des erfindungsgemäßen BSB-Analysators. Eine BSB-Probe wird aus einem Probenbehälter 4 durch ein magnetisches Ventil 5 und eine Flüssigkeitsförderpumpe 6 zu einer Fließzelle 7 geleitet. In der Fließzelle 7 wird die Probe durch einen von einem Motor 10 angetriebenen Rührstab 9 gerührt. Veränderungen werden durch einen Mikrobensensor 8 nachgewiesen, der eine Sauerstoffelektrode 3 mit einer Mikrobenmembran 2 umfaßt, die beide durch einen Aufsatz 1 fest gepreßt werden, dann durch einen Amplifikator 13 amplifiziert und durch ein Aufzeichnungsvorrichtung 14 aufgezeichnet. Die Probe fließt nach der Analyse zu einem Abflußtank 11. Das magnetische Ventil 5 ist ein Schalter zur Öffnung eines Waschlösungstanks 12 zum Waschen des BSB-Analysators.
Fig. 3 zeigt ein Fließdiagramm, das den erfindungsgemäßen BSB-Analysator zeigt, wobei eine Flüssigkeitsleitung, die mit dem Einlaß der mit einem Mikrobensensor ausgestatteten Fließzelle verbunden ist, mit einem Auslaß ausgestattet ist.
Fig. 4 zeigt eine Analyse von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB- Standards unter Verwendung eines BSB-Analysators von Fig. 2.
Fig. 5 zeigt eine Analyse von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB- Standards in Gegenwart von Arsen unter Verwendung eines BSB-Analysators von Fig. 2.
Fig. 6 zeigt eine Analyse von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB- Standards unter Verwendung eines schematisch in Fig. 2 dargestellten BSB-Analysators, wobei Mikroben durch ein Geliermittel immobilisiert sind.
Fig. 7 zeigt eine Analyse von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB- Standards unter Verwendung eines BSB-Analysators, der schematisch in Fig. 2 dargestellt ist, wobei Mikrobenmembranen poröse Membranen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Porendurchmessern sind.
Fig. 8 zeigt eine Analyse von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB- Standards unter Verwendung eines schematisch in Fig. 2 dargestellten BSB-Analysators, wobei Mikrobenmembranen poröse Membranen mit unterschiedlichen durchschnittlichen Porendurchmessern sind.
Fig. 9 zeigt einen Vergleich der Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Mikrobenmembran mit der Empfindlichkeit einer Polyacrylamid/Mikrobenmembran.
Fig. 10 zeigt eine Analyse von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB- Standards unter Verwendung eines BSB-Analysators, wobei die Membran eine asymmetrische Ultrafiltrationsmembran ist.
Fig. 11 zeigt eine Schwankung des Output einer Sauerstoffelektrode, die mit oder ohne Auslaß erhalten wird.
Fig. 12 zeigt die Aktivierung von getrockneten Mikrobenmembranen unter Verwendung von Nährlösungen.
Fig. 13 zeigt einen Zeitplan der periodischen Zugabe von Lösungen.
Fig. 14 zeigt eine Korrelation zwischen dem erfindungsgemäßen Mikrobensensorverfahren und dem 5 Tage-Verfahren.
Fig. 15 zeigt eine kontinuierliche BSB-Analyse durch das erfindungsgemäße Mikrobensensorverfahren und das 5 Tage-Verfahren.

Definitionen und Abkürzungen

1: Aufsatz
2: Mikrobenmembran
3: Sauerstoffelektrode
4: Probenbehälter
5: Magnetisches Ventil
6: Flüssigkeitsförderpumpe
7: Fließzelle
8: Mikrobensensor
9: Rührfisch
10: Motor
11: Abflußtank
12: Waschlösungstank
13: Amplifikator
14: Aufzeichnungsvorrichtung
15, 16, 17, 18 und 19: Umschaltventil
AP: Luftpumpe
P: Flüssigkeitsförderpumpe

5. Genaue Beschreibung der Erfindung

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind alle Mikroorganismen, die zur Gattung Klebsiella gehören. Diese Mikroorganismen schließen Klebsiella oxytoca JCM1665, Klebsiella planticola JCM7251, Klebsiella ozaenae JCM1663 und Klebsiella terrigena JCM1687 ein. Die Erfinder haben in der Natur vorkommende Mikroorganismen auf ihre Verwendbarkeit in der BSB-Analyse untersucht und ein Bakterium gefunden, das aus Bodenproben aus der Präfektur Kagoshima isoliert wurde. Das Bakterium weist ein breites Assimilationsspektrum auf und kann BSB in kurzer Zeit analysieren.
Die Eigenschaften des Bakteriums sind nachstehend beschrieben.

A. Morphologie

(1) Form und Größe der Zelle: bazillenförmig,
Größe: 0,8 bis 1,2 um X 3 bis 6 um
(2) Polymorphismus:
(3) Beweglichkeit:
(4) Sporenbildner:
(5) Gramfärbung:
(6) Säurebeständigkeit:

B. Kulturmedium

(1) Agarplatte, die Fleischextrakt enthält: gutes Wachstum, bildet schwach blaugraue Kolonien.
(2) Schrägagarkultur, die Fleischextrakt enthält: gutes Wachstum
(3) Flüssigmedium, das Fleischextrakt enthält: gutes Wachstum
(4) Stichkultur, die Gelatine enthält: keine Verflüssigung
(5) Lackmusmilch-Kulturmedium: Ansäuerung und Verfestigung

C. Physiologie

(1) Reduktion von Nitrat: +
(2) Denitrifizierung: +
(3) Methylrottest: -
(4) Voges-Proskauertest: +
(5) Indoltest: +
(6) Schwefelwasserstoffproduktion: -
(7) Hydrolyse von Stärke: -
(8) Zitronensäureverwertung: -
(9) Verwertung von anorganischem Stickstoff: +
(10) Pigmentierung: -
(11) Urease: +
(12) Oxidase: -
(13) Katalase: +
(14) Wachstumsbedingungen: Temperatur 5 bis 40ºC, pH-Wert 4 bis 9,5
(15) Atmung: fakultativ anaerob
(16) Oxidationsfermentationstest: Fermenter D. Säure- oder Gaserzeugung Medium Säure Gas L-Arabinose D-Xylose D-Glucose D-Mannose D-Fruktose D-Galaktose Maltose Saccharose Lactose Trehalose D-Sorbit D-Mannit Inosit Glycerin Stärke

