DE68927153T2

DE68927153T2 - Biosynthetische osteogene proteine und sie enthaltende osteogene vorrichtungen

Info

Publication number: DE68927153T2
Application number: DE68927153T
Authority: DE
Inventors: Thangavel Medway Ma 02053 Kuberasampath; Hermann Medway Ma 02053 Oppermann; Engin Milford Ma 01757 Ozkaynak; David C. West Roxbury Ma 02132 Rueger
Original assignee: Stryker Corp
Current assignee: Stryker Corp
Priority date: 1988-04-08
Filing date: 1989-04-07
Publication date: 1997-03-06
Anticipated expiration: 2009-04-08
Also published as: AU618357B2; EP0714665A2; EP0362367A1; EP0723013A2; ATE231523T1; EP1225225A3; JP2522568B2; EP0372031B1; JPH03500655A; CA1341610C; EP0723013B1; WO1989009788A2; DE01201546T1; CA1338663C; WO1989009787A3; WO1989009788A3; ATE142644T1; US6297213B1; DE01201555T1; US20050054825A1

Description

Diese Erfindung betrifft osteogene Vorrichtungen, synthetische Gene, die Proteine codieren, die eine osteogenese in Säugern induzieren können, und Verfahren für ihre Herstellung mit Hilfe rekombinanter DNS- Techniken sowie synthetische Formen eines osteogenen Protein.
Säugerknochengewebe enthält bekannterweise einen oder mehrere proteinartige Stoffe, die vermutlicherweise bei Wachstum und natürlicher Knochenheilung aktiv sind und eine Entwicklungskaskade zellulärer Ereignisse, die zur endochondralen Knochenbildung führen, induzieren können. Diese(r) aktive(n) Faktor(en) ist(sind) in der Literatur unterschiedlich als knochenmorphogenetisches oder morphogenes Protein, knocheninduktives Protein, osteogenes Protein, osteogenin oder osteoinduktives Protein bezeichnet worden.
Die Entwicklungskaskade der Knochendifferenzierung besteht aus Recruitment der Mesenchymzellen, Proliferation der Vorläuferzellen, Calcifizierung des Knorpels, Einwachsen von Gefäßen, Knochenbildung, Reorganisation und schließlich Knochenmarkdifferenzierung (Reddi (1981) Collagen Rel. Res. 1:209-226).
Wenn auch die genauen Mechanismen, die diesen Phänotypischen Umwandlung zugrunde liegen, unklar sind, so ist doch gezeigt worden, daß die natürliche endochondrale Knochendifferenzierungsaktivität der Knochenmatrix, dissoziativ extrahiert und mit inaktiver restlicher Kollagenmatrix wieder hergestellt werden kann, um die vollständige Knocheninduktionsaktivität wieder herzustellen (Sampath and Reddi, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7599-7603). Dies liefert ein experimentelles Verfahren zum Testen von Proteinextrakten auf ihre Fähigkeit, eine endochondrale Knochenbildung in vivo zu induziern.
Dieses mutmaßliche Knocheninduktionsprotein hat offensichtlich ein Molekulargewicht von weniger als 50 Kilodalton (kD). Mehrere Säugerarten bilden ein eng verwandtes Protein, wie mit Hilfe von Kreuzimplantierungsexperimenten mit verschiedenen Species gezeigt wurde (Sampath and Reddi, (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6591-6595).
Der mögliche Nutzen dieser Proteine ist umfassend erkannt worden. Es ist zu erwarten, daß die Verfügbarkeit des reinen Proteins, die Orthopädie, bestimmte plastische Operationsverfahren und verschiedene periodontale und craniofaciale Rekonstruktionsverfahren revolutionieren würde.
Die beobachteten Eigenschaften dieser Proteinfrak tionen haben intensive Forschungsanstrengungen in verschiedenen Labors ausgelöst, um den reinen Faktor oder die Faktoren, die für die osteogene Aktivität verantwortlich sind, zu isolieren und zu identifizieren. Der heutige Stand der Reinigungstechnik des osteogenen Proteins aus Säugerknochen ist von Sampath et al. (Proc. Natl. Sci. USA (1987) 80) publiziert. Urist et al. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1984) 173:194-199) publizieren eine osteogene Humanproteinfraktion, die aus demineralisiertem kortikalen Knochen mit einer Calciumchlorid-Harnstoff an organische/organische Lösungsmittelmischung extrahiert wurde und die mittels fraktionierter Fällung in Guanidin- Hydrochlond und präparativer Gelelektrophorese wiedergewonnen wurde. Die Autoren berichten, daß die Proteinfraktion eine Aminosäure-Zusammensetzung eines sauren Polypeptids mit einem Molekulargewicht in einem Bereich von 17-18 kD besitzt.
Urist et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:371-375) veröffentlichen einen morphogenen Proteinextrakt aus bovinen Knochen mit den Eigenschaften eines sauren Polypeptids und einem Molekulargewicht von etwa 18 kD. Die Auoren berichteten, daß das Protein sich in einer mittels Hydroxyapatit-Chromatographie abgetrennten Fraktion befand, und daß das Protein die Knochenbildung im Hinterhandmuskel der Maus und die Knochenregeneration bei Trephinedefekten bei Ratten- und Hundeschädeln induzierte. Ihr Verfahren zur Extraktgewinnung aus Knochen führte zu nicht definierten und unreinen Präparaten.
In der europäischen Patentanmeldung, Nr. 148.155, am 7. Oktober 1985 veröffentlicht, werden vom Rind, Schwein und Mensch abstammende osteogene Proteine angeblich offengelegt. Eines dieser Proteine, von den Erfindem als Protein P3 bezeichnet mit einem Molekulargewicht von 22-24 kD, soll bis zu einem im wesentlichen homogenen Stadium gereinigt worden sein. Von diesem Stoff wird berichtet, daß er die Knochenbildung induziert, wenn er in Tiere implantiert wird.
In der internationalen Anmeldung, Nr. PCT/087/01537, am 14. Januar 1988 veröffentlicht, wird eine unreine Fraktion aus einem bovinen Knochen offengelegt, die Knocheninduktionseigenschaften besitzt. Die genannten Anmelder legen ebenfalls mögliche Knocheninduktionsfaktoren offen, die mit rekombinanten DNS-Techniken hergestellt wurden. Vier DNS-Sequenzen wurden aus humanen oder bovinen genomischen oder cDNS-Bibliotheken erhalten und in rekombinanten Wirtszellen offensichtlich exprimiert. Während die Anmelder darlegten, daß die exprimierten Proteine morphogene Proteine für Knochen sein könnten, wurde eine Knocheninduktion nicht demonstriert. Siehe ebenfalls Urist et al., EP 0.212.474 mit dem Titel "Bone Morphogenic Agents".
Wang et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85:9484-9488) publizieren die Reinigung eines morphogenen Proteins aus bovinen Knochen aus Guanidin-Extrakten von demineralisierten Knochen, das eine Knorpel- und Knochenbildungsaktivität besitzt, als ein basisches Protein mit einem entsprechenden Molekulargewicht von 30 kD, was durch Gelelution bestimmt wurde. Die Reinigung des Proteins ergab Proteine mit 30, 18 und 16 kD, die nach Trennung inaktiv waren. Anbetracht dieses Resultats räumten die Autoren ein, daß die genaue Bestimmung des aktiven Stoffes nicht gelungen war.
