DE60319820T2

DE60319820T2 - Pyrazoloä1,5-aüpyrimidin-verbindungen als antivirale agentien

Info

Publication number: DE60319820T2
Application number: DE60319820T
Authority: DE
Inventors: Gerald W. Stoneham SHIPPS; Kristin E. Watertown ROSNER; Janeta Waltham POPOVICI-MULLER; Yongqi Newton DENG; Tong Cambridge WANG; Patrick J. Winthrop CURRAN
Original assignee: Schering Corp
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 2002-06-04
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2009-03-26
Anticipated expiration: 2023-06-03
Also published as: CA2487211C; ATE389656T1; AU2003240488A1; CN1671710A; EP1511751A1; JP2005533040A; CA2487211A1; JP4602076B2; MXPA04012245A; US20040038993A1; DE60319820D1; WO2003101993A1; EP1511751B1; ES2304511T3; US7196111B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Inhibierung der Replikation des Hepatitis C-Virus (HCV). Die Erfindung betrifft insbesondere Verbindungen und Verfahren zum Inhibieren der HCV RNA-abhängigen RNA-Polymerase.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Hepatitis C-Virus (HCV) ist ein positiv-strängiges RNA-Virus der Familie Flaviviridae. Sein 9,6 kb Genom kodiert ungefähr 10 Proteine einschließlich des Strukturcapsids und der Hüllproteine, sowie die Nicht-Strukturproteine NS3 (Protease und Helicase) und NS5B (Polymerase). Ishii et al., Hepatology, 1227 (1999), lehren, dass die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) sowohl für die Erzeugung der intermediären minus-Strang-RNA-Matrix als auch für die Synthese der erogenen positiv-strängigen genomen RNA verantwortlich ist. Die Autoren betonen, dass RdRp nur bei der Replikationen von RNA-Viren verwendet wird und sehr strenge Matrixspezifizitäten aufweist. Die Autoren folgern, dass RNA-abhängige RNA-Polymeraseenzyme einschließlich HCV RdRp, ideale Ziele für antivirale Arzneimittel sind.
HCV ist ein bedeutsames Pathogen des Menschen und hat vermutlich ungefähr 3% der Weltpopulation infiziert. Bressanelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96: 13034–13039 (1999), lehren, dass HCV zu einer persistenten Infektion führen kann, die zu chronischer Hepatitis führen kann, die zu Zirrhose und hepatozellulären Karzinom führen kann.
Die bestehenden Therapien für HCV sind begrenzt, und es sind nur wenige Inhibitoren von HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase bekannt, beispielsweise aus EP-A-1 162 196 . Es gibt somit einen Bedarf an der Identifizierung weiterer HCV RdRp-Inhibitoren und der Identifizierung von Strukturmerkmalen, die für potente HCV RdRp-Inhibierungsaktivität erforderlich sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert Verbindungen, die zur Prophylaxe oder Behandlung der HCV-Infektion brauchbar sind, sowie Stereoisomere und pharmazeutisch annehmbare Salze dieser Verbindungen. Die Erfindung liefert ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbaren Salze enthalten, die Verwendung der Verbindungen oder Salze zur Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der HCV-Replikation in einer Zelle oder zur Behandlung oder Vorbeugung einer HCV-Infektion, und in vitro-Verfahren zum Inhibieren der HCV-Replikation in einer Zelle, bei denen Zellen, die mit HCV infiziert sind, mit den Verbindungen oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen kontaktiert werden.
Die Erfindung liefert gemäß einem ersten Aspekt daher eine Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

oder ein Stereoisomer davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer solchen Verbindung. Weitere Aspekte der Erfindung gehen aus den angefügten Ansprüchen hervor.
Ausführungsformen der Erfindung liefern insbesondere Verbindungen, Zusammensetzungen, Medikamente und in vitro-Verfahren zum Inhibieren der enzymatischen Aktivität von HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase (RdRp). Offenbart werden hier HCV RdRp-Inhibitoren mit der Formel (I):
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin
G¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, Cyano, -C(O)-OH, -C(O)-OR⁸, -C(O)-NR²R³, -N(R)-C(O)R⁸, -S(O)₂NR²R³, -N(R)-S(O)₂R⁸, Heteroaryl, Aryl, Halogen, Amino, Formyl, Heterocyclenalkenyl, Heterocyclylalkyl, CH(N)OH, CH(N)OR⁸, Hydroxyalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, wobei
R⁸ bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl, Carboalkoxyalkyl, Carboalkoxy, Acyloxyalkyl, Acyloxyalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, oder
R² und R³ zusammengenommen einen 5- oder 6-gliedrigen heteroaromatischen oder gesättigten oder teilweise ungesättigten heterocyclischen Ring bilden, oder
-NR²R³ zusammen eine α-, β- oder γ-Aminosäure bildet, wobei R² Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist und R³ eine Formel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl, Alkoxyalkyl, Hydroxyalkyl, Cyano, Arylsulfonyl, Alkylsulfonyl, Hydroxy, Alkoxy, -C(R⁶)(R⁶)CO₂H, -CH₂CH₂CH(R⁶)CO₂H, -CH₂CH(R⁶)CO₂H, -CHC(R⁶)CO₂alkyl, -SO₂aralkyl, -SO₂fluoralkyl, -CH(R⁶)CONH₂, -CH(R⁶)CH₂CO₂H, -CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CH₂CO₂H, -CH₂CH(R⁶)CH₂CO₂H und -CH₂CH₂CH(R⁶)CO₂H hat;
wobei R⁶ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, Aminoalkyl, Alkylthioalkyl, Carbamoyl, Hydroxy und -CH₂R⁷, wobei R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Aralkoxy, Thio, Alkylthio, Arylthio und Aralkylthio;
G¹ an einer der Positionen C3 oder C4 des Pyrazolrings gebunden ist, wobei die andere Position gegebenenfalls mit Alkyl, Alkenyl, Alkenyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Cyano substituiert ist, und
G² unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, Trifluormethyl, Carboxyalkylamino, Alkylamino, Carboxy, Alkenyl, Alkoxyalkyl, Heterocyclylalkyl, Cycloalkylalkyl, Arylalkyl und -W-Cy, wobei
W ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R)-, -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R)-, -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)₂-N(R), -N(R)-S(O)₂- und -N(R)-C(O)-N(R)-, wobei R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
Cy ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
G³ fehlen kann oder unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest und -W-Cy, wobei
W ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R)-, -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R)-, -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)₂-N(R), -N(R)-S(O)₂- und -N(R)-C(O)-N(R)-, wobei R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
Cy ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, und
G² und G³ zusammen an beliebigen zwei der Positionen C7, C8 und C9 des Pyrimidinrings gebunden sind, wobei die verbleibende Position gegebenenfalls mit Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Cyano substituiert ist;
wobei der Ringanteil von jedem der Cycloalkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl- oder heterocyclischen Reste in G¹, G² oder G³ gegebenenfalls substituiert sein kann.
Ebenfalls offenbart werden hier HCV RdRp-Inhibitoren mit der Formel (I):
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin
G¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, Cyano, -C(O)-OH, -C(O)-OR, -C(O)-NR²R³, -N(R)-C(O)R, -S(O)₂NR²R³, -N(R)-S(O)₂R, Heteroaryl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, wobei
R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, oder
R² und R³ zusammengenommen einen 5- oder 6-gliedrigen heteroaromatischen oder gesättigten oder teilweise ungesättigten heterocyclischen Ring bilden, oder
-NR²R³ zusammen eine α-, β- oder γ-Aminosäure bilden, wobei R² Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist und R³ eine Formel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CO₂H, -CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CH₂CO₂H, -CH₂CH(R⁶)CH₂CO₂H und -CH₂CH₂CH(R⁶)CO₂H hat;
wobei R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest und -CH₂R⁷, wobei R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Aralkoxy, Thio, Alkylthio, Arylthio und Aralkylthio;
G¹ an eine der Positionen C3 oder C4 des Pyrazolrings gebunden ist, wobei die andere Position gegebenenfalls mit Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Cyano substituiert ist, und
G² und G³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest und -W-Cy, wobei
W ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R)-, -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R)-, -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)₂-N(R), -N(R)-S(O)₂- und -N(R)-C(O)-N(R)-, wobei R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
Cy ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, und
G² und G³ zusammen an beliebigen zwei der Positionen C7, C8 und C9 des Pyrimidinrings gebunden sind, wobei die verbleibende Position gegebenenfalls mit Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Cyano substituiert ist;
wobei der Ringanteil von jedem der Cycloalkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl- oder heterocyclischen Reste in G¹, G² oder G³ gegebenenfalls substituiert sein kann.
Hier wird ebenfalls eine Verbindung mit der Formel (V)
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon offenbart, worin
R⁹ Aryl oder Heteroaryl ist, die jeweils unabhängig gegebenenfalls substituiert sind;
R¹⁰ OH, Heteroaryl, NHR oder NR²R³ ist;
R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, und
-NR²R³ zusammen eine α- oder β-Aminosäure bilden, wobei R² Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist und R³ eine Formel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CO₂H und -CH(R⁶)CO₂H hat.
Hier wird ebenfalls eine Verbindung mit der Formel (VI) offenbart
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin
R⁹ Aryl oder Heteroaryl ist, die jeweils unabhängig gegebenenfalls substituiert sind;
R¹⁰ OH, Heteroaryl, NHR oder NR²R³ ist;
R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, und
-NR²R³ zusammen eine α-, oder β-Aminosäure bilden, wobei R² Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist und R³ eine Formel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CO₂H und -CH(R⁶)CO₂H hat.
-NR²R³ kann zusammen eine α- oder β-Aminosäure bilden.
Hier wird auch (i) eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, die mindestens eine Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel enthält,

(ii) ein Verfahren zur Inhibierung der HCV-Replikation in einer Zelle, bei dem eine Zelle, die mit HCV infiziert ist, mit mindestens einer Verbindung der Formel (I) oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon in Kontakt gebracht wird,
(iii) die Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Prophylaxe oder Behandlung der HCV-Infektion, und
(iv) ein Verfahren zur Prophylaxe oder Behandlung der HCV-Infektion, bei dem einem menschlichen oder tierischen Subjekt eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einer Verbindung der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon verabreicht wird.

BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ausführungsformen der Erfindung liefern Verbindungen und in vitro-Verfahren zum Inhibieren der enzymatischen Aktivität von HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase (RdRp). Die Erfindung liefert auch Zusammensetzungen, die solche Verbindungen enthalten, zur Prophylaxe oder Behandlung der HCV-Infektion, und die Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der HCV-Replikation in einer Zelle oder zur Behandlung oder Verhinderung der HCV-Infektion. Die hier zitierte Patent- und wissenschaftliche Literatur bezieht sich auf Wissen, das Fachleuten zur Verfügung steht. Die erteilten Patente, Anmeldungen und Referenzen, die hier zitiert sind, werden in dem Maße zum Zweck der Bezugnahme zitiert, als wäre jede spezifisch und individuell zum Zweck der Bezugnahme zitiert worden. Im Falle von Inkonsistenzen gilt die vorliegende Offenbarung.
Die folgenden Definitionen werden für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung verwendet:
Die Begriffe "HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase-Inhibitor", "HCV RdRp-Inhibitor" und "Inhibitor von HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase" und "Inhibitor von HCV RdRp" werden hier zur Bezeichnung einer Verbindung mit einer Struktur wie hier definiert verwendet, die mit HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase in Wechselwirkung treten kann und ihre enzymatische Aktivität inhibieren kann. Das Inhibieren der enzymatischen Aktivität der HCV RNA-abhängigen RNA-Polymerase bedeutet das Reduzieren der Fähigkeit von HCV RdRp, Ribonukleotide in einen wachsenden HCV RNA-Strang einzubauen. Eine derartige Reduktion der HCV RdRp-Aktivität beträgt in einigen bevorzugten Ausführungsformen mindestens 50%, insbesondere mindestens 75% und bevorzugter mindestens 90%. Die Aktivität der HCV RdRp wird in anderen bevorzugten Ausführungsformen um mindestens 95% und insbesondere um mindestens 99% reduziert.
Diese Inhibierung ist vorzugsweise spezifisch, d. h. der HCV RdRp-Inhibitor reduziert die Fähigkeit von HCV RdRp zum Einbau von Ribonukleotiden in einen wachsenden HCV RNA-Strang auf eine Konzentration, die unter der Konzentration des Inhibitors liegt, die erforderlich ist, um eine andere, damit nicht zusammenhängende biologische Wirkung zu erzeugen. Die für HCV RdRp-inhibierende Aktivität erforderliche Konzentration des Inhibitors ist vorzugsweise mindestens 2 Mal niedriger, insbesondere mindestens 5 Mal niedriger, bevorzugter mindestens 10 Mal niedriger und am meisten bevorzugt mindestens 20 Mal niedriger als die Konzentration, die erforderlich ist, um eine damit nicht zusammenhängende biologische Wirkung hervorzurufen.
Die Begriffe "Alkyl", "Alkenyl" und "Alkinyl" beziehen sich hier auf geradkettige und verzweigte aliphatische Gruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und insbesondere 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, die gegebenenfalls mit einem, zwei oder drei Substituenten substituiert sein können. Der Begriff "Alkyl" wird für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung verwendet, wenn das Kohlenstoffatom, das die aliphatische Gruppe an den Rest des Moleküls bindet, ein gesättigtes Kohlenstoffatom ist. Eine Alkylgruppe kann jedoch Ungesättigtheit an anderen Kohlenstoffatomen einschließen. Alkylgruppen schließen somit ohne Einschränkung Methyl, Ethyl, Propyl, Allyl, Propargyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, 2-Propinyl, 2-Butinyl, 3-Butenyl und 3-Methylbuten-2-yl ein.
Der Begriff "Alkenyl" wird für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung verwendet, wenn das Kohlenstoffatom, das die aliphatische Gruppe an den Rest des Moleküls bindet, ein Teil einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung ist. Zu Alkenylgrup pen gehören ohne Einschränkung Vinyl, 1-Propenyl, 1-Butenyl, 1-Pentenyl und 1-Hexenyl. Der Begriff "Alkinyl" wird für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung verwendet, wenn das Kohlenstoffatom, das die aliphatische Gruppe an den Rest des Moleküls bindet, ein Teil einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung ist. Zu Alkinylgruppen gehören ohne Einschränkung Ethinyl, 1-Propinyl, 1-Butinyl, 1-Pentinyl und 1-Hexinyl.
Der Begriff "Cycloalkyl" schließt hier gesättigte und teilweise ungesättigte cyclische Kohlenwasserstoffgruppen mit etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 3 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen und insbesondere 3 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen ein, wobei die Cycloalkylgruppe außerdem substituiert sein kann. Zu Cycloalkylgruppen gehören ohne Einschränkung Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclopentenyl, Cyclohexyl, Cyclohexenyl, Cycloheptyl und Cyclooctyl.
Eine Arylgruppe ist eine aromatische C₆-C₁₄-Einheit, die einen bis drei aromatische Ringe enthält, die gegebenenfalls substituiert sein können. Die Arylgruppe ist vorzugsweise eine C₆- bis C₁₀-Arylgruppe. Arylgruppen schließen ohne Einschränkung Phenyl, Naphthyl, Anthracenyl und Fluorenyl ein. Eine "Aralkyl"- oder "Arylalkyl"-Gruppe enthält eine Arylgruppe, die kovalent an eine Alkylgruppe gebunden ist, wobei eine oder beide hiervon gegebenenfalls unabhängig substituiert oder unsubstituiert sein kann bzw. können. Die Aralkylgruppe ist vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₆)-alkyl, einschließlich ohne Einschränkung Benzyl, Phenethyl und Naphthylmethyl.
Der Begriff "Heteroaryl" bezieht sich hier auf Gruppen mit 5 bis 14 Ringatomen, vorzugsweise 5, 6, 9 oder 10 Ringatomen mit 6, 10 oder 14 π-Elektronen, die zusammen in einer cyclischen Gruppierung vorliegen, und zusätzlich zu den Kohlenstoffatomen ein bis vier Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, O und S aufweisen. Zu Heteroarylgruppen gehö ren ohne Einschränkung Thienyl, Benzothienyl, Furanyl, Benzofuranyl, Dibenzofuranyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyrazolyl, Pyridyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Indolyl, Chinolyl, Isochinolyl, Chinoxalinyl, Tetrazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl und Isoxazolyl. Eine "Heteroaralkyl"- oder "Heteroarylalkyl"-Gruppe enthält eine Heteroarylgruppe, die kovalent an eine Alkylgruppe gebunden ist, wobei eine oder beide hiervon gegebenenfalls unabhängig substituiert oder unsubstituiert sein kann bzw. können. Die Heteroaralkylgruppe ist vorzugsweise C₆-C₁₄-Heteroaryl(C₁-C₆)-alkyl, einschließlich ohne Einschränkung Pyridylmethyl, Thiazolylmethyl und dergleichen.
Die Begriffe "heterocyclischer Rest" und "Heterocyclyl" beziehen sich hier auf eine stabile monocyclische 5- bis 7-gliedrige oder bicyclische 7- bis 10-gliedrige heterocyclische Einheit, die entweder gesättigt oder teilweise ungesättigt ist und zusätzlich zu den Kohlenstoffatomen ein bis drei Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, O und S aufweist, wobei die Stickstoff- und Schwefel-Heteroatome gegebenenfalls oxidiert sein können und die Stickstoffatome gegebenenfalls quaternisiert sein können, und einschließlich jeglicher bicyclischen Gruppe, in der irgendeiner der oben definierten heterocyclischen Ringe an einen Benzolring kondensiert ist. Der heterocyclische Ring kann an seiner Seitengruppe an jedes beliebige Heteroatom oder Kohlenstoffatom gebunden sein, das zu einer stabilen Struktur führt. Zu Beispielen für derartige gesättigte oder teilweise ungesättigte heterocyclische Reste gehören ohne Einschränkung Tetrahydrofuranyl, Tetrahydrothienyl, Pyrrolidinyl, Pyrrolidonyl, Piperidinyl, Pyrrolinyl, Tetrahydrochinolinyl, Tetrahydroisochinolinyl, Decahydrochinolinyl, Oxazolidinyl, Piperazinyl, Dioxanyl, Dioxolanyl, Diazepinyl, Oxazepinyl, Thiazepinyl und Morpholinyl.
Der Begriff "teilweise ungesättigt" bezieht sich hier auf eine Ringeinheit, die mindestens eine Doppel- oder Dreifachbindung zwischen den Ringatomen einschließt. Der Begriff "teilweise ungesättigt" soll Ringe mit mehreren ungesättigten Stellen umschließen, soll jedoch keine Aryl- oder Heteroaryleinheiten wie hier definiert einschließen.
Der Begriff "teilweise ungesättigter heterocyclischer Rest" bezieht sich auf eine stabile, 5- bis 7-gliedrige monocyclische oder 7- bis 10-gliedrige bicyclische heterocyclische Ringeinheit, die mindestens eine Doppelbindung zwischen den Ringatomen einschließt. Der Begriff soll Ringe mit mehreren ungesättigten Stellen erfassen, soll jedoch keine Aryl- oder Heteroaryleinheiten wie hier definiert einschließen. Zusätzlich zu den Kohlenstoffatomen weist die heterocyclische Ringeinheit ein bis drei Heteroatome ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus N, O und S auf, wobei die Stickstoff- und Schwefel-Heteroatome gegebenenfalls oxidiert sein können und die Stickstoffatome gegebenenfalls quaternisiert sein können, und einschließlich jeglicher bicyclischer Gruppe, in der beliebige der oben definierten heterocyclischen Ringe an einen Benzolring kondensiert sind. Der heterocyclische Ring kann an seiner Seitengruppe an jedes beliebige Heteroatom oder Kohlenstoffatom gebunden sein, das zu einer stabilen Struktur führt. Zu Beispielen für solche teilweise ungesättigten heterocyclischen Reste gehören ohne Einschränkung Tetrahydrochinolinyl, Tetrahydroisochinolinyl, Tetrahydrobenzothiophen, Tetrahydroindol und Tetrahydrobenzofuran.
Der Begriff "Heterocyclenalkenyl" bezieht sich auf eine Heterocyclylgruppe, in der ein Ring-Kohlenstoff und ein exo-Kohlenstoff eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung bilden (z. B. wie beispielsweise in Verbindung 449 der nachfolgenden Tabelle der Verbindungen), die wiederum an den interessieren den Kern gebunden ist. Die Bezeichnungen -CH(N)OH und -CH(N)OR beziehen sich auf Gruppen, in denen die Kohlenstoff- und Stickstoffatome mit einer Doppelbindung verbunden sind, wodurch ein Oxim beziehungsweise ein Oxim-Alkylether gebildet wird.
Eine "substituierte" Cycloalkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl- oder Heterocyclylgruppe ist hier eine Gruppe mit einem bis vier, vorzugsweise einem bis drei, insbesondere einem oder zwei Substituenten, die nicht Wasserstoff sind. Zu geeigneten Substituenten gehören ohne Einschränkung Halogen, Hydroxy-, Oxo-, Nitro-, Fluoralkyl-, Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl-, (Cycloalkyl)alkyl-, Aryl-, (Aryl)alkyl-, Heteroaryl-, (Heteroaryl)alkyl-, (Heteroaryl)alkyloxy-, (Heteroaryl)alkylamino-, (Heteroaryl)alkylthio-, Heteroaryloxy-, Heteroarylamino-, Heteroarylthiogruppen, gesättigter oder teilweise ungesättigter heterocyclischer Rest, (Heterocyclyl)alkyl-, (Heterocyclyl)oxy-, (Heterocyclyl)amino-, (Heterocyclyl)thio-, (Heterocyclyl)alkyloxy-, (Heterocyclyl)alkylthio-, Fluoralkyloxy-, Cycloalkylalkoxy-, Cycloalkoxy-, Alkoxyalkyl-, Alkoxy-, (Aryl)alkoxy-, Aryloxy-, Amino-, Acylamino-, Carbamoyl-, Aminoalkyl-, Hydroxyalkyl-, Carboalkoxy-, Carboaryloxy-, Carboxy-, Alkylthio, Arylthio, Aralkylthio, Alkylsulfinyl, Arylsulfinyl, Aralkylsulfinyl-, Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl, Aralkylsulfonyl-, Alkylsulfonamido-, Arylsulfonamido-, Aralkylsulfonamido-, Acyl-, Acyloxy-, Cyano- und Ureidogruppen.
Der Begriff "substituiert" bedeutet hier, dass ein oder mehrere Wasserstoffe der angegebenen Einheit ersetzt worden sind, vorausgesetzt, dass die normale Wertigkeit von keinem Atom überschritten wird und mit der Maßgabe, dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung führt.
Mit "stabiler Verbindung" oder "stabiler Struktur" ist eine Verbindung gemeint, die ausreichend robust ist, um die Isolierung zu einem brauchbaren Reinheitsgrad aus einer Reaktionsmischung und die Formulierung zu einem wirksamen therapeutischen Mittel zu überstehen.
Der Begriff "Halogen" oder "Halo" soll Fluor, Chlor, Brom oder Iod einschließen.
Der Begriff "Acyl" bezieht sich hier auf einen Alkylcarbonyl- oder Arylcarbonylsubstituenten.
Die Begriffe "Acylamino" und "Amido" beziehen sich auf eine Amidgruppe, die über das Stickstoffatom gebunden ist. Der Begriff "Carbamoyl" bezieht sich auf eine Amidgruppe, die an das Carbonyl-Kohlenstoffatom gebunden ist.
Das Stickstoffatom eines Acylamino- oder Carbamoylsubstituenten kann außerdem substituiert sein. Der Begriff "Sulfonamid" bezieht sich auf einen Sulfonamidsubstituenten, der über das Schwefel- oder das Stickstoffatom gebunden ist. Der Begriff "Amino" soll, wenn nicht anderweitig ausdrücklich eingeschränkt, NH₂, Alkylamino, Dialkylamino, Arylamino, Aralkylamino und cyclische Aminogruppen einschließen.
Der Begriff "Ureido" bezieht sich hier auf eine substituierte oder unsubstituierte Harnstoffeinheit.
Der Begriff "pharmazeutisch annehmbar" bedeutet hier ein nicht toxisches Material, das mit einem biologischen System verträglich ist, wie einer Zelle, Zellkultur, einem Gewebe oder Organismus.
Offenbart werden hier Inhibitoren von HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase mit der Formel (I):
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, worin
G¹ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, Cyano, -C(O)-OH, -C(O)-OR, -C(O)-NR²R³, -N(R)-C(O)R, -S(O)₂NR₂R₃, -N(R)-S(O)₂R, Heteroaryl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, wobei
R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
R² und R³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, oder
R² und R³ zusammengenommen einen 5- oder 6-gliedrigen heteroaromatischen oder gesättigten oder teilweise ungesättigten heterocyclischen Ring bilden, oder
-NR²R³ zusammen eine α-, β- oder γ-Aminosäure bildet, wobei R² Wasserstoff oder C₁- bis C₆-Alkyl ist und R³ eine Formel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CO₂H, -CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CH₂CO₂H, -CH₂CH(R⁶)CH₂CO₂H und -CH₂CH₂CH(R⁶)CO₂H hat;
wobei R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest und -CH₂R⁷, wobei R⁷ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Aralkoxy, Thio, Alkylthio, Arylthio und Aralkylthio;
G¹ an einer der Positionen C3 oder C4 des Pyrazolrings gebunden ist, wobei die andere Position gegebenenfalls mit Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Cyano substituiert ist, und
G² und G³ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest und -W-Cy, wobei
W ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R)-, -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R)-, -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)₂-N(R), -N(R)-S(O)₂- und -N(R)-C(O)-N(R)-, wobei R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest,
Cy ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, und
G² und G³ zusammen an zwei beliebige der Positionen C7, C8 und C9 des Pyrimidinrings gebunden sind, wobei die verbleibende Position gegebenenfalls mit Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy oder Cyano substituiert ist;
wobei der Ringanteil von jedem der Cycloalkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Heteroaryl-, Heteroarylalkyl- oder heterocyclischen Reste in G¹, G² oder G³ gegebenenfalls substituiert sein kann.
Substituierte Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl- oder heterocyclische Gruppen sind vorzugsweise mit einem oder mehreren Substituenten substituiert, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Halogen, vorzugsweise Cl, Br oder F; Hy droxy; Nitro; Fluoralkyl, vorzugsweise (Fluor)_1-5(C₁-C₆)alkyl, insbesondere (Fluor)_1-5(C₁-C₆)alkyl, einschließlich z. B. CH₂F, CF₃, CH₂CH₂F und CF₂CF₃; Alkyl, vorzugsweise C₁-C₆-Alkyl, insbesondere C₁-C₄-Alkyl; Alkenyl, vorzugsweise C₂-C₈-Alkenyl, insbesondere C₂-C₆-Alkenyl; Alkinyl, vorzugsweise C₂-C₈-Alkinyl, insbesondere C₂-C₆-Alkinyl; Cycloalkyl, vorzugsweise C₃-C₈-Cycloalkyl, insbesondere C₃-C₆-Cycloalkyl; (Cycloalkyl)alkyl, vorzugsweise C₃-C₈-Cycloalkyl(C₁-C₆)alkyl, insbesondere C₃-C₆-Cycloalkyl(C₁-C₆)alkyl; Aryl, vorzugsweise C₆-C₁₄-Aryl, insbesondere C₆-C₁₀-Aryl, einschließlich z. B. Phenyl und Naphthyl; (Aryl)alkyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₆)alkyl, insbesondere C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₄)alkyl, einschließlich, z. B. Benzyl und Phenethyl; Heteroaryl; (Heteroaryl)alkyl, vorzugsweise Heteroaryl(C₁-C₆)alkyl, insbesondere Heteroaryl(C₁-C₄)alkyl; (Heteroaryl)alkyloxy, (z. B. (Furyl)alkoxy, (Thiophenyl)alkoxy, (Pyridyl)alkoxy, usw.); (Heteroaryl)alkylamino, (z. B. (Furyl)alkylamino, (Thiophenyl)alkylamino, (Pyridyl)alkylamino, usw.); (Heteroaryl)alkylthio, (z. B. (Furyl)alkylthio, (Thiophenyl)alkylthio, (Pyridyl)alkylthio, usw.); Alkylamino (z. B. (C₁-C₆)Alkylamino); Heteroaryloxy (z. B. Furyloxy, Thiophenyloxy, Pyridyloxy, usw.); Heteroarylamino (z. B. Furylamino, Thiophenylamino, Pyridylamino, usw.); Heteroarylthio (z. B. Furylthio, Thiophenylthio, Pyridylthio, usw.); gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest; (Heterocyclyl)alkyl; (Heterocyclyl)oxy; (Heterocyclyl)amino; (Heterocyclyl)thio; (Heterocyclyl)alkyloxy; (Heterocyclyl)alkylthio; Alkoxy, vorzugsweise C₁-C₆-Alkoxy, einschließlich z. B. Methoxy und Ethoxy; (Aryl)alkoxy, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₆)alkoxy, insbesondere C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₄)alkoxy, einschließlich z. B. Benzyloxy; Aryloxy, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryloxy, einschließlich z. B. Phenoxy; Amino, einschließlich: NH₂; Alkylamino, vorzugsweise C₁-C₆-Alkylamino, insbesondere C₁-C₄-Alkylamino, einschließlich z. B. Methylamino, Ethylamino und Propylamino; Dialkyl amino, vorzugsweise Di(C₁-C₆)alkylamino, insbesondere Di(C₁-C₄)alkylamino, einschließlich z. B. Dimethylamino und Diethylamino; Arylamino, vorzugsweise C₆-C₁₄-Arylamino, insbesondere C₆-C₁₀-Arylamino, einschließlich z. B. Phenylamino; Diarylamino, vorzugsweise Di(C₆-C₁₄)arylamino, insbesondere Di(C₆-C₁₀)arylamino, einschließlich z. B. Diphenylamino; (Aryl)alkylamino, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₆)alkylamino, insbesondere C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₄)alkylamino, einschließlich z. B. Benzylamino; und Di(aryl)alkylamino, vorzugsweise Di(C₆-C₁₀)aryl(C₁-C₆)alkylamino, insbesondere Di(C₆-C₁₀)aryl(C₁-C₄)-alkylamino, einschließlich z. B. Dibenzylamino; Arylamino, einschließlich Alkanacylamino, vorzugsweise C₁-C₆-Alkanacylamino, insbesondere C₁-C₄-Alkanacylamino, einschließlich z. B. Acetamido und Propionamido; Arenacylamino, vorzugsweise C₆-C₁₄-Arenacylamino, insbesondere C₆-C₁₀-Arenacylamino, einschließlich z. B. Benzamido, und Arylalkanacylamino, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₆)alkanacylamino, insbesondere C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₄)alkanacylamino, einschließlich z. B. Phenylacetamido; Carbamoyl, einschließlich -C(O)NH₂; Alkylcarbamoyl, vorzugsweise C₁-C₆-Alkylcarbamoyl oder Di(C₁-C₆)alkylcarbamoyl, einschließlich z. B. Methylcarbamoyl und Dimethylcarbamoyl; Arylcarbamoyl, vorzugsweise (C₆-C₁₀)Arylcarbamoyl oder Di(C₆-C₁₀)arylcarbamoyl, einschließlich z. B. Phenylcarbamoyl und Diphenylcarbamoyl, und Arylalkylcarbamoyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryl(C₁-C₆)alkylcarbamoyl oder Di(C₆-C₁₀)aryl(C₁-C₆)alkylcarbamoyl, einschließlich z. B. Benzylcarbamoyl und Dibenzylcarbamoyl; Aminoalkyl, vorzugsweise Amino(C₁-C₆)alkyl; Hydroxyalkyl, vorzugsweise Hydroxy(C₁-C₆)alkyl; Carboalkoxy, vorzugsweise Carbo(C₁-C₆)alkoxy, einschließlich z. B. Carbomethoxy und Carboethoxy; Carboaryloxy, vorzugsweise Carbo(C₆-C₁₀)aryloxy, einschließlich z. B. Carbophenoxy; Carboaralkoxy, vorzugsweise Carbo(C₆-C₁₀)ar(C₁-C₆)alkoxy, einschließlich z. B. Carbobenzyloxy, Carboxy; Alkylthio, vorzugsweise C₁-C₆-Alkylthio, insbe sondere C₁-C₄-Alkylthio, einschließlich z. B. Methylthio; Arylthio, vorzugsweise C₆-C₁₀-Arylthio, einschließlich z. B. Phenylthio und Tolylthio; Aralkylthio, vorzugsweise C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₃)alkylthio, einschließlich z. B. Benzylthio; Alkylsulfinyl, vorzugsweise C₁-C₆-Alkylsulfinyl, insbesondere C₁-C₄-Alkylsulfinyl, einschließlich z. B. Methylsulfinyl; Arylsulfinyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Arylsulfinyl, einschließlich z. B. Phenylsulfinyl und Tolylsulfinyl; Aralkylsulfinyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)Alkylsulfinyl, einschließlich z. B. Benzylsulfinyl; Alkylsulfonyl, vorzugsweise C₁-C₆-Alkylsulfonyl, insbesondere C₁-C₄-Alkylsulfonyl, einschließlich z. B. Methylsulfonyl; Arylsulfonyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Arylsulfonyl, einschließlich z. B. Phenylsulfonyl und Tolylsulfonyl; Aralkylsulfonyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkylsulfonyl, einschließlich z. B. Benzylsulfonyl; Alkylsulfonamido, vorzugsweise C₁-C₆-Alkylsulfonamido, insbesondere C₁-C₄-Alkylsulfonamido, einschließlich z. B. Methylsulfonamido; Arylsulfonamido, vorzugsweise C₆-C₁₀-Arylsulfonamido, einschließlich z. B. Phenylsulfonamido und Tolylsulfonamido; Aralkylsulfonamido, vorzugsweise C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkylsulfonamido, einschließlich z. B. Benzylsulfonamido; Acyl, einschließlich Alkanoyl, vorzugsweise C₁-C₆-Alkanoyl, einschließlich z. B. Acetyl; Aroyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aroyl, einschließlich z. B. Benzoyl; und Aralkanoyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkanoyl, einschließlich z. B. Phenylacetyl; Acyloxy, einschließlich z. B. Acetoxy; Cyano- und Ureidogruppen. Ein oder mehrere Kohlenstoffatome einer Cycloalkylgruppe und ein oder mehrere Kohlenstoffatome oder Heteroatome eines heterocyclischen Restes können gegebenenfalls auch mit einer Oxogruppe substituiert sein. Der Präfix oder Suffix "Ar" bezieht sich auf Aryl.
In einigen Verbindungen ist mindestens einer von G² und G³ Aryl oder Heteroaryl, die gegebenenfalls wie oben beschrieben substituiert sind. In einigen Verbindungen ist mindestens einer von G² und G³ substituiertes Phenyl. In einigen Verbindungen ist mindestens einer von G² und G³ Phenyl, das mit einem oder zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₆-Alkyl, C₆-C₁₀-Aryl, C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkyl, heterocyclischem Rest, Halogen, (Fluor)_1-5(C₁-C₆)alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, C₆-C₁₀-Aryloxy und C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkoxy substituiert ist. In bestimmten bevorzugten Verbindungen ist jeder von G² und G³ Aryl oder Heteroaryl, das gegebenenfalls wie oben beschrieben substituiert ist. In einigen Verbindungen sind G² und G³ vorzugsweise nicht beide unsubstituiertes Phenyl, wenn G² und G³ sich an den Positionen C7 und C9 befinden. In einigen Verbindungen ist einer von G² und G³ substituiertes Phenyl, wenn sich G² und G³ an den Positionen C7 und C9 befinden. In einigen Verbindungen sind sowohl G² als auch G³ unabhängig substituiertes Phenyl, wenn G² und G³ sich an den Positionen C7 und C9 befinden.
