DE60206388T2

DE60206388T2 - Drehbarer probenhalter zur abbildung einer probe

Info

Publication number: DE60206388T2
Application number: DE60206388T
Authority: DE
Inventors: Alexander James SHARPE; Ernest Paul PERRY
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 2001-05-22
Filing date: 2002-05-21
Publication date: 2006-05-11
Anticipated expiration: 2022-05-22
Also published as: JP2004531729A; EP1530073A1; ATE305623T1; HK1067412A1; US7218393B2; EP1410090B1; WO2002095476A3; WO2002095476A2; CA2445780A1; JP4308535B2; DE60206388D1; GB0112392D0; ES2294583T3; EP1530073B1; DK1530073T3; CA2445780C; US20040207840A1; PT1530073E; EP1410090A2; ES2248548T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft einen drehbaren Probenhalter zur Abbildung einer Probe sowie ein Verfahren zur Erlangung der Abbildung einer Probe. Die Erfindung betrifft insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, die optische Projektionstomografie und die dreidimensionale Mikroskopie.
Hintergrund der Erfindung
Optische Abbildungsvorrichtungen zur Erzeugung dreidimensionaler Abbildungen von Proben durch optische Projektionstomografie sind bekannt, s. z.B. US-Patent 5,680,484. Die optische Vorrichtung, die in diesem Patent des Stands der Technik offenbart ist, nimmt eine Reihe digitaler Abbildungen einer Probe aus verschiedenen Winkeln auf. Diese Abbildungen werden in einen Algorithmus eingespeist, der eine mathematische Transformation verwendet, um eine dreidimensionale Abbildung zu rekonstruieren. In der US-5,680,484 wird die Probe in einer transparenten Röhre gehalten, die an zwei Punkten gestützt wird, so dass sie im Wesentlichen horizontal ist, und die Röhre wird unter Verwendung eines Schrittmotors und eines Antriebsbands gedreht, so dass verschiedene Teile der Probe abgebildet werden können. Lichtbrechung von der Röhre beeinflusst die Signalqualität, und die Verwendung der Röhre stellt eine enge Grenze für die maximale Größe der Probe dar, die abgebildet werden kann. Die in dem Patent des Stands der Technik offenbarte Vorrichtung ist verschiedenen Beschränkungen unterworfen, die die möglichen Verwendungen dieser Abbildungstechnik beeinflussen; insbesondere ist es schwierig, die Probe in der hohlen zylindrischen Röhre zu platzieren, und schwierig, die Position der Probe einzustellen.
US-Patent 5710625 offenbart einen drehbaren Probenhalter zum Halten und Positionieren einer Probe während der Spektralanalyse, und die vorliegende Erfindung be trifft eine verbesserte Art, eine Probe in einem drehbaren Probenhalter festzuhalten und genau zu positionieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein drehbarer Probenhalter zur Verwendung beim Abbilden einer Probe aus einer Vielzahl von Richtungen zur Verfügung gestellt, wobei der drehbare Probenhalter ein Probenhaltemittel umfasst, das ein drehbares Glied aufweist, das so betätigbar ist, dass es eine abzubildende Probe um eine vertikale oder im Wesentlichen vertikale Drehachse dreht, die quer zu einer optischen Achse verläuft, entlang derer Licht von der Probe emittiert wird, wobei das Probenhaltemittel oberhalb einer stationären Abbildungskammer angeordnet ist, um die Probe aufzunehmen, die die in optisches Abbildungsfluid in der Kammer eingetaucht ist, dadurch gekennzeichnet, dass das drehbare Glied an seinem unteren Ende oder an dieses angrenzend ein magnetisches Glied für eine lösbare Befestigung der Probe durch Magnetanziehung aufweist und dass das Probenhaltemittel ein Probenpositionierungsmittel für eine genaue Positionierung der Probe bezüglich der Drehachse aufweist.
Der drehbare Probenhalter kann mit einem getrennten Mikroskop und damit zusammenhängender Hard- und Software verwendet werden, die ein dreidimensionales Abbilden von einer Probe, z.B. von einem biologischen Gewebe, ermöglichen. Indem ein Probenhaltemittel beabstandet von dem Mikroskop angeordnet wird, kann die Positionierung der Probe leicht eingestellt werden, da der Probenhalter leichter zugänglich ist. Bei einer langgestreckten Probe ist die längste Achse der Probe im Wesentlichen parallel zu der Schwerkraft, wenn diese in dem Probenhaltemittel gehalten wird. Dies ermöglicht es, die Probe an nur einem Punkt zu halten, was wiederum bei der Anordnung der Probe in dem Probenhaltemittel hilft, und vermeidet eine Ablenkung der Probe durch Auswirkungen der Schwerkraft, da eine solche Ablenkung eine unerwünschte Verzerrung der Probenform verursachen und die Genauigkeit und Auflösung des erhaltenen Bildes beeinflussen kann.
Da eine stationäre Kammer von dem drehbaren Teil des Probenhalters getrennt ist, ist die Kammerform nicht auf eine drehsymmetrische Form beschränkt. Bevorzugt weist die Kammer wenigstens eine plane Seite auf, auf die Licht auftrifft, um die Probe abzubilden. Die Verwendung einer flachen planen Seite ohne Fehler oder Wellen stellt sicher, dass die Abbildungsverzerrung aufgrund der Lichtbrechung reduziert wird. Die Kammer kann als transparenter hohler Kuboid ausgebildet und so angeordnet sein, dass zwei gegenüberliegende Seiten des Kuboids im Wesentlichen senkrecht zu der optischen Achse sind, entlang derer Licht von der Probe emittiert wird, so dass eine große Querschnittsfläche der optischen Achse dargeboten wird. Die Auswahl einer solchen Kammer mit quadratischem Querschnitt stellt sicher, dass die Menge des Lichts, das gebrochen wird, bevor es durch die Probe hindurchgeht, im Vergleich zu zylindrischen drehbaren Kammern nach dem Stand der Technik wesentlich reduziert wird und damit die Abbildungsqualität verbessert wird. Eine Wand oder Seite der Kammer kann so ausgebildet sein, dass sie Licht auf gewünschte Art bricht, z.B. um eine Vergrößerungswirkung zu erzielen.
Das Probenpositionierungsmittel kann einen Hebel umfassen, der drehbar in dem Probenhalter montiert ist und so wirkt, dass er eine befestigte Probe so schiebt, dass sie ihre Endpositionierung erreicht. Alternativ kann das Probenpositionierungsmittel zwei Elektromotoren umfassen.
Der drehbare Probenhalter kann weiterhin ein Prisma aufweisen, das so angeordnet ist, dass es Licht empfängt, nachdem Letzteres die Probe beleuchtet hat, wobei das Prisma so wirkt, dass es Licht um 90° ablenkt, um zu ermöglichen, dass das Licht von einem Mikroskop mit einer vertikalen optischen Achse empfangen werden kann. Durch Verwendung eines Prismas muss der optische Weg zu dem Mikroskop nicht gerade sein, und daher ist eine Veränderung vorhandener Mikroskope bei der Verwendung mit einem erfindungsgemäßen drehbaren Probenhalter nicht nötig.
Das drehbare Glied des Probenhaltemittels kann auf einer einstellbaren Plattform getragen werden, deren Position bezüglich der Horizontalen variabel ist. Das ermöglicht eine Einstellung der Drehachse bezüglich einer optischen Achse, so dass, wenn erforderlich, ein 90°-Winkel zwischen der optischen Achse und der Drehachse gesetzt wird. Dies ist besonders nützlich bei dreidimensionalen Abbildungen.