Wozney et al. (Science (1988) 242:1528-1534) legen die Isolierung vollständiger cDNSn offen, die die menschlichen Äquivalente dreier Polypeptide codieren, die ursprünglich aus bovinen Knochen gereinigt wurden. Die Autoren berichten, daß jedes dieser drei rekombinant exprimierten menschlichen Proteine einzeln oder kombiniert in der Lage sind, eine Knorpelbildung zu induzieren. Von einer Knochenbildung wird nicht berichtet.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf den Gegenstand der Ansprüche. Die Erfindung umfaßt osteogene Vorrichtungen, die, wenn sie in einen Säugerkörper implantiert sind, am Implantationslocus die vollständige Entwicklungskaksade der Knochenbildung und Knochenmarkdifferenzierung induzieren können. Geeignet modifiziert, wie hier offengelegt, können die Vorrichtungen die Knochen- wie auch die Knorpelbildung induzieren. Die Vorrichtungen umfassen ein Trägermaterial, hier als Matrix bezeichnet, mit den unten offengelegten Merkmalen, das dispergiertes osteogenes Protein in Form eines biosynthetischen Konstrukts enthält.
Der Schlüssel für diese Entwicklungen war die erfolgreiche Präparation eines im wesentlichen reinen osteogenen Proteins durch eine Reinigung aus einem Knochen, die Aufklärung der Aminosäure-Sequenz sowie der Strukturdaten des nativen osteogenen Proteins und Erkenntnis aus Untersuchung der DNS und Aminosäure-Sequenzen des natürlichen Ausgangsmaterials. Ein Protokoll wurde entwickelt, das zur Wiedergewinnung des aktiven, im wesentlichen reinen osteogenen Proteins aus Säugerknochen führte. Die Untersuchung der Eigenschaften und Struktur der nativen Form des osteogenen Proteins erlaubte dann den Erfindern, eine rationale Konstruktion nicht-nativer Formen, z. B. in der Natur zuvor nicht bekannter Formen, die in der Lage sind, eine Knochenbildung zu induzieren, zu entwickeln. Soweit es den Anmeldern bekannt ist, bilden die hier offengelegten Konstrukte erstmalig die Konstruktion eines funktionalen, aktiven Proteins ohne vorherige Kenntnis der aktiven Region einer nativen Form der Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenz.
Eine Reihe übereinstimmender DNS-Sequenzen wurden mit dem Ziel konstruiert, ein aktives osteogenes Protein herzustellen. Die Sequenzen basierten auf Daten der partiellen Aminosäure-Sequenz-Daten, die vom natürlichen Ausgangsprodukt erhalten wurden, und auf beobachteten Homologien mit nicht verwandten, in der Literatur erwähnten Genen oder der sie codierenden Sequenzen, die eine vermutete oder gezeigte Funktion in der Entwicklung besitzen. Verschiedene biosynthetische Konsensus-Sequenzen sind als Fusionsproteine in Prokaryonten exprimiert, gereinigt, geschnitten, rückgefaltet, mit einer Matrix vereinigt und in ein etabliertes Tiermodell implantiert worden und haben gezeigt, daß sie eine endochondrale Knocheninduktionsaktivität besitzen. Die heute bevorzugten aktiven Proteine umfassen die als COP5, COP7, COP16 und OP1 bezeichneten Sequenzen. Die Aminosäure-Sequenzen dieser Proteine sind unten angeführt.
In diesen Sequenzen und in sämtlichen weiteren hier offengelegten Aminosäure-Sequenzen werden die Gedankenstriche (-) als Platzhalter ausschließlich verwendet, um die Sequenzen mit vergleichbaren Sequenzen in verwandten Proteinen in einer Reihe untereinander auszurichten, und besitzen keine weitere Funktion. Folglich sind die Aminosäuren 45-50 von COP7 zum Beispiel NHAVV. Auch ist die Numerierung der Aminosäuren lediglich nur zum Zwecke der Erleichterung von Vergleichen zwischen den Sequenzen gewählt. Folglich können zum Beispiel die DF-Reste von COP5 und COP7, als Nummer 9 und 10 bezeichnet, die Reste beispielsweise 35 und 36 eines osteogenen Proteins gemäß der Erfindung darstellen. Verschiedene Leader- oder Trailer-Sequenzen können an die operative aktive Region angehängt sein, vorausgesetzt die osteogene oder chondrogene Aktivität des Proteins wird nicht zerstört.
Folglich umfaßt die Erfindung in einem Aspekt ein Protein, das eine Aminosäure-Sequenz umfaßt, die den Sequenzen CPP5, COP7, COP16 oder OP1 hinreichend entspricht, so daß das Protein in der Lage ist, eine endochondrale Knochenbildung zu induzieren, wenn es korrekt gefaltet ist und in Verbindung mit einer Matrix in einen Säuger implantiert ist. Einige dieser Sequenzen induzieren Knorpel aber keinen Knochen. Auch können die knochenbildenden Materialien eingesetzt werden zur Bildung von Knorpel, wenn sie in einen gefäßfreien Ort implantiert werden, oder falls ein Inhibitor gegen eine vollständige Knochenentwicklung zusammmen mit dem aktiven Protein implantiert wird. Folglich umfaßt die Erfindung in einem weiteren Aspekt ein Protein mit einer Länge von weniger als 200 Aminosäuren (für jede Kette) einschließlich einer Sequenz, die den Sequenzen COP5, COP7, COP16 oder OP1 hinreichend entspricht, so daß es in der Lage ist, mindestens eine Knorpelbildung zu induzieren, wenn es korrekt gefaltet ist und in Verbindung mit einer Matrix in einen Säuger implantiert ist. Der hier verwendete Ausdruck "hinreichend entsprechend" wird verwendet, um Proteine zu beschreiben, die ein bestimmtes Ausmaß an Homologie mit den hier offengelegten spezifischen Sequenzen und anderen verschiedenen Aminosäuren besitzen, die aber dennoch osteogene oder chondrogene Aktivität zeigen.
In einer bevorzugten Form umfassen diese Proteine Arten der allgemeinen Aminosäure-Sequenzen:
wo die Buchstaben den Standard-Einbuchstabencode der Aminosäurereste angeben und X jeweils eine beliebige der 22 natürlich vorkommenden Aminosäurereste darstellt. Bevorzugte Aminosäure-Sequenzen innerhalb der zuvor erwähnten allgemeinen Sequenzen sind:
worin jede der Aminosäuren, die an der jeweiligen Position in der Sequenz vertikal angeordnet ist, wahlweise in verschiedenen Kombinationen verwendet werden kann. Es ist zu beachten, daß diese allgemeinen Sequenzen 6 und vorzugsweise 7 Cystein-Reste besitzen, wo sich inter- oder intramolekulare Disulfidbindungen ausbilden können, und andere entscheidende Aminosäuren enthalten, die die Tertiärstruktur der Proteine beeinflussen. Diese allgemeinen Strukturmerkmale werden in den zuvor veröffentlichten Sequenzen gefunden, wobei keine mit einer osteogenen Aktivität beschrieben wurde und die meisten davon niemals mit einer derartigen Aktivität in Verbindung gebracht wurden.
