JP3356775B2 - ＴＧＦ―βとの共同的組合せによる骨修復のための骨形成タンパク質の使用 - Google Patents
ＴＧＦ―βとの共同的組合せによる骨修復のための骨形成タンパク質の使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、骨成形術に関する。特に本発明は、骨の成
長を誘導するタンパク質の組合せ、この組合せを含む薬
学的組成物、このような組成物を使用する骨成長を促進
する方法、骨髄前駆細胞を刺激し、骨髄細胞へ***およ
び分化させる方法、ならびに骨粗しょう症のような、骨
の生成および／または骨の再吸収の機能障害／機能不全
に関連する疾病の治療方法に関する。
長を誘導するタンパク質の組合せ、この組合せを含む薬
学的組成物、このような組成物を使用する骨成長を促進
する方法、骨髄前駆細胞を刺激し、骨髄細胞へ***およ
び分化させる方法、ならびに骨粗しょう症のような、骨
の生成および／または骨の再吸収の機能障害／機能不全
に関連する疾病の治療方法に関する。
技術背景 骨が、生体系（living systems）と接触することによ
って新しい骨の形成を刺激し得る物質を含んでいること
が立証されている。（Urist,M.R.,Clin Orthop（1968）
56:37;Science（1965）150:893;Reddi,A.H.ら,Proc Nat
l Acad Sci（USA）（1972）69:1601）。この活性の原因
となる因子を精製する試みがなされてきた。Uristの米
国特許第4,294,753号および第4,455,256号によれば、尿
素または塩酸グアニジンを使用して、脱塩した骨から
「骨形成タンパク質」（BMP）が抽出され、そして再沈
降された。次いで、Uristは、この粗製タンパク質混合
物のイオン交換精製により、pH4.8で、活性がカルボキ
シメチルセルロース樹脂（CMC）に吸着しないことを報
告した（Urist,M.R.,Clin Orthop Rel Res（1982）162:
219）。Science（1983）220:680−685およびProc Natl
Acad Science（USA）（1984）81:371−375におけるUris
tの報告は、17,500および18,500ダルトンの分子量を有
するBMPを記載している。Uristの公開特許、EPA公開第0
212474号は、BMPの限定タンパク質分解によって得られ
た4,000から7,000ダルトンのBMPフラグメントを記載し
ている。
って新しい骨の形成を刺激し得る物質を含んでいること
が立証されている。（Urist,M.R.,Clin Orthop（1968）
56:37;Science（1965）150:893;Reddi,A.H.ら,Proc Nat
l Acad Sci（USA）（1972）69:1601）。この活性の原因
となる因子を精製する試みがなされてきた。Uristの米
国特許第4,294,753号および第4,455,256号によれば、尿
素または塩酸グアニジンを使用して、脱塩した骨から
「骨形成タンパク質」（BMP）が抽出され、そして再沈
降された。次いで、Uristは、この粗製タンパク質混合
物のイオン交換精製により、pH4.8で、活性がカルボキ
シメチルセルロース樹脂（CMC）に吸着しないことを報
告した（Urist,M.R.,Clin Orthop Rel Res（1982）162:
219）。Science（1983）220:680−685およびProc Natl
Acad Science（USA）（1984）81:371−375におけるUris
tの報告は、17,500および18,500ダルトンの分子量を有
するBMPを記載している。Uristの公開特許、EPA公開第0
212474号は、BMPの限定タンパク質分解によって得られ
た4,000から7,000ダルトンのBMPフラグメントを記載し
ている。
米国特許第4,608,199号は、30,000から32,000ダルト
ンの骨由来タンパク質を記載している。このタンパク質
は、水溶性であり、コンカナバリンＡ（ConA）に対して
親和性を有していないことが記載されている。
ンの骨由来タンパク質を記載している。このタンパク質
は、水溶性であり、コンカナバリンＡ（ConA）に対して
親和性を有していないことが記載されている。
WO 88/00205は、BMP−１、BMP−２クラスＩ（“BMP−
2"）、BMP−３およびBMP−２クラスII（“BMP−4"）と
命名される４つのタンパク質を報告しており、これら
は、骨形成活性を有していることが記載されている。こ
れらのBMPが、それ自体で骨形成活性を有しているの
か、または他の因子との組合せを必要としているのかは
知られていない。
2"）、BMP−３およびBMP−２クラスII（“BMP−4"）と
命名される４つのタンパク質を報告しており、これら
は、骨形成活性を有していることが記載されている。こ
れらのBMPが、それ自体で骨形成活性を有しているの
か、または他の因子との組合せを必要としているのかは
知られていない。
J.M.Wozneyは、Growth Factor Research,Vol.1（198
9）,pp.267−280において、BMP−２に密接に関連したさ
らに３つのBMPタンパク質を記載しており、それらは、B
MP−５、BMP−６およびBMP−７と命名されている。
9）,pp.267−280において、BMP−２に密接に関連したさ
らに３つのBMPタンパク質を記載しており、それらは、B
MP−５、BMP−６およびBMP−７と命名されている。
WO 89/09787および89/09788は、「OP−１」と呼ばれ
る、現在ではBMP−７として知られるタンパク質を記載
している。BMP−７のクローン化は、E.Ozkaynakら、EMB
O Journal（1990）９:2085−2093に記載されており、BM
P−７の精製は、T.K.Sampathら、J Biol Chem（1990）2
65:13198−13205に記載されている。
る、現在ではBMP−７として知られるタンパク質を記載
している。BMP−７のクローン化は、E.Ozkaynakら、EMB
O Journal（1990）９:2085−2093に記載されており、BM
P−７の精製は、T.K.Sampathら、J Biol Chem（1990）2
65:13198−13205に記載されている。
SeyedinおよびThomasの米国特許第4,434,094号は、カ
オトロピック剤を用いた抽出、アニオンおよびカチオン
交換カラムを用いた分画、およびpH4.8におけるCMCへ吸
着した画分からの活性の回収による骨生成を刺激する骨
由来タンパク質の部分的生成を報告した。この新しいタ
ンパク質画分は、「骨形成因子」（OF）と名付けられ、
約30,000ダルトン未満の分子量を有するものとして特徴
づけられた。
オトロピック剤を用いた抽出、アニオンおよびカチオン
交換カラムを用いた分画、およびpH4.8におけるCMCへ吸
着した画分からの活性の回収による骨生成を刺激する骨
由来タンパク質の部分的生成を報告した。この新しいタ
ンパク質画分は、「骨形成因子」（OF）と名付けられ、
約30,000ダルトン未満の分子量を有するものとして特徴
づけられた。
本譲受人が所有する米国特許第4,774,332号は、カオ
トロピック剤を用いた抽出およびイオン交換カラム分画
によって均一に精製された、２つの骨由来のタンパク質
を記載している。これら２つのタンパク質は、初めは、
軟骨誘導因子（CIF）ＡおよびCIF Bと呼ばれた。次い
で、CIF Aは、腫瘍増殖因子β（TGF−β）と呼ばれる、
以前に同定されたタンパク質と同一であることが見い出
された。CIF Bは、TGF−βの新規の形態であることが見
い出され、現在はTGF−β２として知られ、CIF Aは、TG
F−β１として知られている。
トロピック剤を用いた抽出およびイオン交換カラム分画
によって均一に精製された、２つの骨由来のタンパク質
を記載している。これら２つのタンパク質は、初めは、
軟骨誘導因子（CIF）ＡおよびCIF Bと呼ばれた。次い
で、CIF Aは、腫瘍増殖因子β（TGF−β）と呼ばれる、
以前に同定されたタンパク質と同一であることが見い出
された。CIF Bは、TGF−βの新規の形態であることが見
い出され、現在はTGF−β２として知られ、CIF Aは、TG
F−β１として知られている。
その他のTGFについてもまた記載されている。Derynck
らの米国特許第4,886,747号は、TGF−β３の同定および
そのヌクレオチド配列を記載しており、組換え細胞培養
物からのTGF−β３の回収方法を開示している。S.B.Jak
owlewら、Molec Endocrinol（1988）２:1186−1195は、
TGF−β４、およびcDNA特徴付けによって同定されるそ
のヌクレオチド配列を記載している。A.B.Robertsら、G
row＋h Factors,Vo1.2（1990）,pp.135−147は、Xenopu
