DE3586830T2

DE3586830T2 - Verfahren zur ligation von heterogenen genen.

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Publication number: DE3586830T2
Application number: DE8585104976T
Authority: DE
Inventors: Tasuku Honjo
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-04-24
Filing date: 1985-04-24
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2005-04-25
Also published as: ATE82591T1; JPS60224492A; EP0162319B1; EP0162319A3; DE3586830D1; EP0162319A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum direkten Verbinden heterologer Gene. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Verbinden von 2 oder mehreren heterologen Genen biologisch unterschiedlichen Ursprungs mit ihren mittels der Spleißtechnik unter Verwendung eines Retrovirus und einer eukaryontischen Zelle eleminierten Introns.
Bei höheren Eukaryonten wie beispielsweise Säugern, einschließlich des Menschen, durchläuft die von dem Operon transkribierte RNA das Spleißverfahren, wodurch sie reife mRNA wird, welche wiederum in ein Protein translatiert wird. Bevorzugter besteht das Strukturgen eines eukaryontischen Operons aus alternierenden Exons und Introns; die von jedem Intron transkribierte RNA wird mittels Spleißen unter Bildung reifer mRNA, welche aus nur einer Sequenz von RNAs aus den Exons besteht, eliminiert, und nur das Protein, das von dieser reifen mRNA translatiert wird, wird als Endprodukt hergestellt. Eucaryonten haben die Fähigkeit des Spleißens, aber Prokaryonten, wie beispielsweise E. coli besitzen diese Fähigkeit nicht. Deshalb kann, selbst wenn ein bestimmtes Genomgen mit Introns in einem höheren Tier oder einer Pflanze, beispielsweise ein Gen, das für eine geeignete physiologisch aktive Substanz kodiert, in einen Expressionsvektor für die Transformation eines Prokaryonten, wie beispielsweise E. coli eingeführt wird, die gewünschte physiologisch aktive Substanz nicht aus der transformierten Zelle erhalten werden.
Um deshalb in einem Mikroorganismus, wie beispielsweise E. coli, ein Protein, welches üblicherweise von höheren Tieren oder Pflanzen hergestellt wird, zu erzeugen, wird das nachfolgende Verfahren gegenwärtig verwendet: reife mRNA, die dem gewünschten Protein entspricht, wird aus einer Zelle oder Gewebe, das sich zum Herstellen des Proteins eignet, isoliert, und die aus der isolierten reifen mRNA hergestellte cDNA wird einem geeigneten Expressionsvektor kloniert. Weil das klonierte Gen aus der reifen mRNA, die von allen Intronregionen befreit ist, abstammt, kann selbst ein Mikroorganismus, der nicht die Fähigkeit des Spleißens besitzt, für die Herstellung einer Substanz, insbesondere eines Proteins, welche durch höhere Tiere erzeugt wird, verwendet werden. Tatsächlich wird dieses Verfahren oft angewandt, wenn Mikroorganismen (beispielsweise E. coli und Hefen) für die Herstellung von Interferonen, Wachstumshormonen und vielen anderen geeigneten, von höheren Organismen produzierten Proteinen verwendet werden.
Jedoch ist bei diesem konventionellen Verfahren eine beträchtliche Menge gereinigter mRNA erforderlich. Zusätzlich ist es trotz der neueren Entwicklung eines neuen Verfahrens zum Klonieren von cDNA aus mRNA (Okayama, H & Berg, P., Mol. Cell. Biol. 2: 16, 1982) manchmal schwierig, cDNA der gewünschten Länge herzustellen.
Es ist auch ein Verfahren entwickelt worden, das das in vitro-Verbinden der Exonbereiche allein in einem bestimmten Genom mittels chemisch synthetisierter DNA ermöglicht (Adelman, J.P. et al., DNA 2: 183-193, 1983), aber wenn das Genom ein hohes Molekulargewicht besitzt und viele Exons enthält, ist viel Zeit und Mühe für die Bestimmung und selbst für die Synthese der Exonbereiche und ihrer DNA-Sequenz erforderlich.
Es wurden von Shimotohno und Temin, die über das Spleißen von Maus-α-Globingen mit Hilfe eines Kükenretrovirus (Avian spleen necrosis Virus: hier als SNV abgekürzt) berichteten (Shimotohno, K. & Temin, H.M., Nature 299: 265-268, 1982), Versuche zum Eliminieren von Introns in einem einzelnen Gen unter Verwendung der Spleißfähigkeit eines Eukaryonten durchgeführt. Jedoch führten sie keine detaillierte Untersuchung der DNA-Sequenz des sich ergebenden Gens im Hinblick auf eine Prüfung, ob die Introns in dem Gen vollständig gespleißt worden waren, aus. Darüber hinaus haben Shimotohno und Temin derartiges Spleißen auf die Introns nur in einem einzelnen Gen angewandt, und die gespleißten Introns waren diejenigen, die natürlich in dem Organismus auftraten. Der Ausdruck "einzelnes Gen", wie er hier verwendet wird, bedeutet ein einzelnes, von einem Organismus abstammendes Gen.
Die Erfinder haben deshalb verschiedene Versuche zum Entwickeln eines Verfahrens zum gleichzeitigen Spleißen von aus zwei oder mehreren Organismen stammenden Genen mittels der Lebenszyklen von Retroviren und der Spleißfähigkeit von Eukaryonten durchgeführt. Als Ergebnis haben die Erfinder festgestellt, daß ihre Aufgabe gelöst werden kann, indem zuerst Gene aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Organismen, insbesondere warmblütigen Tieren, in einen vom Retovirus abstammenden DNA-Vektor eingeführt und anschließend die DNA mit Introns in einer eukaryontischen Zelle gespleißt wird. Das andere Ergebnis der Erfinder ist, daß "künstliche" Introns, die zwei oder mehrere Gene innerhalb des Vektors trennen, auch unter Erhalt der direkten Verbindung dieser Gene gespleißt werden können. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieser neuen Ergebnisse fertiggestellt worden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, ein Verfahren zum Herstellung und Klonieren eines Intron-freien cDNA-Gens aus Genomen höherer Tiere oder Pflanzen zur Verfügung zu stellen, indem Verwendung von einem Retrovirusvektor und der Spleißfähigkeit einer eukaryontischen Zelle gemacht wird, ohne mRNA zu trennen und zu reinigen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Erhalten eines einzelnen Intron-freien Gens durch Spleißen von zwei oder mehreren Genen unterschiedlichen biologischen Ursprungs, die durch Introns innerhalb eines Retrovirusvektors getrennt sind, zur Verfügung zu stellen.
