DE60225349T2

DE60225349T2 - Immunstimulierende und regulierende zusammensetzung mit bakteriellen chromosomalen dna-fragmenten und nichttoxischen lipopolysacchariden

Info

Publication number: DE60225349T2
Application number: DE60225349T
Authority: DE
Inventors: Bo Young Ahn; Yang Je Cho; Won Il Bundang Sungnam-si YOO; Sung Ho Lee; Hye Ran Park; Dong Hyun Goyang-si LEE; Na-Gyong Gwangjin-gu LEE; Doo Sik Kim
Original assignee: Eyegene Inc; Daewoong Co Ltd
Current assignee: Eyegene Inc; Daewoong Co Ltd
Priority date: 2002-05-22
Filing date: 2002-09-26
Publication date: 2009-03-12
Anticipated expiration: 2022-09-27
Also published as: AU2002335560A8; KR100456681B1; EP1507560A1; ATE387219T1; JP2006506399A; US20050163806A1; US8883987B2; DE60225349D1; EP1507560B1; KR20030090897A; AU2002335560A1; CN1627960A; EP1507560A4; ES2303568T3; WO2004039413A1; US20060166923A1; CN100344329C; US7507802B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine immunstimulierende und -regulierende Zusammensetzung, umfassend bakterielle chromosomale DNA-Fragmente und nicht toxische Lipopolysaccharide.
HINTERGRUND DES STANDES DER TECHNIK
Die ab den 1960er Jahren entwickelte Krebstherapie hat größtenteils die Anwendung von Chirurgie, Radiotherapeutika und Chemotherapie beinhaltet. Diese Therapien haben den Effekt aufgewiesen, dass die Kurve der Krebstodesrate, die in den USA bis 1973 unaufhaltsam anstieg, langsamer wird. Chirurgie und Radiotherapeutika stellen jedoch eine topische Therapie dar, die folglich eine Limitation dahingehend aufweist, dass Patienten nur dann mit gutem Ausgang genesen, wenn die Krebserkrankung noch als lokalisierter Krebs frühzeitig aufgehalten wird. Die Chemotherapie ist nur erfolgreich, wenn alle Krebszellen vollkommen eliminiert werden, und folglich kann die Chemotherapie den Wirt, das normale Gewebe, wie zum Beispiel das Immunsystem des Patienten schädigen und für alte und schwache Menschen lebensbedrohlich sein. Der Hauptzweck der Immuntherapie besteht darin, die Kanzerisierung durch Verstärken der Immunsurveillance abzuwehren. Es gibt mehrere Studien wie folgt:

1) zur immunologischen Prävention – ein Tier der gleichen Klasse wurde zur Prävention von homologem Krebs mit Krebsgewebe inokuliert. So kann zum Beispiel die virale Leukämie des Tieres durch Verwendung ihres verursachenden Virus verhindert werden (Morton et al. 1991, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 2: 492:494). Dieses Verfahren wurde jedoch niemals an einem Menschen angewendet, und die Induktion zellulärer Immunität ist schwierig;
2) zur Immuntherapie.