sで調整した培地からのTGF−β５の精製を記載してい
る。
らの米国特許第4,886,747号は、TGF−β３の同定および
そのヌクレオチド配列を記載しており、組換え細胞培養
物からのTGF−β３の回収方法を開示している。S.B.Jak
owlewら、Molec Endocrinol（1988）２:1186−1195は、
TGF−β４、およびcDNA特徴付けによって同定されるそ
のヌクレオチド配列を記載している。A.B.Robertsら、G
row＋h Factors,Vo1.2（1990）,pp.135−147は、Xenopu
sで調整した培地からのTGF−β５の精製を記載してい
る。
異なる場所での骨誘導活性をその精製に使用して、骨
誘導因子（OIF）と命名されたウシの骨由来の新規な糖
タンパク質もまた、報告されている（Bentz,H.ら、J.Bi
ol.Chem.（1989）264:20805−20810）。最初、これらの
「OIF調製物」の骨誘導活性は、TGF−β１または２のい
ずれかによって実質的に向上され得ると考えられた（Be
ntz,H.ら、J.Biol.Chem.（1989）264:20805−20810;Ben
tz,H.ら、Development and Diseases of Cartilage and
Bone Matrix（A.SenおよびT.Thornhill編）pp.137−14
7,Alan R.Liss,Inc.（1987）New York）。しかし、後
に、OIF活性を有すると思われていた因子は、実は、そ
の活性を有していないことが見い出された。
誘導因子（OIF）と命名されたウシの骨由来の新規な糖
タンパク質もまた、報告されている（Bentz,H.ら、J.Bi
ol.Chem.（1989）264:20805−20810）。最初、これらの
「OIF調製物」の骨誘導活性は、TGF−β１または２のい
ずれかによって実質的に向上され得ると考えられた（Be
ntz,H.ら、J.Biol.Chem.（1989）264:20805−20810;Ben
tz,H.ら、Development and Diseases of Cartilage and
Bone Matrix（A.SenおよびT.Thornhill編）pp.137−14
7,Alan R.Liss,Inc.（1987）New York）。しかし、後
に、OIF活性を有すると思われていた因子は、実は、そ
の活性を有していないことが見い出された。
単離された調製物中の骨誘導活性が、単一タンパク質
によるものか、または複数のタンパク質が共同で作用し
たものかは知られていない。骨誘導活性に関与するタン
パク質の同定は、骨から抽出されるタンパク質の膨大な
数（数百と推定される）と、骨誘導活性の決定的なイン
ビトロアッセイがないことにより複雑になっている。
によるものか、または複数のタンパク質が共同で作用し
たものかは知られていない。骨誘導活性に関与するタン
パク質の同定は、骨から抽出されるタンパク質の膨大な
数（数百と推定される）と、骨誘導活性の決定的なイン
ビトロアッセイがないことにより複雑になっている。
発明の要旨 本発明は、予想しなかった２つの発見から生じたもの
である。その１つは、ウシの骨由来の部分的に精製され
た「OIF調製物」中の骨形成刺激活性が、明らかに、BMP
−２、BMP−３、BMP−４およびBMP−７を含む、調製物
中のBMPの存在に起因することである。もう１つは、TGF
−βが、BMP−２、BMP−３、BMP−４およびBMP−７を含
むBMPと共に投与されると、骨形成活性において共同の
効果が得られるという、細胞増殖効果を有することであ
る。
である。その１つは、ウシの骨由来の部分的に精製され
た「OIF調製物」中の骨形成刺激活性が、明らかに、BMP
−２、BMP−３、BMP−４およびBMP−７を含む、調製物
中のBMPの存在に起因することである。もう１つは、TGF
−βが、BMP−２、BMP−３、BMP−４およびBMP−７を含
むBMPと共に投与されると、骨形成活性において共同の
効果が得られるという、細胞増殖効果を有することであ
る。
従って、本発明の第１の目的は、軟骨および／または
骨の欠陥を治療するための、BMPおよびTGF−βを含む組
成物を提供することである。
骨の欠陥を治療するための、BMPおよびTGF−βを含む組
成物を提供することである。
本発明の他の目的は、生きた哺乳類における所定の部
位の骨の欠陥を、インビボで治療する方法を提供するこ
とである。
位の骨の欠陥を、インビボで治療する方法を提供するこ
とである。
本発明の他の目的は、生きた哺乳類における骨髄細胞
生産を誘導する方法を提供することである。
生産を誘導する方法を提供することである。
本発明のその他の目的、利点および新規な特徴は、以
下本明細書に一部説明し、以下の試験を行うことによっ
て、または本発明の実施によって、その一部が当業者に
明白となるであろう。
下本明細書に一部説明し、以下の試験を行うことによっ
て、または本発明の実施によって、その一部が当業者に
明白となるであろう。
本発明の１つの局面では、軟骨および／または骨の欠
陥をインビボで治療するための組成物であって、（ａ）
組織成長誘導に有効な量の骨形成タンパク質（BMP）お
よび、腫瘍増殖因子β（TGF−β）とを、（ｂ）薬学的
に受容可能なキャリヤーと共に含む組成物が提供され
る。
陥をインビボで治療するための組成物であって、（ａ）
組織成長誘導に有効な量の骨形成タンパク質（BMP）お
よび、腫瘍増殖因子β（TGF−β）とを、（ｂ）薬学的
に受容可能なキャリヤーと共に含む組成物が提供され
る。
本発明の他の局面では、インビボで所望の部位で軟骨
および／または骨の欠陥の治療方法であって、上記の組
成物を哺乳類の前記の部位に移植する工程を含む方法が
提供される。
および／または骨の欠陥の治療方法であって、上記の組
成物を哺乳類の前記の部位に移植する工程を含む方法が
提供される。
本発明のさらに他の局面では、生きた哺乳類での骨髄
細胞の生産の誘導方法であって、組織成長誘導に有効な
量の上記組成物を哺乳類に組織的に投与する工程を含む
方法が提供される。
細胞の生産の誘導方法であって、組織成長誘導に有効な
量の上記組成物を哺乳類に組織的に投与する工程を含む
方法が提供される。
図面の簡単な説明 図１は、骨誘導因子を含む画分のRP−HPLCクロマトグ
ラフィー分画を示す。
ラフィー分画を示す。
図２は、図１の工程において得られたいくつかの画分
のSDS−PAGEの結果を示す。
のSDS−PAGEの結果を示す。
図３は、図１の第１ピークからの物質のRP−HPLC分画
を示す。
を示す。
図４は、ピーク１タンパク質のペプチド配列と、BMP
−２およびBMP−３配列とを比較している。
−２およびBMP−３配列とを比較している。
図５は、TGF−β（●）を有する、およびTGF−β
（○）を有さないBMP−２＋３移植片の骨誘導特性を示
す。移植片のアルカリホスファターゼ（ALPase）活性を
アッセイし、０−５（最高）のスケールで、骨（Ｂ）お
よび軟骨（Ｃ）を組織学的に評価した。
（○）を有さないBMP−２＋３移植片の骨誘導特性を示
す。移植片のアルカリホスファターゼ（ALPase）活性を
アッセイし、０−５（最高）のスケールで、骨（Ｂ）お
よび軟骨（Ｃ）を組織学的に評価した。
発明の詳細な説明 定義： 明細書の用語「骨形成タンパク質」（BMP）は、イン
ビボでのネズミの骨形成アッセイでの活性により測定さ
れる、骨の形成を誘起し得る骨由来の１つのクラスのタ
ンパク質を指す。BMPは、BMP−１、BMP−２、BMP−３、
BMP−４、BMP−５、BMP−６およびBMP−７、ならびに、
天然のBMPの生物学的特徴を保持する、そのフラグメン
ト、欠失体、付加体、置換体、変異体および改変体を含
む。BMPは、ヒト、ウシまたは他の種の起源であり得
る。
ビボでのネズミの骨形成アッセイでの活性により測定さ
れる、骨の形成を誘起し得る骨由来の１つのクラスのタ
ンパク質を指す。BMPは、BMP−１、BMP−２、BMP−３、
BMP−４、BMP−５、BMP−６およびBMP−７、ならびに、
天然のBMPの生物学的特徴を保持する、そのフラグメン
ト、欠失体、付加体、置換体、変異体および改変体を含
む。BMPは、ヒト、ウシまたは他の種の起源であり得
る。
明細書の用語「腫瘍増殖因子β」（TGF−β）は、TGF
−β１、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４およびTGF−
β５を含む、細胞増殖を誘起し得るポリペプチドのファ
ミリー、ならびに天然のTGF−βの生物学的特徴を保持
する、そのフラグメント、欠失体、付加体、置換体、変
異体および改変体を指す。TGF−βは、ヒト、ウシまた
は他の種の起源であり得る。
−β１、TGF−β２、TGF−β３、TGF−β４およびTGF−
β５を含む、細胞増殖を誘起し得るポリペプチドのファ
ミリー、ならびに天然のTGF−βの生物学的特徴を保持
する、そのフラグメント、欠失体、付加体、置換体、変