Die einstellbare Plattform ist bevorzugt vertikal einstellbar, um das drehbare Glied bezüglich der optischen Achse anzuheben und abzusenken, damit eine Probe in einen optischen Lichtweg oder aus diesem heraus abgesenkt werden kann.
Bevorzugt ist das drehbare Glied so ausgebildet, dass es ermöglicht, die Probe von dem unteren Ende des drehbaren Glieds aufzuhängen, frei hängen oder nach unten hängen zu lassen. Wenn eine Probe in geeigneter Weise mit einer magnetisierbaren Metallhalterung versehen ist, ist die Befestigung der Probe an dem Probenhaltemittel anschließend einfach, da sie nur auf magnetischer Anziehung und nicht auf einer komplizierten Befestigung beruht. Dies ist vorteilhaft, die die Proben typischerweise recht klein und empfindlich sind, üblicherweise mit einem Durchmesser im Bereich von 1–20 mm, und ihre Befestigung in einer Halterung mit Hilfe eines Schraubgewindes kompliziert sein kann.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Erlangung der Abbildung einer Probe vorgesehen, wobei das Verfahren umfasst: Drehen der Probe um eine vertikale oder im Wesentlichen vertikale Drehachse, die quer zu einer optischen Achse verläuft, entlang derer Licht von der Probe emittiert wird, wobei die drehende Probe in Fluid in einer stationären optischen Kammer getaucht ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe lösbar an dem drehbaren Glied durch ein magnetisches Glied an oder angrenzend an dem unteren Ende des magnetischen Glieds befestigt ist und dass die Probe bezüglich der Drehachse genau positioniert ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nun beispielartig unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:
1 eine perspektivische Ansicht der optischen Abbildungsvorrichtung ist, die einen erfindungsgemäßen drehbaren Probenhalter zusammen mit einem Mikroskop aufweist;
2 eine schematische Darstellung dessen zeigt, wie eine solche Abbildungsvorrichtung gesteuert wird, wenn digitale Abbildungen gewonnen werden;
3 eine perspektivische Vorderansicht der Vorrichtung zeigt;
4a und 4b schematische Diagramme sind, die zur Darstellung der geeignetsten Arbeitskonfiguration der Vorrichtung dient;
5a, 5b, 5c und 5d die Befestigung einer Probe an dem Probenhaltemittel und die Ausrichtung eines untersuchten Bereichs darstellt;
6a, 6b und 6c schematische Diagramme sind, die zur Erläuterung der Auflösung der Vorrichtung dienen;
7a einen Querschnitt durch eine Röhre gemäß dem Stand der Technik zeigt, die eine Probe enthält, wobei 7(b) und 7(c) zwei Probenkammern zeigen, wie sie bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden;
8a und 8b eine plane Teilansicht entlang der Linie VIII-VIII von 1 zeigen, die die Verwendung eines drehbar angebrachten Hebels zum Einstellen der Probenposition darstellt;
9 eine perspektivische Ansicht der abgewandelten erfindungsgemäßen optischen Abbildungsvorrichtung ist;
10 ein Diagramm ist, das die Vorrichtung von 9 illustriert;
11a, 11b, 11c, 12a, 12b, 13a 13b und 14 die Positionierung und Betrachtung der Probenabbildung in der Vorrichtung von 9 darstellen;
15 und 16 ein parallel gerichtetes Beleuchtungsmittel darstellt, das bei der Vorrichtung von 1 oder 9 verwendet werden kann;
17 eine Art zeigt, auf die eine Wellenlänge von einer Lichtquelle in dem optischen Probenhalter von 1 oder 9 gewählt werden kann; und
18 eine Abwandlung der in 16 gezeigten Vorrichtung darstellt.
Ausführliche Beschreibung
1 zeigt eine optische Abbildungsvorrichtung in Form eines OPT-Scanners, die einen drehbaren Probenhalter 10 und ein Mikroskop 12 für einen langen Arbeitsabstand oder eine Auflösung, das von dem drehbaren Probenhalter 10 getrennt ist, aufweist. Der drehbare Probenhalter 10 weist einen Träger 14, einen drehbar angebrachten Hebel 16, eine Irisblende und einen optischen Diffusor 20 sowie ein Quarzprisma 22 auf. Der Träger 14, die Irisblende und der Diffusor 20 und das Prisma 22 sind an einer Basis 24 des Probenhalters 10 befestigt, ebenso wie eine Halterung 25 zur Aufnahme einer transparenten Kammer 26 oder einer Küvette von insgesamt kuboider Form. Die Küvette 26 umfasst ein Fluid mit geeigneten optischen Eigenschaften für die Abbildung einer Probe 28, die in der Küvette frei hängt, wobei ein geeignetes Fluid eine Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat ist. Diese Vorrichtung kann für Hellfeld-, Dunkelfeld- und fluoreszente Abbildungen verwendet werden, ist jedoch besonders geeignete, wenn ein dreidimensionales (3D)-Bild der Probe aus einer Reihe von Abbildungen erzeugt wird, die aus verschiedenen Winkeln aufgenommen wurde, sowie für Proben, die für eine Abbildung durch konfokale Mikroskopie zu groß sind.
Licht fällt entlang der optischen Achse 29, gelangt durch den Mittelpunkt der Irisblende und des Diffusors 20 und durch die Probe 28 und wird in rechten Winkeln durch das Prisma 22 abgelenkt, so dass es in ein Objektiv 30 des Mikroskops 12 eintritt. Da das Mikroskop einen großen Arbeitsabstand hat, steht genug Raum zur Verfügung, damit das Prisma 22 unter dem Mikroskopobjektiv 30 ruhen kann. Die Verwendung eines Prismas ermöglicht es, dass ein vertikal ausgerichtetes Mikroskop die Probe abbildet. Das Prisma 22 kann jedoch weggelassen werden, wenn das Mikroskopobjektiv parallel zu der optischen Achse ist. Die Irisblende und der Diffusor 20 steuern die Menge an Licht, die von einer Lichtquelle (nicht gezeigt) ausgeht, die Probe 28 erreicht und eine gleichmäßige Beleuchtung bietet.
Der Träger 14 trägt eine kreisförmige Bosse, auf der um eine Achse 90 (4) eine Kippplatte 33 drehbar angebracht ist, auf der eine Platte 32 nach oben und unten ver schiebbar ist. Die Platte 32 trägt eine einstellbare Plattform 34 horizontal von der Platte 32 frei tragend. Der Winkel der Plattform 34 kann bezüglich der Horizontalen geändert werden, wobei eine Kippeinstelleinrichtung 36 verwendet wird, und die vertikale Position der Plattform 34 kann durch eine Vertikaleinstelleinrichtung 40 variiert werden. Ein Schrittmotor 42 ist an der Plattform 34 angebracht, wobei eine drehbare Motorwelle 44 des Motors sich durch die Plattform 34 erstreckt. Ein Magnet 46 (ein Dauermagnet oder ein Elektromagnet) ist an dem unteren Ende der Welle 44 angebracht und trägt die abzubildende Probe 28. Die Art, mit der die Probe an dem Magneten angebracht ist, wird weiter unten unter Bezugnahme auf 5 beschrieben. Der Schrittmotor 42 dreht die Welle 44 mit einer Schrittgröße von 0,9 Grad, wodurch 400 Abbildungspositionen der Probe zur Verfügung gestellt werden. Eine Reihe von digitalen Abbildungen der langgestreckten Probe 28 wird genommen, indem die Welle 44 zu ihren aufeinander folgenden Drehpositionen weitergerückt wird und so die Probe in aufeinander folgenden Drehpositionen positioniert wird, während die Probe in der Küvette 26 frei hängt, wobei die Küvette stationär bleibt.