Besonders zweckdienliche Sequenzen umfassen:
Vg1 ist eine bekannte Xenopus Sequenz, die bis heute mit Knochenbildung nicht in Verbindung gebracht wurde. DPP ist eine von einem Drosophila Gen codierte Aminosäure-Sequenz und für die Entwicklung des dorsoventralen Musters verantwortlich. OP1 ist ein Bereich einer von den Anmeldern gefundenen natürlichen Sequenz, die von Exons einer genomischen DNS-Sequenz codiert wird. Die CBMPs sind Aminosäure-Sequenzen, die Teilbereiche eines Säugerproteins umfassen, die von genomischen DNSn und cDNSn, die von den Anmeldern gefunden wurden, codiert werden. Die COPs sind gänzlich biosynthetische Protein- Sequenzen, die mittels neuartiger Konsensus-Genkonstrukte, die mit Hilfe der hier angeführten Kriterien konstruiert wurden, exprimiert werden und in der Natur bisher nicht gefunden wurden.
Von diesen Proteinen wird vermutet, daß sie als Dimere vorliegen. Sie scheinen nicht aktiv zu sein, wenn sie reduziert vorliegen. Verschiedene Kombinationen der Proteinspecies können als Heterodimere oder Homodimere vorliegen. Soweit es den Anmeldern bekannt ist, stellen die COP5, COP7, COP16 und OP1 Konstrukte die ersten Beispiele für die Konstruktion eines bioaktiven Proteins ohne eine voherige Kenntnis von der aktiven Region einer nativen Form der Nucleotid- oder Aminosäure-Sequenz dar.
Die Erfindung liefert folglich ein mit Hilfe rekombinanter DNS-Techniken hergestelltes synthetisches osteogenes Protein. Das Protein kann Formen mit unterschiedlichen Glycosylierungsmustern, unterschiedlichen N- Termini, eine Familie verwandter Proteine mit Aminosäure Sequenz-Homologiebereichen und aktive verkürzte oder mutierte Formen des nativen Proteins umfassen, egal von wo sie stammen. Im Hinblick auf diese Offenlegung können erfahrene Gentechnologen geeignete Aminosäure-Sequenzen codierende Gene konstruieren und synthetisieren und diese dann in verschiedenen wirtszelltypen, einschließlich Pround Eukaryonten, exprimieren, um große Mengen aktiver synthetischer Proteine zu produzieren, einschließlich verkürzter Analoga, mutierter Proteine, Fusionsproteine und anderer Konstrukte, die die biologische Aktivität der nativen Formen nachahmen und in der Lage sind, eine Knochenbildung in Säugern einschließlich Menschen zu induzieren.
Die synthetischen Proteine sind für klinische Anwendungen in Verbindung mit einem geeigneten Transport- oder Versorgungssystem (Matrix) zweckdienlich. Die Matrix wird aus Partikeln oder porösen Materialien hergestellt. Die Poren müssen eine Mindestgröße besitzen, um eine Migration von Vorläuferzellen und deren nachfolgende Differenzierung und Proliferation zu erlauben. Die Partikelgröße sollte im Bereich von 70-850 µm, vorzugsweise 70-420 µm, liegen. Sie kann durch dichtes Packen des par tikularisierten Materials in einer Form, die den Knochendefekt überbrückt oder durch sonstiges Strukturieren, wie gewünscht, eines Materials, das biokompatibel (nicht inflammatorisch) und in vivo biologisch abbaubar ist, um als "zeitweiliges Gerüst" und Substrat für ein Recruit ment migrierender Vorläuferzellen und als eine Basis für ihr anschließendes Festsetzen und ihre Proliferation zu dienen. Heutige bevorzugte Träger umfassen einen partikularisierten, demineralisierten, Guanidin-extrahierten Species-spezifischen (allogenen) Knochen und partikulansierten, deglycolysierten (oder HF behandelten), Protein extrahierten, demineralisierten, xenogenen Knochen. Gegebenenfalls können derartige Matrices aus pulverisierten xenogenen Knochen ebenfalls mit Proteasen, wie beispielsweise Trypsin, behandelt werden. Weitere zweckmäßige Matrix-Materialien umfassen Kollagen, Homopolymere und Copolymere der Glycolsäure und Milchsäure, Hydroxyapatit, Tricalciumphosphat und andere Calciumphosphate.
Die osteogenen Proteine und implantierbaren osteogenen Vorrichtungen, die damit ermöglicht und hier offengelegt werden, erlauben dem Arzt eine optimale vorhersagbare Knochenbildung zu erzielen, um beispielsweise erwor bene oder kongenitale cranofaciale und andere Skelettoder Dentalanomalien zu korrigieren. (Glowacki et al. (1981) Lancet 1:959-963). Die Vorrichtungen konnen verwendet werden, um eine lokale endochondrale Knochenbildung bei nicht-heilenden Frakturen und bei anderen klinischen Anwendungen einschließlich periodontalen Anwendungen, wo eine Knochenbildung erforderlich ist, zu induzieren.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die vorausgehenden und weiteren Gegenstände dieser Erfindung, deren verschiedene Merkmale wie auch die Erfindung selbst, können aus der folgenden Beschreibung voll und ganz verstanden werden, wenn sie zusammen mit den begleitenden Zeichnungen gelesen wird, in denen:
Abbildung 1 ein Vergleich der Aminosäure-Sequenz verschiedener osteogener Proteine mit den Proteinen der TGF-beta Familie ist. COP1, COP3, COP4, COP5 und COP7 sind eine Familie von analogen synthetischen osteogenen Proteinen, die aus dem Konsensus-Gen entwickelt wurden, das mit einem Leader-Protein über eine Gelenkregion mit der Sequenz D-P-N-G verknüpft wurde, was eine chemische Spaltung der D-P Bindung (mittels Säure) oder N-G Bindung (mittels Hydroxylamin) erlaubte und zu einer Freisetzung des analogen Proteins führte; VGL ist ein Xenopus Protein, DPP ist ein Drosophila Protein; OP1 ist ein natives osteogenes Protein; CBMP2A und 2b sowie CBMP3 sind Teilbereiche von Proteinen, die in der PCT Anmeldung 087/01537 offengelegt wurden; MIS ist Müllersche Inhibitionssubstanz; und "Konsensus Auswahlen" stellen verschiedene Substitutionen von Aminosäuren dar, die an verschiedenen Positionen in osteogenen Proteinen gemacht werden können;
Abbildung 2A ein E. coli Expressionsvektor ist, der ein Gen eines an ein Leader-Protein fusionierten osteogenen Proteins enthält;
Abbildung 2B die DNS-Sequenz zeigt, die einen modifizierten trp-LE Leader, zwei Fb Domänen von Protein A, eine ASP-PRO Schnittstelle und die COP5 Sequenz umfaßt;
Abbildungen 3A und 3B Mikrophotographien von Implantaten sind, die die Histologie (Tag 12) des aktiven rekombinanten COP5 Proteins zeigen. A zeigt eine Kontrolle (nur Ratten-Matrix, 25 mg). B zeigt Ratten-Matrix plus COP5 und zeigt +++ Knorpelbildung und ++ Knochenbildung (siehe Erklärung unten). Ähnliche Ergebnisse werden mit COP7 erhalten; und
Abbildung 4 eine schematische Darstellung der DNS- Sequenz und korrespondierenden Aminosäure-Sequenz eines Konsensus-Gens für das osteogene Protein (COPO) zeigt.

