DE3382659T2

DE3382659T2 - Verfahren zur herstellung von poxvirus-rekombinanten zur expression fremder gene.

Info

Publication number: DE3382659T2
Application number: DE8383111976T
Authority: DE
Inventors: Michael Mackett; Bernard Moss; Geoffrey Lilley Smith
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1982-11-30
Filing date: 1983-11-29
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2003-11-30
Also published as: JPH0795954B2; WO1984002077A1; EP0110385A3; EP0110385B1; DE3382659D1; AU570940B2; JPS60500518A; EP0110385A2; AU2342484A

Description

Die Technik der DNA-Rekombination hat es ermöglicht, Gene des einen Organismus in einem anderen Organismus zu exprimieren. Der Stand der Technik zeigt, daß mehrere Virusgruppen einschließlich Papovaviren, Papillomaviren, Adenoviren und Retroviren als eukaryontische Klonierungs- und Expressionsvektoren eingesetzt wurden. Die relativ geringe Größe dieser Virusgenome erleichterte die in vitro-Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle. Sie besitzen jedoch im allgemeinen einen beschränkten Wirtsbereich, sind hinsichtlich ihrer Aufnahmekapazität für DNA strikt beschränkt und verlieren ihre Infektivität nach Insertion von Fremd-DNA. Obwohl die Gentechnologie größerer Viren, beispielsweise von Pockenviren, schwieriger ist, könnten solche Vektoren wegen ihrer höheren Kapazität und ihres größeren Potentials, die Infektivität für einen breiten Wirtszellbereich zu erhalten, vorteilhaft sein. Für Pockenviren, beispielsweise Vacciniavirus, können solche Rekombinanten zur Entwicklung lebender Virusimpfstoffe führen.
Vacciniavirus wird hier beschrieben, da es das am besten untersuchte Mitglied der Gruppe der Pockenviren ist. Vacciniavirus hat einen breiten Wirtsbereich in vitro und in vivo und ist weltweit als wirksamer Impfstoff gegen Variola, ein verwandtes Pockenvirus, das Pocken verursacht, eingesetzt worden. Vaccinia ist ein großes Virus mit einem linearen doppelsträngigen DNA-Genom mit einem Molekulargewicht von ungefähr 122 Millionen, gleichbedeutend mit mehr als 180.000 Basenpaaren. Das Virus benutzt zur Transkription und Replikation im Cytoplasma der infizierten Zelle seine eigenen Enzyme. Die Nukleotidsequenz zeigt, daß sich die im Virusgenom von Vaccinia für die Transkription codierten Regulationssignale von den von eukaryontischen Zellen benutzten unterscheiden. Die hier beschriebene Erfindung berücksichtigt sowohl die Größe des Pockenvirusgenoms als auch die einzigartigen Regulationssignale für die Transkription.
Literaturstellen, die die vorliegende Erfindung betreffen, sind Venkatesan et al., Cell 125:805-813 und J. Virol. 44:637-646 (1982); Baiszer et al., J. Virol. 45:62-72 (1983); Weir et al., J. Virol. 46:530 (1983); Moss et al., J. Virol. 40:387-395 (1981); Mackett et al., PNAS USA 79:7415 (1982); US-A-4237224; Valuenzuela et al., Nature 298:347-350 (1982); Moriarty et al., PNAS USA 78:2606-2610 (1981); und Liu et al., DNA 1:213-221 (1982).
Panicali und Paoletti, PNAS USA 79:4927-4931 (1982), beschreiben Donor- oder Insertionsvektoren zur Präparation rekombinanter Vacciniaviren. Die Vektoren umfassen das Hind III F-Fragment von Vaccinia, in dessen BamHI-Stelle das Thymidinkinase-Gen von Herpes Simplex-Virus (HSV TK) inseriert wurde (vgl. pDP132 und pDP137 in Fig. 1). Das HSV TK-Gen enthält die geneigenen Regulationssignale (Seite 4927, Spalte 1, Zeilen 15-16). Diese Druckschrift stellt fest, daß man die bei der Transkriptionsanalyse erhaltenen Ergebnisse in ihrer Bedeutung so interpretieren könnte, daß die Regulationssignale des HSV TK-Gens erkannt werden, obwohl "andere (unveröffentlichte) Daten nahelegen, daß Vaccinia-Signale für die Expression der HSV TK Wirkung entfalten könnten".
Weir et al., PNAS USA 79:1210-1214 (1982), beschreiben die Kartierung des TK-Gens von Vacciniavirus nach zwei unabhängigen Methoden; "Marker-Rescue" und zellfreie Translation. "Marker- Rescue" zeigte, daß TK&spplus;-Virus in Gegenwart von "lebendem" TK&supmin;- Virus im Überschuß selektiv titriert werden konnte. Plasmide mit DNA-Segmenten von Vacciniavirus wurden benutzt, um virale mRNA mittels eines Hybridisierungsverfahrens zu selektionieren. Durch zellfreie Translation solcher mRNAs wurde enzymatisch aktive TK gebildet.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß umfaßt ein Plasmid-, Cosmid- oder ein Phagenvektor, der zur homologen Rekombination in ein Pockenvirus in der Lage ist: ein chimäres Gen, das wenigstens eine Regulationssequenz von einem Pockenvirus für die Transkription und, unter der Transkriptionskontrolle der Regulationssequenz, wenigstens eine durchgehende proteincodierende Sequenz eines fremden Gens umfaßt, worin die Regulationssequenz und die codierende Sequenz nicht durch eine weitere Regulationssequenz für die Transkription getrennt sind; und DNA aus einem nichtessentiellen Bereich des Pockenvirusgenoms, die das chimäre Gen flankiert.
Wenn es sich um ein geeignetes fremdes Gen aus einem Pathogen handelt, kann das rekombinante Pockenvirus als lebender Impfstoff dienen. Einige Beispiele für solche fremden Gene umfassen DNA-Gene oder DNA-Kopien von RNA-Genen aus Hepatitis B-Virus, Hepatitis A- Virus, Hepatitis non-A, non-B-Virus, Influenzavirus, Herpesvirus, Cytomegalovirus, Adenoviren, Parvoviren, Maul- und Klauenseuche- Virus, Poliovirus, Masernvirus, Tollwutvirus, Coronaviren, Coxsakkieviren und pathogenen Bakterien, Rickettsien, Protazoen und Metazoen. Erfindungsgemäß werden Zellen, die mit Pockenvirus-Rekombinanten infiziert sind, auch zur Präparation des Fremdgen-Produkts benutzt.
Bei den Überlegungen zur Entwicklung von Vacciniavirus oder anderen Pockenviren als infektiöse Expressionsvektoren wurden die folgenden biologischen Charakteristika dieser Agentien berücksichtigt: die Evidenz, daß Vacciniavirus seine eigenen Regulationssequenzen zur Transkription evolviert hat; seine Genomgröße; und die mangelnde Infektivität isolierter viraler DNA.
Mit der vorliegenden Erfindung erreicht man eine effiziente Expression fremder DNA, indem man chimäre Gene konstruiert, die aus einer Regulationssequenz von Pockenvirus für die Transkription und einer durchgehenden proteincodierenden Sequenz eines Fremdgens bestehen. Die Regulationssequenz von Pockenvirus für die Transkription besteht aus einem DNA-Segment, das der Stelle, an der die RNA- Synthese beginnt, vorangeht und diese Stelle einschließt. In der folgenden Beschreibung werden Sequenzen, die die Transkription eines Gens positiv regulieren, als "Promotor" bezeichnet. Die proteincodierende Sequenz des fremden Gens umfaßt den Ort, der der Translationsinitiation entspricht und wird im folgenden als "Fremdgen" bezeichnet. Wenn erfindungsgemäß die Initiationsstelle für die Translation des Fremdgens benutzt wird, werden Leserasterverschiebungen und mögliche Probleme, die mit der biologischen Aktivität von Fusionsproteinen zusammenhängen, vermieden. Das chimäre Gen wird von DNA aus einem bekannten, nichtessentiellen Bereich des Pockenvirusgenoms flankiert, die letztlich die homologe Rekombination erlaubt. Die vorliegende Erfindung stellt somit ein allgemeines Verfahren zur Expression von Fremdgenen bereit, in dem Plasmide konstruiert werden können, die multiple Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen neben dem Pockenvirus-Promotor besitzen und sowohl die flankierende Pockenvirus-DNA als auch den Replikationsort des Plasmids und dessen Gen für die Antibiotikaresistenz enthalten. Die Plasmide werden dann mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease unter Bildung ligierbarer Enden geschnitten, und ein Fremdgen mit komplementären Enden wird neben den Pockenvirus- Promotor ligiert. Das Plasmid, das das chimäre Gen und die flankierende Pockenvirus-DNA enthält, wird zur Transformation von Bakterien benutzt und dann aus den transformierten Bakterien gereinigt.
Das Plasmid mit dem von der Pockenvirus-DNA flankierten chimären Gen wird dann erfindungsgemäß unter transfizierenden Bedingungen zur Transfektion von Zellen eingesetzt, die mit Vacciniavirus oder einem anderen kompatiblen Pockenvirus infiziert sind. Man läßt die homologe Rekombination und die Replikation erfolgen, worauf das chimäre Gen an der Stelle, die durch die verwendete flankierende DNA spezifiziert ist, in das Pockenvirusgenom inseriert wird. Es ist wichtig, flankierende DNA aus einem nichtessentiellen Bereich des Genoms zu verwenden, damit die Infektivität nicht zerstört wird.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten rekombinanten Pockenviren lassen sich vom ursprünglichen Virus durch verschiedene Verfahren unterscheiden. Wenn man beispielsweise Segmente des Thymidinkinase (TK)-Gens von Vacciniavirus als flankierende DNA verwendet, kann das chimäre Gen in das Thymidinkinase-Gen von Vacciniavirus inseriert werden und dadurch dessen Funktion zerstören. Wenn also die flankierende DNA aus dem TK-Gen Von Vacciniavirus stammt, können Virus-Rekombinanten selektioniert werden, denen die TK-Aktivität fehlt. Alternativ können die Viren entweder durch DNA-DNA-Hybridisierung, durch Nachweis des Fremdgen-Produkts oder durch andere Selektionsverfahren unterschieden werden.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