Das mittels dieser Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene Intron-freie Gen kann für die direkte Herstellung eines einzelnen funktionellen Hybridproteins, das nicht in der Natur auftritt, und welches aus 2 oder mehreren verbundenen Proteinen, für die individuelle Gene, die dem Spleißen ausgesetzt sind, kodieren, in einer eukaryontischen Zelle verwendet werden.
Die Vorteile des Verbindens von Genen biologisch unterschiedlichen Ursprungs in Übereinstimmung mit den Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind insbesondere dann groß, wenn diese auf das Verbinden von Immunglobulingenen angewendet werden. Bei Verwendung der vorliegenden Erfindung kann ein Gen, das für ein Hybridimmunglobulinprotein kodiert, dessen molekulare Struktur teilweise vom Menschen und teilweise von einem anderen Tier stammt, erhalten werden. Durch Exprimieren dieses Gens in einem Mikroorganismus kann ein Hybridimmunglobulinprotein hergestellt werden, das sowohl eine von der Maus abstammende variable Region (V-Region) mit Spezifität für ein bestimmtes Antigen wie auch eine vom Menschen stammende konstante Region (C-Region), welche artspezifische Funktionen hat und das Immunsystem des menschlichen Körpers aktiviert, aufweist. Dieses Protein kann als monoklonaler Antikörper zum Zwecke des Heilens oder Diagnostizierens von Krankheiten im Menschen verwendet werden, ohne eine unerwünschte Antigen/Antikörper-reaktion zu erzeugen.
Das Verlangen, menschliche monoklonale Antikörper für die Verwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krankheiten im Menschen zu entwickeln, nimmt heutzutage zu. Jedoch ist es praktisch unmöglich, Zellen herzustellen, die sich für eine konsequente Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper mit der gewünschten Antigenspezifität eignen. Selbst wenn derartige Zellen hergestellt würden, würde ihre bösartige Natur aus Sicherheitsgründen das Verabreichen der hergestellten Antikörper an Menschen ausschließen. Andererseits können Maus-monoklonale Antikörper herstellende Zellen (einschließlich Hybridome) mit Leichtigkeit hergestellt werden, aber das Verabreichen derartiger Antikörper an Menschen ist auch nicht empfehlenswert, weil ihre konstante Region (C-Region) immunogen ist und nicht die Fähigkeit besitzt, das menschliche Immunsystem zu aktivieren.
Eine mögliche Methode zum Lösen dieser Probleme würde die Verwendung eines nicht natürlich auftretenden Hybridimmunglobulinproteins, bei dem die V-Region eines Maus-Immunglobulins mit der gewünschten Antigenspezifität an die C-Region eines Humanimmunglobulins mit der Fähigkeit, das menschliche Immunsystem zu aktivieren, gebunden ist, sein. Jedoch ist bis heute kein praktisches Verfahren erhältlich, das das Herstellen derartiger Hybridimmunglobuline ermöglicht.
Deshalb ist es ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, bei dem menschliche Gene und Mausgene, die für die zuvor beschriebenen C- und V-Regionen kodieren, ausschließlich in ihren Exonregionen verbunden werden. Die verbundenen Gene können für das Herstellen des Hybridimmunglobulinproteins mittels Gentechniken verwendet werden.
Gene, die für die C-Region von Humanimmunglobulinen kodieren, können aus dem Genom jedweder menschlicher Zellen abgetrennt werden, und Klone derartiger Gene sind schon verfügbar. Gene, die für die V-Region mit der gewünschten Antigenspezifität kodieren, können auch mit relativer Leichtigkeit aus einem durch Fusion bösartiger Zellen und Mausmilzzellen, die durch das Antigen sensibilisiert sind, hergestelltem Hybridom herausgetrennt werden. Die vorliegende Erfindung ist auf der Grundlage dieses technischen Hintergrundes fertiggestellt worden, und stellt ein Verfahren zum Herstellen eines neuen Gens wie auch ein Verfahren zum Herstellen eines in biologischen Bereichen, insbesondere zum Heilen und Diagnostizieren von Krankheiten beim Menschen, geeigneten Hybridproteins zur Verfügung.
Fig. 1 zeigt das Verfahren zum Herstellen einer Retrovirus-rekombinanten DNA, pSNV-VT15+hCY1;
Fig. 2 ist eine Restriktionskarte für ein Maus VT15XbaI DNA-Fragment (4,75 kb), welches auch ein als Sonde verwendetes BamHI-Fragment zeigt (eingeschlossen in Rechtecke);
Fig. 3 ist eine Restiktionskarte für ein menschliches hCY1 Hind III-HhaI-Fragment (2,2 kb), welches auch ein als Sonde verwendetes SacII-Fragment zeigt (in Rechtecke eingeschlossen);
Fig. 4 ist eine Restiktionskarte für die rekombinante Region von pSNV-VT15+hCY1, die als rekombinante DNA mittels des in Fig. 1 dargestellten Verfahrens erhalten wurde;
Fig. 5 zeigt eine Spritze zum Herstellen zerhackten Gewebes aus Kükenembryo;
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse des Analysierens gespleißter rekombinanter DNA mittels des Southern-Transferverfahrens, (a) zeigt die erhaltenen Ergebnisse bei Verwendung des VT15 BamHI-DNA-Framgents als Sonde und (b) zeigt die erhaltenen Ergebnisse bei Verwenden der hCY1 SacII DNA als Sonde;
Fig. 7 zeigt die DNA-Sequenzstrategie für das Spleißen des BamHI- Fragments von pSNV-VT15+hCY1 wie auch für die Bereiche um die verbunden Exons (in Rechtecke eingeschlossen) in der gespleißten DNA-Region; und die
Fig. 8 (a) bis (d) zeigen die DNA-Sequenzen vor und nach dem Spleißen der Bereiche um die Bindungen der Exons in Fig. 7, (a) unter Bezugnahme auf den Bereich um die Bindung zwischen VHDJH1 von VT15 und CH1 von hCY1, (b) unter Bezugnahme auf den Bereich um die Bindung zwischen CH1 und H von hCY1, (c) unter Bezugnahme auf den Bereich um die Bindung zwischen H und CH2 von hCY1 und (d) unter Bezugnahme auf den Bereich um die Bindung zwischen CH2 und CH3 von hCY1.
Das Verfahren zum direkten Verbinden heterologer Gene gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt die folgenden Stufen:
- Einfügen von zwei und mehreren DNA-Sequenzen unterschiedlichen biologischen Ursprungs in einen vom Retrovirus-abstammenden DNA- Vektor, wobei
a) jede der DNA-Sequenzen ein zu verbindendes Gen und ein oder mehrere Introns enthält; und wobei
b) das zwischen den zwei Genen in dem Vektor angeordnete DNA-Segment die entsprechende Spleißstellen-Erkennungssequenz in Übereinstimmung mit der GT-AG-Regel enthält;
- Einführen des Vektors in eukaryontische Zellen;
- Kultivieren der Zellen;
- Sammeln des Kulturüberstandes, der Virusteilchen aus den Zellen enthält;
- Infizieren einer anderen Menge eukaryontischer Zellen mit den Virusteilchen durch Inberührungbringen der Zellen mit dem Überstand; und
