DE3888086T2

DE3888086T2 - Rekombinantes Geflügelpockenvirus, Expressionsvektoren für heterologische Proteine und davon derivierte Geflügelvakzine.

Info

Publication number: DE3888086T2
Application number: DE3888086T
Authority: DE
Inventors: Robert Drillien; Daniele Spehner
Original assignee: Transgene SA
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1987-10-29
Filing date: 1988-10-26
Publication date: 1994-10-06
Anticipated expiration: 2008-10-27
Also published as: DK603888A; AU2445888A; EP0314569A1; FR2632863B2; JP2766984B2; CA1341263C; FR2632863A2; DK603888D0; DE3888086D1; EP0314569B1; JPH02430A; US5180675A; ES2061708T3; AU633472B2; DK175291B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Geflügelpocken-Viren allgemein als Fowlpox-Viren bezeichnet, und ihre Verwendung zur Herstellung von Impfstoffen oder für den Stoffwechsel von Geflügel nützlichen Proteinen.
Bei den Viren der Familie der Poxviridae, zu der das Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus) gehört, handelt es sich um Viren mit einer Doppelstrang-DNA, die sich in dem Cytoplasma der Zellen vermehren und für einen wichtigen Teil der für ihre Replikation erforderlichen enzymatischen Maschinerie codieren.
Die gereinigte Virus-DNA ist nicht infektiös, weil Enzyme, die mit dem Virus-Teilchen kombiniert sind, erforderlich sind, um seine Expression und seine Replikation zu starten. Sie kann jedoch teilnehmen an Rekombinationsvorgängen mit der DNA eines in die gleiche Zelle eingeführten infektiösen Virus. Diese Entdeckung (Sam und Dumbell, 1981) ist die Basis für die Entwicklung von Vektoren für die Klonierung und Expression von Fremdgenen, die von dem Vakzine-Virus (Kohpocken-Virus) abgeleitet sind (Mackett et al., 1982; Panicali und Paoletti, 1982). Lebende rekombinante Vakzine-Viren ermöglichen die Expression von Fremdgenen und somit die Erzielung von Immunisierungen gegen verschiedene virale oder parasitäre Erkrankungen (Smith et al., 1983; Panicali et al., 1983; Kieny et al., 1984; Chakrabarti et al., 1986; Hu et al., 1986; Kieny et al., 1986).
Obgleich in neueren Publikationen die Verwendung des Fowlpox-Virus als Vektor vorgeschlagen wurde (Brown, 1985 und Taylor et al., 1987), wurden bis heute keine experimentellen Ergebnisse veröffentlicht und die Molekularbiologie des Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus) war noch nicht Gegenstand von näheren Untersuchungen im Gegensatz zur Biologie des Vakzine-Virus (Kuhpocken-Virus), das bereits gründlich untersucht wurde (vgl. die Zusammenfassung von Moss, 1985).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus) als Vektor zur Expression von heterologen Proteinen.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere ein rekombinantes Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus), das aus einem abgeschwächten Stamm, d. h. einem künstlich nichtpathogen gemachten Stamm, stammt und in einem nicht-essentiellen Teil seines Genoms eine DNA-Sequenz, die für das gesamte oder einen Teil eines heterologen Proteins Codiert, sowie die Elemente, die seine Expression durch das Fowlpox-Virus gewährleisten, in einer geeigneten Zelle enthält.
Gemäß einem ihrer Aspekte betrifft die Erfindung die Herstellung eines Impfstoffes, insbesondere eines Impfstoffes, der Geflügel gegen mindestens eine der Viruserkrankungen, durch die es angegriffen werden kann, schützt. In diesem Falle ist das heterologe Protein ein Protein, das eine Immunantwort gegen ein heterologes Virus induziert. Unter den interessanten (vorteilhaften) heterologen Viren können genannt werden das Newcastle-Krankheits-Virus, das infektiöse Bronchitis-Virus und das Marek-Krankheits-Virus.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung des Geflügelpocken-Virus (Fowlpox-Virus) zur Herstellung von Impfstoffen gegen die Morbilli-Viren und sie betrifft somit ein Geflügelpocken-Virus (Fowlpox-Virus), das dadurch gekennzeichnet ist, daß die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das eine Immunantwort gegen ein Morbilli-Virus induziert.
Unter den Viren, die zur Familie der Morbilli-Viren gehören, können insbesondere genannt werden das Masern-Virus, das Carre-Krankheits-Virus, das Rinderpest-Virus und das kleine Wiederkäuerpest-Virus.
Die Untersuchung der verschiedenen Morbilli-Viren hat die immunologischen Beziehungen zwischen den Oberflächenproteinen des Masern-Virus und denjenigen der anderen Morbilli-Viren sowie Sequenz-Homologien zwischen den DNA, die für bestimmte dieser Proteine codieren, gezeigt. Diese Analogien erlauben die Verwendung von Antigenen des Masern-Virus für die Impfung gegen die Carre-Krankheit, die Rinderpest und die kleine Wiederkäuerpest. Es ist auch möglich, Oberflächenantigene, die aus jedem der Morbilli- Viren stammen, in einem homologen oder heterologen Impfsystem zu verwenden.
Die Oberflächenproteine, z. B. das Hämagglutinations- Protein (HA) und das Fusions-Protein (F), sind besonders interessant (vorteilhaft), es können aber auch andere Strukturproteine, z. B. das Nucleoprotein (NP), verwendet werden. Die entsprechenden DNA-Sequenzen können für das Protein in seiner Gesamtlänge oder auch für Fragmente Codieren, die ausreichen, um in vitro die Synthese von Antikörpern, welche das Morbilli-Virus neutralisieren, zu induzieren.
Es ist auch möglich, eine DNA-Sequenz einzusetzen, die für mehrere Proteine oder mehrere Fragmente derselben codiert.
Gemäß einem anderen ihrer Aspekte betrifft die Erfindung die in vivo-Produktion in Geflügel eines Faktors, der in deren Stoffwechsel eingreift, wie z. B. eines Wachstumshormons oder eines Faktors, der dieses induziert (wie der GRF). In diesem Fall ist das heterologe Protein der genannte Faktor und das Geflügelpocken-Virus (Fowlpox-Virus) enthält die Elemente, die seine Expression in vivo gewährleisten. Um diese Produktion zu erzielen, verabreicht man dem Tier ein erfindungsgemäßes Geflügelpocken-Virus, welches das für diesen Faktor codierende Gen enthält, wobei das Virus lebend ist.