異体および改変体を指す。TGF−βは、ヒト、ウシまた
は他の種の起源であり得る。
タンパク質の「変異」は、それをコードするDNAのヌ
クレオチド配列の変化による、（通常存在するタンパク
質に対する）その一次構造の変異である。これらの変異
には、遺伝子的に操作された変異体および対立変異体が
含まれる。「改変された」タンパク質は、グリコシル化
パターンまたはリピッド化パターン、あるいは、タンパ
ク質の一次構造、二次構造または三次構造を変化させる
翻訳後の事象の結果、通常存在するタンパク質とは異な
る。タンパク質の一次構造の変化はまた、欠失、付加ま
たは置換から生じ得る。「欠失体」は、１つまたはそれ
以上の内部アミノ酸残基が存在しないポリペプチドと定
義される。「付加体」は、野生型と比較して、１つまた
はそれ以上の付加された内部アミノ酸残基を有するポリ
ペプチドと定義される。「置換体」は、１つまたはそれ
以上のアミノ酸残基の他の残基による置換から生じる。
タンパク質「フラグメント」は、該ポリペプチドが関連
するタンパク質の一次配列の一部と同一の一次アミノ酸
配列からなるポリペプチドである。
クレオチド配列の変化による、（通常存在するタンパク
質に対する）その一次構造の変異である。これらの変異
には、遺伝子的に操作された変異体および対立変異体が
含まれる。「改変された」タンパク質は、グリコシル化
パターンまたはリピッド化パターン、あるいは、タンパ
ク質の一次構造、二次構造または三次構造を変化させる
翻訳後の事象の結果、通常存在するタンパク質とは異な
る。タンパク質の一次構造の変化はまた、欠失、付加ま
たは置換から生じ得る。「欠失体」は、１つまたはそれ
以上の内部アミノ酸残基が存在しないポリペプチドと定
義される。「付加体」は、野生型と比較して、１つまた
はそれ以上の付加された内部アミノ酸残基を有するポリ
ペプチドと定義される。「置換体」は、１つまたはそれ
以上のアミノ酸残基の他の残基による置換から生じる。
タンパク質「フラグメント」は、該ポリペプチドが関連
するタンパク質の一次配列の一部と同一の一次アミノ酸
配列からなるポリペプチドである。
好ましい「置換体」は、保存性、すなわち、残基は、
同じ遺伝型の他の残基と置換される、置換である。十分
理解されているように、天然に存在するアミノ酸は、酸
性、塩基性、中性極性、または中性非極性に細分類され
る。さらに、天然に存在する３つのアミノ酸は、芳香族
である。天然のBMPおよびTGF−βと異なるコードされた
ペプチドが、置換されたアミノ酸と同一のグループのア
ミノ酸の置換されたコドンを含んでいるのが一般に好ま
しい。従って、一般に、塩基性アミノ酸Lys、Argおよび
Hisは、互換可能である；酸性アミノ酸アスパラギン酸
およびグルタミン酸は、互換可能である；中性極性アミ
ノ酸Ser、Thr、Cys、ClnおよびAsnは、互換可能であ
る；非極性脂肪酸Gly、Ala、Val、IleおよびLeuは、互
いに保存性である（しかし、サイズにより、GlyとAlaと
はより密接に関連し、Val、IleおよびLeuはより密接に
関連している）、そして、芳香族アミノ酸Phe、Trpおよ
びThrは、互換可能である。プロリンは、非極性中性ア
ミノ酸であるが、コンホメーションへの影響により問題
を引き起こすため、同一のまたは同様のコンホメーショ
ンが得られ得る場合以外は、プロリンによる置換または
プロリンの置換は好ましくない。保存性の変化を示す極
性アミノ酸は、Ser、Thr、Gln、Asnを含む；そして、よ
り少ない程度保存性を示す極性アミノ酸にはMetを含
む。さらに、異なるカテゴリーに分類されるが、Ala、G
lyおよびSerは、互換可能なようであり、Cysは、付加的
にこのグループに適合し、あるいは、極性中性アミノ酸
として分類し得る。
同じ遺伝型の他の残基と置換される、置換である。十分
理解されているように、天然に存在するアミノ酸は、酸
性、塩基性、中性極性、または中性非極性に細分類され
る。さらに、天然に存在する３つのアミノ酸は、芳香族
である。天然のBMPおよびTGF−βと異なるコードされた
ペプチドが、置換されたアミノ酸と同一のグループのア
ミノ酸の置換されたコドンを含んでいるのが一般に好ま
しい。従って、一般に、塩基性アミノ酸Lys、Argおよび
Hisは、互換可能である；酸性アミノ酸アスパラギン酸
およびグルタミン酸は、互換可能である；中性極性アミ
ノ酸Ser、Thr、Cys、ClnおよびAsnは、互換可能であ
る；非極性脂肪酸Gly、Ala、Val、IleおよびLeuは、互
いに保存性である（しかし、サイズにより、GlyとAlaと
はより密接に関連し、Val、IleおよびLeuはより密接に
関連している）、そして、芳香族アミノ酸Phe、Trpおよ
びThrは、互換可能である。プロリンは、非極性中性ア
ミノ酸であるが、コンホメーションへの影響により問題
を引き起こすため、同一のまたは同様のコンホメーショ
ンが得られ得る場合以外は、プロリンによる置換または
プロリンの置換は好ましくない。保存性の変化を示す極
性アミノ酸は、Ser、Thr、Gln、Asnを含む；そして、よ
り少ない程度保存性を示す極性アミノ酸にはMetを含
む。さらに、異なるカテゴリーに分類されるが、Ala、G
lyおよびSerは、互換可能なようであり、Cysは、付加的
にこのグループに適合し、あるいは、極性中性アミノ酸
として分類し得る。
BMPまたはTGF−βまたはその両方を合成する場合に
は、天然の遺伝子にコードされていないアミノ酸による
置換もまた行ない得る。例えば、代替残基には、式H2N
（CH2）nCOOH、ここでｎは２−６、のω−アミノ酸が含
まれる。これらは、サルコシン、ｔ−ブチルアラニン、
ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチル−イソロイシンおよび
ノルロイシンのような、中性、非極性アミノ酸である。
例えば、フェニルグリシンのような他のアミノ酸で、芳
香族中性アミノ酸としてのTrp、TyrまたはPheを置換し
得る。シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性
極性、シクロヘキシルアラニンは中性非極性、システイ
ン酸は酸性、そしてオルニチンは塩基性である。もし、
これらの１つまたはそれ以上がヒドロキシプロリンと置
換されるならば、置換されたプロリン残基のコンホメー
ション寄与特性は、保持され得る。
は、天然の遺伝子にコードされていないアミノ酸による
置換もまた行ない得る。例えば、代替残基には、式H2N
（CH2）nCOOH、ここでｎは２−６、のω−アミノ酸が含
まれる。これらは、サルコシン、ｔ−ブチルアラニン、
ｔ−ブチルグリシン、Ｎ−メチル−イソロイシンおよび
ノルロイシンのような、中性、非極性アミノ酸である。
例えば、フェニルグリシンのような他のアミノ酸で、芳
香族中性アミノ酸としてのTrp、TyrまたはPheを置換し
得る。シトルリンおよびメチオニンスルホキシドは中性
極性、シクロヘキシルアラニンは中性非極性、システイ
ン酸は酸性、そしてオルニチンは塩基性である。もし、
これらの１つまたはそれ以上がヒドロキシプロリンと置
換されるならば、置換されたプロリン残基のコンホメー
ション寄与特性は、保持され得る。
タンパク質の生物学的「特徴」という用語は、タンパ
ク質が天然に存在する微生物の通常の生物学的工程中で
の、タンパク質の構造的または生化学的機能を指す。BM
Pの生物学的特徴の例に、その特異的な抗原性または免
疫原性、および／またはその骨誘起活性が挙げられる。
TGF−βの生物学的特徴には、その特異的な抗原性また
は免疫原性、および／または、インビボでの炎症応答お
よび化学走化性応答を媒介する能力が含まれる。
ク質が天然に存在する微生物の通常の生物学的工程中で
の、タンパク質の構造的または生化学的機能を指す。BM
Pの生物学的特徴の例に、その特異的な抗原性または免
疫原性、および／またはその骨誘起活性が挙げられる。
TGF−βの生物学的特徴には、その特異的な抗原性また
は免疫原性、および／または、インビボでの炎症応答お
よび化学走化性応答を媒介する能力が含まれる。
本明細書の用語「有効な量」は、患者に投与した時
に、毒性のような、耐え難い副作用を引き起こすことな
しに、所望のまたは目的とする有益な効果を提供するた
めに必要な治療薬剤の量を指す。
に、毒性のような、耐え難い副作用を引き起こすことな
しに、所望のまたは目的とする有益な効果を提供するた
めに必要な治療薬剤の量を指す。
組成物： 本発明の組成物には、２つの活性成分がある。BMPタ
ンパク質とTGF−βタンパク質である。これらの成分
は、組成物の骨形成能力に関して共同的に作用する。
ンパク質とTGF−βタンパク質である。これらの成分
は、組成物の骨形成能力に関して共同的に作用する。
好ましくは、BMP成分は、BMP−２、BMP−３、BMP−
４、BMP−７またはその混合物を含む。最も好ましく
は、BMP成分は、BMP−２およびBMP−３の混合物であ