Die folgende Beschreibung unterteilt sich in folgende Abschnitte:
I. Präparation eines Plasmidvektors, der einen Pockenvirus- Promotor, Insertionsstellen für ein Fremdgen und flankierende Sequenzen von Pockenvirus-DNA enthält.
II. Präparation und Insertion eines Fremdgens in den Plasmidvektor unter Bildung eines chimären Gens.
III. Transfektion virusinfizierter Zellen mit Plasmid, das ein chimäres Gen enthält.
IV. Isolierung von rekombinantem Pockenvirus und Nachweis des Fremdgen-Produkts.
V. Infektion empfindlicher Zellen oder Tiere mit Rekombinanten von Vacciniavirus.
In der folgenden Beschreibung werden die Manipulationen an Vacciniavirus-DNA, beispielsweise die Lokalisierung des Thymidinkinase- Gens im Virusgenom von Vaccinia, beispielhaft für die allgemein leicht auf Pockenvirus anwendbaren Manipulationen im einzelnen dargelegt. Entsprechend sind die hier angeführten Beispiele nur als Erläuterung zu verstehen und eine Vielzahl von Abwandlungen und Modifikationen sind dem Fachmann im Rahmen dieser Erfindung geläufig.
I. Präparation eines Plasmidvektors, der einen Vacciniavirus- Promotor, Insertionsstellen für ein Fremdgen und flankierende Sequenzen aus Vacciniavirus-DNA enthält.
Das für die Zusammenstellung des Insertionsvektors benutzte Vehikel kann jedes übliche Plasmid, Cosmid oder jeder übliche Phage sein. Beispiele für Phagen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind die Lambda- und M13-Phagen. Ein beispielhaftes Cosmid, das eingesetzt werden kann, trägt die Bezeichnung pHC79 und wird von Hohn und Collins, Gene 11:291 (1980), beschrieben. Beispiel für Plasmide, die verwendet werden können, sind pBR322, pBR325, pBR327, pBR328, pUC7, pUC8 oder pUC9. Das DNA-Segment von Vacciniavirus, das in dem vorliegenden Beispiel als Promotor für die Transkription des Fremdgens verwendet wird, besaß Nukleotidsequenzen, die der Startstelle einer RNA vorangehen und diese umfassen. Um dieses Verfahren anwenden zu können, wurde die Nukleotidsequenz und eine genaue Transkriptionskarte dieser Region benötigt. Wenn sich eine passende Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease vor und eine weitere nach der RNA-Startstelle aber vor dem ersten ATG oder Initiationscodon für die Translation befand, wurde das Promotor- Segment durch einen Verdau mit einer Restriktionsendonuklease ausgeschnitten und nach Standardmethoden wie Agarosegelelektrophorese isoliert. Wenn keine passende Restriktionsstelle zur Verfügung stand, war es erforderlich, andere Methoden, beispielsweise Spalten hinter der gewünschten Stelle und Entfernen von überzähligen Nukleotiden mit einer Nuklease wie Bal31, anzuwenden äfür eine Beschreibung solcher und anderer hier angewandter Methoden siehe MANIATIS et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory 1982)).
Das Promotorsegment wurde entweder direkt oder nach Modifizierung seiner Enden mit einem Plasmid ligiert, das mit einer Restriktionsendonuklease gespalten war, die kompatible ligierbare Enden lieferte. Die Ligation der kohäsiven oder stumpfen Enden erfolgte nach Standardmethoden. Indem man den Promotor in ein Plasmid wie pUC9 inserierte, das bereits multiple Insertionsstellen besaß, wurden zusätzliche Restriktionsstellen neben den Promotor plaziert; die Ligation mit synthetischen Oligonukleotide ist jedoch ebenfalls möglich. Das den Promotor enthaltende Plasmid wurde zur Transformation von Bakterien benutzt und dann gereinigt. Um den Promotor auszuschneiden wurden Restriktionsendonukleasen mit benachbarten Restriktionsstellen verwendet und das resultierende DNA-Fragment wurde nach üblichen Methoden gereinigt.
Die zur Flankierung des Promotors und der zusätzlichen Restriktionsstellen verwendete DNA wurde aus einer nichtessentiellen Region des Vacciniavirus-Genoms erhalten. Beispiele für solche nichtessentiellen Regionen umfassen das Thymidinkinase-Gen (Weir, Bajszar und Moss, a.a.O.; Weir und Moss, a.a.O.) und einen Bereich von wenigstens 9.000 Basenpaaren (bp), der sich neben der linken invertierten terminalen Sequenzwiederholung befindet (Moss, Winters und Cooper, a.a.O.). DNA, die den nichtessentiellen Bereich enthielt, wurde durch Spaltung mit Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten und durch Agarosegelelektrophorese oder andere übliche Methoden gereinigt. Das Segment wurde dann mit Plasmid-DNA ligiert, die mit einer Restriktionsendonuklease geschnitten war, die ligierbare komplementäre Enden lieferte. Das Plasmid, das die Vacciniavirus-DNA enthielt, wurde zur Transformation von Bakterien eingesetzt und dann gereinigt. Zur Spaltung des nichtessentiellen Segments der Vacciniavirus-DNA im Plasmid wurde eine geeignete Restriktionsendonuklease verwendet, so daß es mit dem zuvor isolierten Promotorfragment ligiert werden konnte. Nach diesem Verfahren (oder offensichtlichen Abwandlungen davon, bei denen die Reihenfolge der Ligations- und Spaltungsschritte geändert wurde) wurde ein Plasmid erhalten, das einen Promotor von Vacciniavirus mit angrenzenden Restriktionsstellen besitzt, flankiert von einem nichtessentiellen Segment aus der Vacciniavirus-DNA. Da dieses Plasmid den Replikationsursprung und das Gen für die Antibiotikaresistenz des Plasmids behalten hatte, wurde es zur Transformation von Bakterien eingesetzt und repliziert.
II. Präparation und Insertion eines Fremdgens in den Plasmidvektor unter Bildung eines chimären Gens.
Ein DNA-Segment, das ein Fremdgen oder eine cDNA-Kopie eines Fremdgens enthielt, wurde isoliert. Das DNA-Segment wurde mit einer Restriktionsendonuklease an einer Stelle vor dem Initiationscodon für die Translation und an einer Stelle nach dem Ende der proteincodierenden Sequenzen geschnitten. Wenn es keine passenden Stellen gab war es erforderlich, jenseits der gewünschten Stelle zu schneiden und eine Exonuklease wie Bal31 zu verwenden, um überzählige Nukleotide abzuspalten. Zur optimalen Expression wurde das erste ATG im Segment zur Translationsinitiation des gewünschten Gens verwendet. Da es keinen Hinweis auf Spleißen von Vacciniavirus- RNA gibt, wurden durchgehende proteincodierende Sequenzen verwendet.
Das in Teil I dieses Abschnitts konstruierte Plasmid wurde an einer Restriktionsschnittstelle neben dem Promotor gespalten. Dann wurde das proteincodierende Segment des Fremdgens direkt, wenn es komplementäre Enden hatte, oder nach Modifikation seiner Enden, mit dem Promotor ligiert. Nach Transformation von Bakterien wurde das Plasmid gereinigt. Wenn das Fremdgen in mehr als einer Orientierung inseriert werden konnte, mußte man durch Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese oder durch Nukleotidsequenzanalyse überprüfen, ob man die richtige Orientierung erhalten hatte. In dem gewünschten Plasmid befand sich der Promotor neben der Startstelle des Fremdgens.
III. Transfektion virusinfizierter Zellen mit Plasmid, das ein chimäres Gen enthält.
Plasmide mit chimären Genen, die von DNA aus nichtessentiellen Bereichen des Vacciniavirus-Genoms flankiert sind, wurden zur Transfektion von Zellen verwendet, die bereits mit Vacciniavirus infiziert waren. Das chimäre Gen wurde durch homologe Rekombination in das Vacciniavirus-Genom inseriert. Typischerweise wurden konfluente Monolayer von CV-1, BSC-1, TK 143 oder anderer Zellen in 2 Flaschen mit 25 cm Bodenfläche mit 0,01 bis 0,05 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Zelle Vacciniavirus infiziert. Ungefähr 1 ug Plasmid-DNA wurde mit oder ohne 1 ug Vacciniavirus-DNA mit 20 ug Kalbsthymus-DNA oder einer anderen Träger-DNA in 1 ml 0,1% Dextrose, 0,14 M NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 20 mM Hepes, (pH 7,5) gemischt und durch Zugabe von CaCl&sub2; auf eine Endkonzentration von 125 mM gefällt. Die Mischung wurde sanft umgeschwenkt und ungefähr 45 min bei Raumtemperatur belassen. Zwei Stunden nach der Infektion wurden 0,8 ml der feinen Suspension zu einem infizierten Monolayer gegeben, von dem das Medium entfernt worden war. Nach 30 min gab man 8 ml Eagle- oder anderes Gewebekulturmedium, das 8% fötales Rinderserum enthielt, zu jeder Flasche hinzu und inkubierte weitere 3,5 Stunden bei 37ºC. 6 Stunden nach der Infektion wurde frisches Medium mit 8% fötalem Rinderserum zugegeben und die Inkubation wurde weitere 48 Stunden fortgesetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die infizierten Zellen von der Flasche abgekratzt, zentrifugiert, in Gewebekulturmedium resuspendiert und zum Aufbrechen der Zellen und Freisetzen des Virus homogenisiert.
IV. Isolierung von rekombinantem Vacciniavirus und Nachweis des Fremdgen-Produkts.
Das Virus aus transfizierten Zellen bestand aus einer Population, von der nur ein geringer Prozentsatz Rekombinanten waren. Diese Rekombinanten wurden mit Hilfe einer Vielzahl selektiver und nichtselektiver Methoden isoliert.
Selektive Verfahren hingen von der Fähigkeit der Rekombinanten ab, unter Bedingungen zu replizieren, die das ursprüngliche Virus inhibierten. Eine Selektionsmethode beinhaltete die Inaktivierung des TK-Gens von Vacciniavirus. Dies wurde erreicht, indem DNA des TK- Gens von Vacciniavirus zur Flankierung des chimären Gens benutzt wurde. Im Fall einer homologen Rekombination wurde das chimäre Gen in das TK-Gen der Virus-DNA inseriert und die Rekombinanten zeigten einen TK negativen (TK&supmin;) Phänotyp. Die Selektionsbedingungen zur Isolierung von TK&supmin;-Vacciniavirus wurden erhalten, indem man das Virus auf Monolayern von TK&supmin; negativen Zellen, wie TK&supmin;143-Zellen, mit Top-Agar, 1%-ig an bei niedriger Temperatur erstarrendem Agar und mit 25 ug/ml 5-Bromdeoxyuridin (BUdR), Plaques bilden ließ. Nach 48 bis 72 Stunden bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; wurden die Plaques durch Anfärben mit 0,005% Neutralrot nachgewiesen. Typischerweise waren mehr als 30% der TK&supmin;-Plaques Rekombinanten, während der Rest aus spontanen TK&supmin;-Mutanten von Vacciniavirus bestand.
Eine zweite Selektionsmethode wurde angewandt, wenn TK&supmin;-Zellen mit TK&supmin;-Mutanten von Vacciniavirus infiziert und dann mit Plasmiden, die ein chimäres TK-Gen von Herpes-Virus enthielten, transfiziert wurden. [Die TK&supmin;-Mutanten von Vacciniavirus wurden durch Infektion von TK&supmin;143-Zellen mit Vacciniavirus in Gegenwart von 25 ug/ml BUdR erhalten. Die TK negativen Mutanten wurden dann wenigstens zweimal hintereinander in Gegenwart von BUdR auf TK 143-Zellen ausplattiert.] Rekombinanten, die das Herpesvirus-TK-Gen exprimierten, wurden durch Plaque-Test auf TK&supmin;143-Zellen mit Top-Agar mit 1% niedrigerstarrender Agarose, der Eagle-Medium mit 8% fötalem Rinderserum, 100 uM Thymidin, 50 uM Adenosin, 50 uM Guanosin, 10 uM Glycin und 1 uM Methotrexat enthielt, selektioniert. Nach 48 bis 72 Stunden bei 37ºC in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO&sub2; wurden die Plaques durch Anfärben mit Neutralrot nachgewiesen.
Nichtselektive Methoden, die von der Identifizierung von Virus- Plaques abhängen, die das Fremdgen besitzen, wurden ebenfalls angewandt. Zusätzlich wurden derartige Methoden benutzt, um die Identität der Rekombinanten selbst nach der Isolation mittels selektiver Methoden zu bestätigen.
Die Methodik der DNA-DNA-Hybridisierung wurde benutzt, um Plaques zu identifizieren, die von rekombinantem Virus gebildet wurden. Ein Verfahren wurde als Dot-Blot-Hybridisierung bezeichnet. In diesem Verfahren ließ man Viren, die nach Transfektion infizierter Zellen mit chimären Plasmiden erhalten worden waren, auf Zell-Monolayern mit 1%-igem Top-Agar Plaques bilden. Nach 48 bis 72 Stunden wurden die Plaques durch Anfärben mit Neutralrot nachgewiesen. Aus Einzelplaques wurde mit einer sterilen Pasteurpipette Virus gepickt und zur Infektion von Zell-Monolayern in Mikrotiterplatten mit Vertiefungen von 16 mm Durchmesser benutzt. Nach 48 Stunden Inkubation bei 37ºC wurden die Zellen abgekratzt, durch dreimaliges Frieren und Tauen lysiert und durch Filtration mittels eines Vielfach- Mikroprobengeräts (Schleicher und Schüll, NH) auf Nitrozellulosefiltern gesammelt. Das Filter wurde mit 100 mM NaCl, 50 mM Tris- HCl (pH 7,5) gewaschen, dreimal hintereinander auf Whatman 3MM Papiere geblottet, die mit (1) 0,5 M NaOH, (2) 1 M Tris-HCl (pH 7,5), und (3) 2 · SSC (SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) gesättigt waren, bei 80ºC 2 Stunden lang gebacken und dann mit 5 · Denhardt-Lösung [Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 23:641- 646 (1966)], supplementiert mit 0,1 mg/ml denaturierter Lachsspermien-DNA in 4 · SSC bei 65ºC 4 Stunden lang inkubiert. Die Fremd- DNA, die mittels Nick-Translation mit ³²P markiert worden war, und Natriumdodecylsulfat (SDS; Endkonzentration 0,1%) wurden hinzugegeben und die Hybridisierung wurde 12 Stunden lang fortgeführt. Das Filter wurde zweimal 15 Minuten lang bei 65ºC mit 2 · SSC/0,1% SDS und dann mit 0,2 · SSC/0,1% SDS gewaschen. Eine Autoradiographie wurde angefertigt, indem das Filter auf einen Röntgen-Film gelegt wurde, und das Auftreten dunkler Flecken auf dem entwickelten Film identifizierte rekombinantes Virus. Eine weitere angewandte Methode der DNA-DNA-Hybridisierung wurde von Villarreal und Berg beschrieben [Science, 196:183-185 (1977)]. Bei dieser Methode wurde ein Replica der Virus-Plaques angefertigt, indem ein Nitrozellulosefilter direkt auf das Zell-Monolayer plaziert wurde. Die DNA-DNA- Hybridisierung erfolgte wie oben und nach Lokalisierung der Plaques, die rekombinantes Virus enthielten, wurde das restliche Virus aus dem Agar, mit dem die Plaques ursprünglich überschichtet waren, eluiert.
Weitere Methoden, die von der Expression des Fremdgens abhängig sind, wurden ebenfalls zur Identifizierung von Plaques benutzt. Plaques, die rekombinantes Virus enthielten, wurden dann durch Autoradiographie identifiziert. Wenn die Thymidinkinase von Herpesvirus exprimiert wurde, wurden die rekombinanten Plaques durch Einbau von [¹²&sup5;I]-Deoxycytidin (1 uCi/ml) in Gegenwart von 20 ug/ml Tetrahydrouridin 14 bis 48 Stunden nach der Infektion nachgewiesen.
V. Infektion empfindlicher Zellen oder Tiere mit Vacciniavirus- Rekombinanten.
Nach der Identifizierung von Vacciniavirus-Rekombinanten erfolgten hintereinander zwei oder mehr Plaquereinigungen, um reines rekombinantes Virus zu erhalten. Empfindliche Zellen wie BSC-1, HeLa, MRC-5 oder andere wurden infiziert, um große Präparationen von rekominantem Virus zu erhalten. Die Titer der Präparationen wurden mittels Verdünnungsreihen und Plaque-Test bestimmt.
Zur Expression des Fremdgens wurden Zellen mit 1 bis 30 pfu/Zelle von ungereinigtem oder gereinigtem Virus infiziert und die Inkubation erfolgte bei 37ºC bis zu 48 Stunden lang. Das Fremdgen-Produkt wurde abhängig von seiner Natur entweder im Zellkultur-Medium oder in den Zellen gefunden. Wenn es sich innerhalb der Zellen befand wurde es nach einer von vielen Methoden, einschließlich Beschallung, Frieren und Tauen, Homogenisierung oder Detergensbehandlung freigesetzt. Das Fremdprotein wurde mittels immunologischer, enzymatischer und elektrophoretischer Methoden nachgewiesen.
Zur Infektion von Tieren wurde rekombinantes Virus intradermal eingeführt, obwohl andere Wege ausreichend sein sollten. Die Bildung von Antikörpern gegen das Produkt des Fremdgens zeigte, daß das Protein produziert wurde und immunogen war.

