DE69002325T2

DE69002325T2 - Pharmazeutische zusammensetzung zur verhütung oder heilung von durch den papillomavirus induzierten tumoren.

Info

Publication number: DE69002325T2
Application number: DE90904636T
Authority: DE
Inventors: Marie-Paule Kieny Marie- Kieny; Richard Lathe; Guerrino Meneguzzi
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1989-03-06
Filing date: 1990-03-06
Publication date: 1993-12-02
Anticipated expiration: 2010-03-07
Also published as: FR2643817A1; WO1990010459A1; JP2926270B2; FR2643817B1; JPH05503282A; EP0462187B1; DE69002325D1; DK0462187T3; CA2050304C; EP0462187A1; ES2058898T3; CA2050304A1; ATE91630T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Impf-Zusammensetzungen die verwendbar sind gegen durch Papillomaviren induzierte Tumore und insbesondere gegen die Typen HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35.
Die Papillomaviren repräsentieren eine Gruppe von DNA-Viren. Sie weisen einen Protein-Körper und ein circuläres DNA-Genom aus etwa 7900 Basenpaaren auf. Eine bestimmte Anzahl von Papillomavirus-Typen, Rinder-Papillomavirus (BPV), Human-Papillomavirus (HPV) wurden bereits identifiziert und die Genome bestimmter Vertreter derselben wurden vollständig sequenziert (1).
Die grundlegenden Forschungsarbeiten, die über diese Viren durchgeführt wurden. führten somit durch Analogie mit dem Genom des Polyom-Virus und des SV 40-Virus dazu, daß in ihrem Genom ein frühentwickelter Bereich und ein spätentwickelter Bereich unterschieden werden können. Der spätentwickelte Bereich enthält zwei Lese-Raster (-Phasen) L1 und L2, die für die Hauptkomponenten des Capsids codieren. Der frühentwickelte Bereich enthält mindestens die Leseraster (-phasen) E1, E2, E4, E5, E6, E7 und E8. Die durch diese Leseraster (Lesephasen) codierten Proteine weisen unterschiedliche Funktionen auf. Drei dieser Proteine sind an den onkogenen Umwandlungsprozessen der infizierten Zellen beteiligt. Das Protein E5 von BPV-1, das ein starkes Umwandlungsvermögen besitzt und in vitro auf unabhängige Weise Zellen umwandeln kann (2), wird durch den Abschnitt 3' des frühentwickelten Bereiches codiert. Die Proteine E6 von BPV-1 und E7 von HPV-16 werden durch den Abschnitt 5' des frühentwickelten Bereiches codiert und sind an der Induktion und Aufrechterhaltung der onkogenen Umwandlung (Transformation) beteiligt. Diese beiden Proteine scheinen aus einem gemeinsamen Ursprungs-Gen durch aufeinanderfolgende Duplikationen eines Peptids mit 33 Aminosäuren zu stammen (3). Das Umwandlungsvermögen von E7 wurde für HPV-16 und 13 gezeigt (4, 5, 6). Unter den anderen frühentwickelten Proteinen spielen E1 und E2 eine Rolle bei der Replikation und/oder Expression des Virus, während dieser Funktionsnachweis bei E4 und E8 nicht erbracht worden ist.
Beim Menschen stehen die HPV im Zusammenhang mit Erkrankungen, die von einer gutartigen Infektion der Haut bis zu Warzen und bösartigen Tumoren reichen. Diese Viren sind hochspezifisch für dte Zielgewebe, insbesondere die Epithele der Epidermis dem Genital-, Oral- und Atmungswege (7). Die epidemiologischen Daten lassen stark die Rolle bestimmter Stämme von HPV vermuten bei dem Krebs des Gebärmutterhalses und der unteren Wege (dem häufigsten tödlichen Tumor bei der Frau). Die DNA von HPV-16 und HPV-18 ist bei den meisten Biopsten wiederzufinden, die aus Genital-Krebszellen stammen, seltener findet man HPV-31, HPV- 33, HPV-35, HPV-39 und HPV-45.
Die mit den HPV-Viren in Verbindung stehenden Erkrankungen (Pathologien) stellen ein therapeutisches Problem dar wegen ihrer persistenten und wiederkehrenden Natur. Bei der Behandlung dieser Erkrankungen werden bereits zahlreiche Methoden angewendet: die Chirurgie, die Cheomotherapie, die Verabreichung von antiviralen Mitteln und die Immuntherapie (8).
In der europäischen Patentpublikation EP-A-0 133 123 ist insbesondere eine Methode der Impfung gegen eine Infektion durch Papillomaviren beschrieben, die darin besteht, daß man auf gentechnischem Wege proteine des Capsids des Virus, d.h. Strukturproteine, die dem spätentwickelten Bereich des Virus entsprechen, herstellt und sie als immunogene Agentien verwendet. Die in dieser Druckschrift beschriebenen Mittel sind gerichtet auf einen Schutz gegen eine Infektion durch die Viren selbst und damit a priori gegen alle Infektionsformen, die sich daraus entwickeln können.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Herstellung von aktiven Vaccinen (Impfstoffen) zur Prävention oder Heilung von malignen Tumoren, die aus einer vorher erfolgten Infektion durch HPV resultieren.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Beobachtung, daß die Bildung von Tumoren, die durch die Papillomaviren induziert werden, auf die Expression der frühentwickelten Gene der Viren zurückzuführen ist.
Gegenstand der Erfindung sind daher pharmazeutische Zusammensetzungen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie als präventives (vorbeugendes) oder kuratives (heilendes) aktives Prinzip (Wirkstoff) mindestens ein rekombinantes Poxvirus enthalten, das umfaßt eine heterologe DNA-Sequenz, die mindestens für den essentiellen Bereich eines frühentwickelten Proteins eines Papillomavirus codiert, sowie die Regulationselemente, die seine Expression in die höheren Zellen gewährleisten.
Unter dem essentielklen Bereich des genannten Proteins ist der Teil der Protein-Sequenz zu verstehen, der in der Lage ist, eine Antitumor-Immunität zu induzieren.
Die erfindungsgemäßen Vaccine-Zusammensetzungen können zu verschiedenen Zwecken verwendet werden. Sie können als präventives Mittel verwendet werden, um das Auftreten von malignen Tumoren zu verhindern entweder vor jeder Infektion durch das Virus oder auch nach einer Infektion, die gutartige Störungen verursacht hat, damit sie keine anderen Gewebe befallen und sich in Krebsgewebe umwandeln können. Sie können potentiell auch als kuratives Mittel (Heilmittel) verwendet werden, um einen bereits entstandenen Tumor zum Verschwinden zu bringen oder eine Ablation (Entfernung) zu vervollständigen oder zu ersetzen. Diese Anwendungen können den Menschen, aber auch das Tier, insbesondere die Rinder zur Verhinderung von Infektionen durch das BPV-Virus, betreffen. Man kann gegebenenfalls das recombinante Poxvirus zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger verwenden, um es in den Menschen oder in das Tier zu inokulieren (einzuimpfen).
