DE3006789A1

DE3006789A1 - Verfahren und enzymzusammensetzung zur hydrolyse von glycerinestern

Info

Publication number: DE3006789A1
Application number: DE19803006789
Authority: DE
Inventors: Paul Thomas Nix; Janet Marie Santoro; Joyce Ellen Stephens
Original assignee: Millipore Corp
Current assignee: EMD Millipore Corp
Priority date: 1979-02-22
Filing date: 1980-02-22
Publication date: 1980-09-04
Also published as: JPS5728276B2; JPS55159794A; FR2449726A1

Description

MILLIPORE CORPORATION Bedford, Massachusetts V.St.A.

Verfahren und Enzymzusammensetzung zur Hydrolyse von Glycerinestern

Die Erfindung betrifft die Bestimmung von Glycerinestern, insbesondere die klinische in-vitro-Bestimmung von Glycerinestern in Körperflüssigkeiten, und besonders die Hydrolyse von Glyceriden zu Glycerin zu analytischen Zwecken.

Die Glyceridkonzentration und insbesondere die Konzentration von Triglyceriden in menschlichen und tierischen Körperflüssigkeiten ist bekanntlich für eine Anzahl pathologischer Verhältnisse signifikant, weshalb die entsprechende Bestimmung zu den üblichen Verfahren der klinischen Chemie gehört. Dabei werden die Glyceride generell hydrolysiert und das so freigesetzte Glycerin nach verschiedenen Verfahren bestimmt. Zur Hydrolyse sind sowohl chemische als auch enzymatisch^ Verfahrensweisen be-

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kannt, wobei die enzymatischen Verfahren aufgrund ihrer Sicherheit, Spezifität und leichten Anwendbarkeit allgemein bevorzugt werden.

Als Enzyme wurden bereits mehrere, jeweils aus einer einzigen Quelle stammende Lipasen angegeben, beispielsweise Lipase aus Rhizopus arrhizus (im folgenden kurz als LIPR bezeichnet) (vgl. die US-PS 3 759 793) sowie Lipase aus Pseudomonas fluorescens (im folgenden kurz als LPL bezeichnet) (vgl. Clinica Chimica Acta 8J (1977) 125-130).

Derartige aus einer einzigen Quelle stammende Lipasen führen jedoch entweder nicht zu einer vollständigen Hydrolyse der Glyceride oder erlauben eine vollständige Hydrolyse lediglich unter eingeschränkten Bedingungen oder unter Verwendung unpraktikabel großer Mengen an Enzym bzw. nur während ungeeignet langer Reaktionszeiten. Aus diesem Grund wurden bisher aus einer einzigen Quelle stammende Lipasen für diesen Zweck nicht eingesetzt. Anstelle davon wurden Enzymgemische angewandt, beispielsweise Gemische von LIPR mit Protease (US-PS 3 703 591), Gemische von LIPR mit Carboxylesterase (US-PS 3 862 009) sowie Gemische von LIPR mit Lipase aus Candida cylindracea (US-PS 4 056 442) .

Derartige Gemische sind jedoch ebenfalls nur beschränkt 'anwendbar: Proteasen begrenzen die Stabilität entsprechender Reagentien, da sie gegebenenfalls Proteine im Reagens oder der Probe angreifen; Carboxylesterasen weisen andererseits den Nachteil auf, daß sie nur schwierig zu reinigen sind; Kombinationen von LIPR mit Lipasen von Candida cyclindracea werden andererseits

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durch Netzmittel, wie sie üblicherweise bei Reagentien, Proben oder Kontrollproben, insbesondere in automatisch, kontinuierlich arbeitenden Analysatoren (zB Continuousflow-Analyzer) _f angewandt werden, inhibiert.

Derartige mit einem kontinuierlichen Flüssigkeitsstrom arbeitende automatische Analysatoren bringen erhebliche Einschränkungen hinsichtlich der Verfahrensbedingungen für die Hydrolyse von Triglyceriden mit sich. Häufig enthalten die Eichproben und Standards grenzflächenaktive Mittel, wobei zugleich kleine Probenmengen und kurze Reaktionszeiten angewandt werden. So wird beispielsweise beim Gerät Technicon SMAC eine feste Inkubationszeit von 2,5 min bei 37 ⁰C angewandt, wobei grenzflächenaktive Mittel bei den zur Eichung verwendeten Standards zur Anwendung kommen, die zur Inhibierung einiger Lipasen und beispielsweise des in der US-PS 4 056 442 angegebenen Enzymgemischs führen.

