DE69534995T2

DE69534995T2 - Varianten von antigenen des menschlichen papillomvirus

Info

Publication number: DE69534995T2
Application number: DE69534995T
Authority: DE
Inventors: John Stirling Coburg EDWARDS; Cooper John Bullengarook COX; Ann Elizabeth Eltham WEBB; Ian Saint Lucia FRAZER
Original assignee: University of Queensland UQ; CSL Ltd
Current assignee: University of Queensland UQ; CSL Ltd
Priority date: 1994-12-20
Filing date: 1995-12-20
Publication date: 2007-01-11
Anticipated expiration: 2015-12-21
Also published as: CA2419289A1; AU693627B2; AU4322996A; ZA9510832B; JPH10510989A; EP0796273B1; CA2207741C; AUPN015794A0; EP0796273A1; US6306397B1; DE69534995D1; US6004557A; US6303128B1; EP0796273A4; ATE326479T1; WO1996019496A1; NZ297946A; CA2207741A1

Description

Gebiet der Erfindung
Das Gebiet der Erfindung betrifft allgemein variante humane Papillomavirus(HPV)-Proteine und insbesondere nicht transformierende variante HPV-Proteine, die zur Verwendung in Impfstoffen geeignet sind. Die Erfindung umfasst diese Varianten zur Verwendung als Medikamente und in Zusammensetzungen zum Auslösen einer Immunantwort gegen HPV in einem Wirtstier.
Hintergrund der Erfindung
Papillomaviren sind kleine DNA-Viren, die eine Vielzahl von Tierarten infizieren. Einige stehen mit der Entwicklung bösartiger Erkrankungen in deren natürlichen Wirten in Verbindung. Über 60 Arten des humanen Papillomavirus(HPV) wurden identifiziert. Diese infizieren Menschen an einer Vielzahl von Körperstellen und sind für gewöhnliche Hautwarzen, Larynxpapillome, Genitalwarzen und andere warzenähnliche Läsionen verantwortlich. Genital-HPV-Infektionen sind besonders häufig und eine Zahl von HPV-Typen, jedoch am häufigsten die Typen 6, 11, 16 und 18 infizieren den Genitaltrakt bei sowohl Männern als auch Frauen. Bei Frauen infizieren HPVs verschiedene Bereiche des Genitaltrakts einschließlich des Gebärmutterhalses.
Genitale HPVs sind ein bedeutendes klinisches Problem. Eine HPV-Infektion der anogenitalen Region wird derzeit als die häufigste Form einer viralen, sexuell übertragenen Erkrankung (STD) betrachtet. Die Viren können Genitalinfektionen verursachen, die auf einem von drei Wegen manifest werden:

(i) eine klinische Infektion, wobei große Genitalwarzen sichtbar sind;
(ii) eine subklinische Infektion, wobei virale Läsionen nicht offensichtlich sind, jedoch unter Verwendung spezieller Betrachtungstechniken detektierbar sind; und
(iii) Latenz, wobei das einzige Zeichen einer Infektion das Vorhandensein von HPV-DNA ist.