Angesichts der Beobachtungen, die gemacht wurden und auf die weiter oben hingewiesen wurde in bezug auf die Häufigkeit der Infektion durch HPV vom Typ 16-18-31-33-35- 39 und 45 in den Fällen des Gebärmutterhals-Krebses betrifft die vorliegende Erfindung insbesondere Vaccine-Zusammensetzungen, die gegen HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39 und HPV-45 verwendet werden können.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine Vaccine(Impf)-Zusammensetzung wie sie oben definiert ist, in der das Poxvirus umfaßt mindestens eine DNA-Sequenz, die für mindestens ein nicht-strukturelles Protein des Virus HPV vom Typ 16, 18, 31, 33, 35, 39 oder 45 und insbesondere des Virus HPV-16, codiert.
Wie weiter oben angegeben, ist die Struktur der Viren der Familie der Papilloma insbesondere von BPV-1 und HVP, so, daß mindestens 7 Leseraster (Lesephasen) existieren, die sehr spezifischen Proteinfunktionen der Wirkungsmechanismen des Virus und der Aufrechterhaltung des Virus-Genoms entsprechen können. Deshalb kann es interessant (vorteilhaft) sein, pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, die in den menschlichen Organismus gleichzeitig mehrere Proteine exprimieren. Dies kann erzielt werden entweder mit mehreren Poxviren, die jeweils ein gegebenes Protein exprimieren, oder mit einem Poxvirus, das mehrere heterologe DNA-Sequenzen enthält, die den ausgewählten Proteinen entsprechen.
Selbstverständlich enthält das rekombinante Poxvirus die Gesamtheit der Elemente, die für die Expression der Proteine in höhere Zellen erforderlich sind, d.h. allgemetn einen Promotor für die Transkription des Gens und einen Initiierungsbereich für die Translation in die Wirtszelle; vorzugsweise handelt es sich bei dem Promotor um den Promotor eines Gens des verwendeten poxvirus.
Unter allen verwendbaren Poxviren wählt man vorzugsweise das Vaccine-Virus aus, weil bereits festgestellt wurde, daß die durch das rekombinante Vaccine-Virus exprimierten Antigene an der Oberfläche der infizierten Zellen korrekt wiedergegeben werden und die Induktion einer Immunresponse vom Zellen-Typ erlauben. Diese Umstände sind besonders vorteilhaft, da es bekannt ist, daß die Eliminierung von Tumorzellen die Zellimmunität mit sich bringt. Wenn es sich bei dem Poxvirus um das Vaccinevirus handelt, verwendet man vorzugsweise als Promotor denjenigen des Gens des Proteins 7,5 K des Vaccinevirus. Die gesamte codierende Promotor-Sequenz wird in einen nicht-essentiellen Bereich des Virus inseriert; beispielsweise im Falle des Vaccine-Virus das Gen der Thymidin-Kinase (TK), was eine leichte Selektion der rekombinanten Viren TK&supmin; erlaubt.
Im allgemeinen wird das lebende Virus dem Menschen oder dem Tier eingeimpft (inokuliert). Man kann aber auch dem Menschen oder dem Tief das abgetötete rekombinante Virus injizieren, das an seiner Oberfläche die ausgewählten Proteine aufweist, oder man kann die gereinigten Proteine injizieren, die aus Zellkulturen stammen, die mit den rekombinanten Vaccineviren infiziert worden sind.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können nach auf dem Gebiet der Impfstoffe bekannten Verfahren hergestellt werden und die anwendbaren Dosen können innerhalb eines braiten Bereiches variieren. Sie sind eine Funktion insbesondere des Zustands des Patienten und anderer Parameter, die vom praktizierenden Arzt beurteilt werden.
Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele erläutert, in denen einerseits die Impfergebnisse bei Tieren, denen Zellen injiziert wurden, die durch das Rinder-Papillomavirus (BPV-1) umgewandelt (transformiert) worden sind, und andererseits die Impfergebnisse bei Tieren, denen Zellen injiziert wurden, die durch das Humanpapillomavirus (HPV-16) umgewandelt (transformiert) wurden, beschrieben sind. Darin sind insbesondere die Klonierung und die Sequenzierung der DNA, die den Leserastern (Lesephasen) bei den Proteinen E5, E6 und E7 von HPV-16 entsprechen, sowie die Impfergebnisse, die mit rekombinanten Viren erhalten wurden, welche diese Proteine exprimieren, beschrieben.
Nachstehend wird die Erfindung detailliert beschrieben unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 7 der beiliegenden Zeichnungen, wobei darstellen:
- Fig. 1 das SDS-PAGE-Gel der Immunpräzipitate der Produkte der Leseraster (Lesephasen) E1, E2, E5 und E6 des frühentwickelten Bereiches des Genoms des Rinder-Papillomavirus BPV-1;
- Fig. 2 die Latenzperiode der Entwicklung der Tumore bei Tieren, die mit den rekombinanten Vaccine-Viren, welche die Produkte der Leseraster (Lesephasen) E1, E2, E5, E6 oder E7 des Rinder-Papillomavirus BPV-1 (VVbE1, VVbE2, VVbE5, VVbE6 und VVbE7) exprimieren, oder mit einem rekombinanten Vergleichs-Vaccinevirus VV-O (das kein Protein von BPV-1 exprimiert) geimpft und mit FR3T3-Zellen, die durch BPV-1 umgewandelt (transformiert) worden sind (FR3T3 BPV-1-6), geprüft wurden;
- Fig. 3 die Latenzperiode der Entwicklung von Tumoren bei Tieren, die mit rekombinanten Vaccineviren, welche die Produkte der Leseraster (Lesephasen) E5, E6 und E7 des Rinder-Papillomavirus BPV-1 (VVbE5, VVbE6, VVbE7) oder eine Assoziation VVbE5-VVbE6 oder VVbE5-VVbE7 exprimieren, oder mit einem rekombinanten Vergleichs-Vaccinevirus VV-O (das kein Protein von BPV-1 exprimiert) geimpft und mit durch BPV-1 umgewandelten (transformierten) FR3T3-Zellen (FR3T3-BPV-1-3) geprüft wurden;
- Fig. 4 in schematischer Darstellung die Struktur des Bacteriophagen M13 E7/E6 (HPV-16);
- Fig. 5 in schematischer Darstellung die Struktur des Bacteriophagen M13 E5 (HPV-16);
- Fig. 6 die komplementäre DNA-Sequenz des Leserasters (der Lesephase) E5 (HPV-16);
- Fig 7 das SDS-PAGE-Gel der Immunpräzipitate der Produkte der Leseraster (Lesephasen) E6 und E7 des frühentwickelten Bereiches des Genoms des Human-Papillomavirus HPV-16;
- Fig. 8 die Entwicklung der Größe der Tumoren bei Tieren, die mit dem rekombinanten Vaccinevirus, welches das Produkt des Leserasters (der Lesephase) E6 des Human-Papillomavirus HPV-16 exprimiert (VVhE6), geimpft und mit primären Rattenzellen geprüft worden sind, die durch HPV- 16 und ein glattes Onkogen umgewandelt (transformiert) wurden;
- Fig. 9 die Entwicklung der Größe von Tumoren bei Tieren, die mit dem rekombinanten Vaccinevirus, welches das Produkt des Leserahsters (der Lesephase) E7 des Human-Papillomavirus HPV-16 exprimiert (VVhE7), geimpft und mit primären Rattenzellen geprüft worden sind, die durch HPV- 16 und ein glattes Onkogen umgewandelt (transformiert) worden sind.