Anschließend an die Hydrolyse der Triglyceride kann das freigesetzte Glycerin in geeigneter Weise bestimmt werden, üblicherweise wird hierfür das Verfahren unter Verwendung von Glycerinkinase angewandt, das in zahlreichen Veröffentlichungen beschrieben ist, beispielsweise in den US-PSen 3 703 591, 3 759 793 und 4 056 442 sowie in der Firmenschrift 'Technicon Method No. SG4-OO23PC6¹ der Technicon Instruments Corporation von März 1976; auf diese Veröffentlichungen wird hier Bezug genommen.

Bei einer dieser Verfahrensweisen lassen sich die zur Bestimmung herangezogenen Reaktionen wie folgt zusammenfassen:

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m · ι -j enzymatische Hydrolyse „, . „„„ Triglyceride - - - > Glycerin + FFS

Glycerin + ATP — > GP + ADP

ADP + PEP $ ATP + Pyruvat

Pyruvat + NADH ^°-^ » Lactat + NAD;

dabei bedeuten:

FFS = freie Fettsäuren

ATP = Adenosintriphosphat

GK = Glycerinkinase

GP = Glycerinphosphat

ADP = Adenosindiphosphat

PEP = Phosphorenolbrenztraubensäure

LDH = Lactatdehydrogenase

PK = Pyruvätkinase

NAD = Nicotinamid-adenin-dinucleotid (oxidierte Form) und

NADH = Nicotinamid-adenin-dinucleotid (reduzierte Form)

NADH besitzt eine Absorption bei 340 nm, während NAD keine entsprechende Absorption aufweist; die Abnahme der optischen Absorption bei 340 nm wird gemessen und als Maß für die Konzentration an Triglyceriden in der Probe geeicht.

Verfahren, bei denen die Abnahme von NAD über andere Enzymreaktionen ermittelt wird, sind ebenfalls bekannt und beispielsweise in der US-PS 4 056 442 sowie in Clinica Chimica Acta _81_ (1977) 125 bis 130 beschrieben. Auch auf diese Druckschriften wird hier Bezug genommen.

Erfindungsgemäß wurde ein neuartiges Gemisch von Lipasen entwickelt, die stabil sind und Triglyceride in

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Körperflüssigkeiten in kurzen Reaktionszeiten, wie sie in mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Analysengeräten nur vorliegen, sowie in Gegenwart von grenzflächenaktiven Mitteln vollständig hydrolysieren. Dieses Gemisch läßt sich sowohl für manuelle Einzelbestimmungen als auch bei beliebigen anderen Verfahrensweisen einsetzen und eignet sich insbesondere zur schnellen automatischen Bestimmung in kontinuierlich arbeitenden Analysengeräten.

Anschließend an die hiermit vorgenommene Hydrolyse kann die Bestimmung des freigesetzten Glycerins nach irgendeiner geeigneten Verfahrensweise erfolgen, beispielsweise nach dem oben angegebenen Verfahren unter Verwendung von Glycerinkinase und NADH/NAD.

Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung enthält ein Gemisch von Lipase aus Rhizopus arrhizus (LIPR) und aus Lipase von Pseudomonas fluorescens (LPL) im Verhältnis von etwa 2:1 bis etwa 10:1 Einheiten/ml der betreffenden Lipasen, vorzugsweise im Verhältnis von etwa 4:1 bis 10:1 und noch günstiger im Verhältnis von etwa 5:1.

Das Gemisch sollte entsprechend etwa 65 bis 91 Einheiten LIPR und 35 bis 9 Einheiten LPL pro 100 Einheiten an insgesamt vorliegender Lipase enthalten.

Zur Hydrolyse einer Probe innerhalb der verfügbaren Reaktionszeit muß eine ausreichende Gesamtmenge an Lipase eingesetzt werden. Zur raschen Hydrolyse von etwa 20 _/U1 einer Testprobe, die bis zu 5 g/l oder mehr Triglyceride enthält, sollten etwa 150 Einheiten Lipase-Gesamtmenge eingesetzt werden.

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Ein Gemisch von 250 U/ml Lipase von Khizopus arrhizus und 50 U/ml Lipase von Pseudomonas fluorescens ist dabei bevorzugt. Das Gemisch sollte ferner auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 7,0 und noch bevorzugter zwischen 6,4 und 6,5 gepuffert sein und wird ferner vorzugsweise aus Stabilitätsgründen lyophilisiert bzw- als trockenes Pulver hergestellt.

Lipase aus Rhizopus arrhizus (E. C. 3.1.1.3) ist in den oben genannten Publikationen beschrieben; ein Verfahren zu ihrer Herstellung ist in der US-PS 3 513 angegeben.

Lipase aus Pseudomonas fluorescens sowie Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der US-PS 3 431 175 sowie in Clinica Chimica Acta _8j[ (1977) 125 - 130 angegeben.