E. Weitere physiologische Eigenschaften

(1) β-Galaktosidase: +
(2) DNase: -
(3) Tryptophandesaminase: -
(4) Abbau von Äsculin: +
(5) Abbau von Arginin: -
(6) Decarboxylierung von Lysin: +
(7) Decarboxylierung von Ornithin: -
(8) Arsenresistenz: Lebensfahig in Gegenwart von 10 000 ppm Arsen
Das Bakterium wurde auf der Basis der vorstehend beschriebenen Eigenschaften anhand von "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" Bd. 1 (1984), 415-416 und 461-465, klassifiziert. Das Bakterium wurde als zu Klebsiella oxytoca gehörendes Bakterium identifiziert und als Klebsiella oxytoca 12092 bezeichnet. Klebsiella oxytoca 12092 wurde gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrages am 22. Oktober 1991 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-3616 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, hinterlegt.
Klebsiella oxytoca 12092 kann durch ein übliches Züchtungsverfahren für Bakterien gezüchtet werden. Beispiele für Kohlenstoffquellen für das Kulturmedium sind Glucose, Maltose, Saccharose und Melasse oder eine Kombination davon.
Stickstoffquellen für die Kultur schließen alle organischen, Stickstoff enthaltenden Substanzen, beispielsweise verschiedene Aminosäuren, Maisquellwasser, Malzextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt und Harnstoff, und anorganischen, Stickstoff enthaltenden Substanzen, beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumnitrat, oder eine Kombination davon ein.
Vitamine und Mineralien sind ebenfalls in einem Kulturmedium enthalten. Die geeignete Kulturtemperatur ist 20 bis 40ºC, vorzugsweise 28 bis 37ºC. Der geeignete pH-Wert des Mediums ist 4,5 bis 9,0, vorzugsweise 5,5 bis 8,0. Das Nährmedium kann flüssig oder fest sein. Geeignete Bakterienzellen für ein Mikrobensensormaterial können in der log-Phase des Wachstums erhalten werden. In einer Flüssigkultur wird unter Luftzutritt 10 bis 72 Stunden, vorzugsweise 12 bis 48 Stunden, inkubiert. In einer festen Kultur wird 12 bis 96 Stunden, vorzugsweise 24 bis 72 Stunden, inkubiert. Nach der Züchtung können Bakterienzellen durch das im Stand der Technik bekannte Verfahren, z. B. Zentrifugation, geerntet werden.
Die Bakterienzellen werden gewaschen und anschließend immobilisiert. Zur Immobilisierung kann das im Stand der Technik bekannte Immobilisierungsverfahren verwendet werden, wobei Bakterienzellen zwischen zwei durchlässige Membranen positioniert und die beiden Membranen anschließend zusammengekiebt werden, um die Bakterienzellen einzuschließen. Diese Immobilisierungsverfahren sind jedoch nach längerer häufiger Verwendung anfällig für eine Ablösung. Das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren ist vorzuziehen. Dabei werden Battterienzellen durch ein Geliermittel auf einer porösen hydrophilen Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,65 um bis 3 um im Durchmesser immobilisiert.
Eine erfindungsgemäße Membran, d. h., ein Träger zur Immobilisierung von Bakterienzellen, schließt alle Gas- oder Flüssigkeits-durchlässigen, porösen hydrophilen Membranen ein. Die Membran muß für Sauerstoff, verschiedene organische und anorganische Verbindungen durchlässig sein. Es können beispielsweise Membranfilter und asymmetrische Ultrafiltrationsmembranen verwendet werden. Beispiele für Membranmaterialien sind Zelluloseesterverbindungen, beispielsweise Nitrocellulose und Acetylcellulose, und hydrophiles Polyfluoridvinyliden und Polyethersulfon. In der Erfindung verwendete poröse hydrophile Membranen müssen biegsam und verformbar sein, damit sie sich der Oberflächenform einer Sauerstoffelektrode anpassen können, da Membranen als ein Teil eines Biosensorelementes verwendet werden und für eine hohe Empfindlichkeit einen vollständigen Kontakt mit der Oberfläche der Sauerstoffelektrode aufweisen müssen.
Erfindungsgemäße poröse Membranen weisen vorzugsweise eine durchschnittliche Porengröße von 0,65 bis 3 um im Durchmesser auf, so daß die Bakterienzellen zwischen der Porenstruktur eingeschlossenen bleiben. Wenn asymmetrische Ultrafiltrationsmembranen verwendet werden, betragt die durchschnittliche Porengroße auf der Membranoberseite 0,65 bis 3 um im Durchmesser, das heißt, eine Membranseite mit größeren Poren ist für eine erfindungsgemäße Verwendung ausreichend. Die Membranstärke wird durch Testläufe ausgewählt und ist vorzugsweise 50 um bis 200 um, d. h., die Stärke, die eine gute Manipulierbarkeit, Biegsamkeit und Stärke liefert.
Ein zur Immobilisierung von Bakterienzellen in der Membran verwendetes Geliermittel schließt alle gelbildenden hydrophilen Substanzen ein. Alginsäure oder deren Salze, Gellangummi, Xanthangummi, Gelatine, Carageenan, Johannisbrotkeinmehl, Methylcellulose, Pectin und Pullulan sind beispielsweise als Geliermittel geeignet.
Das Verfahren zur Immobilisierung von Bakterienzellen in einer Membran ist nachstehend beschrieben.
In einem geeigneten Kulturmedium gezüchtete Mikroorganismen werden geerntet, gewaschen und anschließend immobilisiert. Mikrobielle Zellen werden mit einer geeigneten Menge eines Geliermittels, beispielsweise einer Alginsäurelösung, kombiniert, wobei ein Mikroben/Geliermittelgemisch erhalten wird. Das Gemisch wird auf eine poröse Membran, beispielsweise ein Acetylcellulosemembranfilter, getropft. Auf der Membranunterseite wird der Druck reduziert und auf der Membranoberseite erhöht, wobei das Gemisch in die Poren eindringt und die Mikroben mit dem Geliermittel in den Poren immobilisiert werden. Unterdruck und Überdruck wirken weiter auf die Membran ein, so daß sichergestellt ist, daß das gesamte Mikroben/Geliermittelgemisch auf der Membranoberfiäche in den Poren eingeschlossen ist und dort fest zurückgehalten wird. Die Stärke von Unter- und Überdruck wird so gewählt, daß die porösen Membranen nicht zerstört werden.
Mit einem Geliermittel beschichtete Mikroben sind in den Poren der Membran eingeschlossen, und das Geliermittel wird anschließend zur Fixierung der Mikroben in den Poren unter Verwendung eines geeigneten Mittels verfestigt. Die in der Membran immobilisierten Mikroben können nur schwer von der Membran abgelöst werden. Beispiele für Mittel zur Verfestigung von Geliermitteln sind anorganische Salze, beispielsweise Calciumsalze, und Polymerisationsmittel. In einer anderen Ausführungsform kann ein Mikroben/Geliermittelgemisch durch Abkühlung verfestigt werden.
Im vorstehend beschriebenen Immobilisierungsverfahren reichen Spuren eines Geliermittels aus. Die Gelbildung dauert bei Raumtemperatur nur kurz, wobei diese milde Bedingung ohne Schädigung der Mikroben die Mikroorganismen auf einem hohen Aktivitätsniveau hält.
Die Mikrobenmembran ist für Sauerstoff und verschiedene anorganische und organische Verbindungen durchlässig, und bei einer Beschädigung eines Teils der Mikrobenmembran ist der Mikrobenverlust sehr gering. Ferner ist die Mikrobenmembran im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Membranen haltbar. Der Mikrobensensor des erfindungsgemäßen BSB-Analysators umfaßt eine Mikrobenmembran und eine Sauerstoffelektrode. Die Mikrobenmembran wird durch einen entfernbaren Aufsatz in festem Kontakt mit der Sauerstoffelektrode gehalten, was dem Anwender den Austausch der Mikrobenmembran erleichtert. Die signifikante Empfindlichkeit der Mikrobenmembran ermöglicht selbst in einer kleinen Probenmenge einen Nachweis. Durch Zugabe eines Probenvolumens von 1 ml oder weniger, vorzugsweise 0,3 bis 0,6 ml, zur Fließzelle kann die Analysezeit verkürzt werden. Ferner kann die Fließzelle vertikal positioniert sein. Eine Probe wird von der Unterseite der Fließzelle geliefert und fließt von der Oberseite der Fließzelle wieder ab, wobei die Probe in der Fließzelle durch den Rührfisch gerührt wird. Durch eine vertikale Positionierung der Fließzelle kann eine verläßliche BSB-Analyse durchgeführt werden, da Blasen nicht an der Mikrobenmembran haften und aus der Fließzelle entfernt werden. Eine Probe kann beispielsweise in etwa 5 Minuten bei 30ºC analysiert werden, wenn die Probe mit 4 ml/min. auf die in Fig. 2 dargestellte Vorrichtung aufgebracht wird.
Der erfindungsgemaße BSB-Analysator enthält vorzugsweise eine Flüssigkeitsleitung, die mit dem Einlaß der mit einem Mikrobensensor ausgestatteten Fließzelle verbunden und mit einem Auslaß ausgestattet ist. Im im Stand der Technik bekannten BSB-Analysator ist jeder Einlaß für Waschlösungen, Puffer, einen BSB- Standard und eine Probe direkt mit der Leitung zur Fließzelle verbunden, eine Konstruktion, die eine schnelle Analyse unmöglich macht. Wenn beispielsweise eine erste Analyseprobe einen hohen BSB aufweist, bleibt die Probe in der Leitung. Wenn eine zweite Analyseprobe einen geringen BSB aufweist, muß der Anwender warten, bis die erste Probe die BSB-Analyse der zweiten Probe nicht beeinflußt. Die Erfinder lösten dieses Problem, indem sie die Flüssigkeitsleitung, die mit dem Einlaß der Fließzelle verbunden ist, mit einem Auslaß ausstatteten.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion des erfindungsgemaßen BSB-Analysators. In Fig. 3 werden durch die Zahlen (15) bis (19) magnetische Umschaltventile angezeigt. P ist eine Flüssigkeitsförderpumpe, die gleichzeitig Waschlösungen, BSB-Standards oder eine Probe und Phosphatpuffer zur Fließzelle fördert. Beispiele für Waschlösungen sind Leitungswasser, destilliertes Wasser und entionisiertes Wasser. Puffer schließen einen Kaliumdihydrogenphosphat (KH&sub2;PO&sub4;) und Dikaliumhydrogenphosphat (K&sub2;HPO&sub4;) umfassenden Phosphatpuffer ein. Die Konzentration des Puffers ist üblicherweise 50 bis 300 mm, vorzugsweise 130 bis 260 mM. Der pH-Wert des Puffers wird in Abhängigkeit von den verwendeten Mikroorganismen auf einen pH-Wert von 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, eingestellt. Weitere Puffer, die Kaliumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;) enthalten, können ebenfalls verwendet werden.