Schließlich erlaubt die Erfindung die Herstellung von Proteinen von industriellem Interesse oder therapeutischem Interesse in Zellkulturen, insbesondere in Aviär-Zellen, in vitro, aber auch in vivo bei Tieren.
Die Expression einer Sequenz, die für ein Fremdprotein codiert, durch ein Poxvirus und insbesondere durch das Fowlpox-Virus, umfaßt notwendigerweise die folgenden drei Stufen:
1) die codierende Sequenz muß auf einen Poxvirus-Promotor ausgerichtet sein und in ein nicht-essentielles Segment der DNA des Fowlpox-Virus, der in einem geeigneten Bakterien-Plasmid kloniert wird, inseriert sein;
2) die DNA-Sequenzen des Fowlpox-Virus, die beiderseits der codierenden Sequenz angeordnet sind, erlauben homologe Rekombinationen zwischen dem Plasmid und dem Virus-Genom in einer Empfängerzelle; eine doppelte Rekombination führt zu einem Transfer des DNA-Inserts des Plasmids in das Virus-Genom, in dem es vermehrt und exprimiert wird;
3) die in das Genom des rekombinanten Fowlpox-Virus integrierte DNA-Sequenz muß in einer geeigneten Zelle, welche die Vermehrung (Multiplikation) des Virus unterstützt, exprimiert werden.
Es wurde oben bereits angegeben, daß die Insertion der Fremd-DNA in einen nicht-essentiellen Teil des Genoms des Fowlpox-Virus erfolgen muß, d. h. in einen Teil, der seine Replikation nicht verhindert. Es könnte auch in Betracht gezogen werden, das Fremdgen in das Gen TK einzuführen wie bei den rekombinanten Vakzine-Viren. Da jedoch der Ausgangs-Stamm ein abgeschwächter Stamm ist, ist zu befürchten, daß die Veränderung einer Funktion, die für seine Replikation nützlich ist, ein zu starkes Handicap darstellt und sein Immunisierungs-Vermögen und damit dasjenige des durch das rekombinante Virus exprimierten Fremd-Antigens stark vermindert. Aus diesem Grund wird nach einem charakteristischen Merkmal der vorliegenden Erfindung die fremde DNA-Sequenz in eine Intergen-Zone eingeführt, die nicht für das Fowlpox-Virus codiert. Diese Intergen-Zone liegt vorzugsweise zwischen ORF 7 und 9 des Fragments HindIII von 1,3 K pb des Genoms nach Drillien et al., 1987.
Die Erfindung betrifft außerdem Eukariotenzellen-Kulturen, die man mit dem erfindungsgemäßen rekombinanten Virus infiziert und welche seine Replikation erlauben. Unter den verwendbaren Zellen können insbesondere die Aviär-Zellen genannt werden.
Die Erfindung betrifft außerdem Impfstoffe, die aus diesen rekombinanten Viren hergestellt wurden, in Form von lebenden oder inaktivierten Viren. Die Verfahren zur Herstellung der Impfstoffe sind dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt und brauchen nicht wiederholt zu werden.
Die Erfindung betrifft außerdem lebende rekombinante Viren, deren Verabreichung die in vivo-Produktion eines für den Stoffwechsel von Geflügel nützlichen Faktors während der Virus-Multiplikation erlauben kann.
Schließlich betrifft die Erfindung DNA-Sequenzen, die mindestens ein heterologes Gen des Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus) enthält, unter der Kontrolle eines Poxvirus-Promotors, beiderseits flankiert von dem 3'-Ende des ORF 7 und dem 5'-Ende des ORF 9, sowie Plasmide, welche diese DNA-Sequenzen enthalten.
Diese Plasmide sind insbesondere nützlich im Rahmen eines Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen rekombinanten Virus, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Kultur von kompetenten Zellen mit der DNA eines erfindungsgemäßen Plasmids transfektiert, wobei die genannte Kultur vorher mit einem Fowlpox-Virus infiziert worden ist, das gegebenenfalls ein Selektionselement enthält.
Weitere Charakteristika und Vorteile der Erfindung gehen aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung hervor. Die folgenden vier Figuren erläutern die Beispiele:
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Plasmids pTG1170 und des Inserts, welches den Promotor 7,5 Kd trägt, der in den "Polylinker" eingeführt worden ist, um das pTG1171 zu ergeben;
Fig. 2 ist eine Photographie einer Hühner-Fibroblasten- Kulturschale, welche die Bereiche (Zonen) des rekombinanten Fowlpox-Virus zeigen, welches die β-Galactosidase exprimiert und die in Gegenwart von X-Gal blau gefärbt erscheinen;
Fig. 3 zeigt den Aufbau von zwei Vektoren, welche den Transfer des Gens, das für das Protein F des Masern-Virus codiert, in das Genom des Fowlpox-Virus erlaubt.
Die DNA-Sequenzen des Genoms des Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus) sind dargestellt durch Doppelstrich-Kreisbögen, bei denen angegeben ist, daß sie je nach Leseraster entweder F&sub6;-F&sub7;, oder F&sub9; enthalten. Der Einfachstrich-Kreisbogen stellt den Bakterienvektor PolyII dar. Der Promotor P7,5 wird schematisch dargestellt durch einen dicken Pfeil, der die Richtung der Transkription anzeigt. Die für die β-Galactosidase von E. coli und das Protein F des Masern-Virus codierenden Gene werden bezeichnet als lac Z bzw. als F und ihre normale Leserichtung ist die gleiche wie diejenige des Promotors P7,5 der stromabwärts jedes Gens angeordnet ist. Die mit B&sup0; bezeichneten Stellen entsprechen der Stelle einer Ligation zwischen einer Stelle BglII und einer Stelle BamHI.
Fig. 4 zeigt die Synthese des Proteins F des Masern- Virus in Zellen, die durch das Virus FPV3113 infiziert sind.
Die Proteine der Hühnerzellen, die durch den wilden Stamm des Fowlpox-Virus infiziert worden sind (Bahn T), oder drei Isolate des rekombinanten Stammes FPV3113 (Bahnen 1, 2 und 3) wurden immunpräzipitiert mit einem Antimasern-Meerschweinchen-Serum, dann wurden sie durch Elektrophorese an einem Polyacrylamid-Gel analysiert. Die Autoradiographie des getrockneten Gels ist dargestellt. Die unterschiedlichen Formen des Proteins F (F&sub0;, F&sub1;, F&sub2;) sind durch Pfeile gekennzeichnet.