る。好ましくは、TGF−β成分は、TGF−β１またはTGF
−β２またはその両方を含み、最も好ましくはTGF−β
２を含む。
４、BMP−７またはその混合物を含む。最も好ましく
は、BMP成分は、BMP−２およびBMP−３の混合物であ
る。好ましくは、TGF−β成分は、TGF−β１またはTGF
−β２またはその両方を含み、最も好ましくはTGF−β
２を含む。
２つの成分は、以下の３通りの方法の１つによって調
製され得る：（１）天然の産物の単離および精製による
調製方法；（２）合成による方法；および（３）組換え
による方法。
製され得る：（１）天然の産物の単離および精製による
調製方法；（２）合成による方法；および（３）組換え
による方法。
調製方法 BMP−１、BMP−２、BMP−３およびBMP−４
の単離および精製は、本明細書では参考文献として援用
する米国特許第4,877,864号に記載されている。BMP−７
の単離および精製は、T.K.Sampathら、J Biol Chem（19
90）265:13198−13205に記載されている。
の単離および精製は、本明細書では参考文献として援用
する米国特許第4,877,864号に記載されている。BMP−７
の単離および精製は、T.K.Sampathら、J Biol Chem（19
90）265:13198−13205に記載されている。
TGF−β１およびTGF−β２の単離および精製は、本明
細書では参考文献として援用する米国特許第4,774,332
号に記載されている。TGF−β５の単離および精製は、
A.B.Robertsら、Growth Factors,Vol.2（1990）,pp.135
−147に記載されている。
細書では参考文献として援用する米国特許第4,774,332
号に記載されている。TGF−β５の単離および精製は、
A.B.Robertsら、Growth Factors,Vol.2（1990）,pp.135
−147に記載されている。
合成による方法 本発明のBMPおよびTGF−βは、例え
ば、固相ペプチド合成のような当該技術分野で公知の手
段によって、化学的に合成し得る。それらのアミノ酸配
列は公知である、または、それらの当該技術分野に公知
のヌクレオチド配列から推定される。合成は、α−アミ
ノを保護したアミノ酸を使用し、ペプチドのカルボキシ
末端から開始される。他の保護基も適切であるが、ｔ−
ブチルオキシカルボニル（Boc）保護基を、すべてのア
ミノ基に使用し得る。例えば、Boc−Lys−OHまたはBoc
−Arg−OH（すなわち、BMP様カルボキシ末端アミノ酸）
を、クロロメチル化ポリスチレン樹脂支持体にエステル
化し得る。ポリスチレン樹脂支持体は、ポリスチレンポ
リマーを特定の有機溶媒に対して完全に不溶とする架橋
剤として、約0.5から２％のジビニルベンゼンを有する
スチレンのコポリマーであることが好ましい。Stewart
ら、Solid−Phase Peptide Synthesis（1969）,W.H.Fre
eman Co.,San Francisco,およびMerrifield,J.Am.Chem.
Soc.（1963）85:2149−2154を参照。ペプチドを合成す
るための種々の方法は、米国特許第3,862,925号、第3,8
42,067号、第3,972,859号および第4,105,602号にも例示
されている。
ば、固相ペプチド合成のような当該技術分野で公知の手
段によって、化学的に合成し得る。それらのアミノ酸配
列は公知である、または、それらの当該技術分野に公知
のヌクレオチド配列から推定される。合成は、α−アミ
ノを保護したアミノ酸を使用し、ペプチドのカルボキシ
末端から開始される。他の保護基も適切であるが、ｔ−
ブチルオキシカルボニル（Boc）保護基を、すべてのア
ミノ基に使用し得る。例えば、Boc−Lys−OHまたはBoc
−Arg−OH（すなわち、BMP様カルボキシ末端アミノ酸）
を、クロロメチル化ポリスチレン樹脂支持体にエステル
化し得る。ポリスチレン樹脂支持体は、ポリスチレンポ
リマーを特定の有機溶媒に対して完全に不溶とする架橋
剤として、約0.5から２％のジビニルベンゼンを有する
スチレンのコポリマーであることが好ましい。Stewart
ら、Solid−Phase Peptide Synthesis（1969）,W.H.Fre
eman Co.,San Francisco,およびMerrifield,J.Am.Chem.
Soc.（1963）85:2149−2154を参照。ペプチドを合成す
るための種々の方法は、米国特許第3,862,925号、第3,8
42,067号、第3,972,859号および第4,105,602号にも例示
されている。
合成は、用手法を用い、または例えばApplied Biosys
tems 430A型ペプチド合成装置（Foster City,Californi
a）またはBiosearch SAM II型自動ペプチド合成装置（B
iosearch,Inc.,San Rafael,California）を製造者によ
る手順書の指示に従い自動で使用し得る。
tems 430A型ペプチド合成装置（Foster City,Californi
a）またはBiosearch SAM II型自動ペプチド合成装置（B
iosearch,Inc.,San Rafael,California）を製造者によ
る手順書の指示に従い自動で使用し得る。
自動合成では配列の制御も可能なため、この合成方法
の使用で、アミノ酸配列の付加、置換および欠失も当然
可能になる。さらに、置換されたアミノ酸が遺伝子によ
ってコードされている必要もない。故に、Ｄ形あるいは
β−またはω−アミノ酸で、天然に存在するアミノ酸を
置換し得る。
の使用で、アミノ酸配列の付加、置換および欠失も当然
可能になる。さらに、置換されたアミノ酸が遺伝子によ
ってコードされている必要もない。故に、Ｄ形あるいは
β−またはω−アミノ酸で、天然に存在するアミノ酸を
置換し得る。
組換えによる方法 本発明のBMPおよびTGF−βはま
た、それらの同定および単離されたヌクレオチド配列を
使用し、そして、当該技術分野内の分子生物学、微生物
学、組換えDNA技術および免疫学といった従来の技術を
使用して製造し得る。このような技術は、文献に完全に
説明されている。例えば、Maniatis,FritschおよびSamb
rook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（198
2）;DNA Cloning,Volumes IおよびII（D.N.Glover編198
5）;Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編1984）;Nu
cleic Acid Hybridization（B.D.HamesおよびS.J.Higgi
ns編1984）;Transcription and Translation（B.D.Hame
sおよびS.J.Higgins編1984）;Animal Cell Culture（R.
K.Freshney編1986）;Immobilized Cells and Enzymes
（IRL press 1986）;Perbal,B.,A Practical Guide to
Molecular Cloning（1984）;Gene Transfer Vectors fo
r Mammalian Cells（J.H.MillerおよびM.P.Calos編、Co
ld Spring Harbor Laboratory,1987）;the series,Meth
ods in Enzymology（S.ColowickおよびN.Kaplan編、Aca
demic Press,Inc.）、およびHandbook of Experimental
Immunology,Volumes I−IV（D.M.WeirおよびC.C.Black
we11編、1986,Blackwell Scientific Publications）を
参照。
た、それらの同定および単離されたヌクレオチド配列を
使用し、そして、当該技術分野内の分子生物学、微生物
学、組換えDNA技術および免疫学といった従来の技術を
使用して製造し得る。このような技術は、文献に完全に
説明されている。例えば、Maniatis,FritschおよびSamb
rook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual（198
2）;DNA Cloning,Volumes IおよびII（D.N.Glover編198
5）;Oligonucleotide Synthesis（M.J.Gait編1984）;Nu
cleic Acid Hybridization（B.D.HamesおよびS.J.Higgi
ns編1984）;Transcription and Translation（B.D.Hame
sおよびS.J.Higgins編1984）;Animal Cell Culture（R.