Subklinische Infektionen sind häufig. Es wird geschätzt, dass 2 bis 4 % von Papanicolaou(Pap.)-Abstrichen Anzeichen von HPV zeigen. Latente Infektionen sind noch häufiger und der größte Teil der Erwachsenen beherbergt eine oder mehrere Arten von genitalen HPV.
Zervixkarzinom (CaCx) ist eine häufige Krebserkrankung bei Frauen. Zwei Formen von Gebärmutterhalskrebs sind bekannt; Plattenepithelkarzinom (SCC) ist bei weitem der häufigste, der etwa 90 % der beobachteten Fälle darstellt; Adenokarzinom, eine Krebserkrankung der Sekretionszellen, macht etwa 10 % aus. Gebärmutterhalskrebs entwickelt sich über vorkanzeröse Zwischenstufen zu invasiven Formen (dem Karzinom), das lebensbedrohlich werden kann. Die vorkanzerösen Stufen zunehmender Schwere sind als zervikale Plattenepitheldysplasie (CIN) der Grade 1 bis 3 bekannt. Über einen Zeitraum von 20 Jahren entwickeln etwa 40 % der unbehandelten CIN3-Patienten invasiven Krebs, dessen zunehmend schwere Formen als Stufe I bis IV bekannt sind. Invasiver Krebs führt häufig zum Tod.
Gebärmutterhalskrebs ist sowohl in dessen vorkanzerösen als auch invasiven Stadien eine der wenigen Krebserkrankungen, für die ein hoch zuverlässiges und relativ billiges Screeningverfahren verfügbar ist. Der Papanicolaou(Pap.)-Abstrich umfasst eine zytologische Untersuchung von Gebärmutterhalsabstrichen zum Test auf das Vorhandensein anomaler Gebärmutterhalszellen, die in ein Zeichen für präinvasiven oder invasiven Krebs sind. Die Detektion von Anomalitäten führt zu weiterer Untersuchung und, falls nötig, Behandlung.
Um zur Verringerung der Zahl von Gebärmutterhalskrebserkrankungen und daraus folgender Todesfälle wirksam zu sein, wird ein Pap.-Abstrichscreening im Massenmaßstab durchgeführt und es umfasst idealerweise alle Frauen im sexuell aktiven Alter. Die Detektion und anschließende Behandlung von CIN hat eine sehr hohe Erfolgsrate im Hinblick auf die Prävention von invasivem Krebs, während eine frühe Detektion des letzteren eine deutliche Wirkung auf die Sterblichkeit haben kann.
Die meisten Industrieländer weisen hoch entwickelte Pap.-Abstrichscreeningprogramme auf, die zu einer 30 eigen Abnahme der altersspezifischen Sterblichkeit aufgrund von CaCx zwischen 1960 und 1980 führten. Jedoch führen, abgesehen von den skandinavischen Ländern, wenige Industrieländer ein Screening bei mehr als 50 bis 60 % der Frauen durch, wodurch CaCx und daraus resultierende Todesfälle ein signifikantes Problem bleiben. In den Entwicklungsländern ist die Situation noch schlechter, da wenige organisierte Screeningprogramme existieren, was zu 400.000 neuen Fällen von invasivem Krebs jährlich in diesen Ländern führt.
Wie früher angegeben, verursacht eine Vielzahl von Arten von HPV Genitalinfektionen bei Menschen, obwohl vier Arten (6, 11, 16, 18) vorherrschen. Über die vergangenen 15 Jahre angesammelte Beweisanzeichen legen stark nahe, dass mehrere der HPVs mit der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs in Verbindung stehen. Tatsächlich folgerten viele Forscher, dass spezifische HPV-Arten der wesentliche ätiologische Faktor, der für die Entwicklung von vielen der Krebserkrankungen verantwortlich ist, sind.
Eine Infektion mit HPV-16 und HPV-18 wurde mit der Entwicklung von Gebärmutterhalskrebs in Verbindung gebracht. Es wurde postuliert, dass HPV als Auslöser der Zervixkarzinogenese fungiert und dass eine maligne Transformation von der Interaktion mit anderen Faktoren abhängt. Infektionen mit HPV-6 und HPV-11 wurden mit der Entwicklung von Genitalwarzen in Verbindung gebracht. Das Auftreten einer HPV-Infektion scheint zuzunehmen, was durch eine starke Zunahme in der letzten Zeit von Patientenbesuchen im Zusammenhang mit Genital-HPV-Infektionen bei sowohl Männern als auch Frauen und das Vorhandensein von HPV in Pap.-Abstrichen von einigen Frauen eines Alters unter 30 Jahren gezeigt wurde.
Die Natur von HPV-16 in speziellen und Papillomaviren im allgemeinen wurde in der letzten Zeit gut untersucht. HPV-16 enthält ein doppelsträngiges DNA-Genom von 7904 bp (K. Seedorf et al., Virology (1985) 145:181–185). Das Capsid ist 50 nm groß und enthält 72 Capsomere (A. Klug, J. Mol. Biol. (1965) 11:403–423). Das US-Patent 4 777 239 offenbart eine Reihe von 17 synthetischen Pepsiden, für die angegeben wird, dass sie Antikörper gegen HPV-16 bilden können und daher für diagnostische Zwecke verwendbar sein können. Ferner offenbart das europäische Patent 0 412 762 Polypeptide, die Antagonisten der biochemischen Interaktion des HPV-E7-Proteins und des Retinoblastomgen(RBG)-Proteins sind und für die angegeben wird, dass sie bei der Behandlung von Genitalwarzen und Gebärmutterhalskrebs verwendbar sind.
Die DNAs mehrerer Papillomaviren wurden sequenziert, wobei diese mehrere HPV-Arten, Rinder-Papillomavirus (BPV) und Cottontail Rabbit-Papillomavirus (CRPV) umfassen. Alle von diesen zeigen ähnliche Muster der Nucleotidsequenz in Bezug auf offene Leseraster. Die offenen Leseraster können funktional in frühe Regionen (E) und späte Regionen (L) unterteilt werden: es wird postuliert, dass die E-Regionen zur Replikation und Transformation benötigte Proteine codieren und die L-Regionen die Viruscapsidproteine codieren (O. Danos et al., J. Invest. Derm. (1984) 83:75–11s).
Es wird angenommen, dass zwei HPV-codierte Proteine, E6 und E7, an der Pathogenese von HPV-induzierter. anomaler Zellproliferation beteiligt sind (Übersicht in Stoppler et al., Intervirology (1994) 37:168–179). Die Aminosäuresequenzen der HPV-16-E6- und E7-Proteine, die von der Nucleinsäuresequenz abgeleitet sind, sind in Seedorf et al., Virology (1985) 145:181–185, angegeben.
Die HPV-Gene mit Codierung für die E6- und E7-Proteine werden unveränderlich in Gewebe- oder Tumorzellen, die von Gebärmutterhalskrebserkrankungen erhalten wurden, die mit einer HPV-Infektion in Verbindung stehen, exprimiert. Ferner sind die von dem HPV-16-Stamm abgeleiteten HPV-E6- und -E7-Gene zur Induktion von Epithelzellentransformation in Zellkultur ohne das Vorhandensein anderer HPV-Gene fähig. Diese Beobachtungen zeigen, dass mindestens ein Teil der durch eine HPV-Infektion verursachten Stimulation der Zellproliferation auf den E6- und E7-Virusproteinen beruht.
Es wird angenommen, dass die HPV-E6- und -E7-Proteine wirksame immunologische Ziele zur Tumorregression sind. Wie oben beschrieben, ist jedoch bekannt, dass die E6- und E7-Gene Zellen möglicherweise durch die Wirkung ihrer Proteinprodukte der Störung zellulärer Proteine, die am Kontrollzellwachstum beteiligt sind, "transformieren". Daher könnte, auch wenn nur winzige Spuren von DNA mit Codierung für die E6- und E7-Proteine in einer Impfstoffzubereitung vorhanden wären, dies bewirken, dass eine Impfzubereitung irreversible Transformationsereignisse in den Zellen eines Empfängers der Impfstoffzubereitung auslöst. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung nicht transformierender Varianten der HPV-E6- und -E7-Proteine, die in einem Wirtstier (insbesondere einem Menschen) einen Bereich humoraler und zellulärer Immunantworten induzieren können und daher zur Verwendung bei der Produktion von Impfstoffen zur Prävention, Prophylaxe, Therapie und Behandlung HPV-induzierter Er krankungen oder anderer Zustände, die aus einer Hemmung einer HPV-Infektion Nutzen ziehen könnten, geeignet sind.
Bei den zur vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten wurde erkannt, dass es vier Wege zur Induktion von Immunantworten auf E6- und/oder E7-Proteine gibt:

(i) die Verwendung ganzer Proteine (diese führt die Möglichkeit ein, das kontaminierende DNA mit den Proteinen assoziiert sein kann);
(ii) die Verwendung von Punktmutanten (dies kann zur Rückkehr zu nativem Protein führen, was die Vermeidung mehrfacher Mutationen erfordert; ferner führt jede Punktmutation zum Verlust potentiell vitaler Epitope);
(iii) die Verwendung spezifischer Peptide (dies erfordert eine große Zahl von Peptiden, deren Identifizierung sehr komplex ist, um einen Impfstoff breiter Verwendbarkeit herzustellen); und
(iv) die Verwendung von Varianten, beispielsweise Fusionen und Kombinationen von Deletionsmutanten (dieses Verfahren weist keine der obigen Beschränkungen auf).