In einigen Verbindungen ist mindestens einer von G² und G³ -W-Cy, wobei Cy ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, wobei beliebige hiervon gegebenenfalls wie oben beschrieben substituiert sein können. In einigen Verbindungen ist Cy Aryl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Aryl, das unsubstituiert oder gegebenenfalls substituiert sein kann. In einigen bevorzugten Verbindungen ist Cy unsubstituiertes Phenyl oder Phenyl, das mit einem oder zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₆-Alkyl, C₆-C₁₀-Aryl, C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkyl, heterocyclischem Rest, Halogen, (Fluor)_1-5(C₁-C₆)alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, C₆-C₁₀-Aryloxy und C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkoxy substituiert ist.
In einigen anderen Verbindungen ist Cy Cycloalkyl, vorzugsweise C₅-C₆-Cycloalkyl, wobei das Cycloalkyl unsubstituiert oder gegebenenfalls substituiert sein kann. In einigen bevorzugten Verbindungen ist Cy unsubstituiertes C₅-C₆-Cycloalkyl oder C₅-C₆-Cycloalkyl, das mit einem oder zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₆-Alkyl, C₆-C₁₀-Aryl, C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkyl, heterocyclischem Rest, Halogen, (Fluor)_1-5(C₁-C₆)alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, C₆-C₁₀-Aryloxy und C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkoxy substituiert ist.
In einigen Verbindungen ist das Heterocyclyl in G¹ gegebenenfalls wie oben beschrieben substituiert. In einigen Verbindungen ist das Heterocyclyl in G² oder G³ gegebenenfalls wie oben beschrieben substituiert.
In anderen Verbindungen ist Cy Aralkyl, vorzugsweise C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkyl, wobei der Arylanteil des Aralkyls gegebenenfalls wie oben beschrieben substituiert sein kann. In einigen bevorzugten Verbindungen ist Cy Benzyl oder Phenethyl, wobei der Phenylring mit einem oder zwei Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C₁-C₆-Alkyl, C₆-C₁₀-Aryl, C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkyl, heterocyclischem Rest, Halogen, (Fluor)_1-5(C₁-C₆)alkyl, C₁-C₆-Alkoxy, C₆-C₁₀-Aryloxy und C₆-C₁₀-Ar(C₁-C₆)alkoxy substituiert ist.
In jeder der oben für Cy beschriebenen Möglichkeiten ist W ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus O, N(R), S, C(O), CH(R), -O-CH(R)-, -N(R)-CH(R)-, -S-CH(R)-, -C(O)-N(R)-, -N(R)-C(O)-, -S(O)₂-N(R), -N(R)-S(O)₂- und -N(R)-C(O)-N(R)-, wobei R bei jedem Vorkommen unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Aryl, Aralkyl, Heteroaryl, Heteroarylalkyl und gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest. In einigen bevorzugten Verbindungen ist W N(R), wobei R Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl ist. In einigen bevorzugten Verbindungen ist W NH oder NCH₃.
In einigen Verbindungen ist G¹ ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus OH, -C(O)OH und Heteroaryl. Das Heteroaryl ist vorzugsweise ein saures Heteroaryl, einschließlich z. B. Tetrazolyl.
In einigen anderen Verbindungen ist G¹ -C(O)NR²R³, wobei -NR²R³ zusammen eine α, β- oder γ-Aminosäure bildet. In diesen Verbindungen ist R² Wasserstoff oder C₁-C₆-Alkyl, und R³ hat eine Formel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CO₂H, -CH(R⁶)CO₂H, -CH(R⁶)CH₂CH₂CO₂H, -CH₂CH(R⁶)CH₂CO₂H und -CH₂CH₂CH(R⁶)CO₂H, wobei R⁶ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl-, Heteroaryl-, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischen Rest und -CH₂R⁷, und R⁷ ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl, gesättigtem oder teilweise ungesättigtem heterocyclischem Rest, Hydroxy, Alkoxy, Aryloxy, Aralkoxy, Thio, Alkylthio, Arylthio und Aralkylthio. Der Substituent R⁶ kann entweder die (R)- oder die (S)-Konfiguration haben. In einigen Verbindungen bildet -NR²R³ zusammen eine natürlich vorkommende Aminosäure. In einigen Verbindungen bildet -NR²R³ zusammen eine nicht natürlich vorkommende Aminosäure.
Es ist zu erkennen, dass heteroaromatische Ringe, die einen Hydroxysubstituenten an einer Position neben einem Ring-Stickstoffatom tragen, in der Hydroxy- oder der tautomeren Ketoform oder als Mischung der beiden vorliegen können. Verbindungen mit der Formel (I) mit einem Hydroxysubstituenten an C3 können beispielsweise als Hydroxy-Tautomer (1) oder als Keto-Tautomer (2) vorliegen.
Verbindungen mit der Formel (I) mit einem Hydroxysubstituenten an C7 können in ähnlicher Weise beispielsweise als Hydroxy-Tautomer (3) oder als Keto-Tautomer (4) vorliegen.
Es sei darauf hingewiesen, dass alle tautomeren Formen der Verbindungen der Formel (I) sowie alle möglichen Mischungen davon in beliebigem Anteil in den Umfang der Offenbarung eingeschlossen sind, wie hier auch nachfolgend angegeben wird.
Es sei zudem darauf hingewiesen, dass die Offenbarung auch alle hydratisierten, dehydratisierten und solvatisierten Formen der Verbindungen der Formel (I) einschließt.
In einigen Verbindungen ist G¹ an C3 gebunden, und G² und G³ sind an C9 beziehungsweise C7 gebunden. Diese Verbindungen haben somit die Formel (II):
wobei G¹, G² und G³ wie oben beschrieben sind und R⁴ und R⁵ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy und Cyano. In einigen bevorzugten Verbindungen sind R⁴ und R⁵ beide Wasserstoff.
In einigen Verbindungen ist G¹ an C3 gebunden, und G² und G³ sind an C8 beziehungsweise C7 gebunden. Diese Verbindungen haben somit die Formel (III):
wobei G¹, G² und G³ wie oben beschrieben sind, und R⁴ und R⁵ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy und Cyano. In einigen bevorzugten Verbindungen sind R⁴ und R⁵ beide Wasserstoff.
In anderen Verbindungen ist G¹ an C4 gebunden, und G² und G³ sind an C9 beziehungsweise C8 gebunden. Diese Verbindungen haben somit die Formel (IV):
wobei G¹, G² und G³ wie oben beschrieben sind, und R⁴ und R⁵ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Halogen, Fluoralkyl, Hydroxy, Alkoxy und Cyano. In einigen bevorzugten Verbindungen sind R⁴ und R⁵ beide Wasserstoff.
Die Formeln (II)–(IV) illustrieren bestimmte bevorzugte Verbindungen. Es sind jedoch auch andere Regioisomere möglich und in den Umfang der Offenbarung eingeschlossen.
Der Begriff "gegebenenfalls substituiert" bedeutet gegebenenfalls mit den angegebenen Gruppen, Resten oder Einheiten substituiert.
Der Begriff "Zusammensetzung" soll ein Produkt einschließen, das die angegebenen Bestandteile in den spezifizierten Mengen enthält, sowie jegliches Produkt, das direkt oder indirekt aus der Kombination der spezifizierten Bestandteile in den spezifizierten Mengen resultiert.
Es sind hier auch Prodrugs und Solvate der hier offenbarten Verbindungen eingeschlossen.
Der Begriff "Prodrug" bezeichnet hier eine Verbindung, die ein Wirkstoffvorläufer ist, der bei Verabreichung an ein Subjekt durch metabolische oder chemische Prozesse chemisch verändert wird, um eine Verbindung der Formel I oder ein Salz und/oder Solvat davon zu ergeben. Eine Erörterung von Prodrugs findet sich in T. Higuchi und V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems (1987), Band 14 der A. C. S. Symposium-Reihe, und in Bioreversible Carriers in Drug Design, (1987) Edward B. Roche, Herausgeber, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, wobei hier auf beide Bezug genommen wird.
"Solvat" bedeutet eine physikalische Assoziation einer hier offenbarten Verbindung mit einem oder mehreren Lösungsmittelmolekülen. Diese physikalische Assoziation beinhaltet variierende Grade von ionischer und kovalenter Bindung einschließlich Wasserstoffbrückenbindung. In bestimmten Fällen kann das Solvat isoliert werden, beispielsweise wenn ein oder mehr Lösungsmittelmoleküle in das Kristallgitter des kristallinen Feststoffs eingebaut werden. "Solvat" schließt sowohl Lösungsphasensolvate als auch isolierbare Solvate ein. Nichteinschränkende Beispiele für geeignete Solvate schließen Ethanolate, Methanolate und dergleichen ein. "Hydrat" ist ein Solvat, wobei das Lösungsmittelmolekül H₂O ist.
Die Verbindungen der Formel I bilden Salze (z. B. pharmazeutisch annehmbare Salze), die auch innerhalb des Umfangs dieser Offenbarung liegen. Die Bezugnahme auf eine Verbindung der Formel I soll hier die Bezugnahme auf deren Salze einschließen, wenn nicht anders angegeben. Der Begriff "Salz(e)" bezeichnet hier saure Salze, die mit anorganischen und/oder organischen Säuren gebildet sind, sowie basische Salze, die mit anorganischen und/oder organischen Basen gebildet sind. Wenn eine Verbindung der Formel I zudem sowohl eine basische Einheit wie, jedoch nicht begrenzt auf ein Pyridin oder Imidazol, als auch eine saure Einheit enthält, wie eine Carbonsäure, jedoch nicht darauf begrenzt, können Zwitterionen ("innere Salze") gebildet werden und sind hier in den Begriff "Salz(e)" eingeschlossen. Pharmazeutisch annehmbare (d. h. nichttoxische, physiologisch annehmbare) Salze sind bevorzugt, obwohl auch andere Salze brauchbar sind. Salze der Verbindungen der Formel I können beispielsweise gebildet werden, indem eine Verbindung der Formel I mit einer Menge an Säure oder Base, wie einer äquivalenten Menge, in einem Medium umgesetzt wird, wie einem, in dem das Salz ausfällt, oder in einem wässrigen Medium, gefolgt von Lyophilisierung.
Zu beispielhaften Säureadditionssalzen gehören Acetate, Adipate, Alginate, Ascorbate, Aspartate, Benzoate, Benzolsulfonate, Bisulfate, Borate, Butyrate, Citrate, Camphorate, Camphersulfonate, Cyclopentanpropionate, Digluconate, Dodecylsulfate, Ethansulfonate, Fumarate, Glucoheptanoate, Glycerophosphate, Hemisulfate, Heptanoate, Hexanoate, Hydrochloride, Hydrobromide, Hydroiodide, 2-Hydroxyethansulfonate, Lactate, Maleate, Methansulfonate, 2-Naphthalinsulfonate, Nicotinate, Nitrate, Oxalate, Pamoate ((d. h. 1,1-Methylenbis-(2-hydroxy-3-naphthoate)), Pectinate, Persulfate, 3-Phenylpropionate, Phosphate, Pikrate, Pivalate, Propionate, Salicylate, Succina te, Sulfate, Sulfonate (wie jene, die hier genannt wurden), Tartrate, Thiocyanate, Toluolsulfonate (auch als Tosylate bekannt), Undecanoate und dergleichen. Säuren, die allgemein für die Bildung pharmazeutisch brauchbarer Salze aus basischen pharmazeutischen Verbindungen als geeignet angesehen werden, sind zudem beispielsweise in S. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1–19; P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33, 201–217; Anderson et al., The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York, in The Orange Book (Fond & Drug Administration, Washington, DC, auf ihrer Website) und Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20. Auflage, Herausgeber A. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, erörtert. Auf diese Offenbarungen wird hier Bezug genommen.
Beispielhafte basische Salze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze wie Natrium-, Lithium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze wie Calcium- und Magnesiumsalze, Salze mit organischen Basen (beispielsweise organischen Aminen) ein, wie Benzathinen, Dicyclohexylaminen, Hydrabaminen (mit N,N-Bis(dehydroabietyl)ethylendiamin gebildet), N-Methyl-D-glucaminen, N-Methyl-D-glucamiden, t-Butylaminen und Salzen mit Aminosäuren, wie Arginin, Lysin und dergleichen. Basische stickstoffhaltige Gruppen können mit Mitteln wie niederen Alkylhalogeniden (z. B. Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchloriden, -bromiden und -iodiden), Dialkylsulfaten (z. B. Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten), langkettigen Halogeniden (z. B. Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, -bromiden und -iodiden), Aralkylhalogeniden (z. B. Benzyl- und Phenethylbromiden) und anderen quaternisiert werden.
Alle derartigen Säuresalze und Basesalze sollen pharmazeutisch annehmbare Salze innerhalb des Umfangs dieser Offenbarung sein, und alle Säure- oder Basensalze werden für die Zwecke dieser Offenbarung als zu den freien Formen der entsprechenden Verbindungen äquivalent angesehen.
Verbindungen der Formel I und Salze und Solvate und Prodrugs davon können in ihrer tautomeren Form vorliegen (beispielsweise als Amid oder Iminoether). Alle derartigen tautomeren Formen werden hier als Teil der vorliegenden Offenbarung angesehen.
Alle Stereoisomere (beispielsweise geometrische Isomere, optische Isomere und dergleichen) der vorliegenden Verbindungen (einschließlich jenen der Salze, Solvate und Prodrugs der Verbindungen sowie der Salze und Solvate der Prodrugs), wie jene, die aufgrund von asymmetrischen Kohlenstoffatomen an verschiedenen Substituenten vorliegen können, einschließlich enantiomeren Formen (die sogar in Abwesenheit asymmetrischer Kohlenstoffatome vorliegen können), rotameren Formen, Atrop-isomeren und diastereomeren Formen, sind hier in den Umfang dieser Offenbarung eingeschlossen. Individuelle Stereoisomere der Verbindungen dieser Offenbarung können beispielsweise im Wesentlichen frei von anderen Isomeren sein, oder können beispielsweise als Racemate oder mit allen anderen oder anderen ausgewählten Stereoisomeren gemischt sein. Die chiralen Zentren der vorliegenden Erfindung können die S- oder R-Konfiguration haben, wie durch die Empfehlungen der IUPAC von 1974 definiert. Die Verwendung der Begriffe "Salz", "Solvat", "Prodrug" und dergleichen soll gleichermaßen für das Salz, Solvat und Prodrug von Enantiomeren, Stereoisomeren, Rotameren, Tautomeren, Racematen oder Prodrugs der hier offenbarten Verbindungen gelten.
In anderen Aspekten dieser Offenbarung haben die Verbindungen (einschließlich Salzen, Prodrugs, Zusammensetzungen und Verfahren derselben) die folgenden Formeln, wobei die Variablen wie hier definiert sind:
Hier offenbarte Verbindungen liefern gemäß einem anderen Aspekt pharmazeutische Zusammensetzungen, die einen Inhibitor von HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase gemäß einer der Formeln (I)–(IV) und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger, ein pharmazeutisch annehmbares Hilfsmittel oder Verdünnungsmittel enthalten.
Bevorzugte Werte für G¹, G², G³, W, Cy, R, R², R³, R⁴ und R⁵ sind wie bereits für den ersten Aspekt der Offenbarung beschrieben. Hier offenbarte Verbindungen können nach jedem Verfahren formuliert werden, das in der Technik bekannt ist, und können zur Verabreichung über einen beliebigen Weg formuliert werden, einschließlich ohne Einschränkung parenteral, oral, sublingual, transdermal, topisch oder intrarektal. In einigen Fällen ist die orale Verabreichung bevorzugt.
Die Charakteristika des Trägers hängen vom Verabreichungsweg ab. Die hier offenbarten Zusammensetzungen können zusätz lich zu dem HCV RdRp-Inhibitor Verdünnungsmittel, Füllstoffe, Salze, Puffer, Stabilisatoren, Lösungsvermittler und andere Materialien enthalten, die in der Technik wohl bekannt sind, vorausgesetzt, dass diese Materialien wie Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Bestandteils/der aktiven Bestandteile nicht nachteilig beeinflussen. Die Zusammensetzung kann in Abhängigkeit von dem vorgesehenen Verabreichungsweg in jeder geeigneten Form vorliegen, z. B. Tablette, Kapsel oder flüssigen Formen für die orale Verabreichung, oder Lösungs- oder Suspensionsformen für die parenterale Verabreichung. Die Herstellung der pharmazeutisch annehmbaren Formulierungen ist beispielsweise in Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20. Auflage, Herausgeber A. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000, beschrieben.
Die hier offenbarten pharmazeutischen Zusammensetzungen schließen in einigen Fällen ein oder mehrere andere Mittel zur Behandlung von Virusinfektionen ein, einschließlich z. B. Antivirusmitteln oder immunmodulierenden Mitteln. Das andere Mittel ist in bestimmten Fällen ein Inhibitor von HCV RdRp, HCV Helicase, HCV Protease oder einem anderen HCV-Zielprotein. Das andere Mittel ist in bestimmten anderen Fällen ein Breitband-Antivirus- oder Immunmodulationsmittel, z. B. Ribavirin, Interferon oder ein Derivat davon.
Die Offenbarung liefert in einem weiteren Aspekt Verfahren zum Inhibieren der HCV-Replikation in einer Zelle. Bei den Verfahren wird eine Zelle, die mit HCV infiziert ist, mit einer hier offenbarten Verbindung oder Zusammensetzung kontaktiert. Die Zelle ist in einigen Fällen ein Hepatozyt. HCV kann sich jedoch in anderen Zelltypen als Hepatozyten replizieren, und die hier offenbarten Verfahren sind auch in diesen anderen Zelltypen wirksam.
Die Zelle ist in bestimmten Fällen eine kultivierte Zelle, die die Replikation von HCV unterstützen kann. Zellkultursysteme, die die HCV-Replikation unterstützen, können durch Infektion von Primärzellkulturen oder Zelllinien oder durch Kultivieren von Primärzellen aus einem chronisch infizierten Säuger hergestellt werden. Beispiele für derartige HCV-Replikationssysteme sind z. B. in Lohmann et al., Science 285: 110–113 (1999), Blight et al., Science 290: 1972 (2000), und Barenschlager und Lohmann, J. Gen. Virology 81: 8631–1648 (2000) beschrieben. Die Zelle befindet sich in bestimmten anderen Fällen in einem menschlichen oder tierischen Subjekt. Das Tier ist vorzugsweise ein Säuger. Das Tier ist in einigen Fällen ein Primat.
Die Offenbarung liefert in einem weiteren Aspekt die Verwendung von mindestens einer Verbindung der Formel (I) zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Prophylaxe oder Behandlung einer HCV-Infektion.
Die Offenbarung liefert in einem weiteren Aspekt Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung oder eines Zustands, die mit HCV-Infektion zusammenhängen, bei denen einem mit HCV infizierten menschlichen oder tierischen Subjekt eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge von mindestens einer hier offenbarten Verbindung oder Zusammensetzung verabreicht wird. Mit "Erkrankung oder Zustand, die bzw. der mit HCV-Infektion zusammenhängen" ist jede Erkrankung oder jeder Zustand gemeint, die bzw. der direkt oder indirekt durch Infektion mit HCV hervorgerufen wird. Das Tier ist vorzugsweise ein Säuger. Das Tier ist in einigen Fällen ein Primat.
HCV ist durch eine ausgeprägte Genomvariabilität gekennzeichnet, und die HCV-Replikation führt zur raschen Erzeugung von Virusvarianten. Holland et al., Current Topics in Microbiology and Immunology 176: 1–20 (1992) lehrt, dass HCV selbst bei einem individuellen Patienten als Schwarm von Mikrovarianten vorliegt, ein Phänomen, welches die Autoren als Quasispezies bezeichnen. Die Begriffe "Hepatitis C-Virus" und "HCV" sollen sich hier daher auf jegliche dieser Virusvarianten oder Mischungen davon beziehen.
Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich hier auf eine ausreichende Menge, um für das Subjekt von Nutzen zu sein, oder eine ausreichende Menge, um irgendeine günstige Veränderung bei irgendeinem Symptom oder Marker herbeizuführen, die mit HCV-Infektion assoziiert sind. Mit "Marker, der mit HCV-Infektion assoziiert ist" ist jegliche biologische Messgröße gemeint, die mit der HCV-Infektion korreliert und/oder einen Vorhersagewert für die klinische Prognose hat. Zu derartigen Markern gehören, ohne einschränkend zu sein, aktive Viruse und virale Antigene.
Der Begriff "prophylaktisch wirksame Menge" bezieht sich hier auf eine ausreichende Menge, um die Schwere der HCV-Symptome bei einem menschlichen oder tierischen Subjekt zu verhindern oder zu reduzieren, das HCV ausgesetzt oder damit infiziert war. Zu der prophylaktischen Behandlung gehört in einigen Fällen das Verabreichen einer Verbindung oder Zusammensetzung wie hier offenbart an ein menschliches oder tierisches Subjekt, von dem gefunden wurde, dass es HCV-Träger ist, jedoch keine Symptome der Hepatitis C-Erkrankung zeigt. Prophylaktische Behandlung schließt hier auch die Verabreichung einer Verbindung oder Zusammensetzung wie hier offenbart an ein menschliches oder tierisches Subjekt ein, welches einen verbesserten Erkrankungszustand zeigt, jedoch nach wie vor HCV-Träger ist und das Risiko hat, dass die symptomatische Erkrankung wieder auftritt.
Die (z. B. therapeutisch oder prophylaktisch) wirksame Menge des verabreichten HCV RdRp-Inhibitors wird empirisch be stimmt und basiert auf solchen Überlegungen wie dem speziellen verwendeten Inhibitor, dem Alter, Körpergewicht und Zustand des Individuums, dem gewünschten Behandlungseffekt, dem Verabreichungsweg und dergleichen. Es wird erwartet, dass der typische Dosisbereich von etwa 0,1 mg/kg bis etwa 100 mg/kg pro Dosis reicht, die in einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag gegeben werden kann.
In einigen Fällen schließen die Verfahren gemäß diesem Aspekt der vorliegenden Offenbarung ferner die Verabreichung von einem oder mehreren anderen Mitteln zur Behandlung viraler Infektionen ein, z. B. antivirale Mittel oder immunmodulierende Mittel. Das andere Mittel ist in bestimmten Fällen ein Inhibitor von HCV RdRp, HCV Helicase, HCV Protease oder einem anderen HCV-Zielprotein. Das andere Mittel ist in bestimmten anderen Fällen ein Breitband-Antivirus- oder Immunmodulationsmittel, z. B. Ribavirin, Interferon oder ein Derivat davon.
Das andere Mittel oder die anderen Mitteln können gleichzeitig mit dem HCV RdRp-Inhibitor verabreicht werden, oder können zu einer anderen Zeit verabreicht werden. Innerhalb des Umfangs der vorliegenden Offenbarung liegen auch sequentielle oder alternierende Therapieschemata.
BEISPIELE
Obwohl hier nachfolgend eine Reihe unterschiedlicher Verbindungen offenbart werden, sind die erfindungsgemäßen Verbindungen in dem angefügten Anspruch 1 angegeben.
Chemische Synthese
NMR-Spektren wurden auf einem Mercuryplus 400 MHz NMR Spektrometer (Varian) unter Verwendung von CDCl₃ oder DMSO-d₆ als Lösungsmittel erfasst. Die LC-MS-Daten wurden unter Verwendung eines Agilent 1100 Series LC/MSD (Quadrupol, API-ES (Atmospheric Pressure Interface Electrospray) erhalten, wobei die Kapillarspannung auf 3500 V eingestellt war, und welches im positiven Modus lief.
Die Reinigung mittels Reverse-Phase-Chromatographie wurde mit einer C₁₈-Reverse-Phase-Säule mit einem Gradienten von 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser bis 95:5 Acetonitril:Wasser mit einer Durchflussrate von 20 ml/Min bewirkt. Die Proben wurden mit eines UV-(Gilson, 254 nm) oder Massenspektrum-(Agilent 1100 Series LC/MSD Modell SL) Signals erfasst.
Die Normalphasenchromatographie an Silikagel mit einem Biotage-Instrument wurde unter Verwendung eines Quad UV Systems (P/N 07052) unter Verwendung von KP-SIL 32–63 μm Säulen, 60A mit Flash-Kartuschen 12 + M oder 25 + M durchgeführt.
In den Beispielen verwendete Abkürzungen