Der BSB-Standard ist ein Gemisch, das unter Verwendung von 150 mg/l Glucose und 150 mg/l Glutaminsäure hergestellt und auf 220 ppm eingestellt wird. Der 220 ppm BSB-Standard wird auf eine gewünschte Konzentration verdünnt.
Nach Passieren der Flüssigkeitsförderpumpe werden Waschlösungen, BSB- Standards, Phosphatpuffer und eine Probe vermischt. AP ist eine Luftpumpe, die nach Passieren des Ventils 19 dem Gemisch Luft zuführt, damit die BSB-Standards und die Probe die gleiche Menge an gelöstem Sauerstoff enthalten und außerdem die Wirkung einer Sauerstoffübersättigung beseitigt wird. (3) ist eine Sauerstoffelektrode, deren Ende (2) eine Mikrobenmembran ist. (7) ist eine Fließzelle mit dem Ein- und Auslaß für die Lösungen.
Die Vorteile des erfindungsgemaßen BSB-Analysators sind nachstehend beschrieben. Die Fließzeit einer Probe vom Einlaß des Probenbehälters zum Ventil 18 wird beispielsweise mit X angegeben. Die Fließzeit einer Probe von Ventil 18 zum Ventil 19 wird mit Y angegeben. Wenn die Analyse einer ersten Probe beendet ist und eine zweite Probe in den Probenzuführer gegeben wird, öffnet sich das Ventil 19 für X oder mehr Minuten, und gleichzeitig öffnet sich das Ventil 18. Anschließend schließt das Ventil 18 Y Minuten, und das Ventil 15 öffnet sich zum Wegspülen der Waschlösungen Y oder mehr Minuten. Der Mechanismus des erfindungsgemaßen BSB-Analysators verhindert, daß die erste Probe in die Fließzelle fließt. Stattdessen fließt die erste Probe aus dem Ventil 19 ab, und die zweite Probe füllt die Leitung vom Probenzuführer zum Ventil 18. Die zweite Probe kann nun analysiert werden.
Wenn das Ventil 19 geöffnet wird, wird der Fließzelle von der Luftpumpe (AP) Luft zugeführt, was die Basislinie des Ergebnisses instabilisiert. Nach Y Minuten wird das Ventil 19 jedoch geschlossen und Waschlösungen werden zur Fließzelle geschickt, wodurch die Basislinie stabilisiert wird.
In der erfindungsgemaßen BSB-Analyse wird die Mikrobenmembran vorzugsweise mit Nährstoffquellen versorgt und die Membran anschließend vor der Verwendung gewaschen. Diese Verfahren vor der Analyse verkürzen die Aktivierungszeit der Mikrobenmembran. Die Mikrobenmembran wird in getrockneter Form aufbewahrt, wobei das Aktivierungsniveau der Mikroben über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten bleibt. Zur Aktivierung der zu verwendenden getrockneten Mikrobenmembranen zur Analyse müssen die Mikrobenmembranen von einer getrockneten in eine feuchte Form überführt werden. In dem im Stand der Technik bekannten Verfahren werden die Mikrobenmembranen in Puffer getrankt und anschließend in einer Sauerstoffelektrode plaziert, wonach bis zu einem stabilen Output kontinuierlich BSB- Standard zugesetzt wird. Erst nach zwei Tagen kann bei diesem Verfahren eine Analyse durchgeführt werden.
Die Erfinder haben Verfahren untersucht, die die Aktivierungszeit von Mikrobenmembranen verkürzen. Im erfindungsgemaßen Verfahren werden Mikrobenmembranen in Wasser oder im zur Analyse verwendeten Puffer getränkt und anschließend in der Sauerstoffelektrode positioniert. Anschließend werden die Lösungen, die Nährstoffquellen (hier nachstehend als "Nährlösungen" bezeichnet) enthalten, in einen der Einlässe für die BSB-Standards 1, 2, 3 oder Probenzuführer gegossen. Nach einer bestimmten Zeit werden Waschlösungen und Nährlösungen abwechselnd durchgeleitet.
Die Spülzeit von Waschlösungen oder Nährlösungen beträgt 30 Sekunden bis 30 Minuten, vorzugsweise etwa 10 Minuten. Die Zusammensetzung der Nährlösung entspricht einer üblicherweise zur Züchtung von Mikroorganismen verwendeten oder für eine Züchtung von Mikroorganismen in Membranen geeigneten Zusammensetzung. Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Monosaccharide, beispielsweise Glucose und Fructose, und Disaccharide, beispielsweise Saccharose und Maltose. Beispiele für Stickstoffquellen sind Ammoniumsalze, beispielsweise Ammoniumchlorid und Ammoniumsulfat, unterschiedliche Aminosäuren und Polypeptone. Vitamine schließen Hefeextrakt und Spurenelemente Metallsalze, beispielsweise Magnesiumsulfat und Eisensulfat, ein.
In einer anderen Ausführungsform wird als Nährlösung eine BSB- Standardlösung, die Hefeextrakt als Vitaminquelle enthält, verwendet, und Metallsalze können der Lösung gegebenenfalls zugesetzt werden. Diese BSB-Standardlösung und Hefeextrakt umfassenden Nährlösungen enthalten Glucose, Glutaminsäure und Hefeextrakt. In der Nährlösung ist die Konzentration von Glucose oder Glutaminsäure 5 bis 1 000 ppm, vorzugsweise 300 bis 600 ppm, und die Konzentration von Hefeextrakt 10 bis 10000 ppm, vorzugsweise 200 bis 400 ppm. Von Mikroorganismen für das Wachstum benötigtes Phosphat wird als Phosphatpuffer zugesetzt.
Im erfindungsgemäßen BSB-Analyseverfahren wird es vorgezogen, der Mikrobenmembran abwechselnd Waschlösungen oder Substratlösungen zuzusetzen, wenn die Mikrobenmembran über einen längeren Zeitraum nicht verwendet wird. Durch Zugabe der Lösungen bleibt die Mikrobenmembran in einer kleinen Menge der Lösungen über einen längeren Zeitraum aktiv. Es wird angenommen, daß Nährstoffe aus organischen Materialien in einer Probe zugesetzt werden, wenn Mikrobenmembranen zur Analyse verwendet werden. Wenn Mikrobenmembranen nicht zur Analyse verwendet und keine Nährstoffe zugesetzt werden, verringert sich das Aktivierungsniveau von Mikroben. Wenn Mikrobenmembranen nicht zur Analyse verwendet und Nährstoffquellen beständig zugesetzt werden, kann das Aktivierungsniveau der Mikrobenmembranen aufrechterhalten werden. In einem Zugabeverfahren von Nährstoffen zu Mikrobenmembranen werden Waschlösungen und BSB-Standardlösungen wie bei der Analyse des BSB-Standards den Mikrobenmembranen kontinuierlich zugesetzt. In diesem Verfahren gibt es zwei Alternativen: Die Nährstoffzufuhr ist der gesamte zur Analyse verwendete BSB-Standard, oder die Nährstoffzufuhr ist eine einzige Konzentration eines BSB-Standards. Dieses Verfahren erfordert jedoch eine große Menge an BSB-Standardlösungen, Waschlösungen und Puffer, selbst wenn eine der Alternativen verwendet wird. Etwa 5 Liter eines kombinierten Volumens (Waschlösungen, BSB-Standards und Puffer) werden beispielsweise für einen 16-stündigen Arbeitsgang mit einer Fließrate von 5 ml/min. verbraucht. Daher müssen die Lösungen häufig hergestellt werden, was auch Zeit erfordert, so daß eine BSB-Analyse durch dieses Verfahren mühsam ist.
Die Erfinder stellten fest, daß eine periodische Zufuhr von Nährstoffen in einer minimalen Menge das Aktivierungsniveau der Mikrobenmembranen besser aufrechterhält, als dies bei einer kontinuierlichen Zugabe der Nährstoffe der Fall ist. Im Verfahren mit dem periodischen Nährstoffzusatz wird eine Pumpe über einen bestimmten Zeitraum betrieben und anschließend über einen bestimmten Zeitraum abgestellt. Wasch- und Substratlösungen werden abwechselnd in einem bestimmten Zyklus während des Arbeitsablaufes zugesetzt. Es wird 10 Sekunden bis 4 Minuten, vorzugsweise 30 Sekunden bis 2 Minuten, je nach den Eigenschaften der Mikroorganismen gepumpt. Das Pumpen wird für 30 Sekunden bis 3 Minuten, vorzugsweise 1 bis 2 Minuten, gestoppt. Mikrobenmembranen zugesetzte Substratlösungen können BSB-Standards und die vorstehend beschriebenen, Nährstoffe enthaltenden Nährlösungen einschließen. Wasch- und Substratlösungen werden so zugesetzt, daß abwechselnd Wasch- und Substratlösungen oder 10 mal Waschlösungen und anschließend einmal Substratlösungen zugesetzt werden oder unterschiedliche Kombinationen der Zugabe dieser Lösungen verwendet werden. Dieses Verfahren erfordert nicht die häufige Herstellung verschiedener Lösungen, wodurch die Kontrolle des erfindungsgemaßen BSB-Analysators erleichtert wird.
Im erfindungsgemäßen BSB-Analyseverfahren werden den für eine BSB- Analyse verwendeten Lösungen vorzugsweise Borsäure, Sorbinsäure oder deren Salze zugesetzt. Üblicherweise wird einer für eine BSB-Analyse verwendeten Lösung Salzsäure oder Essigsäure zugesetzt, um durch Herabsetzung des pH-Werts eine Fäulnis der Lösung zu verhindern.
Alternativ werden zur Herabsetzung des pH-Werts der Lösung Natriumhypochlorit oder andere Chemikalien und anschließend Chloramphenicol zugesetzt. Die Konservierungsmittel sollten eine möglichst geringe Wirkung auf Mikroorganismen in der Membran aufweisen.
Die Erfinder stellten fest, daß von den verschiedenen Konservierungsmitteln Borsäure (H&sub3;BO&sub3;) oder Sorbinsäure oder deren Salze für Mikrobenmembranen geeignet sind. Salze der Borsäure oder Sorbinsäure schließen Natriumborat und Kaliumsorbat ein. Borsäure und Kaliumsorbat sind bevorzugt. Die Konzentration des Konservierungsmittels schwankt: Die Konzentration der Borsäure ist 0,1 bis 1,0 %, vorzugsweise 0,3 bis 0,5 %, und die Konzentration der Sorbinsäure ist 0,1 bis 1,0 %, vorzugsweise 0,25 bis 0,5 %. Ferner kann durch Kombination von Borsäure und niedrigem pH-Wert eine Fäulnis wirksam verhindert werden. Der pH-Wert wird zur besseren Fäulnisverhinderung mit anorganischen Säuren, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure und ähnlichen, oder organischen Säuren, die von Mikroorganismen in der Mikrobenmembran nicht metabolisiert werden, auf 2 bis 3 eingestellt.
Dieses Verfahren erfordert nicht die häufige Herstellung verschiedener Lösungen, wodurch die Kontrolle des erfindungsgemäßen BSB-Analysators erleichtert wird.