Beispiele

Zur Erläuterung des Erfindungsgegenstandes wurden mehrere Vektoren hergestellt, die Vacciniavirus-Promotoren enthielten und zur Insertion fremder proteincodierender Sequenzen unter Bildung chimärer Gene benutzt werden können. Proteincodierende Sequenzen aus anderen DNA-Viren, RNA-Viren und Prokaryonten wurden in die Plasmide inseriert. Zellen, die mit Vacciniavirus infiziert waren, wurden dann mit den Vektoren, die die chimären Gene enthielten, transfiziert und das rekombinante Virus wurde mittels selektiver Methoden isoliert. In jedem Fall wurde die Expression der Fremdgene nachgewiesen. Viele der angewandten Standardverfahren werden im einzelnen bei MANIATIS et al., a.a.O., beschrieben.
Beispiel 1 Konstruktion der Plasmide pGS20 und pGS21, die den Promotor des Gens für das 7,5K Polypeptid (7,5K-Gen) von Vacciniavirus, Restriktionsstellen zur Insertion von Sequenzen, die ein Fremdprotein codieren, und ein unterbrochenes Thymidinkinase-Gen von Vacciniavirus als flankierende DNA enthalten.

(a) Isolierung von 7,5K Promotor-DNA

Ein DNA-Fragment von ungefähr 275 bp, das der RNA-Startstelle eines frühen Vacciniavirus-Gens, das für ein als 7,5K bekanntes Polypeptid codiert, vorangeht und diese umfaßt, wurde aus einem Plasmid pAG4 [Venkatesan et al., Cell, 125:805-813 (1981)] erhalten. 70 ug pAG4 wurden mit 100 Einheiten der Restriktionsendonukleasen HincII und RsaI (New England Biolabs) in 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgSO&sub4; und 1 mM Dithiothreitol (DTT) (im folgenden als Mediumsalz-Restriktionspuffer bezeichnet) 2 Stunden bei 37ºC vollständig verdaut. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden durch Elektrophorese (1 Stunde bei 200 Volt) durch ein 1,5%-iges Agarosegel mit 40 mM Tris-Acetat (Tris-Ac) (pH 8,0), 20 mM Natriumacetat (NaAc), 2 mM EDTA, 18 mM NaCl aufgetrennt. Das Gel wurde 10 Minuten lang in 1 ug/ml Ethidiumbromid (EtBr)-Lösung mit Agarosegelpuffer getränkt. Die DNA-Fragmente im Gel wurden unter langwelligem Ultraviolett-Licht sichtbar gemacht und ein Gelstreifen, der ein 275 bp-DNA-Fragment enthielt, wurde mit einer Rasierklinge ausgeschnitten. Die DNA aus diesem Gelstreifen wurde 45 Minuten lang bei 2,5 mA in 40 mM Tris-Ac (pH 7,2), 20 mM NaAc, 1 mM EDTA auf ein Blatt Diethylaminoethyl (DEAE)-Zellulose elektrogeblottet und aus der DEAE-Zellulose durch 30 min Schütteln in 1,2 M NaCl, 40 mM Tris- Ac (pH 7,2), 20 mM NaAc, 1 mM EDTA eluiert. Die DEAE-Zellulose wurde durch Zentrifugation (12.000 · g, 2 Min.) entfernt, und die DNA aus dem Überstand durch Zugabe von 2 Volumenteilen Ethanol gefällt und durch Zentrifugation (12.000 · g, 5 Min.) zurückerhalten.

(b) Insertion des Promotors des 7,5K-Gens in Plasmid pUC9

2 ug pUC9-DNA wurden mit 5 Einheiten Restriktionsendonuklease HincII in Mediumsalz-Restriktionspuffer 2 Stunden bei 37ºC verdaut. Die Mischung wurde 5 min auf 70ºC erhitzt und die DNA wurde mit einem gleichen Volumen Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und durch Ethanolfällung zurückerhalten. Die DNA wurde an ihren 5'- Enden durch 30 min Inkubation in 50 ul 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;&sub1; 1 mM Spermidin mit 0,1 Einheiten alkalische Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer Mannheim) bei 37ºC dephosphoryliert, um eine Selbstligation im nachfolgenden Schritt zu Verhindern. Die Mischung wurde zweimal mit gleichen Volumenteilen Phenol:Chloroform extrahiert und die DNA wurde durch Ethanolfällung zurückerhalten. 0,5 ug linearisierte, dephosphorylierte pUC9- DNA wurden mit 0,15 ug der zuvor isolierten Promotor-DNA von Vaccinia in 50 ul 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl&sub2;&sub1; 10 mM DTT, 0,5 mM ATP zusammen mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase bei 12ºC 15 Stunden ligiert. 25 ul der ligierten DNA-Mischung wurden zur Transformation von kompetentem E. Coli JM103 eingesetzt und 100 ul der transformierten Zellsuspension wurden mit 50 ul 2% X-Gal und 10 ul 0,1 M IPTG gemischt und auf einer L Broth-Platte mit 1,5% Bacto-Agar (Difco) und 50 ug/ml Ampicillin ausplattiert. Die Platte wurde 15 Stunden bei 37ºC inkubiert. Weiße Bakterienkolonien wurden gepickt und in 10 ml L Broth mit 50 ug/ml Ampicillin wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde nach folgendem Verfahren aus 1,5 ml der Bakterienkulturen gereinigt (im weiteren als Minipräparation von Plasmid-DNA bezeichnet). Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation pelletiert (12.000 · g, 1 min), in 0,1 ml 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, 2 mg/ml Lysozym (Lysis-Lösung) resuspendiert und bei 4ºC 30 min inkubiert. 0,2 ml 0,2 M NaOH, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden hinzugegeben und die Mischung wurde weitere 5 min auf Eis inkubiert. 0,15 ml 3 M NaAc (pH 4,8) wurden hin zugegeben und die Mischung wurde 1 Stunde auf Eis inkubiert, gefolgt von 5 min Zentrifugation bei 12.000 · g. Die Plasmid-DNA im Überstand wurde durch Zugabe von 1 ml Ethanol gefällt, durch Zentrifugation zurückgewonnen und erneut in 0,1 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA (TE-Puffer) gelöst. Die Präparationen der Plasmid-DNA wurden durch Verdau von jeweils 10% jeder Plasmidpräparation mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und EcoRI (5 Einheiten jedes Enzyms in Mediumsalz-Restriktionspuffer, 1 Stunde bei 37ºC) auf die Anwesenheit des Vacciniavirus-Promotors geprüft ("gescreent"). Die DNA-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und wie oben sichtbar gemacht. Plasmidpräparationen mit dem Vacciniavirus-Promotor wurden weiter analysiert, um die Orientierung des Vaccinia-Promotors bezüglich der Plasmidsequenzen zu bestimmen. Dies geschah durch Verdau mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und HindII oder HincII und EcoRI (5 Einheiten jedes Enzyms in Mediumsalz-Restriktionspuffer, 1 Stunde bei 37ºC), gefolgt von Agarosegelelektrophorese. Ein Plasmid mit dem Vaccinia-Promotor in Leserichtung auf die einzige BamHI-Restriktionsstelle des Plasmids wurde pGS15 genannt. Dieses Plasmid wurde in großen Mengen nach dem folgenden Verfahren, im weiteren als Präparation von Plasmid-DNA bezeichnet, gereinigt. Bakterien, die das gewünschte Plasmid besaßen, wurden in 400 ml Lösung von M9- Medium, das 50 ug/ml Ampicillin, 150 ug/ml Prolin, 150 ug/ml Leucin und 0,8 ug/ml Vitamin B1 enthielt, angeimpft und bis zu einer optischen Dichte von 0,8 bei 590 nm angezogen. Man gab Chloramphenicol zu einer Endkonzentration von 200 ug/ml hinzu und inkubierte die Kultur 12 Stunden bei 37ºC. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation pelletiert (5000 · g, 10 min), mit 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl gewaschen, in 10 ml Lysis-Lösung resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 20 ml 0,2 M NaOH, 0,1% SDS wurde weitere 5 min auf Eis inkubiert und anschließend gab man 15 ml 3 M NaAc (pH 4,8) hinzu und inkubierte eine weitere Stunde auf Eis. Die Mischung wurde zentrifugiert (10.000 · g, 10 min). Die Plasmid-DNA wurde durch Zugabe von zwei Volumenteilen Ethanol gefällt und durch 10 min Zentrifugation bei 10.000 · g zurückerhalten. Das DNA-Pellet wurde in 10 ml TE-Puffer wieder gelöst, die Lösung zweimal mit gleichen Volumenteilen Phenol:Chloroform extrahiert, die DNA durch Ethanolfällung und Zentrifugation zurückerhalten und erneut in 5 ml TE-Puffer gelöst. Man gab 0,1 mg/ml Ribonuklease (durch 10 min Kochen zur Inaktivierung von Deoxyribonukleasen vorbehandelt) hinzu und inkubierte 30 min bei 37ºC. Die DNA wurde dann durch Zugabe von NaAc (pH 7) auf 0,1 M und von 1,5 Volumenteilen Ethanol gefällt und durch Zentrifugation zurückerhalten. Restliche RNA wurde von der DNA entfernt, indem man das Pellet in 0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA löste und durch eine Sephacryl-S300-Säule filtrierte, die mit demselben Puffer äquilibriert war. Die DNA, die mit dem ersten Peak bei A260nm eluierte, wurde durch Ethanolfällung und Zentrifugation zurückerhalten. Die DNA wurde schließlich in TE-Puffer gelöst und bei 4ºC aufbewahrt.