AKTIVE SPEZIFISCHE IMMUNISIERUNG
Diese Immunisierung ist zur Prävention vorgesehen, dass Krebszellen spezifische Immunüberwachungszellen des Krebses durch Inokulation von Patienten mit „Eigen"-Krebszellen oder homologen Krebszellen oder durch Röntgenstrahlung oder Mitomycin C regulierte inaktivierte „Eigen"- oder Iso-Krebszellen aktivieren. Dieses Verfahren war jedoch im Tierversuch und nicht bei Menschen erfolgreich. Zur Förderung der Expression spezifischer Antigene im Krebsgewebe bestanden verschiedene Verfahren in letzter Zeit darin, sie an Con-A zu binden oder „verstecktes" Antigen durch Behandlung mit Neuramindase oder Bildung eines Hybridoms mit heterologen Zellen zu exponieren. Die Verwendung dendritischer Zellen (Sprinz 1 et al., Cancer Treat Rev. 2001 Aug; 27(4): 247–55) oder die Entwicklung verschiedener anderer Therapien mit DNA-Vakzin (Pantuck et al., Int. J. Urol. 2001 Jul; 8(7):S1–4) weisen jedoch hinsichtlich ihrer Sicherheit und Wirkung noch Grenzen auf.
NICHT SPEZIFISCHE IMMUNTHERAPIE
Diese zurzeit am meisten herausgestellte Immunisierung wird allein oder mit Chemotherapeutika zur Behandlung von fast allen Tumorarten angewendet. Unter nicht spezifischer Immuntherapie versteht man, dass sie nicht durch die Krebsarten eingeschränkt ist. Obwohl verschiedene Theorien zu diesem Mechanismus vorgeschlagen wurden, basieren sie nur auf Studien, die darauf hinweisen, dass die nicht spezifische Immuntherapie das retikuloendotheliale System, spezifisch die Aktivität von Lymphozyten, stimuliert. Es liegt das Corynebakterium als das Hauptmaterial vor, das faktisch in klinischen Prüfungen verwendet wird. Picibanil (OK-432), das bereits bei Patienten in Korea angewendet worden ist, wurde untersucht und wird hauptsächlich von einem japanischen Pharmaunternehmen hergestellt. Es wird auf dem japanischen, koreanischen oder südostasiatischen Markt angeboten. Die Stoffe, aus denen Picibanil besteht, wurden schon seit langem in der Behandlung von Krebs eingesetzt. Im Jahr 1968 entdeckten die Deutschen Busch und Fehleisen et al., dass das Fortschreiten des Krebses aufgehalten werden konnte oder sich der vorbestehende Krebs verringerte. Im Jahr 1891 stellte Coley, ein Chirurg in Chicago, USA, ein aus Stoffen gebildetes Toxin her, die aus dem Kulturmedium von Streptokokken extrahiert wurden, das bei vielen Patienten angewendet wurde.
BCG (ODER TUBERKELBAZILLEN) UND ASSOZIIERTE STOFFE DAVON
BCG-Lebendorganismus: In den 1960er Jahren teilten Old in den USA und Mathe in Frankreich mit, dass Krebs bei Tieren durch Inokulation von BCG geheilt werden konnte. 1970 teilte Morton in den USA mit, dass auch das Melanom durch Inokulieren von BCG geheilt werden konnte. Auf Grund dessen wurde BCG und seine assoziierten Stoffe breit gefächert als eine nicht spezifische Immuntherapie eingesetzt. Eine große BCG-Inokulationsmenge ist erforderlich, wenn man eine zunehmende Immunantwort erwartet. BCG kann direkt unter die Haut, direkt in die Region des Krebsgewebes inokuliert oder oral verabreicht werden. Die orale Verabreichung von BCG ist jedoch nicht bei Menschen wirksam, die in ihrem Neonatalalter mit BCG inokuliert wurden, aber danach mit Tuberkelbazillen in Kontakt kamen (BCG oder Tuberkelbazillen werden von tuberkulinpositiven Menschen nicht absorbiert). Bei der Behandlung mit dem BCG-Lebendorganismus ist jedoch eine große Menge dieser BCG-Lebendorganismen erforderlich, und es treten Nebenwirkungen auf, wie zum Beispiel Ulzera in der Umgebung der Injektion sowie systemische Symptome wie Schüttelfrost, Fieber oder Leberfunktionsstörungen. Falls jedoch zur Verringerung der Nebenwirkung eine kleinere Menge angewendet wird, ist die Wirksamkeit reduziert oder schwach.
NICHT METHYLIERTE CpG-DNA
Säuger-DNA unterscheidet sich von der bakteriellen DNA dahingehend, dass sie umfangreiche CpG-Inhibitionen aufweist und das Cytosin von einem CpG-Dinukleotid selektiv methyliert wird. Vor kurzem wurde erkannt, dass CpG-Motive in bakterieller DNA die polyklonalen B-Zellen rasch stimulierten und folglich die IgM-Sekrektion erhöhten und die Progression des Zellzyklus durch den anti-IgM-Antikörper stoppten und die Induktion der Apoptose zur Inhibition der c-myc-Expression hoch wirksam inhibierten und durch die Steigerung der myn-, blc2- und bc1-XL-mRNA-Expression zum Schutz der Zellen gegen Apoptose führten. In einer anderen Studie wurde mitgeteilt, dass CpG-Motive B-Zellen zur Steigerung der IL-6- und IL-12-Sekretion innerhalb einer kurzen Zeit direkt aktivierten. Eine klinische Prüfung zu Immunadjuvanzien und Asthmatherapien unter Verwendung der Synthese von Oligonukleotiden, einschließlich CpG-Sequenzen, werden von einem CPG-Unternehmen in Amerika durchgeführt.
Obwohl, wie vorstehend beschrieben, Therapien unter Verwendung diverser immunregulierender Stoffe entwickelt wurden, werden unter diesen Therapien BCG und CpG nur bei Menschen angewendet. Trotz der breit gefächerten Wirkungen von BCG ist es schwierig, aufgrund seiner Stabilität eine größere BCG-Menge oder sie durch Blutinjektion zu verabreichen. Im Fall von CpG lasst sich sagen, dass synthetische Oligonukleotide zu teuer sind.
Bezüglich aktuell durchgeführter Forschungsarbeiten sind diese durch die Arbeit von Jian Jun Gao, Qiao Xue, Christopher J. Papasian und David C. Morrison typifiziert, wie in ihrer Publikation von 2001, veröffentlicht in The American Association of Immunologists unter dem Titel „Bacterial DNA and Lipopolysaccharide Induced Synergistic Production of TNF-α Through A Post Transcriptional Mechanism" detailliert ist. In diesem Artikel beschreiben sie die Verwendung bakterieller DNA mit einer unterschwelligen Konzentration von LPS zur Induktion von TNF-α in einer Makrophagen-ähnlichen Zelllinie. Sie führen spezifisch aus, dass es sich um die synergistische Wirkung der LPS und der DNA und die Wirkung handelt, die dies auf die Sekretion oder Induktion auf den TNF-α ausübt, die wichtig ist.
Diese Arbeit stellt die Fortsetzung einer Arbeit dar, die in einem Artikel von Jian Jun Gao, Eleanor G. Zuvanich, Qiao Xue, David L. Horn, Richard Silverstein und David C. Morrison, veröffentlicht in The American Association of Immunologists Magazine in 1999 unter dem Titel „Cutting Edge: Bacterial DNA and LPS Act in Synergy in Inducing Nitric Oxide Production in RAW 264.7 Macrophages", detailliert wurde. Dieser Artikel offenbart die bakterielle DNA- und LPS-Synergie bei der Induktion von Stickoxid in Makrophagen und stellt Spekulationen aber ihre potenzielle Anwendung an.
Außerdem wird auf einen Artikel von Ae-Kyung Yi, Jae-Geun Yoon, Soon-Cheol Hong, Thomas W. Redford und Arthur M. Krieg, veröffentlicht in The Japanese Society of Immunology, Vol. 13, Nr. 11, Seiten 1391 bis 1404, und unter dem Titel „Lipopolysaccharide and CpG DNA synergise for tumor necrosis factor-α production through activation of NF-κB", verwiesen. Dieser Artikel beschreibt nicht methylierte CpG-Motive in bakterieller DNA (CpG-DNA), die innate Immunantworten des Wirts synergistisch mit einigen anderen mikrobiellen Produkten, wie zum Beispiel Endotoxinen, motivieren und gegebenenfalls zur Pathogenese der Erkrankung durch exzessive Produktivität von proinflammatorischen Zytokinen beitragen können. Insbesondere der Monozyten-hergeleitete Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) stellt einen wichtigen Krankheitsmediator dar, und dieser wird mit einer synergistischen Wirkung mit Lipopolysaccharid (LPS) zur Induktion der TNF-α-Biosynthese untersucht. Dieser Artikel konzentriert sich wiederum primär auf die synergistische Wirkung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß die Bereitstellung von Stoffen zur Induktion einer Immunantwort, die stabiler, ökonomischer, wirksamer und spezifischer als die üblichen ist.
Es ist eine immunregulierende Zusammensetzung vorgesehen, umfassend: a) bakterielle DNA-Fragmente, worin die DNA-Fragmente im Bereich von 2,0 bis 0,5 kb liegen und endotoxinfrei sind, und b) Lipopolysaccharide von E. coli, worin Lipid A der Lipopolysaccharide durch Alkalibehandlung abgebaut wird und das Molekulargewicht der Lipopolysaccharide von 5000 bis 10000 Dalton beträgt.
Die bakterielle DNA-Sequenz schließt nicht nur nicht modifizierte, sondern auch modifizierte Basen wie eine methylierte Base (Cytosin, Adenin oder Guanin) ein.
Es ist bevorzugt, dass die kleinste Menge der bakteriellen chromosomalen DNA-Fragmente und der Lipopolysaccharide vermischt werden kann, um die erfindungsgemäße Wirkung zu zeigen. Die vorliegende Erfindung zeigt insbesondere die dosisabhängige Zunahme der Wirksamkeit in einem Massenverhältnis, das in einem Bereich von 500:1 bis 1:500 liegt. Im vorstehend beschriebenen Massenverhältnis ist die vorliegende Erfindung nicht toxisch und ökonomisch.