Beispiel 1

Selektion und Charakterisierung von wärmeempfindlichen Mutanten (ts) des Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus)

Man verwendet einen Impfstamm des Hühnermasern-Virus oder des Fowlpox-Virus (Geflügelpocken-Virus), beispielsweise den Impfstoff, wie er von Les Laboratoires Salsbury produziert wird (Poxine®, Laboratoire Salsbury, 56 Rue Delprier, 37000 TOURS, Frankreich).
Die Vermehrung (Multiplikation) des Virus wird bei drei Temperaturen gemessen:
Gehalt nach 6 Tagen:
33ºC 4,1·10&sup5; ufp/ml
37ºC 4,1·10&sup5; ufp/ml
39,5ºC 4,2·10&sup5; ufp/ml Das nicht-mutierte Virus vermehrt sich ebenso wirksam bei den drei genannten Temperaturen.
Ein Virus-Ausgangsmaterial, das kloniert und verstärkt worden ist bei 39,5ºC wird mit 10 oder 20 ug Nitrosoguanidin pro ml behandelt. Nach dieser mutagenen Behandlung wird das Virus in einer für die Erzielung gut isolierter Bereiche geeigneten Verdünnung auf Kulturen von Hühnerembryo-Fibroblasten verteilt (ausgebreitet). Die Kulturen werden bei 33ºC (zulässige Temperatur) sechs oder sieben Tage lang inkubiert, dann mit Neutralrot gefärbt, um die Virus-Bereiche (-Zonen) sichtbar zu machen.
Die Kulturen werden anschließend 2 Tage lang bei 39,5ºC (restriktrive Temperatur) inkubiert. Die Bereiche (Zonen), deren Größe nicht zugenommen hat, werden als wärmeempfindlich angesehen. Die Viren einiger Bereiche (Zonen) werden entnommen und bei 33ºC verstärkt, dann bei 33 und 39,5ºC erneut titriert, um ihren wärmeempfindlichen Charakter ts zu bestätigen. In der folgenden Tabelle sind die bei zwei Temperaturen erhaltenen Gehalte (Titer) angegeben: Gehalt (Titer) bei: 33ºC 39,5ºC Vergleichs-Fowlpox-Virus Mutante ts1