Beschreibung

Aufreinigungsprotokolle sind entwickelt worden, die die Isolation des in Protein-Rohextrakten von Säugerknochen vorhandenen osteogenen Proteins ermöglichen. Das Isolierungsverfahren ermöglicht die Produktion wesentlicher Mengen von einem im wesentlichen reinen osteogenen Proteins aus beliebigen Säuger-Species, vorausgesetzt hinreichende Mengen an frischen Knochen dieser Species sind verfügbar. Die empirische Entwicklung des Verfahrens, verbunden mit der Verfügbarkeit von frischen Kalbsknochen, ermöglicht die Isolierung eines im wesentlichen reinen bovinen osteogenen Proteins (BOP). BOP ist im wesentlichen charakterisiert worden; seine Fähigkeit, Knorpel- und letztendlich endochondrales Knochenwachstum bei Katzen, Kaninchen und Ratten zu induzieren, ist untersucht worden; es ist gezeigt worden, daß es in der Lage ist, die gesamte Entwicklungskaskade der Knochenbildung, die zuvor einem unbekannten Protein oder Proteinen in heterogenen Knochenextrakten zugeschrieben wurde, zu induzieren; und es kann verwendet werden, um die Bildung von endochondralen Knochen bei orthopädischen Defekten, einschließlich nicht-heilender Frakturen, zu induzieren. In seiner nativen Form ist es ein glycosyliertes dimeres Protein. Jedoch ist es in der deglycosylierten Form aktiv. Es ist teilweise sequenziert worden.
Die Aufklärung der Aminosäure-Sequenz von BOP ermöglichte die Konstruktion einer Konsensus-Nudeinsäure- Sequenz, die, wie hier offengelegt, gestützt auf die Sequenzdaten, die abgeleiteten Codons für die Sequenzen und die Feststellung einer partiellen Homologie zu bekannten Genen konstruiert wurde.
Diese Konsensus-Sequenzen sind durch Vergleich mit den vorhandenen Sequenzen in bestimmmten regulatorischen Genen aus Drosophila, Xenopus und Menschen, anschließender Punktmutation, Expression und Prüfung auf Aktivität verbessert worden. Dieses Verfahren ist bei der Herstellung mehrerer aktiver vollständig synthetischer Konstrukte, die in der Natur nicht gefunden wurden (soweit es den Anmeldern bekannt ist) und die eine spezifische osteogene Aktivität besitzen, erfolgreich gewesen.
Diese Entdeckungen ermöglichen die Konstruktion von DNSn, die vollständig neue, nicht-native Proteinkonstrukte codieren, die einzeln und kombiniert in der Lage sind, echten endochondralen Knochen zu bilden. Die DNSn können mit Hilfe gut etablierter rekombinanter DNS-Technologien in prokaryontischen oder eukaryontischen Wirtszellen exprimiert werden, und die exprimierten Proteine können in vitro oxidiert und rückgefaltet werden, wenn es für die biologische Aktivität notwendig ist.
Die Konstruktion und Herstellung derartiger biosynthetischer Proteine, die Natur der Matrix und weitere Materialaspekte, die die Natur, Zweckdienlichkeit, Herstellungsweise und Verwendungsweise des hier beanspruchten Gegenstands betreffen, wird weiter aus den nachfolgenden Ausführungen besser verstanden werden, die das beste heute bekannte Verfahren zur Ausführung der verschiedenen Aspekte der Erfindung darstellen.

KONSTRUKTION DER KONSENSUS-SEQUENZ

Ein synthetisches Konsensus-Gen, das in Abbildung 4 gezeigt wird, wurde zur Codierung eines Konsensus- Proteins, das auf den vorausgesagten Aminosäuren durch die Homologie mit der TGF-beta Genfamilie beruht, konstruiert. Die konstruierte Konsensus-Sequenz wurde dann mit Hilfe bekannter Techniken, einschließlich Zusammenbau der mit einem DNS-Synthesizer hergestellten Oligonucleotide, konstruiert.
Tryptische Proteine, die von dem von den Anmeldern isolierten bovinen osteogenen Protein abstammen und mit Hilfe des Edman-Abbaus sequenziert wurden, lieferten Aminosäure-Sequenzen, die eine starke Homologie zu der Drosophila DPP Protein-Sequenz (wie aus dem Gen abgeleitet), dem Xenodus VG1 Protein und eine etwas geringere Homologie zu Inhibin und TGF-beta zeigten, wie es in Tabelle 1 unten dargestellt ist. Tabelle 1
*-Entsprechung
Bei der Festlegung einer geeigneten Aminosäure- Sequenz eines osteogenen Proteins (aus der die Nucleinsäure-Sequenz bestimmt werden kann) wurden die folgenden Kriterien herangezogen: (1) die Aminosäure-Sequenz, die mit Hilfe des Edman-Abbaus osteogener tryptischer Proteinfragmente aus einer natürlichen Quelle bestimmt wurde, nahm den höchsten Rang ein, so lange sie ein starkes Signal zeigte und eine Homologie oder konservative Veränderungen zeigte, wenn sie mit den anderen Mitgliedern der Genfamihe abgeglichen wurde; (2) bei Sequenz-Entsprechungen in allen vier Proteinen wurde diese Sequenz in der synthetischen Gensequenz verwendet; (3) entsprechende Aminosäuren in DPP und Vg1 wurden verwendet; (4) Wenn Vg1 oder DPP divergierten, aber einer Aminosäure in Inhibin oder TGF-beta entsprach, wurde diese passende Aminosäure ausgewählt; (5) wo alle Sequenzen divergierten, wurde erst die DPP Sequenz gewählt; mit der späteren Absicht zur Erzeugung der Vg1 Sequenz mittels Mutagenese als eine weitere Möglichkeit. Zusätzlich wurde die Konsensus-Sequenz so konstruiert, daß sie die Disulfid-Vernetzung und offensichtliche Strukturhomologie zu den verwandten Proteinen beibehält.

REKOMBINANTE OSTEOGENE PROTEINKONSTRUKTE

Dieses Verfahren führt zu der Herstellung neuartiger rekombinanter Proteine, die in der Lage sind, eine Knorpel- und endochondrale Knochenbildung zu induzieren, und eine Proteinstruktur aufweisen, die analog zu der funktionalen Domäne des natürlicherweise vorkommenden Materials ist oder dieser entspricht. Die Aminosäure- Sequenzen, die von den Konsensus-Sequenzen codiert werden, stammen von einer Familie natürlicher, mit der Gewebeentwicklung in Zusammenhang stehender Proteine ab. Von diesen Genprodukten/Proteinen ist bekannt, daß sie in der aktiven Form als Dimere vorliegen und im allgemeinen aus einem Vorläuferprotein prozessiert werden, um eine aktive C-terminale Domäne des Vorläufers zu bilden.
Die rekombinanten osteogenen/chondrogenen Proteine sind in dem Sinn "neuartig", daß, soweit es den Anmeldern bekannt ist, sie nicht in der Natur vorkommen oder wenn doch, sie niemals zuvor mit der Knochen- oder Knorpelbildung in Zusammenhang gebracht worden sind. In dem Verfahren zur Konstruktion dieser Proteine werden Aminosäure-Sequenzen verwendet, die in nativen OP Isolaten, in Polypeptidstrukturen, die Muster von bestimmten, in der Literatur veröffentlichten Proteinen kopieren, oder in den Aminosäure-Sequenzen, die von in der Literatur veröffentlichten DNSn abgeleitet sind, gefunden wurden. Folglich wurde mit Hilfe der oben aufgestellten Konstruktionskriterien und Verbesserung der Aminosäure- Sequenz, als mehr Informationen über die Protein-Sequenz vorlagen, eine Reihe synthetischer Proteine mit der Hoffnung und Absicht konstruiert, daß sie eine osteogene oder chondrogene Aktivität besitzen könnten, wenn sie in dem unten offengelegten Biotestsytem getestet werden.
Es wurde beispielsweise erkannt, daß DPP aus Drosophila, VG1 aus Xenopus, die TGF-beta Proteinfamilie und in einem geringeren Umfang alpha und beta Inhibine, signifikante Homologien zu bestimmten Sequenzen, die von dem natürlich vorkommenden OP Produkt abstammen, besaßen. (Abbildung 1.) Untersuchungen dieser Proteine führten zu der Erkenntnis, daß ein Teil der Sequenz von jedem eine strukturelle Ähnlichkeit besaß, die durch Analyse der positionellen Beziehung von Cysteinen und anderen Aminosäuren, die einen wichtigen Einfluß auf die dreidimensionale Proteinkonformation besitzen, erkennbar war. Es wurde festgestellt, daß ein Bereich dieser Sequenzen eine Folge von sieben Cysteinen besaß, die sich sehr genau an den gleichen relativen Positionen befanden und bestimmte andere Aminosäuren in der Reihenfolge, wie unten angeführt, besaß:
worin jedes X eine Aminosäure darstellt. Expressionsexperimente mit zwei dieser Konstrukte zeigen Aktivität. Expressionsexperimente mit Konstrukten, die nach dieser Matrizen-Aminosäure-Sequenz mit einer kürzeren Sequenz mit nur sechs Cysteinen gebildet werden, zeigen ebenfalls Aktivität:
worin jedes X eine Aminosäure darstellt. Innerhalb dieser allgemeinen Strukturen gibt es eine Vielzahl spezifischer Sequenzen, die osteogene oder chondrogene Aktivität besitzen. Bevorzugte Strukturen besitzen die Aminosäure-Sequenz:
worin, in jeder Position wo mehr als eine Aminosäure gezeigt wird, eine beliebige der gezeigten Aminosäuren verwendet werden kann. Die neuartigen aktiven Proteine sind ebenfalls durch Aminosäuren definiert, die eine aktive Domäne beginnend bei Rest Nummer 6 dieser Sequenz aufweisen, das heißt, das N-terminale CXXXX ist weggelassen oder eine beliebige der bevorzugten spezifischen Kombinationen, wie beispielsweise CKRHP, CRRKQ, CKRHE etc. ist weggelassen, was ein Konstrukt mit nur sechs Cysteinresten ergibt. Nach dieser Arbeit wurde PCT 87/01537 veröffentlicht, und es wurde festgestellt, daß die dort als BMPII a und b sowie BMPIII identifizierten Proteine jeweils eine Region enthielten, die diese allgemeine Struktur verkörperte. In der veröffentlichten Anmeldung wurde nicht gezeigt, daß diese Proteine osteogen waren. Die Anmelder entdeckten jedoch, daß ein Teilbereich der Aminosäure-Sequenz dieser Proteine, korrekt gefaltet und implantiert, wie hier angeführt, aktiv ist. Diese werden hier als CBMPIIa, CBMPIIb und CBMPIII offengelegt. Ebenfalls fanden die Anmelder ein zuvor nicht veröffentlichtes Gen durch Sondierung einer menschlichen genomischen DNS-Bibliothek mit COPO wieder. Dieses Protein wurde als OP1 bezeichnet. Es weist eine Region auf, die die gleiche allgemeine Struktur zeigt.
Folglich werden die bevorzugten osteogenen Proteine von rekombinanter DNS exprimiert und weisen Aminosäure- Sequenzen einschließlich einer beliebigen der folgenden Sequenzen auf:
Wie in Abbildung 1 gezeigt, besitzen diese Sequenzen eine beträchtliche Homologie mit den alpha und beta Inhibinen, drei TGF-beta Formen und MIS.