Zusätzlich zu den zelltransformierenden Eigenschaften des E7-Proteins selbst wurde auch gezeigt, dass Fusionen dieses Proteins mit β-Galactosidase zelltransformierend sind (Fujikawa et al., Virology, 204, 789–793, 1994). Daher kann nicht vorhergesagt werden, dass Fusionen von E6- und/oder E7-Einheiten, von entweder voller Länge oder nicht voller Länge, nicht ebenfalls zelltransformierend sind.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine isoliertes variantes humanes Papillomavirus(HPV)-Protein zur Verwendung als Medikament bereit, wobei das Protein eine Immunantwort gegenüber HPV in einem Wirtstier auslösen kann, jedoch in dem Wirtstier nicht zelltransformierend ist, wobei das variante Protein ein Fusionsprotein umfasst, das

(i) ein erstes HPV-Protein, das aus der Gruppe von einem E6-Protein voller Länge, einer E6-Deletionsmutante von nicht voller Länge, einem E7-Protein voller Länge und einer E7-Deletionsmutante von nicht voller Länge ausgewählt ist, und
(ii) ein zweites HPV-Protein, das aus der Gruppe von einem E6-Protein voller Länge, einer E6-Deletionsmutante von nicht voller Länge, einem E7-Protein voller Länge und einer E7-Deletionsmutante von nicht voller Länge ausgewählt ist, und
(iii) optional einen Linker, der das erste HPV-Protein und das zweite HPV-Protein verknüpft, umfasst.