Beispiel 2

Optimierung der Rekombinations-Bedingungen zwischen den mutierten Viren ts und der gereinigten DNA eines nicht-mutierten Virus

Unter restriktiven Bedingungen vermehren sich die Mutanten ts nicht mehr.
Die gereinigte DNA der Viren der Familie der Poxviridae ist nicht infektiös.
Wenn die Einführung eines Virus ts und einer gereinigten DNA in die gleiche Zelle zu einer Vermehrung des Virus führt, resultiert diese aus einer Komplementierung oder Rekombination in vivo zwischen den beiden Genomen.
Man infiziert Hühnerembryonen-Fibroblasten-Rasen mit den Viren ts (4·10&sup4; ufp/10&sup6; Zellen). Nach 1-stündiger Adsorption erneuert man die Kulturen in einem frischen Medium und inkubiert sie 2 h lang bei der zulässigen Temperatur (33-37ºC).
Anschließend eliminiert man das Medium und adsorbiert die gereinigte DNA des nicht-mutierten Virus in Form eines Calciumphosphat-Niederschlags (1 ug DNA in 5 ul Puffer für 4 Kulturschalen).
Nach 1-stündiger Adsorption erneuert man in einem frischen Medium und inkubiert 2 h lang bei der nicht-zulässigen Temperatur (39,5ºC), dann führt man eine Schockbehandlung mit Glycerin (10%) durch.
Anschließend werden die Kulturen erneut 5 Tage lang bei 39,5ºC inkubiert.
Die Virus-Bereiche (-Zonen) werden zur Hälfte direkt auf den Schalen, auf denen die Manipulation vorgenommen worden ist, ausgezählt und die Hälfte nach der Verstärkung (d. h. nach einem Einfrieren der ersten Schalen gefolgt von einem zweiten Vermehrungszyklus). Anzahl der Virus-Zonen ohne Verstärkung nach der Verstärkung ohne DNA
Die Erfahrung zeigt, daß die gereinigte DNA des wilden Fowlpox-Virus durch die Mutanten ts reaktiviert werden kann unter Bildung einer infektiösen Vorstufe.
Die Mutante ts1 wurde für die folgenden Versuche zurückbehalten.

Beispiel 3

Konstruktion eines Vektors für den Transfer einer heterologen DNA in das Fowlpox-Virus

Um eine Sequenz von Fremd-DNA in das Genom eines Virus zu transferieren, muß diese Sequenz inmitten der intakten Sequenzen des Virus so integriert werden, daß eine doppelte homologe Rekombinantion möglich ist.
Die Fremd-DNA muß in eine nicht-essentielle Zone des Virus so inseriert werden, daß ihre Vermehrung (Multiplikation) nicht verhindert wird.
Es wurde ein Vektor konstruiert, um die Insertion einer Fremd-DNA in eine Intergen-Zone, die nicht für das Fowlpox-Virus codiert, zu begünstigen.

a) Insertion eines DNA-Fragments des Fowlpox-Virus in ein Bakterien-Plasmid: Konstruktion von TG1170

Ein Fragment der DNA des Fowlpox-Virus, die eine beträchtliche Homologie mit der DNA des Vakzine-Virus aufweist, wurde von Drillien et al., 1987, beschrieben.
Dieses Fragment (homolog zu dem Fragment HindIII J des Vakzine-Virus) trägt fünf offene Lese-Sequenzen (ORF) und unterscheidet sich von dem Vakzine-Virus durch das Fehlen des Gens F8, das durch eine nicht-codierende Intergen-Zone aus 32 Basenpaaren ersetzt ist. Vakzine-Virus Fowlpox-Virus
Diese Intergen-Zone wurde als Insertionsstelle für die Fremd-DNA ausgewählt.
Ein großes DNA-Fragment, das diese Zone umgibt, wurde zurückgewonnen, um als homologe Sequenz zu dienen, welche die Rekombination und die Integration in das Virus-Genom des Fowlpox-Virus erlaubt. Dieses Fragment wurde erhalten nach der Digestion durch EcoRI und PstI. Die Stelle EcoRI ist stromaufwärts von ORF 6 angeordnet und die Stelle PstI ist in ORF 9 (vgl. das obige Schema) angeordnet. Das Fragment EcoRI-PstI wurde in einen Vektor M13TG131 integriert (Kieny et al., 1983), wobei man M13TG188 erhielt.
Die Einführung in M13 erlaubt die Durchführung einer lokalisierten Mutagenese, um Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme einzuführen, welche die Insertion der Fremd-DNA erlauben.
Mit Hilfe des folgenden Synthese-Oligonucleotids wurde in dem Intergen-Bereich von 32 pb drei Stellen geschaffen: Xhol, BamHI und EcoRI:
5' TTAAAAAGGAATTGACTCGAGGGATCCGAATTCAAGAAAATATTTAT 3'
Die Konstruktion, die das synthetische Insert trägt, wird als M13TG195 bezeichnet. Die Anwesenheit der Restriktionsstellen wurde mit den entsprechenden Enzymen überprüft (verifiziert).
Die DNA-Sequenz des mutierten Fowlpox-Virus wurde aus M13TG195 zurückgewonnen in Form des Fragments BglII-PstI (die Stelle BglII ist am Beginn von ORF 6 angeordnet, Drillien et al., 1987) und in einen Klonierungsvektor eingeführt, der von pML2, das einen synthetischen Adapter mit mehreren Restriktionsstellen trägt, dem von Lathe et al., 1987 beschriebenen PolyII, abgeleitet ist.
Die Insertion des Fragments BglII-PstI des Fowlpox- Virus in den durch BamHI und PstI geöffneten Vektor PolyII ergibt das Plasmid pTG1170, das in der Fig. 1 schematisch dargestellt ist.