Es ist bevorzugt, dass die bakteriellen chromosomalen DNA-Fragmente und die Lipopolysaccharide durch Schütteln vermischt werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung ist nützlich für Immunadjuvanzien oder Antikrebstherapien. Diese Wirkungen lassen sich durch die Induktion der Immunaktivierung von T-Helferzellen des Typs 1 zeigen.
Es ist bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Bakterien Escherichia coli oder Mycobakterien darstellen. Bevorzugter stellen die Bakterien Escherichia coli, insbesondere, E. coli EG0021 (KCCM-10374) dar.
In der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann die Synergiewirkung durch CIA02 hinsichtlich der Stabilität und Immuninduktion der Zelle erwartet werden, die Synergiewirkung durch CIA05 hingegen kann hinsichtlich der Immunverstärkung, spezifisch der Krebstherapie, erwartet werden.
Die offenbarte immunstimulierende und -regulierende Zusammensetzung, umfassend bakterielle chromosomale DNA-Fragmente und nicht toxische Lipopolysaccharide, wird kurz beschrieben.
Diese Erfinder waren bei der wirksamen Herstellung bakterieller Oligonukleotide als Antikrebsadjuvans und der Entwicklung modifizierter Lipopolysaccharide für die geeignete Aktivierung als Antikrebstherapien erfolgreich. Ein neues Immunadjuvans, CIA07, wird schließlich durch Kombination der bakteriellen Oligonukleotide und der Lipopolysaccharide erhalten.
Im Allgemeinen weist die Kombination von Lipopolysaccharid und DNA eine Synergiewirkung auf. Lipopolysaccharid weist verschiedene Antworten dergestalt auf, dass es als unabhängiges T-Zellen-Antigen dient. Hier kann die Synergiewirkung zu entscheidenden Ergebnissen, wie zum Beispiel Sepsis, führen.
Diese Erfinder gewannen einen Stamm, E. coli EG0021, mit einem Lipopolysaccharid mit kurzer Kohlenhydratkette von Escherichia coli aus dem gesunden humanen Darm. Sie hinterlegten den Stamm mit der Nummer KCCM 10374 am 2. Mai 2002 beim Koreanischen Kulturzentrum für Mikroorganismen, KCCM, in 361–221 Hongje-dong, Seodaemun-gu, Seoul, Korea. Sie etablierten ein Verfahren zur Reinigung von Lipopolysaccharid aus diesem Stamm.
E. coli-DNA, CIA02, welche die Immunaktivierung darstellt, wurde aus der genomischen DNA von E. coli EG0021 isoliert. CIA02 wurde nach der Fragmentierung der isolierten DNA und allgemeinen Behandlung erhalten.
CIA07 wurde schließlich durch Kombination von CIA02 und CIA05 erhalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht in einer Abbildung die chromosomale E. coli-DNA, die mithilfe eines Beschallungsgeräts in jede Fraktion aufgeteilt wird, um die Größe der die optimale Wirkung darstellenden E. coli-DNA nachzuweisen, worin Spur 1 intakte DNA, Spur 2 DNA über 1 kb, Spur 3 DNA von 2 – 0,5 kb und Spur 4 DNA von weniger als 0,5 kb darstellt.
2A bis 2C stellen Diagramme dar, die die optimale zunehmende Immunwirkung der E. coli-DNA (CIA02) von ca. 2–0,5 kb veranschaulichen.
3 veranschaulicht in einer Abbildung das aus der äußeren Membran von E. coli isolierte Lipopolysaccharidprodukt. Die Abbildung veranschaulicht das isolierte Lipopolysaccharid anhand einer 5X Batch.
4 veranschaulicht in einer Abbildung, dass die Größe des aus E. coli isolierten Lipopolysaccharids, das mit Alkali behandelt wird, durch den Abbau von Lipid A verändert ist und durch diese Behandlung seine Toxizität verliert, worin Spur 1 das isolierte Lipopolysaccharidprodukt CIA04 und Spur 2 das mit Alkali behandelte nicht toxische Lipopolysaccharid CIA05 darstellt.
5 veranschaulicht in einer grafischen Darstellung die Abnahme der TNF-α-Sekretion in einer THP-1-Zelllinie, die mit dem nicht toxischen Lipopolysaccharid (CIA05) behandelt wurde.
6A veranschaulicht in einer grafischen Darstellung die Ergebnisse eines allgemeinen Sicherheitstests am nicht toxischen Lipopolysaccharid (CIA05) in der Maus.
6B veranschaulicht in einer grafischen Darstellung die Ergebnisse eines allgemeinen Sicherheitstests am nicht toxischen Lipopolysaccharid (CIA05) im Meerschweinchen.
7A bis 7C veranschaulichen in grafischen Darstellungen die Zunahme der Immunwirkung gemäß einem Kombinationsverfahren und der Konzentration von E. coli-DNA (CIA02) und nicht toxischem Lipopolysaccharid (CIA05).
8A bis 8C veranschaulichen in grafischen Darstellungen die Zunahme der Immunwirkungen von E. coli hergeleitetem CIA07 im Vergleich mit anderen Immunadjuvanzien.
9 veranschaulicht in einer grafischen Darstellung die Zytokinsekretion in humanem Vollblut, das mit der sich von E. coli hergeleiteten Antikrebstherapie CIA07 behandelt wurde.
10A bis 10B veranschaulichen in grafischen Darstellungen die Menge der Zytokinsekretion in humanem Vollblut, das mit der sich von E. coli hergeleiteten Antikrebstherapie CIA07 und Mycobakterium-DNA behandelt wurde.
11A bis 11B veranschaulichen in grafischen Darstellungen die Zunahme der Promotoraktivität durch NF-κB-Aktivierung nach der Behandlung mit der sich von E. coli hergeleiteten Antikrebstherapie CIA07 in RAW-Zellen.
12 veranschaulicht in einer grafischen Darstellung die Inhibition von Krebswachstum, wenn die sich von E. coli hergeleitete Antikrebstherapie CIA07 an die C3H/HeJ-Maus verabreicht wird, in die die marine Blasenkrebszellinie (MBT2) transplantiert wurde.
BEVORZUGTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Die offenbarte immunstimulierende und -regulierende Zusammensetzung, umfassend bakterielle chromosomale DNA-Fragmente und nicht toxische Lipopolysaccharide, wird ausführlicher unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele beschrieben, die nicht als einschränkend beabsichtigt sind.
BEISPIEL 1: ERHALT EINES NICHT TOXISCHEN STAMMS
SCREENING UND ISOLIERUNG MUTANTER E. coli MIT EINEM LIPOPOLYSACCARID MIT KURZER KOHLENHYDRATKETTE
E. coli EG0021 mit einem Lipopolysaccharid mit kurzer Kohlenhydratkette wurde aus dem gesunden humanen Darm isoliert, und ein Verfahren zum Reinigen des Lipopolysaccharids aus dem Stamm etabliert.
Ein fünfmalig wiederholtes Verfahren umfasste die Injektion von einer in einem flüssigen Medium kultivierten Einzelkolonie von E. coli, die aus dem gesunden Darm eines erwachsenen Mannes isoliert wurde, in ein Versuchstier (Balb/C-Maus).
Es wurden darin 50 Stammarten ausgewählt, und es wurde eine Kolonie der ausgewählten 50 Stämme von einer Platte gewonnen. Nachdem die Kolonie in 4 ml 0,9 %iger physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst war, wurde 1 ml der Lösung in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Die Lösung wurde mit 2 μl DNase I behandelt und eine Stunde bei 37°C in einem Inkubator zur Reaktion gebracht. Nach der Behandlung von DNase I wurde die Lösung mit 50 μl RNase (10 mg/ml) behandelt und eine Stunde bei 37°C in einem Inkubator zur Reaktion gebracht. Danach wurden 100 μl Proteinase K (20 mg/ml) hinzugefügt und über Nacht bei 37°C zur Reaktion gebracht. Die durch GM-CSF differenzierte humane Lymphozyten-Zelllinie wurde mit LPS von jedem daraus erhaltenen Stamm behandelt. Die Sekretion von TNF-α wurde gemessen, und es wurde ein Stamm mit dem kleinsten Wert ausgewählt (siehe Tabelle 1) und das Molekulargewicht von Lipopolysaccharid mittels Elektrophorese bestätigt. Es wurde gezeigt, dass der attenuierte Stamm morphologisch oder bezüglich seiner Merkmale nicht verändert war. Lipopolysaccharide mit einem Molekulargewicht im Bereich von 5000 bis 10000, ohne Lipopolysaccharid-„Leiter", die ein Molekulargewicht im Bereich von 50000 bis 100000 aufweist, wurden mittels der Elektrophorese nachgewiesen (siehe 1). Dieser Stamm wurde als EG0021 bezeichnet.
BEISPIEL 2: HERSTELLUNGSVERFAHREN FÜR E. coli-DNA
REINIGUNG DER CHROMOSOMALEN E. coli-DNA
E. coli EG0021 wurde 10 Stunden bei 37°C unter Schütteln in TSB-Kulturmedium (Tryptische Sojabouillon; Difco) (30 g/l) kultiviert.
Nach 10-stündiger Kultivierung wurden 150 g der durch Zentrifugtion bei 8000 × g erhaltenen Zellen in 300 ml TE-Pufferlösung (10 mM Tris, pH 8,0, 25 mM EDTA) gewaschen und zentrifugiert. Die durch Zentrifugation erhaltenen Zellen (150 g) wurden in 750 ml Lyselösung (10 mM Tris (pH 8,0), 25 mM EDTA, 100 μg/ml Lysozym) aufgelöst und 1 Stunde bei 37°C behandelt.
Danach wurde der Lösung Proteinase K (Sigma) bis zu einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugefügt und wurde 12 Stunden bei 50°C behandelt.
Das Mischen der Lösung mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) in einem Verhältnis von 1:1 wurde zum Erhalt einer Wasserschicht dreimal wiederholt.
Chromosomale E. coli-DNA wurde mittels Ethanolpräzipitation erhalten.
Nachdem die gereinigte E. coli-DNA mit sterilem destilliertem Wasser verdünnt war, wurde die Konzentration der E. coli-DNA bei 260 nm und 280 nm an einem UV-Spektrometer gemessen.
Die Konzentration wurde gemäß dem folgenden Verfahren gemessen:
Konzentration der doppelsträngigen DNA (μg/ml)
= OD_260nm × Verdünnungsrate × 50
Konzentration der einsträngigen DNA (μg/ml)
= OD_260nm × Verdünnungsrate × 40
OD_260nm/OD_280nm = 1,7–1,8
Die gereinigte chromosomale E. coli-DNA wurde in TE-Pufferlösung zu 0,5 mg/ml aufgelöst und in einem Glasbecher mit einem Beschallungsgerät beschallt.