Beispiel 1

Inhibierung der Entwicklung von Tumoren, die durch das Rinder-Papillomavirus (BPV-1) induziert worden sind, durch Impfung mit rekombinanten Vaccineviren, welche die frühentwickelten Proteine von BPV-1 exprimieren.

a) Konstruktion der Vaccineviren, welche die frühentwickelten Proteine von BPV-1 experimieren

Das Plasmid pM69 (9) enthält den frühentwickelten Bereich des Genoms von BPV-1, das als Fragment HindIII-BamHI in die Sequenzen (Stellen) HindIII und BamHI des Plasmids pML2 inseriert worden ist (9). Unterfragmente, welche die Leseraster (Lesephasen) E1, E2, E5, E6 und E7 enthalten, werden durch Digestion mit Restriktionsenzymen gelöscht (vgl. Tabelle I) und in die Bacteriophagen M13TG130 oder M13TG131 eingeführt (10), dann einer gerichteten lokalisierten Mutagenese durch bin Oligonucleotid unterworfen, bevor sie in das Plasmid PTG186 poly transferiert werden (11). Diese Stufen sind in der Tabelle I zusammengefaßt.

Legende zur Tabelle I

[a]: Die unterstrichenen Nucleotide geben die ungepaarten Basen in der Elternsequenz von BPV-1 an;
[b]: Der Initiierungscodon der Translation und die Restriktionsstelle die bei der Klonierung verwendet werden, sind unterstrichen;
[c]: Es war nicht möglich, das Fragment EcoRI-BamHI des Plasmids pM69, welches den Leseraster (die Lesephase) E5 enthält, in den Bacteriophagen M13TG131 in der gewünchten Orientierung einzuführen: die Klone werden in der umgekehrten Orientierung erhalten, in der zwei unabhängige Plasmidfragmente kloniert sind; die Mutagenese durch Oligonucleotid entspricht dem anderen Strang der DNA;
[k]: Das durch Digestion durch ein Restriktionsenzym und dann durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I von E. coli vor der Klonierung gebildete Ende;
na: Nicht anwendbar. Tabelle I: Klonierung und Mutagenese der Unterfragmente des Genoms von BPV-1 für ihren Transfer in die Vaccineviren Leseraster Fragment Vektor Stelle Mutagenese (5'-3')-Sequenz der verwendeten Oligonucleotide Sequenzen an der Initiierungsstelle der Translation [b] Klonierung Vektor
Die gerichtete lokalisierte Mutagenese durch das Oligonucleotid erlaubt die Einführung einer Konsensus-Sequenz im Bereich des Initiierungscodons, um die genaue Expression nach dem Transfer in den Vaccine-Virus zu gewährleisten. In jedem Falle wird durch das Synthese- Oligonucleotid unmittelbar vor der Sequenz, die den Beginn der Translation bestimmt, eine einzelne Restriktionsstelle eingeführt.
Im Falle des Leserasters (der Lesephase) E1 ist es nicht erforderlich, eine lokalisierte Mutagenese durchzuführen wegen der Anwesenheit einer Restriktionsstelle in dem Genom von BPV-1 (Stelle NruI in der Position -11, bezogen auf das Initiator-ATG und einer Quasi-Konsensus-Sequenz des Initiierungsbereichs der Translation (GCGTC G): das Nucleotid G der position -3 ist fast ebenso wirksam wie A bei der Initiierung der Translation.
Hühnerembryo-Primärzellen werden bei 37ºC in einem MEM (Gibco)-Medium, ergänzt durch 10 % Kalbsfötus-Serum, gezüchtet. Sie werden gleichzeitig unterworfen einer Infektion durch ein wärmeempfindliches Vaccinevirus und einer Transfektion durch die Expressions/Transfer-Vektoren, welche die inserierten Segmente von BPV-1 tragen, und durch die DNA des Vaccinevirus vom Wild-Typ. Nach der Selektion isoliert man nach gängigen Verfahren Rekombinanten des Vaccins in denen die Expression der inserierten Sequenz unter der Kontrolle des Promotors 7,5 K des Vaccinevirus steht.
Die rekombinanten Vaccineviren (VV), welche die frühentwickelten Proteine von BPV-1 E1, E2, E5, E6 und E7 exprimieren, werden jeweils als VVbE1, VVbE2, VVbE5, VVbE6 und VVbE7 bezeichnet.

b) Expression von E1, E2, E5, E6 und E7 in die durch die rekombinanten Viren infizierten Zellen