Gen-Präparation

Die zur Expression der Proteine, wie oben beschne ben, konstruierten synthetischen Gene werden bevorzugt durch Zusammenbau von chemisch synthetisierten Oligonucleotide hergestellt. 15-100mer Oligonucleotide können auf einem Biosearch DNA Model 8600 Synthesizer synthetisiert werden und mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit Tris-Borat-EDTA Puffer (TBE) gereinigt werden. Die DNS wird dann aus dem Gel elektroeluiert. Überlappende Oligomere können mit T4 Polynucleotidkinase phosphoryliert werden und zu größeren Blöcken ligiert werden, die ebenfalls mittels PAGE gereinigt werden. Natürliche Gen-Sequenzen und cDNSn können ebenfalls für die Expression verwendet werden.

Expression

Die Gene können in geeigneten prokaryontischen Wirten, wie beispielsweise in verschiedenen E. coli Stämmen und auch in Bacillus, Hefen und verschiedenen Tierzellen, wie beispielsweise CHO, Myelomzellen, etc. exprimiert werden. Im allgemeinen kann eine Expression mit Hilfe vieler Zelltypen und dem Fachmann bekannter Expressionssysteme erreicht werden. Falls das Gen in E. coli exprimiert werden soll, muß es zuerst in einen Expressionsvektor kloniert werden. Ein Expressionsvektor (Abbildung 2A) basiert auf pBR322 und enthält einen synthetischen trp Promotor-Operator und der modifizierte trp LE Leader kann an den EcoRI und PSTI Schnittstellen geöffnet werden, und ein FB-FB COP1, COP3, COP5 und COP7 Genfragment kann zwischen diesen Stellen inseriert werden, wo FB Fragment B des Staphylococcen-Proteins A ist. Das exprimierte Fusionsprotein resultiert aus dem Anhängen des COP-Gens an ein FB codierendes Fragment. Das COP Protein ist mit dem Leader-Protein über eine Gelenkregion mit der Sequenz Asp-Pro-Asn-Gly verknüpft. Diese Gelenkregion erlaubt eine chemische Spaltung des Fusionsproteins mit verdünnter Säure an der Asp-Pro-Stelle oder die Spaltung bei Asn-Gly mit Hydroxylamin, was zur Freisetzung des COP Proteins führt. Bei COP16 und OP1 werden die Proteine mit Hilfe des modifizierten trp-LE als Leader als Fusionsprodukte exprimiert.

Produktion aktiver Proteine

Entsprechend des folgenden Verfahren erfolgte die Herstellung aktiver rekombinanter Proteine. Die Fusionsproteine enthaltenden E. coli Zellen wurden lysiert. Die Fusionsproteine wurden mit Hilfe ihrer unterschiedlichen Löslichkeit gereinigt. Im Falle der COP1, 3, 4, 5, und 7 Fusionsproteine wurde die Spaltung mit verdünnter Säure durchgeführt und die resultierenden Spaltprodukte wurden über eine Sephacryl-200HR Säule gegeben. Die Sephacryl- Säule trennte die meisten der nichtgespaltenen Fusions produkte von den COP1, 3, 4, 5, und 7 Analoga ab. Im Falle des COP16 oder OP1 Fusionsproteins erfolgte die Spaltung mit einer höher konzentrierten Säure und eine SP-Trisacryl-Säule wurde als zusätzliche Reinigungsstufe eingesetzt. Die COP oder OP Fraktionen wurden dann einer HPLC auf einer Semi-prep C-18 Säule unterzogen.
Für die Anfangsbedingungen zum Rückfalten der COP Analoga oder OP1 bei pH 8,0 wurden Tris, Gu-HCl, Dithiothreitol verwendet. Für die Endbedingungen zum Rückfalten der COP Analoga bei pH 8,0 wurden Tris, oxidiertes Glutathion und geringe Teile an Gu-HCl und Dithiothreitol verwendet. Alternativ werden die COP oder OP1 Proteine in 50 mM HCl, 6 M Guanidin-HCl, pH 8,0, 18 Stunden bei 4ºC suspendiert. Ein Rückfalten dürfte nicht erforderlich sein, falls die Proteine in tierischen Zellen exprimiert werden.

Antiseraproduktion

Antisera gegen COP7 und COP5 wurden in weißen Neuseeland-Kaninchen produziert. Western Blots zeigen, daß die Antisera mit COP7 und COP5 Präparaten reagieren. Das Antisera gegen COP7 sind auf Reaktivität an Proben von natürlichem osteogenen Protein bovinen Ursprungs getestet worden. Western Blots zeigen eine eindeutige Reaktion mit dem 30 kD Protein und, wenn reduziert, mit der 16 kD Untereinheit. Die immunreaktive Species scheint als ein eng-benachbartes Dublett in dem 16 kD Untereinheiten-Bereich, ähnlich wie das 1.6 kD Dublett in Con A Blots.