b) Insertion eines Poxvirus-Promotors in den Vektor pTG1170

Um die Expression eines Fremdgens durch ein Pox-Virus zu erzielen, ist es erforderlich, dieses Gen unter die Kontrolle eines Poxvirus-Promotors zu bringen.
In einer ersten Stufe verwendet man einen gut charakterisierten Promotor des Vakzine-Virus, den Promotor des Gens des Proteins 7,5 K, abgekürzt als "Promotor 7,5 K" bezeichnet. In den Vektor pTG1170 führt man den Promotor 7,5 K des Vakzine-Virus ein, der in Form des Fragments SalI-EcoRI aus einem von Kieny et al., 1984, beschriebenen Vektor M13TG7,5K gewonnen worden ist.
Diese Promotor-Sequenz wurde zwischen die Stellen XhoI und EcoRI des synthetischen Adapters von pTG1170 eingeführt (vgl. Fig. 1).
Die resultierende Konstruktion pTG1171 trägt nun den Promotor 7,5 K, der zwischen ORF 6-7 und ORF 9 des Fowlpox-Virus inseriert worden ist, mit einer Stelle BamHI (die aus der Sequenz P7,5 K stammt) und EcoRI unmittelbar stromabwärts.

Beispiel 4

Insertion eines Fremd-Gens in den Vektor pTG1171

Es wurde ein Modellgen verwendet, um die Nützlichkeit des Vektors und des Rekombinanten-Selektions-Systems des Fowlpox-Virus zu demonstrieren: das Gen der β-Galactosidase von E. coli. Dieses Gen wurde ausgewählt, weil seine wirksame Expression leicht nachgewiesen werden kann durch Addition von X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), das unter der Einwirkung der β-Galactosidase eine Blauverfärbung mit sich bringt. Das für die β-Galactosidase von E. coli codierende Gen lacZ kann beispielsweise aus dem Plasmid pCH110 gewonnen werden (Hall et al., 1983). Das Gen lacZ wurde mittels BamHI und HindIII ausgeschnitten und in den Klonierungsvektor POLYII (der weiter oben angegeben ist) inseriert, dann in Form des Fragments BglII-BamHI wieder entnommen, um in das durch BamHI geöffnete pTG1171 inseriert zu werden, und mit Phosphatase behandelt.
Die Konstruktion, die das Gen lacZ stromabwärts von dem Promotor 7,5 K trägt, wird als pTG1177 bezeichnet.

Beispiel 5

Expression eines Fremd-Gens durch ein rekombinantes Fowlpox-Virus

Die DNA des Plasmids pTG11777 (100 ng/10&sup6; Zellen) wurde in Hühnerembryonenzellen transfektiert, die vorher mit dem Fowlpox-Virus ts1 nach der in Beispiel 2 beschriebenen Versuchsanordnung infiziert worden waren.
Nach 5-tägiger Inkubation bei 39,5ºC werden die rekombinanten Viren geerntet (gesammelt), nachdem die Zellen durch Einfrieren lysiert worden sind.
Die Viren werden Hühnerembryonen-Fibroblasten-Kulturen in einem Nährmedium zugegeben. Nach 5 Tagen werden die Virus-Zonen mit X-Gal (Lösung mit 30 mg/ml, verdünnt im Verhältnis 1 : 100 in einem PBS + 1% Agarose-Medium) nachgewiesen.
Die Virus-Zonen färben sich blau, was die Anwesenheit von funktioneller β-Galactosidase anzeigt.