BHK-21-Zellen auf einem Eagle-Medium, das mit Dulbecco MEM.BME (GIBCO) modifiziert worden ist, ergänzt durch 10 % Kalbsfötusserun (GIBCO), werden mit einem der sechs rekombinanten Viren mit einer Multiplizität von etwa 20 Plaque-bildenden Einheiten (ufp) pro Zelle infiziert.
Nach 1 h bei 37ºC wird frisches Medium zugegeben und die Zellen werden 2 h lang inkubiert. Das Medium wird abgezogen, die Zellen werden einmal gewaschen. Dann wird MEM.BME-Medium ohne Methionin und/oder Cystein und ergänzt durch 5 % dialysiertes Kalbsfötus-Serum zugegeben. Die Markierung wird durchgeführt mit 0,5-1 mCi/ml L-Methionin- 35S und/oder L-Cystein-35S (Amersham) während 3 h bei 37ºC. Die so markierten Zellen werden zweimal mit 20 mM Tris . HCl pH 7,2; 150 mM NaCl (Puffer TS), der Aprotinin enthält (1 UI/ml; Biosys, Frankreich), gespült, durch Abkratzen gesammelt und durch zweimaliges Zentrifugieren in dem Puffer STE (20 mM Tris . HCl pH 7,2; 150 mM Nacl; 1 mM Na&sub2;EDTA; 1 % Aprotinin) gespült. Die Zellen werden in dem Puffer RIPA [50 mM Tris . HCl; pH 7,4; 150 mM NaCl; 1 mM Na&sub2;EDTA; 1 % Triton X-100; 1 % Na-Deoxycholat; 0,1 % SDS] lysiert oder fraktioniert zur Bestimmung der subcellulären Lokalisierung der Proteine von BPV-1.
Die Immunpräzipitation und die SDS-PAGE werden nach dem von Davis (12) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Polyklonale Kaninchen-Antiseren, die gegen die bakteriellen Fusionsproteine gerichtet sind, die den Leserastern E1, E2, E5, E6 und E7 entsprechen, werden nach dem klassischen Verfahren erhalten, wie es dem Fachmann bekannt ist, vgl. z.B. die Literaturstellen (13) und (14).
Die mit VVbE1 infizierten Zellen bilden ein Kernprotein von 69 kD, das von dem Antiserum anti-E1 spezifisch erkannt wird (Fig. 1, Bande 1, 1a, Bande 2 entsprechend einer Immunpräzipitation mit einem Nicht-Immun-Serum). Die mit VVbE2 infizierten Zellen enthalten einen erhöhten Gehalt an einem Polypeptid von 48 kD, das eine Überkreuz-Reaktionsfähigkeit mit E2 aufweist und dem Haupt-Transaktivierungs-Protein entspricht, das für den Leseraster E2 von BPV-1 codiert (Fig. 1, Bande 3 und Kontrolle, Bande 4). Dieses Polypeptid ist in allen geprüften Zellen-Unterfraktionen zu finden entsprechend dem, was vorstehend für das Protein E2 der durch BPV-1 umgewandelten (transformierten) Zellen beschrieben worden ist (15). VVbE6 codiert für ein Protein von 15,5 kD, das spezifisch ausgefällt wird durch das Serum anti-E6 (Fig. 1, Bande 6 und Kontroll-Bande 7) und zu mehr als 50 % lokalisiert wird in der Zytoplasma- Fraktion wie bei dem Protein E6 der durch BPV-1 umgewandelten (transformierten) Zellen (16). Die mit VVbE5 infizierten Zellen bilden ein Polypeptid von 7,5 kD, das an Zellmembranen assoziiert ist (Fig. 1, Bande 7 und Kontrolle, Bande 8), der charakteristischen Lokalisierung des Proteins ES von BPV-1 (17). Die Immunpräzipitations-Versuche mit dem Antiserum anti-E7 zeigen keine Überkreuz-Reaktivität. Dennoch zeigt die Analyse der Expressionsvektoren die Anwesenheit des Leserasters E7 in einer richtigen Orientierung und es wird angenommen, daß E7 wirksam gebildet wird, daß es aus einem unbekannten Grund jedoch nicht durch ein verfügbares Antiserum ausgefällt wird.

c) Impfung gegen die durch BPV-1 induzierten Tumorzellen

Gruppen von 4 Wochen alten weiblichen Ratten (Fischer) werden auf intradermalem oder intraperitonealem Wege mit verschiedenen rekombinanten Viren (in einer Dosis von 10&sup8; ufp in 100 ul) geimpft.
Nach 12 Tagen wird ihnen eine Auffrischungs-Injektion mit der gleichen Dosis verabreicht und sie werden einer Probe-Inokulierung zwischen dem 16. und 17. Tag unterworfen mit 3T3-Zellen von syngenischen Linien von Fischer-Ratten (FR3T3), die durch BPV-1 umgewandelt (transformiert) worden sind nach dem in der Literaturstelle (9, 18) beschriebenen Versuchsprotokoll und sie werden als FR3T3- BPV-1-6 bezeichnet. Zu diesem Zweck werden 2 x 10&sup4; Zellen auf subkutanem Wege in einem Volumen von 200 ul MEM . BME- Medium ohne Serum injiziert.
Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt:
- alle kontrollierten Tiere, die mit VV-O geimpft worden sind, entwickeln nach einer Latenzperiode von im Durchschnitt 43 Tagen Tumore;
- die mit VVbE1 oder VVbE2 geimpften Tiere weisen keine Modifizierung (Veränderung) in der Entwicklung der Tumore auf;
- die mit VVbE5, VVbE6 und VVbE7 geimpften Tiere weisen eine signifikante Verzögerung des Auftretens von Tumoren auf. Darüber hinaus gibt es in einigen Fällen keine Entwicklung von Tumoren (> 250 Tage nach der Prüfung), vgl. die innerhalb des Rahmens oberhalb der Figur angegebenen Punkte.
Diese Versuche werden wiederholt, wobei man eine Probeinokulierung mit Zellen der Linie FR3T3 durchführt, die umgewandelt (transformiert) worden sind durch BPV-1 nach dem in den Literaturstellen (9, 18) beschriebenen Versuchsprotokoll, hier als FR3T3-BPV-1-3 bezeichnet. Während VVbE1 und VVbE2 ohne Effekt sind, werden allein VVbE5, E6 und E7 getestet und zwei Gruppen von Ratten werden gleichzeitig mit zwei rekombinanten Viren inokuliert, entweder mit VVbE5 und VVbE7 oder mit VVbE5 und VVbE6, um einen eventuellen cumulativen Effekt dieser Antigene nachzuweisen. Die Fig. 3 bestätigt die vorteilhafte Wirkung einer Impfung mit VVbE5 und VVbE7 (vgl. die Punkte innerhalb des Rahmens oberhalb der Figur, die den Tieren entsprechen, die keinen Tumor entwickeln), während VVbE6 in dieser Situation ohne bemerkenswerte Wirkung bleibt. Darüber hinaus tritt kein ausgeprägter cumulativer Effekt bei der Assoziierung von VVbE5 und VVbE7 auf.