MATRIX PRÄPARATION

Generelle Überlegungen über die Matrixeigenschaften

Der unten im Biotest-Teil beschriebene Träger kann entweder durch eine biologisch abbaubare oder synthetische anorganische Matrix (z. B. HAP, Kollagen, Tricalciumphosphat oder Polymuchsäure, Polyglycolsäure und verschiedene Copolymere davon) ersetzt werden. Auch xenogene Knochen können verwendet werden, wenn sie, wie oben beschrieben, vorbehandelt sind.
Untersuchungen haben gezeigt, daß Oberflächenladung, Partikelgröße, das Vorhandensein von Mineralien und die Verfahrensweise bei Vereinigung der Matrix und des osteogenen Proteins alles eine Rolle für das Erzielen einer erfolgreichen Knocheninduktion spielt. Ladungsstörungen durch chemische Modifikation zerstören die induktive Antwort. Die Partikelgröße beeinflußt quantitativ die Reaktion des neuen Knochens; Partikel mit einer Größe zwischen 75 und 420 µm lösen die maximale Antwort aus. Eine Kontaminierung der Matrix mit Knochenmineralien hemmt die Knochenbildung. Am wichtigsten ist, daß die verwendeten Verfahren zur Formulierung des osteogenen Proteins auf der Matrix äußerst empfindlich für den physikalischen und chemischen Status sowohl des osteogenen Proteins als auch der Matrix sind.
Die Abfolge zellulärer Reaktionen an der Schnittstelle Knochen-Matrix/OP Implantate sind komplex. Die vielstufige Kaskade umfaßt: Binden von Fibrin und Fibrinonektin an der implantierten Matrix, Chemotaxie der Zellen, Proliferation der Fibroblasten, Differenzierung zu Chondroblasten, Knorpelbildung, Einwachsen von Gefäßen, Knochenbildung, Reorganisation und Knochenmarkdifferenzierung.
Ein geeigneter Träger für das osteogene Protein muß mehrere wichtige Funktionen erfüllen. Dieser muß das osteogene Protein binden und als langsames Freisetzungsversorgungssystem fungieren, sich jedem Schritt der zellulären Antwort während der Knochenentwicklung anpassen und das osteogene Protein vor unspezifischer Proteolyse schützen. Zusätzlich müssen die ausgewählten Materialien in vivo biokompatibel und biologisch abbaubar sein; der Träger muß als zeitweiliges Gerüst fungieren, bis er durch den neuen Knochen vollständig ersetzt ist. Die Biokompatibilität erfordert, daß die Matrix keine signifikanten Entzündungen auslöst, wenn sie implantiert ist, und vom Wirtstier nicht abgestoßen wird. Die biologische Abbaubarkeit erfordert, daß die Matrix langsam vom Wirtskörper während der Entwicklung des neuen Knochens oder Knorpeis absorbiert wird. Polymilchsäure (PLA), Polyglycolsäure (PGA) und verschiedene Kombinationen haben in vivo unterschiedliche Zerfallsraten. In Knochen können die Zerfallsraten entsprechend variieren, je nachdem ob das Implantat in kortikalen oder trabekulären Knochen eingepflanzt ist.
Die Matrix-Geometrie, Partikelgröße, das Vorhandensein von Oberflächenladung und die Porösität oder das Vorhandensein von Zwischenräumen mit einer hinreichenden Größe zwischen den Partikeln, um eine Zellinfiltration zu erlauben, sind alle wichtige Kriterien für eine erfolgreiche Matrix-Gestaltung. Es ist zu bevorzugen, daß die Matrix in die gewünschte Form des neuen Knochens gebracht wird und daß sie groß genug ist, um nicht heilende Defekte zu überbrücken. Untersuchungen an Ratten zeigen, daß der neue Knochen im wesentlichen in den Dimensionen der implantierten Vorrichtung gebildet wird.
Die Matrix kann einen formgebenden Festkörper umfassen, der aus locker haftendem partikularisierten Material hergestellt ist z. B. mit Kollagen. Sie kann auch einen geformten, porösen Festkörper oder einfach eine Aggregation eng gepackter Partikel, die durch das umgebende Gewebe fixiert werden, umfassen. Zerkleinerter Muskel oder anderes Gewebe kann ebenfalls verwendet werden. Große allogene Knochenimplantate können als Träger für die Matrix fungieren, wenn ihre Markhöhlen gereinigt sind und mit Partikeln und dem dispergierten osteogenen Protein gepackt sind.

Präparation einer biologisch aktiven allogenen Matrix

Demineralisierte Knochenmatrix wird aus den dehydratisierten Diaphysenschäften von Femur und Tibia der Ratte, wie hier beschrieben, präpariert, um eine Knochenpartikel-Größe, die ein 420 µm Sieb passiert, herzu stellen. Die Knochenpartikel werden einer dissoziativen Extraktion mit 4 M Guanidin-HCl unterzogen. Eine derartige Behandlung führt zu einem vollständigen Verlust der inhärenten Fähigkeit der Knochenmatrix, eine endochondrale Knochenbildung zu induzieren. Aus dem verbleibenden unlöslichen Material wird die Matrix hergestellt. Das Material ist natürlicherweise meist kollagenartig und nach Implantierung induziert es weder Knorpel- noch Knochenbildung. Alle neuen Präparate werden auf ihren Mineralgehalt und falsch Positive vor Gebrauch getestet. Der Totalverlust an biologischer Aktivität der Knochenmatrix wird wiederhergestellt, wenn eine aktive osteoinduktive Proteinfraktion oder ein reines Protein mit der biologisch inaktiven unlöslichen Kollagenmatrix rekonstruiert wird. Das osteomduktive Protein kann aus einem beliebigen Vertebraten, z. B. Rind, Schwein, Affen oder Mensch, gewonnen werden oder mit Hilfe rekombinanter DNS- Techniken produziert werden.

Päparation der deglycosylierten Knochenmatrix zur Verwendung in xenogenen Implantaten

Wenn das osteogene Protein mit kollagener Knochenmatrix von anderen Species rekonstruiert wird und in eine Ratte implantiert wird, so unterbleibt die Knochenbildung. Dies läßt vermuten, daß zwar das osteogene Protein fremd ist (nicht species-spezifisch), wohingegen die Matrix species-spezifisch ist und nicht Species übergreifend implantiert werden kann, vielleicht aufgrund intrinsisch immunogener oder hemmender Komponenten. Folglich war früher für auf Knochen basierende Matrices eine Species-spezifische Kollagen-Knochenmatrix erforderlich, damit das osteogene Protein seine volle Knocheninduktionsaktivität zeigen konnte.
Die Hauptkomponente sämtlicher Knochenmatrices ist das Typ I Kollagen. Zusätzlich zum Kollagen enthält der extrahierte Knochen Nichtkollagenproteine, die 5% seiner Masse ausmachen. Viele der Nichtkollagenkomponenten der Knochenmatrix sind Glycoproteine. Obwohl die biologische Bedeutung der Glycoproteine bei der Knochenbildung nicht bekannt ist, könnten sie potente Antigene aufgrund ihres Carbohydrat -Gehalts darstellen und könnten immunogene und/oder hemmende Komponenten, die in der Fremdmatrix vorhanden sind, bilden.
Es ist jetzt entdeckt worden, daß eine kollagene Knochenrnatrix als ein Träger verwendet werden kann, um eine Knocheninduktionsaktivität in Fremdimplantaten zu bewirken, wenn man zuerst die immunogenen und hemmenden Komponenten aus der Matrix entfernt. Die Matrix wird für diesen Zweck mit Hilfe von, beispielsweise Fluorwasserstoff, chemisch deglycosyliert.
Ein boviner Knochenrest, wie oben beschrieben präpariert, wird gesiebt und Partikel zwischen 74-420 µm werden gesammelt. Die Probe wird im Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet, in das Reaktionsgefäß überführt und getrockeneter Fluorwasserstoff (HF) (10-20 ml/g Matrix) wird dann auf die Probe bei -70 C aufgeträufelt. Das Gefäß wird dann auf 0ºC erwärmt und die Reaktionsmischung wird dann bei dieser Temperatur 120 min gerührt. Nach dem Verdampfen von HF im Vakuum, wird dann der Rest im Vakuum über KOH Plätzchen gründlich getrocknet, um jegliche verbliebenen Säurespuren zu entfernen.
Der Umfang der Deglycosylierung kann durch Kohlenhydrat-Analyse der Matrix-Proben, die vor und nach Behandlung mit HF entnommen werden und nach geeignetem Waschen der Proben, um nicht-kovalent gebundene Kohlenhydrate zu entfernen, bestimmt werden.
Die deglycosylierte Knochenmatrix wird als nächstes, wie unten angeführt, behandelt:
1) Suspendieren in TBS (Tris-gepufferte Sahne) 1 g/200 ml und 2 Stunden bei 4ºC Rühren; oder in 6 M Harnstoff, 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 7,0 (UTBS) und 30 min Rühren bei RT;
2) Zentrifugieren und Waschen mit TBS oder UTBS wie in Schritt 1; und
3) Zentrifugieren; den Überstand verwerfen; Rückstand mit Wasser waschen; und dann Lyophilisieren.