Indem der Schrittmotor 42 mit seiner Drehachse vertikal angebracht wird, braucht die stabartige Probe 28 nur an einem Punkt befestigt zu werden, typischerweise an ihrem obersten Ende, damit eine gesteuerte Drehung der Probe entsteht. Die Probe 28 wird in die Flüssigkeit eingetaucht und von oben durch den Magneten 46 gehalten, indem die Vertikaleinstelleinrichtung 40 verwendet wird, um die Plattform zu senken. Mit dieser vertikalen Ausrichtung der Probe und der Drehachse wird die Verwendung von O-Ringen oder anderen mechanischen Einrichtungen vermieden, die nötig wären, um den trockenen Motor mit der eingetauchten Probe zu verbinden, und wird zweitens sichergestellt, dass die Probe nicht durch die Schwerkraft von ihrer Drehachse abgelenkt wird, da die Hauptachse der langgestreckten Probe parallel zu der Schwerkraft ist. Die Vermeidung von Verzerrungswirkungen an der Probe durch vertikale Ausrichtung der Probe ist besonders wichtig für die Erlangung von genauen 3D-Abbildungen, insbesondere bei größeren Proben. Die Verwendung eines insgesamt aufrechten hohlen Kuboids als Abbildungskammer 26 um die Probe 28 gewährleistet, dass die Oberfläche der Abbildungsflüssigkeit begrenzt ist, wodurch die Verdampfung der Flüssigkeit reduziert wird. Darüber hinaus können weit größere Proben, typischerweise mit einem Durchmesser von 1–20 mm, abgebildet werden, indem eine solche feste Kammer verwendet wird, ohne Verluste bei der Qualität des digitalen Signals.
Im Betrieb wird eine digitale Kamera 52 (2) an dem Mikroskop 12 angebracht und erzeugt eine digitale Abbildung der Probe, wie sie von dem Mikroskop aus Licht abgebildet wird, das die optische Achse 29 entlang gefallen ist und durch die Kammer und die Probe hindurchgelassen wurde. Eine Reihe von digitalen Abbildungen von der Probe wird aus unterschiedlichen Winkeln aufgenommen, und diese digitale Information wird in einen Algorithmus eingespeist, der eine mathematische Formel benutzt, um die Struktur der Probe in drei Dimensionen zu rekonstruieren. Typischerweise werden die Abbildungen erlangt, indem die in 2 dargestellten Steuerungselemente verwendet werden. So steht ein Rechner 50, der mit Software zur Erzeugung digitaler Abbildungen versehen ist, in Zwei-Wege-Kommunikation mit der digitalen Kamera 52, die an dem Mikroskop 12 angebracht ist, das Abbildungen von einer untersuchten Probe empfängt. Der Rechner 50 steuert Filterrevolver 56, die an dem Mikroskop 12 angebracht sind, um die Wellenlänge der erfassten Strahlung zu ändern. Die Rechner-Erzeugungssoftware ist diagrammartig in 2 als Software 58, die die Bilderzeugung von der digitalen Kamera steuert, als Programm 54 zur Steuerung der Abbildungssoftware, des drehbaren Probenhalters und der Filterrevolversoftware, als Software 48 zur Steuerung der Filterrevolver und als Software 64 zur Umwandlung der Bilddateien zu einer 3D-Rekonstruktion gezeigt. Der Rechner steht auch in Zwei-Wege-Kommunikation mit elektronischen Steuerungsschaltkreisen 60, die mit dem drehbaren Probenhalter 10 verbunden sind, und steuert die Schaltkreise 60, um die Ausrichtung der Probe wie erforderlich während der Abbildungserzeugung aufeinander folgender Abbildungen einzustellen. Sobald die digitalen Abbildungen erzielt sind, werden sie bei 64 verarbeitet, um eine 3D-Rekonstruktion 66 der Probe zu erzeugen, unter Verwendung mathematischer Verarbeitung ähnlich wie bei der in der US-5,680,484 beschriebenen Analyse.
Falls erforderlich kann der Rechner den gesamten Abbildungsvorgang steuern, wobei er eine Bildverarbeitung vornimmt, um die Größe der Probe, ihre Ausrichtung, ob sie sich im Brennpunkt befindet usw. zu bestimmen, und die Probenposition einstellt, bevor die Drehungs-Abbildung durchgeführt wird. Diese vollständige Automatisierung des Abbildungsvorgangs ist besonders wünschenswert für großformatige Genausprägungs-Kartierungsprojekte, bei denen viele solcher Vorrichtungen parallel betrieben werden können.
Der Schaltkreis 60, der auf den Rechner anspricht, um den Schrittmotor 42 zu steuern, ist im Handel für die meisten beliebten Rechnersysteme erhältlich. Der Schaltkreis 60 ist mit dem Rechner 50 verbunden und reagiert auf Signale von dem Rechner 50, um eine Vielzahl von mechanischen Vorrichtungen (Schrittmotoren, Solenoide usw.) zu steuern.
Um eine 3D-Darstellung der Probe zu erzeugen, führt die Software die folgenden Funktionen aus: (1) bestimmen der Drehachse (durch die Symmetrie, die zwischen jedem Paar von Abbildungen besteht, die mit 180 Grad zueinander aufgenommen wurden), (2) Reorganisation des Stapels von Abbildungen zu einem rechtwinkligen Stapel von Projektionsabbildungen (wobei eine Abbildung einen einzelnen Schnitt durch die Probe repräsentiert, gesehen von allen unterschiedlichen abgebildeten Winkeln), (3) Durchführung der mathematischen Verarbeitung an jeder Projektionsabbildung, um den Schnitt durch die Probe wiederherzustellen, (4), Kombinieren aller berechneten Schnittabbildungen zu einem 3D-Format. Rekonstruktionen können sowohl von übertragenem Licht als auch von fluoreszent emittiertem Licht erzeugt werden.
Nachdem die Vorrichtung insgesamt und ihre Verwendung bei der Datenerfassung beschrieben wurden, werden bestimmte Komponenten der Abbildungsvorrichtung eingehender beschrieben.
Eine Vorderansicht des drehbaren Probenhalters 10 ist in 3 gezeigt. Die Kippeinstelleinrichtung 36 variiert den Kippwinkel der Plattform 34 um die Achse 90, die sich unterhalb des unteren Endes der Welle 44 und ungefähr auf der Höhe der Probe befindet, so dass die Kippeinstellung die Probe nicht wesentlich bewegt. Die Achse 90 kann die optische Achse 29 schneiden. Die Kippeinstellung (dargestellt durch den zweiköpfigen Pfeil 92 in 3) gewährleistet, dass die Drehachse 94 des Schrittmotors 42 genau senkrecht zu der optischen Achse 29 ist. Nachdem der Kippwinkel der Plattform 34 eingestellt wurde, wird die Position der Plattform 34 bezüglich der Basis 24 eingestellt, wobei die Vertikaleinstelleinrichtung 40 verwendet wird, die eine Zahnstangenanordnung benutzt, um die Plattform 34 in der eingestellten Richtung der Drehachse 94 anzuheben und abzusenken. Durch Verwendung der Vertikaleinstelleinrichtung 40 kann eine Probe, die an dem Magneten gehalten wird, der an dem Ende der Welle 44 angebracht ist, zum Abbilden um eine erforderliche Tiefe in die Abbildungskammer abgesenkt und aus der Kammer angehoben werden, sobald das Abbilden durchgeführt wurde. Die vertikale Position der Probe während des Abbildens kann auch so geändert werden, falls erforderlich. In der angehobenen Position der Welle können Proben in den drehbaren Probenhalter gegeben oder aus ihm herausgenommen werden.