– Jeweils 20 ml der Lösung wurden mittels Beschallung bei 500 Watt mit einem Beschallungsgerät, Modell VCX500 (von der Fa. Sonics Co.) und einer Beschallungsspitze, Modell 630-0220 (Spitzendurchmesser: 1/2'' (13 mm)) beschallt.
– Zur Identifikation der Größe der die optimale Wirkung darstellenden E. coli-DNA wurde hier die komplette chromosomale E. coli-DNA gemäß der Zeitdauer unter Verwendung des Beschallungsgeräts bei 20000 J unterteilt und dann nach Größe getrennt (siehe 1). Die E. coli-DNA gemäß ihrer Größe in die komplette DNA wurde vor der Beschallung (intakt, mehr als 10 kb), 2,0 bis ca. 0,5 kb, 0,5 bis ca. 0,1 kb und weniger als 0,1 kb aufgeteilt.
– Zur Identifikation der Zunahme der Immunwirkungen von gemäß der Größe getrennter E. coli-DNA wurde die Wirkung als Immunadjuvans in der Maus gemessen (siehe 2). 50 μg HEL (Sigma) als Antigen und 50 μg von jeder E. coli-DNA als Adjuvans wurden in einem Intervall von einer Woche zweimal in eine ICR-Maus (ein 4 Wochen altes Männchen, 20 g) i. p. injiziert. 7 Tage nach der letzten Injektion wurde das Vollblut gesammelt und das Serum abgetrennt. Der Antikörperwert wurde im Serum mit HEL als Antigen mithilfe des ELISA-Verfahrens gemessen (siehe 2A).