K.Freshney編1986）;Immobilized Cells and Enzymes
（IRL press 1986）;Perbal,B.,A Practical Guide to
Molecular Cloning（1984）;Gene Transfer Vectors fo
r Mammalian Cells（J.H.MillerおよびM.P.Calos編、Co
ld Spring Harbor Laboratory,1987）;the series,Meth
ods in Enzymology（S.ColowickおよびN.Kaplan編、Aca
demic Press,Inc.）、およびHandbook of Experimental
Immunology,Volumes I−IV（D.M.WeirおよびC.C.Black
we11編、1986,Blackwell Scientific Publications）を
参照。
組換えによって生産される改変型BMPまたはTGF−β
は、BMPまたはTGF−βをコードする配列の突然変異誘
発、例えば、部位特異的突然変異誘発、および配列の欠
失または挿入によって得られ得る。変異を引き起こす技
術は、当業者に公知である。例えば、Maniatisら、前
出、Perbal,B.前出、Methods in Enzymology,前出、お
よびGene Transfer Vectors for Mammalian Cells、前
出を参照。
は、BMPまたはTGF−βをコードする配列の突然変異誘
発、例えば、部位特異的突然変異誘発、および配列の欠
失または挿入によって得られ得る。変異を引き起こす技
術は、当業者に公知である。例えば、Maniatisら、前
出、Perbal,B.前出、Methods in Enzymology,前出、お
よびGene Transfer Vectors for Mammalian Cells、前
出を参照。
本発明のBMPおよびTGF−βポリペプチドを得るための
上記の方法は、限定を意図しておらず、本発明の成分
は、従来の任意の方法で調製し得る。
上記の方法は、限定を意図しておらず、本発明の成分
は、従来の任意の方法で調製し得る。
ヒト、サル、ウシおよびネズミ材料由来の骨誘起タン
パク質が、外来移植片で軟骨内骨を産生する能力では、
非種特異的であることを考慮すると（Sampath,T.K.ら、
Proc Natl Acad Sci（USA）（1983）80:6591）、本明細
書に記載のBMPおよびTGF−βは、哺乳類の種間で高度に
保存されていると思われる。すなわち、異なる哺乳類種
からの対応する骨誘起タンパク質（本明細書では、「種
アナログ」と呼ぶ）は、実質的に相同なアミノ酸配列を
有している。このアミノ酸配列は、仮に変化があるとし
ても、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の付
加、欠失または置換、および／または、該分子が骨形成
を誘起する非種特異的能力に影響を与えない、実質的に
同様のグリコシル化パターンが、ウシのタンパク質と異
なるに過ぎない。この観点から、用語「実質的に同等
な」および「実質的に相同な」は、種または調製の方法
にかかわらず、実施例に記載のウシの骨形成タンパク質
と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、および同様
のタンパク質であるが、その違いが非種特異的軟骨内骨
誘起活性に悪影響を与えない、異なるアミノ酸配列を有
する、タンパク質を指す。このような「実質的に相同
な」タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に記載のウ
シタンパク質に対して、通常、少なくとも50％相同、さ
らに一般的には少なくとも80％相同、そして、好ましく
は少なくとも90％相同である。従って、このようなタン
パク質は、異なった哺乳類起源の骨から得られるか、ま
たは組換えDNA手法を用いて合成され得る。
パク質が、外来移植片で軟骨内骨を産生する能力では、
非種特異的であることを考慮すると（Sampath,T.K.ら、
Proc Natl Acad Sci（USA）（1983）80:6591）、本明細
書に記載のBMPおよびTGF−βは、哺乳類の種間で高度に
保存されていると思われる。すなわち、異なる哺乳類種
からの対応する骨誘起タンパク質（本明細書では、「種
アナログ」と呼ぶ）は、実質的に相同なアミノ酸配列を
有している。このアミノ酸配列は、仮に変化があるとし
ても、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の付
加、欠失または置換、および／または、該分子が骨形成
を誘起する非種特異的能力に影響を与えない、実質的に
同様のグリコシル化パターンが、ウシのタンパク質と異
なるに過ぎない。この観点から、用語「実質的に同等
な」および「実質的に相同な」は、種または調製の方法
にかかわらず、実施例に記載のウシの骨形成タンパク質
と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、および同様
のタンパク質であるが、その違いが非種特異的軟骨内骨
誘起活性に悪影響を与えない、異なるアミノ酸配列を有
する、タンパク質を指す。このような「実質的に相同
な」タンパク質のアミノ酸配列は、本明細書に記載のウ
シタンパク質に対して、通常、少なくとも50％相同、さ
らに一般的には少なくとも80％相同、そして、好ましく
は少なくとも90％相同である。従って、このようなタン
パク質は、異なった哺乳類起源の骨から得られるか、ま
たは組換えDNA手法を用いて合成され得る。
本発明のMBPおよびTGF−βタンパク質は、懸濁または
溶液中にあるとき、あるいは個体の形態で結晶化または
沈澱されるときにはその周囲のpHに依存するが、薬学的
に受容可能な塩または中性の形態であり得る。このタン
パク質の遊離アミノ基は、例えば、塩酸、リン酸または
硫酸等の無機酸；あるいは、例えば、酢酸、グリコール
酸、コハク酸またはマンデル酸等の有機酸、と酸付加塩
を形成し得る。遊離カルボキシル基は、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムまはた水酸化カルシウム等を含む無
機塩基、およびピペリジン、グルコサミン、トリメチル
アミン、コリンおよびカフェイン等の有機塩基、と塩を
形成し得る。さらに、このタンパク質は、脂質および糖
等の他の生物学的物質との組合せによる改変、あるいは
アミノ基のアセチル化、ヒドロキシル側鎖またはリン酸
化、または、チオール基の酸化によって改変し得る。こ
れらの改変は全て、本発明の定義の範囲内に含まれる。
溶液中にあるとき、あるいは個体の形態で結晶化または
沈澱されるときにはその周囲のpHに依存するが、薬学的
に受容可能な塩または中性の形態であり得る。このタン
パク質の遊離アミノ基は、例えば、塩酸、リン酸または
硫酸等の無機酸；あるいは、例えば、酢酸、グリコール
酸、コハク酸またはマンデル酸等の有機酸、と酸付加塩
を形成し得る。遊離カルボキシル基は、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムまはた水酸化カルシウム等を含む無
機塩基、およびピペリジン、グルコサミン、トリメチル
アミン、コリンおよびカフェイン等の有機塩基、と塩を
形成し得る。さらに、このタンパク質は、脂質および糖
等の他の生物学的物質との組合せによる改変、あるいは
アミノ基のアセチル化、ヒドロキシル側鎖またはリン酸
化、または、チオール基の酸化によって改変し得る。こ
れらの改変は全て、本発明の定義の範囲内に含まれる。
投与の形態： 本発明の骨形成組成物は、骨が通常形成されない環境
に、新たな骨形成を誘起するために使用し得る。従っ
て、この組成物は、骨の様々な欠陥を治療するために使
用し得る：組成物は、予防的に、骨折の可能性の減少、
人工関節の固定の改善、先天的なまたは外傷によって誘
起された骨の欠陥を修復するため、または美容成形手術
に使用し得る。この組成物はまた、骨が通常形成される
場合に、骨の形成を促進させるために使用し得る。例え
ば、骨折の修復、外科的に除去された骨の置き換え、歯
周病により損傷した骨の修復、あるいは他の歯または顎
提修復術に使用し得る。このような使用では、組成物
を、骨形成の所望の部位に移植等によって局部的に投与
し得る。
に、新たな骨形成を誘起するために使用し得る。従っ
て、この組成物は、骨の様々な欠陥を治療するために使
用し得る：組成物は、予防的に、骨折の可能性の減少、
人工関節の固定の改善、先天的なまたは外傷によって誘
起された骨の欠陥を修復するため、または美容成形手術
に使用し得る。この組成物はまた、骨が通常形成される
場合に、骨の形成を促進させるために使用し得る。例え
ば、骨折の修復、外科的に除去された骨の置き換え、歯
周病により損傷した骨の修復、あるいは他の歯または顎
提修復術に使用し得る。このような使用では、組成物
を、骨形成の所望の部位に移植等によって局部的に投与
し得る。
この組成物はまた、不十分な骨の形成、関連した兆候
および／または、局部的な、領域的なまたは全身的な骨