In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines isolierten varianten HPV-Proteins gemäß der obigen Beschreibung bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Verwendung zum Auslösen einer Immunantwort gegenüber HPV in einem Wirtstier bereit.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur Verwendung zum Auslösen einer Immunantwort gegenüber HPV in einem Wirtstier, die ein variantes Protein gemäß der obigen Beschreibung zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel und optional einem Adjuvans umfasst, bereit.
Durchgängig in dieser Beschreibung ist, wenn es nicht der Kontext anders erfordert, das Wort "umfassen" oder Variationen wie "umfasst" oder "umfassen" so zu verstehen, dass es den Einschluss einer angegebenen ganzen Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen, jedoch nicht den Ausschluss einer anderen ganzen Zahl oder Gruppe ganzer Zahlen impliziert.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die hier verwendeten Verweise darauf, dass die Variante dieser Erfindung "nicht zelltransformierend in dem Wirtstier" ist, bedeuten, dass die zelltransformierende Eigenschaft des "Stamm-" oder Wildtyp-HPV-E6- oder -E7-Proteins in der Variante verringert und vorzugsweise wirksam beseitigt ist. Insbesondere geben diese Verweise an, dass diese zelltransformierende Eigenschaft im Vergleich zu Wildtyp-E6- oder -E7-Protein in geeigneten Testsystemen signifikant verringert ist.
Es ist klar, dass, wenn das nicht transformierende variante HPV-Protein dieser Erfindung durch Expression eines geeigneten codierenden rekombinanten DNA-Moleküls produziert wird, die Natur der codierenden DNA im Gegensatz zu den Wildtyp-E6- oder -E7-Genen nicht das Potential zum Auslösen irreversibler Transformationsereignisse in den Zellen des Wirtstiers aufweist.
Die varianten HPV-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung können Deletionsmutanten der Wildtyp-E6- oder -E7-Proteine in der Form von Fragmenten nicht voller Länge der Wildtyp-Proteine umfassen. Das erste und zweite Protein des Fusionsproteins werden – optional mit einer Verknüpfung von 1 bis 50, vorzugsweise einer kurzen Verknüpfung von 1–20 und noch besser 1 – 5 Aminosäureresten – fusioniert. Die E6- und/oder E7-Einheiten in einem derartigen Fusionsprotein können die vollen Wildtyp-E6- oder E7-Proteine umfassen oder sie können alternativ Fragmente der Wildtyp-Proteine nicht voller Länge umfassen. Die Fusionsproteine können auch andere Einheiten, die daran fusioniert oder in anderer Weise gekoppelt sind, beispielsweise Einheiten zur Unterstützung der Reinigung des Fusionsproteins (beispielsweise eine Glutathion-S-Transferase- oder GST-Einheit oder hexa-His-Einheit) oder zur Verstärkung der Immunogenität des Fusionsproteins (beispielsweise ein Adjuvans, wie Diphtherie- oder Choleratoxin oder ein nichttoxisches Derivat dersel- ben, wie das Holotoxoid oder die B-Untereinheit des Choleratoxins), umfassen.
Der Ausdruck "Deletionsmutante nicht voller Länge" wird hier zur Beschreibung von Polypeptiden verwendet, die Deletionsmutanten der E6- oder E7-Proteine enthalten, die mindestens 50 %, noch günstiger 60–70 % und sogar 80–90 % der E6- oder E7-Proteinsequenz voller Länge entsprechen. Nur als Beispiel können die Fragmente Deletionsmutanten, die den N-terminalen oder C-terminalen zwei Dritteln der E6- oder E7-Proteine entsprechen, sein.
Geeignete Fusionsproteine, die die E6- und/oder E7-Proteine oder Fragmente derselben nicht voller Länge gemäß der obigen Beschreibung umfassen, können durch Techniken ohne weiteres produziert werden, die einschlägig bekannt sind und im Folgenden mittels Beispielen beschrieben sind. Fachleuten ist klar, dass variante HPV-E6- oder -E7-Proteine gemäß der obigen Beschreibung, die Fusionsproteine umfassen, die verschiedene Kombinationen der E6- und/oder E7-Einheiten umfassen, ohne weiteres unter Verwendung dieser bekannten Techniken produziert werden können und dann unter Verwendung von Routinemethoden getestet werden können, um festzustellen, ob das erhaltene Fusionsprotein die Kriterien der vorliegenden Erfindung erfüllt, d. h. ob es eine humorale und/oder zelluläre Immunantwort in einem Wirtstier auslösen kann, jedoch in dem Wirtstier nicht zelltransformierend ist.
Vorzugsweise ist das Wirtstier ein Mensch, jedoch kann das Wirtstier auch ein nichthumaner Säuger sein.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, auf variante HPV-Fusionsproteine der HPV-16- und HPV-18-Genotypen gerichtet, es ist jedoch klar, dass sich die Erfindung auf variante HPV-Fusionsproteine in anderen HPV-Genotypen, insbesondere den HPV-6- und HPV-11-Genotypen, die Verursacher von Condylomata acuminta sind, und anderen Genotypen, die onkogenes Potential einer HPV-16 und HPV-18 ähnlichen Art aufweisen, erstreckt.
Frühere Arbeiten auf diesem Gebiet zeigten, dass eine Impfung von Ratten mit lebenden Virusvektoren, die HPV-E6- oder -E7-Proteine exprimieren, zur Abstoßung transplantierter, E7 tragender Tumorzellen führt (Meneguzzi et al., Virology, 181:62–69, 1991), während die Impfung von Rindern mit einem HPV-E7-Impfstoff mit Adjuvans zur beschleunigten Abstoßung von Tumoren, die durch bovines Papillomavirus induziert sind, führt (Campo, Cancer Cells, 3:421–426, 1991).
Die varianten HPV-Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung werden als isolierte Proteine bereitgestellt, d. h. sie sind im Wesentlichen frei von anderen HPV-Proteinen, und sie finden spezielle Verwendbarkeit zur Behandlung von Genitalwarzen, Gebärmutterhalskrebs oder anderen durch HPV beim Menschen verursachten Zuständen. Die varianten Proteine können in pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung oder Prävention von Erkrankungen, an denen HPV beteiligt ist, sowie der anderen Zustände, die oben diskutiert wurden, eingearbeitet werden.
Die varianten HPV-Fusionsproteine der Erfindung können zur Bildung von Antikörpern und/oder zur Induktion von zellulären Immunantworten entweder in Subjekten, für die Schutz vor einer Infektion durch HPV gewünscht wird, d. h. als prophylaktische Impfstoffe, oder zur Erhöhung der Immunantwort gegenüber einer bereits vorhandenen HPV-Infektion, d. h. als therapeutische Impfstoffe, verwendet werden. Sie können auch in Produktionsreihen zur Gewinnung von Antiseren injiziert werden. Anstelle der in der Produktionsreihe erhaltenen polyklonalen Antiseren können monoklonale Antikörper unter Verwendung der Standardverfahren oder durch jüngere Modifikationen derselben durch Immortalisierung von Milz- oder anderen, Antikörper produzierenden Zellen zur Injektion in tierische Lebewesen zur Gewinnung von Antikörper produzie renden Klonen produziert werden. Die erhaltenen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, die, falls nötig, bezüglich Artvariationen korrigiert sind, können auch als Therapeutika verwendet werden.
Eine direkte Verabreichung der varianten Proteine an einen Wirt kann entweder Schutzimmunität gegen HPV oder, wenn das Subjekt bereits infiziert ist, eine Auffrischung der eigenen Immunantwort des Subjekts zur wirksameren Bekämpfung des Fortschreitens der HPV-infizierten Erkrankung verleihen.
Die Größe der prophylaktischen oder therapeutischen Dosis eines varianten HPV-Proteins dieser Erfindung variiert natürlich mit der Patientengruppe (Alter, Geschlecht und dergleichen), der Natur oder Schwere des zu behandelnden Zustands und mit dem speziellen varianten Protein und dessen Verabreichungsweg. Allgemein liegt der Wochendosisbereich zur Verwendung im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 5 μg pro kg Körpergewicht eines Säugers.
Jeder geeignete Verabreichungsweg kann verwendet werden, um einen Säuger, insbesondere einen Menschen, mit einer wirksamen Dosierung eines varianten Proteins dieser Erfindung zu versorgen. Beispielsweise kann eine orale, rektale, vaginale, topische, parenterale, okuläre, nasale, sublinguale, bukkale, intravenöse Verabreichung und dergleichen verwendet werden. Dosierungsformen umfassen Tabletten, Lutschtabletten, Dispersionen, Suspensionen, Lösungen, Kapseln, Cremes, Salben, Suppositorien, Aerosole und dergleichen. Diese Dosierungsformen umfassen auch injizierte oder implantierte, langsam freisetzende Vorrichtungen, die für diesen Zweck speziell gestaltet sind, oder andere Implantatformen, die zur zusätzlichen Wirkung auf diese Weise modifiziert sind.
Wenn die varianten Proteine als Impfstoffe zu verabreichen sind, können sie gemäß herkömmlichen Verfahren für eine derartige Verabreichung an das zu schützende Subjekt formuliert werden. Wenn die Antikörper für therapeutische Zwecke verwendet werden sollen, ist es allgemein günstig, ihnen mit dem zu behandelnden Subjekt kompatible Arteigenschaften zu verleihen. Daher ist es häufig günstig, diese Antikörper in monoklonaler Form herzustellen, da eine Fusion mit geeigneten Partnern den sezernierten monoklonalen Antikörpern die gewünschten Eigenschaften verleihen kann.
Die varianten Proteine können in ISCOMS^TM (immunstimulierenden Komplexen), Liposomen oder in Verbindungen wie Acrylaten oder poly(DL-Lactid-co-glykosid) unter Bildung von Mikrokügelchen verkapselt zugeführt werden. Die varianten Proteine können auch in ölige Emulsionen eingearbeitet und oral zugeführt werden.
Andere Adjuvantien sowie herkömmliche pharmazeutisch akzeptable Träger, Streckmittel, Puffer oder Verdünnungsmittel können ebenfalls in die Impfstoffzusammensetzungen dieser Erfindung eingearbeitet werden. Allgemein umfasst eine Impfstoffzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung eine immunologisch wirksame Menge des varianten HPV-Proteins gemäß der obigen Beschreibung und optional ein Adjuvans in Verbindung mit einem oder mehreren herkömmlichen pharmazeutisch akzeptablen Trägern und/oder Verdünnungsmitteln. Eine umfangreiche, wenn auch nicht erschöpfende Liste von Adjuvantien findet sich in Coulter und Cox, "Advances in Adjuvant Technology and Application", in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Kapitel 4, Hrsg. W. K. Young, CRC Press, 1992. Die hier verwendeten "pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel" umfassen beliebig und alle Lösemittel, Dispersionsmedien, wässrige Lösungen, Beschichtungen, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und Absorption verzögernde Mittel und dergleichen. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist einschlägig bekannt und beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18.
Auflage, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USA, beschrieben.
Bei der praktischen Verwendung kann ein variantes Protein dieser Erfindung als Wirkstoff in innigem Gemisch mit einem pharmazeutischen Träger gemäß herkömmlichen pharmazeutischen Mischtechniken kombiniert werden. Der Träger kann eine breite Vielzahl von Formen in Abhängigkeit von der zur Verabreichung, beispielsweise oralen oder parenteralen (einschließlich intravenösen und intraarteriellen) Verabreichung, gewünschten Form der Zubereitung erhalten. Bei der Herstellung der Zusammensetzungen zur oralen Dosierungsform können jedes der üblichen pharmazeutischen Medien, beispielsweise Wasser, Glykole, Öle, Alkohole, Aromatisierungsmittel, Konservierungsmittel, Farbmittel und dergleichen im Falle oraler flüssiger Zubereitungen, beispielsweise Suspensionen, Elixiere und Lösungen; oder Träger, wie Stärkearten, Zucker, mikrokristalline Cellulose, Verdünnungsmittel, Granulierungsmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Disintegrationsmittel und dergleichen im Falle oraler fester Zubereitungen, beispielsweise Pulver, Kapseln und Tabletten, verwendet werden. Wegen ihrer leichten Verabreichung stellen Tabletten und Kapseln die am stärksten vorteilhafte orale Dosierungseinheitsform dar, wobei in diesem Fall feste pharmazeutische Träger offensichtlich verwendet werden. Falls gewünscht, können Tabletten durch Standardtechniken mit Zucker überzogen oder enterisch überzogen werden.
Zusätzlich zu den oben angegebenen üblichen Dosierungsformen können die varianten Proteine dieser Erfindung auch durch Mittel zur gesteuerten Freisetzung und/oder Abgabevorrichtungen verabreicht werden, die beispielsweise die in der internationalen Patenbeschreibung PCT/AU/93/00677 (Veröffentlichung WO 94/15636) offenbarten Zubereitungen mit gesteuerter Freisetzung umfassen.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zur oralen oder parenteralen Verabreichung geeignet sind, können als diskrete Einheiten, wie Kapseln, Cachets oder Tabletten, die jeweils eine vorgegebene Menge des Wirkstoffs enthalten, als Pulver oder Granulatkörnchen oder als Lösung oder Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit, einer nichtwässrigen Flüssigkeit, einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder Wasser-in-Öl-Flüssigkeitsemulsion präsentiert werden. Derartige Zusammensetzungen können durch beliebige pharmazeutische Verfahren hergestellt werden, doch umfassen alle Verfahren die Stufe des Inverbindungbringens des Wirkstoffs mit dem Träger, der einen oder mehrere notwendige Bestandteile bildet. Allgemein werden die Zusammensetzungen durch gleichförmiges und inniges Mischen des Wirkstoffs mit flüssigen Trägern oder fein zerteilten festen Trägern oder beiden und dann, falls nötig, Formen des Produkts zur gewünschten Zubereitung hergestellt.
Weitere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im folgenden Beispiel bzw. in den folgenden Beispielen vollständiger beschrieben. Selbstverständlich ist diese detaillierte Beschreibung jedoch nur für die Zwecke von Beispielen der vorliegenden Erfindung eingearbeitet und sie sollte in keinster Weise als eine Beschränkung der breiten Beschreibung der Erfindung, die oben angegeben ist, verstanden werden.
Beispiel 1
Klonierung und Expression des GST-E6/E7-Fusionsproteins
Ein Molekül, das aus HPV-16-E6- und -E7-Sequenzen als "in-frame"-Fusion bestand, wurde wie im Folgenden angegeben erzeugt. Ein Klon von HPV-16-DNA, der sowohl E6- als auch E7-Genomsequenzen enthielt, diente als Templat zur getrennten PCR-Amplifikation von E6 und E7 unter Verwendung der Oligonucleotide:

(a) (5')CGCTCGAGAGATCTCATATGCACCAAAAGAGAACTGC(3') und
(b) (5')CGCCCGGGCAGCTGGGTTTCTCTACGTG(3') für E6; und
(c) (5')CGCCCGGGATGCATGGAGATACACCTACATTGCATG(3') und
(d) (5')CGGTCGACGGATCCTGGTTTCTGAGAACAGATGGG(3') für E7.

Eine SmaI-Erkennungsstelle am 3'-Ende von E6 und 5'-Ende von E7 ermöglichte die Fusion und führte zwei zusätzliche Aminosäuren (Prolin und Glycin) zwischen E6 und E7 ein. Weitere Restriktionsenzymerkennungsstellen an den 5'- und 3'-Grenzen des Fusionsmoleküls (die in die Oligonucleotide eingeführt wurden) unterstützten anschließende Klonierungsverfahren.
Die fusionierte E6/E7-Sequenz wurde als BglII-BamHI-Fragment in den Vektor pDS56 (Stuber et al., EMBO J.; (1984) 3:3143–3148) kloniert, was eine in-frame-3'-hexa-his(hh)-Sequenz ergab. Aus dieser wurde E6/E7hh als EcoRI/HindIII-Fragment entfernt und in pGEM7+3, das durch Insertion des BamHI/HindIII-Bereichs des pGEM3-Zf(+)(Promega)-Polylinkers in die BamHI/HindIII-Stelle der multiplen Klonierungsstelle des pGEM7-Zf(+)(Promega)-Vektors erzeugt wurde, subkloniert. E6/E7hh wurde dann aus pGEM7+3 als EcoRI/SalI-Fragment entfernt und in die multiple Klonierungsstelle von pGEX-4T-1 (Pharmacia) unter Bildung von pGEX-4T-1 E6/E7hh insertiert. Dieses Plasmid wurde zur Transformation einer Vielzahl von E. coli-Stämmen, die TOPP2 (Stratagene) und BL2I (Amrad/Pharmacia) umfassen, verwendet. Beide Arten transformierter Zellen produzierten eine signifikante Menge Fusionsprotein nach IPTG-Induktion (2). Das Fusionsprotein (GST E6/E7hh, schematisch in 1a dargestellt) lag im erwarteten Größenbereich von etwa 60 kDa. Die Identität des Proteins wurde durch Western-Blots, die mit zwei gegen E7 gerichteten Antikörpern (LHIL.16E7.8F und LHIL.16E7.6D, Tindle et al., Journal of General Virology (1990) 71:1347–1354) sondiert wurden, festgestellt (3).
Beispiel 2
Klonierung und Expression von E6/E7-Fusionsprotein
Um E6/E7hh als Protein, dem GST fehlt, zu exprimieren, wurde ein Terminationscodon in pGEX-4T-1 E6/E7hh an einer singulären BalI-Stelle 3' zum und in-frame mit dem GST-Translationsinitiationscodon unter Verwendung des phosphorylierten Linkers TGCTCTAGAGCA eingeführt. Nach der Transformation des E. coli-Stamms BL21 mit diesem neuen Plasmid ([GST]E6/E7hh) wurde eine signifikante Proteinmenge (E6/E7hh, schematisch in 1b dargestellt) nach IPTG-Induktion mit einer Größe von etwa 33 kD, die der erwarteten Größe eines E6/E7hh-Fusionsproteins entspricht, produziert (2). Die Identität dieses Proteins wurde durch Western-Blot unter Verwendung der gleichen monoklonalen Antikörper wie in Beispiel 1 festgestellt (3).
Beispiel 3
Klonierung und Expression deletierter Formen (nicht voller Länge) von E6 und E7