(c) Umwandlung der HindIII-Stelle von pGS15 in eine EcoRI-Stelle

Um die Insertion des jetzt in pGS15 klonierten 7,5K-Gen-Promotors von Vaccinia in die einzige EcoRI-Stelle des Thymidinkinase-Gens von Vaccinia zu ermöglichen, war es erforderlich, die HindIII- Stelle in pGS15 in eine EcoRI-Stelle umzuwandeln. Dies führte dazu, daß der Vaccinia-Promotor und die angrenzenden Restriktionsschnittstellen durch EcoRI-Stellen flankiert wurden. 20 ug pGS15-DNA wurden mit 50 Einheiten der Restriktionsendonuklease HindIII 2 Stunden bei 37ºC in Mediumsalz-Restriktionspuffer gespalten. Nach Extraktion mit Phenol:Chloroform wurde die DNA durch Ethanolfällung und Zentrifugation zurückerhalten. Die DNA-Enden wurden durch Inkubation der DNA in 0,2 mM dATP, 0,2 mM dCTP, 0,2mM dGTP, 0,2 mM dTTP, 0,5 mM DTT, 5 mM MgCl&sub2;, 50 mM Tris-HCl (pH 7,8) mit 2 Einheiten des großen Fragments der DNA-Polymerase I (Boehringer Mannheim) für 45 min bei 37ºC auf stumpfe Enden aufgefüllt. Die DNA wurde nach Extraktion mit Phenol:Chloroform durch Ethanolfällung und Zentrifugation zurückerhalten. Synthetische EcoRI-Linker wurden an ihren 5'-Enden durch 30 min Inkubation mit 1 Einheit Polynukleotidkinase in 50 mM ATP, 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol bei 37ºC phosphoryliert. Die phosphorylierten EcoRI-Linker wurden dann mit linearisierter pGS15-DNA mit stumpfen Enden durch 15 Stunden Inkubation in 0,5 mM ATP, 66 mM Tris-HCl (pH 7,6), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT mit 1 Einheit T4 DNA-Ligase bei 4ºC ligiert. Die DNA wurde dann 4 Std mit 100 Einheiten EcoRI in Hochsalz-Restriktionspuffer [100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgSO&sub4;] verdaut und die Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt. Ein 290 bp-Fragment wurde durch Elektroblotten auf DEAE-Zellulose gereinigt und mit pUC9, das mit EcoRI geschnitten und mit Phosphatase behandelt worden war, ligiert. Transformationskompetente Zellen von E. Coli wurde mit dem ligierten Plasmid transformiert, Transformanten wurden selektioniert und hochgezogen, und das Plasmid wurde wie oben beschrieben amplifiziert und gereinigt. Dies Plasmid wurde pGS19 genannt.

(d) Insertion des Promotors des 7,5K-Gens in das Thimidinkinase- Gen von Vacciniavirus

Plasmid pGS8 (abgeleitet aus pBR328 durch Insertion des HindIII- J-Fragments von Vaccinia, das das TK-Gen von Vacciniavirus enthält, in die einzige HindIII-Stelle des Plasmids und Deletion der BamHI- und EcoRI-Schnittstellen in den Plasmidsequenzen) wurde hochgezogen und gereinigt. 5 ug pGS8 wurden mit EcoRI verdaut und nach Extraktion mit Phenol:Chloroform und Ethanolfällung zurückerhalten. Die Phosphatreste an den 5'-Enden wurden durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase entfernt und die DNA erneut nach Extraktion mit Phenol:Chloroform durch Ethanolfällung zurückerhalten. 0,5 ug pGS8-DNA wurden dann mit 0,1 ug des 290 bp-DNA-Fragments, das die von EcoRI-Schnittstellen flankierte Promotorsequenz von Vacciniavirus enthielt, ligiert. Dies Fragment war aus pGS19 durch Verdau mit EcoRI ausgeschnitten und durch Agarosegelelektrophorese und Elektroblotten gereinigt worden. Ligierte DNA wurde dann zur Transformation kompetenter Zellen des E. Coli-Stamms HB101 benutzt und die Bakterienklone wurden auf ein Plasmid, das die Promotorsequenz von Vaccinia inseriert hatte, geprüft. Zwei solche Plasmide wurden amplifiziert und gereinigt; beide enthielten die Promotorsequenz von Vaccinia, aber in entgegengesetzten Orientierungen bezüglich der Plasmidsequenzen. Die Klone wurden als pGS20 und pGS21 bezeichnet. Beide Vektoren besitzen BamHI- und SmaI-Restriktionsschnittstellen zur Insertion von Fremdgenen stromabwärts von dem translozierten 7,5K-Gen-Promotor von Vaccinia und sind von DNA- Sequenzen von Vaccinia flankiert, die für Segmente des Thymidinkinase-Gens codieren.
Beispiel 2 Konstruktion der Plasmide pMM3 und pMM4, die den Promotor des Thymidinkinase-Gens von Vacciniavirus, Restriktionsschnittstellen zur Insertion von Sequenzen, die ein Fremdprotein codieren, und flankierende DNA, die einen Teil des Thymidinkinase-Gens umfaßt, enthalten.

(a) Konstruktion von pMM1

Die kürzliche Kartierung und Sequenzierung des Thymidinkinase (TK)- Gens von Vacciniavirus (Weir, Bajszar und Moss, a.a.O.; Weir und Moss, a.a.O.) erlaubten die Entwicklung einer Strategie, um den TK- Promotor mit seiner Transkriptionsinitiationsstelle aber ohne seine Translationsstartstelle zu isolieren. Die Untersuchung der Sequenz zeigte ein GTC zwischen den Startstellen für die Transkription und die Translation. Wenn diese Sequenz mit GAC ligiert würde, würde eine Sequenz GACGTC geschaffen, die von mehreren Restriktionsenzymen erkannt wird. Dies wurde auf folgende Weise erreicht. 25 ug eines Plasmids, das sich von pUC9 durch Insertion des HindIII-J- Fragments von Vaccinia ableitete, wurden mit 50 Einheiten ClaI (Boehringer Mannheim) 2 Stunden bei 37ºC in 10 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM NaCl zu linearer DNA gespalten. Die Pufferzusammensetzung wurde auf 20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 100 mM NaCl, 12 mM CaCl&sub2;, 1 mM Na&sub2;EDTA geändert und die Lösung wurde bei 30ºC 10 min vorinkubiert. Zwei Einheiten Exonuklease Bal31 wurden hinzugegeben und Proben von 6 ug wurden 1, 2, 5 und 10 min nach Zugabe der Nuklease entnommen. 1 ug jeder Probe wurde mit 2 Einheiten HindIII (Bethesda Research Labs) in Mediumsalz-Restriktionspuffer bei 37ºC 2 Stunden lang verdaut und die resultierenden Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 1%-igem Agarosegel aufgetrennt. Für weitere Manipulationen wurde die Zeit des Exonukleaseverdaus mit Bal31 gewählt, die eine durchschnittliche Größe von 500 bp für das kleinste Fragment ergab. 5 ug der Probe, die 10 min mit Nuklease verdaut worden war, wurden mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA wurde mit 10 Einheiten HincII 2 Stunden bei 37ºC in Mediumsalz- Restriktionspuffer gespalten. Die Pufferzusammensetzung wurde auf 40 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 200 mM NaCl, 75 mM Tris-HCl (pH 8,8) und 10 mM MgCl&sub2; eingestellt, 1 Einheit E. Coli DNA-Polymerase I (großes Fragment) wurde hinzugegeben und die Reaktionsmischung 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die DNA-Moleküle in der Mischung mit dem Replikationsursprung und dem Gen für die Antibiotikaresistenz des Plasmids tragen an einem Ende, generiert durch die Spaltung mit HincII, alle GAC und am anderen Ende eine variable Sequenz. Von einigen Molekülen war jedoch zu erwarten, daß sie das GTC zwischen dem Transkriptionsstart und dem Translationsstart des TK-Gens am entgegengesetzten Terminus haben. Nach der Ligation wäre in diesen Molekülen eine neue SalI-Stelle (GACGTC) generiert. Die Molekülmischung wurde mit 2 Einheiten T4 DNA-Ligase (Boehringer Mannheim) bei Raumtemperatur über Nacht in 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM DTT, 10 mM MgCl&sub2;, 0,5 mM ATP ligiert. 1 ug der ligierten Mischung wurde zur Transformation kompetenter Zellen des E. Coli- Stamms JM103 eingesetzt, die auf L Broth-Platten mit 50 ug/ml Ampicillin ausplattiert und bei 37ºC über Nacht wachsen gelassen wurden. 144 Einzelkolonien wurden auf eine Master-Agarplatte mit Ampicillin transferiert. Die 144 Kolonien wurden in 12 Gruppen angeordnet und jede Gruppe wurde zur Inokulation von L Broth-Kulturen mit Ampicillin eingesetzt. Nach Wachstum über Nacht wurden Minipräparationen der Plasmide hergestellt und 2 ug der gereinigten DNAs wurden mit 2 Einheiten HindIII und 2 Einheiten SalI 2 Stunden bei 37ºC in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl gespalten. Eine DNA-Präparation enthielt ein Fragment mit einer Länge von ungefähr 500 bp, was der Größe eines durch HindIII und SalI erzeugten Fragments entspräche, wenn eine SalI-Stelle nach der Transkriptionsstartstelle der TK generiert worden wäre. Die 12 Kolonien, die zur Herstellung dieser DNA-Präparation benutzt wurden, wurden einzeln in L Broth-Kulturen wachsen gelassen und die Plasmid-DNA wurde gereinigt und mit HindIII und SalI gespalten. In einem der Plasmide wurde ein Fragment von ungefähr 500 bp durch Agarosegelelektrophorese nachgewiesen. Dieses Fragment wurde in die Phagen M13mp8 und M13mp9 umkloniert und die Nukleotidsequenz wurde für 100 Nukleotide sowohl von der HindIII- als auch von der SalI-Stelle aus nach der Dideoxy-Kettenabbruchsmethode von Sanger bestimmt, um nachzuweisen, daß es die gewünschten Sequenzen aufwies. Das Plasmid, das das HindIII - SalI-Fragment enthielt, wurde pMM1 genannt und aus einer 1 Liter-Kultur von transformiertem E. Coli gereinigt.

(b) Konstruktion von PMM2

5 ug eines pUC9-Derivats, das das HindIII-J-Fragment aus der Vacciniavirus-DNA enthielt, wurden mit 5 Einheiten XhoI 2 Stunden bei 37ºC in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2;&sub1; 150 mM NaCl (Hochsalz-Restriktionspuffer) gespalten. Die Pufferzusammensetzung wurde auf 40 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 250 mM NaCl, 75 mM Tris-HCl (pH 8,8) eingestellt. Eine Einheit E. Coli DNA-Polymerase I (großes Fragment) wurde hinzugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur zur Erzeugung stumpfer Enden 1 Stunde lang inkubiert. Synthetische EcoRI-Linker wurden wie zuvor beschrieben an ihren 5'-Enden durch Inkubation mit Polynukleotidkinase phosphoryliert. Die phosphorylierten Linker wurden wie zuvor beschrieben bei Raumtemperatur mit dem DNA-Fragment mit stumpfen Enden ligiert. 1 mg der Ligationsmischung wurde zur Transformation von E. Coli JM103 eingesetzt, ampicillinresistente Einzelkolonien wurden gepickt, und die Plasmide wurden auf eine neue EcoRI-Stelle an der Stelle geprüft, an der sich zuvor eine XhoI-Stelle befunden hatte. Das Plasmid mit einer neuen EcoRI-Stelle wurde pMM2 genannt.