Wenn die Vorrichtung eingerichtet wird, wird sie so ausgerichtet, dass die optische Achse des Mikroskops durch das Prisma und durch den Mittelpunkt der Abbildungskammer hindurchgeht. Bei starker Vergrößerung kann jedoch die Ausrichtung einer Einstellung bedürfen, da die Probe etwas aus dem Mittelpunkt des Sichtfelds heraus verschoben wird. Der oben genannte Anhebe-/Absenkmechanismus kann so eingestellt werden, dass er diese Fehlausrichtung in vertikaler Richtung korrigiert.
Während viele Abbildungen der Probe gemacht werden können, indem die Drehachse ungefähr senkrecht zu der optischen Achse ist, ist eine 3D-Rekonstruktion der Probe unter Verwendung der mathematischen Verarbeitung von sehr schlechter Qualität, wenn der Winkel zwischen der optischen Achse und der Drehachse nicht genau 90° beträgt. Die Kippeinstelleinrichtung 36 ermöglicht es, die Drehachse 94 leicht zu kippen, um zu gewährleisten, dass der Winkel genau 90° beträgt. Die Kippeinstelleinrichtung 36 beruht typischerweise auf einem Schraubgewindemechanismus, um die Plattform 34 auf eine Seite zu zwingen. Eine Kalibrierungsprobe wird benutzt, um den Kippwinkel einzustellen, wobei die Kalibrierungsprobe mehrere kleine Teilchen enthält, deren Trajektorien auf einem Rechnerbildschirm beobachtet werden können, während die Welle dreht. Wenn die Drehachse nicht genau senkrecht zu der optischen Achse ist, erscheint die Trajektorie des Teilchens als Ellipse, s. 4a, die die Ansicht entlang der optischen Achse zeigt, wenn die Welle um die Achse 94 dreht. Wenn die Achse richtig ausgerichtet ist, ist zu beobachten, dass sich das Teilchen von einer Site zur anderen bewegt, ohne vertikale Komponente der Bewegung, s. 4b.
5 zeigt das verwendete magnetische Befestigungssystem, das auf magnetischer Anziehung zwischen einer Metallscheibe 110, die an einer Probe 112 befestigt ist, und dem zylindrischen Magneten 46 beruht, der dauerhaft an dem unteren Ende der drehbaren Welle 44 des Schrittmotors 42 angebracht ist. Jede Probe weist eine kleine magnetisierbare Metallscheibe auf, die während der Probenpräparation an einem Ende an geklebt wird. Die Scheibe wird anschließend an dem Magneten befestigt, wenn ein Abbilden erfolgen soll, und die Probe wird aufgrund der magnetischen Anziehung zwischen der Scheibe und dem Magneten gehalten. Da die Scheibe 110 und die Probe 112 relativ leicht sind, braucht der Magnet nicht stark magnetisiert zu werden, um ihr Gewicht zu halten. Ein Vorteil des Magnetsystems z.B. gegenüber einem Festschraubsystem liegt darin, dass die kleine Größe der Scheibe und der Probe mit einer Pinzette angefasst werden müssen. Das Platzieren der Halterung oder Scheibe 110 an einem Magneten ist mit einer Pinzette einfach, das Einschrauben in eine Halterung dagegen nicht. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass die Position der Probe bezüglich der Drehachse ohne weiteres eingestellt werden kann, indem die Halterung 110 über die Magnetoberfläche 120 geschoben wird. Außerdem können viele Proben mit daran angebrachter Scheibe vor-vorbereitet werden und anschließend schnell zum Abbilden in die Vorrichtung eingesetzt, wenn es erforderlich ist.
Bestimmte Flüssigkeiten, die in der Kammer für die Probenabbildung verwendet werden, sind toxisch und korrnosiv gegenüber Kunststoff, und wo dies der Fall ist, werden die Proben am besten mit einer Pinzette angefasst. Das magnetische Befestigungssytem ist dann vorteilhaft, das die Proben nur unter den Magnet gehalten werden müssen, um sicher befestigt zu werden. Es ist ebenso leicht, jede Probe nach dem Abbilden zu entfernen.
Um die Auflösung der Abbildungen zu maximieren, muss ein untersuchter Bereich 122 einer Probe 112 an der Drehachse 94 zentriert sein, d.h. er darf sich nicht bewegen, wenn die Welle dreht. Wenn der untersuchte Bereich oder die gesamte Probe nicht zentriert ist und während der drehenden Aufnahme einer Abbildung von einer Seite zur anderen oszilliert, ist eine geringere Vergrößerung notwendig, um ihn im Sichtfeld zu halten. Dies ist in 6a dargestellt. Die beiden Formen 130, 132 repräsentieren die Probe 112 während der Drehung an ihrer äußersten linken und rechten Position. Wenn die Probe 112 perfekt zentriert ist, rotiert sie um ihre eigene Achse, s. 6b. Dies präsentiert eine geringere Breite über das Sichtfeld, und daher kann die Vergrößerung verstärkt werden, um eine Abbildung mit höherer Auflösung zu bieten, s. 6c.
Eine Einstellung der Probe 112 bezüglich der Drehachse 94 wird durch die magnetische Befestigung vereinfacht. Durch Drücken auf die Scheibe 110 kann der Mittelpunkt der Scheibe bezüglich der Drehachse 94 verschoben werden. In 5a ist der untersuchte Bereich 122 der Probe 112 nicht an der Drehachse zentriert, sondern ist nach links verschoben. Wenn die Motorwelle um 180° gedreht wird, ist der untersuchte Bereich 122 nun auf der rechten Seite der Drehachse zu sehen, s. 5b. Da der Magnet 46 es der Metallhalterung 110 ermöglicht, in eine beliebige Richtung verschoben zu werden, ohne dass sich die Befestigung löst, kann ein Druck von der Seite durch den Hebel 16 (gezeigt durch den Pfeil 114 in 5c) die Probe so positionieren, dass der untersuchte Bereich 122 an der Drehachse zentriert wird, s. 5c. Eine weitere Drehung um 180° zeigt, dass nun die gesamte Probe 112 von einer Seite zur anderen oszilliert, während der untersuchte Bereich zentriert bleibt, s. 5d. Eine solche Einstellung der Probe wird üblicherweise durchgeführt, während Abbildungen der drehenden Probe auf einem Rechnerbildschirm beobachtet werden.