Beispiel 6

Konstruktion eines zweiten Vektors für den Transfer von heterologer DNA in das Fowlpox-Virus

a) Es wurde ein anderer Vektor, der den Transfer von heterologer DNA in das Fowlpox-Virus erlaubt, konstruiert unter Aufrechterhaltung eines größeren Intergen-Bereiches zwischen ORF F7 und F9. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde eine erste lokale Mutagenese an dem Phagen M13TG188 (wie er in Beispiel 3 beschrieben ist) mit dem folgenden Synthese-Oligonucleotid durchgeführt:
5' AACAACCTAATATCACTATAGGATCCTTGTTAAAAAGGAAT 3'
Dies ergibt den Phagen M13TG2123 und als Ergebnis wird eine Stelle BamHI in den 3'-Abschnitt eingeführt, der für ORF F7 codiert. Eine zweite Mutagenese wurde anschließend mit M13TG2123 mit dem folgenden Oligonucleotid durchgeführt:
5' CCTAATATCACTACTGAAGCGCAACTAGGATCCTTGTTAA 3'
In dem resultierenden Phagen M13TG2125 wird der Intergen-Abstand zwischen ORF F7 und ORF F9 durch etwa 15 Nucleotide vergrößert und die in 3'-Stellung des ORF F7 angeordneten Codons werden durch äquivalente Codons ersetzt, die für die gleichen Aminosäuren codieren.
Die DNA-Sequenz des mutierten Fowlpox-Virus wurde aus M13TG2125 in Form des Fragments BglII-PstI zurückgewannen und in den Vektor POLYII eingeführt wie in Beispiel 3 unter Bildung des Plasmids pTG2134.

b) Insertion eines Pox-Virus-Promotors in den Vektor pTG2134

Der Promotor des Gens des Proteins 7,5 K des Vakzine- Virus, das in Form des Fragments BglII-BamHI aus einem Vektor M13TG2119 zurückgewonnen worden ist (abgeleitet von M13TG7,5K, wie in Beispiel 3 beschrieben) wurde in die Stelle BamHI des Plasmids pTG2134 inseriert. Dies führte zur Bildung von zwei Vektoren pTG2135 und pTG2136, die sich durch die Orientierung des Promotors voneinander unterscheiden. In dem Plasmid pTG2135 ist der Promotor in gleichem Sinne orientiert wie die ORF F7 und F9, während in dem Plasmid pTG2136 die Orientierung umgekehrt ist.

Beispiel 7

Insertion eines Fremd-Gens in die Vektoren pTG2135 und pTG2136

Wie in Beispiel 4 wurde das Gen der β-Galactosidase in Form eines Fragments BglII-BamHI in die vorher mit BamHI geöffneten Vektoren pTG2135 und pTG2136 inseriert und mit Phosphatase behandelt. Diese Manipulationen führten zur Bildung des Vektors pTG2137, in den das Gen der β- Galactosidase in der gleichen Richtung orientiert ist wie die Gene der ORF F7 und F9 und des Vektors pTG 2138, in dem die Orientierung des Gens der β-Galactosidase umgekehrt ist.
Die DNA von pTG2137 wurde in Hühnerembryonen-Zellen transfektiert, die durch das Fowlpox-Virus ts1 infiziert worden waren wie in Beispiel 5.
5 Tage später wurden Zonen von rekombinanten Viren beobachtet, die sich nach der Zugabe von X-Gal blau färbten.

Beispiel 8

Insertion eines von dem Gen der β-Galactosidase verschiedenen Fremd-Gens in das Genom des Fowlpox-Virus und Expression in Zellen, die durch rekombinante Fowlpox-Viren infiziert worden sind