(c) Konstruktion von pMM3

Durch Insertion des neu erzeugten EcoRI-Fragments, das einen Teil des TK-Gens von pMM2 enthält, in die EcoRI-Stelle von pMM1, wurde ein neues Plasmid erhalten, das eine Anzahl von Restriktionsstellen zur Insertion einer codierenden Fremdgensequenz besitzt. 50 ug pMM2 wurden mit 75 Einheiten EcoRI 2 Stunden bei 37ºC in Hochsalz-Restriktionspuffer gespalten und das 1 kb-EcoRI-fragment wurde durch Agarosegelelektrophorese und Elektroblotten auf DEAE-Papier gereinigt. 5 ug pMM1 wurden wie zuvor beschrieben mit 5 Einheiten EcoRI 2 Stunden bei 37ºC gespalten. 1,5 Einheiten alkalische Phosphatase aus Bakterien wurden dem Restriktionsverdau hinzugegeben und weitere 30 min inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. 0,25 ug des mit EcoRI gespaltenen und mit alkalischer Phosphatase behandelten pMM1 wurden zu 0,5 ug des isolierten EcoRI-Fragments aus pMM2 gegeben und die DNAs wurden über Nacht ligiert. Die ligierte Mischung wurde zur Transformation von E. Coli JM103 eingesetzt und die Plasmide wurden auf ein 1 kb-EcoRI-Fragment gescreent, das in pMM1 in derselben Orientierung inseriert war, wie es im Vaccinia- Genom vorliegt. Das resultierende Plasmid, pMM3 genannt, enthält einmalige HincII-, AccI-, SalI-, BamHI- und SmaI-Stellen zur Insertion von Fremdgenen neben dem Thymidinkinase-Promotor.

(d) Konstruktion von pMM4

Um eine EcoRI-Stelle zur Verfügung zu haben, in die Fremdgene unter der Kontrolle des TK-Promotors inseriert werden können, war es zunächst erforderlich, die zweite, zum TK-Promotor distale EcoRI- Stelle, zu entfernen. Dies wurde auf folgende Weise erreicht. 100 ug pMM2 wurden mit 20 Einheiten EcoRI 15 min bei 37ºC in Hochsalz- Restriktionspuffer partiell gespalten und das durch Spaltung an nur einer EcoRI-Stelle gebildete lineare DNA-Molekül wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und auf DEAE-Papier elektrogeblottet. 250 ng des linearen DNA-Moleküls wurden mit 0,5 Einheiten E. Coli DNA-Polymerase I (großes Fragment) bei 15ºC 1 Stunde in 40 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 250 mM NaCl, 75 mM Tris-HCl (pH 8,8) inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Nach der Ligation wurde E. Coli JM103 mit dem Plasmid transformiert. Die resultierenden transformierten E.Coli-Zellen wurden auf ein Plasmid gescreent, in dem die EcoRI-Stelle, die am weitesten vom Promotor entfernt lag, deletiert war. Das Plasmid, pMM4 genannt, enthält einmalige HincII-, AccI-, SalI-, BamHI-, SmaI- und EcoRI-Stellen zur Insertion von Fremdgenen.
Beispiel 3 Bildung von Vacciniavirus-Rekombinanten, die das prokaryontische Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen exprimieren.

(a) Insertion des CAT-Gens in pGS21

Ein DNA-Fragment mit einer Länge von 770 bp, das das CAT-Gen enthielt, wurde aus pBR328 durch Spaltung von pBR328-DNA mit der Restriktionsendonuklease TaqI, gefolgt von Agarosegelelektrophorese, Elektroblotten auf DEAE-Zellulose und Rückgewinnung der DNA durch Ethanolfällung und Zentrifugation, isoliert. Dies 770 bp- DNA-Fragment wurde wie folgt in Plasmid pUC7 inseriert. pUC7-DNA wurde mit dem Restriktionsenzym AccI gespalten, die 5'-Enden wurden mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm entfernt und die DNA wurde nach Extraktion mit Phenol:Chloroform und Ethanolfällung zurückerhalten. 0,5 ug linearisierte dephosphorylierte Plasmid- DNA wurden mit 0,2 ug des 770 bp-Fragments unter den oben beschriebenen Standardbedingungen ligiert. Mit der ligierten DNA wurde dann der E. Coli-Stamm JM103 transformiert und weiße Bakterienkolonien, die auf 1,5%-igen Bacto-Agar-Platten mit L Broth, 50 ug/ml Ampicillin, X-Gal und IPTG wuchsen, wurden gepickt und in L Broth hochgezogen. Minipräparationen der Plasmid-DNA wurden auf das Vorliegen des 770 bp-DNA-Fragments, das das CAT-Gen enthält, durch Verdau mit BamHI und Agarosegelelektrophorese geprüft. Ein derartiges Plasmid wurde nach den oben beschriebenen Standardmethoden hochgezogen, amplifiziert und gereinigt und pGS29 genannt.
Plasmid pUC7 enthält zwei BamHI-Stellen, die die AccI-Stellen eng flankieren. Folglich konnte das CAT-Gen nach Insertion in die AccI- Stelle nunmehr als ein 780 bp-Fragment mit BamHI ausgeschnitten werden. Nach Verdau von pGS29 mit BamHI wurde das 780 bp-Fragment durch Agarosegelelektrophorese isoliert, auf DEAE-Zellulose elektrogeblottet, eluiert und durch Ethanolfällung zurückgewonnen.
Der nächste Schritt war die Insertion dieses BamHI-Fragments in den Plasmid-Vektor pGS21. pGS21-DNA wurde durch Spaltung mit BamHI linearisiert, die Phosphatreste an den 5'-Enden wurden durch Verdau mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm entfernt und die DNA wurde durch Extraktion mit Phenol:Chloroform und Ethanolfällung zurückgewonnen. 0,5 ug linearisierte dephosphorylierte pGS21-DNA wurden mit 0,1 ug des 780 bp-DNA-Fragments unter Standardbedingungen ligiert und die ligierte DNA wurde dann zur Transformation kompetenter Zellen des E. Coli-Stamms HB101 eingesetzt. Transformierte Zellen wurden auf einer L Broth-Platte mit 1,5% Bacto-Agar und 50 ug/ml Ampicillin ausplattiert. Nach 15 Stunden Inkubation bei 37ºC wurden Bakterienkolonien gepickt, in L Broth mit 50 ug/ml Ampicillin hochgezogen und Plasmid-DNA wurde nach dem Verfahren für die Minipräparationen gereinigt. Die Plasmid-DNA wurde durch Verdau mit BamHI und EcoRI und anschließende Agarosegelelektrophorese auf das Vorliegen des 780 bp-BamHI-Fragments, das das CAT-Gen enthält, in der korrekten Orientierung bezüglich des Vaccinia-Promotors geprüft. Ein solcher Klon wurde pGS24 genannt und nach den oben beschriebenen Standardmethoden hochgezogen, amplifiziert und gereinigt.

(b) Insertion des chimären CAT-Gens in Vaccinia-Virus

Ein 25 cm² Monolayer von TK&supmin;143-Zellen wurde mit 0,01 pfu/Zelle Wildtyp-Vacciniavirus infiziert. Eine Mischung aus 1 ug pGS24, 1 ug Vacciniavirus-DNA und 20 ug Kalbsthymus-DNA wurden mit 125 mM CaCl&sub2; gefällt. Die feine Suspension wurde 2 Stunden nach der Infektion zur Transfektion der Zellen eingesetzt. Nach 30 min bei 25ºC wurden 7,2 ml Eagle-Medium mit 8% fötalem Rinderserum hinzugegeben und der Monolayer wurde 3,5 Stunden bei 37ºC inkubiert. Das Kulturmedium wurde entfernt und durch 8 ml frisches Eagle-Medium mit 8% fötalem Rinderserum ersetzt und die Inkubation wurde zwei Tage bei 37ºC fortgesetzt. Die Zellen wurden aus den Flaschen gekratzt, durch Zentrifugation pelletiert (2.000 · g, 5 min) und in 0,5 ml Eagle- Medium mit 2,5% fötalem Rinderserum resuspendiert.

(c) Selektion von rekombinantem Vacciniavirus mit dem chimären CAT-Gen

Thymidinkinase negative Vacciniavirus-Rekombinanten wurden durch Plaque-Test in TK&supmin;143-Zellen mit Top-Agar mit 1% niedrigerstarrender Agarose und 25 ug/ml BUdR selektioniert. Nach drei Tagen bei 37ºC wurden die Zell-Monolayer mit 0,005% Neutralrot angefärbt, mit einer sterilen Pasteurpipette wurden Plaques gepickt und in 0,5 ml Eagle-Medium mit 2,5% fötalem Rinderserum gegeben. Nach dreimaligem Frieren und Tauen und Beschallung wurden 0,25 ml eines jeden Plaques zur Infektion von Monolayern von TK&supmin;143-Zellen mit einem Durchmesser von 16 mm eingesetzt. Zwei Stunden nach der Infektion wurde das Kulturmedium entfernt und die Monolayer wurden mit 1 ml Eagle-Medium mit 2,5% fötalem Rinderserum und 25 ug/ml BUdR überschichtet. Nach zweitägiger Inkubation bei 37ºC wurden die Zell- Monolayer aus den Vertiefungen gekratzt, durch Zentrifugation pelletiert, in 0,5 ml 0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) resuspendiert, dreimal gefroren und getaut, und 0,1 ml wurden mittels eines Vielfachproben-Mikrofiltrationsgeräts (Schleicher und Schüll) auf Nitrozellulose transferiert. Nach Verfahren zum Denaturieren, Neutralisieren und Fixieren der DNA auf der Nitrozellulose wurde das Filter mit der mit ³²P-markierten CAT-Gen-DNA hybridisiert. Nach Waschen des Filters wurde eine Autoradiographie erhalten. Virus-Rekombinanten, die ein positives Hybridisierungssignal mit ³²P-CAT-DNA zeigen, wurden weiter unter BUdR-Selektion in TK&supmin;143- Zellen über Plaques gereinigt und das Screening-Verfahren auf CAT- DNA wurde wiederholt. Ein auf dieser Stufe für CAT-DNA positiver Klon wurde dann einmal in TK&supmin;-Zellen unter BUdR-Selektion und einmal in CV-1-Zellen ohne Selektion amplifiziert und der Virustiter wurde durch Plaque-Test in CV-1-Zellen bestimmt. Dies Virus wurde vCAT24 genannt.