- selektives Gewinnen von DNA, wobei die Gene in den zwei oder mehreren DNA-Sequenzen direkt durch Eliminierung irgendwelcher DNA-Segmente zwischen den Genen und irgendwelcher Introns aufgrund des Spleißens in Übereinstimmung mit der GT-AG-Regel verbunden worden sind.
Der bei der vorliegenden Erfindung verwendete DNA-Vektor stammt von einem Retrovirus. Der Retrovirus ist ein RNA-Virus der aus zwei homologen in ein Hüll-Protein eingekapselten RNA-Molekülen besteht und einen Lebenszyklus hat, der dargestellt werden kann durch:
Das charakteristische Merkmal dieses Lebenszyklus ist, daß der Virus den gleichen Transkriptionsmodus durchläuft wie mit der eukaryontischen Wirtszelle auf der Stufe von DNA → RNA. Wenn deshalb aus irgendeinem Grund ein Intron in der Genom DNA des Virus existiert, wird es der Spleiß-Wirkung der Wirtszelle auf der Stufe DNA → RNA ausgesetzt, und eine Intron-freie DNA wird durch die Stufe RNA → DNA erhalten. Die vorliegende Erfindung macht von diesem interessanten Phänomen Gebrauch und hat die Verwendung eines vom Retrovirus abstammenden DNA- Vektors und die Verwendung eukaryontischer Zellen zur Voraussetzung.
Typische Beispiel von Retroviren, aus denen der bei der vorliegenden Erfindung verwendete DNA-Vektor hergeleitet werden kann, umfassen Kükenretroviren und Mausretroviren. Ein vorteilhaftes Beispiel ist der Hybridvektor pSNV-TKΔter(R), welcher ein vom Kükenretrovirus abgeleiteter DNA-Vektor ist, der E. coli pBR322 DNA und Thymidinkinasegen enthält, und welcher in Shimotohno, K & Temin, H.M., Cell, 26, 67-77, 1981 beschrieben ist (gemäß der Verteilungsregeln von "Cell" sollten alle in dem Journal beschriebenen Zellstämme und Plasmide frei an eine dritte Person abgegeben werden, die einen Antrag im Hinblick auf Forschungszwecke gestellt hat). Ein weiteres bevorzugtes Beispiel ist ein von der Maus abstammender Retrovirus, wie beispielsweise der Monoly murine leukemia-Virus (M-MuLV: Herman van der Puptten, et al., Cell 24: 729-739, 1981).
Im Prinzip können die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten eukaryontischen Zellen von beliebigen Eukaryonten abstammen. Wenn jedoch der verwendete DNA-Vektor von einem Kükenretrovirus abstammt, werden Kükenzellen, wie beispielsweise Kükenembryo-Fibroblasten bevorzugt verwendet. Wenn der DNA-Vektor von einem Mausretrovirus abstammt, können Zellinien, wie beispielsweise SC-1 (Hartley, J.W. & Rowe, W. P., Virology 65: 128-134, 1975) vorteilhaft als Wirtszellen verwendet werden.
Die zwei oder mehrere unterschiedliche Gene biologischen Ursprungs, von denen man erwartet, daß sie direkt mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens miteinander verbunden werden können, sind irgendwelche beliebigen zwei oder mehrere Gene oder Teile derartiger Gene, die als Ergebnis des Spleißens in eukaryontischen Zellen funktionell exprimiert werden können. Die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind besonders groß, wenn die entsprechenden Gene unterschiedlichen biologischen Ursprungs sind. Beispiele der Sätze von Genen unterschiedlichen biologischen Ursprungs umfassen das Gen für die C-Region der schweren Kette eines Humanimmunglobulins und das Gen für die V-Region der schweren Kette eines Mausimmunglobulins wie auch die Gene für die leichten Ketten der entsprechenden Immunglobuline. Das erfindungsgemäße Verfahren wird auch zum Zwecke des direkten Verbindens verschiedener anderer Intron-haltiger Gene an den Exonregionen verwendet.
Die zu verbindenden Gene können in den DNA-Vektor mittels bekannter Techniken unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme eingefügt werden. Es sind auch Verfahren zum Transformieren eukaryontischer Zellen durch Verbinden des Vektors mit den Geninsertionen in derartigen Zellen bekannt; eine veranschaulichende Technik ist das Kalziumphosphatverfahren, das in dem im nachfolgenden in dieser Patentschrift aufgeführten Beispiel 3 beschrieben ist. In diesem Fall wird vorzugsweise eine intakte oder vollständige Retrovirus-DNA gleichzeitig als Helfervirus zusammen mit dem Vektor, der die Geninsertionen enthält, in die Zellen eingeführt. Dieser Helfervirus produziert eine virale Proteinhülle für die von der Vektor-DNA innerhalb des Zellkerns transkribierte RNA. Dieses Hüllprotein vergrößert die Wirksamkeit der nachfolgenden kontagiösen Infektion der eukaryontischen Zellen mit der transkribierten RNA, wobei die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens beim Verbinden heterologer Gene vergrößert wird.
Die in dem Kulturmedium der transfizierten Zellen enthaltene, von dem in den Virusteilchen enthaltenen DNA-Vektor abstammende RNA ist von jedweden Introns durch die Spleißfähigkeit der Zellen befreit worden, als die RNA von der Vektor-DNA transkribiert wurde. Die eukaryontischen Zellen werden durch Kontakt mit dem die RNA-Virusteilchen enthaltenden Kulturmedium entweder direkt oder in geeigneter konzentrierter Form infiziert. Durch Kultivieren der infizierten Zellen kann ein Gen, bei dem die Ursprungsgene direkt miteinander verbunden sind, ohne durch irgendein Intron getrennt zu sein, erhalten werden. Dieses gewünschte Gen kann selektiv mittels eines bekannten Verfahrens gewonnen werden, beispielsweise mittels des in Beispiel 4 beschriebenen Verfahrens von Hirt et al, welches im nachfolgenden in dieser Patentschrift enthalten ist.
Die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden hier detailliert unter Bezugnahme auf den Fall des direkten Verbindens zweier fremder Gene unterschiedlichen Ursprungs, d. h. des Gens für die variable Region (V-Region) der schweren Kette eines Mausimmunglobulins und des Gens für die konstante Region (C-Region) der schweren Kette eines Humanimmunglobulins, unter Verwendung eines Kükenretorvirus-DNA- Vektors und Kükenembryo-Fibroblasten beschrieben. Es ist jedoch so zu verstehen, daß der Umfang der vorliegenden Erfindung keineswegs auf diesen bestimmten Fall beschränkt ist.
Beispielsweise ist es möglich, das Mausimmunglobulingen, das für die konstante Region (C-Region) des Immunglobulingens kodiert, direkt mit dem Humanimmunglobulingen, das für die variable Region (V-Region) des Gens kodiert, zu verbinden.