Beispiel 2

Klonierung des Genoms des Virs HPV-16

Die Zellen der Linie CaSki (ATCC 1550) enthalten das Genom des Virus HPV-16 integriert in ein Chromosom. Ausgehend von 10 Kolben von 75 cm³ semi-konfluierenden CaSki- Zellen wird die gesamte Genom-DNA auf die folgende Weise gereinigt: die Zellen werden durch Abkratzen gewonnen, zentrifugiert und gewaschen, dann in 15 ml Puffer TE [Tris 10 mM pH 7,5; EDTA 1 mM] + 0,5 % SDS wieder aufgenommen. Nach der Behandlung mit der Proteinase K (7,5 mg/15 ml) bei 37ºC wähend 16 h wird die DNA bei 4ºC aufbewahrt. Auf diese Weise erhält man 1 ml Lösung, die 0,6 mg DNA enthält.
70 ug dieser DNA werden einer partiellen Digestion mit dem Enzym MboI (10 min; 40 Einheiten) unterworfen, dann auf einem linearen Gradienten von Saccharose (20 %-40 %) abgeschieden. Nach dem Zentrifugieren (Rotor SW 28, 16 h bei 25 000 t, 20ºC) werden 500 ul-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, welche die DNA in einer Größe zwischen 10 und 20 kb enthalten (Fraktionen 23-26) werden vereinigt, gegen den Puffer TE dialysiert, dann mit Ethanol ausgefällt. Auf diese Weise erhält man 5 ug DNA.
Zur Herstellung eines Klonierungsvektors für die vorstehend beschriebene DNA wird die DNA des Bacteriophagen lambda EMBL 301 (19) mit dem Restriktionsenzym BamHI digeriert. Nach der Extraktion mit Phenol-Chloroform und nach der Ausfällung mit Ethanol wird die DNA in dem Puffer TE wieder suspendiert.
Die Genom-DNA der Zellen CaSki und die DNA des Bacteriophagen lambda werden anschließend nach einem klassischen Versuchsprotokoll liegert (1 ug Vektor, 2 ug genomische DNA). Nach dem Verpacken der DNA in eine Packung (Umhüllung), wie sie von der Firma Amersham in den Handel gebracht wird, erhält man eine Gesamtmenge von 0,75 x 10&sup6; unabhängigen Klonen. Diese Bakteriophagen werden zusammen mit den Bakterien E. coli 2358 auf 18 Schalen mit einem Durchmesser von 14 cm und auf dem LBM-Mileu ausgestrichen, damit sie selektioniert werden können mit synthetischen Oligonucleotiden, die von der Sequenz des Virus HVP- 16 abgeleitet sind [(EMBL) PA16].
Das Aussortieren (Selektionieren) der DNA der rekombinierten Bacteriophagen wird auf eine für den Fachmann klassische Weise durchgeführt. Die mit ³²P radioaktiv markierten Oligonucleotide 1817 (Sequenz 5'CATGCATGGAGATACACCTACATTG 3'; Leseraster E7) und 1818 (Sequenz 5' GTGGATAACAGCAGCCTCTGCGTTT 3'; Leseraster E5) werden mit der Phagen-DNA (übertragen auf Nitrocellulose- Filter) 16 h lang bei 55ºC in einem auf das 6-fache konzentrierten SSC-Puffer gemischt und hybridisiert. Die Filter werden anschließend unter den gleichen strengen Bedingungen gewaschen, wobei sechs positive Signale (1-10) erhalten werden. Die Zone der Petri-Schalen, die diesen Signalen entsprechen, wird in 1 ml LBM-Puffer wieder aufgenommen. Diese Suspensioen werden wieder auf Petrischalen mit einem Durchmesser von 10 cm doppelt verteilt (2 bis 10 ul Suspension pro Schale) und es wird eine sekundäre Aussortierung (Selektionierung) mit den Oligonucleotiden 1817 und 1818 getrennt durchgeführt. Die Signale, die den Phagen entsprechen, die aus den ersten Isolierungen 4 und 5 erhalten wurden, waren die stärksten, wobei diese beiden Klone für die folgenden Versuche ausgewählt wurden.
Es werden Minikulturen von Bakterien E. coli Q358, die mit dem Bakteriophagen infiziert sind, isoliert aus den Subklonen 4-1, 4-2, 5-1 und 5-2 hergestellt. Die DNA dieser Klone wird gereinigt und einer Digestion durch das Restriktionsenzym PstI unterworfen, um die ausgewählten Rekombinanten zu analysieren.
Nach der Wanderung auf einem 1 %igen Agarose-Gel werden die obengenannten DNA nach der Methode von Southern auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Diese Membranen werden anschließend mit den beiden mit ³²P markierten Oligonucleotiden 1817 und 1818 unter der Entwirkung der Polynucleotid-Kinase wie oben inkubiert. Nach der Hybridisierung und nach dem Waschen der Membran wird letztere einer Autoradiographie unterworfen. Dabei zeigen sich zwei Banden, die den jeweiligen DNA mit den Größen 1063 und 1772 pb entsprechen, die anzeigen, daß die Klone 4-1, 4-2, 5-1 und 5-2 das Genom des Virus HPV-16 besitzen.