(d) Analyse der Expression des chimären CAT-Gens

CV-1-Zellen wurden mit 10 pfu/Zelle VCAT24 infiziert. Nach 24 Stunden bei 37ºC wurden die Zellen abgekratzt, pelletiert, in 0,2 ml 0,25 M Tris-HCl (pH 7,8) resuspendiert und beschallt. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt (12.000 · g, 5 min) und der Überstand wurde im wesentlichen wie bei Gorman et al., Mol. Cell Biol. 2:1044-1051 (1982) beschrieben auf Chloramphenicol-Acetyltransferase-Aktivität getestet. Extrakte von Zellen, die mit vCAT24 infiziert waren, besaßen eine Enzymaktivität, die Chloramphenicol acetylierte, wie durch Dünnschichtchromatographie nachgewiesen wurde. Extrakte sowohl aus uninfizierten Zellen als auch aus Zellen, die mit Wildtyp-Vacciniavirus infiziert waren, besaßen keine nachweisbare Chloramphenicol-Acetyltransferase-Aktivität.
Beispiel 4 Konstruktion von Vacciniavirus, das chimäres Herpes- Thymidinkinase (HTK) -Gen exprimiert.
50 ug eines Plasmids, das ein BamHI-Fragment mit dem HTK-Gen enthält [Enquist et al., Gene 7:335-342 (1979)] wurden mit 50 Einheiten HincII und 50 Einheiten PvuII 2 Stunden bei 37ºC in Mediumsalz-Restriktionspuffer gespalten. Ein 1,8 kb-HincII-PvuII-Fragment ohne die Transkriptionsstartstelle von HTK aber mit dessen gesamter codierender Sequenz wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und auf DEAE-Papier elektrogeblottet. 5 ug pUC7 wurden mit 5 Einheiten HincII 2 Stunden bei 37ºC in Mediumsalz-Restriktionspuffer gespalten. Man gab 1,5 Einheiten alkalische Phosphatase aus Kälberdarm zu und inkubierte die Reaktionsmischung weitere 30 min, wonach sie mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt wurde. 250 ng dieser DNA wurden mit 500 ng des isolierten HincII-PVuII-HTK-Fragments ligiert und Zellen von E. Coli JM103 wurden mit der Ligationsmischung transformiert. Aus den transformierten Zellen wurden Plasmide isoliert und auf das in pUC7 inserierte HincII-PvuII-Fragment geprüft. Dies Plasmid wurde pVH4 genannt. 50 ug pVH4 wurden mit EcoRI gespalten und das EcoRI-Fragment mit dem HTK-Gen wurde durch Agarosegelelektrophorese isoliert und auf DEAE-Papier elektrogeblottet. 5 ug pMM4 wurden mit EcoRI gespalten; man gab 1,5 Einheiten alkalische Phosphatase aus Kälberdarm zu und inkubierte die Reaktionsmischung weitere 30 min. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. 250 ng dieses gespaltenen Plasmids wurden mit 500 ng des EcoRI-Fragments mit den für HTK codierenden Sequenzen ligiert, und E. Coli JM103 wurde mit dieser Ligationsmischung transformiert. Ampicillinresistente Einzelkolonien wurden auf ein Plasmid mit den für HTK codierenden Sequenzen in der EcoRI-Stelle von pMM4 gescreent. Dieses rekombinante Plasmid wurde pMM20 genannt und kombiniert die Regulationssequenz für die Transkription des TK-Gens Von Vacciniavirus mit der durchgehenden, für Herpes-TK codierenden Sequenz und die distale Hälfte des TK-Gens von Vacciniavirus. Dies chimäre Gen ist durch Vaccinia- Sequenzen flankiert, so daß eine homologe Rekombination dort erfolgen kann, wo sich das TK-Gen von Wildtyp-Vacciniavirus befindet.
Humane TK&supmin;143-Zellen wurden mit 0,01 pfu/Zelle einer TK&supmin;-Mutante von Vacciniavirus (TK&supmin;13; Bajszar et al., J. Virol., a.a.O.) infiziert. Die Schadstelle in der TK kartiert zwischen der Transkriptionsstartstelle für Vaccinia-TK und der EcoRI-Stelle im TK-Gen von Vaccinia, und folglich konnte diese Läsion durch Rekombination mit pMM20 nicht zur Wildtyp-TK von Vaccinia restauriert werden. 1 ug der mit Calciumphosphat präzipitierten pMM20-DNA wurde durch Transfektion in TK&supmin;143-Zellen eingebracht, die mit Vacciniavirus TK&supmin;13 infiziert waren. Die zuvor für die Selektion von TK&spplus;-Virus beschriebenen Selektionsverfahren wurden eingesetzt. Isolierte TK&spplus;- Einzelplaques wurden wiederum über Plaques gereinigt und auf die Synthese von Herpesvirus-TK getestet. Da [¹²&sup5;I]dC ein spezifisches Substrat für Herpesvirus-TK aber nicht für Vacciniavirus-TK oder zelluläre TK ist, wird [I¹²&sup5;]dC nur in virale DNA eingebaut, wenn die Herpesvirus-TK exprimiert wird. Autoradiographie von Zell- Monolayern, die mit den mutmaßlichen rekombinanten Viren infiziert waren, zeigten in Gegenwart von [¹²&sup5;I]dC dunkle Flecken auf dem Film, die viralen Plaques entsprachen, was zeigte, daß das TK&spplus;- Virus Herpesvirus-TK exprimierte. Daß die Herpes-TK in das Virusgenom integriert war, wurde durch DNA-DNA-Hybridisierung von ³²P- markierter HTK-DNA mit Blots von aufgetrennten Restriktionsverdaus Von gereinigter rekombinanter Virus-DNA nachgewiesen. Eine weitere Bestätigung, daß Herpesvirus-TK exprimiert wurde, wurde durch Plaquebildung eines rekombinanten Virusstamms in Gegenwart oder Abwesenheit von 40 ug/ml Bromdeoxycytidin (BCdR) erhalten. Plaques von Wildtyp-Vacciniavirus waren in der Größe leicht vermindert, die Zahl der Plaques blieb jedoch konstant, wenn das Medium mit 40 ug/ml BCdR supplementiert war. Der Titer des rekombinanten Virus war jedoch in Gegenwart von 40 ug/ml BCdR 10 bis 100-fach geringer, wie im Fall der Synthese der Herpesvirus-TK zu erwarten war.
Beispiel 5 Konstruktion von Vacciniavirus-Rekombinanten, die chimäres N-Gen von Vesicular Stomatitis-Virus (VSV) exprimieren.
50 ug pJS223 [ein Plasmid, das eine cDNA-Kopie des VSV-N-Gens enthält, Spraque et al., J. Virol. 45:773 (1983)] wurden mit 50 Einheiten XhoI 2 Stunden bei 37ºC in Hochsalz-Restriktionspuffer gespalten. Das kleinere Fragment, das die DNA des N-Gens enthält, wurde durch Agarosegelelektrophorese und Eloktroblotten auf DEAE- Papier isoliert. 5 ug pMM3 wurden mit 5 Einheiten SalI 2 Stunden bei 37ºC gespalten. 1,5 Einheiten alkalische Phosphatase aus Kälberdarm wurden für weitere 30 min hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde mit Phenol extrahiert, mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. 250 ng dieser DNA wurden mit 500 ng des isolierten XhoI-Fragments ligiert und E. Coli JM103 wurde mit der Ligationsmischung transformiert. Ampicillinresistente Einzelkolonien wurden auf die in pMM3 klonierte VSV-cDNA gescreent. Das chimäre Plasmid, das den Vaccinia-Promotor angrenzend an die VSV- cDNA enthält, wurde pMM17 genannt. Zellen wurden mit Wildtyp- Vacciniavirus infiziert und mit diesem Plasmid transfiziert. Nach 48 Stunden wurden die Zellen aufgebrochen und TK&supmin;-Virus wurde durch Plaquebildung mit BUdR im Top-Agar selektioniert. Die Expression des chimären VSV-N-Gens wurde durch Standardverfahren für die Immunpräzipitation gezeigt. 20 pfu/Zelle rekombinantes Virus wurden zur Infektion von Zellen eingesetzt und dem Medium wurde [³&sup5;S]- Methionin zugegeben. 6 Stunden nach der Infektion wurde aus den infizierten Zellen ein cytoplasmatischer Extrakt hergestellt. Anti- VSV-Antiserum von Kaninchen und Staph-A Protein wurden zur Präzipitation von VSV-Proteinen verwendet. Nach Dissoziation des Staph- A-Proteinkomplexes wurden die Proteine auf einem 10% Acryl-amidgel parallel mit authentischen markierten VSV-Proteinen analysiert. Nach Fluorographie wurde ein Protein beobachtet, das aus den mit rekombinantem Virus infizierten Zellen immunpräzipitierte und mit authentischem VSV N-Protein comigrierte. Dies Ergebnis zeigte, daß die Vacciniavirus-Rekombinante das chimäre VSV-N-Gen exprimierte.
Beispiel 6 Konstruktion von Vacciniavirus, das ein chimäres Gen für das Hepatitis B-Virus Oberflächenantigen (HBsAG) exprimiert.

(a) Insertion des HBsAG-Gens in pGS20, pGS21 und pMM3

Ein 1.350 bp-DNA-Fragment mit dem HBsAG-Gen wurde aus einem Plasmid erhalten [Moriarity et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2606- 2670 (1981)]. Die Daten für die Nukleotidsequenz legten nahe, daß das erste ATG-Codon nach einer der BamHI-Restriktionsstellen das Start-Methionin von HBsAG darstellt. Das Fragment, das das HBsAG- Gen enthält, wurde aus 50 ug dieses Plasmids durch 2 Stunden Verdau bei 37ºC mit 100 Einheiten BamHI in 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgSO&sub4;, 10 mM Dithiothreitol (DTT) (im folgenden Mediumsalz-Restriktionspuffer genannt) isoliert. Die DNA-Fragmente wurden durch einstündige Elektrophorese bei 200 Volt durch ein 1%-iges Agarosegel mit 40 mM Tris-Acetat (Ac) (pH 8,0), 20 mM NaAc, 2 mM EDTA, 18 mM NaCl aufgetrennt. Das Gel wurde in 1 ug/ml Ethidiumbromid (EtBr) getränkt und die DNA-Fragmente wurden durch Bestrahlung mit langwelligem Ultraviolettlicht sichtbar gemacht. Ein Gelstreifen mit einem DNA-Fragment einer Länge von 1,35 Kilobasenpaaren (kb) wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten und die DNA in diesem Streifen wurde durch einstündiges Elektroblotten bei 2,5 mA in 40 mM Tris-Ac (pH 7,2), 20 mM NaAc, 1 mM EDTA auf Diethylaminoethyl (DEAE)-Zellulose transferiert. Die DNA wurde aus dem DEAE- Zellulose-Papier durch 30 min Schütteln bei 25ºC in 1,2 M NaCl, 40 mM Tris-Ac (pH 7,2), 20 mM NaAc, 1 mM EDTA eluiert und aus dem Überstand durch Zugabe von 2 Volumenteilen Ethanol und anschließende Zentrifugation bei 12.000 · g für 5 min zurückgewonnen.
Die Plasmide pGS20, pGS21 und pMM3 wurden durch 2 Stunden Verdau mit 2 Einheiten BamHI/ug DNA in Mediumsalz-Restriktionspuffer bei 37ºC linearisiert. Die linearisierten Plasmide wurden dann an ihren 5'-Enden durch 30 min Inkubation bei 37ºC mit 0,1 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm in 50 mM Tris-HCl (pH 9,0), 1 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2;, 1 mM Sperinidin dephosphoryliert. Nach zwei Extraktionen mit gleichen Volumenteilen Phenol:Chloroform (1:1) wurde die DNA durch Ethanolfällung und Zentrifugation zurückerhalten. 0,5 ug jedes linearisierten, dephosphorylierten Plasmids wurden mit 0,2 ug des 1,35 kb-BamHI-Fragments mit dem HBsAG-Gen in 66 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 0,5 mM ATP 15 Stunden bei 12ºC ligiert. Mit der ligierten DNA wurden kompetente Zellen des E. Coli-Stamms HB101 transformiert, und die transformierten Zellen wurden 15 Stunden bei 37ºC auf L Broth-Platten mit 1,5% Bacto-Agar und 50 ug/ml Ampicillin wachsen gelassen. Bakterienkolonien wurden gepickt und in 10 ml L Broth mit 50 ug/ml Ampicillin 15 Stunden bei 37ºC wachsen gelassen. Plasmid-DNA wurde aus 1,5 ml Bakterienkultur durch das folgende Verfahren der Minipräparation von Plasmid-DNA präpariert. Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation (12.000 · g, 1 min) pelletiert, in 0,1 ml Lysis-Lösung [25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, 2 ug/ml Lysozym] resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. 0,2 ml 0,2 M NaOH, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden hinzugegeben und die Mischung wurde 5 min auf Eis inkubiert. Es wurden 0,15 ml 3 M NaAc (pH 4,8) hinzugegeben und nach einer weiteren einstündigen Inkubation auf Eis wurde die Mischung 5 min bei 12.000 · g zentrifugiert. Die Plasmid-DNA wurde aus dem Überstand durch Zugabe von 1 ml Ethanol gefällt, durch Zentrifugation (12.000 · g, 5 min) zurückerhalten und schließlich in 0,1 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (TE-Puffer) wieder gelöst.
Die Plasmid-DNAs wurden durch 1 Stunde Verdau Von je 10% der Plasmid-DNA-Proben mit 5 Einheiten Restriktionsendonuklease BamHI bei 37ºC in Mediumsalz-Restriktionspuffer und anschließende Agarosegelelektrophorese und Färbung mit EtBr auf das Vorliegen des 1,35 kb-BamHI-Fragments mit dem HBsAG-Gen geprüft.
Da das 1,35 kb-BamHI-DNA-Fragment Von Hepatitis B-Virus in jedem der Plasmide in jeder der beiden Orientierungen inseriert sein konnte, war ein zusätzliches Screenen erforderlich. Plasmidderivate von pGS20 und pGS21 wurden mit der Restriktionsendonuklease XbaI in 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgSO&sub4; (Hochsalz-Restriktionspuffer) 1 Stunde bei 37ºC verdaut und durch Agarosegel elektrophorese analysiert. Die Identifizierung von XbaI-Fragmenten Von ungefähr 830 bp oder 1.730 bp unterschied zwischen Derivaten von pGS20, die das HBsAG-Gen in falscher bzw. korrekter Orientierung enthielten. XbaI-Fragmente von 2.150 bp oder 1.150 bp unterschieden zwischen Derivaten von pGS21, die das HBsAG-Gen in inkorrekter bzw. korrekter Orientierung enthielten. Plasmide, die Von pMM3 abstammten, wurden durch Verdau mit HincII in Mediumsalz- Restriktionspuffer und anschließende Agarosegelelektrophorese überprüft. Die Anwesenheit des HBsAG-Gens in korrekter Orientierung wurde durch das Auftreten von Fragmenten von ungefähr 5.400 bp und 200 bp angezeigt, wogegen Fragmente von 4.400 bp und 1.200 bp resultierten, wenn HBsAG in falscher Orientierung vorlag. Die Plasmide wurden dann wie folgt hochgezogen, amplifiziert und gereinigt. Transformierte Bakterien wurden in 400 ml-Kulturen von M9- Medium mit 150 ug/ml Leucin, 150 ug/ml Prolin, 0,8 ug/ml Vitamin B&sub1;, 50 ug/ml Ampicillin angeimpft und bei 37ºC wachsen gelassen, bis die Kultur eine optische Dichte von 0,8 bei 590 nm erreicht hatte. Dann wurde Chloramphenicol zu einer Konzentration von 200 ug/ml hinzugegeben und die Kultur wurde 12 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugation pelletiert (5.000 · g, 10 min), einmal in 0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen und dann in 10 ml Lysis-Lösung (s. oben) resuspendiert. Nach 30 min Inkubation auf Eis wurden 20 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS hinzugegeben und die Inkubation 5 min fortgesetzt. Dann wurden 15 ml 3 M NaAc (pH 4,8) hinzugegeben, und nach einer weiteren Stunde Inkubation auf Eis wurde die Mischung 10 min bei 10.000 · g zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut 10 min bei 10.000 · g zentrifugiert und die Plasmid-DNA wurde aus dem letzten Überstand durch Zugabe von zwei Volumenteilen Ethanol gefällt. Nach 5 min Zentrifugation bei 10.000 · g wurde das Pellet in 10 ml TE-Puffer wieder aufgenommen und die Lösung wurde zweimal mit gleichen Volumenteilen Phenol:Chloroform extrahiert. Die DNA wurde durch Ethanolfällung und Zentrifugation zurückerhalten und erneut in 5 ml TE-Puffer aufgenommen. 0,1 mg/ml Ribonuklease (die zur Inaktivierung kontaminierender Deoxyribonukleasen auf 100ºC erhitzt worden war) wurden hinzugegeben und die Mischung wurde 30 min bei 37ºC inkubiert. Die DNA wurde dann durch Zugabe von NaAc (pH 7) auf eine Konzentration von 0,1 M und von 1,5 Volumenteilen Ethanol gefällt und durch 5 min Zentrifugation bei 5.000 · g zurückgewonnen. Die restliche RNA wurde von der DNA entfernt, indem man das Pellet in 0,3 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA löste und durch eine Sephacryl-S300-Säule gab, die mit demselben Puffer äquilibriert war. DNA, die mit dem ersten Peak eluierte, wurde durch Ethanolfällung und Zentrifugation zurückgewonnen, in 1,0 ml TE- Puffer gelöst und bei 4ºC aufbewahrt. Plasmide, die von pGS21 abstammen und das HBsAG-Gen in falscher bzw. korrekter Orientierung bezüglich des translozierten Promotors tragen, wurden pHBs1 bzw. pHBs2 genannt. Plasmide die von pGS20 abstammen und das HBsAG-Gen in falscher bzw. korrekter Orientierung tragen, wurden pHBs3 bzw. pHBs4 genannt. Das Plasmid, das von pMM3 abstammt und das HBsAG- Gen in korrekter Orientierung bezüglich des TK-Promotors trägt, wurde pHBs5 genannt.