Zuerst wird, wie in Fig. 1 dargestellt, der Retrovirus-DNA-Vektor, pSNV-TKΔter(R) DNA, mit dem Restriktionsenzym SacII behandelt, so daß die DNA von dem SacII-DNA-Fragment des Thymidinkinasegens (TKΔter(R)) befreit wird. Anschließend werden 4,75 kb des VT15 XbaI-Fragments mit der V-Region des Gens in der schweren Kette des Mausimmunglobulins (Nakanishi, K. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 6984-6988, 1982) in die mit SacII behandelte DNA an der XbaI-Stelle eingefügt; und anschließend werden etwa 2,2 kb des hCY1 HindIII-HhaI-Fragments mit der C-Region der schweren Kette in dem Humanimmunglobulingen (Takahashi, N. et al, Cell 29: 671-679, 1982) an der SmaI-Stelle eingefügt. Das sich ergebende Plasmid pSNV-VT15+hCY1 hat die in Fig. 4 dargestellte Restriktionskarte, wobei das offene Rechteck und das durchgezogene Rechteck fremde Gene darstellen, wobei das durchgezogene Rechteck sich insbesondere auf die Exons bezieht.
E. coli HB101 wird anschließend mit dem Plasmid transfiziert, und pSNV-VT15+hCY1 DNA wird aus den kultivierten Zellen des transfizierten Stammes abgetrennt. Das Spleißen in den Kükenembryo-Fibroblasten- Wirtszellen mit dieser DNA wird mittels der nachfolgenden Verfahren durchgeführt. Der Zweck des Spleißens besteht darin, die DNA-Sequenzen (Introns), die zwischen VHDJH1 und CH1, zwischen CH1 und H, zwischen H und CH2 und zwischen CH2 und CH3 existieren, von sSNV-VT15+hCY1 (siehe Fig. 4) zu entfernen, wodurch eine Final DNA als einzelnes Gen erhalten wird, bei dem die ursprünglichen zwei Gene (die V- und C-Regionen) direkt miteinander unter Erhalt der Intron-freien Sequenz VHDJH1·CH1·H·CH2·CH3 verbunden sind.
Die beim Spleißen verwendeten Kükenemoryo-Fibroblasten (hier CEF) werden aus den Embryos in käuflich erhältlichen Hühnereiern von 10 Tagen oder dergl. hergestellt (Einzelheiten der CEF-Herstellung sind in dem Beispiel 2, welches im nachfolgenden in dieser Patentschrift angeführt ist, beschrieben). Nach 80 bis 100%igem Wachstum werden die CEF durch Reizen mit der zuvor erhaltenen DNA, pSNV-VT15+hCY1, zusammen mit einem Helfervirus (beispielsweise dem Reticuloendotheliosis-Virusstamm A (REV-A)) infiziert. Das Auftreten der Transfektion kann durch Messen der Reverse-Transkriptaseaktivität (RT-Aktivität) der in dem Kulturüberstand der behandelten CEF vorhandenen Virusteilchen bestätigt werden. Die transfizierten CEF-Zellen werden einige Tage kultiviert, wobei das Kulturmedium jeden Tag erneuert wird. Der Kulturüberstand (welcher die von der Helfervirus DNA abstammenden RNA-Virusteilchen und die von der gespleißten pSNV-VT15+hCY1 DNA abstammenden enthält) wird anschließend zur Hervorrufung der Virusinfektion von CEF verwendet. Die infizierten CEF-Zellen werden 2 bis 3 Tage kultiviert, und die mittels reverser Transkription von RNA in den CEF hergestellte Virus-DNA wird mittels des Hirt-Verfahrens (Hirt, B., J. Mol. Biol. 26: 365-369, 1967) aus der Kultur gewonnen, wobei das gewünschte Intron-freie Gen erhalten wird. Die vollständige Eliminierung der Introns von dem Gen kann durch Analysieren der gewonnenen DNA nachgeprüft werden, indem die Southern-Hydridisierung (Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) mit dem VT15 XbaI-Fragment und dem hCY1 HindIII-HhaI-Fragment (siehe Fig. 2 bzw. 3) durchgeführt wird. Gemäß der von den Erfindern durchgeführten Analyse konnte die Intron-freie pSNV-VT15+hCY1 DNA nur aus den CEF gewonnen werden, die der Virusinfektion durch den Kulturüberstand von CEF, welche durch pSNV-VT15+hCY1 DNA in Anwesenheit der Helfervirus DNA infiziert worden waren, ausgesetzt waren.
Die Intron-freie DNA wurde anschließend mit BamHI unter Herstellung von etwa 1,7 kb des BamHI DNA-Fragments behandelt. Dieses Fragment wurde in einen Charon28-Vektor eingefügt, in vitro-verpackt und mit E. coli LE392 für die Infektion von E. Coli LE392 in Kontakt gebracht (E. coli LE392 ist ein üblicherweise in Laboratorien verwendeter Phagen-Wirtsstamm). Ein Phage, der etwa 1,7 kb des gewünschten DNA-Fragments enthielt, wurde durch Selektieren von in die Plaquehybridisierung eintretenden Klonen mit zwei Sonden, den VT15 BamHI und hCY1 SacII-Fragmenten, erhalten. Die Basensequenz von etwa 1,7 kb des BamHI-Fragments der Phagen-DNA, erhalten aus den selektierten Klonen, oder die von 1,7 kb des BamHI-Fragments der pBR322 DNA, welche durch Klonieren von 1,7 kb des BamHI-Fragments der Phagen-DNA erhalten wurde, wurde mittels des Maxam-Gilbert-Verfahrens bestimmt (Maxam, A. & Gilbert, W., Methods in Enzymology, 65: 499-560, 1980) (siehe Fig. 7 und 8). Als Ergebnis konnte bestätigt werden, daß die beiden anfangs in die Retrovirus-DNA eingefügten Gene, d. h. die V-Region des Mausimmunglobulingens und die C-Region des Humanimmunglobulingens (siehe Fig. 1) direkt unter Bildung eines einzelnen, Intron-freien Gens mittels des beabsichtigten Spleißverfahrens in Übereinstimmung mit der "GT-AG-Regel" (Breathnach, R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 4853-4857, 1978) verbunden worden waren.
Es wurde somit gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren für das Herstellen eines einzelnen, Intron-freien Gens aus heterologen Genen mit dazwischenliegenden Sequenzen sehr geeignet ist. Offensichtlich kann das erhaltene Gen ein funktionelles Hybridprotein in einem Prokaryonten (beispielsweise E. coli) oder einem Eukaryonten (beispielsweise Hefe) exprimieren, wenn das Gen mit einem geeigneten Expressionsvektor verbunden wird.
Falls das so erhaltene Hybridprotein ein immuntherapeutisches Mittel ist, kann es als immundiagnostisches oder immuntherapeutisches Agens verwendet werden.
Ein Verfahren zum Erhalten von Hybridimmunglobulinprotein umfaßt die nachfolgenden Schritte:
- Einfügen eines Hybridgens in einen Phagen- oder Plasmidvektor in derartiger Weise, daß es in einem Mikroorganismus exprimiert werden kann;
- Transformieren eines Mikroorganismus mit dem Vektor; und
- Gewinnen eines Hybridimmunglobulinproteins aus einer Kultur des tranformierten Mikroorganismus, wobei das einzufügende Hybridgen dasjenige ist, daß durch Verbinden von Immunglobulingenen unterschiedlichen biologischen Ursprungs in Übereinstimmung mit dem in einem der Ansprüche 1 bis 11 beschriebenen Verfahren erhalten worden ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden im nachfolgenden detaillierter unter Bezugnahme auf ein bestimmtes Beispiel beschrieben.