AcOH

Essigsäure

DCM

Dichlormethan

DIAD

Diisopropylazodicarboxylat

DIEA

Diisopropylethylamin

DMAP

4-Dimethylaminopyridin

DME

Dimethoxyethan

DMF

Dimethylformamid

DMFDMA

N,N-Dimethylformamiddimethylacetal

DMSO

Dimethylsulfoxid

EtOAc

Ethylacetat

EtOH

Ethanol;

HATU

N,N,N',N'-Tetramethyl-O-(7-azabenzotriazol-1-yl)-uroniumhexafluorphosphat

Hex

Hexane

HPLC

Hochdruck-Flüssigchromatographie

mCPBA

meta-Chlorperoxybenzoesäure

MeOH

Methanol

Pyr

Pyridin

RT

Raumtemperatur

THF

Tetrahydrofuran

DC

Dünnschichtchromatographie

Repräsentative Verbindungen der Formel (I), worin G -C(O)-OH ist, wurden nach dem in Schema 1 beschrieben Syntheseweg hergestellt.
Schema 1
Beispiel 1: 7-Biphenyl-4-yl-5-(4-chlorphenyl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester
Stufe 1: 5-(4-Chlorphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo [1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester
Eine Mischung von Methyl-4-chlorbenzoylacetat (2,13 g, 10 mmol) und Ethyl-5-amino-3-pyrazolcarboxylat (1,55 g, 10 mmol) in Eisessig wurde 20 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Während der Reaktion bildete sich ein glänzender Niederschlag. Die Reaktionsmischung wurde abgekühlt und mit Ethylacetat verdünnt und filtriert. Der Niederschlag wurde mit Ethylacetat gewaschen, um einen schmutzigweißen glänzenden Feststoff zu ergeben (1,92 g, 60%).
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 12,8 (bs, 1H), 7,87 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 7,67 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 6,55 (s, 1H), 6,21 (s, 1H), 4,34 (q, 2H, J = 6,8 Hz), 1,35 (t, 3H, J = 6,8 Hz). MS berechnet für C₁₅H₁₃ClN₃O₃ [M+H]⁺ 318,057, gefunden 318,0.
Stufe 2: 7-Chlor-5-(4-chlorphenyl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester
Zu einer Suspension von 5-(4-Chlorphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester (1,92 g, 6,04 mmol) und N,N-Diethylanilin (2,4 ml, 15,1 mmol) wurde Phosphoroxychlorid (6 ml) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Beim Abkühlen erstarrte die Reaktionsmischung. Die Reaktionsmischung in Dichlormethan gelöst und konzentriert. Der Feststoff wurde in Dichlormethan gelöst und nacheinander mit kaltem Wasser (3 × 100 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (1 × 100 ml) und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (SiO₂, 1% Ethylacetat/Dichlormethan) ergab einen gelben Feststoff (1,53 g, 75%).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8,04 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,52 (s, 1H), 7,51 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,33 (s, 1H), 4,53 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,49 (t, 3H, J = 6,8 Hz). MS berechnet für C₁₅H₁₂Cl₂N₃O₂ [M+H]⁺ 336,023, gefunden 336,0.
Stufe 3: 7-Biphenyl-4-yl-5-(4-chlorphenylpyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester
In ein Reaktionsröhrchen, das 7-Chlor-5-(4-chlorphenyl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester (50 mg, 0,15 mmol), 4-(Phenyl)phenylboronsäure (36 mg, 0,18 mmol), Natriumcarbonat (35 mg, 0,33 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (17 mg, 0,015 mmol) enthielt, wurden Toluol (5 ml) und Wasser (1 ml) gegeben. Das Reaktionsröhrchen wurde evakuiert und mit Argon gespült. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde nach dem Abkühlen mit Ethylacetat (10 ml) und Wasser (15 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (SiO₂, Dichlormethan) ergab einen blassgelben Feststoff (53 mg, 78%).
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8,23 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 8,12 (d, 2H, J = 6,8 Hz), 7,81 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 7,68 (d, 2H, J = 7,2 Hz), 7,55-7,40 (m, 8H), 7,31 (s, 1H), 6,90 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 4,49 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 1,47 (t, 3H, J = 6,8 Hz). MS berechnet für C₂₇H₂₁ClN₃O₂ [M+H]⁺ 454,12, gefunden 454,0.
Beispiel 2: 5-(4-Chlorphenyl-7-(2-chlorphenyl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester
In ein Reaktionsröhrchen, das 7-Chlor-5-(4-chlorphenyl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester (50 mg, 0,15 mmol) und Tetrakis(triphenylphosphin)palladium(0) (17 mg, 0,015 mmol) in Dimethylformamid (2 ml) enthielt, wurde 0,5 M 2-Chlorphenylzinkiodid in THF (0,38 ml, 0,19 mmol) gegeben. Das Reaktionsröhrchen wurde evakuiert und mit Argon gespült. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf 60°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde nach dem Abkühlen mit Ethylacetat (10 ml) und gesättigter Ammoniumchloridlösung (10 ml) verdünnt. Die organische Phase wurde abgetrennt, mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Die Reinigung durch Säulenchromatographie (SiO₂, Dichlormethan) ergab einen blassgelben Feststoff (51 mg, 66%) mit einer Reinheit von 80%.
¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8,08 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 7,70-7,45 (m, 6H), 7,40 (s, 1H), 7,30 (s, 1H), 4,45 (q, 2H, J = 6,8 Hz), 1,43 (t, 3H, J = 6,8 Hz). MS berechnet für C₂₁H₁₆Cl₂N₃O₂ [M+H]⁺ 412,05, gefunden 412,0.
Beispiel 3: 5-(4-Chlorphenyl-7-(2-chlorphenyl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäure
Zu 5-(4-Chlorphenyl-7-(2-chlorphenyl)-pyrazolo[1,5a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester (50 mg, 0,12 mmol) in Tetrahydrofuran (3 ml) wurde bei Raumtemperatur Benzyltrimethylammoniumhydroxid (2,2 M in Methanol, 222 μL, 0,49 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde 1,5 Stunden gerührt, bevor p-Toluolsulfonsäureharz (275 mg, etwa 4,5 Äquivalente) zugegeben wurden. Die Reaktionsmischung wurde eine Stunde gerührt. Die Mischung wurde filtriert und konzentriert. Reinigung durch präparative HPLC-Chromatographie ergab einen schmutzigweißen Feststoff (25 mg, 54%). Diese Verbindung entspricht Eintrag 106 in Tabelle 1.
¹H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 13,45 (bs, 1H), 8,33 (d, 2H, J = 6,4 Hz), 7,99 (s, 1H), 7,80-7,6 (m, 6H), 7,25 (s, 1H). MS berechnet für C₁₉H₁₂Cl₂N₃O₂ [M+H]⁺ 384,02, gefunden 384,0.
Beispiel 4: Synthese von Pyrazolo[1,5-a]pyrimidinylaminoderivaten
Eine Mischung von 7-Chlorpyrazolo[1,5-a]pyrimidin (0,05 mmol), Amin (0,05 mmol) und Kaliumcarbonat (0,1 mmol) in DMF (1,5 ml) wurde 16 Stunden bei 60°C gerührt.
Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und danach mit Ethylacetat (10 ml) verdünnt. Die resultierende Mischung wurde mit Wasser (2×) und gesättigter Salzlösung extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert.
MS (+, 30 V) berechnet für C₂₃H₂₁ClN₄O₂ [M+H]⁺ 421,14, gefunden 421,2.
Stufe 2:
Zu der Pyrazolo[1,5-a]pyrimidinaminoverbindung (0,05 mmol) in THF (1,5 ml) und Wasser (0,5 ml) wurde 1 M LiOH (200 μl, 0,2 mmol) gegeben und 16 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktion wurde mit Ethylacetat (10 ml) verdünnt und auf pH 2 angesäuert, in einen Scheidetrichter überführt und die Phasen getrennt. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert.
Für den obigen Fall, wobei die Aminogruppe D,L-α-Methylbenzylamin (Eintrag 78) war: MS (+, 30 V) berechnet für C₂₁H₁₇ClN₄O₂ [M+H]⁺ 393,10, gefunden 393,0.
Beispiel 5: Synthese von Amino- und Anilinopyrazolo[1,5-a]pyrimidinderivaten
Stufe 1:
Eine Mischung von 7-Chlorpyrazolo[1,5-a]pyrimidin (0,05 mmol), Anilin (0,05 mmol) und Kaliumcarbonat (0,1 mmol) in DMF (1,5 ml) wurde 16 Stunden bei 60°C gerührt.
Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und danach mit Ethylacetat (10 ml) verdünnt. Die resultierende Mischung wurde mit Wasser (2×) und gesättigter Salzlösung extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert.
MS (+, 30 V) berechnet für C₂₁H₁₇ClN₄O₂ [M+H]⁺ 393,10, gefunden 393,0.
Stufe 2:
Für X = H (Eintrag 76): MS (+, 30 V) berechnet für C₁₉H₁₃ClN₄O₂ [M+H]⁺ 365,07, gefunden 365,0.
Beispiel 6: Synthese von 6,7-Diarylpyrazolo[1,5-a]pyrimidincarboxylaten
Stufe 1:
Zu einer Lösung von Benzyl-4-chlorphenylketon (230 mg, 1 mmol) in trockenem Toluol (10 ml) wurde unter Argon tropfenweise bei RT N,N-Dimethylformamiddimethylacetal (DMFDMA) (159 μl, 1,2 mmol) gegeben. Nach 12 Stunden wurde DMFDMA (4 μl, 0,03 mmol) zugegeben, und die Mischung wurde weitere 24 Stunden auf 50°C erwärmt. Während 5 Tagen wurde dann täglich DMFDMA (4 μl, 0,03 mmol) zugegeben, und die Temperatur wurde täglich etwa 15°C erhöht. Am fünften Tag, als die Reaktion abgeschlossen war (DC-Überwachung), wurde das Lösungsmittel entfernt, um das Enaminoketon (285 mg, 100%) als rotbraunes Öl zu ergeben.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7,35 (s, 1H), 7,38 (m, 2H), 7,25 (m, 6H), 7,16 (m, 2H), 2,8 (s, 6H).
MS (+, 30 V) berechnet für C₁₇H₁₆ClNO [M+H]⁺ 286,09, gefunden 286,05.
Zu der Enaminketonverbindung (285 mg, 1 mmol) in Essigsäure (10 ml) wurde 3-Amino-5-carbomethoxypyrazol (141 mg, 1 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde auf 118°C erwärmt und 16 Stunden bei 118°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert. Das Pyrazolopyrimidinprodukt wurde durch Säulenchromatographie (SiO₂, 5% Ethylacetat/DMC) gereinigt, was einen weißen Feststoff (335 mg, 89%) ergab.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8,66 (s breit, 1H), 7,44 (m, 2H), 7,35 (m, 6H), 7,17 (m, 2H), 3,98 (s, 3H).
MS (+, 30 V) berechnet für C₂₀H₁₄ClN₃O₂ [M+H]⁺ 364,08, gefunden 364,05.
Stufe 3:
Zu dem 7-(4-Chlorphenyl)-6-phenylpyrazolo[1,5]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester (98 mg, 0,27 mmol) in THF (5 ml) wurde Benzyltrimethylammoniumhydroxid (40 Gew.-% Lösung in Methanol) (491 μl, 1,1 mmol) gegeben, und die Mischung wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. DC (DCM/MeOH/AcOH 90:10:1) zeigte, dass die Umsetzung vollständig war. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (10 ml) verdünnt und mit 1 N HCl auf pH 2 angesäuert. Nach dem Überführen in einen Scheidetrichter und Trennen der Phasen wurde die organische Phase mit Salzlösung (1×) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Das Pyrazolpyrimidinprodukt wurde durch präparative Flüssigchromatographie gereinigt, was einen blassgelben Feststoff (46 mg, 49%) ergab. Dies entspricht in Tabelle 1 Eintrag 236.
¹H-NMR (DMSO, 400 MHz): δ 8,74 (s, 1H), 7,49 (s, 4H), 7,28 (m, 6H). MS (+, 30 V) berechnet für C₁₉H₁₁ClN₃O₂ [M+H]⁺ 350,08, gefunden 350,05.
Beispiel 7: Synthese von 6,7-Diarylpyrazolo[1,5-a]pyrimidintetrazolen
Stufe 1:
Zu einer Lösung von Benzyl-3-phenoxyphenylketon (523 mg, 1,8 mmol) in trockenem Toluol (5 ml) wurde unter Argon tropfenweise bei RT tert.-Butoxybis(dimethylamino)methan (524 μl, 2,54 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden auf 60°C erwärmt. DC zeigte, dass die Reaktion abgeschlossen war. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um das Enaminketon (617 mg, 100%) als rotbraunes Öl zu ergeben.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 7,39 (s, 1H), 7,25 (m, 12H), 6,99 (dd, 2H), 2,75 (s breit, 6H).
MS (+, 30 V) berechnet für C₂₃H₂₁NO₂ [M+H]⁺ 344,16, gefunden 344,05.
Stufe 2:
Zu der Enaminketonverbindung (150 mg, 0,44 mmol) in Essigsäure (5 ml) wurde 3-Aminopyrazol-4-carbonitril (141 mg, 0,44 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde auf 118°C erwärmt und 16 Stunden bei 118°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert. Das Pyrazolpyrimidinprodukt wurde durch Säulenchromatographie (SiO₂, 5% Ethylacetat/DMC) gereinigt, was einen weißen Feststoff (117 mg, 68%) ergab.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8,82 (s, 1H), 8,38 (m, 2H), 7,45 (m, 4H), 7,31 (m, 3H), 7,15 (m, 6H), 6,85 (t, 1H), 6,78 (dd, 2H).
MS (+, 30 V) berechnet für C₂₅H₁₆N₄O [M+H]⁺ 389,13, gefunden 389,05.
Stufe 3:
Zu dem Pyrazolpyrimidinnitril (102 mg, 0,26 mmol) in Xylolen (5 ml) wurde Azidotributylzinn (144 μl, 0,52 mmol) gegeben. Die resultierende Mischung wurde 60 Stunden unter Argon auf 110°C erwärmt. Das Lösungsmittel wurde nach 60 Stunden abgedampft, Acetonitril (10 ml) wurde zugefügt und die Lösung mit Hexanen (8 × 10 ml) gewaschen. Die Acetonitrilphase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um das gewünschte pyrazolpyrimidinzinngeschützte Tetrazol als gelbes Gummi (187 mg, 98%) zu ergeben.
Dieses gelbe Gummi wurde in Methanol (5 ml) aufgenommen. Der resultierenden Lösung wurde Chlorwasserstoff (1,0 M Lösung in Diethylether) (1 ml, 1 mmol) zugegeben und 3 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (10 ml) verdünnt und mit wässrigem gesättigtem Natriumbicarbonat (2×) und Salzlösung (1×) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde mit Hexan trituriert, um das freie Tetrazolprodukt als gelben Feststoff zu ergeben (10,7 ml, 10%). Dies entspricht in Tabelle 1 Eintrag 250.
¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 8,85 (s, 1H), 8,75 (s, 1H), 7,4 (m, 6H), 7,28 (m, 1H), 7,15 (m, 5H), 6,95 (t, 1H), 6,82 (dd, 2H).
MS (+, 30 V) berechnet für C₂₃H₁₇N₇O [M+H]⁺ 432,15, gefunden 432,05.
Beispiel 8: Synthese von 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester
Zu einer Lösung von 25,8 g (164 mmol) 5-Nitro-1H-pyrazol-3-carbonsäure in 250 ml wasserfreiem Methanol (MeOH) wurden tropfenweise 10,3 ml (141 mmol) Thionylchlorid gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht auf Rückfluss erwärmt, danach auf RT abgekühlt und konzentriert, um 27,6 g (98% Ausbeute) 5-Nitro-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester als Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 6,08 (s, 1H), 3,91 (s, 3H).
10,25 g (60 mmol) 5-Nitro-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester wurden in 75 ml Essigsäure (AcOH) und 75 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Nach einem Vakuum- und Argon-Zyklus wurden 2,05 g (20 Gew.-%) Palladium auf Kohle (Pd/C, 10 Gew.-%) zugegeben, die Mischung wurde erneut entgast und aus einem Ballon mit Wasserstoff gefüllt. Die Reaktionsmischung wurde 2 Tage lang unter einer Wasserstoffatmosphäre bei RT gerührt. Die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie (DC) zeigte vollständige Umwandlung von Ausgangsmaterial zu Produkt. Die Mischung wurde dann konzentriert, das resultierende rotviolette Öl wurde in 300 ml Ether aufgenommen, die fein verteilte rotviolette Verunreinigung wurde abfiltriert und das Etherfiltrat eingedampft, um 7,23 g (85% Ausbeute) 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester als schmutzigweißen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird, dessen Struktur unter Verwendung von ¹H-NMR bestätigt wurde.
Beispiel 9: Synthese von 2-{[5-(4-Chlorphenyl)-7-(4-phenoxyphenyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl]amino}-3-hydroxypropionsäure
Zu einer Lösung von 10 mg (0,023 mmol) 5-(4-Chlorphenyl)-7-(4-phenoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure in 1 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 0,016 ml (0,068 mmol) Diisopropylethylamin (DIEA), 6,3 mg (0,025 mmol) L-Serin-(tBu)OtBu-Hydrochlorid, wenige Kristalle Dimethylaminopyridin (DMAP Kat.), gefolgt von 10,3 mg (0,027 mmol) HATU gegeben, und die resultierende Mischung wurde 3 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Ethylacetat verdünnt, mit 0,1 N Natriumhydroxidlösung, Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 3-tert.-Butoxy-2-{[5-(4-chlorphenyl)-7-(4-phenoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl]amino}propionsäure-tert.-butylester zu ergeben, der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet wurde.
Eine Probe von 3-tert.-Butoxy-2-{[5-(4-chlorphenyl)-7-(4-phenoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl]amino}propionsäure-tert.-butylester wurde mit 1 ml 95:5 Trifluoressigsäure (TFA):H₂O behandelt, und die resultierende Lösung wurde 1,5 Stunden bei RT gerührt, nach dieser Zeit wurde sie durch Zugabe von 2 ml 1:1 Acetonitril:Wasser gequencht. Die Mischung wurde dann konzentriert und lyophilisiert, um 11,2 mg (93% Ausbeute über 2 Stufen) der gewünschten 2-{[5-(4-Chlorphenyl)-7-(4-phenoxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl]amino}- 3-hydroxypropionsäure als Feststoff zu ergeben, dessen ¹H-NMR-Spektrum in Übereinstimmung mit ihrer Struktur war. Für Eintrag 260: LC-MS berechnet für C₂₈H₂₁ClN₄O₅ [M+H]⁺: 529,12; gefunden: 529,1.
Beispiel 10: Synthese von 7-Oxo-5-phenyl-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure und 5-(2-Chlorphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure
Eine Lösung von 0,56 ml (3,22 mmol) 3-Oxo-3-phenylpropionsäureethylester und 0,50 g (3,22 mmol) 5-Amino-2H-pyrazol-3-carbonsäureethylester in 4 ml Essigsäure (HOAc) wurde 4 Stunden auf Rückfluss erwärmt, wobei währenddessen ein Niederschlag gebildet wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Ethylacetat gewaschen und getrocknet, um 0,51 g (56 Ausbeute) 7-Oxo-5-phenyl-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester als Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₁₅H₁₃N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 284,1; gefunden: 284,1.
Zu einer Lösung von 50 mg (0,18 mmol) 7-Oxo-5-phenyl-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäureethylester in 4 ml Ethanol (EtOH) wurden 26 mg (0,40 mmol) Kaliumhydroxid (KOH) gegeben, und die resultierende Mischung wurde 60 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 4 M HCl in Dioxan-Lösung angesäuert und mit Ethylacetat verdünnt. Der organische Extrakt wurde mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um die gewünschte 7-Oxo-5-phenyl-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₁₃H₉N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 256,06, gefunden: 256,1. Dies entspricht Eintrag 619.
5-(2-Chlorphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (Eintrag 620) wurde nach der gleichen Synthesesequenz ausgehend von 3-(2-Chlorphenyl)-3-oxopropionsäureethylester synthetisiert, wobei die Cyclisierung mit 5-Amino-1H-pyrazol-4-carbonsäureethylester durchgeführt wurde.
Beispiel 11: Synthese von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-isobutyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
Die Synthese von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-isobutyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (410) wurde wie oben abgebildet durch Transformationen bewirkt, die an anderer Stelle in diesem Dokument für strukturell ähnliche Verbindungen beschrieben sind. Andere Verbindungen mit Modifikationen an der 7-Position wurden in einer ähnlichen Weise synthetisiert.
Beispiel 12: Synthese von 7-Isopropyl-6-methyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
Die Synthese von 7-Isopropyl-6-methyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (390) wurde wie oben gezeigt ausgehend von dem kommerziell erhältlichen 2-Methylpentan-3-on durch bekannte Transformationen bewirkt, die zuvor für strukturell ähnliche Verbindungen beschrieben wurden. 7-Ethyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (392), 7-Cyclohexyl-6-methyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (391) und 7-Cyclohexyl-6-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (394) wurden nach der folgenden Synthesesequenz hergestellt.
Beispiel 13: Synthese von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-(tetrahydrothiopyranyl)-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
Gemäß einer Modifikation eines Literaturverfahrens (Helv. Chim. Acta 1997, 80, 1528) wurden zu einer eiskalten Lösung von 2,0 g (17,2 mmol) Tetrahydrothiopyran-4-on und 3,69 g (18,9 mmol) 1-Isocyanomethansulfonyl-4-methylbenzol in 100 ml 1,2-Dimethoxyethan (DME) 34,4 ml (34,4 mmol) Kalium-t-butoxid (1 M Lösung in t-Butanol) gegeben, und die resultierende Lösung wurde 3 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Diethylether verdünnt, mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 2,05 g (93% Ausbeute) des gewünschten Tetrahydrothiopyran-4-carbonitrils zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird.
Eine Lösung von 1,97 g (15,5 mmol) Tetrahydrothiopyran-4-carbonitril in 5 ml Ethanol (EtOH) wurde zu einer Lösung von 6,2 g (155 mmol) Natriumhydroxid (NaOH) in 30 ml EtOH und 15 ml Wasser gegeben, und die resultierende Mischung wurde 4 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde in einem Eisbad abgekühlt, mit konzentrierter Salzsäure auf pH 2 angesäuert und danach konzentriert, um einen Niederschlag zu ergeben, der filtriert wurde, um 1,36 g (60%) der gewünschten Tetrahydrothiopyran-4-carbonsäure als braunen kristallinen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird.
Zu einer eiskalten Lösung von 1,36 g (9,32 mmol) Tetrahydrothiopyran-4-carbonsäure in 25 ml Dichlormethan (DCM) wurden tropfenweise 1,1 ml (12,6 mmol) Oxalylchlorid gegeben, und die resultierende Mischung wurde 2 Stunden bei 0°C gerührt. Dann wurden 2 μl N,N-Dimethylformamid (DMF Kat.) zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde 2 Stunden bei RT gerührt und konzentriert, um 1,43 g (93%) des gewünschten Tetrahydrothiopyran-4-carbonylchlorids als braunes Öl zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird. Das Produkt wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe zur Herstellung von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-(tetrahydrothiopyran-4-yl)-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (unten, Eintrag 375) verwendet.
Beispiel 14: Synthese von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-(tetrahydropyran-4-yl)-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-(tetrahydropyran-4-yl)-4-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5a]pyrimidin wurde unter Verwendung des gleichen experimentellen Schemas synthetisiert.
Beispiel 15: Synthese von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-morpholin-4-yl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
Einer Lösung von 15 g (90,3 mmol) Methyl-4-hydroxyphenylacetat in 25 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 32,4 g (99,3 mmol) Cäsiumcarbonat und anschließend 13,4 ml (112,9 mmol) Benzylbromid (BnBr) zugefügt und die resultierende heterogene Mischung 72 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, die Feststoffe mit Ethylacetat gewaschen und die kombinierten organischen Extrakte konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel (25% Hexan in Dichlormethan) chromatographiert wurde, um 19,1 g (83% Ausbeute) des gewünschten (4-Benzyloxyphenyl)essigsäuremethylesters zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₁₆H₁₆O₃ [M⁺+H]⁺: 257,11; gefunden: 257,2.
Gemäß einem modifizierten Literaturverfahren (H. H. Wasserman; J. L. Ives, J. Org. Chem. 1985, 50, 3573–3580) wurde eine Lösung von 1,0 g (3,9 mmol) (4-Benzyloxyphenyl) essigsäuremethylester in 4 ml Toluol mit Argon gespült. Dieser Lösung wurden 0,842 ml g (5,5 mmol) Methoxybis(dimethylamino)methan zugefügt, und die resultierende Mischung wurde über Nacht unter Argon bei 65°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um 1,21 g des gewünschten 2-(4-Benzyloxyphenyl)-3-dimethylaminoacrylsäuremethylesters zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird (der Spuren von Ausgangsmaterial enthält). Das Produkt wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.
Eine Lösung von 1,21 g (3,9 mmol) 2-(4-Benzyloxyphenyl)-3-dimethylaminoacrylsäuremethylester und 0,422 g (3,9 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-4-carbonitril in 5 ml Essigsäure (HOAc) wurde über Nacht auf Rückfluss erwärmt, wobei sich währenddessen ein Niederschlag bildete. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt, mit 20% Ethylacetat-in-Hexan-Lösung verdünnt und filtriert, um 0,86 g (65% über 2 Stufen) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril als bräunlich gefärbten Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₀H₁₄N₄O₂ [M⁺+H]⁺: 343,11; gefunden: 343,1.
Eine Aufschlämmung von 0,86 g (2,5 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril, 1,0 ml (6,3 mmol) N,N-Diethylanilin und 2 ml (21,5 mmol) Phosphoroxychlorid (POCl₃) wurde 7 Stunden auf Rückfluss erwärmt, wobei die Reaktionsmischung während dieser Zeit eine olivgrüne Farbe annahm. Die Mischung wurde auf RT abgekühlt, über Eis gegossen und mit Dichlormethan/Chloroform extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden mit Wasser (3 Mal), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2 Mal), Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel (Dichlormethan) chromatographiert wurde, um 0,637 g (70% Ausbeute) 6-(4- Benzyloxyphenyl)-7-chlorpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird, LC-MS – berechnet für C₂₀H₁₃ClN₄O [M⁺+H]⁺: 361,07, gefunden: 361,1.