6. Beispiel

Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachstehend beschriebenen Beispiele leichter verständlich. Diese Beispiele sollen die Erfindung erläutern, jedoch nicht so ausgelegt werden, daß sie den Schutzbereich der Erfindung beschränken.

Beispiel 1: Züchtung von Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616)

Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616) wurde in 100 ml sterilisiertes Flüssigmedium/pH-Wert 6,5 (1 % Polypepton, 0,1 % Hefeextrakt und 0,5 % Natriumchlorid) in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben steril inokuliert und 24 Stunden bei 30ºC unter aeroben Bedingungen unter Schütteln inkubiert. Nach der Züchtung wurden die Bakterienzellen durch eine 20-minütige Zentrifugation mit 6 000 Upm geerntet. Die Bakterienzellen wurden in ein wenig sterilisiertem Wasser suspendiert und die Suspension wurde 20 Minuten mit 6 000 Upm zentrifugiert (gewaschen). Der Waschvorgang wurde dreimal wiederholt, und 150 mg Bakterienzellen (Trockengewicht) wurden erhalten.

Beispiel 2: Sauerstoffverbrauchsrate von Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616) und verschiedener anderer Bakterien

Die Sauerstoffverbrauchsrate von Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616), die in Beispiel 1 bestimmt wurde, und von verschiedenen anderen Bakterien, die in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wurden, wurde unter Verwendung einer BSB-Standardlösung analysiert. 250 ppm BSB-Standardlösung wurde unter Verwendung von 150 mg/l Glucose und 150 mg/l Glutaminsäure, wie es in JIS K0102 beschrieben ist, hergestellt und gegebenenfalls verdünnt. Diese verdünnte BSB- Lösung wird hier nachstehend als "BSB-Standard" bezeichnet. Tabelle 1 Bakterienstamm Sauerstoffverbrauchsrate* (mg O&sub2;/min./g Trockengewicht) Klebsiella oxytoca Klebsiella ozaenae JCM1663 Klebsiella planticola JCM7251 Klebsiella terrigena JCM1687 Trichosporon cutaneum IFO10466 * Sauerstoffverbrauchsrate wurde bei 30ºC unter Verwendung eines 37 ppm BSB-Standards als Substrat analysiert.
Wie in Tabelle 1 dargestellt ist, weisen zu Klebsiella gehörende Mikroorganismen im Vergleich zum BSB-Standard eine hohe Sauerstoffverbrauchsrate auf. Unter diesen Mikroorganismen weist Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616) die höchste Sauerstoffverbrauchsrate auf.

Beispiel 3: Vorrichtung. Analyse und Standardkurve

0,4 mg (Trockengewicht) Bakterienzellen des Stamms Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616), die in Beispiel 1 erhalten wurden, wurde zwischen zwei Nitrocellulosemembranen [Membranfilter HAWPO2500 (Porengröße: 0,45 um Durchmesser), Millipore Co.] positioniert. Die beiden Membranen wurden fest miteinander verbunden, so daß keine weiteren Zwischenräume außer den Bakterienzellen vorhanden waren (hier nachstehend wird die Bakterien enthaltende Membran als "Mikrobenmembran" bezeichnet). Die Mikrobenmembran wurde in 100 mM Phosphatpuffer/pH-Wert 7,0 eingetaucht und zur Aktivierung unter Verwendung einer Luftpumpe mit 100 ml/Minute drei Stunden belüftet. Unterschiedliche Konzentrationen von BSB-Standards wurden mit der in Fig. 2 dargestellten, mit der Mikrobenmembran ausgestatteten Vorrichtung getestet. Wie in Fig. 4 gezeigt, gibt es eine lineare Korrelation zwischen einer Veränderung in einer BSB-Standardkonzentration und der entsprechenden, von der Sauerstoffelektrode gemessenen Spannungsänderung.
Der BSB-Standard wurde getestet, indem sein Volumen im Reaktionsgefäß geändert wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt, in der eine durch die Vorrichtung analysierte BSB-Standardkonzentration durch die Spannungsänderung auf der Basis der in Fig. 4 dargestellten Standardkurve berechnet wird. Es wurde festgesteut, daß weniger als 1 ml BSB-Standard für eine Messung geeignet ist. Die Messung und das Waschen dauern länger, wenn mehr als 1 ml BSB-Standard verwendet werden. Im Gegensatz dazu ist die Messung unzuverlässig, wenn weniger als 0,3 ml BSB- Standard verwendet werden. Tabelle 2 BSB-Standardkonzentration (ppm) Volumen im Reaktionsgefäß (ml) BSB Gefunden (ppm) Dauer der Analyse* (min.) * Dauer der Analyse schließt das Waschen ein.

Beispiel 4: Vergleich der Aktivierungszeit

In Beispiel 1 erhaltene unterschiedliche Bakterienzellen wurden in einer Nitrocellulosemembran, wie in Beispiel 3 beschrieben, immobilisiert, wobei eine Mikrobenmembran erhalten wurde. Unmittelbar nach der Immobilisierung wurde die lmikrobenmembran in einen 100 mM Phosphatpuffer/pH-Wert 7,0 getaucht und zur Aktivierung unter Verwendung einer Luftpumpe mit 100 ml/Minute belüftet. Die aktivierte Mikrobenmembran wurde periodisch herausgenommen und zur Untersuchung von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB-Standards in die in Fig. 2 schematisch dargestellte Vorrichtung eingefügt. Wie in Tabelle 3 dargestellt ist, dauert die Aktivierung von Trichosporon cutaneum IFO10466 1 bis 2 Tage, während sie bei zur Gattung Kiebsiella gehörenden Mikroorganismen, Klebsiella oxytoca 12092, nur drei Stunden dauert. Tabelle 3 Belüftung (Std.) Klebsiella oxytoca 12092 (ppm) Trichosporon cutaneum IFO10466 (ppmn) Werte wurden unter Verwendung eines 66 ppm BSB-Standards ermittelt.

Beispiel 5: BSB-Analyse von verschiedenen Verbindungen (vergleich der Klebsiella oxytoca 12092-Membran mit der Trichosporon cutaneum-Membran).