粗しょう症のような、望ましくないレベルの骨の再吸収
を治療するため、または、慢性および急性の骨髄性白血
病および造血系の他の癌のような造血系の機能不全また
は機能障害の治療で骨髄前駆細胞を刺激するため、また
は、照射治療後に、骨髄幹細胞を刺激して***および分
化を行わせるために、静脈注射等により、全身に投与し
得る。
および／または、局部的な、領域的なまたは全身的な骨
粗しょう症のような、望ましくないレベルの骨の再吸収
を治療するため、または、慢性および急性の骨髄性白血
病および造血系の他の癌のような造血系の機能不全また
は機能障害の治療で骨髄前駆細胞を刺激するため、また
は、照射治療後に、骨髄幹細胞を刺激して***および分
化を行わせるために、静脈注射等により、全身に投与し
得る。
本発明の骨形成組成物は、通常、薬学的に受容可能な
固体または液体キャリヤーと共に、骨形成に有効な量で
処方され、活性が所望される部位に局部注射または移植
により、あるいは従来の非経口経路により全身投与され
る。局部投与用処方は、活性が所望される部位にタンパ
ク質を提供でき、骨および軟骨を発達するための構造を
提供できるマトリックス物質を含むのが好ましい。可能
なマトリックスは、生物分解性または非生物分解性であ
り得、化学的または生物学的に定義され得る。このよう
な物質の例は、硫酸カルシウム、ヒドロキシアパタイ
ト、リン酸トリカルシウム、ポリオルソエステル類、ポ
リ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、コラーゲン、生体
ガラス等である。全身投与用処方は、タンパク質の治療
薬の非経口投与に通常使用される液体媒体が含まれる。
固体または液体キャリヤーと共に、骨形成に有効な量で
処方され、活性が所望される部位に局部注射または移植
により、あるいは従来の非経口経路により全身投与され
る。局部投与用処方は、活性が所望される部位にタンパ
ク質を提供でき、骨および軟骨を発達するための構造を
提供できるマトリックス物質を含むのが好ましい。可能
なマトリックスは、生物分解性または非生物分解性であ
り得、化学的または生物学的に定義され得る。このよう
な物質の例は、硫酸カルシウム、ヒドロキシアパタイ
ト、リン酸トリカルシウム、ポリオルソエステル類、ポ
リ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、コラーゲン、生体
ガラス等である。全身投与用処方は、タンパク質の治療
薬の非経口投与に通常使用される液体媒体が含まれる。
本発明の骨形成組成物は、その水溶性を高めるため、
半減期を高めるため、または骨への結合能力を向上させ
るために、他の分子と結合し得る。例えば、タンパク質
は、ポリエチレングリコールと結合されてその水溶性を
高め得る。あるいはビスホスフォネート（例えば、１−
ヒドロキシエチリデン−1,1−ビス−ホスフォン酸、ジ
クロロメチレンビスホスフォン酸、および３−アミノ−
１−ヒドロキシプロピリデン−1,1−ビスホスフォン
酸）のような骨と結合する分子および蛍光色素（例え
ば、テトラサイクリン類、カルセインブルー、キシレノ
ールオレンジ、カルセイングリーンおよびアリザリンコ
ンプレクソンレッド）と結合し、骨の部位へ標的付け得
る。分子をタンパク質に結合するための様々な試薬は、
当該技術分野で公知であり、アルデヒド類、カルボジイ
ミド類および他の二官能官能基が含まれる。
半減期を高めるため、または骨への結合能力を向上させ
るために、他の分子と結合し得る。例えば、タンパク質
は、ポリエチレングリコールと結合されてその水溶性を
高め得る。あるいはビスホスフォネート（例えば、１−
ヒドロキシエチリデン−1,1−ビス−ホスフォン酸、ジ
クロロメチレンビスホスフォン酸、および３−アミノ−
１−ヒドロキシプロピリデン−1,1−ビスホスフォン
酸）のような骨と結合する分子および蛍光色素（例え
ば、テトラサイクリン類、カルセインブルー、キシレノ
ールオレンジ、カルセイングリーンおよびアリザリンコ
ンプレクソンレッド）と結合し、骨の部位へ標的付け得
る。分子をタンパク質に結合するための様々な試薬は、
当該技術分野で公知であり、アルデヒド類、カルボジイ
ミド類および他の二官能官能基が含まれる。
投与される骨形成組成物の量は、使用するキャリヤ
ー、患者（年齢、性別、病歴、人種）および治療される
部位と状態により変化し得る。局部移植の場合、処方中
のキャリヤーに対するBMPおよびTGF−βの重量比は、通
常、約1:5,000から1:50,000の範囲内である。組成物中
のTGF−βに対するBMPの重量比は、通常、10:1から1:10
である。移植片は、移植または注入等の従来の外科技術
によって、患者の所定の部位に配置し得る。
ー、患者（年齢、性別、病歴、人種）および治療される
部位と状態により変化し得る。局部移植の場合、処方中
のキャリヤーに対するBMPおよびTGF−βの重量比は、通
常、約1:5,000から1:50,000の範囲内である。組成物中
のTGF−βに対するBMPの重量比は、通常、10:1から1:10
である。移植片は、移植または注入等の従来の外科技術
によって、患者の所定の部位に配置し得る。
全身投与の場合、BMPおよびTGF−βの総量は、通常、
体重1kg当り20μｇと2mgとの間の範囲である。さらに、
骨粗しょう症の場合、BMPおよびTGF−βタンパク質と、
フッ化物、カルシトニン、ビタミンＤ代謝産物および副
甲状腺ホルモン等の他の治療薬とを組み合わせることが
望ましい。組成物は、その活性が非種特異的であるた
め、スポーツ用、ペット用、農場用の動物およびヒトを
含む哺乳類全般の治療に使用し得る。
体重1kg当り20μｇと2mgとの間の範囲である。さらに、
骨粗しょう症の場合、BMPおよびTGF−βタンパク質と、
フッ化物、カルシトニン、ビタミンＤ代謝産物および副
甲状腺ホルモン等の他の治療薬とを組み合わせることが
望ましい。組成物は、その活性が非種特異的であるた
め、スポーツ用、ペット用、農場用の動物およびヒトを
含む哺乳類全般の治療に使用し得る。
以下の実施例は、本発明を例示することを目的とし、
本発明を限定するものではない。
本発明を限定するものではない。
実施例 A.OIF調製物からのBMPの精製 ５回のクロマトグラフィー工程を連続的に適用するこ
とによって、脱塩したウシの骨の4Mグアニジン−HClか
らOIF調製物を得た。このクロマトグラフィーの最後の
工程は、アセトニトリル勾配を用いるRP−HPLCからなる
（Bentz,H.ら、J.Biol.Chem.（1989）264:20805−20810
を参照のこと）。
とによって、脱塩したウシの骨の4Mグアニジン−HClか
らOIF調製物を得た。このクロマトグラフィーの最後の
工程は、アセトニトリル勾配を用いるRP−HPLCからなる
（Bentz,H.ら、J.Biol.Chem.（1989）264:20805−20810
を参照のこと）。
OIF調製物をさらに精製するために、OIFの塊を含む画
分をプールし、２容積の0.1％TFAで希釈し、ｎ−プロパ
ノール勾配を使用する同一のカラム上で再びクロマトグ
ラフィーにかけた。溶媒Ａは0.1％のTFAであり、溶媒Ｂ
は溶媒Ａ中の90％のｎ−プロパノールであった。タンパ
ク質を、直接勾配、毎分0.4％の溶媒Ａ中の20−45％の
溶媒Ｂ、および毎分1.2mlの流量で、カラムから溶出さ
せた。
分をプールし、２容積の0.1％TFAで希釈し、ｎ−プロパ
ノール勾配を使用する同一のカラム上で再びクロマトグ
ラフィーにかけた。溶媒Ａは0.1％のTFAであり、溶媒Ｂ
は溶媒Ａ中の90％のｎ−プロパノールであった。タンパ
ク質を、直接勾配、毎分0.4％の溶媒Ａ中の20−45％の
溶媒Ｂ、および毎分1.2mlの流量で、カラムから溶出さ
せた。
図１に示されるように、２つの主要なピークが得られ
た。タンパク質の濃度は、BCAピアスアッセイ（Pierce
assay）（Smith,P.K.ら、Anal.Biochem.（1985）150:76
−8613）、およびピーク領域（230nmの吸光度）をウシ
の血清アルブミンの標準サンプルのピーク領域と比較す
ることによって決定した。F.W.Studier（J.Mol.Biol.
（1973）79:237−248）によって改変されたように、U.
K.Laemmli（Nature（1970）227:680−685）の方法を用
いて、15％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する
ことによって、タンパク質を分析した。ゲルを銀染色
し、OIFに特異的なモノクローナル抗体を使用して、ウ
エスタンブロット分析を行った（Dasch,J.R.ら、J.Bone
Min.Res.（1989）４:S286（要約））。
た。タンパク質の濃度は、BCAピアスアッセイ（Pierce
assay）（Smith,P.K.ら、Anal.Biochem.（1985）150:76
−8613）、およびピーク領域（230nmの吸光度）をウシ
の血清アルブミンの標準サンプルのピーク領域と比較す
ることによって決定した。F.W.Studier（J.Mol.Biol.
（1973）79:237−248）によって改変されたように、U.