In den Analyseergebnissen wies die Größe von 2,0–0,5 kb den höchsten Antikörperwert auf. Danach wurde anhand wiederholter Experimente gezeigt, dass ca. 1 kb die optimale Wirkung darstellte.
Die Wirkungen der humoralen und zellulären Immunität in der Antikörper-Unterklasse im Serum wurden mit dem gleichen ELISA-Verfahren identifiziert (siehe 2B und 2C).
Die Beschallungsbedingung zum Erhalt der gemäß dem vorstehenden Ergebnis bestimmten E. coli-DNA von 1 kb beträgt 7 Minuten bei 20000 J.
BEISPIEL 3: ENTFERNUNG VON ENDOTOXIN AUS E. coli-DNA UND MESSUNG DER DNA-REINHEIT
ENTFERNUNG VON ENDOTOXIN
Nach der Beschallung wurde DNA mit Chloroform 12 Stunden bei 4°C zur Reaktion gebracht, und es wurden darin drei Volumina Ethanol zum Erhalt eines Präzipitats behandelt.
Das Präzipitat wurde mit Triton X-114 (Sigma) auf 0,5 % der Endkonzentration behandelt. Das sich ergebende Präzipitat wurde 4 Stunden bei 4°C zur Reaktion gebracht, 5 Minuten bei 37°C angewärmt und dann mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) in einem Verhältnis von 1:1 zum Erhalt einer Wasserschicht gemischt.
Die erhaltene E. coli-DNA wurde mit Ethanol präzipitiert und in pyrogenfreiem Wasser aufgelöst.
DNA mit entferntem Endotoxin wurde mit dem Limulus-Amöbozytenlysat-Kit (LAL-Kit) (Bio Whittaker QCL-1000) zum Nachweis des restlichen Endotoxins analysiert.

Tabelle 1 zeigt den Endotoxinwert und die Ausbeute von gereinigter E. coli-DNA (CIA02) nach Entfernung des Endotoxins gemäß dem vorstehenden Verfahren.

TABELLE 2: ENDOTOXINWERT UND AUSBEUTE VON GEREINIGTER E. coli-DNA (CIA02)
PROBENNUMMER	DNA-KONZENTRATION	MENGE DER DER KOMPLETTEN DNA (/15 ml)	PYROGENFREIE DNA	VERHÄLTNIS	ENDOTOXIN (PRO DNA 1 mg/ml)	AUSBEUTE
1	3 mg/ml	45 mg	16,2 mg	1,77	< 1 ng	36%
2			20,25 mg	1,66	< 1 ng	45%
3			18,9 mg	1,71	< 1 ng	42%

– Die Menge des restlichen organischen Lösungsmittels wurde mithilfe des GC/MSD (Gaschromatographie/Massen-selektiven Detektors), HP-5890A/HP-5870B, gemessen. Ethanol, Aceton, Chloroform und Phenol wurden mittels des SIM (Einzelionennachweises) mit der Säule von 50 m Ultra-1 gemessen (siehe Tabelle 2).