Die Mikrobenmembranen von Klebsiella oxytoca 12092 in Beispiel 4 und von Trichosporon cutaneum wurden zur Untersuchung des BSB von unterschiedlichen Verbindungen vollständig aktiviert und getestet. Die Ergebnisse wurden mit den durch das in JIS K0102 beschriebene 5 Tage-BSB-Verfahren erhaltenen verglichen. Die Mikrobenmembranen wurden in der in Beispiel 3 beschriebenen Vorrichtung getestet und die Eichkurve wurde unter Verwendung eines BSB-Standards aufgezeichnet.
Wie in Tabelle 4 dargestellt, gleicht der von der Klebsiella oxytoca 12092- Membran erhaltene BSB dem vom 5 Tage-BSB-Verfahren, einem offiziell anerkannten Verfahren, erhaltenen. Der Korrelationskoeffizient (r²) ist 0,993. Trichosporon cutaneum IFO 10466 antwortet nicht auf Disaccharide, während Klebsiella oxytoca 12092 darauf antwortet. Wenn Ethylalkohol gemessen wird, weist Trichosporon cutaneum IFO 10466 einen höheren BSB als das 5 Tage-BSB-Verfahren auf, während Klebsiella oxytoca 12092 etwa den gleichen BSB wie das 5 Tage-BSB-Verfahren aufweist. Tabelle 4 Testprobe Erfindungsgemaßer Mikrobensensor Tage-Verfahren Mikrobensensor aus Trichosporon cutaneum IFO10466 Glucose Fructose Saccharose Lactose Maltose Glutaminsäure Glycin Ethanol Essigsäure

Beispiel 6: Analyse von BSB-Standards in Gegenwart von Arsen

Unterschiedliche Konzentrationen von BSB-Standards wurden in Gegenwart von Arsen durch ein dem Beispiel 3 entsprechendes Verfahren analysiert. Wie in Fig. 5 dargestellt, gibt es eine gute lineare Korrelation zwischen einer BSB-Standardkonzentration und der entsprechenden Spannungsänderung an der Sauerstoffelektrode. Wie es den vorstehend beschriebenen Ergebnissen entnommen werden kann, können durch das erfindungsgemaße Verfahren in kurzer Zeit unterschiedliche BSB- Standards präzise analysiert werden.

Beispiel 7: Abwasseranalyse (Vergleich des erfindungsgemaßen Mikrobensensorverfahrens mit dem 5 Tage-BSB-Verfahren)

Die in Beispiel 3 erhaltene aktivierte Mikrobenmembran von Klebsiella oxytoca 12092 wurde in die in Fig. 2 dargestellte Vorrichtung eingebaut. Verschiedene Abwässer wurden unter Verwendung der Klebsiella oxytoca-Membran und des 5 Tage- BSB-Verfahrens auf BSB getestet. Das Mikrobensensorverfahren wird in Tabelle 5 mit dem 5 Tage-BSB-Verfahren verglichen. Es gibt eine nahe Korrelation zwischen den durch die Verfahren erhaltenen Ergebnissen. Tabelle 5 Abwasser Probe Tage-Verfahren Mikrobensensorverfahren Schweinestall Abwasserreinigungsanlage Kläranlage Autowerkstatt Geflügellabor Nahrungsmittelfabrik Meeresprodukte verarbeitende Fabrik Badekurklinik

Beispiel 8: Immobilisierung von Klebsiella oxytoca 12092 in Membranen

0,4 mg (Trockengewicht) Bakterienzellen des in Beispiel 1 erhaltenen Stamms Kiebsiella oxytoca 12092 und 50 ul einer sterilisierten 3 % Natriumalginsäurelösung wurden kombiniert.
Zur Immobilisierung der Bakterienzellen wurde das Gemisch auf eine Acetylcellulosemembran (Membranfilter vom Typ HA, durchschnittliche Porengröße: 0,8 um im Durchmesser, Millipore Co.) getropft. Auf der Membranunterseite wurde ein Unterdruck hergestellt, bis das gesamte Gemisch von der Membran absorbiert war. Die Membran wurde anschließend 10 Minuten bei Raumtemperatur in 50 ml 5 % Calciumchloridlösung getaucht, wobei die Alginsäure zur Immobilisierung der Bakterienzellen in der Membran verfestigt wurde.

Beispiel 9: BSB-Analyse unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung

Der BSB-Standard (JIS-KO102) wurde unter Verwendung der in Beispiel 8 erhaltenen Mikrobenmembran analysiert. Wie in Fig. 1 dargestellt, ist der Mikrobensensor eine Vorrichtung, die die zwischen der Sauerstoffelektrode 3 und dem Aufsatz 1 inserierte Mikrobenmembran 2 umfaßt. Die Analyse wurde unter Verwendung der in Fig. 2 dargestellten Vorrichtung durchgeführt. 10 ml Probe wurden bei 30ºC mit einer Fließrate von 3 Minuten (3 Minuten zur Analyse) analysiert. Proben und Waschlösungen können gegebenenfalls belüftet oder auf dem Weg zur Fließzelle 7 belüftet werden. Als Ergebnis der Analyse unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurde eine gute lineare Korrelation zwischen einer BSB-Standardkonzentration und der entsprechenden Spannungsänderung der Sauerstoffelektrode erhalten (vgl. Fig. 6). In einer Nahrungsmittelfabrik in der Präfektur Kagoshima gesammelte Abwasserproben wurden unter den gleichen vorstehend beschriebenen Bedingungen durch die erfindungsgemäße Vorrichtung und das 5 Tage-Verfahren auf BSB getestet. Die erhaltenen BSB-Werte unterschieden sich nicht voneinander: Der BSB war in der erfindungsgemaßen Vorrichtung 42 ppm und 45 ppm im 5 Tage-Verfahren. Der Vergleich zeigt, daß die erfindungsgemäße Vorrichtung im Außeneinsatz funktioniert.

Beispiel 10: Vergleich von Membran-Porengrößen

Im Handel erhältliche poröse Membranen (die durchschnittliche Porengröße unterscheidet sich von der vorstehend beschriebenen) wurden zur Immobilisierung von in Beispiel 1 erhaltenen Bakterienzellen durch ein Verfahren verwendet, das dem in Beispiel 8 beschriebenen gleicht. Die Membran wurde in die in Beispiel 9 beschriebene Mikrobensensor-Vorrichtung eingebaut und ein BSB-Standard unter den gleichen, wie in Beispiel 9 beschriebenen Bedingungen analysiert. Die Analysen von unterschiedlichen Konzentrationen von BSB-Standards sind in Fig. 7 dargestellt. Die wiederholten Analysen eines 66 ppm BSB-Standards sind in Fig. 8 dargestellt. Mikrobenmembranen, die aus porösen Membranen mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,45 um im Durchmesser hergestellt wurden, zeigen eine geringere Antwort. Mikrobenmembranen, die aus porösen Membranen mit einer durchschnittlichen Porengröße von 5 um im Durchmesser hergestellt wurden, zeigen eine geringere Antwort, wenn sie wiederholt verwendet werden, und können für keine weitere Analyse verwendet werden. Mikrobenmembranen, die aus porösen Membranen mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,65 um oder mehr im Durchmesser hergestellt wurden, liefern eine gute lineare Korrelation zwischen einer BSB-Standardkonzentration und der entsprechenden Spannungsänderung der Sauerstoffelektrode. Mikrobenmembranen, die aus porösen Membranen mit einer durchschnittlichen Porengröße von 3 um oder weniger im Durchmesser hergestellt wurden, liefern bei einer wiederholten Verwendung eine stabile Antwort. Zusammengefaßt kann gesagt werden, daß Mikrobenmembranen, die aus porösen Membranen mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,65 bis 3 um im Durchmesser hergestellt wurden, stabile und reagierende Mikrobensensoren liefern.