(i) Konstruktion von ΔE6C/ΔE7N E6/E7 voller Länge in pGEM3 (Promega) diente als Templat zur PCR-Amplifikation deletierter Formen von E6/E7 unter Verwendung der Oligonucleotide 5'GCGCGAATTCTATTAAGGAGCCCGGGATGGGGAATCCATATGCTGTAT3' und 5'CGCGAGATCTCCGAAGCGTAGAGTCACACTTG3'. Die erhaltene gestutzte Form von E6/E7, der Sequenzen (189 bp) am N-Terminus von E6 und C-Terminus von E7 (96 bp) fehlten, wurde in pGEX-4T-1, das einen Terminationscodon in der GST-Sequenz enthielt, subkloniert, wobei [GST]ΔE6C/ΔE7Nhh produziert wurde. Dieses Plasmid wurde zur Transformation des E. coli-Stamms BL21 verwendet. Transformierte Zellen exprimierten eine signifikante Menge eines Fusionsproteins (ΔE6C/ΔE7Nhh, schematisch in 1c dargestellt) nach IPTG-Induktion (4a), wobei ein Protein der näherungsweisen erwarteten Größe (20 kD) produziert wurde. Die Identität dieses Proteins wurde durch Western-Blot unter Verwendung der gleichen monoklonalen Antikörper wie in Beispiel 1 festgestellt (4b).
(ii) Konstruktion von ΔE7C/ΔE6N Unter Verwendung der Oligonucleotide (a) in Beispiel 1 und von 5'CGCCCGGGTAATGTTGTTCCATACAAACTA3' wurde eine N-terminale Repräsentante von E6, die 285 bp umfasste, aus dem gleichen HPV-16-Klon, der in Beispiel 1 verwendet wurde, amplifiziert. Ebenso wurden die Oligonucleotide 5'CGCCCGGGGAGGAGGAGGATGAAATAGATG3' und (d) in Beispiel 1 zur Produktion einer C-terminalen E7-Sequenz von 198 bp verwendet. Diese wurden jeweils stumpfendig in pGEM7-Zf(+)(Promega) kloniert. Eine Fusionskassette wurde durch Restriktion des E6-Klons mit KpnI/BglII und Insertion der E7-Sequenz strangaufwärts als KpnI/BamHI-Fragment gebildet. Diese fusionierte Sequenz wurde dann mit SmaI- und BglII-Klonierungsstellen zur Insertion in pGEX-4T-1, das einen Terminationscodon in der GST-Sequenz enthält, erneut amplifiziert, wobei [GST] ΔE7C/ΔE6Nhh produziert wurde. Nach Transformation in E. coli-BL21 wurde die Proteinproduktion durch PAGE und anschließende Coomassie-Anfärbung und Western-Blotting getestet (5a und 5b). Ein Protein (ΔE7C/ΔE6Nhh, schematisch in 1d dargestellt) der erwarteten Größe (20 kD) war auf Western-Blots offensichtlich.

Beispiel 4
DNA-Sequenzierung von E6/E7-Konstrukten voller Länge und -Deletionskonstrukten
E6/E7-Konstrukte wurden in beiden Richtungen durch das Didesoxyverfahren unter Verwendung von Primern, die überlappende Sequenzinformation erzeugten, sequenziert. Das ^T7Sequencing^TM Kit (Pharmacia) wurde zur Erzeugung von durch eine ³⁵S-markierte Kette terminierten Fragmenten verwendet, die auf einer Sequi-Gen^TM (Biorad)-Elektrophoresegelvorrichtung analysiert wurden. Die DNA- und entsprechenden Aminosäuresequenzen für E6/E7hh (PPV162.DNA), ΔE6C/ΔE7Nhh (CAD600.SEQ) und ΔE7C/ΔE6Nhh (C620.TXT) sind im Folgenden angegeben.

Datei: PPV162.DNA
Bereich: 1–801 Modus: normal
Codontabelle: Universal

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Datei: C620.TXT
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Codontabelle: Universal