HERSTELLUNG DER VORRICHTUNG

Die Herstellung der osteogenen Vorrichtungen unter Verwendung einer beliebigen der oben angeführten Matrices mit einem beliebigen der oben angeführten osteogenen Proteinen kann folgendermaßen durchgeführt werden.

A. Ethanolfällung

In diesem Verfahren wird die Matrix zu dem osteogenen Protein in Guanidin-HCl gegeben. Die Proben werden vortexiert und bei einer niedrigen Temperatur inkubiert. Die Proben werden dann weiter vortexiert. Kaltes absolutes Ethanol werden zu der Mischung gegeben, die dann ge rührt und inkubiert wird. Nach Zentrifugation (Microfuge max. Geschwindigkeit) wird der Überstand verworfen. Die rekonstituierte Matrix wird mit kaltem konzentrierten Ethanol in Wasser gewaschen und dann lyophilisiert.

B. Lyophilisierung mit Acetonitril-Trifluoressigsäure

In diesem Verfahren wird das osteogene Protein in einer Acetonitril-Trifluoressigsäure (ACN/TFA) Lösung zu dem Träger gegeben. Die Proben werden mehrmals kräftig vortexiert und dann lyophilisiert.

C. Harnstoff Lyophilisierung

In Harnstoff-Puffer hergestellte Proteine werden mit der Matrix gemischt, mehrmals vortexiert und dann lyophilisiert. Das lyophilisierte Material, kann so "wie es ist", als Implantat verwendet werden.

IN VIVO RATTEN-BIOTEST

Verschiedene synthetische Proteine sind in Matrices eingebaut worden, um osteogene Vorrichtungen herzustellen, und in Ratten auf endochondrale Knochenbildung getestet worden. Untersuchungen an Ratten zeigen, daß der osteogene Effekt von der Dosis des in der osteogenen Vorrichtung dispergierten osteogenen Proteins abhängt. Keine Aktivität wird beobachtet, wenn ausschließlich die Matrix implantiert ist. Die folgende Richtschnur gibt bekannt wie die hier veröffentlichten osteogenen Vorrichtungen zur Evaluierung der Proteinkonstrukte und Matrices auf ihre biologische Aktivität getestet werden können.

A. Subkutane Implantation

Der Biotest auf Knocheninduktion, wie von Sampath und Reddi beschrieben (Proc. Natl. Sci. USA (1983) 80:6591-6595), hier als Referenz erwähnt, wird zur Abschätzung der endochondralen Knochendifferenzierungsaktivität verwendet. Dieser Test besteht aus der Implantion der zu testenden Proben in subkutane Stellen in allogenen Empfängerratten unter Ethernarkose. Männliche Long-Evans Ratten im Alter von 28-32 Tagen wurden verwendet. Ein vertikaler Schnitt (1 cm) wird unter sterilen Bedingungen in die Haut über der Thorax- Region gemacht und eine Tasche wird durch groben Schnitt präpariert. Annähernd 25 mg der zu testenden Probe wird tief in der Tasche implantiert und der Schnitt wird mit einer metallenen Hautklammer verschlossen. Der Tag der Implantation wird als Tag eins des Versuchs bezeichnet. Implantate wurden am Tag 12 entfernt. Die heterotope Stelle erlaubt die Untersuchung auf Knocheninduktion ohne die möglichen Mehrdeutigkeiten, die an einer orthotopen Stellen sich ergeben können.

B. Zellulare Ereignisse

Das implantierte Modell in Ratten zeigt eine kontrollierte Progression über die Stadien von Matrix indu zierter endochondraler Knochenentwicklung, die umfaßt: (1) vorübergehende Infiltration von polymorphonuclearen Leukocyten an Tag eins; (2) Migration und Proliferation von Mesenchymzellen an Tag zwei und drei; (3) Erscheinen von Chondrocyten an Tag fünf und sechs; (4) Knorpel- Matrix-Bildung an Tag sieben; (5) Knorpelcalcifizierung an Tag acht; (6) Einwachsen von Gefäßen, Auftauchen von Osteoblasten und Knochenneubildung an Tag neun und zehn; (7) Auftauchen von osteoblastischem und Knochenreorganisation und Auflösung der implantierten Matrix an Tag zwölf bis achtzehn; und (8) hämatopoetische Knochenmarkdifferenzierung in dem Ossiculum an Tag einundzwanzig. Die Ergebnisse zeigen, daß die Form des neuen Knochens mit der Form der implantierten Matrix übereinstimmt.

C. Histologische Evaluation

Gewebeschnitte und -Färbung werden zur Bestimmung des Ausmaß der Osteogenese in den Implantaten bevorzugt. Die Implantate werden in Bouins-Lösung fixiert, in Parafilm eingebettet, in 6-8 mm Schnitte geschnitten. Eine Färbung mit Toluidin-Blau oder Hämotoxilin/Eosin zeigt eindeutig die letzte Entwicklung des endochondralen Knochens. Zwölf Tage alte Implantate sind gewöhnlich hinreichend, um zu bestimmen, ob die Implantate eine Knocheninduktionsaktivität zeigen.