Beispiel 11: Vergleich poröser Membranen

Verschiedene poröse Membranen, die unterschiedliche durchschnittliche Porengrößen im Durchmesser, jedoch eine Stärke von 150 um aufwiesen, wurden zur Herstellung von Mikrobenmembranen verwendet. Bakterienzellen, die von Geliermittel frei waren, wurden auf die porösen Membranen aufgetropft. Auf der Membranunterseite wurde ein Unterdruck angelegt, um die Bakterienzellen in die Membran einzuschließen.
Die erfindungsgemäße Mikrobenmembran wurde ferner wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt. Die Analyse wurde unter den gleichen, wie in Beispiel 10 beschriebenen Bedingungen unter Verwendung der beiden Membranen durchgeführt. Wie in Tabelle 6 dargestellt, zeigt die Mikrobenmembran, die frei von Geliermittel ist, im Vergleich zur erfindungsgemäßen, Geliermittel enthaltenden Mikrobenmembran keine Antwort. Es wurde angenommen, daß die Mikrobenmembran ohne Geliermittel ein unzureichendes Volumen von Bakterienzellen zurückhält. Deshalb wurde die Dicke der perösen Membranen von 150 um auf 600 um verändert. Ferner wurde das Volumen der festzuhaltenden Bakterienzellen auf 4 mg (Trockengewicht) erhöht. Dies entspricht dem 10fachen Volumen, das für die erfindungsgemäße Mikrobenmembran verwendet wurde. Das erhöhte Volumen an Bakterienzellen wurde durch das gleiche, vorstehend beschriebene Verfahren immobilisiert. Tabelle 6 Durchschnittliche Porengröße im Durchmesser (um) Antwort auf einen 66 ppm BSB-Standard (Δmv) * Vorliegende Erfindung
Tabelle 7 zeigt die Ergebnisse. Mikrobenmembranen, die aus porösen Membranen mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,8 um oder weniger im Durchmesser hergestellt werden, sind für Analysen unbrauchbar. Dies liegt an der nachstehend beschriebenen Ursache. Bei der BSB-Analyse wird Waschwasser zum Reaktionsgefäß geleitet. Anschließend wird eine Grundspannung an der Mikrobenelektrode gemessen, die eine anfängliche Sauerstoffkonzentration anzeigt. Die an der Sauerstoffelektrode gemessene Grundspannung war 20 mV (vgl. Tabelle 6), womit fast kein Sauerstoff angezeigt war. Solch ein geringer Sauerstoffgehalt macht die Messung der bei der Assimilation verschiedener organischer Materialien durch Mikroorganismen auftretenden Änderungen der Konzentration von gelöstem Sauerstoff fast unmöglich. Tabelle 7 Fließrate der Probe Durchschnittliche Porengröße im Durchmesser (um) Grundspannung (mV) + Vorliegende Erfindung * Nicht analysiert
Keine Veränderung der Sauerstoffkonzentration zeigt, daß der Sauerstoff im Waschwasser und/oder in den Proben die Mikrobenmembran nicht frei passieren kann. Die Grundspannung der Mikrobenmembran, die eine durchschnittliche Porengröße von mindestens 3 um im Durchmesser aufwies, war 200 bis 300 mV, eine ziemlich hohe Spannung (vgl. Tabelle 7). Es gab keine Antwort auf Proben bei einer 3 Minuten- Fließrate und eine geringe Antwort auf Proben bei einer 30 Minuten-Fließrate. Im Gegensatz dazu wies die erfindungsgemäße Mikrobenmembran eine Grundspannung von 1 000 mV auf und antwortete auf Proben bei einer 3 Minuten-Fließrate.
Der erfindungsgemaße Mikrobensensor liefert eine Grundspannung von 1 000 mv und eine schnelle Antwort auf Proben bei einer 3 Minuten-Fließrate. Mit dem erfindungsgemaßen Mikrobensensor kann daher eine schnelle BSB-Analyse durchgeführt werden.

Beispiel 12: Vergleich von Immobilisierungsverfahren für Bakterienzellen

Zwei Arten von Mikrobensensoren wurden hergestellt: Einer entspricht dem in Beispiel 8 hergestellten Mikrobensensor, und der andere wurde durch Vermischen von 0,4 mg (Trockengewicht) der in Beispiel 1 erhaltenen Bakterienzellen mit einer 10 Gew.-% Acrylamidlösung und anschließender Gelierung des Gemisches hergestellt. Diese Mikrobensensoren wurden in die in Beispiel 9 beschriebene Vorrichtung eingebaut und zur Analyse eines BSB-Standards verwendet. Fig. 9 zeigt, daß der erfindungsgemäße Mikrobensensor in Proben bei einer 3 Minuten-Fließrate und einer BSB- Standardkonzentration von 66 ppm eine 600 mV-Antwort (A) erzeugte, während der Acrylamid/Mikrobensensor keine Antwort (B) erzeugte. Der Acrylamid/Mikrobensensor erzeugte in Proben bei einer 30 Minuten-Fließrate und einer BSB-Standardkonzentration von 66 ppm eine 150 mV-Antwort. Der erfindungsgemaße Mikrobensensor antwortet schneller und kann BSB in kurzer Zeit analysieren. Ein weiterer Nachteil des Acrylamid/Mikrobensensors ist, daß der Sensor gegen Beschädigung empfindlich ist, wenn er mit etwas starkem Druck in die Sauerstoffelektrode eingebaut wird.

Beispiel 13: Immobilisierung unter Verwendung von Ultrafiltrationsmembranen

Die in Beispiel 1 erhaltenen Bakterienzellen wurden auf asymmetrischen Ultrafiltrationsmembranen (Filton Ultrafiltrationsmembran, Omega-Membran, Fuji Filter Co.) durch das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren immobilisiert. Der Mikrobensensor wurde in die in Beispiel 9 beschriebene Vorrichtung eingebaut und zur Analyse des BSB-Standards verwendet. Wie in Fig. 10 dargestellt, wurde eine gute Korrelation zwischen einer BSB-Standardkonzentration und der entsprechenden Spannungsänderung der Sauerstoffelektrode erhalten. Es wurde festgestellt, daß der Mikrobensensor auch gut antwortete.

Beispiel 14: Herstellung von Mikrobenmembranen

Der Stamm Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616) wurde in 100 ml eines Flüssigmediums/pH-Wert 6,5 (1 % Polypepton, 0,1 % Hefeextrakt und 0,5 % Natriumchlorid) in einer 500 ml-Schüttelkulturflasche inokuliert und schüttelnd unter Belüften 17 Stunden bei 30ºC inkubiert.
Nach der Inkubation wurde die Kultur 20 Minuten mit 6 000 Upm zentrifügiert. Die so erhaltenen Bakterienzellen wurden in einer geringen Menge an sterilisiertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde zentrifügiert. Das Waschverfahren wurde dreimal wiederholt. Die Bakterienzellen wurden zu einer Zelldichte von 0,58 0D660 (Bakterienkonzentrat) suspendiert. 32 ul des Konzentrats wurden in 2 g eines Gemisches (1,7 % κ-Carageenan und 0,8 % Johannisbrotkernmehl) suspendiert. Das Gemisch wurde auf Acetylcellulosemembranen (Membranfilter vom Typ HA, durchschnittlichen Porengröße 0,8 um im Durchmesser, Millipore Co.) aufgetropft. Auf der Unterseite der Membran wurde ein Unterdruck erzeugt, bis das gesamte Gemisch absorbiert war. Das Filtrat, eine κ-Carageenan-Lösung, wurde entfernt. Die Mikrobenmembran wurde auf Eis gekühlt und anschließend 5 Minuten bei Raumtemperatur in 100 ml eines 40 mM Phosphatpuffers getaucht. κ-Carageenan und Johannisbrotkernmehl wurden verfestigt, wobei eine Mikrobenmembran erhalten wurde.

Beispiel 15: Vergleich einer Vorrichtung mit und ohne Auslaß

Ein BSB-Standard wurde unter Verwendung der in Beispiel 14 erhaltenen Mikrobenmembran analysiert. Ein 220 ppm BSB-Standard, der aus einem Gemisch (150 mg/l Glucose und 150 mg/l Glutaminsäure) hergestellt worden war, wurde auf eine BSB-Konzentration von 100 ppm und 5 ppm verdünnt. Die Verdünnungen wurden als Proben verwendet.
Zwei Vorrichtungen wurden zum Vergleich verwendet: Eine Vorrichtung wie in Fig. 3 wies einen Auslaß 19 auf und die andere nicht. Luft wurde durch die Luftpumpe mit einer Fließrate von 1 000 ml/min. und die Waschlösungen, der BSB- Standard und die Puffer mit 4 ml/min., 4 ml/min. bzw. 1 ml/min. zugeführt. Diese Lösungen wurden durch eine Flüssigkeitsförderpumpe zugeführt.
Zur Stabilisierung einer Basislinie wurde 10 Minuten vor Zugabe der BSB- Standardproben mit einer Waschlösung (Wasser) gespült. Anschließend wurde mit einem 100 ppm BSB-Standard kontinuierlich gespült. Der Anfangspunkt einer konstanten Output-Linie wurde als Output-Wert bezeichnet. Mit einer Waschlösung wurde 10 Minuten gespült und anschließend eine 5 ppm BSB-Standardprobe in einen Probeneinlaß eingespeist und bis zu einem konstanten Output-Wert gespült.
Fig. 11 zeigt die Fluktuation der Output-Werte der Sauerstoffelektrode. Die in Fig. 3 dargestellte Vorrichtung weist eine lange Leitung zwischen dem BSB-Standard- Probengeber und der Fließzelle auf. Zur Verhinderung einer Verstopfung der Leitung mit festem Material wurde der Durchmesser der Leitung vergrößert, so daß die Analyse länger als in der in Fig. 2 dargestellten, eine einfachere Struktur aufweisenden Vorrichtung dauert. Die Vorrichtung mit einem Auslaß erreichte einen Peak-Output- Wert nach 15 Minuten, während es bei einer Vorrichtung ohne Auslaß bis zur Stabilisierung des Output-Werts durch Wirkung des 100 ppm-BSB-Standards 30 Minuten dauert.