Beispiel 3

Sequenzierung der DNA, die E6, E7 und E5 entsprechen

Der Bakteriophage 5-1 wird für die nachfolgenden Versuche ausgewählt. Um über bedeutende Mengen der DNA dieses Klons verfügen zu können, stellt man die DNA aus 500 ml infizierten Bakterien E. coli Q358 nach einem klassischen Versuchsprotokoll her. Man erhält so 800 ug DNA. Nach der Digestion mit dem Enzym PstI wird die DNA einer Elektrophorese unterworden auf einem 1 %igen Agarose-Gel, das Ethidiumbromid enthält, und unter einer UV-Lampe sichtbar gemacht. Die den Größen 1063 und 1772 pbs entsprechenden Gel-Banden werden herausgeschnitten und die DNA wird extrahiert unter Verwendung einer Packung "Geneclean" (Bio101 Inc). Diese DNA wird anschließend in einen an der Stelle PstI offenen Bakteriophagen M13TG130 ligiert und in kompetente Bakterien E. coli NM522 transformiert.
Die rekombinante DNA der Bakteriophagen M13 wird gereinigt, wobei man von Minikulturen (1,5 ml) ausgeht, und durch Digestion mit Restriktionsenzymen analysiert. Ein die Bande HPV-16 1063 pb enthaltender Klon (M13 E5) und ein die Bande HPV-16 1772 pb enthaltender Klon (M13 E7/E6) werden selektioniert.
Um die Sequenzierungsarbeit zu begrenzen und da die gesuchten DNA diejenigen sind, die den Leserastern E5, E6 und E7 entsprechen, werden nur die Bereiche der Restriktionsfragmente PstI, die den Proteinen E6 und E7 (M13 E7/E6) und E5 (M13 E5) entsprechen, sequenziert mittels synthetischer Oligonucleotide mit der Sequenz
Die Fig. 4 zeigt die Struktur des Bakteriophagen M13 E7/E6 und die Fig. 5 zeigt diejenige des Bakteriophagen M13 E5. Die für E7 erhaltene Sequenz zeigt eine vollständige Homologie mit der Sequenz, die in den Datenbanken PPH16 enthalten ist. Für E6 beobachtet man zwei Mutationen: G anstelle von A in der Position +46 und G anstelle von T in der Position +264, bezogen auf die Initiator-ATG von E6. Für erhält man die in der Fig. 6 dargestellte Sequenz, die sich durch einige Basen von der Sequenz, die in der Datenbank enthalten ist, unterscheidet.

Beispiel 4

Klonierung der DNA-Fragmente, die E6, E7 und E5 in dem Transfer-Vektor enthält

Vor der Integration der für diese drei Leseraster codierenden DNA in rekombinante Vaccineviren ist es erforderlich, sie zu modifizieren, um einzelne Restriktionsstellen stromaufwärts und stromabwärts von den Genen zur Verfügung zu haben und um die Sequenzen um die Initiator- ATG herum zu verbessern zur Erzielung einer guten Translation und eines erhöhten Gehaltes an synthetisiertem Protein.

a) Leseraster E6

Mittels zweier synthetischer Oligonucleotide werden eine Restriktionsstelle SalI und eine Restriktionsstelle SphI jeweils stromaufwärts und stromabwärts von der für E6 codierenden Sequenz erzeugt unter Anwendung einer gerichteten lokalisierten Mutagenese-Technik mit einem Oligonucleotid (Packung Amersham). Diese beiden punktuellen Mutationen werden gleichzeitig durchgeführt unter Verwendung der folgenden Oligonucleotide:
Ein Nucleotid A in der Position -3, bezogen auf ATG, wird anstelle eines Nucleotids T gleichzeitig mit der Restriktionsstelle SalI eingeführt.
Die erhaltenen Bacteriophagen werden durch Digestion mit Restriktionsenzymen und durch Sequenzierung analysiert. Für die nachfolgende Reaktion wird ein Klon mit der Bezeichnung M13TG1181 zurückbehalten. Das Restriktionsfragment SalI-SphI wird anschließend in den Vektor pTG186 poly (11) kloniert, der gegenüber den Restriktionsstellen SalI und SphI offen ist (pTG2198). Dieser Vektor erlaubt den Transfer der DNA in da Genom des Vaccine-Virus.

b) Leseraster E7

Eine Restriktionsstelle PstI und ein Nucleotid A in der Position -3 werden stromaufwärts von der Sequenz, die für das Protein E7 codiert, eingeführt durch lokalisierte Mutagenese mittels des folgenden Oligonucleotids:
Es werden mehrere Klone erhalten. Einer unter denjenigen, die ein Restriktionsfragment PstI von 350 pb enthalten, wird in der der Mutation entsprechenden Zone sequenziert. Die Sequenz entspricht gut der erwarteten Mutation (M13TG1182). Das Restriktionsfragment PstI wird anschließend in das gegenüber der Restriktionsstelle PstI offene Plasmid pTG186 poly inseriert (pTG2199).

c) Leseraster E5

Eine Restriktionsstelle PstI wird stromaufwärts von dem Initiator-ATG des Leserasters E5 (Position 3851 in PPH16) eingeführt durch lokalisierte Mutagenese mittels des folgenden Oligonucleotids:
Eine Restriktionsstelle EcoRI wird stromabwärts von dem Stoppcodon mittels des folgenden Oligonucleotids eingeführt:
Diese beiden Mutationen werden gleichzeitig eingeführt (Packung Amersham). Der für die folgende Reaktion zurückbehaltene Klon wird als M13TG 3151 bezeichnet. Das Restriktionsfragment PstI-EcoRI wird anschließend in das gegenüber den Stellen PstI und EcoRI offene Plasmid pTG186 poly inseriert (pTG3180).