A. Konstruktion der rekombinanten Viren

Die Konstruktion eines Vektors (pTG2137), der den Transfer des Gens der β-Galactosidase in das Genom des Fowlpox-Virus und die Erkennung der rekombinanten Viren aufgrund der Blaufärbung der Zonen des Fowlpox-Virus in Gegenwart eines chromogenen Substrats (X-Gal) erlaubt, ist in dem Hauptpatent beschrieben. Man kann darüber hinaus für die Integration eines zweiten Gens in das Genom des Fowlpox-Virus selektionieren, ohne daß dadurch dem Virus ein leicht nachweisbarer neuer Phänotypus verliehen wird. Dies wird erläutert für den Fall des Gens, das für das Protein F des Masern-Virus codiert. Die Stufen sind die folgenden:
In einer ersten Stufe wurde ein zweiter Promotor P7,5 dem Plasmid pTG2137 zugefügt, um die Transkription eines zweiten Gens unabhängig von der β-Galactosidase zu gewährleisten. Der Promotor P7,5 wurde in Form eines Fragments BglII-BamHI erhalten, das aus dem weiter oben beschriebenen Phagen M13TG2119 ausgeschnitten wurde. Der Promotor P7,5 wurde stromabwärts von dem Gen β-gal in die Stelle BamHI des Vektors pTG2137 entweder in der gleichen Orientierung wie der erste Promotor P7,5 unter Bildung des Plasmids pTG2149 oder in entgegengesetzter Orientierung unter Bildung des Plasmids pTG2150 integriert.
Anschließend wurde die cDNA, die für das Gen F des Masern-Virus codiert, stromabwärts von dem neuen Promotor P7,5 in die beiden Vektoren pTG2149 und pTG2150 inseriert. Zunächst wurde die cDNA, die für den N-terminalen Abschnitt des Proteins F codiert, durch Schneiden von pTG1172 mit den Enzymen BglII und BamHI ausgeschnitten und das erhaltene Fragment wurde in die Stelle BamHI von pTG2149 oder pTG2150 inseriert unter Berücksichtigung der korrekten Transkriptionsrichtung des Gens F, bezogen auf den Promotor P7,5, wobei man jeweils die Plasmide pTG2192 und pTG2193 erhielt.
Die für den C-terminalen Abschnitt des Gens F codierende cDNA wurde anschließend aus pTG1173 isoliert durch Schneiden mit dem Enzym BamHI und das Fragment wurde dem vorher mit dem gleichen Enzym geschnittenen pTG2192 hinzugefügt zur Wiederherstellung eines intakten Gens F. Der C-terminale Abschnitt des Gens F in dem Plasmid pTG1173 enthält einen POLY A-Bereich, der in dem Phagen M13TG2143 gelöscht worden war. Letzterer liefert den C-terminalen Abschnitt des Gens F in Form eines Fragments BglII-BamHI, das dem durch BamHI geschnittenen Plasmid pTG2193 zugefügt wurde. Das bei der vorhergehenden Ligation gebildete Plasmid wird als pTG3113 bezeichnet.
Die Plasmide pTG2195 und pTG3113 enthalten somit jeweils das vollständige Gen F des Masern-Virus unter der Kontrolle des Promotors P7,5 entweder in der gleichen Orientierung wie der erste Promotor P7,5, der die Expression des Gens der β-Galactosidase kontrolliert (pTG2195) oder in der entgegengesetzten Richtung. Die Gesamtheit der durchgeführten Klonierungen, die rekombinante Plasmide erzeugt haben, ist in der Fig. 3 zusammengefaßt.
Die rekombinanten Plasmide pTG2195 und pTG3113 dienen dem Transfer des Gens der β-Galactosidase und des Gens des Proteins F in das Genom des Fowlpox-Virus nach den in den Beispielen 2 und 5 beschriebenen Verfahren.
Zonen des rekombinanten Fowlpox-Virus, als FPV2195 und FPV3113 bezeichnet, wurde nachgewiesen durch ihre blaue Farbe in Gegenwart von X-gal. Das in den Zonen enthaltene Virus wurde daraus gewonnen und durch Infektion von Hühnerembryonen-Zellen verstärkt, dann wieder erneut verteilt. Blaue Zonen wurden nachgewiesen und das vorstehend beschriebene Verfahren wurde wiederholt.
Diese Technik der aufeinanderfolgenden Klonierung zeigt, daß das Virus FPV3113, nachdem es von dem nicht-rekombinanten Virus befreit worden ist, das es anfänglich verunreinigte, einen stabilen β-Galactosidase-Phänotypus aufweist. Dagegen erweist sich das Virus FPV2195, das den gleichen aufeinanderfolgenden Klonierungszyklen unterworfen worden ist, als instabil, d. h. daß eine isolierte blaue Zone etwa 2% farblose Zonen (Bereiche) ergibt, die nicht in der Lage sind, für β-Galactosidase zu codieren. Das zu Beginn isolierte Virus FPV2195 hat die Neigung, das Gen β-gal zu segregieren unter Konservierung des Gens, das für-das Protein F codiert; das Virus, das daraus resultiert, wird als FPV2195 β-galt bezeichnet. Der Verlust des Gens β-gal tritt auf wahrscheinlich als Folge von inter- oder intramolekularen Rekombinationsereignissen zwischen den beiden Promotoren p7,5, die in direkter Wiederholung, bezogen auf das Gen β-gal, angeordnet sind. Dieses Verfahren bietet den Vorteil, daß es die anfängliche Selektion zur Integration eines gewählten Gens (hier das Gen F) aufgrund des Markers β-gal, der physisch damit kombiniert ist, danach die Eliminierung des Markers durch einen natürlichen Rekombinationsmechanismus des Virus und schließlich die eventuelle Wiederverwendung des Markers zur Insertion eines anderen Gens oder des gleichen Gens in einen anderen Bereich des Genoms, erlaubt.