Beispiel 16: Aktivierung von trockenen Mikrobenmembranen durch Nährlösungen

Nährlösungen enthielten 426 ppm Glucose, 426 ppm Glutaminsäure und 300 ppm Hefeextrakt.
Die in Beispiel 15 hergestellten Mikrobenmembranen und eine Vorrichtung mit dem in Beispiel 15 beschriebenen Auslaß 19 wurden verwendet. Die anderen Bedingungen entsprachen den in Beispiel 15 beschriebenen.
Nährlösungen und Puffer wurden jeweils 10 Minuten zugesetzt. Die Output- Werte sind in Fig. 12 dargestellt. Hohe Output-Werte zeigen eine hohe Konzentration an gelöstem Sauerstoff an, während niedrige Output-Werte eine niedrige Konzentration an gelöstem Sauerstoff anzeigen.
Wie in Fig. 12 dargestellt, werden nach der Zugabe von Nährlösungen zu Mikrobenmembranen Substrate in den Nährlösungen durch die Mikroorganismen in den Membranen verbraucht, und die Konzentration an gelöstem Sauerstoff verringert sich. Die Zugabe von Nährlösungen verringert daher die Output-Werte. Nach der Zugabe von Waschlösungen zu den Mikrobenmembranen erhöhen sich die Output-Werte, da aufgrund des Fehlens von Substraten vom Mikroorganismus in der Membran kein Sauerstoff verbraucht wird. Wenn den Membranen erneut Nährlösungen zugesetzt werden, erhöht sich der Sauerstoffverbrauch mehr als nach der ersten Zugabe von Nährlösungen aufgrund der Aktivierung und des Wachstums des Mikroorganismus nach der ersten Zugabe von Nährstoffen, und die Output-Werte verringern sich weiter. Ein Zyklus aus Nährstoffzugabe und Waschwasser reduziert aufgrund einer weiteren Aktivierung der Mikroorganismen die nach Verwendung von Nährlösungen gemessenen Output-Werte. Gleichzeitig erhöht sich ein Output-Wert langsam, wenn Waschwasser zugesetzt wird, und die Output-Wert-Basislinie verringert sich allmählich. Es wird angenommen, daß eine verringerte Output-Wert-Basislinie das Ergebnis der erhöhten Aktivierung von Mikroorganismen ist. Eine konstante Meßwert-Basislinie laßt den Schluß zu, daß die Aktivierung von Mikroorganismen ein für die Analyse ausreichendes Niveau erreicht hat.
Das Aktivierungsniveau der Mikrobenmembran erhöht sich durch Zugabe von Nährlösungen. Mikrobenmembranen mit einem erhöhten Niveau einer Output-Wert- Basislinie sind für eine Analyse jedoch nicht geeignet. Zur Korrektur derartiger Mikrobenmembranen müssen die Mikrobenmembranen zur Stabilisierung der Output- Wert-Basislinie gewaschen werden. Daher muß die Zugabe von Nährlösungen zur Mikrobenmembran beendet werden, wenn ein bestimmtes Aktivierungsniveau erhalten wurde, und es muß zur Stabilisierung der Output-Wert-Basislinie mit Waschlösungen gespült werden.
Eine Output-Wert-Basislinie, von der angenommen wurde, daß sie einer erfolgreichen Aktivierung der Mikrobenmembranen entsprach, wies 1 000, 900, 800 und 700 mv auf, wobei sie nach der Zugabe von Nährlösungen gemessen wurde. Wenn eine Output-Wert-Basislinie diese Spannung erreicht hatte, wurden den Mikrobenmembranen Waschlösungen zugesetzt. Die Analyse wurde durchgeführt, wenn ein konstanter Output-Wert erhalten wurde. Bei einem Output von 800 mv oder weniger wurden die Mikrobenmembranen gewaschen, wobei die gleichen Output-Werte wie mit Mikrobenmembranen vor der Trocknung erhalten wurden (Tabelle 8). Tabelle 8 Aktivierung von Mikrobenmembranen vor der Trocknung Aktivierung von Mikrobenmembranen nach der Trocknung ( mV) Aktivierung von Mikrobenmembranen nach der Trocknung ( mV)
Das gleiche Aktivierungsniveau von Mikrobenmembranen wurde bei einer Output-Basislinie von 700 mv und 800 mV beobachtet. Es dauerte etwa 26 Stunden bis das Aktivierungsniveau eine Output-Basislinie von 700 mv erreicht hatte, während es etwa 21 Stunden dauerte, bis das Aktivierungsniveau eine Output-Basislinie von 800 mV erreicht hatte. Etwa 21 Stunden nach Beginn der Aktivierung wurde mit dem Waschen begonnen und dies bis zur Stabilisierung der Basislinie fortgesetzt. Es wurde festgestellt, daß fünf Stunden Waschen zur Stabilisierung ausreichten. Die Beendigung der Aktivierung und Stabilisierung der Mikrobenmembranen dauerte insgesamt 26 Stunden. Das Aktivierungsniveau der aktivierten Mikrobenmembran ist in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9 Aktivierung von Mikrobenmembranen vor der Trocknung
Wie aus der vorstehenden Beschreibung deutlich wird, können getrocknete, durch Nährlösungen aktivierte Mikrobenmembranen das für eine Analyse ausreichende Aktivierungsniveau wiedergewinnen, und sie zeigen das gleiche Output-Niveau wie die ursprünglichen feuchten Mikrobenmembranen. Eine Aktivierung erfordert nur 26 Stunden. In den im Stand der Technik bekannten Verfahren dauerte es zwei Tage bis getrocknete Mikrobenmembranen zur Analyse verwendet werden konnten: Getrocknete Mikrobenmembranen werden einen Tag in eine Pufferlösung getaucht, in die Vorrichtung eingebaut und abwechselnd mit BSB-Standard und Waschlösungen gespült. In den im Stand der Technik bekannten Verfahren wird ein BSB-Standard anstelle von Nährlösungen verwendet. Der BSB-Standard enthält Glucose und Glutaminsäure, jedoch keine Vitamine und Metallsalze. Die Aktivierung der getrockneten Mikrobenmembranen zur Wiedergewinnung einer für eine Analyse ausreichenden Aktivierung dauert einen weiteren Tag. Daher verkürzt sich das erfindungsgemaße Aktivierungsverfahren für die Aktivierung von getrockneten Mikrobenmembranen um 22 Stunden.

Beispiel 17: Wirkung von periodischer und kontinuierlicher Zugabe von Lösungen auf die Aufrechterhaltung des Aktivierungsniveaus von Mikrobenmembranen

Nachstehend wurden wie in Beispiel 14 hergestellte Mikrobenmembranen verwendet. Die Fließrate der Lösungen war 5 ml/min. und die Betriebszeit 16 Stunden. Die gleiche wie in Beispiel 16 beschriebene Vorrichtung wurde verwendet.

Bedingung 1: Periodische Zugabe von Waschlösungen und BSB-Standard

Pumpenbetrieb: 30 Sekunden
Kein Pumpen: 90 Sekunden
Wie in Fig. 13 dargestellt, wurde mit Waschlösungen vom ersten Pumpen bis zum fünften Pumpen gespült und der BSB-Standard beim sechsten Pumpen durchgeleitet. Dieser Zyklus wurde wiederholt.