Beispiel 5
Immunogenität des E6/E7hh-Proteins
A. Reinigung von E6/E7hh
E. coli-Zellen (Stamm BL21) die das [GST]E6/E7hh-Plasmid enthielten, wurden unter Verwendung von 0,1–0,5 mM IPTG induziert und 3–4 h nach der Induktion geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation niedriger Geschwindigkeit pelletisiert und das E6/E7hh-Protein enthaltende Einschlusskörper wurden durch Ultraschallbehandlung und Zentrifugation isoliert. Das Einschlusspellet wurde in 7M Harnstoff oder 6M Guanidin-HCl solubilisiert und Nickelchelat-Säulenchromatographie (Porath et al., Biochemistry 22, 1621–1630, 1983) unterzogen. Protein wurde unter Verwendung von entweder einem zunehmenden Imidazolgradienten oder abnehmenden pH-Gradienten eluiert und Fraktionen, die E6/E7hh enthielten, wurden gepoolt und gegen 25 mM Tris, 0,5M NaCl, 1 % NOG, 10 mM DTT, pH 7,5, dialysiert. Die Identität und Reinheit des dialysierten Produkts wurde durch Coomassie-angefärbte Polyacrylamidgelelektrophorese und Western-Blot unter Verwendung der in Beispiel 1 angegebenen monoklonalen Antikörper bestimmt (6a und 6b).
B. Immunogenität von E6/E7hh
Am Tag 0 wurden zwei Gruppen von 5 C57BL/6-Mäusen (8 Wochen alt, weiblich) subkutan an der Schwanzbasis mit 0,1 ml einer Formulierung, die 6 μg ISCOMATRIX^TM, 19 μg E6/E7hh (wie in A. oben gereinigt) in PBS, pH 7,2, enthielt, geimpft. Eine zweite Dosis der Formulierung wurde am Tag 14 der Gruppe 1 und am Tag 17 der Gruppe 2 verabreicht. Am Tag 21 und 24 wurde den Mäusen in der Gruppe 1 bzw. 2 Blut entnommen. Serum-Antikörperreaktionen gegenüber E6/E7hh wurden dann unter Verwendung des im Folgenden angegebenen Festphasen-EIA ermittelt.
Nunc MaxiSorp EIA-Platten wurden mit E6/E7hh durch Inkubation von 0,1 ml/Vertiefung einer 10 μg/ml Lösung in 4M Harnstoff in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,5, 2 h bei 37 °C beschichtet. Die Flüssigkeit wurde entfernt und die Platten wurden ferner bei 37 °C 1 h mit 0,2 ml/Vertiefung von 1 mg/ml Kasein in PBS, pH 7,2, inkubiert. Nach 6 Waschvorgängen wurden 0,1 ml/Vertiefung Testserum (verdünnt in PBS, pH 7,2, 1 mg/ml Kasein, 0,5 % Tween 20, 0,002 % Alphazurin A) zugegeben und die Platten 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Platten wurden dann erneut 6 x mit PBS, pH 7,2, 0,5 % Tween 20, gewaschen. Zur Detektion von gebundenem Antikörper wurden 0,1 ml von 0,1 μg/ml KPL-Meerrettichperoxidase-markiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG+IgM (H- und L-kettenspezifisch) in PBS, pH 7,2, 1 mg/ml Kasein, 0,5 % Tween 20, 0,002 % Alphazurin A zu jeder Vertiefung gegeben. Die Platten wurden 1 h bei 20 °C inkubiert, 6 x mit PBS, pH 7,2, 0,5 % (V/V) Tween 20 gewaschen und dann wurden 0,1 ml Enzymsubstrat (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin/H₂O₂-Formulierung, gekauft von KPL) zugegeben. Nach 10 min Inkubation bei 20° wurde die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 0,5M H₂SO₄ gestoppt. Das farbige Produkt wurde dann bei 450 nm in einem Vertikalstrahlspektrophotometer gemessen. Titer wurden als Kehrwert der Serumverdünnung, die zu einem Wert der optischen Dichte von 0,1 führte, ausgedrückt.
Die Tabelle 1 zeigt, dass alle Mäuse der beiden Gruppen 1 und 2 eine signifikante Antwort nach Immunisierung produzierten. Titer reichten von 3,17 bis 5,66 (ausgedrückt als log₁₀ des Kehrwerts der Verdünnung, die zur optischen Dichte von 0,1 in dem oben beschriebenen Festphasen-EIA führte). Vorher existierende Antikörperkonzentrationen waren niedrig oder nicht detektierbar (gemessen in Seren, die am Tag 0 unmittelbar vor der Impfung erhalten wurden).
Es ist klar, dass das E6/E7hh-Fusionsprotein hoch immunogen ist, wenn es Mäusen durch dieses Verfahren verabreicht wird.
Ebenso wurde ermittelt, dass E6/E7hh spezifische Überempfindlichkeit des verzögerten Typs (DTH) nach einer Dosis einer Formulierung, die E6/E7hh plus ISCOM^TM-Adjuvans enthielt, hervorrief. Die Mäuse produzierten spezifische DTH-Reaktionen auf sowohl E6 als auch E7, wenn sie im Ohr mit kleinen Dosen von gereinigtem GST-E6- oder GST-E7-Proteinen stimuliert wurden.
Tabelle 1 Log der Verdünnung auf 0,1 OD
Beispiel 6
Transformationsuntersuchungen des E6/E7-Genkonstrukts
Ein E6/E7-Fusions-DNA-Konstrukt wurde in die multiple Klonierungsstelle des Plasmidvektors pJ4Ω (Wilkinson et al., J. Exp. Med. (1988) 167:1442–58) als BamHI-Fragment subkloniert, wobei pJ4Ω E6/E7 hergestellt wurde. Für Vergleichszwecke wurden pJ4Ω-Vektoren, die HPV16 E6 (pJ4ΩE6)- und HPV16 E7 (pJ4ΩE7)-ORFs enthielten, verwendet. Wenn Neomycinselektion erforderlich war, wurde der pcDNA3-Vektor (Invitrogen), der einen Neomycinresistenzmarker enthielt, verwendet. Diese Plasmide wurden in E. coli amplifiziert und Plasmid-DNA wurde durch alkalische Lyse extrahiert und auf einem Harz (Qiagen) gereinigt, eluiert, durch Ethanol gefällt und in H₂O resuspendiert. Die DNA-Menge und -Reinheit wurde durch spektrophotometrische Messung bei 260 und 280 nm bestimmt. Die DNA-Integrität wurde durch Elektrophorese in 1 % Agarosegelen und Ethidiumbromidanfärbung überprüft. Targetzellen zur Transformation waren Maus-NIH-3T3-Zellen (CSL Biosciences). Die Zellen wurden routinemäßig auf Minimal Essential Medium (Eagle), das mit nicht-essentiellen Aminosäuren, 2 mM Glutamin und 10 % fetalem Rinderserum (Wachstumsmedium) ergänzt war, vermehrt.
Die Transfektion von NIH-3T3-Zellen mit Plasmid-DNA wurde im Wesentlichen gemäß der Beschreibung in dem Promega Technical Bulletin No. 216 unter Verwendung von Tfx^TM-50 zur Verstärkung der DNA-Aufnahme durchgeführt. Typische Transfektionsgemische enthielten 5 μg Testplasmid (pJ4ΩE6/E7, pJ4ΩE7 oder pJ4ΩE6 und pJ4ΩE7) und, wenn erforderlich, 0,1 μg pcDNA3. Wenn pJ4ΩE6 und pJ4ΩE7 cotransfiziert wurden, wurden 2,5 μg von jedem verwendet.
Die Zellen wurden auf etwa 80 % Konfluenz gezüchtet, das Wachstumsmedium wurde entfernt und Plasmid-DNA, die mit Tfx^TM-50 in einem Verhältnis von 4:1 in Minimal Essential Medium gemischt war, wurde zugegeben und die Zellen wurden bei 37 °C inkubiert.
Nach 1–2 h Inkubation bei 37 °C wurde das Transfektionsgemisch entfernt und frisches Wachstumsmedium zugegeben. Nach 48 h Inkubation bei 37 °C wurden transfizierte Zellen durch Trypsinisierung entfernt und entweder auf Koloniebildung in Weichagar getestet oder weitere 24 h bei 37 °C inkubiert, bevor Neomycinselektion angewandt wurde.
Zum Test auf Koloniebildung in Weichagar wurden die trypsinisierten Zellen mit einer Dichte von 1-5 x 10⁵ Zellen/ml in RPMI 1640, das mit 10 % FBS, 2 mM Glutamin, 10 mM Hepes und 0,084 % NaHCO₃ ergänzt war (RPMI 1640+) und 0,4 % Agarose (Seaplaque low gelling temperature, FMC Bioproducts, USA) enthielt, das bei einer Temperatur von 37 °C gehalten wurde, resuspendiert. Nach dem Mischen wurden 2,5 ml dieser Suspension zu jeder Vertiefung einer 6-Vertiefungen-Schale (Nunc) gegeben und absetzen gelassen. Die Schalen wurden dann über einen Zeitraum von 10–14 Tagen bei 37 °C in einer Atmo- sphäre von 5 % CO₂ inkubiert, bevor Kolonien unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops gezählt wurden.
Die Selektion auf neomycinresistente Kolonien wurde an subkonfluenten Zellmonoschichten unter Verwendung von RPMI 1640+, das 700 μg/ml Neomycin (Geneticin) enthielt, durchgeführt. Die Monoschichten wurden bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ 10–14 Tage inkubiert, bevor neomycinresistente Kolonien unter Verwendung eines invertierten Lichtmikroskops gezählt wurden. Nach dem Zählen wurden die Kolonien durch Trypsinisierung dispergiert und auf Koloniebildung in Weichagar wie oben beschrieben getestet. Die Ergebnisse eines Neomycinselektionsexperiments nach Transfektion von 3T3-Zellen mit verschiedenen Plasmidkonstrukten sind in Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2
Diese Ergebnisse zeigen, dass die E6/E7-Fusion im Vergleich zu E7 oder E6 + E7 nur schwach transformierend ist. Sowohl die Koloniezahlen als auch das Zellwachstum für die E6/E7-Fusion waren niedrig im Vergleich zu den nicht-fusionierten Wildtyp-Sequenzen. Dies zeigt, dass eine Folgeerscheinung der Fusion der E6- und E7-Sequenzen die Beeinträchtigung der Fähigkeit dieser Sequenzen zur Förderung der Zelltransformation ist.