B. Expression des Proteins F in Zellen, die mit FPV2195 β-gal&supmin; und PFV3113 infiziert sind

Hühnerembryonen-Zellen wurden infiziert mit etwa 1 ufp FPV3113, FPV2195 β-gal&supmin; oder FPV vom Wild-Typ pro Zelle. Nach 40-stündiger Infizierung wurden die Zellen 4 h lang mit Methionin³&sup5;S markiert, dann mit einem Immunopräzipitations-Puffer lysiert. Das in den mit den rekombinanten infizierten Zellenlysaten enthaltene Protein F wurde mit einem polyklonalen Meerschweinchen-Serum, das gegen die Gesamtheit der Proteine des Masern-Virus gerichtet war, in Gegenwart des Proteins A von Staphylococcus aureus, das an Sepharose fixiert war, immunpräzipitiert. Die immunpräzipitierten Proteine wurden an einem Polyacrylamid-Gel in Gegenwart von SDS analysiert; das getrocknete Gel wurde einer Autoradiographie unterworfen. Die für das rekombinante FPV3113 dargestellten Ergebnisse (Fig. 4) zeigen die Anwesenheit des Primärprodukts der Translation der mRNA, die dem Gen F entspricht (Fº), sowie die Spaltungsprodukte F&sub1; und F&sub2;.

Literaturhinweise

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Claims

1. Rekombinantes Geflügelpocken-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem abgeschwächten Stamm des Geflügelpocken-Virus stammt und in einer nicht-codierenden und nicht-essentiellen Intergen-Zone des Geflügelpocken-Virus eine DNA-Sequenz aufweist, die codiert für das gesamte oder einen Teil eines heterologen Proteins im Geflügelpocken-Virus sowie die Elemente, welche die Expression dieses Proteins in eine durch das genannte rekombinante Virus infizierte Zelle gewährleisten können.

2. Geflügelpocken-Virus nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht-codierende Intergen-Zone die Zone ist, die zwischen den ORF 7 und 9 des HindIII-Fragments mit 1,3 K Basenpaaren der Virus-DNA angeordnet ist.

3. Geflügelpocken-Virus nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für das gesamte oder einen Teil des heterologen Proteins codiert, zwischen den Translations-Schlußcodon von ORF 7 und den Intergen-Bereich mit 32 Basenpaaren, der unmittelbar stromaufwärts von ORF 9 angeordnet ist, inseriert ist.

4. Geflügelpocken-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinante Virus aus einem Vaccine-Stamm des Geflügelpocken-Virus stammt.

5. Geflügelpocken-Virus nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte rekombinante Virus aus einem wärmeempfindlichen Stamm des Geflügelpocken-Virus stammt.

6. Geflügelpocken-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Gen aufweist, das für einen Selektions-Marker codiert, der in eine Zelle exprimiert, die durch das genannte rekombinante Virus infiziert ist.

7. Geflügelpocken-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das eine Immun-Antwort gegen ein heterologes Virus induziert.

8. Geflügelpocken-Virus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte heterologe Virus ausgewählt wird unter dem Newcastle-Krankheits-Virus, dem infektiösen Bronchitis-Virus und dem Marek-Krankheits-Virus.

9. Geflügelpocken-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 57, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für ein Protein codiert, das eine Immun-Antwort gegen ein Morbilli-Virus induziert.

10. Geflügelpocken-Virus nach Anspruch 9, dadurch gegekennzeichnet, daß das Morbilli-Virus ausgewählt wird aus dem Masern-Virus, dem Carr -Krankheits-Virus, dem Rinderpest-Virus und dem kleinen Wiederkäuerpest-Virus.

11. Geflügelpocken-Virus nach Anspruch 10, dadurch gegekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für das gesamte oder mindestens einen Teil eines Proteins mit der Struktur des Masern-Virus codiert.

12. Geflügelpocken-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für einen Faktor codiert, der in den Geflügel-Stoffwechsel eingreift.

13. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kultur von kompetenten Zellen mit der DNA eines Plasmids transformiert, das mindestens ein heterologes Gen im Geflügelpocken-Virus aufweist, unter der Kontrolle eines Geflügelpocken-Virus-Promotors, insbesondere des Promotors des Proteins 7,5 K des Vaccine-Virus, beiderseits flankiert von dem 3'-Ende von ORF 7 und dem 5'-Ende von ORF 9, wobei die Kultur vorher mit einem Geflügelpocken-Virus infiziert worden ist.

14. Eukarioten-Zellenkultur, die durch ein rekombinantes Geflügelpocken-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 infiziert ist.

15. Zellkultur nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich dabei um Aviär-Zellen handelt.

16. Vaccine (Impfstoff), dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Geflügelpocken-Virus nach einem Ansprüche 1 bis 12 enthält.

17. Vaccine (Impfstoff), dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Geflügelpocken-Virus enthält, das durch Replikation in den Zellenkulturen nach einem der Ansprüche 14 oder 15 erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Geflügelpocken-Virus um ein lebendes Virus handelt.

18. Antiserum, das Antikörper enthält, die gegen das Geflügelpocken-Virus nach einem der Ansprüche 1 bis 12 gerichtet sind.

19. Verfahren zur Herstellung eines industriell oder therapeutisch interessanten Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Eukarioten-Zelle nach den Ansprüchen 14 oder 15 züchtet und das erhaltene Protein gewinnt (abtrennt).