TABELLE 3: MENGE DES RESTLICHEN ORGANISCHEN LÖSUNGSMITTELS
RESTLICHES ORGANISCHES LÖSUNGSMITTEL	ACETON	ETHANOL	PHENOL	CHLOROFORM
ng/μl	-	0,813	-	-

– Ein mehr als 99%iger Reinheitsgrad wurde durch Messen der Proteinkontamination pro mg E. coli-DNA mithilfe des Bradford-Verfahrens ermittelt.

BEISPIEL 4: REINIGUNG VON LIPOPOLYSACCHARID (CIA04) AUS MUTANTEN E. coli
REINIGUNG VON LIPOPOLYSACCHARID AUS MUTANTEN E. coli
E. coli wurden mithilfe des gleichen Verfahrens, wie für das vorstehende DNA-Isolierungsverfahren beschrieben, hergestellt.
Die hergestellten E. coli wurden mit 2 Volumina Ethanol gemischt und bei 4000 × g zum Erhalt eines Präzipitats zentrifugiert. 1,5 Volumina Aceton bezogen auf das Präzipitat wurden zugefügt, gemischt und dann bei 4000 × g zentrifugiert.
Es wurde die gleiche Menge Ethylether zugefügt und das sich ergebende Präzipitat gemischt und dann bei 4000 × g zentrifugiert. Das daraus erhaltene Zellpellet wurde mit Aluminiumfolie abgedeckt und die Folie punktiert und zum Messen der Zellmasse getrocknet. Danach wurden 7,5 ml Extraktionsgemisch (90 % Phenol:Chloroform:Petrolether = 2:5:8) pro 1 g zellulärem Trockengewicht zugefügt.
Die sich ergebende Lösung wurde in Glaszentrifugenröhrchen aufgeteilt und bei 25°C, 3000 U/min (1200 × g) 20 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu erhalten. Der Überstand wurde 12 Stunden im Abzug gelassen. Danach wurde die Lösung in Glaszentrifugenröhrchen aufgeteilt und die Lipopolysaccharide in Ethylether mittels Zentrifugation bei 25°C, 3000 U/min (1200 × g) 20 Minuten aufgelöst und dann in ein Eppendorf-Röhrchen überführt. Die Lösung wurde im Abzug getrocknet, und das Trockengewicht wurde mit einer Analysenwaage gemessen. Danach wurde Ethanol zugefügt und vor Gebrauch gelagert.
Nachdem das Ethanol vollkommen in gereinigtem, in Ethanol aufbewahrtem E. coli-Lipopolysaccharid eliminiert war, wurde die Menge von KDO (2-Keto-3-desoxyoctonat) im Lipopolysaccharid mithilfe eines Lipopolysaccharid-Standards (Lsit Biological Lab.) gemessen. Nachdem die Konzentration mithilfe des Standards gemessen worden war, wurden die Lipopolysaccharide mithilfe von SDS-PAGE gemäß der Größe gemessen und anhand von Silberfärbung identifiziert (siehe 3). Das Lipopolysaccharid wies ein Molekulargewicht im Bereich von ca. 5000 bis 10000 auf und seine Größe war im Vergleich zum allgemeinen E. coli-Lipopolysaccharid sehr klein.
BEISPIEL 5: ENTFERNUNG VON TOXIZITÄT IN GEREINIGTEM LIPOPOLYSACCHARID AUS MUTANTEN E. coli
ENTFERNUNG VON TOXIZITÄT IN LIPOPOLYSACCHARID DURCH ABBAU VON LIPID A
Gereinigte E. coli-Lipopolysaccharide wurden auf eine Konzentration von 3 mg/ml verdünnt und mit 0,2 N NaOH in einem Verhältnis von 1:1 gemischt. Die sich ergebende Lösung wurde alle 10 Minuten bei 60°C geschüttelt und 140 Minuten deacyliert.

– Ca. 1/5 Volumina von initialer 0,2N NaOH oder 1N Essigsäure wurden der sich ergebenden Lösung zum Titrieren auf pH 7,0 zugefügt.
– Nach der pH-Titration wurde mit Ethanol präzipitiertes, nicht toxisches Lipopolysaccharid erhalten.

Nachdem die Konzentration von nicht toxischem Lipopolysaccharid mithilfe des KDO-Verfahrens gemessen war, wurde seine Größenänderung mittels SDS-PAGE und Silberfärbung im Vergleich zu Lipopolysaccharid vor der Behandlung identifiziert.

– Aufgrund der Färbung wurde gezeigt, dass Lipid A vom Lipopolysaccharid durch die Alkalibehandlung abgebaut und die Größe des Lipopolysaccharids kleiner wurde (siehe 4).