Beide Enzyme sind im Handel erhältlich; die entsprechenden Mikroorganismen sind bei anerkannten Hinterlegungsstellen hinterlegt.

Als Einheit der Lipaseaktivität wird im Rahmen der" Erfindung diejenige Fettsäuremenge verstanden, die von 1 ,umol Natriumhydroxid in 1 min bei 25 ⁰C und pH 8 neutralisiert wird.

Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Lipase-Hydrolysegemisch ist die in dem nachstehenden Beispiel 1 angegebene wäßrige Enzymlösung. Das Enzymgemisch wird aus Gründen der Lagerstabilität vorzugsweise in trockener oder getrockneter Form erzeugt und vor Gebrauch mit destilliertem Wasser wiederhergestellt.

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Beispiel 1	Lipase	250 U/ml
LIPR >	50 U/ml
LPL 2.	90 mmol/1
Kaliumphosphat	3,8 g/l
Rinderserumalbumin	6,5.
pH-Wert

Zur Verwendung in mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Analysengeräten, beispielsweise dem Gerät Technicon SMAC mit festgelegter Inkubations- bzw. Reaktionszeit von 2,5 min bei 37 ⁰C, wird eine Serumprobe im Volum-Verhältnis 1:6 mit destilliertem Wasser verdünnt, das eine kleine Menge eines grenzflächenaktiven Mittels wie beispielsweise 0,1 % Triton X-100 (DuPont) enthält; jedem Teil der verdünnten Probe werden 4,25 Volumteile des wiederhergestellten Lipasereagens zugesetzt.

118 ,ul der verdünnten Probe werden bei dem oben genannten Gerät eingesetzt; pro Test werden etwa 0,4 ml Lipasereagens zugesetzt. Vollständige Hydrolyse wird in 2,5 min erreicht.

Die Vergleichsversuche wurden in einem mit kontinuierlicher Strömung arbeitenden Analysator (Technicon-Gerät) mit festgelegter Reaktionszeit von 2,5 min (37 ⁰C) durchgeführt, wobei (1) das wäßrige Reagens von Beispiel 1 und (2) Standard-Enzymgemische (von Technicon Instrument Corporation) verwendet wurden, die ein Gemisch von LIPR und Protease gemäß der US-PS 3 703 591 enthielten.

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Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 1 angeführt (Triglyceridgehalte in mg/dl).

Aus den typischen Ergebnissen geht die gute Korrelation hervor.

	Tabelle 1	Erwartungswerte
Probe Nr.	Beispiel 1	100
1	103	266
2	269	-
3	574	133
4	138	82
5	90	131
6	135	270
7	284	565
8	577

Die Proben 1 bis 8 waren Patientenseren, deren Tr iglyceridkonzentrationen nach der Durchführung der Hydrolyse mit der bevorzugten Lipase-Zusammensetzung von Beispiel 1 auf einem Technicon-SMAC-Gerät gemessen wurden; die Erwartungswerte für jedes Serum wurden unter Verwendung eines handelsüblichen Lipasereagens auf der Basis der US-PS 3 703 951 ermittelt.

Die Korrelation dieser Seren zeigt, daß die bei der Geräteeichung eingesetzten grenzflächenaktiven Mittel die Lipasereaktion nicht inhibierten.

Bei jedem Test wurde das hydrolytisch freigesetzte Glycerin in einen fließenden Strom von Nachweisreagens hineindialysiert, bei dem die oben erläuterten Reaktionen

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von NADH zu NAD verwendet und die resultierende Absorptionsänderung optisch bei 340 nm gemessen und durch Eichung der Triglyceridkonzentration in der Probe zugeordnet wurde.

Ein bevorzugtes Reagensgemisch zur Bestimmung von freiem Glycerin ist im nachfolgenden Beispiel 2 angegeben; die Mengen sind jeweils auf 1 1 des wäßrigen Systems bezogen.

Beispiel 2

I. Glycerinkinase-Reagens:

GK Triäthylamin-hydrochlorid

II. Glycerin-Substratreagens:

Trispuffer Magnesiumsulfat ATP PEP NADH LDH

> 2610 ü

100 mmol

32 mmol 8,6 mmol 8,6 mmol 0,306 mmol 0,273 mmol

£ 2400 U

> 1200 U.

Die in Tabelle 1 aufgeführten Ergebnisse von Beispiel 1 wurden unter Verwendung dieser Reagentien erhalten.

Zur Verlängerung der Lagerfähigkeit können den erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzungen übliche ionische sowie Proteinstabilisatoren zugesetzt werden.