Die Abbildungskammer 26, wie in 1 gezeigt, wird nun eingehender unter Bezugnahme auf 7 beschrieben. Durch die befestigte Probenkammer, die während des Abbildens nicht mit der Probe dreht, muss die Kammer nicht zylindrisch sein, um einen konstanten optischen Weg während der Drehung aufrechtzuerhalten, wie bei dem in der US-5,680,484 beschriebenen System. Ein Vergleich zwischen der Röhre 136 gemäß dem Stand der Technik und der bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Kammer ist in 7 gezeigt, wobei 7a einen Querschnitt durch die zylindrischen Röhre 136 nach dem Stand der Technik zeigt (die horizontal frei hängt) und 7b die Kammer 26 zeigt, die die bei der vorliegenden Ausführungsform verwendet wird. Die Abbildungskammer 26 ist so gewählt, dass sie im Wesentlichen Kuboid und in der Querschnittsform quadratisch ist, und ist aus Quarz, Glas oder einem anderen in geeigneter Weise transparenten Material hergestellt. Jede Kammer/Röhre enthält eine Probe 141, die in Flüssigkeit 143 eingetaucht ist, die geeignete optische Eigenschaften hat, um ein Abbilden der Probe zu ermöglichen. Die flachen Seiten 142, 142', 144, 144' der Kammer 26 reduzieren die Brechungsverzerrung der Abbildung und ermöglichen ein Abbilden größerer Proben. Das liegt daran, dass die zueinander parallelen Wände 142, 142' der Kammer mit quadratischem Querschnitt senkrecht zu der optischen Achse 29 ausgerichtet sind und einen größeren Abbildungsbereich zur Verfügung stellen, in dem keine Brechung des Lichts auftritt, als bei der kreisförmigen Röh re 136, bei der nur ein sehr kleiner Teil ihres Umfangs einen senkrechten Lichteinfallswinkel aufweist. So kann eine gute Abbildung über eine Breite von mehr als 10 mm für die Kammer 26 gebildet werden, wodurch die von der Probe empfangene Signalmenge verbessert und die Brechungsverzerrung reduziert wird.
7c stellt eine Abwandlung der Probenkammer von 7b dar. In 7c hat die Probenkammer 26' einen quadratischen Innenquerschnitt, jedoch ist eine Wand 140 so ausgebildet, dass sie eine plankonvexe Linse bildet, um das aus der Kammer austretende Licht zu brechen. Diese Form verursacht eine gewünschte Brechung, im Fall von 7c eine Vergrößerungswirkung.
Der in 1 gezeigte Hebel 16 wird nun unter Bezugnahme auf 8 eingehender beschrieben, die eine plane Ansicht entlang der Linie VIII-VIII von 1 zeigt. 8a zeigt den Hebel 16 in seiner üblichen Position, von dem Magneten 46 und der Metall-Probenhalterung 110 weggeschoben. Wenn die Probe zu weit auf eine Seite verschoben wird (wie dargestellt), kann der Hebel 16 um ein Drehgelenk 164 bewegt werden, so dass der Zapfen 166 mit der Metallhalterung 110 eingreift, um die probe in die richtige Position zu schieben (8b). Dies geschieht, während die Probenposition auf dem Rechnerbildschirm beobachtet wird. Da der Schrittmotor durch handbetriebene Schalter sorgfältig gesteuert werden kann, kann die Trajektorie der Probe während der Drehung beobachtet und der Motor angehalten werden, wenn sich die Probe so weit wie möglich auf einer Seite befindet. Die Probe wird anschließend unter Verwendung des Hebels 16 zentriert, und das Verfahren wird wiederholt, bis das Fluchten der Probe mit der optischen Achse vervollständigt ist. Der Hebel 16 ist dafür vorgesehen, eine Bewegung der Probe „in einem niedrigeren Gang" zu bewirken, wodurch eine Steuerung der Einstellung erleichtert wird.
Das Drehgelenk 164 ist an der Hauptmotorstufe angebracht. Es ist an der Stufe durch eine Halterung befestigt, die sicherstellt, dass der Zapfen 166 in der richtigen Höhe ist, um mit der Metallhalterung in Kontakt zu stehen, gerade unterhalb des Magneten. Auf diese Art bleibt der Zapfen 166 in der richtigen Höhe, gleichgültig, welche Höhe zum Abbilden der Probe gewählt wurde.
Die hier beschriebene Vorrichtung ist für 3D-Mikroskopie und auch für Dreh-Mikroskopie für einen beliebigen Zweck an biologischen Proben und Proben aus anderen Bereichen wie der Werkstoffwissenschaft geeignet.
Wenn 3D-Mikroskopie durchgeführt wird, sollte der Brechungsindex an der ganzen Probe gleich sein. Bei biologischem Gewebe wird dies leicht erreicht, indem das Gewebe in eine Klärungslösung getaucht wird. Eine Probe kann direkt an die Metallhalterung geklebt oder in einen Block aus transparenter Matrix wie z.B. Agarose eingebettet werden, die selbst an der Halterung haftet. Die Klärungslösung durchdringt dann die Blöcke und die Probe. BABB (eine Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat) ist als Lösungsmittel geeignet.
Bei einer Probe, deren Brechungsindex nicht vereinheitlicht werden kann oder die nicht transparent ist, ist diese Technik noch immer nützlich. Die 3D-Oberflächenform von Objekten, deren Querschnitte alle konvex sind (sogar wenn die gesamte 3D-Form nicht konvex ist), kann genau aus ihrer drehenden Silhouette rekonstruiert werden.
Es gibt einige Anwendungen, bei denen die Ursprungsdaten der Vorrichtung nützlich sind. Die Reihe der Abbildungen kann in einen Film des drehenden Objekts (d.h. der Probe) umgewandelt werden. Es ist viel leichter, die Form eines 3D-Objekts zu erfassen, wenn es drehend gezeigt wird, als aus einigen statischen 2D-Bildern (viele 3D-Rekonstruktionsprojekte präsentieren ihre Ergebnisse als Filme eines drehenden Modells).
Die Vorrichtung ist auch geeignet, um eine 3D-Kartierung von Genausprägungsmustern (RNS und/oder Proteinverteilung) in biologischem Gewebe vorzunehmen, während sie ermöglicht, dass die Probe nach dem Abbilden für weitere Analysen verwendet wird. Probenabbildung unter Verwendung der Vorrichtung ist relativ schnell, sie benötigt etwa 20 Minuten. Im Gegensatz dazu dauert das Vorbereiten, Einbetten, Unterteilen, Anbringen, Einfärben und Digitalisieren echter histologischer Schnitte Tage und erzeugt Hunderte von digitalen 2D-Schnitten, aber keine garantierte Art, diese zusammenzusetzen, um die ursprüngliche 3D-Form zu rekonstruieren. Die histologischen Schnitte neigen dazu, sich wesentlich zu strecken, so dass sogar, wenn alle Schnitte aneinander passen, so dass sie eine 3D-Form bilden, das Endergebnis die Form der ursprünglichen Probe nicht genau wiedergibt. Die Ergebnisse, die unter Verwendung der Vorrichtung erzielt wurden, sind der echten physischen Form der Probe sehr ähnlich, wobei der einzige Unterschied zu physischen Schnitten in der reduzierten Auflösung besteht. Da die von der Vorrichtung erzeugten Daten echt 3D sind, können virtuelle Schnitte in jeder Richtung vorgenommen werden, oder sie können in 3D wiedergegeben werden.
Eine abgewandelte Konstruktion des drehbaren Probenhalters ist in 9 dargestellt, wo Teile, die denen aus 1 entsprechen, dieselben Bezugszeichen haben. Bei dem drehbaren Probenhalter von 9 wird eine dreidimensionale Einstellung der Position des Schrittmotors 42 erreicht, indem drei sekundäre Schrittmotoren 150, 152, 154 verwendet werden. Eine Kippeinstelleinrichtung für den Motor 42 ist nicht vorhanden. Stattdessen kann das Prisma durch gesteuertes Kippen um eine horizontale Querachse 23 manuell eingestellt werden. Die wichtigen Schrittmotoren sind die Motoren 150 und 154. Der Motor 152 kann durch eine handbetriebene Vertikaleinstelleinrichtung 40 ersetzt werden.