K.Laemmli（Nature（1970）227:680−685）の方法を用
いて、15％のポリアクリルアミドゲル上で電気泳動する
ことによって、タンパク質を分析した。ゲルを銀染色
し、OIFに特異的なモノクローナル抗体を使用して、ウ
エスタンブロット分析を行った（Dasch,J.R.ら、J.Bone
Min.Res.（1989）４:S286（要約））。
ゲル電気泳動特性および免疫化学標識による特徴付け
られるように、後に溶出されたピーク（ピーク２）は、
OIFを含んでいた（Bentz,H.ら、J.Biol.Chem.（1989）2
64:20805−20810）。ピーク１は、ピーク面積によって
測定されたところによると、様々なサンプル中の全タン
パク質の10−40％を示した。
られるように、後に溶出されたピーク（ピーク２）は、
OIFを含んでいた（Bentz,H.ら、J.Biol.Chem.（1989）2
64:20805−20810）。ピーク１は、ピーク面積によって
測定されたところによると、様々なサンプル中の全タン
パク質の10−40％を示した。
図１の断片40−49（図２に示されるレーン１−10）を
SDS−PAGEで分析すると、ピーク１の物質（レーン２−
４）は、28−34kDAの質量範囲で拡散するいくつかの成
分を含んでいるのが発見された。これらの成分は、還元
されると、相対量の１、３および４のそれぞれにおい
て、30、18および16kDaの成分に変換された。この挙動
は、Wangら（Proc.Natl.Acad.Sci USA（1988）85:9484
−9488）およびLuytenら（J.Biol.Chem.（1989）264:13
377−13380）によって報告されるように、BMP調製物に
特徴的である。
SDS−PAGEで分析すると、ピーク１の物質（レーン２−
４）は、28−34kDAの質量範囲で拡散するいくつかの成
分を含んでいるのが発見された。これらの成分は、還元
されると、相対量の１、３および４のそれぞれにおい
て、30、18および16kDaの成分に変換された。この挙動
は、Wangら（Proc.Natl.Acad.Sci USA（1988）85:9484
−9488）およびLuytenら（J.Biol.Chem.（1989）264:13
377−13380）によって報告されるように、BMP調製物に
特徴的である。
この同定を確認し、BMP種を決定するために、ピーク
１タンパク質をペプチド分析にかけた。還元、エンドプ
ロテイナーゼLys−Ｃ（Boehringer Mannheim）を用いた
Ｓ−ピリジルエチル化開裂およびペプチド精製を、実質
的に、H.Bentzら、J.Biol.Chem.（1990）265:5024−502
9に記載されているように行った。ピーク１タンパク質
のタンパク質開裂から生じるペプチド混合物を、Vydak
C18カラム、2.1 x 150nmを用いるRP−HPLCによって分画
した（図３）。溶媒Ａは0.1％のTFAであり、溶媒Ｃは、
溶媒Ａ中の90％のアセトニトリルであった。カラムを、
溶媒Ａ中の０−20％の溶媒Ｃの毎分１％の直線勾配、次
いで、20−54％の同一溶媒の毎分0.4％の直線勾配、お
よび毎分0.25mlの流量で溶出した。
１タンパク質をペプチド分析にかけた。還元、エンドプ
ロテイナーゼLys−Ｃ（Boehringer Mannheim）を用いた
Ｓ−ピリジルエチル化開裂およびペプチド精製を、実質
的に、H.Bentzら、J.Biol.Chem.（1990）265:5024−502
9に記載されているように行った。ピーク１タンパク質
のタンパク質開裂から生じるペプチド混合物を、Vydak
C18カラム、2.1 x 150nmを用いるRP−HPLCによって分画
した（図３）。溶媒Ａは0.1％のTFAであり、溶媒Ｃは、
溶媒Ａ中の90％のアセトニトリルであった。カラムを、
溶媒Ａ中の０−20％の溶媒Ｃの毎分１％の直線勾配、次
いで、20−54％の同一溶媒の毎分0.4％の直線勾配、お
よび毎分0.25mlの流量で溶出した。
次いで、この調製物から選択された画分の配列決定を
した。モデル120Aミクロボア（microbore）オンライン
フェニルチオヒダントイン誘導体分析器（Applied Bios
ystems）を備えた、モデル475Aミクロタンパク質シーク
エンサーでの自動エドマン分解によって、ペプチドを配
列決定した。この配列（図４に示されるL1からL10）
を、BMP−１−４の知られている配列（Wozney,J.M.ら、
Science（1988）242:1528−1534;Wozney,J.M.ら、Prog.
Growth Factor Res.（1990）１:267−280）と比較し
た。いくつかの部位およびいくつかの残基における、マ
ッチしない二次的な残基帰属によって示されるように、
ペプチドは純粋ではなかったが、ペプチドがBMP−２お
よびBMP−３の混合物のみからのものであることが明白
である。
した。モデル120Aミクロボア（microbore）オンライン
フェニルチオヒダントイン誘導体分析器（Applied Bios
ystems）を備えた、モデル475Aミクロタンパク質シーク
エンサーでの自動エドマン分解によって、ペプチドを配
列決定した。この配列（図４に示されるL1からL10）
を、BMP−１−４の知られている配列（Wozney,J.M.ら、
Science（1988）242:1528−1534;Wozney,J.M.ら、Prog.
Growth Factor Res.（1990）１:267−280）と比較し
た。いくつかの部位およびいくつかの残基における、マ
ッチしない二次的な残基帰属によって示されるように、
ペプチドは純粋ではなかったが、ペプチドがBMP−２お
よびBMP−３の混合物のみからのものであることが明白
である。
B.ピーク１タンパク質の骨誘導活性およびTGF−βの相
乗効果 ピーク１物質によって示されるような、BMP−２およ
びBMP−３（共に「BMP−２＋３」）の骨誘導活性、なら
びにピーク２物質によって示されるような、OIF骨誘導
活性を、以下のラットの皮下組織モデルにおいて測定し
た。
乗効果 ピーク１物質によって示されるような、BMP−２およ
びBMP−３（共に「BMP−２＋３」）の骨誘導活性、なら
びにピーク２物質によって示されるような、OIF骨誘導
活性を、以下のラットの皮下組織モデルにおいて測定し
た。
ピーク１または２物質を、多孔性粒子状のヒドロキシ
アパタイト／トリカルシウムホスフェート（Zimmer,War
saw,IN）およびウシの皮膚コラーゲン（Vitrogen,Colla
gen Corporation）と混合し、凍結乾燥し、リン酸緩衝
生理食塩水で水和し、重量がそれぞれ約50mg（乾燥重
量）のペレットに成形した。ペレットは、1mg当り120ng
のピーク１または２物質を含んでいた。ペレットの中に
は、1mg当り140ngのTGF−β２を含んでいるものもあっ
た。前に記載したように、34から40日齢の雄のSprague
−Dawleyラットの皮下組織に、ペレットを、通常１グル
ープ当り４つずつ移植した（Bentz,H.ら、J.Biol.Chem.
（1989）264;20805−20810）。14日後、ペレットを外植
し、アルカリホスファターゼ活性をアッセイすることに
よって無機物の付加を、そして前述したような組織的方
法で骨および軟骨を評価した（Bentz,H.ら、J.Biol.Che
m.（1989）264:20805−20810）。前述したように、TGF
−β１および２をウシの骨から単離した（Seyedin,S.M.
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）82:2267−2271;Se
yedin,S.M.ら、J.Biol.Chem.（1986）261:5693−5695;S
eyedin,S.M.ら、J.Biol.Chem.（1987）262:1946−194
9）。
アパタイト／トリカルシウムホスフェート（Zimmer,War
saw,IN）およびウシの皮膚コラーゲン（Vitrogen,Colla
gen Corporation）と混合し、凍結乾燥し、リン酸緩衝
生理食塩水で水和し、重量がそれぞれ約50mg（乾燥重
量）のペレットに成形した。ペレットは、1mg当り120ng
のピーク１または２物質を含んでいた。ペレットの中に
は、1mg当り140ngのTGF−β２を含んでいるものもあっ
た。前に記載したように、34から40日齢の雄のSprague
−Dawleyラットの皮下組織に、ペレットを、通常１グル
ープ当り４つずつ移植した（Bentz,H.ら、J.Biol.Chem.
（1989）264;20805−20810）。14日後、ペレットを外植
し、アルカリホスファターゼ活性をアッセイすることに
よって無機物の付加を、そして前述したような組織的方
法で骨および軟骨を評価した（Bentz,H.ら、J.Biol.Che
m.（1989）264:20805−20810）。前述したように、TGF
−β１および２をウシの骨から単離した（Seyedin,S.M.