Bedingung 2: Kontinuierliche Zugabe von Waschlösungen und BSB-Standard

Waschlösungen: 11 Minuten
50 ppm BSB-Standard: 4 Minuten
Dieser Zyklus wurde wiederholt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt. Beim periodischen Pumpen wurden etwa 1,2 Liter Waschlösungen, BSB-Standard und Pufferlösungen, d. h., 1/4 im Vergleich zum kontinuierlichen Pumpen, verbraucht. Das Aktivierungsniveau der Mikrobenmembranen beim periodischen Pumpen ist jedoch zum Aktivierungsniveau beim kontinuierlichen Pumpen äquivalent. Tabelle 10 Aktivierung von Mikrobenmembranen nach 16 Std. Aktivierung von Mikrobenmembranen vor der Aktivierung durch Bedingung Aktivierung von Mikrobenmembranen vor der Aktivierung

Beispiel 18: Wirkung von Konservierungsmitteln auf die Aktivierung von Mikrobenmembranen

(1) Die Aktivierung (Output) von Mikrobenmembranen wurde verglichen: zum einen wurden den Waschlösungen, Pufferlösungen und dem BSB-Standard unterschiedliche Konservierungsmittel zugesetzt, und zum anderen wurden diesen Lösungen keine Konservierungsmittel zugesetzt.
Die erste Aktivierungs-(Output)-Analyse wurde mit dem Durchschnitt von 10 Aktivierungsanalysen unter Verwendung eines 50 ppm BSB-Standards verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt. Tabelle 11 Konservierungsmittel Aktivierungsniveau der Mikrobenmembranen* Phenol (0,1 %) Natriumsalicylat (0,75 %) Natriumhypochlorit (0,01 %) Borsäure (0,5 %) Kaliumsorbat (0.5 %) *Anfangliches Aktivierungsniveau der Mikrobenmembranen wird als 100 % genommen.
Wie in Tabelle 11 dargestellt, sind Borsäure und Kaliumsorbat die besten Konservierungsmittel zur Aktivierung der Mikrobenmembranen.
(2) Die Gegenwart und Abwesenheit von Mikroorganismus-Anhäufungen auf der Oberfläche von Mikrobenmembranen wurden visuell beobachtet. Borsäure enthaltende Waschlösungen, Puffer und ein BSB-Standard wurden der erfindungsgemäßen Mikrobenmembran zugesetzt. Abwasser einer Nalrrungsmittelfabrik wurde unter Verwendung der Membran analysiert. Wenn kein Abwasser analysiert wurde, wurde zur Aufrechterhaltung des Aktivierungsniveaus die Mikrobenmembran der Bedingung 2 in Beispiel 17 ausgesetzt. Mikroorganismus-Anhäufungen wurden anschließend gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 dargestellt. Tabelle 12 Bakterien-Cluster Konzentration von zugesetzter Borsäure Am Tag Keine Vorhanden *Bei Zugabe von 1,0 % Borsäure wurden der Mikrobenmembranen beeinflußt. Obwohl die Mikrobenmembranen zur Analyse verwendet werden konnten, dauerte die Aktivierung der Membranen mehr als 24 Stunden.
Wie in Tabelle 12 dargestellt, weist Borsäure vorzugsweise eine Konzentration von 0,3 bis 0,5 % auf.
(3) Die Zahl der Kolonien wurde auf der Mikrobenmembran gezahlt, indem die Membran 10 Tage bei 30ºC unter der in Tabelle 12 dargestellten Bedingung in einem 50 ppm BSB-Standard (pH 2,0, mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt) gegeben wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 dargestellt. Tabelle 13 Zahl der Kolonien Konservierungsmittel Am Tag Keine Zugabe % Borsäure % Borsäure/pH mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt oder weniger/ml

Beispiel 19: Korrelation zwischen dem 5 Tage-Verfahren (JIS-Verfahren) und dem erfindungsgemaßen Verfahren (Mikrobensensorverfahren)

Bedingungen: Mikrobenmembranen wurden wie in Beispiel 14 beschrieben hergestellt
Die Mikrobenmembran wurde wie in Beispiel 16 beschrieben aktiviert. Borsäure wurde den Waschlösungen, Puffern und dem BSB-Standard zu einer Endkonzentration von 0,3 % zugesetzt. Der pH-Wert dieser Lösungen wurde mit Chlorwasserstoffsäure auf 2,0 eingestellt.
Das Aktivierungsniveau der Mikrobenmembran wurde wie in Bedingung 1 von Beispiel 17 beschrieben aufrechterhalten.
Verfahren: Proben wurden einmal pro Tag aus dem Abwasser einer Nahrungsmittelfabrik genommen und durch das 5 Tage-Verfahren und das Mikrobensensor-Verfahren analysiert. Die Korrelation zwischen diesen Verfahren wurde analysiert. Der Korrelationskoeffizient ist mindestens 0,95, was auf eine enge Korrelation zwischen diesen beiden Verfahren hindeutet (vgl. Fig. 14).

Beispiel 20: Kontinuierliche Verwendung des Mikrobensensors

Zur Untersuchung der Korrelation zwischen dem 5 Tage-Verfahren und dem Mikrobensensor-Verfahren sowie der Retentionszeit des Aktivierungsniveaus der Mikrobenmembran wurde die erfindungsgemäße Mikrobenmembran zur kontinuierlichen BSB-Analyse unter der gleichen Bedingung wie in Beispiel 19 verwendet.
Es gibt auch bei einer kontinuierlichen Verwendung eine enge Korrelation zwischen diesen beiden Verfahren. Ferner kann die Mikrobenmembran 3 Monate verwendet werden (vgl. Fig. 15).
Wie der vorstehenden Beschreibung entnommen werden kann, dauert die BSB-Analyse durch das JIS-Verfahren 5 Tage. Im Gegensatz dazu stellt die vorliegende Erfindung eine schnelle BSB-Analyse und ein leichtes Überwachungssystem zur Routineuntersuchung von Abwasser bereit.

Claims

1. Analysator für den biochemischen Sauerstoffbedarf (BSB), umfassend einen Mikrobensensor, der eine Sauerstoffelektrode und eine Mikrobenmembran enthält, wobei Mikroorganismen der Gattung Klebsiella in einer Membran immobilisiert sind.

2. BSB-Analysator nach Anspruch 1, wobei die Mikrobenmembran Mikroorganismen umfaßt, die zur Gattung Klebsiella gehören und in einer porösen hydrophilen Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,65 bis 3 um im Durchmesser unter Verwendung eines Geliermittels immobilisiert sind.

3. BSB-Analysator nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Mikro- Organismus der Gattung Klebsiella Klebsiella oxytoca umfaßt.

4. BSB-Analysator nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Mikroorganismus der Gattung Klebsiella Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616) umfaßt.

5. BSB-Analysator nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Geliermittel mindestens ein Mittel aus der Gruppe Alginsäure oder Salze davon, Agar, Gellangummi, Xanthangummi, Gelatine, Carageenan, Johannisbrotkernmehl, Methylcellulose, Pectin und Pullulan umfaßt.

6. BSB-Analysator nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend eine Fließzelle, die mit einem Mikrobensensor ausgestattet ist, der eine Sauerstoffelektrode und eine Mikrobenmembran enthält, wobei Mikroorganismen der Gattung Klebsiella in einer Membran immobilisiert sind.

7. BSB-Analysator nach Anspruch 6, wobei eine Flüssigkeitsleitung, die mit dem Einlaß der mit einem Mikrobensensor ausgestatteten Fließzelle verbunden ist, mit einem Auslaß ausgestattet ist.

8. BSB-Analysator nach Anspruch 1, umfassend eine Fließzelle, die mit einem Mikrobensensor ausgestattet ist, der eine Sauerstoffelektrode und eine Mikrobenmembran enthält, wobei Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616) in einer porösen hydrophilen Membran mit einer durchschnittlichen Porengröße von 0,65 bis 3 um im Durchmesser immobilisiert ist, unter Verwendung mindestens eines Geliermittels, ausgewählt aus Alginsäure oder Salzen davon, Agar, Gellangummi, Xanthangummi, Gelatine, Carageenan, Johannisbrotkernmehl, Methylcellulose, Pectin und Pullulan; und einer Flüssigkeitsleitung, die mit dem Einlaß der mit dem Mikrobensensor ausgestatteten Fließzelle verbunden ist und die mit einem Auslaß ausgestattet ist.

9. BSB-Analyseverfahren unter Verwendung eines der BSB-Analysatoren nach Anspruch 1 bis 8, wobei vor der Verwendung des BSB-Analysators eine Nährlösung auf die Mikrobenmembran aufgebracht wird, welche dann für die Analyse gewaschen wird.

10. BSB-Analyseverfahren unter Verwendung eines der BSB-Analysatoren nach Anspruch 1 bis 8, wobei eine Waschlösung oder eine Substrat lösung zeitweise auf die Mikrobenmembran aufgebracht wird, wenn der BSB-Analysator fur einen längeren Zeitraum nicht benutzt wird.

11. BSB-Analyseverfahren unter Verwendung eines der BSB-Analysatoren nach Anspruch 1 bis 8, wobei Borsäure oder Sorbinsäure oder Salze davon zu der BSB-Probe zugegeben werden.

12. BSB-Analyseverfahren nach Anspruch 9, wobei eine Waschlösung oder eine Substratlöung zeitweise auf die Mikrobenmembran aufgebracht werden, wenn der BSB-Analysator für einen längeren Zeitraum nicht benutzt wird und wobei Borsäure oder Sorbinsäure oder Salze davon zur BSB-Probe zugegeben werden.

13. Klebsiella oxytoca 12092 (FERM BP-3616) der Art Klebsiella oxytoca, das ein breites Assimilationsspektrum aufweist und resistent gegenüber Arsen ist.