Die sekundären Schrittmotoren 150, 152, 154 ermöglichen eine Einstellung der 3D-Position des primären Schrittmotors 42 entlang der Ausrichtungen, die mit x, y und z gekennzeichnet sind, mit einer Genauigkeit im Bereich unterhalb eines Mikrometers. Diese Schrittmotoren 150, 152, 154 werden von demselben Rechner gesteuert, der den primären Motor 42 steuert. Dies ist in 10 dargestellt, wo der Rechner 50 die vier Motoren durch Motorantriebsschaltkreise 156 antreibt. Im Rahmen dieses Dokuments wird die z-Achse als parallel zu der optischen Achse 29 betrachtet. Bewegungen entlang dieser Achse verändern wirksam den Fokus des Systems. Bewegungen entlang der anderen beiden Achsen bewirken eine Änderung dessen, welcher Teil der Probe mit dem Zentrum der optischen Achse 29 zusammenfällt.
Die rechnergesteuerte Übersetzung durch die drei sekundären Motoren 150, 152, 154 hat die folgenden Vorteile:

1) Sie ermöglicht es, den untersuchten Bereich (UB) der Probe zentral in dem Sichtfeld des Mikroskops zu halten. Dies wird auf zwei Arten erreicht:
a) Der UB wird innerhalb der Schärfentiefe des Mikroskops gehalten.
b) Sie begrenzt sie Oszillationsbewegungen des UB „von einer Seite zur anderen" entlang der x-Achse. Diese beiden Vorteile ermöglichen ein Abbilden mit weit höherer Auflösung im Vergleich zu einem System, das keinen solchen Mechanismus aufweist.
2) Sie ist genauer als das Hebel-und-Zapfen-System von 1 und 8.
3) Sie kann vollständig durch den Rechner gesteuert werden (im Gegensatz zu dem Hebel-und-Zapfen-System), so dass der UB leicht „auf dem Bildschirm" innerhalb der Software definiert werden kann.
4) Sie ermöglicht es dem Rechner, genaue 3D-Koordinaten für den UB zu berechnen.
5) Sie ermöglicht es, dass unterschiedliche Scans derselben Probe im 3D-Raum zueinander in Beziehung stehen.
6) Dies ermöglicht es dem Rechner, aus einer Vielzahl von automatischen Scans kleinerer Bereiche bei stärkerer Vergrößerung einen hochauflösenden Scan einer großen Probe aufzubauen (genannt „Tiling" (Stückeln) oder „Patching" (Flicken).

Rechnergesteuerte x- und z-Bewegungen zum Halten des UB innerhalb des Sichtfelds werden wie folgt berechnet:
Zuerst muss die Software die Positionen

a) der Drehachse des primären Schrittmotors 42 bezüglich des Sichtfelds
b) des UB bezüglich der Drehachse des primären Schrittmotors

Diese beiden Positionen können durch einen Vorgang berechnet werden. Die Vergrößerung wird gering genug gesetzt, so dass während einer vollen Drehung der UB innerhalb des Sichtfelds der Kamera bleibt. Das System wird vorher geeicht, so dass bekannt ist, wie viele Impulse des x-Schrittmotors einer gegebenen Verschiebung auf dem Rechnerbildschirm, gemessen in Pixeln, entsprechen. Dieses Verhältnis wird für jede Vergrößerung bestimmt. Der Rechner präsentiert dem Nutzer anschließend vier Abbildungen der Probe, gedreht um 0, 90, 180 und 270° (wie in 11a bis 11c gezeigt). In 11a stellt jedes äußere Rechteck das Abbildungsfenster auf dem Rechnerbildschirm dar, und der Punkt stellt den untersuchten Bereich 122 der Probe dar.
11b zeigt Ansichten entlang der optischen Achse (wie auf dem Rechnerbildschirm zu sehen) bei geringer Vergrößerung, und 11c zeigt plane Ansichten entlang der Drehachse 94. Der Nutzer verwendet dann die Rechnermaus (oder ein Äquivalent) um anzuzeigen, wo der UB bei jeder Abbildung liegt.
12 zeigt, wie das Positionierungssystem den Schrittmotor 42 sowohl in der x- als auch in der z-Dimension bewegen kann und daher eine mangelnde Zentrierung des UB ausgleichen kann. Die x- und z-Bewegungen des Motors 42 werden von dem Rechner gesteuert, um sicherzustellen, dass der UB 122 in einer festen Position bleibt und um eine effektive Drehachse dreht.
In 11a, 11b und 11c ist:
χ1 = die x-Position des UB bei 0 Grad, umgerechnet in Schrittmotoreinheiten.
χ2 = die x-Position des UB bei 180 Grad, umgerechnet in Schrittmotoreinheiten.
χw = die Breite des Abbildungsfensters, umgerechnet in Schrittmotoreinheiten.
Das durchschnittliche χ1 und χ2 bildet die Position (χs) der Drehachse des Schrittmotors bezüglich des Abbildungsfensters (χs). Der Durchschnitt von Z1 und Z2 bildet eine zweite Schätzung dieser Position (χs = (χ1 + χ2 + Z1 + Z2)/4). Die x-Verschiebung, die nötig wäre, um die Drehachse des Schrittmotors in dem Abbildungsfenster zu zentrieren, ist: x-Verschiebung (χd) = χw/2 – (χ1 + χ2 + Z1 + Z2)/4.
Dies ist in 13a und 13b dargestellt.
In 13a und 13b sieht das Mikroskop die Probe von der Unterseite des Diagramms. Die Ränder des Sichtfelds erscheinen deshalb als zwei im Wesentlichen parallele Linien, die die Grenze dessen markieren, was sichtbar ist. Die optische Achse, die das Zentrum dieses Sichtfelds ist, ist als vertikale gestrichelte Linie in 13a dargestellt.
13b zeigt die Probe an einer Drehposition von 0 Grad (α = 0). Aus den oben beschriebenen Maßen (χ1, χ2, Z1, Z2) kann der x- und der z-Abstand des UB von der Drehachse des primären Schrittmotors leicht berechnet werden. χαo ist der χ-Abstand, wenn die Drehposition (Winkel α) Null ist (χαo = χ1 – χ2)/2). Ähnlich kann Zαo aus den zwei Maßen berechnet werden, die bei α = 90 Grad und α = 270 Grad genommen werden (Zαo = (Z1 – Z2)/2). Die Position des UB kann dann von kartesischen Koordinaten in Polarkoordinaten umgerechnet werden, wobei D der Abstand des UB von der Schrittmotorachse ist und θ der Winkel dieser Linie zu der optischen Achse (oder einer Linie parallel dazu) ist, wobei α = 0 Grad. D = Quadratwurzel von (χαo2 + Zαo2)θ = tan–1(χαo/Zαo)
Für eine beliebige Drehposition des primären Schrittmotors (α) kann der UB durch Bewegungen der sekundären x-z-Schrittmotoren an der optischen Achse positioniert werden, wobei die Gesamtverschiebungen (Xt und Zt) wie folgt berechnet werden: χt = χd + D·sin(α + θ),undZt = D·cos(α + θ).