Beispiel 5

Konstruktion von rekombinanten Vaccineviren

Die Plasmide pTG2198, 2199 und 3180 werden verwendet für den Transfer der Leseraster E6, E7 und E5 in ein Vaccinevirus (Stamm Kopenhagen), wie vorstehend beschrieben. Die rekombinanten Viren, in denen die codierenden Sequenzen unter der Kontrolle des Promotors 7,5 K des Impfstoffes stehen, werden als VVhE6, VVhE7 und VVhE5 bezeichnet.
BHK-21-Zellen auf dem MEM.BME-Medium, ergänzt durch 10 % Kalbsfötusserum, werden mit einem der drei rekombinanten Viren infiziert irit einer Multiplizität von etwa 20 ufp pro Zelle.
Nach der Inkubation nach dem weiter oben beschriebenen Versuchsprotokoll werden die Zellen abgetrennt (zurückgewonnen), lysiert und fraktioniert, um die subzelluläre Lokalisation der Proteine von HPV-16 zu bestimmen.
Die Expression der Gene E6 und E7 wird durchgeführt durch Immunpräzipitation der synthetisierten Proteine (die mit Cystein 35S markiert worden sind).
Die polyclonalen Antikörper, die auf die bakteriellen Fusionsproteine gerichtet sind, die den Leserastern E6 und E7 entsprechen, werden nach dem dem Fachmann bekannten und in den Literaturstellen (20) und (21) beschriebenen klassischen Verfahren erhalten.
Die durch VVhE6 infizierten Zellen bilden ein Zytoplasmaprotein von 18 kD, das von dem Antiserum anti-E6 spezifisch erkannt wird (Fig. 7, Bande 1, die Bande 2 entspricht einer Immunpräzipitation mit einem Nicht-Immun-Serum). Die durch VVhE7 infizierten Zellen bilden ebenfalls ein Zytoplasmaprotein von 19 bis 20 kDa, das von dem Antiserum anti-E7 spezifisch erkannt wird (Fig. 7, Bande 3, die Bande 4 entspricht einer Immunpräzipitation mit einem Nicht-Immun-Serum).
Für E5, für das kein Antiserum zur Verfügung steht, erfolgt die Integration des Expressionsblockes von E5 in das Vaccinevirus durch Analyse der DNA nach der Methode von Southern.

Beispiel 6

Effekt der Impfung mit VVhE6 und VVhE7 auf die Entwicklung von durch HPV-16 induzierten Tumoren

Gruppen von weiblichen Ratten (Fischer) mit einem Alter von 4 Wochen werden durch intradermale Injektion von 5 x 10&sup7; ufp (in 100 µl) verschiedener rekombinanter Viren geimpft. Nach 12 Tagen werden sie einer Auffrischungs-Injektion mit der gleichen Dosis unterworfen.
Zwischen dem 16. und dem 17. Tag werden sie mit einer Linie überprüft, die durch Cotransfektion in Primärzellen einer Ratte erhalten worden ist (Linie RE01)
1) eines Plasmids, welches das Genom von HPV-16 enthält, unter der Kontrolle bes LTR des Retrovirus von Moloney (22);
2) eines Plasmids, das codiert für ein Gen mit einer Resistanz gegenüber G418 und für EJ-RAS, das nur hergestellte Linienzellen transformiert oder ein immortalisierendes Gen exprimiert.
2 x 10&sup4; Zellen werden in einem Volumen von 200 µl des Puffers MEM.BME ohne Serum auf subkutanem Wege injiziert.
Nach den Figuren 8 und 9 werden die folgenden Feststellungen getroffen:
- die nicht geimpften Vergleichstiere entwickeln Tumore, die 10 Tage nach der Inokulation der transformierten Zellen nachweisbar sind (vgl. die gestrichelten Linien);
- die mit VVhE6 geimpften Tiere entwickeln in zwei von sieben Fällen keinen Tumor (> 100 Tage). Wenn Tumore auftreten, ist in drei Fällen ihre Entwicklung sehr signifikant verlangsamt und bei zwei Tieren ist das Auftreten von Tumoren verzögert (24 und 34 Tage anstelle von 10 Tagen). In zwei Fällen schließlich ist die Entwicklung von Tumoren identisch mit derjenigen, wie sie für die Vergleichstiere angegeben worden ist;
- die mit VVhE7 geimpften Tiere entwickeln keinen Tumor in drei von sieben Fällen (> 100 Tage). In den vier anderen Fällen treten ab dem 10. Tag Tumore auf, ihre Entwicklung ist jedoch signifikant verzögert.
Um die Schutzwirkungen dieser Impfungen zu testen, wurden die Tiere in den beiden Gruppen, die keine Tumore entwickelt hatte, erneut untersucht und getestet 80 Tage nach der ersten Inokulierungsprüfung mit dem 10-fachen der anfänglichen Dosis, d.h. mit 2 x 10&sup5; Zellen. Unter diesen Inokulierungsbedingungen entwickelten die Vergleichstiere nach 4 Tagen Tumore.
- Die Tiere, die mit VVhE6 geimpft worden waren, entwickeln Tumore auf identische Weise wie die Vergleichstiere;
- dagegen entwickeln die Tiere, die vorher mit VVhE7 geimpft worden waren, selbst unter diesen Bedingungen keine Tumore (> 100 Tage).
Diese Ergebnisse sowie die obengenannten Ergebnisse zeigen die wichtige Rolle, welche die Antigene E7 beim Schutz gegen die Entwicklung von durch HPV-16 induzierten Tumoren spielen.
Um die obengenannten Ergebnisse zu verifizieren, werden zwei weitere Versuchsreihen mit anderen Zellinien durchgeführt. Gruppen von weiblichen Ratten mit einem Alter von 4 Wochen werden durch intradermale Injektion der oben beschriebenen rekombinanten Viren geimpft. Die mit den rekombinanten Viren geimpften Ratten werden geprüft mit 2 x 10&sup4; oder 10&sup5; Ratten-Primärzellen (Linie RE31), die nach dem weiter oben beschriebenen Versuchsprotokoll hergestellt worden waren. Die Anzahl der Tiere, bei denen keine Tumoren auftreten oder bei denen man eine Verzögerung in dem Auftreten derselben beobachtet, ist in dem ersten Teil der Tabelle II (erste Prüfung) angegeben. In dieser Tabelle entspricht VVO einem rekombinanten Vergleichs-Vaccinevirus, das kein Protein von HPV exprimiert. Dann werden die Ratten, bei denen beim ersten Mal keine Tumoren aufgetreten sind, erneut geprüft, diesmal jedoch unter Verwendung einer höheren Konzentration an Primärzel-Len (2 x 10&sup5; anstelle von 2 x 10&sup4; oder 10&sup5;). Die erhaltenen Ergebnisse sind in dem zweiten Teil der Tabelle III (zweite Prüfung) angegeben. Tabelle II rekombinantes Virus kein Auftreteten von Tumoren Verzögerung beim Auftreten eines Tumors gesamt Erste Prüfung durch Injektion von 2x10&sup4; Zellen der Linie RE31 pro Ratte
In einer weiteren Versuchsreihe werden die Linien von Ratten-Primärzellen, die zur Prüfung der geimpften Ratten dienen, cotransfektiert durch
1) ein Plasmid, welches das Cenom von HPV-16 enthält, unter der Kontrolle seines eigenen Promotors,
2) ein Plasmid, das codiert für ein Gen mit einer Resistenz gegenüber G418 und für EJ-RAS, das nur hergestellte Zellinien transformiert oder ein immortalisierendes Gen exprimiert.
Man erhält so die Linie RE604. In der Tabelle III sind die unter diesen Versuchsbedingungen erhaltenen Ergebnisse dargestellt. Tabelle III Prüfung durch Injektion von 2 x 10&sup4; Zellen der Linie RE604 pro Ratte rekombinantes Virus kein Auftreten von Tumoren Verzögerung beim Auftreten eines Tumors gesamt
Die Ergebnisse dieser Versuche zeigen die wichtige Rolle, welche die Antigene E7 und E6 bei dem Schutz gegen die Entwicklung von durch HPV-16 induzierten Tumoren spielen.
In allen Zellinien erfolgt die Expression des Proteins E7 durch Immunpräzipitation. Die durch das Antigen E7 ausgeübte Schutzwirkung ist danach nicht von der betrachteten Linie abhängig.
Die folgenden Stämme wurden am 24. Feburar 1989 bei der Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur (Paris) hinterlegt.
E. coli pTG2198 unter der Nr. I-837
E. coli pTG2199 unter der Nr. I-838
E. coli pTG3180 unter der Nr. I-839