BESTÄTIGUNG DER TOXIZITÄTSENTFERNUNG VON NICHT TOXISCHEM LIPOPOLYSACCHARID
Zum Testen der Stabilität des nicht toxischen Lipopolysaccharids wurden Experimente zur Sekretion, Pyrogenität und der abnormen Toxizität inflammatorischer Proteine durchgeführt.
EXPERIMENT ZUR SEKRETION DES INFLAMMATORISCHEN PROTEINS
THP-1 (akute Monozytenleukämie) wurde mit nicht toxischem Lipopolysaccharid von einer hohen bis zu einer niedrigen Konzentration zur Messung der Menge von sezerniertem TNF-α im Vergleich zur Kontrollgruppe mit gereinigtem Lipopolysaccharid behandelt.
Während in der Kontrollgruppe 5 pg TNF-α in 1 μg Lipopolysaccharid sezerniert wurden, wurden 0,1 pg TNF-α in 1 μg nicht toxischem Lipopolysaccharid sezerniert. Es wurde hier gezeigt, dass die durch die Toxizität induzierte inflammatorische Reaktion um das 50fache abnahm. Es wurde außerdem gezeigt, dass die in E. coli-DNA sezernierte TNF-α-Menge unter 100 fg lag. Aufgrund dessen erwies sich das nicht toxische Lipopolysaccharid als ein sehr sicherer Stoff (siehe 5).
EXPERIMENT: ALLGEMEINER SICHERHEITSTEST
Die Probe mit der hohen Dosis wurde in mehr als zwei Nagetierarten zur Beobachtung einer abnormen Gewichtsveränderung injiziert.
A. EXPERIMENT AM MEERSCHWEINCHEN
Wenn es langer als 5 Tage vor Gebrauch beobachtet wurde, wies ein ca. 350 g wiegendes Meerschweinchen keine Anomalie auf und nahm allmählich zu.
Die 5-ml-Probe wurde pro Schwerschweinchen verwendet.
Die Probe wurde einmal in mehr als zwei Meerschweinchen i. p. injiziert, und diese wurden mehr als 5 Tage beobachtet.
B. EXPERIMENT AN DER MAUS
Wenn sie länger als 5 Tage vor Gebrauch beobachtet wurde, wies eine ca. 5 Wochen alte Maus keine Anomalie auf und nahm allmählich zu.
Die Probe wurde einmal in mehr als zwei Mäuse i. p. injiziert, und diese wurden langer als 7 Tage beobachtet.
Die Probe erwies sich in diesem Experiment als geeignet, wenn ein Tier während der Beobachtungsdauer keine Anomalie aufwies.
Anhand der experimentellen Ergebnisse wurde keine abnorme Gewichtsveränderung nach Injektion der Probe beobachtet (siehe 6a).
PYROGENITÄTSEXPERIMENT
Nachdem das Vakzin in drei Kaninchen injiziert worden war, wurde eine Änderung der Rektaltemperatur beobachtet. Die Probe mit 0,2 μg/ml pro 1 kg bezogen auf das Kaninchen wurde in die Ohrvene des Kaninchens injiziert. Danach wurde die Änderung der abnormen Temperatur durch Einführen eines Thermometers in das Rektum gemessen.
Das Gewicht der Kaninchen betrug hier über 1,5 kg. Die Kaninchen wurden mehr als 3 Tage nachdem sie in den Experimenten eingesetzt wurden, wieder verwendet. Die Körpertemperatur wurde mit einem Apparat, der die Temperatur bis zu 0,1°C misst, gemessen. Ein Injektionsgerät und seine Kanüle wurden über 30 Minuten bei 250°C hitzesterilisiert. Ab 16 Stunden vor der Verwendung bis zum Abschluss des Experiments wurde nur Wasser gegfüttert. Die Tiere wurden in ihren Bewegungen so gut wie möglich weitgehend eingeschränkt.
Die Körpertemperatur wurde durch Einführen des Thermometers in das Rektum bis zu einer konstanten Tiefe im Bereich von 60 bis 90 nun über eine konstante Zeitdauer gemessen. Die vor der Injektion gemessene Temperatur wurde als Kontrolltemperatur definiert. Die auf 37°C angewärmte Probe wurde innerhalb von ca. 15 Minuten nachdem die Kontrolle gemessen worden war, in die Ohrvene injiziert. Die Körpertemperatur wurde mindestens 1 Stunde nach der Injektion alle 3 Stunden gemessen. Der Abstand zwischen der Kontrolltemperatur und der Probentemperatur wurde als Temperaturdifferenz definiert. Der Maximalwert der Temperaturdifferenz wurde als pyrogene Reaktion der Versuchstiere definiert. Hierzu wurden die Proben von drei Tieren verwendet.
Das Experiment mit pyrogenem Material war negativ, wenn die Werte von insgesamt drei Tieren unter 1,3°C lagen, während sie positiv waren, wenn sie über 2,5°C lagen. Diese Experimente wurden dreimal durchgeführt, und die negative Reaktion war für diese Experimente mit pyrogenem Material geeignet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 ersichtlich.
BEISPIEL 6: KOMBINATION VON E. coli-DNA-FRAGMENT (CIA02) UND NICHT TOXISCHEM LIPOPOLYSACCHARID (CIA05) UND IDENTIFIKATION DER AKTIVITÄT
KOMBINATION VON E. coli-DNA-FRAGMENT (CIA02) UND NICHT TOXISCHEM LIPOPOLYSACCHARID (CIA05)
Die E. coli-DNA (CIA02) und nicht toxisches Lipopolysaccharid (CIA05), die gemäß dem jeweiligen Standardverfahren hergestellt wurden, wurden zur Bestimmung des optimalen Mischverfahrens und der Dosis gemischt.
Zur Identifikation der Wirkungsänderung gemäß dem Mischverfahren wurde das Antigen mit zwei verschiedenen chemischen Stoffen (MPBH und SPB) zwecks Bindung behandelt. CIA02 und CIA05 wurden mit dem modifizierten Antigen kombiniert. Auf andere Weise wurden CIA02, CIA05 und das Antigen gemischt und geschüttelt. Außerdem wurde mit jeder Dosis die Zunahme der Immunwirkungen analysiert. Zur Identifikation der Wirkung des Immunadjuvans in der Maus wurden 0,1 ml HEL (50 μg; Sigma) als Antigen in eine ICR-Maus (ein 4 Wochen altes Männchen, 20 g) zweimal in einem Intervall von einer Woche i. p. injiziert. Sieben Tage nach der abschließenden Injektion wurde das Vollblut gesammelt und das Serum davon abgetrennt. Der Antikörperwert im Serum wurde unter Verwendung von HEL als Antigen mithilfe des ELISA-Verfahrens analysiert (siehe 7A).
Die Kontrollgruppe bestand aus 0,5 und 1 μg LPS (CIA04), während die experimentelle Gruppe aus Antigen, 0,5 μg CIA05 und 50 μg CIA bestand, die Schüttel-Misch-Gruppe aus Antigen, 1 μg CIA05 und 50 μg CIA, modifiziertem Antigen, 0,5 μg CIA05 und 50 μg CIA bestand, die Kombinationsgruppe aus modifiziertem Antigen, 1 μg CIA05 bzw. 50 μg CIA, bestand.
Als experimentelles Ergebnis wurde nachgewiesen, dass LPS (CIA04) die höchste Antikörperaktivität aufwies, es aber aufgrund seiner toxischen Nebenwirkungen als Antikrebsadjuvans nicht geeignet war (siehe 7A). Obgleich die Kombinationsverfahren wenig Unterschied machten, war ein Schüttel-Misch-Verfahren im Vergleich zu den anderen Verfahren überlegener. Es wurde insbesondere gezeigt, dass das Schüttel-Misch-Verfahren wirksam war, weil es einen Unterschied bei IgG2a in Bezug auf die Zellimmunität unter der Immunoglobulin-Unterklasse zeigte (siehe 7B). Hinsichtlich der Ausbeute war das Schüttel-Misch-Verfahren einfach und wies während der Behandlungsvorgänge keinen Verlust auf. Aufgrund dessen wurde das Schüttel-Misch-Verfahren ausgewählt. Die Dosis wurde gemäß der CIA05-Menge bestimmt. Die Dosis von 1 μg zeigte eine überlegenere Wirksamkeit als die von 0,5 μg. Aufgrund dessen wurde die Dosis von 1 μg ermittelt.
Die Wirkungen der humoralen und zellulären Immunität in der Unterklasse des Antikörpers im Serum wurden mittels des ELISA-Verfahrens analysiert.
EXPERIMENT ZUM VERGLEICH MIT DEM ÜBLICHEN IMMUNADJUVANS
Zum Testen der Zunahme der Immunwirkungen des bestimmten Herstellungsverfahrens und der Dosis wurde ein Experiment zum Vergleich mit denen des üblichen Immunadjuvans durchgeführt (siehe 8A).
Die Anwendbarkeit von CIA07 als Immunadjuvans wurde mithilfe von Tierversuchen analysiert. 0,1 ml HEL (50 μg; Sigma L-6876) als Antigen wurde in eine ICR-Maus (ein 4 Wochen altes Männchen, 20 g) zweimal in Intervallen von einer Woche i. p. injiziert. Sieben Tage nach der abschließenden Injektion wurde das Vollblut gesammelt und das Serum davon abgetrennt. Die Antikörperaktivität im Serum wurde mit HEL als Antigen mithilfe des ELISA-Verfahrens analysiert.
Es wurde gezeigt, dass die Antikörperaktivität von CIA07 die gleiche Wirkung wie das CFA (komplette Freund-Adjuvans), das übliche Immunadjuvans für den Tierversuch, und Alum (Aluminiumhydroxid-Gel), das nur zum Gebrauch am Menschen zugelassen ist, darstellt (siehe 8A). Aufgrund des Analysierens des Isotyp-Switchings wurde jedoch gezeigt, dass die üblichen Immunadjuvanzien, wie zum Beispiel die durch CFA und Alum aktivierte Immunisierung von Th2-Zellen (T-Helfer-Zellen des Typs 2), worin hauptsachlich IgG1-Antikörper produziert wurden, während CIA07 die Immunaktivierung von Th1-Zellen (T-Helfer-Zellen des Typs 1) induzierte, worin spezifisch Antikörper von IgG2a anstelle von IgG1 produziert wurden (siehe 8B und 8C).
Zur Identifikation der Dosis von CIA02 wurde 1 μg CIA05 mit 25 μg bzw. 50 μg CIA02 gemischt. Als Ergebnis der Analyse wurde gezeigt, dass die Antikörperaktivität gemäß der Dosis verändert war. Demzufolge wurden 50 μg CIA02 und 1 μg CIA05 als die optimale Dosis bestimmt.
EXPERIMENT ZUR IDENTIFIKATION DER CIA-AKTIVITÄT ANHAND DER VOLLBLUT-ANALYSE
Venenblut von gesunden erwachsenen Männern wurde steril in einem Vakuumröhrchen mit Heparin als Antikoagulans gewonnen. Das daraus erhaltene Vollblut wurde mit RPMI 1640-Kulturmedium (2 mM L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat, Gentamycin in Höhe von 80 μg/ml) in einem Verhältnis von 1:1 gemischt. 20 μl CIA07 (50 μg CIA02 + 1 μg oder 500 ng, 100 ng CIA05) oder 20 μl HBSS wurden 1 ml des mit Kulturmedium vermischten Vollbluts zugefügt und dann in Kulturmedium mit 5 % CO₂ 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Sekretionsmenge von IFN-γ (R&D-System, 210-TA-010) und IL-12-p40 (R&D-System, 219-IL-005) wurde in der Überstandsflüssigkeit im Kulturmedium mit dem ELISA-Kit analysiert. Die Ergebnisse werden in 9 gezeigt.
Auf gleiche Weise wurden 20 μl CIA07 (50 μg CIA02 + 1 μg CIA05), CIA02 (50 μg), Mycobakterium-DNA (50 μg) oder HBSS (20 μl) 1 ml des mit Kulturmedium vermischten Vollbluts zugefügt. Danach wurde die Zytokinsekretion analysiert.
Als Analysenergebnis wurde die synergische Zunahme der Immunwirkung im Fall der Zugabe von gemischtem CIA02 und CIA05 mehr als im Fall der Zugabe von nur CIA02 oder nur CIA5 dargestellt. Das beste Ergebnis wurde in Form der Dosis von 50 μg CIA02 und 1 μg CIA05 gezeigt. Im Vergleich zur Mycobacterium-DNA stellte CIA07 ebenso wie CIA02 ein ausgezeichnetes Ergebnis dar.
LUZIFERASE-ASSAY
RAW-Zellen wurden in 12-Well-Platten mit 5 × 10⁴ Zellen (1 ml DMEM/10 % FBS) pro Well ausgebreitet und in einem CO₂-Inkubator 24 Stunden bei 37°C kultiviert. IL-12-Luziferase-Reporterplasmid (0,2 μg/Well), gemischt mit PRL-Nullplasmid (20 ng/Well) wurde serumfreiem DMEM (50 μl/Well) zugefügt, mit Fugen 6 (1,5 μl/Well, Roche Kat.-Nr. 1 814 443), Transfektionsreagens gemischt und dann 5 bis 10 Minuten stehen lassen. Das sich ergebende Gemisch wurde den RAW-Zellen in Höhe von 52 μl/Well zugefügt und in einem CO₂-Inkubator 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Danach wurden die RAW-Zellen mit CIA07 (CIA02 20 μg + CIA05 400 ng pro Well) behandelt und in einem CO₂-Inkubator 12 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Luziferase-Reaktion wurde mittels des Luziferase-Assaykits (Promega Kat.-Nr. E1500) zum Messen der Luziferase-Aktivität mit einem Luminometer durchgeführt.
Aufgrund des Messens der Luziferase-Aktivität zum Identifizieren der Wirkungen von CIA07 auf die IL-8- und IL-12-Promotor-Aktivität wurde ermittelt, dass der NF-κB-Bindungsort sowohl in IL-8- als auch IL-12-Promotoren existierte. Es wurde gezeigt, dass NF-κB in der RAW264.7-Zelllinie durch CIA07 zur Steigerung der Aktivität von Promotoren aktiviert wurde (siehe 11).
MESSUNG DER WIRKUNG DER ANTIKREBSBEHANDLUNG MITHILFE DER ZELLLYSE-AKTIVITAT VON CIA
Die Aktivität zum Abtöten von Krebszellen durch CIA07 wurde unter Verwendung der ⁵¹Cr-Freisetzung gemessen.
Antigen allein oder mit CIA07 wurde unter die Haut der Fußsohle einer 5 – 8 Wochen alten männlichen C3H/HeN-Maus injiziert.
RPMI-1640 (10 mM HEPES, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 300 μg/ml Glutamin; Gibco Laborstories, Grand Island, NY) wurde für das basale Kulturmedium zum Kultivieren von Zelllinien verwendet. Inaktiviertes 10 %iges fetales Rinderserum (Gibco Laborstories, Grand Island, NY), 30 Minuten bei 56°C erhitzt, wurde dem basalen Kulturmedium zugefügt. Zum Messen der Aktivität von LAK-Zellen und der durch Krebszellen vermittelten Killeraktivität wurden als Targetzellen die Sarkom 180- und marine Blasenkrebszelllinie (MBT-2) verwendet.
Zur Herstellung der Reaktionszelllinien wurde eine Ratte in der experimentellen Gruppe durch zervikale Dislokation getutet. Ihre Milz wurde steril isoliert und auf einem Edelstahldrahtnetz mit einer Schere zerkleinert. Die Fragmente wurden zermahlen und mit einem Glasstab unter Zufügen von Phosphatgepufferter Salzlösung filtriert. Danach wurden die Gewebetrümmer mittels Passieren durch das Drahtnetz entfernt. Nachdem eine Einzelzellsuspension unter dem Mikroskop identifiziert war, wurden die Zellen unter Verwendung des basalen Kulturmediums einmal gewaschen. Die Zellen wurden 5 Minuten bei 37°C in einer 0,84%igen Ammoniumchloridlösung zum Auflösen von Erythrozyten suspendiert. Die Zellen wurden weiter unter Verwendung des basalen Kulturmediums zweimal gewaschen und in komplettem Kulturmedium suspendiert. Die Zellsuspension wurde in Kulturflaschen aufgeteilt und unter CO₂ bei konstanter Temperatur in einer Feuchtekammer 1 Stunde bei 37°C kultiviert. Die Zellen, die nicht an den Flaschen hafteten, wurden daraus gewonnen, und die Zahl überlebender Zellen wurde unter Verwendung des Ausschlussverfahrens mit Trypanblau-Farbstoff gemessen. Danach wurden unter Verwendung des kompletten Kulturmediums 5 × 10⁶ Zellen erhalten, und die Zahl überlebender Zellen davon wurde unter Verwendung des Ausschlussverfahrens mit Trypanblau-Farbstoff gemessen. Danach wurden 5 × 106 Zellen/ml bezogen auf die Zellsuspension unter Verwendung des kompletten Kulturmediums hergestellt.
Die Targetzelllinie wurde kultiviert, und die Anzahl der Zellen wurde gezählt. Es wurden 106 Zellen erhalten, und die Zellen wurden 3 Minuten bei 300 × g zentrifugiert. Die Überstandsflüssigkeit, außer 0,2–0,3 ml, wurde mit einer Pasteur-Pipette ohne Beschädigung der präzipitierten Zellen entfernt. 100 ml Na₂ ⁵¹CrO₄ (1 mCi/ml, NEZ 030S, NEN, USA) wurden zugefügt und 1 Stunde bei 37°C in einem Schüttelthermostat markiert. Die Zellen wurden mit dem basalen Kulturmedium gewaschen, und die Zahl der überlebenden Zellen davon wurde unter Verwendung des Ausschlussverfahrens mit dem Trypanblau-Farbstoff gemessen. Die markierten Targetzellen wurden in dem kompletten Kulturmedium auf 5 × 104 Zellen/ml suspendiert.
Die markierten Targetzellen wurden in 0,1 ml aufgeteilt, um 5 × 10³ Zellen pro Well auf einer 96-Well-Mikroplatte mit einem Rundboden zu ergeben. 0,1 ml Reaktionszellen wurden in einem Verhältnis von Reaktionszelle:Targetzelle = 100:1 zugefügt. Danach wurden die Zellen in 5 % CO₂ bei konstanter Temperatur und 4 Stunden bei 37°C in einer Feuchtekammer kultiviert. Nachdem mehr als 3 Wells pro Experiment hergestellt wurden und die 4-ständige Kultivierung abgeschlossen war, wurden die Zellen 15 Minuten bei 500 × g zentrifugiert. Die Radioaktivität wurde in der Überstandsflüssigkeit von 0,1 ml aus jedem Well unter Verwendung eines Gammazählers (Packard, USA) gemessen. Zur Induktion der maximalen Emission wurden der Kontroll-Well-Gruppe hier 0,1 ml 5 % Triton X-100 (Sigma, USA) zugefügt. Zur Messung der natürlichen Emission wurden die markierten Zellen in dem kompletten Kulturmedium mit der gleichen Dosis kultiviert. Die Zelltoxizität wurde gemäß der folgenden Formel berechnet: Zytotoxizität (%) = (ER-SR/MR-SR) X 100