(b) Bildung von Vacciniavirus-Rekombinanten mit einem chimären HBsAG-Gen

Plasmide mit einem chimären HBsAG-Gen, das durch Segmente des TK- Gens von Vacciniavirus flankiert wird, wurden zur Transfektion von Zellen eingesetzt, die mit Thymidinkinase positivem (TK&spplus;) Wildtyp- Vacciniavirus infiziert waren. Konfluente Monolayer von CV-1 oder MRC-5-Zellen (25 cm²) wurden mit 0,01 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Zelle Vacciniavirus infiziert. 1 ug Plasmid, 1 ug Vacciniavirus-DNA und 20 ug Kalbsthymus-DNA wurden in 1 ml 0,1% Dextrose, 0,14 M NaCl, 5 mM KCl, 1 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 20 mM Hepes gemischt und durch Zugabe von CaCl&sub2; zu einer Endkonzentration von 0,125 M gefällt. Die Mischung wurde 45 min vorsichtig bei 25ºC umgeschwenkt und 2 Stunden nach der Infektion wurden 0,8 ml der feinen Suspension zu einem Monolayer gegeben, von dem das Medium entfernt worden war. Nach 30 min bei 25ºC wurden 7,2 ml Eagle-Medium mit 8% fötalem Rinderserum (FBS) hinzugegeben und die Inkubation wurde bei 37ºC weitere 3,5 Stunden fortgesetzt. 6 Stunden nach der Infektion wurde das Medium durch frisches Medium mit 8% FBS ersetzt und die Inkubation wurde zwei Tage lang fortgesetzt. Die Zellen wurden dann von der Flasche abgekratzt, pelletiert, in 0,5 ml Gewebekultur-Medium resuspendiert und zum Aufbrechen der Zellen und Freisetzen des Virus homogenisiert.
Nur ein kleiner Prozentsatz der in den transfizierten Zellen produzierten Viren war rekombinant. Diese Rekombinanten wurden durch selektive und nichtselektive Verfahren isoliert. Die Selektion war möglich, da die für das HBsAG codierenden Sequenzen in das TK-Gen inseriert waren und dessen Funktion zerstörten. Wegen des Thymidinkinase negativen (TK&supmin;) Phänotyps war das rekombinante Virus in der Lage, in Gegenwart von 5-Bromdeoxyuridin (BUdR) Plaques zu bilden, wogegen das ursprüngliche TK&spplus;-Virus dies nicht konnte. Die nichtselektiven Verfahren wurden wie bei Villarreal und Berg [Science 196:183-185 (1977)] beschrieben durchgeführt.
Monolayer von TK&supmin;143-Zellen wurden mit Virus aus transfizierten Zellen inokuliert und zwei Stunden später mit Medium, das 1% niedrigerstarrende Agarose, 25 ug/ml BUdR und 2,5% FBS enthielt, überschichtet. Nach 3 Tagen bei 37ºC in feuchter, 5%-iger CO&sub2;-Atmosphäre wurden die Zellen mit 0,005% Neutralrot angefärbt. Durch Dot- Blot-Hybridisierung wurde nachgewiesen, daß mehr als 50% der auf diese Weise sichtbar gemachten Plaques Rekombinanten mit der DNA von Hepatitis B-Virus enthielten. Für letztgenanntes Verfahren wurden einzelne Virus-Plaques mit einer sterilen Pasteurpipette gepickt und zur Infektion von Monolayern von TK 143-Zellen in Mikrotiterplatten mit Vertiefungen von 16 mm Durchmesser eingesetzt. Nach 48 Stunden Inkubation bei 37ºC in Medium mit BUdR wurden die Zellen abgekratzt, durch dreimaliges Frieren und Tauen lysiert und mittels Filtration durch ein Vielfach-Mikroprobengerät (Schleicher und Schüll, NH) auf Nitrozellulosefolien gesammelt. Das Filter wurde mit 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) gewaschen, dreimal hintereinander auf Whatman 3MM Filterpapier geblottet, die mit (1) 0,5 M NaOH, (2) 1 M Tris-HCl (pH 7,5), und (3) 2 · SSC (SSC ist 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) gesättigt waren, bei 80ºC 2 Stunden lang gebacken und dann mit 5 · Denhardt-Lösung [Denhardt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 23:641-646 (1966)], supplementiert mit 0,1 mg/ml denaturierter, gescherter Lachsspermien- DNA in 4 · SSC 4 Stunden bei 65ºC inkubiert. DNA von Hepatitis B- Virus, die mittels Nicktranslation mit ³²P markiert war [Rigby et al., J. mol. Biol. 113:237 (1975)] und Natriumdodecylsulfat (SDS; Endkonzentration 0,1%) wurden hinzugegeben und die Hybridisierung wurde 15 Stunden bei 65ºC fortgesetzt. Das Filter wurde zweimal 15 Minuten bei 65ºC mit 2 · SSC/0,1% SDS und dann mit 0,2 · SSC/0,1% SDS gewaschen. Zur Anfertigung einer Autoradiographie wurde das Filter auf einen Röntgen-Film gelegt, und das Auftreten dunkler Flecken auf dem entwickelten Film identifizierte rekombinantes Virus, das das HBsAG-Gen enthielt. Rekombinantes Virus wurde ein zweites Mal über Plaques auf TK&supmin;143-Zellen mit Top-Agar mit 25 ug/ml BUdR gereinigt und dann wurden die rekombinanten Virusstämme präpariert. Die rekombinanten Virusstämme wurden entsprechend den Namen der Plasmide, von denen sie abstammten, vHBs1, vHBs2, vHBs3, vHBs4 und vHBs5 gebannt.