Zu einer Lösung von 50 mg (0,138 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-chlorpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril in 2 ml Dimethylformamid in einem 5 ml Mikrowellengefäß wurden 25 mg (0,18 mmol) Kaliumcarbonat gegeben, gefolgt von 15 mg (0,166 mmol) Morpholin, und die Mischung wurde in einem Mikrowellen-synthetisierer (Emrys-System von Personal Chemistry, 300 W) 5 Minuten auf 160°C erwärmt. Da die Analyse mittels LC-MS die Produktbildung zeigte, wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat verdünnt, mit Salzlösung (2 Mal) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phasen-Chromatographie unter Verwendung von Gilson gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) das gewünschte 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-morpholin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril (90% Reinheit) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₄H₂₁N₅O₂ [M⁺+H]⁺: 412,17; gefunden: 412,1.
Gemäß einer Modifikation eines Literaturverfahrens (R. J. Herr, Bioorg. Med. Chem. 2002, 10, 3379–3393) wurden einer Lösung von 35 mg (0,085 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-morpholin-4-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril in 1,5 ml Toluol und 0,5 ml Dimethylformamid 71 mg (0,513 mmol) Triethylaminhydrochlorid (Et₃N-HCl) und 33 mg (0,513 mmol) Natriumazid zugefügt, und die resultierende heterogene Mischung wurde 72 Stunden auf Rückfluss erwärmt, wobei währenddessen alle 24 Stunden 71 mg (0,513 mmol) Triethylaminhydrochlorid (Et₃N-HCl) und 33 mg (0,513 mmol) Natriumazid zu der Reaktionsmischung gegeben wurden. Dann wurde die die Mischung auf RT abgekühlt, filtriert und zu einem Rückstand konzentriert, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach der Lyophi lisierung) 15 mg (38% Ausbeute) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-morpholin-4-yl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (370) als Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird. LC-MS berechnet für C₂₉H₂₂N₈O₂ [M⁺+H]⁺ 455,18; gefunden 455,2.
Beispiel 16: Synthese von 7-Cyclohexyl-6-(4-iodphenyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril
Zu einer Lösung von 5 g (19 mmol) (4-Iodphenyl)essigsäure in 50 ml Methanol (MeOH) wurden tropfenweise 3,5 ml (48 mmol) Thionylchlorid (SOCl₂) gegeben, und die resultierende Mischung wurde 36 Stunden bei RT gerührt, danach zeigte die Analyse mittels Dünnschichtchromatographie (DC) Produktbildung. Die Mischung wurde konzentriert, um 4,5 g (86% Ausbeute) (4-Iodphenyl)essigsäuremethylester als blassbeiges Öl zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird.
Eine Lösung von 2,88 ml (20,5 mmol) Diisopropylamin (iPr₂NH) in 50 ml Tetrahydrofuran (THF) wurde mit Argon gespült und auf –78°C abgekühlt. Dieser Lösung wurden tropfenweise 8,2 ml (20,5 mmol) n-Butyllithium (nBuLi) (2,5 M Lösung in Hexan) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde 20 Minuten bei –78°C gerührt, danach wurde tropfenweise eine Lösung von 4,5 g (16,3 mmol) (4-Iodphenyl)essigsäuremethylester in 25 ml THF zugegeben. Die Mischung wurde 40 Minuten auf RT erwärmen gelassen, danach wurde sie wieder auf –78°C abgekühlt, und trop fenweise wurden 2,62 ml (19,6 mmol) Cyclohexancarbonylchlorid zugegeben, die resultierende Mischung auf RT erwärmen und über Nacht unter Argon bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von gesättigter Ammoniumchloridlösung auf Eis gequencht und mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 7 g eines burgunderfarbenen Öls zu ergeben, das an Silikagel (Biotage; 10% Ethylacetat in Hexan) chromatographiert wurde, um 5,06 g (80% Ausbeute) des gewünschten 3-Cyclohexyl-2-(4-iodphenyl)-3-oxopropionsäuremethylesters als blassgelben Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird (1:2,6 Keto:Enol-Verhältnis. (LC-MS berechnet für C₁₆H₁₉IO₃ [M⁺+H]⁺ 387,04; gefunden: 387,0.
Gemäß einem modifizierten Literaturverfahren (I. Collins et al., J. Med. Chem. 2002, 45, 1887–1900) wurde eine Lösung von 5,06 g (13,1 mmol) 3-Cyclohexyl-2-(4-iodphenyl)-3-oxopropionsäuremethylester in 80 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zu einer Lösung von 1,53 g (26,2 mmol) von Natriumchlorid (NaCl) in 5,8 ml Wasser (H₂O) gegeben, und die resultierende Mischung wurde 3 Stunden auf 150°C erwärmt, wobei sich währenddessen ein weißer Feststoff bildete. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt, in 500 ml Wasser gegossen und gründlich mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser (3 Mal), Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 4,13 g (96% Ausbeute) des gewünschten 1-Cyclohexyl-2-(4-iodphenyl)ethanons als gelben Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird (der geringe Spuren an Verunreinigungen enthielt). Das Produkt wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.
Gemäß einem modifizierten Literaturverfahren (H. H. Wasserman; J. L. Ives, J. Org. Chem. 1985, 50, 3573–3580) wurde eine Lösung von 4,13 g (12,6 mmol) 1-Cyclohexyl-2-(4-iod phenyl)ethanon in 20 ml Toluol mit Argon gespült. Dieser Lösung wurden 2,7 ml (17,6 mmol) Methoxybis(dimethylamino)methan zugefügt, und die resultierende Mischung wurde über Nacht unter Argon bei 70°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um 5,07 g des rohen 1-Cyclohexyl-3-dimethylamino-2-(4-iodphenyl)propenons zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird (das Spuren von Ausgangsmaterial enthält). Das Produkt wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.
Eine Lösung von 2,55 g (6,32 mmol max.) des rohen 1-Cyclohexyl-3-dimethylamino-2-(4-iodphenyl)propenons und 0,98 g (6,32 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-4-carbonsäureethylester in 30 ml Essigsäure (HOAc) wurde 66 Stunden auf Rückfluss erwärmt, wobei sich währenddessen ein Niederschlag bildete. Der Niederschlag wurde abfiltriert und verworfen, und das Essigsäurefiltrat wurde zu einem festen Rückstand konzentriert, der mit 1:1 Ethylacetat:Hexan gewaschen und getrocknet wurde, um 1,67 g (55% Ausbeute) 7-Cyclohexyl-6-(4-iodphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester als blassgelben Feststoff zu ergeben. ¹H NMR (CDCl₃) δ 8,57 (s, 1H), 8,53 (s, 1H), 7,86-7,83 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,1-7,06 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 4,46 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 3,31-3,21 (m, 1H), 2,62-2,41 (m, 2H), 1,87-1,82 (m, 2H), 1,74-1,66 (m, 3H), 1,44 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 1,41-1,21 (m, 3H).
Eine Lösung von 1,66 g (4,1 mmol max.) des rohen 1-Cyclohexyl-3-dimethylamino-2-(4-iodphenyl)propenons und 0,44 g (4,1 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-4-carbonitril in 20 ml Essigsäure (HOAc) wurde 66 Stunden auf Rückfluss erwärmt, wobei sich währenddessen ein fein dispergierter Niederschlag bildete. Da alle Versuche, den Niederschlag abzufiltrieren, erfolglos waren, wurde die Reaktionsmischung konzentriert, um einen braunen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (Biotage; 2% Ethylacetat in Dichlormethan), um 1,09 g (62% Ausbeute) 7-Cyclohexyl-6-(4-iodphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril als gelben Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,49 (s, 1H), 8,39 (s, 1H), 7,88-7,86 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,07-7,05 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 4,13 (q, 2H, J = 7,2 Hz), 3,28-3,21 (m, 1H), 2,59-2,47 (m, 2H), 1,87-1,84 (m, 2H), 1,75-1,65 (m, 3H), 1,28 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 1,39-1,20 (m, 3H).
Beispiel 17: Synthese von 7-Cyclohexyl-6-(3'-methoxybiphenyl-4-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure, 7-Cyclohexyl-6-(4'-methansulfonylbiphenyl-4-yl)-3-(1H-tetrazol-5-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin und 6-(4-Benzylphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure
Eine Mischung von 60 mg (0,126 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-iodphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester, 29 mg (0,19 mmol, 1,5 Äquiv.) 3-Methoxyphenylboronsäure, 5 mg (0,0063 mmol, 5 Mol.-%) Pd-Katalysator und 80 mg (0,378 mmol, 3 Äquiv.) Kaliumphosphat wurde in ein Karussellröhrchen gegeben. Nach einem Vakuum-und-Argon-Zyklus wurde 1,4-Dioxan (3 ml) zu gegeben, und die resultierende Mischung wurde 14 Stunden unter Argon auf 80°C erwärmt. Da die Analyse durch LC-MS die Anwesenheit von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial zeigte, wurden 29 mg (0,19 mmol, 1,5 Äquiv.) 3-Methoxyphenylboronsäure, 10 mg (0,012 mmol, 10 Mol.-%) Pd-Katalysator und 80 mg (0,378 mmol, 3 Äquiv.) Kaliumphosphat zugegeben und weitere 24 Stunden erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat verdünnt, durch ein kleines Celitekissen filtriert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen braunen Rückstand zu ergeben (rohes Kupplungsprodukt), das an Silikagel chromatographiert wurde (Biotage; Gradienteneluierung 2% bis 5% Ethylacetat in Dichlormethan), um 47 mg (82% Ausbeute) des gewünschten 7-Cyclohexyl-6-(3'-methoxybiphenyl-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylesters zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₈H₂₉N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 456,22; gefunden: 456,2.
Zu einer Lösung von 47 mg (0,103 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(3'-methoxybiphenyl-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester in 3 ml Tetrahydrofuran wurden 0,62 ml (0,62 mmol) 1 M LiOH-Lösung gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl in Dioxan-Lösung auf pH 2 angesäuert und mit Ethylacetat verdünnt. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 15 mg (34% Ausbeute) 7-Cyclohexyl-6-(3'-methoxybiphenyl-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (446) als Feststoff (90% Reinheit) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₅N₃O₃ [M+H]⁺: 428,19; gefunden: 428,2.
Eine Mischung von 65 mg (0,15 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-iodphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril, 45 mg (0,225 mmol, 1,5 Äquiv.) 4-(Methansulfonyl)phenylboronsäure, 6 mg (0,0075 mmol, 5 Mol.-%) Pd-Katalysator und 95 mg (0,45 mmol, 3 Äquiv.) Kaliumphosphat wurde in ein Karussellröhrchen gegeben. Nach einem Vakuum-und-Argon-Zyklus wurde 1,4-Dioxan (3 ml) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde 14 Stunden unter Argon auf 80°C erwärmt. Da die Analyse durch LC-MS die Anwesenheit von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial zeigte, wurden 45 mg (0,225 mmol, 1,5 Äquiv.) 4-(Methansulfonyl)phenylboronsäure, 12 mg (0,015 mmol, 10 Mol.-%) Pd-Katalysator und 95 mg (0,45 mmol, 3 Äquiv.) Kaliumphosphat zugegeben und weitere 24 Stunden erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat verdünnt, durch ein kleines Celitekissen filtriert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen braunen Rückstand zu ergeben (rohes Kupplungsprodukt), das an Silikagel chromatographiert wurde (Biotage; Gradienteneluierung 2% bis 10% Ethylacetat in Dichlormethan), um 42 mg (62% Ausbeute) des gewünschten 7-Cyclohexyl-6-(4'-methansulfonylbiphenyl-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitrils zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₄N₄O₂S [M⁺+H]⁺: 457,16; gefunden: 457,1.
Zu einer Lösung von 42 mg (0,092 mmol) von 7-Cyclohexyl-6-(4'-methansulfonylbiphenyl-4-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril in 1 ml Toluol und 1,2 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 76 mg (0,55 mmol) Triethylaminhydrochlorid (Et₃N-HCl) und 36 mg (0,55 mmol) Natriumazid gegeben, und die resultierende heterogene Mischung wurde 72 Stunden auf 120°C erwärmt, wobei währenddessen alle 24 Stunden 76 mg (0,55 mmol) Triethylaminhydrochlorid (Et₃N-HCl) und 36 mg (0,55 mmol) Natriumazid zu der Reaktionsmischung gegeben wurden. Die Mischung wurde dann auf RT abgekühlt, filtriert und zu einem Rückstand konzentriert, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 7 mg (15% Ausbeute) 7- Cyclohexyl-6-(4'-methansulfonylbiphenyl-4-yl)-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin als weißen Feststoff (90% Ausbeute, Eintrag 443) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS berechnet für C₂₆H₂₅N₇O₂S [M⁺+H]⁺ 500,18; gefunden 500,2.
Gemäß einer Modifikation eines Literaturverfahrens (A. Suzuki et al., Tetrahedron Lett. 1986, 27, 6369–6372) wurde eine Mischung von 57 mg (0,12 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-iodphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester und 5 mg (0,006 mmol, 5 Mol-%) Pd-Katalysator in ein Karussellröhrchen gegeben. Nach einem Vakuum-und-Argon-Zyklus wurde Tetrahydrofuran (THF) (2 ml) zugegeben, gefolgt von 0,29 ml (0,144 mmol, 1,2 Äquiv.) B-Benzyl-9-BBN (0,5 M Lösung in THF) und 0,12 ml (0,36 mmol, 3 Äquiv.) 3 N NaOH-Lösung, und die resultierende Mischung wurde unter Argon über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Da die Analyse durch LC-MS die Anwesenheit von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial zeigte, wurden 0,12 ml (0,06 mmol) B-Benzyl-9-BBN, 5 mg (0,006 mmol, 5 Mol.-%) Pd-Katalysator und 0,12 ml, (0,36 mmol) 3 N NaOH-Lösung zugegeben und weitere 24 Stunden erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat verdünnt, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, durch ein kleines Celitekissen gegeben und eingedampft, um einen braunen Rückstand zu ergeben (rohes Kupplungsprodukt), das an Silikagel chromatographiert wurde (Biotage; 2% Ethylacetat in Dichlormethan), um 36 mg (68% Ausbeute) des gewünschten 6-(4-Benzylphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird (der Spuren von Verunreinigungen enthält); LC-MS – berechnet für C₂₈H₂₉N₃O₂ [M⁺+H]⁺: 440,23; gefunden: 440,2.
Zu einer Lösung von 36 mg (0,082 mmol) 6-(4-Benzylphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester in 3 ml Tetrahydrofuran wurden 0,5 ml (0,5 mmol) 1 M LiOH-Lö sung gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 1 M HCl in Dioxan-Lösung angesäuert und mit Ethylacetat verdünnt. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 7 mg (21% Ausbeute) 6-(4-Benzylphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure als Feststoff (90% Reinheit, Eintrag 444) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₅N₃O₂ [M⁺+H]⁺: 412,19; gefunden: 412,3.
Beispiel 18: Synthese von 7-Cyclohexyl-6-(4-furan-3-ylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure
Gemäß einer Modifikation eines Literaturverfahrens (C. Savarin; L. S. Liebeskind, Org. Lett. 2001, 3, 2149–2152) wurde eine Mischung aus 24 mg (0,05 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-iodphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester, 7 mg (0,06 mmol, 1,2 Äquiv.) 3-Furylboronsäure, 3 mg (0,0025 mmol, 5 Mol-%) Pd(PPh₃)₄ und 12 mg (0,06 mmol, 1,2 Äquiv.) Kupfer(I)thiophen-2-carboxylat (CuTC) in ein Schlenk-Rohr gegeben. Nach einem Vakuum-und-Argon-Zyklus wurde Tetrahydrofuran (1,2 ml) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde unter Argon über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten Ethylacetatextrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, durch ein kleines Celitekissen filtriert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 28 mg eines gelben Öls (rohes Kupplungsprodukt) zu ergeben, das ohne weitere Reinigung in der nächsten Reaktion verwendet wurde; LC-MS – berechnet für C₂₅H₂₅N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 416,19; gefunden: 416,2.
Der obige Rückstand wurde in Tetrahydrofuran (2 ml) aufgenommen, es wurden 0,3 ml (0,3 mmol, 5 Äquiv.) 1 M LiOH-Lösung zugegeben und die resultierende Mischung über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Ethylacetat verdünnt und mit 1 N HCl-Lösung auf pH 2 angesäuert. Der organische Extrakt wurde mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 4 mg (20% Ausbeute) 7-Cyclohexyl-6-(4-furan-3-ylphenyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (445) als weißen Feststoff (90% Reinheit) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₃H₂₁N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 388,16; gefunden: 388,1.
Beispiel 19: Synthese von 7-Cyclohexyl-6-[4-(3-methoxyphenoxy)phenyl]-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
Das Ausgangsmaterial in dieser Sequenz wurde nach dem gleichen experimentellen Verfahren synthetisiert, das zur Herstellung eines verwandten Intermediats verwendet wurde, wobei die Benzyloxygruppe (OBn) durch Iod (I) ersetzt wurde.
Eine Lösung von 800 mg (1,95 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril in 5 ml Dichlormethan (DCM) wurde auf –78°C abgekühlt. Der obigen kalten Lösung wurden 2,93 ml (2,93 mmol) Bortrichlorid (BCl₃) (1 M Lösung in DCM) zugefügt, und die resultierende Mischung wurde 90 Minuten bei –78°C gerührt. Da die Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DC) zeigte, dass noch Ausgangsmaterial vorhanden war, wurde Bortrichlorid (BCl₃) (3 Äquiv.) im Überschuss zugegeben und die Reaktion bei –78°C mit 5 ml Methanol gequencht. Die Mischung wurde auf RT erwärmen gelassen, es wurde gesättigte Natriumbicarbonatlösung zugegeben und die Mischung mit DCM extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 754 mg eines schmutzigweißen Feststoffs zu ergeben, der an Silikagel (5% Ethylacetat in DCM) chromatographiert wurde, um 560 mg (90% Ausbeute) des gewünschten 7-Cyclohexyl-6-(4-hydroxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitrils als weißen Feststoff zu ergeben. (LC-MS berechnet für C₁₉H₁₈N₄O [M⁺+H] + 319,15; gefunden: 319,1. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 8,53 (s, 1H), 8,38 (s, 1H), 7,20-7,18 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,00-6,98 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 5,43 (s, 1H, OH), 3,34-3,28 (m, 1H), 2,58-2,44 (m, 2H), 1,86-1,82 (m, 2H), 1,74-1,68 (m, 3H), 1,41-1,18 (m, 3H).
Eine wassergrüne Mischung aus 50 mg (0,157 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-hydroxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril, 43 mg (0,235 mmol) Kupfer(II)acetat (Cu(OAc)₂), 48 mg (0,314 mmol) 3-Methoxyphenylboronsäure, 0,025 ml (0,31 mmol) Pyridin (pyr) und 5 ml DCM wurde 68 Stunden bei RT gerührt, während sie sich offen an der Luft befand. Die Reaktionsmischung wurde durch Celite filtriert, wobei das Celitekissen mit Ethylacetat und Chloroform gespült wurde. Die kombinierten organischen Filtrate wurde zu einem grünen festen Rückstand konzentriert, der zwischen Ethylacetat und Wasser partitioniert wurde und mit Ethylacetat extrahiert wurde. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser (3 Mal), Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 74 mg eines braunen Rückstands zu ergeben, der an Silikagel (Biotage; DCM) chromatographiert wurde, um 38 mg (58% Ausbeute) des gewünschten 7-Cyclohexyl-6-[4-(3-methoxyphenoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitrils als farbloses Öl zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₄N₄O₂ [M⁺+H]⁺: 425,19; gefunden: 425,1.
Die Umwandlung von 7-Cyclohexyl-6-[4-(3-methoxyphenoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril zu dem entsprechenden Tetrazol 7-Cyclohexyl-6-[4-(3-methoxyphenoxy)phenyl]-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (301) wurde mittels eines experimentellen Verfahrens bewirkt, das an anderer Stelle in diesem Dokument beschrieben ist.
Beispiel 20: Synthese von 7-Cyclohexyl-6-[4-(2,4-dimethylthiazol-5-ylmethoxy)-phenyl]-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
Zu einer eiskalten Mischung von 40 mg (0,13 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-hydroxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril in 3 ml Tetrahydrofuran (THF) wurden 74 mg (0,52 mmol) (2,4-Dimethylthiazol-5-yl)methanol, 136 mg (0,52 mmol) Triphenylphosphin (PPh₃) und anschließend 0,102 ml (0,52 mmol) Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) gegeben, und die Mischung wurde auf RT erwärmen gelassen und über Nacht bei RT gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung konzentriert und der Rückstand an Silikagel (Biotage; 10% Ethylacetat in DCM) chromatographiert, um das gewünschte 7-Cyclohexyl-6-[4-(2,4-dimethylthiazol-5-ylmethoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₂₅H₂₅N₅OS [M⁺+H]⁺: 444,18; gefunden: 444,2.
Die Umwandlung von 7-Cyclohexyl-6-[4-(2,4-dimethylthiazol-5-ylmethoxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril zu dem entsprechenden Tetrazol 7-Cyclohexyl-6-[4-(2,4-dimethylthiazol-5-ylmethoxy)phenyl]-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (358) wurde mittels eines Verfahrens bewirkt, das an anderer Stelle in diesem Dokument beschrieben ist.
Beispiel 21: Synthese von 7-Cyclohexyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)-6-[4-(3-trifluormethylbenzyloxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin
Zu einer Lösung von 53 mg (0,17 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-hydroxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril in 3 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 72 mg (0,22 mmol) Cäsiumcarbonat (Cs₂CO₃) und anschließend 0,034 ml (0,22 mmol) 3-(Trifluormethyl)benzylbromid gegeben, und die resultierende heterogene Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert, und die kombinierten organischen Extrakte wurden konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel (Biotage; DCM) chromatographiert wurde, um 65 mg (80% Ausbeute) des gewünschten 7-Cyclohexyl-6-[4-(3-trifluormethylbenzyloxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₂₇H₂₃F₃N₄O [M⁺+H]⁺: 477,18; gefunden: 477,1.
Die Umwandlung von 7-Cyclohexyl-6-[4-(3-trifluormethylbenzyloxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril zu dem entsprechenden Tetrazol 7-Cyclohexyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)[4-(3-trifluormethylbenzyloxy)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin (331) wurde mittels eines experimentellen Verfahrens bewirkt, das an anderer Stelle in diesem Dokument beschrieben ist.
Beispiel 22: Synthese von 6-Brom-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester
Eine Mischung aus 3,0 g (23,8 mmol) Cyclohexylmethylketon und 4,56 g (26,2 mmol) t-Butoxybis(dimethylamino)methan (Bredereck's Reagenz) wurde über Nacht bei 60°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann konzentriert, um 4,0 g (93% Ausbeute) 1-Cyclohexyl-3-dimethylaminopropenon als oranges Öl zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde. Dieses Produkt wurde in der nächsten Reaktion ohne jegliche weitere Reinigung verwendet.
Zu einer eiskalten Lösung von 1,18 g (6,51 mmol) 1-Cyclohexyl-3-dimethylaminopropenon in 8 ml Dichlormethan wurden durch einen Zugabetrichter tropfenweise 1,04 g (6,51 mmol) Brom gegeben. Die Reaktionsmischung wurde eine halbe Stunde bei 0°C gerührt, und danach wurden tropfenweise 0,9 ml (6,51 mmol) Triethylamin in 10 ml Ether zugegeben. Die Mischung wurde eine Stunde bei 0°C gerührt und auf RT erwärmen gelassen. Aus der Lösung fiel ein hellgelber Feststoff aus und wurde durch Filtration abgetrennt. Das Filtrat wurde dann konzentriert, um 1,69 g 2-Brom-1-cyclohexyl-3-dimethylaminopropenon als braunen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird. Das Produkt wurde in der nächsten Reaktion ohne jegliche weitere Reinigung verwendet.
Zu einer Mischung von 1,69 g (6,50 mmol) 2-Brom-1-cyclohexyl-3-dimethylaminopropenon und 1,01 g (6,50 mmol) 3-Amino-1H-pyrazol-4-carbonsäureethylester in 6 ml Ethanol wurde 1,0 ml Lösung von 30% Bromwasserstoff in Essigsäure gegeben, und die resultierende Mischung wurde eine Stunde auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf RT abgekühlt und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (Gradienteneluierung mit Dichlormethan bis 25% Ethylacetat in Dichlormethan), um 620 mg (27% über 2 Stufen) 6-Brom-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde (δ 8,70 (s, 1H), 8,49 (s, 1H), 4,44 (q, 7 = 6,8 Hz, 2H), 2,70-2,57 (b, 1H), 1,98-1,90 (m, 2H), 1,87-1,78 (m, 2H), 1,78-1,69 (m, 2H), 1,59-1,42 (m, 4H), 1,43 (t, j = 6,8 Hz, 3H)); LC-MS – berechnet für C₁₅H₁₈BrN₃O₂ [M⁺+H]⁺: 352,06; gefunden: 352,0.