Beispiel

(1) Herstellung von rekombinanter DNA, pSNV-VT15+hCY1 (siehe Fig. 1) 5 ug DNA, pSNV-TK/Δter(R) (aufgrund der Freundlichkeit von K. Shimotohno zur Verfügung gestellt; Shimotohno, K & Temin, H.M., Cell 26: 66-67, 1981) wurden mit 10 bis 15 Einheiten des Restriktionsenzyms SacII (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) eine Stunde bei 37ºC umge
TEXT FEHLT
ment mit einer Verwendung von DE81 von Whatmann Co. (siehe Maniatis, T. et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, S. 473, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) gewonnen, wobei 2,3 ug des DNA-Fragments erhalten wurden. Ein Teil (250 ng) des Fragmentes wurden mit einer Einheit T4- DNA-Ligase (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) 6 Stunden bei 15ºC in 100 ul einer konventionellen Ligasierungslösung (50 mM TrisHCl(pH 7,4)), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP: siehe Dugaiczyk, A. et al., J. Mol. Biol. 96: 171-184, 1975) umgesetzt. Unter Verwendung der sich ergebenden DNA-Fragmente wurde der E. coli HB101-Stamm mittels des üblichen Verfahrens transformiert. Kolonien mit pSNV-TKΔter(R) DNA, von denen etwa 1,6 kb des SacII-SacII DNA-Fragments abgelöst worden waren, wurden aus den transformierten Zellen selektiert (selektiert unter Verwendung von Ampicillinresistenz als Marker), indem die Plasmid DNA des kultivierten Transformanten der Agarosegelelektrophorese ausgesetzt wurde. Die defiziente DNA wurde aus dem selektierten Transformanten mittels des konventionellen Verfahrens abgetrennt.
Die defiziente DNA (5 ug) wurde durch einstündige Behandlung bei 37ºC mit 10 Einheiten des Restriktionsenzyms XbaI (Produkt von BRL Co.) gespalten, woran sich eine Behandlung mit einer alkalischen Phosphatase (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) anschloß. Ein Teil (270 ng) der so behandelten DNA wurde mit 200 ng eines 4,75 kb VT15 XbaI-Fragments der variablen Region (hier V-Region) eines Mausimmunglobulingens (Nakanishi, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 6984-6988 1982) bei 15ºC eine Stunde in 10 ul einer Ligasierungslösung (wegen der Zusammensetzung siehe das Vorangegangene) in Anwesenheit von 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase umgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ligasierungslösung 10-fach verdünnt. Die Verdünnung wurde einer weiteren 6-stündigen Reaktion bei 15ºC in Anwesenheit von 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase ausgesetzt. Die sich ergebende DNA wurde für die Transformierung von E. coli HB101 verwendet (im Hinblick auf das Ligasierungsverfahren Dugaiczyk, A. et al., J. Mol. Biol. 96: 171- 184, 1975). Um zu prüfen, ob die transformierten Zellen (selektiert unter Verwendung von Ampicillinresistenz als Marker) DNA aufwiesen, welche das beabsichtigte DNA-Fragment VT15 (siehe Fig. 1) enthielt, wurden die Zellkolonien auf ein Nitrozellulosefilter transferiert und im Hinblick auf das Auftreten von Hybridisierung geprüft, wobei etwa 1,1 kb des VT15 BamHI-Fragments, welches VHDJH1 (siehe Fig. 2) als Sonde enthielt, verwendet wurden (im Hinblick auf das Verfahren der Kolonie-Hybridisierung siehe Maniatis et al., supra, S. 312-319). Die Plasmid DNA wurde aus den klonierten Kolonien abgetrennt, und es wurde zum Zwecke der Bestätigung der korrekten Insertion des VT15 DNA-Fragments deren Ristriktionskarte erstellt. Die klonierten Kolonien der transformierten Zellen wurden anschließend in 1000 ml L-Brühe unter Erhalt von 270 ug der gewünschten Plasmid-DNA kultiviert.
Die DNA wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI gespalten, und an der Spaltstelle wurden 2,2 kb von hCY1 HindIII-HhaI-Fragment von der konstanten Region (hier C-Region) eines Humanimmunglobulingens (Fig. 3; siehe Takahashi, H. et al, Cell 29: 671-679, 1982), welches mit DNA- Polymerase-Klenow-Fragment (Produkt von BRL Co.) behandelt worden war, unter Erzeugung von glatten Enden eingefügt. Die Insertion dieses glattendigen Fragmentes wurde mittels des schon zuvor beschriebenen Verfahrens vollendet. Die erhaltene DNA wurde zum Transformieren von E. coli HB101 Zellen verwendet. Die transformierten Kolonien wurden mittels des Koloniehybridisierungsverfahrens (schon beschrieben) unter Verwendung der hCY1 SacII-Fragment DNA (siehe Fig. 3) als Sonde selektiert. Die korrekte Insertion des gewünschten Fragments wurde bestätigt, indem eine Restriktionskarte für die Plasmid DNA in den transformierten Zellen hergestellt wurde. Man ließ Klone der transformierten Zelle in 3.000 ml L-Brühe wachsen. Durch Extrahieren von Plasmid DNA aus den kultivierten Zellen und Reinigen dieser, wurden etwa 800 ug der gewünschten rekombinanten DNA, pSNV-VT15+hCY1 (siehe Fig. 4) erhalten. Die Extraktion und Reinigung von Plasmid DNA wurde unter Bezugnahme auf "Idensh Sosa Manuel (Gene Manipulation Maual)", Seiten 3-10, Kodansha Scientific, 1982 durchgeführt. Die in (1) erhaltene Plasmid DNA war eine rekombinante DNA mit einem Typ von Retrovirus DNA als Vektor. Diese Plasmid DNA wurde für das Spleißen der Introns in VT15+hCY1 DNA mittels Kükenembryo-Fibroblasten, wie im nachfolgenden gezeigt, verwendet.

(2) Herstellung und Kultur von Kükenembryo-Fibroblasten (CEF)

Ungefähr 10 Kükenembryos wurden aus 10 Tage alten Eiern oder ähnlich alten Eiern, die von Sato Hatchery, Nakagyo-ku, Kyoto, Japan gekauft wurden, genommen. Die Glieder und der Kopf wurden von jedem Embryo mittels Scheren entfernt. Der Humerus, Femur, Pelvis, Vertebra und die Innereien wurden auch sorgfältig von jedem Embryo entfernt. Wie in Fig. 5 dargestellt, wurden die so behandelten Embryos 3 in eine 50 ml Spritze 1, welche mit einem großen Sieb 2 (Maschenöffnungen: ca. 2 mm·2 mm) an der Spitze versehen war, eingebracht. Der Kolben 4 wurde vorwärts gestoßen, wodurch die Embryos in einen 100 ml Erlenmeyer-Kolben durch das Sieb 2 ausgepreßt wurden. In den Kolben wurden auch 10 bis 20 ml Dulbecco's PBS(-) (Produkt von Nissui Seiyaku Co., Ltd.: ein aus Natriumchlorid 8 g, Kaliumchlorid 0,2 g, Na&sub2;HPO&sub4; 1,15 g und KH&sub2; PO&sub4; 0,2 g zusammengesetztes Pulver wurde in 1.000 ml dreifach destilliertem Wasser gelöst; die Lösung wird hier einfach als PBS(-) bezeichnet) gegeben, und die Mischung aus PBS(-) und den zerschnittenen Embryos wurde mit einem Rührer 10 Minuten bei 37ºC leicht gerührt. Die dispergierten Zellen wurden gesammelt und mit 2 bis 4 Volumenteilen eines eisgekühlten Kulturmediums (im Hinblick auf dessen Zusammensetzung siehe die nachfolgende Tabelle I) gemischt. Der Rückstand der zerschnittenen Embryos wurde wiederum mit einer 0,2%igen Trypsinlösung gemischt, und die Mischung wurde 2 bis 3 Zyklen des gleichen Verfahrens ausgesetzt. Das Medium und der nasse Überstand (Zellsuspension) wurden durch ein Filter aus 4 bis 8 Lagen Gaze gegeben. Das Filtrat wurde bei 1.000 Upm 2 bis 3 Minuten zentrifugiert, und der Niederschlag (Zellen) wurde in einem frischen Kulturmedium wieder suspendiert. Falls nicht genügend Zellniederschlag wegen der hohen Viskosität des Überstandes durch eine einzige Zentrifugation erhalten werden kann, muß er einem weiteren Zentrifugationszyklus nach Hinzufügen von 1 bis 2 Volumenteilen eines Mediums ausgesetzt werden. Durch diese Verfahren wurden ca. 3·10&sup7; Zellen pro einzelnes Embryo erhalten. Die Zellen wurden mit einem Kulturmedium unter Erhalt einer Endkonzentration von 8-12·10&sup5; Zellen/ml gemischt. Die Suspension wurde in 15 ml Anteilen in 250 ml Plastikkolben (Produkt von Halcon International, Inc.) verteilt und bei 37,5ºC in 5% CO&sub2; kultiviert.
Am 2. oder 3. Tage der Kultivierung, als die Zellen eine Monoschicht bildeten, wurden sie mit PBS(-) gewaschen, woran sich eine Behandlung mit einer 0,2% Trypsinlösung anschloß. Die so behandelten Zellen wurden in ein Kulturmedium suspendiert und 2 bis 3 Minuten bei 1.000 Upm zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in einer eisgekühlten Mischung aus 90% Medium und 10% DMSO unter Herstellung von 3 ml pro 250 ml Kolben suspendiert. Ein Milliliter Anteile der Suspension wurden sofort in Serumröhren (Produkt von Sumitomo Chemical Co., Ltd.) verteilt, und unter Tiefkühlbedingungen in flüssigem Stickstoff gelagert. Für Transfektionszwecke wurden die gefrorenen CEF-Zellen in einer einzelnen Serumröhre in drei 50 ml Kulturkolben geimpft und vor Verwendung bis zu 80 bis 100%igem Wachstum kultiviert. Für Infektionszwecke wurden die gefrorenen CEF-Zellen in einer einzelnen Serumröhre in eine Schale (10 cm Durchmesser) geimpft, und sofort nach Bildung einer Monoschicht wurden die Zellen in drei Schalen (Durchmesser 10 cm) subkultiviert und vor Verwendung bis zu 80 bis 100% Wachstum kultiviert.