D. Biologische Marker

Alkalische Phosphatase-Aktivität kann als ein Marker für die Osteogenese verwendet werden. Die Enzymaktivität kann spektrophotometrisch nach Homogenisierung des Implantats bestimmt werden. Die Aktivitätsmaxima werden nach 9-10 Tagen in vivo erhalten und danach erfolgt eine leichte Abnahme. Implantate, die histologisch gesehen keine Knochenentwicklung zeigen, sollten keine oder nur eine geringe alkalische Phosphatase-Aktivität unter diesen Versuchsbedingungen besitzen. Der Test ist für eine Quantifizierung und Abschätzung der Knochenentwicklung sehr rasch nach Entfernung der Implantate aus der Ratte zweckdienlich. Alternativ kann die Menge an gebildetem Knochen durch Messen des Calciumgehalts des Implantats bestimmt werden.
Die dem osteogenen Protein zugeschriebene osteogene Aktivität wird durch "Knochenbildungseinheiten" ausgedrückt. Eine Knochenbildungseinheit stellt die Menge an Protein dar, die für halbmaximale Knochenbildungsaktivität im Vergleich zu demineralisierter Knochenmatrix der Ratte als Kontrolle benötigt wird, und mit Hilfe des Calciumgehalts des Implantats an Tag 12 bestimmt wird.
Vorrichtungen, die ausschließlich einen Träger aus Rattenmaterial enthalten, zeigen keinerlei Knochenneubildung. Das Implantat besteht aus einer Trägermatrix aus Rattenmaterial und umgebenden Mesenchymzellen. Wiederum zeigten Vorrichtungen, die einen Träger aus Rattenmaterial und kein korrekt gefaltetes (oder biologisch inaktives) rekombinantes Protein enthielten, ebenfalls keinerlei Knochenbildung. Diese Implantate werden für Knorpelbildung mit (-) und Knochenbildung mit (-) bewertet. Die endochondrale Knochenbildungsaktivität wird als null Prozent (0%) bewertet (Abb. 3A).
Implantate mit biologisch aktivem rekombinanten Protein zeigten jedoch eindeutig eine endochondrale Knochenbildung. Histologisch gesehen, zeigten diese Implantate die Bildung neuen Knorpels und neuen Knochens.
Die Knorpelbildung wird mit (+) bei Vorhandensein metachromatisch gefärbter Chondrocyten im Zentrum des Implantats, mit (++) bei Vorhandensein zahlreicher Chondrocyten in vielen Bereichen des Implantats und mit (+++) bei Vorhandensein sehr vieler Chondrocyten, die eine Knorpelmatrix bilden, und dem Auftauchen hypertrophierter Chondrocyten, was mit der Knorpelcalcifizierung einhergeht, bewertet (Abb. 3B).
Die Knochenbildung wird bewertet mit (+) bei Vorhandensein von Osteoblasten, die das vaskuläre Endothel umgeben und eine neue Matrix bilden, mit (++) bei Knochenbildung durch Osteoblasten (wie mit Pfeilen angezeigt) und ferner Knochenreorganisation durch das Auftauchen von Osteoklasten im Gegensatz zu der neu gebildeten Knochenmatrix. Das Einwachsen von Gefäßen ist in diesen Implantaten eindeutig. (Abb. 3B). Die Bildung wird mit (+++) bei Vorhandensein eines ausgedehnten reorganisierten Knochens, der zur Bildung von Ossicula führt, bewertet.
Die Knocheninduktionsaktivität aufgrund des rekombinanten Proteins wird als prozentuale Antwort der endochondralen Knochenbildung dargestellt (siehe Tabelle 2 unten). TABELLE 2 HISTOLOGISCHE EVALUATION DES REKOMBINANTEN KNOCHENINDUKTIVEN PROTEINS
Die vorliegenden Anwendungen sind in jeglicher Hinsicht als Erläuterung und nicht als Einschränkung zu betrachten, der Umfang der Erfindung wird eher durch die nachfolgenden Ansprüche als durch die vorausgehende Beschreibung aufgezeigt.

Claims

1. Verwendung einer Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Induktion der Knochenbildung, wobei die Zusammensetzung im wesentlichen aus einem dimeren osteogenen Protein, das von einer einzigen DNS-Sequenz codiert wird, als dem aktiven osteogenen Bestandteil besteht, wobei besagte DNS-Sequenz eine Polypeptidkette codiert, die eine Aminosäure-Sequenz umfaßt, die einer Sequenz

hinreichend entspricht, so daß besagte Polypeptidkette, wenn dimerisiert, in der Lage ist, die Knorpel- und endochondrale Knochenbildung zu induzieren, wenn sie in einen Säuger in Verbindung mit einer Matrix implantiert ist.

2. Die Verwendung gemäß Anspruch 1, worin besagtes Protein erhältlich ist durch:

(a) Konstruieren eines DNS-Moleküls, das eine DNS- Sequenz gemäß Anspruch 1 umfaßt;

(b) Einführen besagten DNS-Moleküls in eine Wirtszelle;

(c) Kultivieren besagter Wirtszelle unter für eine Expression besagten DNS-Moleküls geeigneten Bedingungen, um eine Polypeptidkette herzustellen; und

(d) Wiedergewinnen und Reinigen des dimeren osteogenen Proteins, das besagte Polpeptidkette umfaßt.

3. Die Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin besagtes osteogenes Protein die Aminosäure-Sequenz umfaßt:

4. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin besagte Polypeptidkette eine homologe oder mutierte Form der Aminosäure-Sequenz umfaßt.

5. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin besagte DNS-Sequenz cDNS umfaßt.

6. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin besagte DNS-Sequenz genomische DNS oder chemisch synthetisierte Oligonucleotide umfaßt.

7. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, worin besagte Wirtszelle eine Säugerzelle, z. B. eine CHO-Zelle, ist.

8. Die Verwendung gemäß einem der Anspruche 2 bis 7, worin besagte Wirtszelle eine E. coli, Bacillus oder Hefezelle ist.

9. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin besagte Polypeptidkette weniger als 200 Aminosäuren umfaßt.

10. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin besagtes Medikament ferner umfaßt: (A) eine Matrix, die umfaßt: (a) allogenen Knochen, z. B. demineralisierten, Protein extrahierten, partikulären, allogenen Knochen, (b) demineralisierten, Protein extrahierten, partikulären, deglycosylierten xenogenen Knochen, (c) demineralisierten, Protein extrahierten, partikulären xenogenen Knochen, behandelt mit HF oder einer Protease, (d) Materialien, gewählt aus Kollagen, Hydroxyapatit, Calciumphosphaten (z. B. Tricalciumphosphat) und Polymeren, die Glycolsäure und/oder Milchsäure Monomere umfassen, (e) einen formstabilen Festkörper aus locker haftendem partikulären Material z. B. Kollagen, (f) einen porösen Festkörper oder (g) zerkleinertes Gewebe z. B. Muskel; oder (B) einen Träger, der als ein langsames Abgabe-Liefer-System wirkt, jeden Schritt der Zellantwort während der Knochenentwicklung versorgt, das osteogene Protein vor unspezifischer Proteolyse schützt und biokompatibel und biologisch abbaubar ist.

11. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei besagtes Medikarnent zur Induktion lokaler Knochenbildung in einem Säuger durch Implantation in einen Säuger an einen Ort, der für migrierende Vorläuferzellen zugänglich ist, zur Wiederherstellung nicht zusammenwachsender Frakturen und zur Korrektur erworbener oder kongenitaler craniofacialer und anderen Skelettanomalien oder dentalen Anomalien, einschließlich zur periodontalen Behandlung, dient.

12. Die Verwendung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei besagtes Medikament zur Induktion lokaler Knochen- und Knorpelbildung dient.

13. Ein osteogenes Liefer- oder Versorgungssystem, das adaptiert ist, Knochenbildung in einem Säuger zu induzieren, das eine Zusammensetzung, wie in Anspruch 1 definiert, als den einzigen aktiven osteogenen Bestandteil umfaßt, wobei das Liefer- oder Versorgungssystem geformt ist, um einen Knochendefekt zu überbrücken.

14. Das osteogene System nach Anspruch 13, worin:

(A) das osteogene Protein durch die Schritte wie in Anspruch 2 definiert (worin beispielsweise die Wirtszelle, wie in Anspruch 7 oder Anspruch 8 definiert, ist) erhältlich ist, oder

(B) das osteogene Protein umfaßt; (a) die Aminosäure- Sequenz nach Anspruch 3, oder (b) die homologe oder mutierte Form der Aminosäure-Sequenz, wie in Anspruch 4 definiert;

oder

(C) die DNS-Sequenz so ist, wie in Anspruch 5 oder Anspruch 6 definiert;

(D) die Polypeptidkette so ist, wie in Anspruch 9 definiert; oder

(E) das Liefer- oder Versorgungssystem eine Matrix oder ein Träger ist, wie in Anspruch 10 definiert; oder

(F) das osteogene Liefer- oder Versorgungssystem für die Verwendungen dient, wie in Anspruch 11 oder Anspruch 12 definiert.