Claims

Isoliertes variantes humanes Papillomavirus(HPV)-Protein zur Verwendung als Medikament, wobei das Protein eine Immunantwort gegenüber HPV in einem Wirtstier auslösen kann, jedoch in dem Wirtstier nicht zelltransformierend ist, wobei das variante Protein ein Fusionsprotein umfasst, das (i) ein erstes HPV-Protein, das aus der Gruppe von einem E6-Protein voller Länge, einer E6-Deletionsmutante von nicht voller Länge, einem E7-Protein voller Länge und einer E7-Deletionsmutante von nicht voller Länge ausgewählt ist, und (ii) ein zweites HPV-Protein, das aus der Gruppe von einem E6-Protein voller Länge, einer E6-Deletionsmutante von nicht voller Länge, einem E7-Protein voller Länge und einer E7-Deletionsmutante von nicht voller Länge ausgewählt ist, und (iii) optional einen Linker, der das erste HPV-Protein und das zweite HPV-Protein verknüpft, umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, wobei das erste und zweite Protein aus verschiedenen HPV-Genotypen ausgewählt sind.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ferner ein Fremdprotein oder -peptid, das an eines oder beide von dem ersten und zweiten Protein fusioniert oder in anderer Weise gekoppelt ist, umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 3, wobei das Fremdprotein oder -peptid aus der Gruppe von (i) Proteinen oder Peptiden zur Unterstützung der Reinigung des Fusionsproteins oder (ii) Proteinen oder Peptiden zur Verstärkung der Immunogenität des Fusionsproteins ausgewählt ist.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, das ein Fusionsprotein umfasst, das ein erstes E6-Protein voller Länge, das an ein zweites E6-Protein voller Länge fusioniert ist, umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, das ein Fusionsprotein umfasst, das ein erstes E7-Protein voller Länge, das an ein zweites E7-Protein voller Länge fusioniert ist, umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, das ein Fusionsprotein umfasst, das ein E6-Protein voller Länge, das an ein E7-Protein voller Länge fusioniert ist, umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 7, das das E6-Protein voller Länge als N-terminale Sequenz des Fusionsproteins und das E7-Protein voller Länge als C-terminale Sequenz des Fusionsproteins umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 7, das das E7-Protein voller Länge als N-terminale Sequenz des Fusionsproteins und das E6-Protein voller Länge als C-terminale Sequenz des Fusionsproteins umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, das eine erste Deletionsmutante des E6-Proteins von nicht vol-ler Länge, die an eine zweite Deletionsmutante des E6-Proteins von nicht voller Länge fusioniert ist, umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, das eine erste Deletionsmutante des E7-Proteins von nicht vol-ler Länge, die an eine zweite Deletionsmutante des E7-Proteins von nicht voller Länge fusioniert ist, umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, das ein Fusionsprotein ist, das eine Deletionsmutante des E6-Proteins von nicht voller Länge als N-terminale Sequenz des Fusionsproteins und eine Deletionsmutante des E7-Proteins von nicht voller Länge als C-terminale Sequenz des Fusionsproteins umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, das ein Fusionsprotein ist, das eine Deletionsmutante des E7-Proteins von nicht voller Länge als N-terminale Sequenz des Fusionsproteins und eine Deletionsmutante des E6-Proteins von nicht voller Länge als C-terminale Sequenz des Fusionsproteins umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, wobei jede Deletionsmutante des E6- oder E7-Proteins mindestens 50 % der Proteinsequenz voller Länge umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 14, wobei jede Deletionsmutante des E6- oder E7-Proteins mindestens 60 % der Proteinsequenz voller Länge umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 15, wobei jede Deletionsmutante des E6- oder E7-Proteins mindestens die N-terminalen 60 % der Proteinsequenz voller Länge umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 15, wobei jede Deletionsmutante des E6- oder E7-Proteins mindestens die C-terminalen 60 % der Proteinsequenz voller Länge umfasst.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, wobei der Linker aus 1 bis 50 Aminosäureresten besteht.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 18, wobei der Linker aus 1 bis 20 Aminosäureresten besteht.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 19, wobei der Linker aus 1 bis 5 Aminosäureresten besteht.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 1, wobei das erste und zweite HPV-Protein aus der Gruppe von HPV-16-, HPV-18-, HPV-6- und HPV-11-Genotypen ausgewählt sind.
Isoliertes variantes HPV-Protein nach Anspruch 21, wobei das erste und zweite HPV-Protein aus der Gruppe von HPV-16- und HPV-18-Genotypen ausgewählt sind.
Zusammensetzung zur Verwendung beim Auslösen einer Immunantwort gegenüber HPV in einem Wirtstier, wobei die Zusammensetzung ein isoliertes variantes HPV-Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 22 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 23, die ferner ein Adjuvans umfasst.
Verwendung eines isolierten varianten HPV-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 22 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung beim Auslösen einer Immunantwort gegenüber HPV in einem Wirtstier.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das variante HPV-Protein zur Verabreichung in einem Medikament zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder Verdünnungsmittel geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Medikament ferner ein Adjuvans umfasst.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei das Wirtstier ein Mensch ist.