Beispiel 23: Synthese von 7-Cyclohexyl-6-(4-methansulfanylphenyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure und 7-Cyclohexyl-6-furan-3-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure
Eine Mischung von 14 mg (0,085 mmol) 4-Methylsulfanylphenylboronsäure, 2 mg (0,0028 mmol) Pd-Katalysator und 45 mg (0,213 mmol) Kaliumphosphat wurden in eine 4 ml Ampulle gegeben. Dieser Mischung wurden 25 mg (0,077 mmol) 6-Brom-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester in 1,5 ml 1,4-Dioxan zugegeben, die resultierende Mischung wurde mit Argon gespült und über Nacht bei 80°C (Ölbad) gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Ethylacetat verdünnt, durch ein kleines Celitekissen filtriert und eingedampft (savant), um einen Rückstand (rohes Kupplungsprodukt) zu ergeben. Dieser Rückstand wurde in 1 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst und mit 0,5 ml (0,5 mmol) 1 M LiOH-Lösung behandelt, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Da die Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DC) zeigte, dass die Reaktion nicht abgeschlossen war, wurde die Mischung dann bei 55°C (Sandbad) 15 Stunden lang geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Ethylacetat verdünnt und mit 1 N HCl-Lösung auf pH 2 angesäuert. Die organische Phase wurde abgetrennt und konzentriert (savant), um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie (mittels Gilson) gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 14 mg (56% Gesamtausbeute) 7-Cyclohexyl-6-(4-methylsulfanylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure als Feststoff (472) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₀H₂₁N₃O₂S [M⁺+H]⁺: 368,14, gefunden: 368,2.
Das gleiche experimentelle Verfahren wurde für die Synthese von 7-Cyclohexyl-6-furan-3-ylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (564) verwendet, die als Feststoff erhalten wurde, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₁₇H₁₇N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 312,13, gefunden: 312,1.
Beispiel 24: Synthese von 7-Cyclohexyl-6-(4-methansulfonylphenyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure und 7-Cyclohexyl-6-(4-methansulfanylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure
Zu einer trüben Lösung von 14 mg (0,038 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-methylsulfanylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure in 2 ml Chloroform wurden 9 mg (1,5 Äq.) m-Chlorperoxybenzoesäure (mCPBA) gegeben, und die trübe Lösung wurde klar. Da DC nach 5 Minuten Rühren bei RT das Veschwinden des Ausgangsmaterials anzeigte, wurde die Mischung zu einem Rückstand konzentriert, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie (mittels Gilson) gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 10 mg (69% Gesamtausbeute) 7-Cyclohexyl-6-(4-methylsulfinylphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure als Feststoff (491) zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wurde – berechnet für C₂₀H₂₁N₃O₃S [M⁺+H]⁺: 384,13, gefunden: 384,2.
Es sei darauf hingewiesen, dass 7-Cyclohexyl-6-(4-methansulfonylphenyl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (493) erhalten wurde, wenn das gleiche experimentelle Verfahren mit 2,2 Äquivalenten mCPBA durchgeführt wurde.
Beispiel 25: 2-{[7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]amino}-3-(4-hydroxyphenyl)propionsäure
7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (461) wurde durch eine Suzuki-Reaktion erhalten, die zuvor in einem anderen Abschnitt beschrieben wurde. Die Analysedaten für diese Verbindungen werden nachfolgend wiedergegeben. δ CDCl₃ 8,66 (s, 1H), 8,51 (s, 1H), 7,30-7,27 (m, 2H), 7,26-7,21 (m, 2H), 3,26 (m, 1H), 2,59-2,53 (m, 2H), 1,87-1,84 (m, 2H), 1,75-1,68 (m, 3H), 1,40-1,22 (m, 3H). LC-MS berechnet für C₁₉H₁₈FN₃O₂ [M⁺+H]⁺ 340,15, gefunden: 340,1.
Zu einer Lösung von 15,0 mg (0,044 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure in 2 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 0,019 ml (0,132 mmol) Diisopropylethylamin (DIEA), wenige Kristalle Dimethylaminopyridin (DMAP Kat.), 17,4 mg (0,053 mmol) H-Tyr(tBu)-OtBu·HCl gegeben, gefolgt von 20 mg (0,053 mmol) HATU, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt, mit 0,1 N Natriumhydroxidlösung (2 Mal) und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 3-(4-tert.-Butoxyphenyl)-2-{[7-cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]amino}propionsäure-tert.-butylester zu ergeben, der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet wurde.
Eine Probe des rohen 3-(4-tert-Butoxyphenyl)-2-{[7-cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]amino)propionsäure-tert.-butylesters wurde mit 1 ml 95:5 Trifluoressigsäure (TFA):H₂O behandelt, und die resultierende Lösung wurde eine Stunde bei RT gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 2 ml 1:1 Acetonitril:Wasser gequencht, konzentriert und der Rückstand mit Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt, um (nach Lyophilisierung) 10 mg (45% Ausbeute über zwei Stufen) der gewünschten 2-{[7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]amino}-3-(4-hydroxyphenyl)propionsäure (505) als Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde, LC-MS berechnet für C₂₈H₂₇FN₄O₄ [M⁺+H]⁺: 503,2, gefunden: 503,2.
Es sei darauf hingewiesen, dass in den Fällen, in denen Methyl- oder Ethylester verwendet wurden, eine zweite Entschützungsstufe, eine typische durch wässriges LiOH vermittelte Verseifung, verwendet wurde, um die erforderliche Carbonsäure zu erzeugen.
Beispiel 26: Synthese von N-[7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]-C-phenylmethansulfonamid
Zu einer Lösung von 20 mg (0,059 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure in 2 ml Dichlormethane (DCM) wurden einige DMAP-Kristalle (Kat.), 12 mg (0,071 mmol) Toluolsulfonamid und anschließend 0,071 ml (0,071 mmol) 1 M Dicyclohexylcarbodiimid-(DCC)-Lösung in DCM gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt, konzentriert und der resultierende Rückstand mittels Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) gereinigt, um (nach Lyophilisierung) 15 mg (51% Ausbeute) N-[7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]-C-phenylmethansulfonamid als Feststoff (533) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₅FN₄O₃S [M⁺+H]⁺: 493,16, gefunden: 493,1.
Beispiel 27: Synthese von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-3-brom-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure
Eine Lösung von 0,718 g (1,97 mmol) 2-(4-Benzyloxyphenyl)-1-cyclohexyl-3-dimethylaminopropenon und 0,28 g (1,97 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester in 20 ml. Essigsäure (HOAc) wurde über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (5% Ethylacetat in Dichlormethan), um 0,643 g (74% Ausbeute) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure als beigen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde.
Zu einer eiskalten Lösung von 50 mg (0,113 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester in 2 ml Dichlormethane (DCM) wurde eine Lö sung von 21 mg (0,118 mmol) N-Bromsuccinimid (NBS) in 1 ml of DCM gegeben, und die resultierende Mischung wurde auf RT erwärmen gelassen und über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (5% Ethylacetat in Dichlormethan), um 7 mg (11% Ausbeute) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-3-brom-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester als farbloses Öl zu ergeben, wie durch ¹H-NMR (90% Reinheit) gezeigt wurde, LC-MS – berechnet für C₂₇H₂₆BrN₃O₃ [M⁺+H]⁺: 520,12, gefunden: 520,0.
Die Verseifung von 6-(4-Benzyloxyphenyl)-3-brom-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester zu der Carbonsäure (477) wurde unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Verfahrens durchgeführt.
Beispiel 28: Synthese von [6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]methanol
Eine Lösung von 4,37 g (12 mmol) 2-(4-Benzyloxyphenyl)-1-cyclohexyl-3-dimethylaminopropenon und 1,0 g (12 mmol) 1H-Pyrazol-3-ylamin in 40 ml Essigsäure (HOAc) wurde über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt und konzentriert, um einen festen beigen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (2% Ethylacetat in Dichlormethan), um 3,38 g (74% Ausbeute) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin als weißen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde.
Zu einer eiskalten Lösung von 300 mg (0,78 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin in 2 ml Dimethylformamid (DMF) und 1 ml Dichlormethan (DCM) wurden 0,085 ml (0,9 mmol) Phosphoroxychlorid (POCl₃) gegeben, und die resultierende Mischung wurde auf RT erwärmen gelassen und 4 Stunden bei RT gerührt, als Dünnschichtchromatographie-(DC)-Analyse die vollständige Umwandlung von Ausgangsmaterial zu Produkt zeigte. Die Reaktionsmischung wurde in Eiswasser gegossen und mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 335 mg 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbaldehyd (436) als beigen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₅N₃O₂ [M⁺+H]⁺: 412,19; gefunden: 412,1.
Zu einer gerührten Lösung von 4,4 mg (0,115 mmol) Natriumborhydrid (NaBH₄) in 2 ml Methanol (MeOH) wurde eine Lösung von 35 mg (0,104 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbaldehyd in 3 ml Tetrahydrofuran (THF) gegeben, und die resultierende Mischung wurde 30 Minuten bei RT gerührt, als DC-Analyse die vollständige Umwandlung von Ausgangsmaterial in Produkt zeigte. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von gesättigter Ammoniumchloridlösung gequencht und mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um (nach Lyophilisierung) 20 mg (47% Ausbeute) [6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]methanol (479) als weißen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde (der geringe Spuren an Ausgangsmaterial enthielt); LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₇N₃O₂ [M⁺+H]⁺: 414,21, gefunden: 414,2.
Beispiel 29: Synthese von Cyclopropancarbonsäure[6-(4-benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]amid und Ethansulfonsäure[6-(4-benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]amid
Zu einer Mischung von 25 mg (0,109 mmol) Kupfer(II)nitratdihydrat (Cu(NO₃)₂·2,5H₂O) in 1,5 ml Essigsäure und 3 ml Essigsäureanhydrid wurden portionsweise bei 35°C (im Verlauf von 15 Minuten) 40 mg (0,104 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei 35°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt und mit 0,1 N Natriumhydroxidlösung, Wasser und Salzlösung gewaschen. Der organische Extrakt wurde über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 43 mg purpurvioletten Rückstand zu ergeben, der an Silikagel (Biotage; Dichlormethan) chromatographiert wurde, um 18 mg (41%) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexyl-3-nitropyrazolo[1,5-a]pyrimidin als schmutzigweißen Rückstand (90% Reinheit) zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₂₅H₂₄N₄O₃ [M⁺+H]⁺: 429,18, gefunden: 429,2.
Zu einer Lösung von 18 mg (0,042 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexyl-3-nitropyrazolo[1,5-a]pyrimidin in 3 ml Ethylacetat (EtOAc) wurden 40 mg (0,21 mmol) Zinn(II)chlorid (SnCl₂) gegeben, und die resultierende Mischung wurde 8 Stunden unter Argon bei 80°C gerührt, als die DC-Analyse nur eine 75% Umwandlung von Ausgangsmaterial zu Produkt zeigte. Daher wurden 40 mg (0,21 mmol) Zinn(II)chlorid (SnCl₂) zugegeben und die Reaktionsmischung wurde 8 Stunden auf 80°C erwärmt, als DC-Analyse vollständige Umwandlung von Ausgangsmaterial zu Produkt zeigte. Die Mischung wurde mit Ethylacetat verdünnt, mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, Wasser, Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um (nach Lyophilisierung) 6 mg (36% Ausbeute) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-ylamid als gelben Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₂₅H₂₆N₄O [M⁺+H]⁺: 399,21, gefunden: 399,2.
Zu einer Lösung von 30 mg (0,075 mmol) 6-(4-Benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-ylamin in 2 ml Acetonitril (CH₃CN) wurden 0,018 ml (0,225 mmol) Pyridin (pyr) gegeben, gefolgt von 16 mg (0,2 mmol) Cyclopropylcarbonylchlorid oder 19 mg (0,15 mmol) Ethansulfonylchlorid, und 1 mg Dimethylaminopyridin (DMAP), und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei 60°C gerührt. Da die Analyse mittels LC-MS Produktbildung zeigte, wurde die Reaktionsmischung konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der durch Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 17 mg (49% Ausbeute) Cyclopropancarbonsäure[6-(4-benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]amid (415) als gelben Feststoff oder 17 mg (46% Ausbeute) Ethansulfonsäure[6-(4-benzyloxyphenyl)-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl]-amid (421) als gelben Feststoff zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wurde – berechnet für C₂₉H₃₀N₄O₂ [M⁺+H]⁺: 467,24, gefunden: 467,2; berechnet für C₂₇H₃₀N₄O₃S [M⁺+H]⁺: 491,2; gefunden: 491,2.
Beispiel 30: Synthese von 2-{[7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]amino}-3-(4-hydroxyphenyl)propionsäure
Zu einer Lösung von 1,04 g (4 mmol) 2-Brom-1-cyclohexyl-3-dimethylaminopropenon und 0,676 g (4 mmol) 5-Amino-3-methyl-1H-pyrazol-4-carbonsäureethylester in 10 ml Ethanol wurden 0,65 ml Lösung von 30% Bromwasserstoff in Essigsäure gegeben, und die resultierende Mischung wurde eine Stunde auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde auf RT abgekühlt und konzentriert, um einen braunen Rückstand zu ergeben, der mit 30% Ethylacetat in Hexan schallbehandelt wurde, um einen Niederschlag zu ergeben, der filtriert und dann zwei Mal mit Ethylacetat gewaschen wurde. Die kombinierten organischen Extrakte wurden eingedampft, um 1,32 g eines orangen Feststoffs zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (Gradienteneluierung mit Dichlormethan, gefolgt von 2% bis 10% Ethylacetat in Dichlormethan), um 0,756 g (52%) 6-Brom-7-cyclohexyl-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester als gelben Feststoff zu ergeben, wie mittels ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₁₆H₂₀BrN₃O₂ [M⁺+H]⁺: 366,07, gefunden: 366,1.
Eine Mischung von 187 mg (0,5 mmol) 6-Brom-7-cyclohexyl-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester, 105 mg (0,75 mmol, 1,5 Äquiv.) 4-Fluorphenylboronsäure, 20 mg (0,025 mmol, 5 Mol.-%) Pd-Katalysator und 318 mg (1,5 mmol, 3 Äquiv.) Kaliumphosphat wurde in ein Karussellröhrchen gegeben. Nach einem Vakuum-und-Argon-Zyklus wurde 1,4-Dioxan (7 ml) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde 14 Stunden unter Argon auf 80°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt, durch ein kleines Celitekissen filtriert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen braunen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (Biotage; Gradienteneluierung 2%, 5% bis 10% Ethylacetat in Dichlormethan), um 0,178 g (94% Ausbeute) des gewünschten 7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylesters als schmutzigweißen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS – berechnet für C₂₂H₂₉FN₃O₂ [M⁺+H]⁺: 382,19, gefunden: 382,1.
Zu einer Lösung von 178 mg (0,46 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäureethylester in 9 ml Tetrahydrofuran wurden 2,8 ml (2,8 mmol) 1 M LiOH-Lösung gegeben, und die resultierende Mischung wurde 15 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Da die DC-Analyse zeigte, dass noch Ausgangsmaterial vorhanden war, wurden 2,8 ml (2,8 mmol) 1 M LiOH-Lösung zugegeben, und der Rückfluss wurde 60 Stunden fortgesetzt. Die Reaktionsmischung wurde danach auf RT abgekühlt, konzentriert, mit Wasser verdünnt, mit 10% HCl-Lösung auf pH 2 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 156 mg (96% Ausbeute, 90% Reinheit) 7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure (515) als beigen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₂₀H₂₀FN₃O₂ [M⁺+H]⁺: 354,15, gefunden: 354,2.
Eine Lösung von 36 mg (0,1 mmol) 7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonsäure in 2 ml Dimethylformamid wurde auf 0°C gekühlt. Der obigen kalten Lösung wurden 0,053 ml (0,3 mmol) N,N-Diisopropylethylamin (DIEA), anschließend 38 mg (0,1 mmol) HATU und 37 mg (0,11 mmol) 2-Amino-3-(4-tert.-butoxyphenyl)propionsäure-tert.-butylester und wenige Kristalle 4-Dimethylaminopyridin (DMAP) zugefügt, und die resultierende Mischung wurde auf RT erwärmen gelassen und über Nacht bei RT gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat verdünnt, mit 0,1 N NaOH-Lösung, Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen Rückstand zu ergeben, der mit 2 ml 95:5 Trifluoressigsäure (TFA):Wasser behandelt und 2,5 Stunden bei RT gerührt wurde. Die Mischung wurde durch Zugabe von 10 ml 1:1 Acetonitril:Wasser-Lösung gequencht und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der durch Reverse-Phase-Chromatographie mittels Gilson gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 8 mg (über 2 Stufen) 2-{[7-Cyclohexyl-6-(4-fluorphenyl)-2-methylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonyl]-amino}-3-(4-hydroxyphenyl)propionsäure als weißen Feststoff zu ergeben (92% Reinheit, Eintrag 517), wie durch ¹H-NMR gezeigt wird. (LC-MS berechnet für C₂₉H₂₉FN₄O₄ [M⁺+H]⁺ 517,22, gefunden 517,2.
Beispiel 31: Synthese von 4'-Chlor-2-{4-(7-cyclohexyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-6-yl]phenoxymethyl)biphenyl-4-carbonsäure
Eine Mischung von 250 mg (1,09 mmol) 4-Brom-3-methylbenzoesäuremethylester, 204 mg (1,31 mmol) 4-Chlorphenylboronsäure, 1,06 g (3,27 mmol) Cäsiumcarbonat (Cs₂CO₃) und PdCl₂(dppf)-Katalysator (5 Mol.-%) wurde mit Argon gespült. Dieser Mischung wurden 3 ml 1,4-Dioxan zugegeben, und die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf 80°C erwärmt. Dann wurde die Mischung auf RT abgekühlt und durch ein Celitekissen filtriert, während das Kissen mit Ethylacetat gespült wurde. Das Filtrat wurde mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel (5% Ethylacetat in Hexan) chromatographiert wurde, um 191 mg (67%) des gewünschten 4'-Chlor-2-methylbiphenyl-4-carbonsäuremethylesters als Öl zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS berechnet für C₁₅H₁₃ClO₂ [M⁺+H]⁺: 261,07, gefunden: 261,1.
Zu einer Lösung von 191 mg (0,73 mmol) 4'-Chlor-2-methylbiphenyl-4-carbonsäuremethylester in 4 ml Kohlenstoffte trachlorid (CCl₄) wurden 9,7 mg (0,04 mmol) Benzoylperoxid gegeben, gefolgt von 124 mg (0,696 mmol) N-Bromsuccinimid (NBS), und die Reaktionsmischung wurde 6 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Die Mischung wurde auf RT abgekühlt, mit Dichlormethan verdünnt und mit Wasser und Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 132 mg (53%) 2-Brommethyl-4'-chlorbiphenyl-4-carbonsäuremethylester als Öl zu ergeben, welches ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe verwendet wurde. ¹H-NMR δ CDCl₃ 8,10 (s, 1H), 7,91-7,89 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 7,37-7,35 (d, J = 8,3 Hz, 2H), 7,30-7,18 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,22-7,20 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,30 (s, 2H), 3,87 (s, 3H).
Die Alkylierung von 7-Cyclohexyl-6-(4-hydroxyphenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-carbonitril mit 2-Brommethyl-4'-chlorbiphenyl-4-carbonsäuremethylester wurde in Dimethylformamid (DMF) unter Verwendung von Cäsiumcarbonat nach einem zuvor beschriebenen experimentellen Verfahren durchgeführt, um 4'-Chlor-2-[4-(3-cyano-7-cyclohexylpyrazolo[1,5-a]pyrimidin-6-yl)phenoxymethyl]biphenyl-4-carbonsäuremethylester zu ergeben. Diese Verbindung wurde nach einem zuvor beschriebenen Verfahren in ihr entsprechendes Tetrazol 4'-Chlor-2-{4-[7-cyclohexyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-6-yl]-phenoxymethyl}biphenyl-4-carbonsäuremethylester (475) überführt. Schließlich wurde nach einem Standard-Verseifungsprotokoll mit LiOH 4'-Chlor-2-{4-[7-cyclohexyl-3-(1H-tetrazol-5-yl)-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-6-yl]phenoxymethyl}biphenyl-4-carbonsäure (490) erhalten.
Beispiel 32: Synthese von 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydxopyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure
Zu einer Mischung von 5,0 g (21,9 mmol) 4-Benzyloxybenzoesäure in 25 ml Dichlormethan (DCM) wurden tropfenweise 10 ml (114 mmol) Oxalylchlorid gegeben, gefolgt von 5 μl Dimethylformamid (DMF Kat.), und die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden auf Rückfluss erwärmt und konzentriert, um 5,32 g (98%) des gewünschten 4-Benzyloxybenzoylchlorids als gelben Feststoff zu ergeben, wie mittels ¹H-NMR gezeigt wurde. Das Produkt wurde in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.
Eine Lösung von 0,35 ml (2,5 mmol) Diisopropylamin (iPr₂NH) in 7 ml Tetrahydrofuran (THF) wurde mit Argon gespült und auf –78°C abgekühlt. Dieser Lösung wurde tropfenweise 1 ml (2,5 mmol) n-Butyllithium (nBuLi) (2,5 M Lösung in Hexan) zugegeben, und die resultierende Mischung wurde 20 Minuten bei –78°C gerührt, nach dieser Zeit wurden tropfenweise 0,33 ml (2 mmol) Methylcyclohexylacetat zugegeben. Die Mischung wurde 40 Minuten auf RT erwärmen gelassen, danach wurde sie wieder auf –78°C abgekühlt, und tropfenweise wurde eine Lösung von 0,592 g (2,4 mmol) 4-Benzyloxybenzoylchlorid in 8 ml THF zugegeben, die resultierende Mischung auf RT erwärmen und über Nacht un ter Argon bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch Zugabe von gesättigter Ammoniumchloridlösung auf Eis gequencht und mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser, Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um 0,83 g eines gelben festen Rückstands zu ergeben, der an Silikagel (Biotage; 25% Hexan in Dichlormethan) chromatographiert wurde, um 0,306 g (42% Ausbeute) des gewünschten 3-(4-Benzyloxyphenyl)-2-cyclohexyl-3-oxopropionsäuremethylesters als weißen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₂₃H₂₆O₄ [M⁺+H]⁺: 367,18, gefunden: 367,2.
Eine Mischung von 274 mg (0,747 mmol) 3-(4-Benzyloxyphenyl)-2-cyclohexy1-3-oxo-propionsäuremethylester, 106 mg (0,747 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester, 15 mg (10 Mol-%) p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (PTSA) und 10 ml Toluol wurde 88 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann zu einem Rückstand konzentriert, der an Silikagel chromatographiert wurde (Biotage; Gradienteneluierung 2% bis 20% Ethylacetat in Dichlormethan), um 55 mg (16% Ausbeute) des gewünschten 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester als Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde, LC-MS – berechnet für C₂₇H₂₇N₃O₄ [M⁺+H]⁺: 458,2, gefunden: 458,2.
Dieses Material wurde dann nach dem wohl bekannten Verseifungsprotokoll mit LiOH in 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure überführt (55% Ausbeute, Eintrag 538); LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₅N₃O₄ [M⁺+H]⁺: 444,18, gefunden: 444,2.
Beispiel 33: Synthese von 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-2-(1H-tetrazol-5-yl)-4H-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-on
Eine Lösung von 1,0 g (7 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester in 10 ml Methanol (MeOH) wurde in einem versiegelten Röhrchen mit Ammoniak (NH₃) gesättigt, und die Mischung in dem versiegelten Röhrchen wurde über Nacht bei RT gerührt. Da die Analyse durch Dünnschichtchromatographie (DC) zeigte, dass die Reaktion nicht abgeschlossen war, wurde die Mischung dann einen Tag auf 80° erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung abgekühlt, das versiegelte Röhrchen geöffnet und das Lösungsmittel verdampft, um 0,9 g des gewünschten 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäureamids zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₄H₆N₄O [M⁺+H]⁺: 127,05, gefunden: 127,2.
Die Herstellung von 3-(4-Benzyloxyphenyl)-2-cyclohexyl-3-oxopropionsäuremethylester ist an anderer Stelle in diesem Dokument beschrieben.