(c) Expression von HBsAG in mit Vacciniavirus-Rekombinanten infizierten Zellen

Der Nachweis für die HBsAG-Expression in Zellen, die mit Vacciniavirus-Rekombinanten infiziert waren, erfolgte mittels eines Standard-Radioimmunassays (ASURIA, Abbot Laboratories). Monolayer von CV-1-Zellen wurden, wie in Tabelle 1 angegeben, mit 10 plaquebildenden Einheiten (pfu) pro Zelle Vacciniavirus-Rekombinanten oder Wildtyp-Vacciniavirus infiziert, oder scheininfiziert. Zwei Stunden nach der Infektion wurde das Virus-Inokulum entfernt und die Zellen wurden mit Eagles-Medium mit 2,5% FBS überschichtet. Nach 24 Stunden Inkubation wurden die Zellen aus den Kulturflaschen gekratzt und durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt (2.000 · g, 5 min). Die Zellpellets wurden in 0,5 ml TBS [0,15 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)] resuspendiert, dreimal gefroren und getaut, beschallt und zur Entfernung der Zelltrümmer zentrifugiert (12.000 · g, 1 min). Der Überstand und das Gewebekultur-Medium wurden durch Radioimmunassay auf HBsAG getestet. Glasperlen, die mit anti-HBsAG- Antikörper beschichtet waren, wurden mit 0,2 ml Probe 2 Stunden bei 45ºC inkubiert, achtmal gründlich mit 1 ml H&sub2;O gespült und dann erneut 1 Stunde bei 45ºC mit ¹²&sup5;I-markiertem Antikörper gegen HBsAG inkubiert. Die Perlen wurden erneut gewaschen und dann in einem Gammastrahlen-Szintillationszähler gezählt. Die Menge an HBsAG wurde unter Bezug auf positive und negative Kontrollen berechnet, die von Abbot Laboratories bezogen und parallel inkubiert worden waren.
Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, wurde HBsAG in den größten Mengen in Zellen produziert, die mit vHBs2 und vHBs4 infiziert waren. Geringere Mengen HBsAG wurden in Zellen produziert, die mit vHBs5 infiziert waren. Im Gegensatz dazu produzierten diejenigen Rekombinanten, die das HBsAG-Gen nicht in der korrekten Orientierung bezüglich des translozierten Vacciniavirus-Promotors trugen, vHBs1 und vHBs3, kaum nachweisbare Mengen an HBsAG. Auffallenderweise wurde viel HBsAG ins Medium ausgeschieden. Die Freisetzung von HBsAG erfolgte nicht aufgrund von Zellysis, da 90% des infektiösen Virus zellassoziiert blieben. Tabelle 1 zeigt auch, daß ähnliche Virusausbeuten nach Infektion mit Wildtyp (WT) oder rekombinantem Virus erhalten wurden.
Die Natur des HBsAG, das durch die mit Vacciniavirus-Rekombinanten infizierten Zellen synthetisiert wurde, wurde durch Immunpräzipitation analysiert. Monolayer von CV-1-Zellen, die mit 30 pfu/Zelle gereinigten Vacciniavirus-Rekombinanten infiziert waren, wurden 4 Stunden nach der Infektion mit Eagles-Medium inkubiert, das 0,01 mM Methionin enthielt. Die Zellen wurden dann 20 min bei 37ºC mit frischem Eagles-Medium ohne Methionin inkubiert, das mit [³&sup5;S]Methionin (120 uCi/5 · 10 Zellen) supplementiert war. Überschüssiges [³&sup5;S]Methionin wurde durch dreimaliges Waschen der Zellen mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung entfernt und Zellextrakte wurden durch 10 min Inkubation der Zellen auf Eis in 0,5 ml 0,1% Aprotinin, 0,1 M Tris-HCl (pH 8,0) 0,1 M NaCl, 0,5% NP40 und anschließende Zentrifugation präpariert. 80% des Überstandes wurden mit 25 ul Non-Immun-Serum von Meerschweinchen bei 4ºC 15 Stunden inkubiert, und die Immunkomplexe wurden durch Zugabe von 50 ul einer formalinbehandelten Staphylococcus A-Suspension, 30 min Inkubation bei 4ºC und anschließende Zentrifugation entfernt. Dann gab man 20 ul HBsAG-Antiserum von Meerschweinchen zu, inkubierte 15 Stunden bei 4ºC und entfernte anschließend die Immunkomplexe wie oben durch Zugabe einer Staphylococcus A-Suspension und anschließende Zentrifugation. Das Pellet wurde zweimal in 0,05 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 1% Natriumdeoxycholat und zweimal in 0,4 M LiCl, 2 M Harnstoff, 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) gewaschen. Die Immunkomplexe wurden aus dem Staphylococcus A-Pellet durch 15 min Inkubation in 50 ul 0,06 M Tris-HCl (pH 6,8), 3% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 0,002% Bromphenolblau bei 25ºC eluiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand gekocht und einer Elektrophorese durch ein 15% Polyacrylamidgel unterworfen. Das Gel wurde fixiert, mit Enhance (New England Nuclear Corporation) behandelt und man erhielt eine Fluorographie. Die Untersuchung der Fluorographie zeigte, daß zwei Polypeptide spezifisch immunpräzipitiert waren. Sie besaßen Molekulargewichte von 23.000 und 25.400 und comigrierten auf den Polyacrylamidgelen mit Polypeptiden, die mit HBsAG-Antiserum aus einer Hepatom-Zellinie PLC/PRF/5 immunpräzipitierten. Die Natur des HBsAG, das aus mit Vacciniavirus-Rekombinanten infizierten Zellen ausgeschieden wurde, wurde weiter untersucht. Gewebekultur-Medium, das 24 Stunden nach der Infektion von CV-1-Zellen mit 30 pfu/Zelle der Vacciniavirus- Rekombinante vHBs4 geerntet worden war, wurde durch 5 min Zentrifugation bei 2.000 · g geklärt und dann nochmals 24 Stunden bei 4ºC und 75.000 · g zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4,5 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA resuspendiert und dann wurden 1,38 g CsCl zu einer Enddichte von 1,2 g/cm³ hinzugegeben. Die Probe wurde 64 Stunden bei 4ºC und 220.000 · g zentrifugiert und Gradientenfraktionen wurden aufgefangen. Verdünnte Proben wurden mittels Radioimmunassay auf HBsAG getestet. Ein HBsAG-Peak wurde bei einer Dichte von 1,2 g/cm³ nachgewiesen, der mit einem HBsAG-Peak identisch war, der erhalten wurde, wenn Kulturmedium der Hepatom-Zellinie PLC/PRF/5 parallel behandelt wurde. Die Peak- Fraktionen von HBsAG wurden gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) dialysiert und nochmals 4,5 Stunden bei 150.000 · g und 4ºC auf einem 5 bis 30%-igen (w/w) Saccharosegradienten in PBS zentrifugiert. Gradientenfraktionen wurden aufgefangen und die Proben wurden verdünnt und mittels Radioimmunassay auf HBsAG getestet. Man fand einen HBsAG-Peak, der mit derselben Geschwindigkeit wie das HBsAG aus der Hepatom-Zellinie PLC/PRF/5 sedimentierte. Bei der Analyse von Proben dieser Peaks durch Elektronenmikroskopie wurden HBsAG-Partikel nachgewiesen.
In allen überprüften Eigenschaften (einschließlich Antigenizität, Polypeptid-Zusammensetzung, Schwimmdichte, Sedimentationsrate) war das HBsaG, das aus Zellen ausgeschieden wurde, die mit der Vacciniavirus-Rekombinante vHBs4 infiziert waren, nicht von den aus der Hepatom-Zellinie PLC/PRF/5 freigesetzten HBsAG-Partikeln zu unterscheiden.

(d) Impfung von Kaninchen mit Vacciniavirus-Rekombinanten.

Frühere Untersuchungen haben gezeigt, daß HBsAG-Partikel aus dem Blut von Trägern von humanem Hepatitis B-Virus hoch immunogen sind und die Infektivität von Hepatitis B-Virus neutralisieren können. Folglich wurde die Frage untersucht, ob eine Infektion von Tieren mit Vacciniavirus-Rekombinanten, die HBsAG exprimieren, die Produktion von anti-HBVsAG Antikörpern induzieren würde.
Den Kaninchen wurde zuerst Blut abgenommen und dann wurden sie entweder mit Wildtyp-Vacciniavirus oder mit der Vacciniavirus- Rekombinante vHBs4 durch intradermale Injektion von 10&sup8; pfu des Virus in 4 Stellen auf dem Rücken eines jeden Kaninchens infiziert. Nach der Inokulation wurde den Kaninchen täglich Blut abgenommen und Serum wurde präpariert und bei -70ºC gefroren aufbewahrt. Nach 5 Tagen entwickelten die Kaninchen an den Inokulationsstellen Läsionen, die nach 10 Tagen sichtbar abheilten. Das Serum der Kaninchen wurde mittels Radioimmunassay auf HBsAG und Antikörper gegen HBsAG, und mittels Plaque-Test auf Vacciniavirus getestet. Im Serum war weder HBsAG noch Vacciniavirus nachweisbar. 5 Tage nach der Inokulation wurden jedoch Antikörper gegen HBsAG nachgewiesen (Tabelle 2). Tabelle 1 Produktion von HBsAG und Vacciniavirus in infizierten Zellen ng HBsAG/5·10&sup6; Zellen Zellextrakt Kulturmedium Virusausbeute uninfiziert Hepatomzellen
Monolayer von CV-1-Zellen wurden mit 30 plaquebildenden Einheiten (pfu)/Zelle von gereinigtem Wildtyp (WT) oder von Vacciniavirus- Rekombinanten (vHBs 1-5) infiziert, oder scheininfiziert. Nach zwei Stunden wurde das Virusinokulum durch 2,5 ml Eagle-Medium mit 2,5% fötalem Rinderserum ersetzt. Die Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet und vom Kulturmedium durch 5 min Zentrifugation bei 2.000 · g abgetrennt. Die Zellpellets wurden in 2,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert, dreimal gefroren und getaut und beschallt. Gleiche Portionen von Zellextrakten und Kulturmedium wurden mittels Radioimmunassay auf HBsAG und mittels Plaque-Test auf CV-1-Zellen auf Vacciniavirus getestet. Kulturmedium und Zellextrakt, die wie oben beschrieben aus der Hepatom-Zellinie PLC/PRF/5 drei Tage nach Konfluenz präpariert worden waren, wurden parallel auf HBsAG getestet. Tabelle 2 Produktion von Antikörpern gegen HBsAG durch Kaninchen, die mit rekombinantem vHBs4 infiziert waren Tage nach der Impfung RIA-Einheiten/0,2 ml Serum WT-Virus
Unverdünntes Serum, das von den Kaninchen an den angegebenen Tagen erhalten wurde, wurde mit einem Radioimmunassay (AUSAB, Abbot Laboratories) auf Antikörper gegen HBsAG getestet. Eine HBsAG positive Kontrolle von Humanplasma, die von Abbot Laboratories bezogen wurde, hatte einen Titer von 512 RIA-Einheiten.

Hinterlegung von Material

Eine Probe von E. Coli HB101, die mit pGS20 transformiert war, wurde am 30. November 1982 bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter der Nummer ATCC No. 39249 hinterlegt. Am 1. Dezember 1982 wurden Proben von E. Coli HB101, die mit pHBs4 transformiert waren, unter der Nummer ATCC No. 39250, und Proben von vHBs4 unter der Nummer ATCC No. VR2055 hinterlegt.

Claims

1. Vektor, der zur homologen Rekombination in ein Pockenvirus in der Lage ist, umfassend:

ein chimäres Gen, das wenigstens eine Regulationssequenz von Pockenvirus für die Transkription und, unter der Transkriptionskontrolle der Regulationssequenz, wenigstens eine durchgehende proteincodierende Sequenz eines Fremdgens umfaßt, wobei die Regulationssequenz und die codierende Sequenz nicht durch eine weitere Regulationssequenz für die Transkription getrennt sind; und

DNA aus einem nichtessentiellen Bereich des Pockenvirus- Genoms, die das chimäre Gen flankiert.

2. Vektor nach Anspruch 1, worin das Fremdgen von prokaryotischer Chloramphenicol-Acetyltransferase, Herpes Thymidinkinase, Vesicular Stomatitis-Virus N-Gen, Hepatitis-Virus Oberflächenantigen, Hepatitis B-Virus, Hepatitis A-Virus, Hepatitis non-A, non-B-Virus, Influenza-Virus, Cytomegalo- Virus, einem Adenovirus, einem Parvo-Virus, Maul- und Klauenseuche-Virus, Poliovirus, Masern-Virus, Tollwut-Virus, einem Corona-Virus, Coxsackie-Virus, einem pathogenen Bakterium, Rickettsien, einem Protozoon oder einem Metazoon stammt.

3. Vektor nach Anspruch 1, worin die proteincodierende Sequenz mindestens für den antigenen Teil eines immunogenen Proteins codiert.

4. Vektor nach Anspruch 1, worin die proteincodierende Sequenz für ein immunogenes Protein codiert.

5. Vektor nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die flankierende DNA ein Segment des Thymidinkinase-Gens von Vacciniavirus und zu diesem Thymidinkinase-Gen benachbarte DNA umfaßt.

6. Vektor nach Anspruch 5, worin die flankierende DNA das Thymidinkinase-Gen von Vacciniavirus umfaßt.

7. Vektor nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Regulationssequenz für die Transkription das Thymidinkinase-Gen von Vacciniavirus oder ein frühes Gen von Vacciniavirus, das für das 7,5 K Polypeptid codiert, kontrolliert.

8. Vektor nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Pockenvirus-DNA Vacciniavirus-DNA ist.

9. Vektor nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, worin die proteincodierende Sequenz eines Fremdgens die der Translationsinitiation des Fremdgens entsprechende Sequenz und DNA umfaßt, die über die Terminationsstelle der Translation des Fremdgens hinausgeht.

10. Vektor nach Anspruch 9, worin die proteincodierende Sequenz von einer DNA-Kopie eines DNA-Gens oder einer DNA-Kopie eines RNA-Gens erhalten ist.

11. Infektiöses Pockenvirus, das enthält:

ein chimäres Gen, wie es in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 und 7 bis 10 definiert ist; und

flankierende DNA, wie sie in irgendeinem der Ansprüche 1, 5 und 6 definiert ist, so daß das infektiöse Pockenvirus nach Infektion einer Zelle in der Lage ist, die proteincodierende Sequenz des chimären Gens zu exprimieren.

12. Infektiöses Pockenvirus nach Anspruch 11, worin das chimäre Gen Pockenvirus-DNA umfaßt, die der Sequenz, an der die RNA- Synthese beginnt, vorangeht und sie einschließt.

13. Infektiöses Pockenvirus nach Anspruch 12, worin die Pockenvirus-DNA ein DNA-Segment mit ungefähr 275 oder weniger Basenpaaren umfaßt, die der Stelle, an der die RNA-Synthese beginnt, vorangehen.

14. Infektiöses Pockenvirus nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 13, worin die proteincodierende Sequenz wenigstens für den antigenen Teil des Oberflächenantigens von Hepatitis B- Virus codiert.

15. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10, das die Schritte umfaßt:

(a) Herstellung eines Plasmids, Cosmids oder Phagen, die flankierende DNA enthalten, die eine Regulationssequenz von Pockenvirus-DNA für die Transkription flankiert und, benachbart zu wenigstens einer Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease, die Stelle, an der die RNA-Synthese beginnt, einschließt; und

(b) Inserieren der wenigstens einen durchgehenden proteincodierenden Sequenz eines Fremdgens in die Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease.

16. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten infektiösen Pockenvirus nach irgendeinem der Ansprüche 11 bis 14, das die Schritte umfaßt:

(a) Transfektion einer mit einer Gattung eines Pockenvirus infizierten Zelle mit einem Vektor nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 10 oder erhältlich nach einem Verfahren nach Anspruch 15, in der eine homologe Rekombination zwischen der DNA des infizierenden Pockenvirus und wenigstens einem Teil der Pockenvirus-DNA im Vektor erfolgt; und

(b) Isolieren des rekombinanten Pockenvirus aus der Zelle.