Tabelle I

Zusammensetzung des Kulturmediums

Eagle's MEM-Medium (Nissui 1 # 05900), 9,4 g/l, sterilisiert im Autoklaven . . .. 400 ml
Tryptose-Phosphatmedium (Dico Co., # 0060-01-6), 29,5 g/l, sterilisiert im Autoklaven . . .. 100 ml
L-Glutamin, 200 mM . . .. 5 ml
Rinderfötusserum (Gibco Co.) . . .. 25 ml
Natriumbicarbonat, 7% V/V . . .. 12,5 ml
Stereptomycin, 10 mg/ml; Penicillin G, 10.000 E/ml; und Amphotericin B, 2,5 ug/ml . . .. 5 ml
Eine flüssige Mischung aus diesen Komponenten wurde durch ein Membranfilter (0,22 um, Millipor Co.) unter Herstellung des gewünschten Kulturmediums gegeben.

(3) Transfektion von CEF mit rekombinanter DNA, pSNV-VT15+hCY1

Bei Erreichung von 80 bis 100% Wachstum in den 50 ml-Kulturflaschen wurde das Medium verworfen, und die CEF-Zellen wurden einmal mit PBS(-) gewaschen. Ein Cocktail, der 20 γ/ml der in (1) erhaltenen rekombinanten DNA pSNV-VT15+hCY1 und 2 γ/ml einer Helfervirus DNA enthielt, wobei der Recticuloendotheliosisvirusstamm A (REV-A) aufgrund der Freundlichkeit von Dr. Shimotohno zur Verfügung gestellt worden war, wurde mittels des Kalziumphosphatverfahrens (Graham, F. L. & van der Eb, A.J., Virology 52: 456-467, 1973) hergestellt, und 0,6 ml dieses Cocktails wurden zu der gewonnenen CEF-Monoschicht (im 50 ml-Kolben) hinzugegeben. Nachdem der Kolben 5 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen worden war, wurden 2,4 ml eines frischen Kulturmediums mit der in Tabelle I gezeigten Zusammensetzung hinzugegeben, und es wurde in 5%igem CO&sub2; bei 37ºC inkubiert. 4 Stunden später wurde das Medium durch ein frisches ersetzt, und nach 18-stündiger Transfektion wurden die Zellen in einem Medium, welches 2,5% (V/V) Glycerin enthielt, 1 Minute bei Raumtemperatur behandelt (Nielsen, D.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 5198-5202, 1983), zweimal mit PBS(-) gewaschen und zusätzlich in einem frischen Medium kultiviert.
Nach 4 oder 5 Tagen Transfektion wurde die Aktivität der Reversen Transkriptase (hier R.T.) in dem Kulturmedium gemessen (mittels des Verfahrens, welches im nachfolgenden in dieser Patentschrift beschrieben ist), und das Auftreten der Transfektion oder Vorhandensein von Viren in dem Medium wurde durch die angestiegene R.T.-Aktivität bestätigt. Wenn die Transfektion auftritt, steigt die R.T.-Aktivität (bestimmt mittels des Zählwerts von ³H-TTP in den TCA unlöslichen Fraktionen) auf einen Wert, der mehrmals so groß ist wie der Kontrollwert. Nach Bestätigung des Auftretens von Transfektion wurde der Überstand des Kulturmediums täglich durch frisches Medium ersetzt, und der gewonnene Kulturüberstand wurde bei -80ºC gelagert.
Die R.T.-Aktivitätsmessung wurde in Übereinstimmung mit den Verfahren von Hagino, K. et al., (Virology 107: 174-179, 1980) durchgeführt, jedoch mit der Ausnahme, daß eine Mischung aus 20 ul des Mediums in dem Kolben und 20 ul destilliertem Wasser anfangs zu der in der Literaturstelle beschriebenen Reaktionslösung gegeben wurde.

(4) Infektion von CEF mit rekombinanter DNA und Gewinnung der gespleißten rekombinanten DNA