Die 3D-Form des Bereichs, der bei einer OPT-Rekonstruktion abgetastet wird, ist im Wesentlichen ein Zylinder mit kreisförmigem Querschnitt, dessen Drehsymmetrieachse die effektive Drehachse ist, die während des Abbildens verwendet wird, und dessen Durchmesser und Länge von der Breite und Höhe des Sichtfelds beschrieben werden. Da ein Alternieren zwischen kartesischen und polaren Koordinaten möglich ist, um Stellen der Probe zu beschreiben, und da die Größe der Pixel mit echten Abständen an der Probe in Verbindung gesetzt werden können, können Position und Form des abgetasteten Zylinders bezüglich anderer Scans, die von derselben Probe gemacht wurden, leicht berechnet werden.
Bei einer 2D-Abbildung wird oft eine hoch auflösende Abbildung konstruiert, indem viele stark vergrößerte Abbildungen kleiner Bereiche des Objekts gemacht werden und anschließend die kleineren Abbildungen zusammengesetzt werden. Dies ist oft als „Tiling" (Stückeln) oder „Patching" (Flicken) bekannt. Der rechnergesteuerte XYZ-Probenhalter ermöglicht es, denselben Ansatz auf eine 3D-OPT-Abbildung anzuwenden.
Wie oben beschrieben ist der abgetastete Bereich von einem OPT-Scan ein Zylinder mit kreisförmigem Querschnitt. 14 zeigt, in planer Ansicht die Achse 94 hinunter gesehen, wie eine Probe 160 in einem Scanvorgang 162 bei geringer Auflösung abgebildet werden kann oder wahlweise abgebildet werden kann, indem sieben hoch auflösende Scans 170 so positioniert werden, dass jede Stelle an der Probe in wenigstens einem abgetasteten Bereich enthalten ist. Da die einzelnen Probenbereiche einen kreisförmigen Querschnitt haben, besteht eine effiziente Anordnung zum Abdecken eines großen Bereichs darin, die Scans in einem sechseckigen Muster anzuordnen, wobei sich angrenzende Scans leicht überlappen. Verschiedene Stellen entlang der y-Achse der Probe können ebenfalls abgetastet werden, indem der y-Achsen-Schrittmotor verwendet wird.
Dieses Stückelungsverfahren kann vollständig durch den Rechner gesteuert und durchgeführt werden.
Für alle Proben, die in ihrer Gesamtheit mit einem Scanvorgang abgebildet werden sollen, kann die Berechnung der Position des optimalen abgetasteten Bereichs automatisch durchgeführt werden, ohne dass der Nutzer den UB wie zuvor beschrieben definieren muss. Durch einfache Bildverarbeitung kann der Umriss oder der Mittelpunkt der Probe in Testbildern während des Ausrichtungsverfahrens wie folgt gefunden werden:

1) Vergrößerung gering setzen (kann automatisch unter Verwendung eines rechnergesteuerten Mikroskops geschehen).
2) Aufnehmen von vier Abbildungen bei 0, 90, 180 und 270 Grad Drehung.
3) Berechnen eines Histogramms jeder Abbildung zur Bestimmung eines geeigneten Schwellenwerts zur Unterscheidung der Probe vom Hintergrund.
4) Berechnen der Position des Massenmittelpunkts der Probe in jeder Abbildung.
5) Verwenden dieser Positionen als UB-Messungen wie zuvor beschrieben.
6) Anwenden der neuen Verschiebungen bei nachfolgenden Drehungen.
7) Vergrößerung verstärken.
8) Aufnehmen von vier gedrehten Abbildungen und bestimmen, ob die Vergrößerung zu stark ist (d.h. ob die Ränder der Probe außerhalb des Sichtfelds liegen).
9) Wenn die Probe noch im Sichtfeld ist, zurückgehen zu Schritt 4.
10) Wenn die Ränder der Probe außerhalb des Sichtfelds liegen, Vergrößerung auf vorherigen Wert reduzieren.
11) Probe scannen.

Ein parallel gerichtetes Beleuchtungsmittel, das bei dem drehbaren Probenhalter von 1 oder 9 verwendet werden kann, ist in 15 und 16 dargestellt.
Eine Laser- oder andere Lichtquelle 172 wird zusammen mit einem Fokussierungsmittel (entweder Brechungslinsen 174 oder reflektierende Spiegel) verwendet, um ein Lichtstrahlbündel 176 zu erzeugen, bei dem alle Lichtstrahlen im Wesentlichen parallel zu der optischen Achse sind. 15 zeigt diese Einrichtung im Verhältnis zu dem Rest des drehbaren Probenhalters, der bei diesem Beispiel zwei Schrittmotoren 150, 154 für eine rechnergesteuerte Einstellung in der x- bzw. z-Richtung aufweist. Die vertikale Einstellung wird manuell durch die Vertikaleinstelleinrichtung 40 bewirkt. Die Linse 22 kann eine Kippeinstellung um die Achse 23 bewirken.
Experimente haben deutlich gezeigt, dass Beleuchtungslicht, das nicht-parallel zu der optischen Achse in die Probe eintritt, Störungen in die Ergebnisse bringt. Eine parallel gerichtete Lichtquelle, bei der alle beleuchtenden Lichtstrahlen parallel zu der optischen Achse sind, reduziert dieses Problem und erhöht daher die Qualität der Abbildung.
In 17 ist gezeigt, dass ein Wellenlängefilter 178 an einer Position zwischen der Lichtquelle 180 und der Probe 28 platziert ist. Dieser kann entweder aus einer Reihe verschiedener Filter bestehen, von denen jeder die Übertragung verschiedener Bereiche von Wellenlängen ermöglicht und die manuell oder automatisch in dem Lichtweg positioniert werden können. Oder er kann ein elektronisch einstellbarer Filter sein.
Alternativ können zwei elektronisch einstellbare Flüssigkristallfilter für eine fluoreszente Abbildung verwendet werden, um die Wellenlängen sowohl des Beleuchtungslichts als auch des erfassten Lichts zu begrenzen, wobei diese Möglichkeit von dem zweiten elektrisch gesteuerten Filter 182 dargestellt wird, der vor einer 2D-Anordnung von Lichtdetektoren 184 platziert ist.
Eine bestimmte Chemikalie absorbiert verschiedene Wellenlängen mit unterschiedlichen Graden an Effizienz. Diese Unterschiede können als ein Spektrum dargestellt werden (das die Absorption für einen großen Bereich an Wellenlängen beschriebt). Die meisten Proben bestehen aus variierenden räumlichen Verteilungen verschiedener Chemikalien, und folglich werden unterschiedliche Proben optimal abgebildet, indem unterschiedliche Wellenlängen (oder Kombinationen von Wellenlängen) verwendet werden. Das beschriebene Filtersystem ermöglicht es dem Nutzer, Änderungen bezüglich dessen vorzunehmen, welche Wellenlängen verwendet werden, um eine gegebene Probe abzubilden.
Ähnlich besitzen fluoreszierende Chemikalien ein Spektrum, das die Effizienz unterschiedlicher Wellenlängen beschreibt, um sie anzuregen, und ein zweites Spektrum, das die Vielzahl unterschiedlicher Wellenlängen beschreibt, die bei Fluoreszenz emittiert werden. Die Verwendung von zwei elektronisch gesteuerten Filtern erzeugt (wenigstens) einen 2D-Parameter-Raum für die möglichen Kombinationen von Anregung und Emission. Ein solches System ermöglicht die Erforschung optimaler Kombinationen, um zwischen unterschiedlichen Chemikalien zu unterscheiden. Dies ermöglicht es, die 3D-Histologie von biomedizinischen Proben abzubilden, ohne dass spezifische Einfärbungen nötig sind.