Eine Mischung von 1,0 g (2,7 mmol) 3-(4-Benzyloxyphenyl)-2-cyclohexyl-3-oxopropionsäuremethylester, 340 mg (2,7 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäureamid, 51 mg (10 Mol-%) p-To luolsulfonsäuremonohydrat (PTSA) und 15 ml Toluol wurde 72 Stunden auf Rückfluss erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann zu einem Rückstand konzentriert, der an Silikagel (Biotage; Gradienteluierung 15% Ethylacetat in Dichlormethan bis 6% Methanol in Dichlormethane) chromatographiert wurde, um einen Rückstand zu ergeben, der durch Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) weiter gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 22 mg (2% Ausbeute) des gewünschten 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäureamids zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wird; LC-MS berechnet für C₂₆H₂₆N₄O₃ [M⁺+H]⁺: 443,2, gefunden: 443,2.
Zu einer Mischung von 22 mg (0,05 mmol) 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäureamid in 1 ml Dichlormethan (DCM) wurden 0,04 ml (0,3 mmol) Triethylamin (Et₃N) gegeben, und die resultierende Mischung wurde in einem Eisbad gekühlt. Danach wurden 0,021 ml (0,15 mmol) Trifluoressigsäureanhydrid ((CF₃CO)₂O) zugegeben, wobei die Mischung währenddessen homogen wurde, und 2,5 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch die Zugabe von Wasser gequencht und zu einem Rückstand konzentriert, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 3 mg (14% Ausbeute) des gewünschten 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonitrils zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wurde, berechnet für C₂₆H₂₉N₄O₂ [M⁺+H]⁺: 425,19, gefunden: 425,2.
Dieses Material wurde danach nach einem zuvor beschriebenen experimentellen Verfahren (Natriumazid, Triethylaminhydrochlorid) in das entsprechende Tetrazol 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-2-(1H-tetrazol-5-yl)-4H-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-7-on (551) überführt (54% Ausbeute); LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₅N₇O₂ [M⁺+H]⁺: 468,21, gefunden: 468,2.
Beispiel 34: Synthese von 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-methoxypyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure
Zu einer eiskalten Mischung von 22 mg (0,048 mmol) 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester in 3 ml Tetrahydrofuran (THF) wurden 0,008 ml (0,192 mmol) Methanol (MeOH), 50 mg (0,192 mmol) Triphenylphosphin (PPh₃) und anschließend 0,038 ml (0,192 mmol) Diisopropylazodicarboxylat (DIAD) gegeben, die Mischung wurde auf RT erwärmen gelassen und 2 Stunden bei RT gerührt, als Dünnschichtchromatographie-(DC)-Analyse den vollständigen Verbrauch des Ausgangsmaterials zeigte. Dann wurde die Reaktionsmischung konzentriert und der Rückstand an Silikagel (Biotage; Gradienteneluierung Dichlormethan (DCM) bis 10% Ethylacetat in DCM) chromatographiert, um 24 mg des gewünschten 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-methoxypyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylesters zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde (der Spuren von Verunreinigungen enthielt).
Es sei darauf hingewiesen, dass 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-methoxypyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester auch unter Verwendung eines Alkylierungsverfahrens (Dimethylsulfat mit Acetonitril als Lösungsmittel) erhalten wurde.
Die Umwandlung von 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-methoxypyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester in die entsprechende Säure 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-methoxypyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (329) wurde nach dem wohl bekannten Verseifungsprotokoll mit LiOH bewirkt; LC-MS – berechnet für C₂₇H₂₇N₃O₄ [M⁺+H]⁺: 458,2, gefunden: 458,2.
Beispiel 35: Synthese von 2-{[5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl]amino}-3-hydroxypropionsäure
Zu einer Lösung von 71 mg (0,16 mmol) 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure in 4 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 0,053 ml (0,48 mmol) 4-Methylmorpholin, 14 mg (0,164 mmol) 5-Aminotetrazol gegeben, gefolgt von 100 mg (0,192 mmol) PYBOP, woraufhin die Lösung gelb wurde, und die resultierende Mischung wurde 41 Stunden bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um 29 mg (35% Ausbeute) des gewünschten 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure(1H-tetrazol-5-yl)-amids (540) als Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS berechnet für C₂₇H₂₆N₈O₃ [M⁺+H]⁺: 511,21, gefunden: 511,1.
Zu einer Lösung von 67 mg (0,15 mmol) 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydro-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure in 3 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 0,13 ml (0,75 mmol) Diisopropylethylamin (DIEA), wenige Kristalle Dimethylaminopyridin (DMAP Kat.), 50 mg (0,195 mmol) 2-Amino-3-tert.-butoxypropionsäure-tert.-butylesterhydrochlorid gegeben, gefolgt von 74 mg (0,195 mmol) HATU, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat verdünnt, mit 0,1 N Natriumhydroxidlösung (2 Mal) und Salzlösung gewaschen. Die abgetrennte organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mit 3 ml 95:5 Trifluoressigsäure (TFA):Wasser behandelt, 2 Stunden bei RT gerührt und durch Zugabe von 1:1 Acetonitril:Wasser gequencht wurde. Die resultierende Mischung wurde konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 14 mg (17%) der gewünschten 2-{[5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl]amino}-3-hydroxypropionsäure (544) als weißen Feststoff zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS berechnet für C₂₉H₃₀N₄O₆ [M⁺+H]⁺: 531,22, gefunden: 531,2.
Beispiel 36: Synthese von 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-(2-cyclohexylethyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure und 6-(2-Cyclohexylethyl)-5-furan-3-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure
Zu einer unter Rückfluss befindlichen Mischung aus 7,0 g (175 mmol) Natriumhydrid (NaH, 60% Dispersion in Mineralöl) und 10,45 g (88,5 mmol) Diethylcarbonat (CO(OEt)₂) in 100 ml Toluol wurde tropfenweise über einen Zugabetrichter eine Mischung aus 10 g (44,3 mmol) 1-(4-Benzyloxyphenyl)ethanon in 20 ml Toluol gegeben, und die resultierende Mischung wurde eine Stunde unter Argon auf Rückfluss erhitzt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf 0°C abgekühlt, durch Zugabe von 40 ml Essigsäure gequencht, wobei sich währenddessen ein gelber Niederschlag bildete und sich bei nachfolgender Zugabe von Wasser auflöste. Die abgetrennte organische Phase wurde mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der an Silikagel chromatographiert wurde (10% Hexan in Dichlormethan), um 9,2 g (70% Ausbeute) des gewünschten 3-(4-Benzyloxyphenyl)-3-oxopropionsäureethylester zu ergeben, wie mittels ¹H-NMR gezeigt wurde.
Zu einer Lösung von 2 g (6,7 mmol) 3-(4-Benzyloxyphenyl)-3-oxopropionsäureethylester in 12 ml Ethanol (wobei zur vollständigen Auflösung gelinde erwärmt wurde) wurden tropfenweise 7 ml Kalium-t-butoxid (KOtBu, 1 M Lösung in t-Butanol) gegeben, wobei sich währenddessen ein Niederschlag bildete. Die Reaktionsmischung wurde 20 Min bei RT gerührt, danach wurde Diethylether zugegeben und der Niederschlag durch Filtration aufgefangen, mit Ether gewaschen und getrocknet, um 2,2 g (98% Ausbeute) des gewünschten (3-(4-Benzyloxyphenyl)-3-oxopropionsäureethylester-Kaliumsatzes zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde.
Eine Mischung aus 100 mg (0,3 mmol) 3-(4-Benzyloxyphenyl)-3-oxopropionsäureethylester-Kaliumsatz, 86 mg (0,45 mmol) 2-Cyclohexylethylbromid und 17 mg (0,1 mmol) Kaliumiodid (KI) in 1 ml Dimethylformamid (DMF) wurden in einer 4 ml Ampulle über Nacht bei 80°C in einem Sandbad geschüttelt. Dann wurde die Mischung konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) gereinigt wurde, um (nach Lyophilisierung) 85 mg (70% Ausbeute) 2-(4-Benzyloxybenzoyl)-4-cyclohexyl-buttersäureethylester als Feststoff zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wurde – berechnet für C₂₆H₃₂O₂ [M⁺+H]⁺: 409,23, gefunden: 409,2.
Eine Mischung aus 71 mg (0,171 mmol) 2-(4-Benzyloxybenzoyl)-4-cyclohexylbuttersäureethylester, 24 mg (0,171 mmol) 5-Amino-1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester, 7 mg (20 Mol.-%) p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (PTSA) und 3 ml Chlorbenzol wurde über Nacht auf 120°C erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung zu einem Rückstand konzentriert, der durch Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) gereinigt wurde, um (nach der Lyophilisierung) den gewünschten 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-(2-cyclohexylethyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester als Feststoff zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wurde – berechnet für C₂₉H₃₁N₃O₄ [M⁺+H]⁺: 486,23, gefunden: 486,2. Dieses Material wurde dann nach dem wohl bekannten Verseifungsprotokoll mit LiOH (10% Ausbeute über 2 Stufen) in 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-(2-cyclohexylethyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (559) überführt; LC-MS – berechnet für C₂₈H₂₉N₃O₄ [M⁺+H]⁺: 472,22, gefunden: 472,2.
Es sei darauf hingewiesen, dass die gleiche Synthesesequenz ausgehend von dem im Handel erhältlichen 3-Furan-3-yl-3-oxopropionsäureethylester wie oben abgebildet durchgeführt wurde, um 6-(2-cyclohexylethyl)-5-furan-3-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (612) zu ergeben.
Beispiel 37: Synthese von 4-(3-trifluormethylphenoxy)benzoesäure
Gemäß einer Modifikation eines Literaturverfahrens aus (J. Org. Chem. 2002, 67, 1699–1702) wurde eine wassergrüne Mischung aus 2,74 g (18 mmol) 4-Hydroxybenzoesäuremethylester, 4,9 g (27 mmol) Kupfer(II)acetat (Cu(OAc)₂), 6,84 g (36 mmol) 3-Trifluormethylphenoxyboronsäure, 2,92 ml (36 mmol) Pyridin (pyr) und 120 ml DCM 68 Stunden bei RT gerührt, während sie sich offen an der Luft befand. Die Reaktionsmischung wurde durch Celite filtriert, wobei das Celitekissen mit Ethylacetat und Chloroform gespült wurde. Die kombinierten organischen Filtrate wurde zu einem grünen festen Rückstand konzentriert, der zwischen Ethylacetat und Wasser partitioniert und mit Ethylacetat extrahiert wurde. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser (3 Mal) und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um 4,6 g eines braunen Rückstands zu ergeben, der an Silikagel (Biotage; 1:1 Hexan:DCM) chromatographiert wurde, um 3,56 (67% Ausbeute) des gewünschten 4-(3-Trifluormethylphenoxy)benzoesäuremethylester als blassgelbes Öl zu ergeben, wie durch ¹H-NMR und ¹⁹F-NMR gezeigt wurde; LC-MS – berechnet für C₁₅H₁₁F₃O₃ [M⁺+H]⁺: 297,07, gefunden: 297,1.
Eine Mischung von 3,56 g (12 mmol) 4-(3-Trifluormethylphenoxy)benzoesäuremethylester und 15 ml (60 mmol) 4 N Natriumhydroxid-(NaOH)-Lösung in 45 ml Tetrahydrofuran (THF) und 15 ml Methanol (MeOH) wurde 25 h auf 50°C erwärmt, während Dünnschichtchromatographieanalyse die vollständige Umwandlung des Ausgangsmaterials in Produkt zeigte. Die Reaktionsmischung wurde konzentriert und mit 2 N HCl Lösung angesäuert, während der Kolben in einem Eisbad gehalten wurde, als sich ein weißer Niederschlag bildete. Der Feststoff wurde filtriert und getrocknet, um 3,02 g (89%) der gewünschten 4-(3-Trifluormethylphenoxy)benzoesäure als weißen Feststoff zu erhalten, wie durch ¹H-NMR und ¹⁹F-NMR gezeigt wird.
Die Synthese von 6-Cyclohexyl-7-oxo-5-[4-(3-trifluormethylphenoxy)phenyl]-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (543) wurde wie in dem obigen Schema gezeigt ausgehend von 4-(3-Trifluormethylphenoxy)benzoesäure über Transfor mationen bewirkt, die für die Synthese von 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (538) beschrieben wurden. Für Eintrag 543: LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₂F₃N₃O₄ [M⁺+H]⁺: 498,16, gefunden: 498,1.
Beispiel 38: Synthese von 6-Cyclohexyl-7-oxo-5-[4-(3-trifluormethylbenzyloxy)phenyl]-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure
Einer Lösung von 2,28 g (15 mmol) 4-Hydroxybenzoesäuremethylester in 30 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 5,38 g (16,5 mmol) Cäsiumcarbonat (Cs₂CO₃) und anschließend 2,75 ml (18 mmol) 3-(Trifluormethyl)benzylbromid zugefügt, und die resultierende heterogene Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und konzentriert, mit Wasser verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert, und die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Wasser und Salzlösung gewaschen und konzentriert, um 4,75 g des gewünschten 4-(3-Trifluormethylbenzyloxy)benzoesäuremethylester zu ergeben, wie durch ¹H-NMR und ¹⁹F-NMR gezeigt wird (der Spuren von restlichem 3-(Trifluormethyl)benzylbromid enthält).
Dieses Produkt wurde ohne weitere Reinigung bei der Synthese von 6-Cyclohexyl-7-oxo-5-[4-(3-trifluormethylbenzyloxy)phenyl]-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (545) verwendet, die wie in dem obigen Schema gezeigt durch Standardtransformationen bewirkt wurde, die zuvor für die Synthese von 5-(4-Benzyloxyphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure beschrieben wurden.
Beispiel 39: Synthese von 6-Cyclohexyl-5-[4-(3,5-dimethylisoxazol-4-yl)-phenyl]-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure, 5-(4-Benzylphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure und 5-(4-(3-Trifluormethoxyphenyl)phenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure
Das Produkt der obigen Sequenz wurde nach dem gleichen experimentellen Verfahren synthetisiert, das zur Herstellung eines verwandten Intermediats verwendet wurde, wobei die 4-Bromphenylgruppe durch eine 2-Furylgruppe ersetzt wurde. Diese Arylbromidverbindung wurde als Syntheseintermediat verwendet, welches unter Verwendung von einer der folgenden repräsentativen Reaktionen transformiert wurde.
Eine Mischung von 42 mg (0,1 mmol) 5-(4-Bromphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester, 21 mg (0,15 mmol) 5,5-Dimethylisoxazolboronsäure, 7,3 mg (0,01 mmol) Pd-Katalysator und 63 mg (0,3 mmol) Kaliumphosphat in 1 ml 1,4-Dioxan wurde über Nacht in einem Sandbad bei 95°C geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Dichlormethan verdünnt, durch ein kleines Celitekissen filtriert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen Rückstand zu ergeben, der durch Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) gereinigt wurde, um das gewünschte 6-Cyclohexyl-5-[4-(3,5-dimethylisoxazol-4-yl)-phenyl]-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester als Feststoff zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wurde – berechnet für C₂₅H₂₆N₄O₄ [M⁺+H]⁺: 447,19; gefunden: 447,3. Dieses Material wurde dann nach dem wohl bekannten Verseifungsprotokoll mit LiOH (37% Ausbeute über 2 Stufen) in 6-Cyclohexyl-5-[4-(3,5-dimethylisoxazol-4-yl)phenyl]-7-oxo-4,7-dihydropyrazo lo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (591) überführt; LC-MS – berechnet für C₂₄H₂₄N₄O₄ [M⁺+H]⁺: 433,18, gefunden: 433,1.
Gemäß einer Modifikation eines Literaturverfahrens (A. Suzuki et al., Tetrahedron Lett. 1986, 27, 6369–6372) wurde eine Mischung von 43 mg (0,1 mmol) von 5-(4-Bromphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester, 7,3 mg (0,01 mmol) Pd-Katalyst, 0,4 ml (0,2 mmol) B-Benzyl-9-BBN (0,5 M Lösung in THF) und 63 mg (0,3 mmol) Kaliumphosphat mit Argon gespült, es wurde 1 ml 1,4-Dioxan zugefügt und die resultierende Mischung in einem Sandbad bei 80°C über Nacht geschüttelt. Die Reaktionsmischung wurde mit Dichlormethan verdünnt, durch ein kleines Celitekissen filtriert, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um einen Rückstand zu ergeben, der durch Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) gereinigt wurde, um den gewünschten 5-(4-Benzylphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester als Feststoff zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wird – berechnet für C₂₇H₂₇N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 442,21, gefunden: 442,2. Dieses Material wurde dann nach dem wohl bekannten Verseifungsprotokoll mit LiOH (33% Ausbeute über 2 Stufen) in 5-(4-Benzylphenyl)-6-cyclohexyl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (581) überführt; LC-MS – berechnet für C₂₆H₂₅N₃O₃ [M⁺+H]⁺: 428,19, gefunden: 428,2.
Beispiel 40: Synthese von 6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure und 6-Cyclohexyl-5-(3-fluorphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure
Zu einer eiskalten Suspension von 0,92 g (23 mmol) Natriumhydrid (NaH 60% Dispersion in Mineralöl) (zuvor mit Hexan gewaschen und unter Vakuum getrocknet) in 25 ml 1,2-Dimethoxyethan (DME) wurden 0,9 g (5,76 mmol) Methylcyclohexylacetat gegeben, und die resultierende Mischung wurde 20 Minuten bei 0°C gerührt. Dann wurden 1,2 g (8,56 mmol) Ethyl-2-furoat zugefügt und die Reaktionsmischung über Nacht auf Rückfluss erwärmt. Die Mischung wurde danach auf 0°C abgekühlt, durch Zugabe von 1 M HCl-Lösung auf pH 3 gequencht und mit Ethylacetat extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um ein braunes Öl zu ergeben, das an Silikagel (Biotage; 10% Hexan in Dichlormethan) chromatographiert wurde, um 1,1 g (76% Ausbeute) des gewünschten 2-Cyclohexyl-3-furan-2-yl-3-oxopropionsäuremethylesters zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde.
Eine Mischung aus 1,1 g (4,4 mmol) 2-Cyclohexyl-3-furan-2-yl-3-oxopropionsäuremethylester, 0,592 g (4,2 mmol) 5-Amino- 1H-pyrazol-3-carbonsäuremethylester, 16 mg (0,4 mmol, 10 Mol.-%) p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (PTSA) und 50 ml Chlorbenzol wurde über Nacht auf 120°C erwärmt. Dann wurde die Reaktionsmischung zu einem Rückstand konzentriert, der an Silikagel (7% Methanol in Dichlormethan) chromatographiert wurde, um 0,46 g (32% Ausbeute) des gewünschten 6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester zu ergeben, wie durch ¹H-NMR gezeigt wurde; LC-MS berechnet für C₁₈H₁₉N₃O₄ [M⁺+H]⁺: 342,14, gefunden: 342,3.
Die Umwandlung von 6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäuremethylester zu 6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (595) wurde nach dem wohl bekannten LiOH-Verseifungsprotokoll bewirkt, wobei die Ausbeute 77% betrug. LC-MS berechnet für C₁₇H₁₇N₃O₄ [M⁺+H]⁺ 328,13, gefunden: 328,1. ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ 8,06-8,05 (d, J = 2 Hz, 1H), 6,99-6,98 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 6,80-6,78 (d von d, J = 3,6 Hz, J = 2 Hz, 1H), 6,39 (s, 1H), 2,79-2,71 (m, 1H), 2,25-2,16 (m, 2H), 1,77-1,75 (m, 2H), 1,66-1,65 (m, 1H), 1,59-1,55 (m, 2H), 1,25-1,20 (m, 3H).
Es sei darauf hingewiesen, dass das gleiche Syntheseschema für 3-Fluorbenzoesäuremethylester wie oben abgebildet durchgeführt wurde, um 6-Cyclohexyl-5-(3-fluorphenyl)-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure (598) zu ergeben, wobei die Cyclisierungsausbeute etwas verbessert war (54%).
Beispiel 41: Synthese von 2-[(6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonylamino]-3-(1H-indol-2-yl)-propionsäure
Zu einer Lösung von 8,2 mg (0,023 mmol) 6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure in 2 ml Dimethylformamid (DMF) wurden 0,009 ml (0,05 mmol) Diisopropylethylamin (DIEA), wenige Kristalle Dimethylaminopyridin (DMAP Kat.), 7 mg (0,027 mmol) L-Tryptophanmethylesterhydrochlorid, gefolgt von 11 mg (0,03 mmol) HATU gegeben, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann mit Ethylacetat verdünnt, mit 0,1 N Natriumhydroxidlösung (2 Mal) und Salzlösung gewaschen. Die abgetrennte organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und konzentriert, um einen Rückstand zu ergeben, der mittels Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) gereinigt wurde, um den gewünschten 2-[(6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl)amino]-3-(1H-indol-2-yl)propionsäuremethylester (606) zu ergeben. Diese Verbindung wurde dann nach dem wohl bekannten LiOH-Verseifungsprotokoll (39% Ausbeute über 2 Stufen) in 2-[(6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl)amino]-3-(1H-indol-2-yl)-propionsäure (599) überführt; LC-MS berechnet für C₂₈H₂₇N₅O₅ [M⁺+H]⁺: 514,2, gefunden: 514,2.
Es sei darauf hingewiesen, dass dieses Protokoll für die meisten der Amide in dieser Reihe verwendet wurden, in einigen Fällen wurde jedoch aus praktischen Gründen ein anderes Amidierungsprotokoll wie folgt verwendet: Zu einer Lösung der Säure in Tetrahydrofuran (THF) wurden 4 Äquivalent Amin (R-NH₂) gegeben, gefolgt von 2 Äquivalent 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) und 4 Äquiv. PS-Carbodiimidharz, und die resultierende Mischung wurde über Nacht bei RT gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit 4 Äquiv. MP-Carbonatharz und 4,8 Äquivalent PS-TsOH behandelt, und es wurde weitere 4 Stunden bei RT gerührt. Dann wurde die Mischung filtriert und mit THF gewaschen, und die kombinierten THF-Extrakte wurden konzentriert, um das rohe Kupplungsprodukt zu erhalten.
In der zweiten (Entschützungs-)Stufe wurde für jene Aminbausteine, die Methyl- oder Ethylester enthielten, eine typische mit wässrigem LiOH vermittelte Verseifung verwendet, und für jene Aminbausteine, die t-Butylester oder -ether enthielten, wurde ein typisches 95:5 TFA:Wasser-Entschützungsprotokoll durchgeführt.
Beispiel 42: Synthese von N-(6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl)-C-phenylmethansulfonamid
Zu einer Lösung von 20 mg (0,06 mmol) 6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonsäure in 2 ml Dichlormethan (DCM) wurden wenige Kristalle DMAP (Kat), 12 mg (0,071 mmol) Toluolsulfonamid, gefolgt von 0,071 ml (0,071 mmol) 1 M Dicyclohexylcarbodiimid-(DCC)-Lösung in DCM gegeben. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei RT gerührt, konzentriert und der resultierende Rückstand durch Reverse-Phase-Chromatographie (Gilson) gereinigt, um (nach Lyophilisierung) 5 mg (17% Ausbeute) des gewünschten N-(6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl)-C-phenylmethansulfonamids (616) als Feststoff zu ergeben, wie durch LC-MS gezeigt wurde, berechnet für C₂₄H₂₄N₄O₅S [M⁺+H]⁺: 481,15, gefunden: 481,1.
Es sei darauf hingewiesen, dass auch N-(6-Cyclohexyl-5-furan-2-yl-7-oxo-4,7-dihydropyrazolo[1,5-a]pyrimidin-2-carbonyl)-C,C,C-trifluormethansulfonamid (617) nach diesem Protokoll hergestellt wurde.
Beispiel 43: Assay für die Aktivität von HCV RNA-abhängiger RNA-Polymerase
Übersicht
HCV RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRp) wurde durch den Scintillation Proximity Assay (SPA) mit einem RNA-Homopolymer (PolyC) bewertet, komplexiert mit einem biotinylierten OligoG₁₂-Primer. Der Primer kann ohne ein Denaturierungs- und Annealing-Verfahren direkt zu dem Templat gegeben werden. Der Assay misst speziell den Einbau von [³H]-markiertem GTP in PolyG. Das biotinylierte G₁₂ ermöglicht das Einfangen der [³H]-markierten Produkte mit Streptavidin-beschichteten SPA-Perlen.
Das in diesem Assay verwendete HCV NS5B RdRp wurde durch Entfernung des 55-Aminosäureanteils von dem C-Terminus modifiziert, der eine hydrophobe Domäne von 21 Aminosäuren enthielt. Das HCV NS5B RdRp-Protein wurde als in E. coli exprimiertes Polyhistidin-(His₆)Fusionsprotein gereinigt, und das His-Tag wurde dann durch spezifische Proteolyse entfernt.
Der Assay wurde 50 Minuten lang bei Raumtemperatur (etwa 22°C) in einer 96-Muldenplatte durchgeführt. Es war keine Vo rinkubation erforderlich. Die Reaktion wurde initiiert, indem das Enzym in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindungen zu dem RNA-Substrat gegeben wurde. Zur Beendigung der Reaktion wurden jeder Mulde 50 μm von 10 mg/ml Streptavidin-beschichteten SPA-Perlen, ergänzt mit 100 mM EDTA, zugegeben, und die Platte wurde inkubiert, indem sie 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Nach der Ernte und einer Wäsche durch Filtration wurde die Radioaktivität in jeder Mulde mit einem TopCount Szintillations/Lumineszenz-Zähler gezählt.
Die Assaybedingungen waren: 50 μl Reaktionsvolumen, inkubiert bei Raumtemperatur für 50 Minuten in 20 mM Hepes pH 7,3, 7,5 mM DTT, 20 Einheiten/ml RNasin, 0,5 μg/ml Oligo(G)₁₂, 5 μg/ml Poly(C), 0,5 μM GTP, 1 μl Ci/ml ³H-GTP, 10 mM MgCl₂, 60 mM NaCl, 100 μg/mL BSA, 6 nM NS5B CT55 Enzym.
MATERIALIEN
Puffer:

1X 1 Liter

Hepes (pH 7,3) 20 mM 20 ml 1 M

MgCl₂ 10 mM 10 ml 1 M

NaCl 60 mM 12 ml 5 M

BSA 100 μg/ml 100 mg

RNAse-freies H₂O auf 1 Liter
Es wurde steril filtriert. Der Puffer wurde bei 4°C gelagert.
RNA-Templat:
In 20 mM Hepes pH 7,3 wurde eine Vorratslösung von 5 mg/ml hergestellt. Zu 5 mg Polycytidylsäure [Sigma, Nr. P4903] wurde Puffer (4 ml) gegeben, und die Extinktion der Lösung bei OD₂₆₀ wurde geprüft und unter Verwendung der folgenden Umwandlung quantifiziert: OD₂₆₀ von 1 = 40 μg/ml. Die Lösung wurde danach in Puffer auf 5 mg/ml korrigiert, aliquotiert und bei –80°C gelagert.
RNA-Primer
In 20 mM Hepes pH 7,3 wurde eine Vorratslösung von 0,5 mg/ml Primer hergestellt. Die Extinktion der Lösung bei OD₂₆₀ wurde geprüft und unter Verwendung der folgenden Umwandlung quantifiziert: OD₂₆₀ von 1 = 32 μg/ml. Die Lösung wurde danach aliquotiert und bei –80°C gelagert.
GTP-Substrat:
In 20 mM Hepes pH 7,3 wurde eine Vorratslösung (2 mM) hergestellt, danach aliquotiert und bei –80°C gelagert.
NS5BΔCT55 RdRp:
HCV NS5BΔCT55 (aus 1b BK Stamm) wurde als in E. coli exprimiertes Polyhistidin-(His₆) Fusionsprotein gereinigt. Das Protein wurde modifiziert, indem ein 55 Aminosäureabschnitt von dem C-Terminus entfernt wurde, der eine hydrophobe Domäne von 21 Aminosäuren enthielt, und ein His₆-Tag wurde am C-Terminus an das Protein fusioniert. Das His-Tag wurde nach der Reinigung durch spezifische Proteolyse entfernt. Das Molekulargewicht des Proteins betrug 60323. Das Enzym wurde als Arbeitsmaterial 1:10 von 53 μM bis herunter auf 5,4 μM verdünnt, danach aliquotiert und bei –80°C gelagert. Für jede Reaktion waren 6 nM des Enzyms erforderlich.
Enzymlagerungspuffer:
25 mM Hepes (pH 7,5), 5 mM DTT, 0,6 M NaCl, 15% Glycerin, 0,1% Ocrylglucosid, 2 mg/L Leupeptin, 100 μM PMSF.
Der Puffer wurde bei –20°C gelagert.
Zinkacetat-Kontrollinhibitor:
Es wurden 50× Vorratslösungen von Zinkacetat in 16, 8, 4 und 2 mM in 100% DMSO hergestellt. Die Vorratsmaterialien wurden bei 4°C gelagert.
Waschpuffer für die Filterplatten:

200 ml 20 × SSC-Puffer und 80 ml 1 M Hepes pH 7,3 wurde in milli-Q^R Wasser auf 4 Liter gebracht. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gelagert. INSTRUMENTE UND ANBIETER

TopCount.NXT Microplattenablesegerät	[Packard, A991200]
Mach 3U Ernter 96	[TomTec, 96-3]
Mictotest U-Boden-Gewebekulturplatte	[Falcon, 353077]
Unifilter-96, GF/B weiße Mikroplatte	[Packard, 6005177]
Nunc Polypropylen-Mikroplatte	[Nunc, 442587]
TopSeal-A:96-Mulden-Mikroplattensiegelfolie	[Packard, 6005185]
Mini-Orbital-Schüttelgerät	[Bellco, 7744-08096]

CHEMIKALIEN

RNA homopolymer/Poly(C)	[Sigma, Nr: P4903]
Biotin-Oligo(G)₁₂	[Oligo, Etc., EO-1/22/98]
unmarkiertes GTP	[Novagen, 69176-1]
[³H]-markiertes GTP	[Amersham, TRK314]
1 M Hepes (pH 7,3)	[USB, 16924]
0,5 M EDTA (pH 8,0)	[GibcoBRL, 15575-012]
DTT [Dithiothreitol]	[GibcoBRL, 15508-013]
MgCl₂	[Sigma, M1028]
BSA (Fraktion V)	[Boehringer Mannheim, 100350]
RNaseIN	[Promega, N2515]
Leupeptin	[Sigma, L9783]
n-Octylglucosid	[Boehringer Mannheim, 1359088]
PMSF	[Sigma, 7626]
5 M NaCl	[GibcoBRL, 24740-011]
Glycerin	[GibcoBRL, 15514-011]
Streptavidin-beschichtete SPA-Perlen	[Amersham, RPNQ0007]
PBS (mit/ohne Mg⁺⁺ und Ca⁺⁺)	[GibcoBRL, 14190-144]
DMSO	[Sigma, D5879]
ZnOAc	[Sigma, 20625]
Rnase-freies Wasser	[USB, US70783]
20 × SSC Puffer	[GibcoBRL, 15557-044]

ASSAY-VERFAHREN
Verdünnung der Testverbindungen
Vorratslösungen wurden in einer Konzentration von 1 mg/ml in 100% DMSO hergestellt. Die Verbindungen wurden seriell in einer 96-Mulden-Mikroplatte aus Polypropylen [Nunc] mit einem Mehrkanal-Pipettiergerät wie folgt verdünnt:

(1) den Reihen B, E und H wurden 15 μl DMSO zugefügt, den Reihen C, D, F und G wurden 20 μl DMSO zugefügt. 12 Verbindungen wurden unverdünnt über Reihe A zugegeben, und danach wurden 5 μl von jeder Verbindung aus Reihe A in Reihe B transferiert, wobei zum Mischen 10 bis 12 Mal trituriert wurde. Dann wurden von Reihe B weitere 5 μl auf Reihe C und so weiter bis zu Reihe H transferiert, was 7 serielle Verdünnungen des Vorratsmaterials ergab.
(2) 1 μl jeder Verdünnung (50×) wurden wie nachfolgend beschrieben auf Assay-Platten transferiert, was Endkonzentrationen von 20, 5, 1, 0,2, 0,05, 0,01, 0,002 und 0,0005 μg/ml ergab.

Assay-Aufbau: 1 Platte
Enzym/RNA-Mischung (700 μl insgesamt, 5 μl/Reaktion)

660 μl 1× Puffer
7 μl 5 mg/ml Templat PolyC
7 μl 0,5 mg/ml Primer OligorG₁₂
3,5 μl 40 Einheiten/μl RNAsin
10 μl 1 M DTT
8 μl 5,3 μM Enzym (10× für 6 nM Endkonzentration)

Nukleotid-Mischung (insgesamt 2 ml, 20 μl/Reaktion):

2.0 ml 1× Buffer
30 μl 1 MDTT
5 μl 1 mCi/ml [³H]-GTP
1,3 μl 2 mM kaltes GTP

Reaktionsmischung:

24 μl 1× Puffer
20 μl Nukleotidmischung
1 μl Verbindung
5 μl Enzym

PROTOKOLL

(1) In jede Mulde einer 96-Muldenplatte (Microtest U-Boden-Gewebekulturplatte von Falcon) wurden 24 μl 1× Puffer gegeben.
(2) In der Zugabereihenfolge wurden 1× Puffer, DTT, unmarkiertes GTP und ³H-GTP gemischt. In jede Mulde wurden 20 μl dieser Nukleotidmischung in 1× Puffer gegeben.
(3) In Dreierreihen wurden 1 μl jeder Testverbindungsverdünnung in jede Mulde gegeben, außer bei den Kontrollmulden mit Enzym/RNA und RNA allein. Die Kontrollmulden erhielten 1 μl 100% DMSO.
(4) 1 μl von jeder Vorratslösung des Zinkacetat-Kontrollinhibitors wurde in Zweierreihen in die Mulden gegeben. Die verwendeten 50× Zinkacetat-Vorratslösungen waren 16, 8, 4 und 2 mM für Endkonzentrationen von 320, 160, 80 und 40 μM.
(5) 1× Puffer, DTT, RNasin, Biotin-Oligo(G)₁₂ und PolyC wurden in der Zugabereihenfolge gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Enzym wurde zugefügt, gemischt, und 5 μl der Enzym/RNA/Puffer-Mischung wurde in jede Mulde gegeben, außer bei den Kontrollmulden mit RNA allein. In die Kontrollmulden mit RNA allein wurden 5 μl RNA/1× Puffermischung gegeben.
(6) Die Platte wurde 1 Minute auf einem Mini-Orbital-Schüttelgerät (Bellco) geschüttelt, um die Reaktionskomponenten gründlich zu mischen. Die Platte wurde 50 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 22°C) inkubiert.
(7) Die Reaktion wurde gestoppt, indem 50 μl Streptavidin-SPA-Perlen (10 mg/ml in PBS mit/ohne Mg⁺⁺ und Ca⁺ ⁺-Zusatz mit 100 mM EDTA) in jede Mulde gegeben wurden. Dann wurde die Platte wieder wie in (5) 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt, um die Perlen zu mischen.
(8) Dann wurde die Platte unter Verwendung eines Ernters (Tomtec) geerntet und durch Überführen auf eine Filterplatte (Unifilter-96 GF/B weiße Mikroplatte von Packard) mit Filterplatten-Waschpuffer gewaschen Die Platte wurde 30 Minuten bei 37°C trocknen gelassen. Das Kleberückseiten-Tape (hergestellt vom Hersteller) wurde nach dem Trocknen auf den Boden der Unifilterplatte geklebt. Die Oberseite wurde mit TopSeal Mikroplattensiegelfolie bedeckt.
(9) Die Radioaktivität in jeder Mulde wurde mit einem Top-Count Szintillations/Lumineszenz-Zähler gezählt.

Repräsentative Daten für die erfindungsgemäßen HCV RdRp-Inhibitoren sind in Tabelle 1 gezeigt.
Beispiel 43: High-Throughput-Assay für HCV NS5B RNA-abhängige RNA-Polymerase
Der Scintillation Proximity Assay (SPA) für HCV NS5B RdRp, den wir entwickelt haben, verwendet ein RNA-Homopolymer (PolyC), komplexiert mit einem biotinylierten OligoG₁₂-Primer. Der Primer kann ohne ein Denaturierungs- und Annealing-Verfahren direkt zu dem Templat gegeben werden. Der Assay misst speziell den Einbau von [³H]-markiertem GMP in PolyG. Das biotinylierte G₁₂ ermöglicht das Einfangen der [³H]-markierten Produkte mit Streptavidin-beschichteten SPA-Perlen.
Die NS5B-Enzyme, NS5BCT21-His und NS5BCT55, die in diesem Assay verwendet wurden, wurden als in E. coli exprimierte Polyhistidin-(His₆)Fusionsproteine gereinigt. Das NS5BCT21-His-Protein war durch Entfernen einer hydrophoben Domäne aus 21 Aminosäuren von dem C-Terminus modifiziert worden. Ein His₆-Tag wurde am C-Terminus an das Protein fusioniert, wobei die deletierte hydrophobe Domäne ersetzt wurde. Das NS5BCT55-Protein wurde modifiziert, indem ein 55 Aminosäureabschnitt von dem C-Terminus entfernt wurde, der eine hydrophobe Domäne von 21 Aminosäuren enthielt, und ein His₆-Tag wurde am C-Terminus an das Protein fusioniert. Das His-Tag wurde nach der Reinigung durch spezifische Proteolyse entfernt.
Das Substrat dieses Assays ist ein RNA-Homopolymertemplat (PolyC), komplexiert mit einem biotinylierten Primer (OligoG₁₂). [³H]-GTPs werden in PolyG polymerisiert, wodurch das PolyC-Templat komplementiert wurde.
Der Assay wurde drei Stunden lang bei Raumtemperatur (etwa 22°C) in einer 96-Muldenplatte durchgeführt. Es war keine Vorinkubation erforderlich. Die Reaktion wurde initiiert, indem das RNA-Substrat und das Enzym in Gegenwart oder Abwesenheit der Testverbindungen gemischt wurden. Es wurde EDTA auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Dann wurden Streptavidin-beschichtete SPA-Perlen (0,5 mg) in jede Mulde gegeben. Nach der Ernte und einer Wäsche durch Filtration wurde die Radioaktivität in jeder Mulde mit einem TopCount Szintillations/Lumineszenz-Zähler gezählt.
Die Assaybedingungen waren: 50 μl Reaktionsvolumen bei Raumtemperatur für drei Stunden in: 20 mM Hepes (pH 7,3), 7,5 mM DTT, 10 mM MgCl₂, 121 mM NaCl, 100 Mg/ml BSA, 2% DMSO, 0,05% Glycerin, 5 μM GTP, 1,0 μCi [³H]-GTP, 0,25 μg Poly(C)/0,025 μg Oligo(G)₁₂, 1 Einheit RNaseIN und 0,05 μM NS5BDCT21-His oder NS5BDCT55.
MATERIALIEN
Enzympuffer:

1× 1,25× 5× Vorratsmaterial

Hepes (pH 7,3) 20 mM 25 mM 100 mM

MgCl₂ 10 mM 12,5 mM 50 mM

NaCl 120 mM 150 mM 600 mM

Reaktionspuffer:

1× 1,25× 5× Vorratsmaterial

Hepes (pH 7,3) 20 mM 25 mM 100 mM

MgCl₂ 10 mM 12,5 mM 50 mM

BSA 100 μg/ml 125 μg/ml 500 μg/ml
Der Puffer wurde bei 4°C gelagert.
Substrate und Enzym wurden bei –80°C gelagert.
NS5BCT21-His Enzymlagerungspuffer:
50 mM Hepes (pH 7,3), 5 mM DTT, 0,5 M NaCl, 20% Glycerin, 200 ng/ml Antipain, 2 mg/L Leupeptin, 100 μM PMSF.
Der Puffer wurde bei –20°C gelagert.
NS5BCT55 Enzymlagerungspuffer:
25 mM Hepes (pH 7,5), 10 mM β-Merkaptoethanol, 0,6 M NaCl, 15% Glycerin, 0,1% Octylglucosid, 2 mg/L Leupeptin, 100 μM PMSF.
Der Puffer wurde bei –20°C gelagert.
ASSAY-VERFAHREN

(1) In jede Mulde einer 96-Muldenplatte (Microtest U-Boden-Gewebekulturplatte von Falcon) wurden 9 μl Rnase-freies Wasser gegeben.
(2) RNase-freies H₂O, 5× Reaktionspuffer (mit BSA), DTT, kaltes GTP und ³H-GTP wurden in Zugabereihenfolge gemischt. In jede Mulde wurden 20 μl dieser Nukleotidmischung in 1,25× Reaktionspuffer gegeben.
(3) RNase-freies H₂O, 5× Enzympuffer (mit NaCl), DTT, RnaseIN, Oligo(G)₁₂ und PolyC wurden in Zugabereihenfolge gemischt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Enzym wurde zugefügt, gemischt, und 20 μl der Enzym/RNA-Mischung in 1,25× Enzympuffer in jede Mulde gegeben, außer bei den Kontrollmulden mit RNA allein. In die Kontrollmulden mit RNA allein wurden 20 μl Enzymlagerungspuffer/RNA-Mischung in 1,25× Enzympuffer gegeben.
(4) 1 μl jeder Testverbindungsverdünnung [100% DMSO, 100 μg/ml] wurde in jede Mulde gegeben, außer bei den Kontrollmulden mit Enzym/RNA und RNA allein. Die Kontrollmulden erhielten 1 μl 100% DMSO.
(5) Die Platte wurde eine Minute lang gelinde auf einem Mino-Orbital-Schüttelgerät (Bellco) geschüttelt, um die Reaktionskomponenten gründlich zu mischen, und danach 3 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.
(6) Die Reaktion wurde gestoppt, indem 50 μl Streptavidin-SPA-Perlen (0,5 mg, erneut suspendiert in PBS mit/ohne Mg⁺⁺ und Ca⁺ ⁺-Zusatz mit 100 mM EDTA) in jede Mulde gegeben wurden. Die Platte wurde wiederum wie oben geschüttelt, um die Perlen zu mischen, und wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.
(7) Dann wurde die Platte geerntet, gewaschen und mit einem Ernter (Tomtex) auf eine Filterplatte transferiert. Die Radioaktivität in jeder Mulde wurde mit einem TopCount Szintillations/Lumineszenz-Zähler gezählt.

Tabelle 1 Inhibierung von HCV RdRp¹
Alle Stickstoffatome sind dreiwertig, wenn keine Bindung explizit angegeben ist, gehen wir von einer Bindung an Wasserstoff aus.
Obwohl die vorhergehende Erfindung zum Zweck der Erläuterung und des Verständnisses in einigen Details beschrieben worden ist, werden diese speziellen Ausführungsformen als veranschaulichend und nicht als einschränkend angesehen. Der Fachmann wird aus der Lektüre dieser Offenbarung erkennen, dass verschiedene Änderungen an Form und Details vorgenommen werden können, ohne den Schutzumfang der Erfindung und der angefügten Ansprüche zu verlassen.

Claims

Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

oder ein Stereoisomer davon oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer solchen Verbindung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens eine Verbindung nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon und einen pharmazeutisch annehmbaren(s) Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel enthält.
Verwendung von mindestens einer Verbindung nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren der Replikation des Hepatitis C Virus ("HCV") in einer Zelle.
Verwendung von mindestens einer Verbindung nach Anspruch 1 oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung von HCV-Infektion.
In-vitro-Verfahren zur Inhibierung der HCV-Replikation in einer Zelle, bei dem eine Zelle, die mit HCV infiziert ist, mit mindestens einer Verbindung gemäß Anspruch 1 oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon in Kontakt gebracht wird.