CEF-Zellen, die 50 bis 80%iges Wachstum in einer 10 cm Schale erreicht hatten, wurden mit dem rekombinanten Virus durch Hinzufügung von 3 bis 4 ml des in (3) gewonnenen Kulturüberstands infiziert. 2 oder 3 Tage nach der Infektion wurde Virus DNA, die Revers von RNA in den CEF transkribiert war, mittels des Hirt-Verfahrens gewonnen (Hirt, B., J. Mol. Biol., 26: 365-369, 1967) und in destilliertem Wasser (20 ul destilliertes Wasser pro DNA in einer Schale von 10 cm Durchmesser) gelöst. Einige wenige pg (Picogram) der gespleißten rekombinanten Virus DNA wurden aus der einen Schale gewonnen. Gelelektrophorese auf 0,8% Agarosegel mit daran anschließendem Southern-Verfahren (Southern E.M., J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) wurden wie folgt durchgeführt, um zu bestätigen, daß die gewonnene rekombinante DNA richtig gespleißt worden war. Die Ergebnisse sind in den Fig. 6(a) und (b) dargestellt.
Zuerst wurden 20 ul der gespleißten rekombinanten Virus DNA auf die Bahn 4 in Fig. 6 gelegt. Weitere 20 ul Virus DNA wurden auf die Bahn 5 gelegt, nachdem sie mit 10 Einheiten BamHI (Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.) 2 Stunden bei 37ºC umgesetzt worden waren. Die beiden DNA-Anteile wurden 0,8%iger Agarosegelelektrophorese ausgesetzt. Auf Bahn 1 wurden 200 pg der ungespleißten DNA, pSNV-VT15+hCY1 (siehe Fig. 4) als Kontrolle nach Spalten mit BamHI aufgetragen. Auf Bahn 2 ließ man 20 ul DNA, die durch Transfizieren von CEF nur mit pSNV-VT15+hCY1 in Abwesenheit von Helfervirus DNA in Stufe 3 erhalten war, als negative Kontrolle laufen. Auf Bahn 3 ließ man DNA, die durch Spalten der DNA auf Bahn 2 mit BamHI erhalten war, laufen. Das Gel wurde anschließend dem Southern-Transfer ausgesetzt (siehe Southern, E.M., Supra), wobei ein Nitrozellulosefilter hergestellt wurde; dieser Filter wurde zuerst mit hC 1 Sonde (siehe Fig. 3), wie in Fig. 6 (b) gezeigt, hybridisiert und anschließend einem kochenden 10 mM Tris-HCl- Puffer (pH 8,0) 10 Minuten ausgesetzt, wobei die hCY1-Sonde entfernt wurde. Danach wurde der Nitrozellulosefilter mit VT15-Sonde (siehe Fig. 2), wie in Fig. 6(a) dargestellt, hybridisiert. Die Fig. 6(a) und (b) zeigen, daß Banden mit einer Länge von etwa 1,7 kb (bezeichnet durch ) und an der gleichen Position lokalisiert, nur in Bahn 5 beobachtet wurden. Diese Banden wurden nicht in der DNA-Probe beobachtet, die durch Transfektion mit der rekombinanten DNA (pSNV-VT15+hCY1: siehe Fig. 4) in Abwesenheit von Helfervirus DNA (Bahn 3 in Fig. 6(a) und (b)) erhalten wurde. Es konnte deshalb die Schlußfolgerung gezogen werden, daß das BamHI-DNA-Fragment, das in Bahn 5 in Fig. 6(a) und (b) auftrat, nicht direkt von der bei der Transfektion verwendeten rekombinanten DNA, pSNV-VT15+hCY1 abstammte, sondern von der entsprechenden Intron-freien DNA, die durch Transfektion derjenigen rekombinanten DNA gebildet worden war, die zuerst in Virus (RNA) umgewandelt wurde, welche ihrerseits in den neu infizierten CEF revers transkribiert wurde. Diese Schlußfolgerung wird durch die beiden Tatsachen gestützt: das betroffene BamHI-DNA-Fragment hybridisiert mit den beiden Sonden VT15 und hCY1; und die Position der Bande für das Fragment stimmt mit der Länge von etwa 1,7 kb überein, von der man erwartet, daß sie auftritt, wenn die Introns innerhalb hC 1 und das zwischen VT15 und hCY1 eliminiert werden. Somit kann mit Sicherheit die Schlußfolgerung gezogen werden, daß DNA von etwa 1,7 kb erwartungsgemäß von allen Introns befreit worden ist, die zwischen VT15 und hCY1 existieren (d. h. die DNA, bei der die in Fig. 4 schattierten Exons in direkten Kontakt unter Erzeugung der Sequenz VHDJH1·CH1·H·CH2·CH3 gebracht worden sind). Diese Annahme wurde endgültig durch Bestimmung der Basensequenz des betroffenen DNA-Fragment verifiziert, wie im Nachfolgenden in (6) gezeigt wird.
Die Bande (A) in Fig. 6(a) entspricht der Länge 1,1 kb des BamHI- Fragments von VT15, wohingegen die Bande (B) in Fig. 6(b) der Länge 3,75 kb des BamHI-Fragments von pSNV-VT15+hCY1 entspricht.

(5) Klonieren von Intron-freier rekombinanter DNA

Die in (4) durch Kultivieren der infizierten CEF in Übereinstimmung mit dem Hirt-Verfahren erhaltene DNA wurde in 20 ul destilliertem Wasser pro Schale mit einem Durchmesser von 10 cm gelöst. Nach Zugabe von 10 Einheiten BamHI wurde die Lösung 2 Stunden auf 37ºC gehalten. Die Lösung wurde anschließend einer Gelelektrophorese auf 0,8% Agarosegel ausgesetzt, und ein durch Schneiden der gespleißten VT15-hCY1- DNA mit BamHI erhaltenes kleines DNA-Fragment (ca. 1,7 kb) wurde mittels des DEAE-Papierverfahrens abgetrennt (beschrieben in Maniatis, T. et al., Supra S. 473).
Die abgetrennte DNA wurde wie folgt unter Verwendung von modifiziertem Charon28 als Vektor kloniert.
Das in pBR322 (Nikaido, T. et al., J. Biol. Chem., 257: 7322-7329, 1982) klonierte BamHI-BglII-Fragment des Mausimmunglobulingens Sγ2a wurde als Arm-Linker für die Modifizierung von Charon28 (Chin-Ping Liu et al., Science 209: 1348-1353, 1980) verwendet. Das modifizierte Charon28 wurde mit BamHI gespalten, das zuvor erhaltene BamHI-DNA-Frament (ca. 1,7 kb) wurde an der Spaltstelle mittels des konventionellen Verfahrens (wie in (1) beschrieben) eingefügt. Die modifizierte Charon28-DNA (1,7 kb) wurde der in vitro-Verpackung mittels des in Maniatis, T. et al., supra, S. 264-268 beschriebenen Verfahrens ausgesetzt und anschließend für die Infektion mit E. coli LE392 in Berührung gebracht. Die infizierten E. coli-Zellen wurden plattiert, und die sich ergebenden Plaques wurden der Plaquehybridisierung (Benton, W. D. & Davis, R.W., Science, 196: 180-182, 1977 ) unter Verwendung von VT15 und hCY1 als Sonden (siehe Fig. 2 bzw. 3) ausgesetzt. Durch Selektieren von Plaques, die mit beiden Sonden hybridisierten, wurden Klone, die das gewünschte BamHI-DNA-Fragment (ca. 1,7 kb) enthielten, erhalten. Die Klone wurden kultiviert, und die DNA wurde aus einer Lösung des durch die kultivierten Klone erzeugten Phagen extrahiert. Die DNA wurde mit BamHI behandelt und einer Gelelektrophorese auf 0,8% Agarose ausgesetzt. Die gewünschte DNA von einer Länge von etwa 1,7 kb wurde mittels des DEAE-Papierverfahrens (schon in (1) beschrieben) abgetrennt. Ein Teil (5 ug) der abgetrennten DNA wurde mit AvaII und SmaI gespalten, und die DNA-Sequenzen auf den sich ergebenden Fragmenten wurden mittels des Maxam-Gilbert-Verfahrens (schon beschrieben) bestimmt.