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA（1985）82:2267−2271;Se
yedin,S.M.ら、J.Biol.Chem.（1986）261:5693−5695;S
eyedin,S.M.ら、J.Biol.Chem.（1987）262:1946−194
9）。
表１に示されるように、14日目に、BMP−２＋３（ピ
ーク１物質）は、大量の骨形成を誘導し、この実験にお
いてはTGF−β２を有する場合と有さない場合の両方に
おいて、アルカリホスファターゼ活性が増加した。一
方、BMP−２＋３による軟骨の誘導は、TGF−β２によっ
て著しく刺激された。TGF−β２を有さないOIF（ピーク
２物質）は、完全に不活性であった。TGF−β２を用い
たとき、OIF外植片は、表１に示されるように、時折、
軟骨および骨の両方を示した。この発見は、いくつかの
BMPコンタミネーションが、いくつかのOIFサンプル中に
残存していることを示唆している。BMP−２＋３に付加
されたOIFは、TGF−β２を用していても、または有して
いなくても、何等効果を与えなかった。
ーク１物質）は、大量の骨形成を誘導し、この実験にお
いてはTGF−β２を有する場合と有さない場合の両方に
おいて、アルカリホスファターゼ活性が増加した。一
方、BMP−２＋３による軟骨の誘導は、TGF−β２によっ
て著しく刺激された。TGF−β２を有さないOIF（ピーク
２物質）は、完全に不活性であった。TGF−β２を用い
たとき、OIF外植片は、表１に示されるように、時折、
軟骨および骨の両方を示した。この発見は、いくつかの
BMPコンタミネーションが、いくつかのOIFサンプル中に
残存していることを示唆している。BMP−２＋３に付加
されたOIFは、TGF−β２を用していても、または有して
いなくても、何等効果を与えなかった。
BMP−２＋３の骨誘導活性の調節に対する、TGF−β２
の効果をさらに十分に示すために、BMP−２＋３の応答
曲線をTGF−β２を有する場合と有さない場合とで、14
日目に再び決定した。図５に示されるように、軟骨およ
び骨の形成を強化するTGF−β２の効果は、明白であ
る。TGF−β２を有さない場合、BMP−２＋３は、1mg移
植片当り25ngまでのレベルで、実質的に不溶性であり、
軟骨はすべてのレベルで存在しなかった。TGF−β２を
有する場合、1mg移植片当り12.5ng以上のBMP−２＋３の
レベルで、確実に強化され、軟骨は、1mg移植片当り25n
g以上で存在していた。
の効果をさらに十分に示すために、BMP−２＋３の応答
曲線をTGF−β２を有する場合と有さない場合とで、14
日目に再び決定した。図５に示されるように、軟骨およ
び骨の形成を強化するTGF−β２の効果は、明白であ
る。TGF−β２を有さない場合、BMP−２＋３は、1mg移
植片当り25ngまでのレベルで、実質的に不溶性であり、
軟骨はすべてのレベルで存在しなかった。TGF−β２を
有する場合、1mg移植片当り12.5ng以上のBMP−２＋３の
レベルで、確実に強化され、軟骨は、1mg移植片当り25n
g以上で存在していた。
BMP−２＋３によって誘導された軟骨内性骨形成にお
ける、上記の２つの実験によって示される、ある一定時
間でのデータは、TGF−β２が初期の軟骨形成を増加さ
せ、軟骨退化および骨による置換の開始を遅らせている
ことを示唆している。TGF−β１は、他の実験でも、同
様の結果を示している。
ける、上記の２つの実験によって示される、ある一定時
間でのデータは、TGF−β２が初期の軟骨形成を増加さ
せ、軟骨退化および骨による置換の開始を遅らせている
ことを示唆している。TGF−β１は、他の実験でも、同
様の結果を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 トンプソン，アンドリア ワイ. アメリカ合衆国 カリフォルニア 94043 マウンテン ビュー，イージー ストリート 221 (72)発明者 アームストロング，ローザ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303 パロ アルト，ルイス ロード 2106 (72)発明者 ローゼン，デイビッド エム. アメリカ合衆国 カリフォルニア 95148 サン ホセ，ニーマン ブール バード ＃430 2981 (56)参考文献 Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．130, Ｎｏ．２（1988）ｐ．435−442 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ. 11（1990）ｐ．33−34 Ｃｏｎｎｅｃｔ．Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏｌ．20，Ｎｏ．１−４ （1989）ｐ．303−312 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 264，Ｎｏ．32（1989）ｐ．20805− 20810 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．87，Ｎｏ．８ （1990）ｐ．3023−3026 Ｍａｔｒｉｘ，Ｖｏｌ．11，Ｎｏ．４ （1991）ｐ．269−275 Ｐｒｏｇ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏ ｒ Ｒｓｅ．，Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．４ （1989）ｐ．267−280 Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ，Ｓｃ ｉ．，Ｖｏｌ．593（1990）ｐ．98−106 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 38/00 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ
Claims (12)
- 【請求項１】軟骨および／または骨の欠陥を治療するた
めの組成物であって、 一緒になって組織成長を誘導する量の、少なくとも骨形
成タンパク質−２（BMP−２）および骨形成タンパク質
−３（BMP−３）、ならびに少なくとも１つの腫瘍増殖
因子β２（TGF−β２）；ならびに 薬学上受け入れられるキャリアーまたは賦形剤、 から本質的になる、組成物。 - 【請求項２】さらにBMP−４を含む、請求項１に記載の
組成物。 - 【請求項３】さらにBMP−７を含む、請求項１に記載の
組成物。 - 【請求項４】さらにTGF−β１を含む、請求項１に記載
の組成物。 - 【請求項５】骨の成長を誘導するための骨形成組成物で
あって、 一緒になって組織成長を誘導する量の、少なくとも骨形
成タンパク質−２（BMP−２）および骨形成タンパク質
−３（BMP−３）、ならびに少なくとも１つの腫瘍増殖
因子β２（TGF−β２）；ならびに 薬学上受け入れられるキャリアーまたは賦形剤、 から本質的になる、組成物。 - 【請求項６】さらにBMP−４を含む、請求項５に記載の
組成物。 - 【請求項７】さらにBMP−７を含む、請求項５に記載の
組成物。 - 【請求項８】さらにTGF−β１を含む、請求項５に記載
の組成物。 - 【請求項９】個体において骨髄細胞の生産を誘導するた
めの組成物であって、 一緒になって組織成長を誘導する量の、少なくとも骨形
成タンパク質−２（BMP−２）および骨形成タンパク質
−３（BMP−３）、ならびに少なくとも１つの腫瘍増殖
因子β２（TGF−β２）；ならびに 薬学上受け入れられるキャリアーまたは賦形剤、 から本質的になる、組成物。 - 【請求項１０】さらにBMP−４を含む、請求項９に記載
の組成物。 - 【請求項１１】さらにBMP−７を含む、請求項９に記載
の組成物。 - 【請求項１２】さらにTGF−β１を含む、請求項９に記
載の組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US62014290A | 1990-11-30 | 1990-11-30 | |
| US620,142 | 1990-11-30 | ||
| PCT/US1991/008953 WO1992009697A1 (en) | 1990-11-30 | 1991-11-27 | USE OF A BONE MORPHOGENETIC PROTEIN IN SYNERGISTIC COMBINATION WITH TGF-β FOR BONE REPAIR |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05505404A JPH05505404A (ja) | 1993-08-12 |
| JP3356775B2 true JP3356775B2 (ja) | 2002-12-16 |
Family
ID=24484760
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50267692A Expired - Fee Related JP3356775B2 (ja) | 1990-11-30 | 1991-11-27 | ＴＧＦ―βとの共同的組合せによる骨修復のための骨形成タンパク質の使用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5393739A (ja) |
| EP (1) | EP0513334A4 (ja) |
| JP (1) | JP3356775B2 (ja) |
| AU (1) | AU651421B2 (ja) |
| CA (1) | CA2071912C (ja) |
| WO (1) | WO1992009697A1 (ja) |
Families Citing this family (95)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6117425A (en) * | 1990-11-27 | 2000-09-12 | The American National Red Cross | Supplemented and unsupplemented tissue sealants, method of their production and use |
| US7208179B1 (en) | 1990-11-27 | 2007-04-24 | The American National Red Cross | Methods for treating disease and forming a supplemented fibrin matrix |
| US6559119B1 (en) | 1990-11-27 | 2003-05-06 | Loyola University Of Chicago | Method of preparing a tissue sealant-treated biomedical material |
| US6197325B1 (en) | 1990-11-27 | 2001-03-06 | The American National Red Cross | Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use |
| US6054122A (en) * | 1990-11-27 | 2000-04-25 | The American National Red Cross | Supplemented and unsupplemented tissue sealants, methods of their production and use |
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| US6077823A (en) * | 1991-03-11 | 2000-06-20 | Creative Biomolecules, Inc. | Method for reducing tissue damage associated with ischemia-reperfusion or hypoxia injury |
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| US6395883B1 (en) * | 1991-03-11 | 2002-05-28 | Curis, Inc. | Soluble morphogenic protein complex compositions of matter |
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| JP3681069B2 (ja) * | 1993-05-12 | 2005-08-10 | ジェネティックス・インスチチュート・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | Ｂｍｐ−１１組成物 |
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| US6919434B1 (en) | 1995-02-20 | 2005-07-19 | Sankyo Co., Ltd. | Monoclonal antibodies that bind OCIF |
| WO1996030038A1 (en) * | 1995-03-29 | 1996-10-03 | The Rockefeller University | Peptide growth factor having epidermal inducing activity |
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