Literaturstellen

(1) H Pfister (1987), "The papovaviridae: The papillomaviruses" (Edition, N.P. Salzman und P.M. Howley, Plenum Press, New York, S. 1-38.
(2) R Schlegel et al. (1986), "SCIENCE" 233, 464-467.
(3) O. Danos und M. Yaniv (1987). "In. Cancer Cells" 5: Papillomaviruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.
(4) T. Kanda et al. (1988) "J. Virol." 62, 610-613.
(5) K.H. Vousden et al. (1988) "Oncogene Res." 3, 1-9.
(6) M.A. Bedell et al. (1987). "J. Virol " 61, 3635-3640.
(7) H. Zur Hausen und A. Schneider (1987). "The Papovaviridae: The papillomaviruses" (Edition, N.P. Salzman und P.M. Howley, Plenum Press, New York, S. 245-263.
(8) P.K. Weck und J.K. Whisnant (1987): "The papillomaviruses "(Edition, N.P. Salzman und P.M. Howley) Plenum Press, New York, S. 393-402.
(9) B. Binetruy et al. (1982). "EMBO J." 82, 621-628.
(10) M.P. Kieny et al. (1983). "Gene" 26, 91-99.
(11) P.P. Kieny et al. (1984). "Nature" 312, 163-166.
(12) G. Davis et al. (1986). "Basic methods in molecular biology (Elsevier)".
(13) E.J. Androphy et al. (1987) "The Papovaviridae: The papillovaviruses" (Edition, N.P. Salzman und P.M. Howley, Plenum Press, New York, S. 79-85.
(14) R. Schlegel und M. Wade-Glass (1987) "The papillomaviruses" (Edition, N.P. Salzman und P.M. Howley) "Plenum Press", New York, S. 87-91.
(15) Schiller et al. (1984) "PNAS" 81, 7880.
(16) E.J. Androphy et al. (1986). "Science" 230, 442-445.
(17) A Burckhardt et al. (1987). "EMBO J.", 6, 2381-2385.
(18) M. Grisoni et al. (1984). "Virology" 135, 406-416.
(19) R. Lathe et al. (1987) "GENE" 57, 193-201.
(20) E.J. Androphy et al. (1987) "EMBO J." 6, 989-992.
(21) Shotkin und Wettstein (1986, "PNAS" 83, 1689-1694.
(22) A. Storey et al. (1988), "EMBO J." 7, 1815-1820.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, bestimmt zur Behandlung oder Vorbeugung einer Infektion oder eines Tumors durch Papillomavirus, umfassend ein rekombinantes Poxvirus in dessen Oenom ein heterologes DNA-Fragment eingeführt ist, das kodiert für ein Protein, ausgewählt unter den ursprünglichen Proteinen E&sub5;, E&sub6; und E&sub7; eines Papillorravirus oder für eine essentielle Region dieses Proteins; wobei dieses DNA-Fragment unter die Kontrolle von für seine Expression in Säugetier-Zellen notwendige Elemente plaziert ist.

2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend ein rekombinantes Poxvirus, in dessen Genom ein heterologes DNA-Fragment eingeführt ist, das für ein Protein kodiert, das ausgewählt ist unter den ursprünglichen Proteinen E&sub5;, E&sub6; ond E&sub7; eines Papillonavirus; wobei dieses DNA-Fragment unter die Kontrolle von für seine Expression in Säugetier-Zellen notwendige Elemente plaziert ist.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, umfassend ein rekombinantes Poxvirus, in dessen Genom ein heterologes DNA-Fragment eingeführt ist, das für ein Protein kodiert, das ausgewählt ist unter den ursprünglichen Proteinen E&sub5;, E&sub6; und eines Papillomavirus vom Typ HPV-16.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 oder 3, umfassend ein rekombinantes Kuhpockenvirus, in dessen Genom ein heterologes DNA-Fragment eingeführt ist, das für ein Protein kodiert, das ausgewählt ist unter den ursprünglichen Proteinen E&sub5;, E&sub6; und E&sub7; eines Papillomavirus.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, umfassend ein rekombinantes Poxvirus, in dessen Genom ein heterologes DNA-Fragment eingeführt ist, das für das ursprüngliche Protein E&sub5; eines Papillomavirus kodiert.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, umfassend ein rekombinantes Poxvirus, in dessen Genom ein heterologes DNA-Fragment eingeführt ist, das für das ursprüngliche Protein E&sub6; eines Papillomavirus kodiert.

7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2, 3 oder 4, umfassend ein rekombinantes Poxvirus, in dessen Genom ein heterologes DNA-Fragment eingefühct ist, das für ein ursprüngliches Protein E&sub7; eines Papillomavirus kodiert.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 dadurch gekennzeichnet, daß die 3-Stellung der Initiierungs-Region der Translation ein A oder in G umfaßt.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Poxvirus lebend oder abgetötet ist.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1l bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen brauchbaren pharmazeutischen Träger umfaßt, der ihre Verabreichung durch Injektion an Menschen oder Tiere ermöglicht.