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Zur Ermittlung der in Tabelle 1 angegebenen Erwartungswerte wurden handelsübliche Reagentien (von Technicon Instrument Corporation) herangezogen.

Aus weiteren Tests geht hervor, daß weder LIPR noch LPL allein zu einer vollständigen Hydrolyse von Triglyceriden in der Probe bzw. im Eichgemisch innerhalb einer Inkubationsdauer von 2,5 min bei 37 ⁰C in der Lage sind und die erfindungsgemäße Enzymkombination eine-synergistische Wirkung besitzt.

Erforderlichenfalls können auch längere Reaktionszeiten sowie Temperaturen zwischen etwa Raumtemperatur und etwa 50 ⁰C angewandt werden. Zur Erzielung einer vollständigen Hydrolyse innerhalb der zur Verfügung stehenden Reaktionszeit und innerhalb des zur Bestimmung in Frage kommenden Konzentrationsbereichs muß eine ausreichende Enzymgesamtmenge innerhalb der oben angegebenen Mengenverhältnisse eingesetzt werden.

Die Erfindung ist nicht auf die lediglich beispielhaften Angaben der obigen Ausführungsbeispiele beschränkt.

Die Erfindung betrifft zusammengefaßt eine neuartige, stabile Kombination von Lipase aus Rhizopus arrhizus und Lipase von Pseudomonas fluorescens zur Hydrolyse von Triglyceriden zur freiem Glycerin, insbesondere in Körperflüssigkeiten und für analytische Zwecke.

Eine im wesentlichen vollständige und sehr schnelle Hydrolyse wird mit einem Enzymgemisch im Mengenverhältnis

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von 2:1 bis 10:1 und vorzugsweise 5:1 erreicht, wobei sich die Mengenangaben auf die Aktivitätseinheiten der jeweiligen Lipase beziehen.

Etwa 150 Einheiten Gesamt-Lipase führen zu einer im wesentlichen vollständigen Hydrolyse der in 20 /ul Serum bis zu einer Minimalkonzentration von 5 g/l enthaltenen Triglyceride innerhalb von 2,5 min bei 37 C.

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Claims

Ansprüche

1. Enzymzusammensetzung zur Hydrolyse von Glycerinestern in wäßrigen Medien,

gekennzeichnet durch

etwa 65 bis 91 Einheiten Lipase aus Rhizopus arrhizus

und

etwa 35 bis 9 Einheiten Lipase aus Pseudomonas fluorescens

pro 1OO Einheiten an insgesamt vorliegender Lipase.

2. Enzymzusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Lipase aus Rhizopus arrhizus zu Lipase aus Pseudomonas fluorescens etwa 2:1 bis 10:1 beträgt.

3. Enzymzusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Verhältnis etwa 5:1 beträgt.

4. Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie in einem wäßrigen, auf einen pH-Wert zwischen etwa 6,0 und 7,0 gepufferten Medium mit einem Gesamtgehalt von mindestens etwa 300 Einheiten Lipase/ml vorliegt.

5. Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie in getrockneter Form vorliegt.

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6. Reagenszusammensetzung zur Bestimmung der Konzentration von Triglyceriden im Serum durch Hydrolyse der Triglyceride zu Glycerin und freien Fettsäuren und Messung der Lichtabsorption einer das durch Hydrolyse entstandene Glycerin enthaltenden wäßrigen Flüssigkeit,

gekennzeichnet durch ein Enzymgemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zusammen mit chemischen Reagentien zur Erzielung einer der im Serum freigesetzten Glycerinmenge proportionalen Absorptionsänderung der wäßrigen Flüssigkeit.

7. Reagenszusammensetzung nach Anspruch 6, -gekennzeichnet durch eine getrocknete Enzymzusammensetzung nach Anspruch

8. Reagenszusammensetzung nach Anspruch 6 oder 7, gekennzeichnet durch Glycerinkinase, Adenosintriphosphat, Phosphoenolbrenztraubensäure, NADH, Lactatdehydrogenase und Pyruvatkinase als chemische Reagentien.

9. Reagenszusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie ferner Rinderserumalbumin als Stabilisator enthält.

10. Verfahren zur Hydrolyse von Glycerinestern und zur Bestimmung der in wäßrigen Körperflüssigkeiten vorliegenden Menge an Glycerinestern,

gekennzeichnet durch Inkubieren der zu untersuchenden Flüssigkeit mit einer Enzymzusammenset zung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 bzw. einer Reagenszusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 9 während einer Reaktionszeit von weniger als etwa 10 min zur vollständigen Hydrolyse der Glycerinester

und Bestimmung der hydrolytisch freigesetzten Menge an Glycerin und/oder Fettsäuren.

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