Es ist klar, dass ein erfindungsgemäßer drehbarer Probenhalter kein Prisma 22 enthalten muss, und dass der drehbare Probenhalter auch nicht mit einem Standard-Vertikalmikroskop verwendet werden muss. 18 zeigt eine Abwandlung der Anordnung von 15. In 18 (in der Teile, die denen von 15 entsprechen, die gleichen Bezugszeichen haben), tritt das Licht, das von der Kammer 26 ausstrahlt, in eine Mikroskopoptik und eine digitale Kamera ein, wodurch sich ein kurzer Arbeitsabstand zwischen dem Mikroskopobjektiv 30 und der Probe ergibt.
Die Probe kann positioniert werden, indem ein Translationshalter verwendet wird, der von der Welle 44 getragen wird. Der Translationshalter weist eine manuelle oder rechnergesteuerte Einstellung in der x- und in der z-Richtung auf.

Claims

Drehbarer Probenhalter (10) zur Verwendung bei der Abbildung einer Probe (28) aus einer Vielzahl von Richtungen, wobei der drehbare Probenhalter ein Probenhaltemittel umfasst, das ein drehbares Glied (44) aufweist, das so betätigbar ist, dass es eine abzubildende Probe um eine vertikale oder im Wesentlichen vertikale Drehachse (94) dreht, die quer zu einer optischen Achse (29) verläuft, entlang derer Licht von der Probe emittiert wird, und wobei der drehbare Probenhalter weiterhin eine stationäre Abbildungskammer (26) umfasst, wobei das Probenhaltemittel oberhalb der stationären Abbildungskammer (26) angeordnet ist, um die Probe (28) aufzunehmen, die in optisches Abbildungsfluid in der Kammer eingetaucht ist, dadurch gekennzeichnet, dass das drehbare Glied (44) an seinem unteren Ende oder an dieses angrenzend ein magnetisches Glied (46) für eine lösbare Befestigung der Probe (28) durch Magnetanziehung aufweist und dass das Probenhaltemittel ein Probenpositionierungsmittel für eine genaue Positionierung der Probe (28) bezüglich der Drehachse (94) aufweist.
Drehbarer Probenhalter nach Anspruch 1, bei dem die Abbildungskammer (26) wenigstens eine plane Seite (142) aufweist, die senkrecht zu der optischen Achse verläuft.
Drehbarer Probenhalter nach Anspruch 1 oder 2, der ein Prisma (22) aufweist, das an der optischen Achse (29) so angeordnet ist, dass es von der Probe emittiertes Licht empfängt, wobei das Prisma (22) so wirkt, dass es Licht um 90° ablenkt, so dass das Licht von einem Mikroskop (12) mit einer vertikalen optischen Achse empfangen werden kann.
Drehbarer Probenhalter nach Anspruch 3, bei dem das Prisma (22) in seiner Position um eine horizontale Achse senkrecht zu der optischen Achse (29) einstellbar ist, die ebenfalls horizontal verläuft.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, bei dem das drehbare Glied (44) in seiner Position einstellbar ist, um die Drehachse um eine horizontale Einstellachse (90) einzustellen, die senkrecht zu der optischen Achse (29) verläuft.
Drehbarer Probenhalter nach Anspruch 5, bei dem die horizontale Einstellachse (90) unterhalb des unteren Endes des drehbaren Glieds (44) angeordnet ist, um zu gewährleisten, dass eine horizontale Einstellung eine minimale Verschiebung der Probe verursacht.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, bei dem das drehbare Glied (44) durch Verschiebung entlang einer Richtung, die mit der Drehachse (94) fluchtet, einstellbar ist, damit das Probenträgermittel zwischen einer abgesenkten Betriebstellung und einer erhöhten Außerbetriebsstellung, in der Proben in den Probenhalter geladen oder aus diesem entladen werden können, bewegt werden kann.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, bei dem das drehbare Glied (44) die Ausgangswelle eines Schrittmotors (42) ist, der auf einer Plattform (34) montiert ist, deren Position einstellbar ist.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, bei dem das untere Ende des drehbaren Glieds (44) so ausgebildet ist, dass die Probe von dem unteren Ende des drehbaren Glieds aufgehängt werden oder frei hängen oder nach unten hängen kann.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, bei dem das Probenpositionierungsmittel einen Hebel (16) umfasst, der drehbar in dem Probenhalter montiert ist und so wirkt, dass er eine befestigte Probe schiebt, so dass die Probe ihre Endpositionierung erreicht.
Drehbarer Probenhalter nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Probenpositionierungseinrichtung zwei Elektromotoren (150, 154) für eine rechnerge steuerte Einstellung des drehbaren Glieds (44) entlang zweier zueinander senkrechter Richtungen in einer Ebene senkrecht zu der Drehachse (94) umfasst.
Drehbarer Probenhalter nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem das Probenpositionierungsmittel ein manuelles oder rechnergesteuertes Einstellmittel zur Einstellung einer zweidimensionalen Verschiebungshalterung aufweist, die von dem drehbaren Glied getragen wird, wobei die Verschiebungshalterung eine Einstellung in zwei zueinander senkrechten Richtungen in einer Ebene senkrecht zu der Drehachse vorsieht.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, der eine parallel gerichtete Lichtquelle (172) zur Erzeugung eines Lichtstrahls umfasst, bei dem alle Lichtstrahlen im Wesentlichen parallel zu der optischen Achse sind und der im Betrieb die Probe beleuchtet.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, der einen Wellenlängenfilter (178) zur Einschränkung der Wellenlänge des Lichts, das die Probe beleuchtet, aufweist.
Drehbarer Probenhalter nach einem der Ansprüche 1 bis 13, der zwei Wellenlängenfilter aufweist, nämlich einen ersten Filter zur Einschränkung der Wellenlänge des Lichts, das die Probe beleuchtet, und einen zweiten Filter zur Einschränkung der Wellenlänge des Lichts, das von der Probe ausgeht, und vor der Erfassung.
Drehbarer Probenhalter nach einem der vorigen Ansprüche, der einen Teil eines optischen Projektions-Tomografie-Scanners bildet.
Verfahren zur Erlangung einer Abbildung einer Probe (28), umfassend: Drehen der Probe um eine vertikale oder im Wesentlichen vertikale Drehachse (94), die quer zu einer optischen Achse (29) verläuft, entlang derer Licht von der Probe emittiert wird, wobei die drehende Probe in Fluid in einer stationären optischen Kammer getaucht ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (28) lösbar durch ein magnetisches Glied (46) an dem drehbaren Glied (44) an oder angrenzend an dem unteren Ende des magnetischen Glieds befestigt ist und dass die Probe (28) bezüglich der Drehachse (94) genau positioniert ist.
Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Drehachse senkrecht zu der optischen Achse verläuft.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, bei dem die Probe von einem unteren Ende des drehbaren Glieds aufgehängt wird oder frei hängt oder nach unten hängt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, umfassend die Überwachung der Trajektorie eines Teils der Probe, der entlang der optischen Achse gesehen nicht auf der Drehachse liegt, und das Kippen der Probe um eine Einstellachse, bis die Form der Trajektorie eine gerade Linie und keine Ellipse ist.