(6) Nachweis der Eliminierung von Introns durch Sequenzieren (siehe Fig. 7 und 8)

Fig. 7 zeigt die Sequenzen von Immunglobulingenen auf dem BamHI DNA-Fragment der rekombinanten DNA, pSNV-VT15+hCY1, und auf dem BamHI DNA-Fragment (ca. 1,7 kb) der rekombinanten DNA nach dem Spleißen. Fig. 7 zeigt auch die Strategie der DNA-Sequenzanalyse der Genbindungen um das BamHI Fragment der gespleißten rekombinanten DNA herum.
Die DNA-Sequenzen um die Bindungen zwischen VHDJH1 und CH1, zwischen CH1 und H und zwischen H und CH2 auf dem BamHI Fragment (ca. 1,7 kb) wurden mittels des Maxam-Gilbert-Verfahrens in Übereinstimmung mit der in Fig. 7 dargestellten Strategie nach dem Spalten des DNA- Fragments mit AvaII mit anschließendem weiteren Spalten des sich ergebenden DNA-Fragments mit HhaI bestimmt. Die DNA-Sequenz um die Bindung zwischen CH2 und CH3 wurde auch mittels des Maxam-Gilbert-Verfahrens in Übereinstimmung mit der gleichen Strategie nach dem Spalten des DNA-Fragments mit SmaI mit anschließendem weiteren Spalten des sich ergebenden DNA-Fragments mit AvaII bestimmt. Die Ergebnisse der Sequenzbestimmung sind in Fig. 8(a) bis (d) dargestellt, welche nur die Sequenzen um die entsprechenden Bindungen zeigen. Fig. 8(a) bezieht sich auf die DNA-Sequenz um die Bindung zwischen VHDJH1 von VT15 und CH1 von hCY1; Fig. 8(b) veranschaulicht die DNA-Sequenz um die Bindung zwischen CH1 und H von hCY1; Fig. 8(c) stellt die DNA-Sequenz um H und CH2 von hCY1 dar; und Fig. 8(d) zeigt die DNA-Sequenz um die Bindung zwischen CH2 und CH3 von hCY1.
In den Fig. 8(a) bis (d) bedeutet (i) den Zustand vor dem Spleißen und (ii) den Zustand nach dem Spleißen. Die DNA-Sequenzen vor dem Spleißen, die Introns enthielten, sind schon bestimmt worden (im Hinblick auf hCY1 siehe Ellison, J.W. et al., Nucl. Acid. Res. 10: 4071- 4079, 1982, und im Hinblick auf die JH1-Region von Maus VHDJH1 siehe Early, P. et al., Cell, 19: 981-992, 1980).
Die Balken über den DNA-Sequenzen in Fig. 8 stellen Triplettcodons von Aminosäuren dar. Die entsprechenden Buchstaben oberhalb der Balken bedeuten die folgenden Aminosäuren:
A: Alanin, C: Cystein, D: Aparaginsäure, E: Glutaminsäure, G: Glycin, I: Isoleucin, K: Lysin, L: Leucin, P: Prolin, Q: Glutamin, R: Arginin, S: Serin, T: Threonin, V: Valin.
Die Pünktchen über den DNA-Sequenzen in Fig. 8 und die Sternchen darunter bedeuten Donor- bzw. Akzeptorsequenzen in der GT-AG-Regel (Breathnach, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 4853-4857, 1978).
Jede der vertikalen, in die DNA-Sequenzen in Fig. 8 eingefügten wellenförmigen Linien bedeutet die Region, wo zwei Exons verbunden sind.
Die in Fig. 8 dargestellten Daten zeigen, daß die Introns an jeder der Bindungsstellen der gespleißten DNA eliminiert wurden und die Exons in Übereinstimmung mit der GT-AG-Regel direkt verbunden wurden. Bevorzugt wurden die Introns auf der in Fig. 4 (oder Fig. 7) gezeigten rekombinanten DNA, pSNV-VT15+hCY1, wie beabsichtigt korrekt gespleißt, wonach die beiden Gene unterschiedlichen Ursprungs (die V-Region des Mausimmunglobulingens und die C-Region des Humanimmunglobulingens) miteinander unter Erhalt eines einzelnen, Intron-freien funktionellen Gens verbunden wurden.
Es ist von Fachleuten leicht zu verstehen, daß die sich ergebende DNA, wenn sie in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt wird, als ein einzelnes funktionelles gebundenes Protein nicht nur in Eukaryonten sondern auch in Prokaryonten, wie beispielsweise E. coli exprimiert werden kann. Das exprimierte gebundene Protein eignet sich als immundiagnostisches oder immuntherapeutisches Agens.

Claims

1. Verfahren zum direkten Verbinden heterologer Gene, welches die nachfolgenden Schritte umfaßt:

- Einfügen von zwei und mehreren DNA-Sequenzen unterschiedlichen biologischen Ursprungs in einen vom Retrovirus abstammenden DNA-Vektor, wobei

a) jede der DNA-Sequenzen ein zu verbindendes Gen und ein oder mehrere Introns enthält; und wobei

b) das zwischen den beiden Genen in dem Vektor angeordnete DNA-Segment die entsprechenden Spleißstellen-Erkennungssequenzen in Übereinstimmung mit der GT-AG-Regel enthält;

- Einführen des Vektors in eukaryontische Zellen;

- Kultivieren der Zellen;

- Sammeln des Kulturüberstandes, der Virusteilchen aus den Zellen enthält;

- Infizieren einer anderen Menge eukaryontischer Zellen mit den Virusteilchen durch Inberührungbringen der Zellen mit dem Überstand; und

- selektives Gewinnen von DNA, wobei die Gene in den zwei oder mehreren DNA-Sequenzen durch Eliminierung jedweder DNA-Segmente zwischen den Genen und jedweder Introns aufgrund des Spleißens in Übereinstimmung mit der GT-AG-Regel direkt verbunden worden sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die DNA-Sequenzen unterschiedlichen biologischen Ursprungs Gene von warmblütigen Tieren und/oder Menschen enthalten.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Gene unterschiedlichen biologischen Ursprungs Immunglobulingene sind.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei eines der Gene ein Mausimmunglobulingen und das andere ein Humanimmunglobulingen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Mausimmunglobulingen für die variable Region (V-Region) des Immunglobulingens kodiert, wohingegen das Humanimmunglobulingen für die konstante Region (C-Region) des Gens kodiert.

6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Mausimmunglobulingen für die konstante Region (C-Region) des Immunglobulingens kodiert, wohingegen das Humanimmunglobulingen für die variable Region (V-Region) des Gens kodiert.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Vektor, in den zwei oder mehrere Gene mit Introns eingefügt werden, ein Hybridvektor ist, der eine vom Retrovirus abstammende DNA und pBR322 DNA enthält.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Retrovirus ein Kükenretrovirus ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Retrovirus ein Mausretrovirus ist.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eukaryontische Zelle eine Kükenzelle ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die eukaryontische Zelle eine Mauszelle ist.

12. Verfahren zum Erhalten von Hybridimmunglobulinprotein, welches die nachfolgenden Schritte umfaßt:

- Einfügen eines Hybridgens in einen Phagen- oder Plasmidvektor auf derartige Weise, daß es in einem Mikroorganismus exprimiert werden kann;

- Transformieren eines Mikroorganismus mit dem Vektor; und

- Gewinnen eines Hybridimmunglobulinproteins aus einer Kultur des tranformierten Mikroorganismus, wobei das einzufügende Hybridgen eines ist, das durch Verbinden von Immunglobulingenen unterschiedlichen biologischen Ursprungs in Übereinstimmung mit dem in einem der vorhergehenden Ansprüche beschriebenen Verfahren erhalten worden ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der Mikroorganismus E. coli oder Hefe ist.

14. Verwendung eines gemäß einem der Verfahren der Ansprüche 12 oder 13 erhaltenen Hybridimmunglobulinproteins für die Herstellung eines immundiagnostischen oder immuntherapeutischen Mittels.