ER:: Durchschnittliche Zahl (cpm) der experimentellen Gruppe
SR:: Durchschnittliche Zahl (cpm) der in Kulturmedium kultivierten Targetzellen
MR:: Durchschnittliche Zahl (cpm) der mit 5 % Triton X-100 behandelten Targetzellen.

Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 5 ersichtlich. LAK-Zellen zeigten eine Zunahme der Zelllyse um das 8fache im Vergleich zu Nichtimmunzellen und um das 1,5fache im Vergleich zur BCG-Injektionsgruppe. Die MBT-2-Zelllinie wies eine Zunahme der Zelllyse um das 5fache im Vergleich zu Nichtimmunzellen auf. Diese Ergebnisse stellen eine Möglichkeit für CIA bei Antikrebstherapien anstelle von zu verschiedenen Nebenwirkungen führendem BCG dar.
EXPERIMENT ZUM IDENTIFIZIEREN VON ANTIKREBSAKTIVITÄT IN DER MAUS
5 × 10⁵ MBT2-Zellen (sich von C3H/He herleitende Blasenkrebszellen) wurden einer 5 – 8 Wochen alten männlichen C3H/HeJ-Maus subkutan an zwei Stellen (linke Schulter, rechter Oberschenkel) injiziert. Hierbei sollten mehrere Einstiche bei der Injektion vermieden werden, damit nur ein einzelnes Krebsgewebe herbeigeführt wird. In einer experimentellen Gruppe befanden sich 6 bis 10 der verwendeten Mäuse. Ab dem nächsten Tag nach der Injektion der Tumorzelle wurden 100 μl CIA07 (50 μg CIA02 + 500 ng CIA05) oder physiologische Kochsalzlösung in die mit der Zelllinie injizierten Stelle injiziert, und zwar 1 Woche lang jeden Tag und während der nächsten 2 Wochen alle 2 Tage. Die Größe des in der Hypodermis generierten Krebses wurde dreimal wöchentlich mit einem Kaliger gemessen. Die Ergebnisse sind in 12 ersichtlich. Es wurde gezeigt, dass das Wachstum des Krebsgewebes in der CIA05-Injektionsgruppe im Vergleich zur Gruppe, der die physiologische Kochsalzlösung injiziert wurde, inhibiert wurde.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Die Antikrebstherapie CIA07 durch Mischen von zwei sich von E. coli herleitenden erfindungsgemäßen Stoffen CIA02 und CIA05 weist eine höhere Sicherheit als die übliche Behandlung auf und minimiert die Herstellungskosten aufgrund der Einfachheit des Herstellungsverfahrens. CIA07 induziert auch eine wirksamere und spezifischere Immunisierung, was auf das Mischen der beiden Stoffe zurückzuführen ist. Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung aufgrund der physikalischen Verarbeitung von DNA billiger als CpG und ist ferner wirksamer als BCG.
Die sich von E. coli herleitende erfindungsgemäße Antikrebstherapie CIA07 ist folglich insbesondere in der industriellen Anwendung für die Antikrebstherapie und ein Immunadjuvans signifikant.

Claims

Immunregulierende Zusammensetzung, umfassend: a) bakterielle DNA-Fragmente, worin die DNA-Fragmente im Bereich von 2,0 bis 0,5 kb liegen und endotoxinfrei sind; und b) Lipopolysaccharide von E. coli, worin Lipid A der Lipopolysaccharide durch Alkalibehandlung abgebaut wird und das Molekulargewicht der Lipopolysaccharide von 5000 bis 10000 Dalton beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das Gewichtsverhältnis von a) und b) im Bereich von 500:1 bis 1:500 liegt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, worin a) und b) durch Schütteln gemischt werden.
Zusammensetzung nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Bakterien Escherichia coli oder Mycobakterien darstellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 4, worin die Bakterien Escherichia coli darstellen.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, worin der Stamm von Escherichia coli für E. coli EG0021 mit der Zugangsnummer KCCM-10374 steht.
Immunadjuvans, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 1.
Antikrebspräparat, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 1.
Präparat zur Immunaktivierung von T-Helferzellen vom Typ 1, umfassend die Zusammensetzung nach Anspruch 1.